ペプチドコンジュゲート組成物およびアルツハイマー病の予防および治療のための方法
本発明は、患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に関連した疾患、例えばアルツハイマー病の治療のための組成物および方法を提供する。そのような方法は、Ａβに対する抗体の形態の有益な免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を投与することを含む。もう１つの態様においては、Ａβの免疫原性断片は血漿Ａβレベルを上昇させうる。該免疫原性断片はＡβの直鎖状または多価ペプチドを含む。医薬組成物は、アジュバントと共に投与されうる、担体分子に化学的に連結された免疫原性断片を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド形成性疾患、特にアルツハイマー病の予防および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行的な記憶障害および認知低下により特徴づけられる。その特徴的な病変はアミロイド沈着（老人斑）、神経原線維変化および特定の脳領域におけるニューロン喪失である。アミロイド沈着は４０〜４３アミノ酸残基のアミロイドベータペプチド（Ａβ）から構成され、これはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。神経原線維変化は高リン酸化タウタンパク質の細胞内線維状凝集物である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７）。
【０００３】
ＡＤの病因は完全には理解されていないが、多因性事象であると予想される。脳組織内のＡβの蓄積および凝集は、アミロイドカスケード仮説としても公知のとおり（Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７，１９９５）、疾患過程において中心的な役割を果たすと考えられている。この仮説によれば、Ａβ、特にＡβ４２は、小さなオリゴマーから、大きな伸長した前線維（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌｅ）構造体に至る、種々の形態の凝集物を形成する傾向にある。これらの凝集物は神経毒性であり、該疾患の初期段階における記憶喪失および認知低下に関連したシナプス病態を引き起こす（Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５：５６９−５８０，２００４）。最近の刊行物は、三重トランスジェニックマウスモデルにおけるＡβの減少が細胞内タウ沈着をも妨げることを示唆している（Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４）。この知見は、細胞外アミロイド沈着が、ニューロン喪失を引き起こしうる後続の神経原線維のもつれ形成の原因となりうることを示唆している。
【０００４】
Ａβ抗原でのＡＰＰトランスジェニックマウスの免疫化は脳Ａβ沈着を減少させ、疾患の進行を軽減しうる。これはＳｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９により最初に報告され、現在では、種々のトランスジェニック動物モデル、種々の能動ワクチンおよびＡβ特異的モノクローナル抗体での受動免疫を含む多数の研究により裏付けられている（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。これらの動物データに合致して、凝集前（ｐｒｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）Ａβ（１−４２）免疫原（ＡＮ１７９２，Ｂｅｔａｂｌｏｃ）での能動免疫を既に受けていた患者からの死後ヒト脳組織の、３つの公開されている評価は、老人斑の局所的消失を示した（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．．１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）。総合すると、このデータは、Ａβ抗原に対する抗体応答を有効に惹起するワクチンが、ＡＤにおいて見出される病的老人斑に対して有効であることを示している。しかし、ワクチンまたは抗体の効力のメカニズムは依然として明らかでない。
【０００５】
公共の領域（公有財産）における、免疫療法に基づく最も進んだＡＤ対策は、アジュバントＱＳ−２１（商標）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に投与される凝集前（ｐｒｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）Ａβ（１−４２）から構成されるワクチンであるＡＮ１７９２（Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を使用する能動免疫第ＩＩ相ワクチン治験であった。２００２年１月に、４名の患者が、髄膜脳炎に合致した症状を示した際に、この研究は打ち切られた（Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２）。最終的に、治療された２９８名中１８名の患者が髄膜脳炎の徴候を現した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。脳炎と抗体価との間に相関性は存在しなかった。この作用の考えられうる原因メカニズムは自己免疫原、特に、Ａβ４２ペプチドの中央およびカルボキシ末端部分に対するＴ細胞の活性化であったと報告されている（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３）。この結論を支持するものとして、脳炎を発症した２名のワクチン被投与者からの脳組織の死後検査は、一方の患者においてはＣＤ４＋Ｔ細胞の相当な髄膜浸潤を示し（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．．９：４４８−４５２，２００３）、もう一方の患者においてはＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋Ｔ細胞を示した（Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）。
【０００６】
現在の証拠は、受動または能動免疫後の血漿Ａβレベルの増加が、後の脳Ａβの減少の前兆としての末梢流出（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｓｉｎｋ）の開始を反映することを示唆している。末梢流出は、末梢への中枢Ａβの正味の流出を引き起こす、脳および血漿Ａβ貯蔵の平衡における変化を意味する（例えば、Ｄｅａｎｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５：１１４９５−１１５０３，２００５；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８：８９３１−８９３２，２００１を参照されたい）。他の研究は、抗Ａβ免疫療法後に観察された血漿Ａβのこの増加が中枢Ａβの後続の減少の実現に必要であることを示唆している（Ｃｒｉｂｂｓら，７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＤ／ＰＤ，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ，Ｉｔａｌｙ，２００５）。したがって、血漿Ａβレベルの上昇をもたらす免疫応答を生成しうるいずれかの能動ワクチン免疫原が、アルツハイマー病および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連障害の治療に有用であると予想される。
【０００７】
驚くべきことに、本出願人は、自己Ｔ細胞応答を回避するためにＴ細胞エピトープを除去する抗原が免疫原性であり血漿Ａβレベルを上昇させることを見出した。これは、安全かつ有効なＡＤワクチンを得る可能性を意味する。本出願人は、ＡＤワクチンとして使用するためのそのような抗原および製剤を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、Ａβに対する抗体の形態で免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含む医薬組成物を提供する。１つの態様においては、この組成物はＡβの直鎖状の８アミノ酸のペプチド（８−ｍｅｒ）を含む。もう１つの態様においては、この組成物は、少なくとも１つのスペーサーが介在する多価直鎖状８−ｍｅｒ、または多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を含む。該医薬組成物はＡＤおよび関連アミロイド疾患用のワクチンとして使用されうる。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、血漿Ａβレベルを上昇させるＡβに対する抗体の形態で免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含むＡβ血漿上昇性物質である。該医薬組成物は、ＡＤ、および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連アミロイド疾患用のワクチンとして使用されうる。
【００１０】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、コンジュゲートを形成するよう担体分子に連結されており、ここで、該担体は、該Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を惹起するのを補助する。本発明の好ましい実施形態においては、該担体はナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＳ）である。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、医薬上許容されるアジュバントと共に投与される。好ましい実施形態においては、該アジュバントはアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント，ＭＡＡ）、またはサポニン系アジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００１２】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に関連した疾患の予防または治療方法を提供する。そのような疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群、認知障害または他の形態の老人性痴呆が含まれる。該方法は、直鎖状の８アミノ酸のペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在する多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を投与することを含む。好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含有する多価直鎖状ペプチドを含む。より好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価分枝状ＭＡＰ、Ａβ（３−１０）／（２１−２８）コンジュゲート、構築物番号１２、図６Ａを含む。
【００１３】
そのような方法は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するＴ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片の有効量を、治療を要する患者に投与することを含む。該抗体応答は血漿Ａβレベルを上昇させうる。この実施形態のもう１つの態様においては、投与する免疫原性断片は担体分子に連結されている。この実施形態の更にもう１つの態様においては、該免疫原性断片をアジュバントと共に投与する。
【００１４】
定義
「８−ｍｅｒ」なる語は、Ａβの断片、天然Ａβペプチドの類似体またはペプチド模倣体のに対応する８アミノ酸のペプチドを意味する。１以上の８−ｍｅｒを少なくとも１つのスペーサーと組合せて、多価直鎖状ペプチドを形成させ又は多価分枝状ＭＡＰを形成させることが可能である。
【００１５】
「Ａβ」コンジュゲートなる語は、担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニンまたはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）に化学的または生物学的に連結された、Ａβの８−ｍｅｒまたは免疫原性断片を意味する。
【００１６】
「Ａβペプチド」なる語は、直鎖状８−ｍｅｒ、少なくとも１つのスペーサーを含有する多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を含む（これらに限定されるものではない）、本明細書に記載のＡβペプチドのいずれかを意味する。
【００１７】
「エピトープ」なる語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次フォールディング（三次折り畳み）により配置された不連続的なアミノ酸または連続的なアミノ酸の両方から形成されうる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に対する露出に際しても維持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、変性溶媒での処理に際して失われる。Ｔ細胞エピトープは、宿主ＭＨＣ分子と複合体を形成しうるペプチドよりなる。ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対するＴ細胞エピトープはＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導をもたらし、一般には、９〜１１アミノ酸残基を含み、一方、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に対するエピトープはＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導をもたらし、典型的には、１２以上のアミノ酸残基を含む（Ｂｊｏｒｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６−５１２，１９８７；Ｍａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ ７５：６９３−７０８；ＢａｔａｌｉａおよびＣｏｌｌｉｎｓ；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１８１−２０７−６２２．１９９５；Ｍａｄｄｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：５８７−６２２．１９９５）。Ｔ細胞と違い、Ｂ細胞は僅か４アミノ酸長のペプチドを認識しうる。Ｔ細胞活性化を引き起こすためにＴ細胞受容体により認識されるのはＴ細胞エピトープ／ＭＨＣ複合体である。
【００１８】
本明細書中で用いる「Ａβの免疫原性断片」または「Ｔ細胞応答を欠く、Ａβの免疫原性断片」なる語は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるがその応答に自己抗原Ａβに対するＴ細胞応答を含まない８−ｍｅｒまたはＡβ断片を意味する。
【００１９】
「免疫学的」または「免疫」または「免疫原性」応答なる語は、脊椎動物個体における抗原に対する体液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはその分泌産物により媒介される）応答を意味する。そのような応答は、免疫原の投与により誘導される能動応答、または抗体の投与により誘導される受動応答でありうる。
【００２０】
「多価ペプチド」なる語は、２以上の抗原決定基を有するペプチドを意味する。
【００２１】
「医薬組成物」なる語は、哺乳動物個体への投与に適した化学的または生物学的組成物を意味する。本明細書中で用いる場合、それは、アジュバントの存在下または非存在下で投与される本明細書に記載の８−ｍｅｒ、Ａβの免疫原性断片およびＡβコンジュゲートを含む組成物を意味する。
【００２２】
発明の詳細な説明
既に記載されているとおり、前臨床研究は、抗Ａβポリクローナル抗体応答をもたらす能動免疫が、アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＡＤに関連した病的症状および認知症状に対する有効性をもたらすことを示唆している（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。これらの前臨床研究は、能動免疫原としてＡβ４２の凝集形態を使用した単一の臨床試験により裏付けられている。この研究からの予備的証拠は、病理学的（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）および認知的な改善（Ｇｉｌｍａｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４（９）：１５５３−１５６２，２００５）が治療後に見られたことを示唆している。これらの治験は励みになるものであり、また、前臨床研究に合致しているが、該治療は安全でないことが判明し、治療患者の約６％に髄膜脳炎が現れた後に打ち切られた（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。したがって、有害な安全性の問題を伴わずに有効な免疫応答をもたらしうる能動免疫法が必要とされている。
【００２３】
この予備臨床試験における有害事象の性質の理解が進みつつある。現在、数名の研究者が、死後評価の際のＣＤ４＋およびＣＤ８＋陽性髄膜浸潤物の存在を報告しており（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）、これは自己ペプチドＡβ４２に対するＴ細胞応答を示唆している。しかし、かなりの程度の抗体応答（Ｂ細胞媒介性）を維持しつつ自己Ｔ細胞応答を回避する必要性を当業者が認識しているものの、この性質を有する物質を得るための手段は公知でない。この難題は、予測のための動物モデル、またはこれらの活性に関する予測のための妥当性を有する他の前臨床アッセイが存在しないことにより、より一層深刻となる。
【００２４】
この目的のために、本出願人は、本発明に使用するペプチドを設計するためにＴおよびＢ細胞エピトープの種々の性質を用いた。直鎖状ペプチドのサイズを８アミノ酸に限定し、必要に応じて、いずれかの潜在的なＣ末端Ｔ細胞エピトープアンカー残基を除去することにより、ワクチン構築物を設計した。
【００２５】
したがって、本発明の１つの態様は、ＡＤワクチンとして使用するための、免疫原性であるがＴ細胞エピトープを欠くＡβ断片の特定である。本出願前には、Ａβペプチドのどのアミノ酸断片が、Ｔ細胞エピトープを欠くと同時に免疫原性応答を引き起こすのかが明らかには知られていなかった。この分野における従前の教示は、例えば、８−ｍｅｒが免疫原性応答をもたらすことを予測させるものではなく、また、Ａβペプチドの別の領域からの断片の有用性を識別させるものではないと、当業者は理解するであろう。例えば、米国特許第６，８０８，７１２号および第６，７８７，１４４号を参照されたい。
【００２６】
本明細書における本発明のもう１つの態様は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導し血漿Ａβレベルを上昇させる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含むＡβ血漿上昇性物質の特定を含む。そのような物質は、ＡＤワクチンとして、および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連アミロイド疾患に対して使用されうる。本出願人の発明の前には、Ａβのどの免疫原性断片が血漿Ａβレベルの上昇をもたらすのかが公知でなく、かつ、予測可能でなかった。いずれの理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載のＡβ血漿上昇性物質は、Ａβ消失の末梢流出説によれば血漿Ａβのレベルの上昇およびそれに続く脳Ａβの減少をもたらす、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するよう作用すると考えられている。さらに、個々の８−ｍｅｒまたはＡβの免疫原性断片は、血漿Ａβレベルを上昇させるよう免疫応答を誘導しうるが、本出願人は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価分枝状ＭＡＰであるＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）が、その構成単量体構築物であるＡβ（３−１０）（配列番号６９）またはＡβ（２１−２８）（配列番号７３）の場合と比較して血漿Ａβレベルの上昇において特に有効であることを見出した。
【００２７】
アミロイド疾患
本発明は、アミロイド沈着の蓄積により特徴づけられる疾患の予防および治療のための組成物および方法を提供する。アミロイド沈着は、不溶性塊へと凝集したペプチドを含む。該ペプチドの性質は疾患によって様々であるが、ほとんどの場合、該凝集物はβプリーツシート構造を有し、コンゴ・レッド（Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ）色素で染色される。アミロイド沈着により特徴づけられる疾患には、早発性および遅発性の両方のアルツハイマー病（ＡＤ）が含まれる。どちらの疾患においても、アミロイド沈着は、罹患個体の脳内に蓄積する、アミロイドベータ（Ａβ）と称されるペプチドを含む。したがって、「アミロイド疾患」なる語は、脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる疾患をも意味する。
【００２８】
治療用物質
本発明において使用する治療用物質はＡβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導する。免疫応答の誘導は、Ａβに対して反応性の抗体またはＴ細胞を誘導するために免疫原を投与した場合のように能動的であることが可能であり、あるいはそれ自体が個体内のＡβに結合する抗体を投与した場合のように受動的であることが可能である。
【００２９】
ＡＤのようなアミロイド疾患の予防または治療において使用する治療用物質には、Ａβのペプチド断片が含まれ、これは、天然に存在する形態（すなわち、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４２、Ａβ４２またはＡβ４３）のいずれかでありうる。これらの配列は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｄｙら，ＴＩＮＳ ２０：１５５−１５８，１９９７を参照されたい。
【００３０】
本明細書中で用いる治療用物質は、好ましい実施形態においては、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片である。Ａβの免疫原性断片は８−ｍｅｒ、少なくとも１つのＰＥＧスペーサーを有する多価直鎖状Ａβコンジュゲート、または多価分枝状ＭＡＰ Ａβコンジュゲートの形態でありうる。該治療用物質は医薬組成物の形態で投与されうる。もう１つの実施形態においては、該治療用物質は、個体における血漿Ａβレベルを上昇させる、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるＡβ血漿上昇性物質である。そのような物質は、天然に存在するペプチド断片を含むことが可能であり、あるいは１以上の置換、付加または欠失を含むことが可能であり、合成アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含みうる。断片および構築物は、本明細書中の実施例に記載のアッセイにおいて、予防および治療効力に関してスクリーニングされうる。
【００３１】
好ましい実施形態においては、該治療用物質はＡβのペプチド断片を含むが、そのような物質は、Ａβに対する有意なアミノ酸配列類似性を必ずしも有さないが尚もＡβの模倣体として作用し類似した免疫応答を誘導しうるペプチドおよび他の化合物をも含みうる。例えば、βプリーツシートを形成するペプチドおよびタンパク質を、本明細書に記載の本発明に対する適合性に関してスクリーニングすることが可能である。同様に、コンビナトリアル（組合せ）ライブラリーおよび他の化合物を、本発明に対する適合性に関してスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
そのような特定された治療用物質は、免疫原としてのその使用を促進する担体に化学的または生物学的に連結されうる。そのような担体には、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、オボアルブミン、破傷風毒素タンパク質、または他の病原性細菌、例えばジフテリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コレラもしくはエイチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に由来するトキソイド、または弱毒化毒素誘導体が含まれる。本発明の好ましい実施形態においては、該担体はナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＳ）である。
【００３３】
本発明は、所望によりアジュバントと共に投与される、担体に連結されていてもよい８−ｍｅｒまたはＡβの免疫原性断片を含む医薬組成物における、そのような治療用物質の使用をも含む。適当なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）、脂質、例えば３ デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、またはサポニン系アジュバントが含まれる。好ましい実施形態においては、該アジュバントはアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント，ＭＡＡ）、またはサポニン系アジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ Ｌｔｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００３４】
治療計画
ＡＤまたは他のアミロイド疾患の予防または治療処置のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、他の投薬、および処置が治療用（すなわち、疾患症状の発現後）であるか予防用（すなわち、疾患症状の発現を予防するためのもの）であるかを含む（これらに限定されるものではない）多数の要因に応じて様々なものとなろう。好ましい実施形態においては、患者はヒトであり、治療用物質を注射により投与する。
【００３５】
使用する免疫原または治療用物質の量は、アジュバントを同時または連続的に投与するかどうかにも左右され、アジュバントの非存在下では、より高い用量を使用する。
【００３６】
投与する免疫原または治療用物質の量は様々となるが、注射当たりペプチド０．５〜５０μｇ（Ａβペプチド含量に基づく）の範囲の量がヒトに対する使用に想定される。本明細書に記載のタイプの抗原を含む組成物の製剤化方法は当業者に公知であろう。
【００３７】
投与計画は、初回免疫、およびそれに続く、一定の間隔を空けた追加（ブースター）注射よりなるであろう。初回免疫と追加免疫との間の間隔、追加注射間の間隔、および追加免疫の回数は、該ワクチンにより惹起される抗体価および持続時間に左右されるであろう。それは、抗体応答の機能的効力、すなわち、ＡＤの発生を予防するのに必要な抗体価のレベル、あるいはＡＤ患者において発揮される治療効果にも左右されるであろう。典型的な計画は１、２および６ヶ月の時点の初期の一連の注射よりなるであろう。もう１つの計画は１および２ヶ月の時点の初期の注射よりなるであろう。いずれの計画の場合も、抗体価および持続時間に応じて、追加注射を６ヶ月または１年ごとに行うことになろう。投与計画は、患者における免疫応答のモニターにより判断して必要に応じて実施することも可能である。
【００３８】
ＡＤワクチンエピトープの特定
免疫原性応答を得るためにはＡβペプチドのどの８アミノ酸断片（「８−ｍｅｒ」）で十分なのかを決定するために、本出願人は、天然に存在するＡβ配列（配列番号１）に由来する小さな（８アミノ酸）の重複合成ペプチド（図１（配列番号２〜３７）に示すとおり）でＡβ４２の全長を系統的にスキャン（走査）した。Ａβ４２の全長に及ぶ２９個の重複する８アミノ酸ペプチドを、抗原として使用するために合成した（図２Ａ）。可溶性を改善するために、該ペプチドの幾つかを三重リシン（ＫＫＫ）（配列番号５２、５３、５４、５６、５９、６０、６２、６４および６５）もしくはグルタミン（ＥＥＥ）（配列番号５０、５１および６１）残基の付加またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（配列番号５５および６３）スペーサーの使用により修飾した。この理由により、残基（１１−１８）および（１３−２０）に対応するＡβの配列に伸長するペプチドは、複数の形態のものとして製造した。その第１のものは６−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）スペーサー＋Ｎ末端における化学的架橋用の官能基を有し、その他のものはＡｈａおよびＣ末端における官能基を有する。対照として、より長いペプチドＡβ（１−１８）を含めた。
【００３９】
本明細書に記載の免疫原性断片は、天然に存在する（すなわち、野生型）または合成されたＡβ（配列番号１）あるいはその突然変異または変異に由来する８−ｍｅｒペプチド（８アミノ酸残基）でありうる。そのような突然変異または変異は、当業者に公知の合成または組換え手段により得られうる。そのような変異体の一例として、野生型Ａβの１位および２位が変異している、Ａβ（１−４２）に対応するＥＶ基質（ＥＶＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ）（配列番号６６）が挙げられる。
【００４０】
ワクチン製剤において使用するＡβコンジュゲート
ワクチンの製剤化に使用するＡβコンジュゲートの選択は８−ｍｅｒの免疫原性に基づくものであった。ヒトＡβ配列と同一の配列を有する種における８−ｍｅｒの免疫原性を決定するために、２９個のペプチド（図２Ａ）をＫＬＨにコンジュゲート化してＡβコンジュゲートを形成させ、モルモットにおいて試験した（図３）。対照免疫原として、Ａβ（１−１８）−ＫＬＨ（配列番号３７）をこの分析に含めた。
【００４１】
モルモットを、実施例３．Ｂに記載のとおり、ミョウバン＋５０μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に製剤化されたコンジュゲート化免疫原で免疫化した。非免疫原性Ａβ４２断片から免疫原性のものを区別するために、モルモットを３週間隔で３回免疫化した。各免疫化の３週間後、血液サンプルを集め、Ａβ４０ペプチドに対する抗体価に関してＥＬＩＳＡにより試験した。これらの力価を、それぞれ第１投与後（ＰＤ１）、第２投与後（ＰＤ２）および第３投与後（ＰＤ３）として図３に示す。
【００４２】
最初の注射後（ＰＤ１）、いくつかのペプチド領域が、１８−ｍｅｒ対照と同様に、明らかな抗体価を惹起した。特に、Ａβアミノ酸１−８、２−９、３−１０、１７−２４、２１−２８および３３−４０に対応するＡβコンジュゲートは全て、１：８００を超える力価を示した。二回目の注射後（ＰＤ２）、該Ａβコンジュゲートのうちの１５個が、１：１０００を超える抗体価を惹起した。第３投与後（ＰＤ３）の分析は更に、Ａβの或る領域がその他のものより免疫原性であることを証明した。１１個の領域が、１：６０００より大きな力価を示した。これらには、Ａβアミノ酸１−８、３−１０、７−１４、１１−１８、１３−２０、１５−２２、１９−２６、２１−２８、２３−３０、２７−３４および２９−３６に対応する領域が含まれた。これらの領域のうち、領域１−８、１５−２２、２１−２８、２３−３０および２９−３６を含む５個は高度に免疫原性（＞１：１００００）であった。Ａβの或る８−アミノ酸領域は高度に免疫原性であり、一方、他の領域（例えば、５−１２、２５−３２、３１−３８および３５−４２）は非免疫原性（力価＜１：３００）であることを、このデータは示唆している。また、該ＡβコンジュゲートはＡβ４０ペプチド特異的抗体応答を惹起することが可能であったが、Ａβの全ての断片が同等に免疫原性であったわけではないことを、これらの結果は示している。
【００４３】
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートの免疫反応性
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートでの免疫化の後にモルモットから得た免疫血清がヒトＡＤに関連していることを示すために、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートで免疫化したモルモットからのポリクローナル血清の免疫原性を評価するための研究を行った。Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートの第２注射の４週間後にモルモットから集めた血清サンプルを免疫組織化学法によりヒトＡＤ脳組織に対する反応性に関して試験した（実施例４）。
【００４４】
図４に示すとおり、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートにより生じた免疫原性応答はヒトＡＤ脳組織に対する抗体応答をもたらした。図４Ａはモノクローナル抗Ａβ抗体６Ｆ３Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の免疫反応性を示す。示されているとおり、この脳は、ヒトＡＤに典型的であると予想される様態の広範なＡβ沈着を有する。図４Ｂは免疫前モルモットからの血清の免疫反応性の欠如を示す。図４Ｃは、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートの２回の注射の後のこの同じモルモットからの血清の陽性免疫反応性を示す。総合すると、このデータは、ＥＬＩＳＡにより見出された免疫原性が、このＡＤ組織において見出されたヒトＡβに対する有意な抗体応答を含むことを示している。これらの結果は、Ａβの個々の断片により付与される示差的免疫原性の予想外の知見を証明し拡張して、この応答が治療用途に合致した様態でもたらされることを示している。
【００４５】
ＯＭＰＣコンジュゲートおよび多抗原コンジュゲートの作製
モルモットにおける免疫原性、Ａβ４２アミノ酸配列内のペプチド断片の相対位置、Ａβ断片の溶解度、および担体タンパク質としてのＯＭＰＣの使用の実施可能性に基づき、ＯＭＰＣコンジュゲート化のための幾つかの８−ｍｅｒ（図２Ｂ）を選択した。これらのペプチド断片はＡβの以下のアミノ酸領域に対応した：１−８、２−９、３−１０、７−１４、１７−２４、２１−２８および３３−４０。
【００４６】
本発明は、例えば図５、６Ａおよび６Ｂに示されているような多価ペプチドコンジュゲートを含む。多価分枝状ＭＡＰ−ＯＭＰＣコンジュゲート（図６Ａおよび６Ｂ）は、リシンに基づく骨格を使用することにより作製し、一方、多価直鎖状８−ｍｅｒ−ＯＭＰＣコンジュゲート（図５）は、ＰＥＧリンカーを使用して調製した。ＰＥＧリンカーは、本発明において同様に使用されうる通常のアミノ酸リンカーと比較して、より低い免疫原性およびより大きなペプチド溶解度という利点をもたらす、と当業者は理解するであろう。本発明の好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価ＭＡＰである。そのようなコンジュゲート化はペプチド：担体の１：１の比ではない、と当業者により理解されるはずである。むしろ、複数のペプチドが球状に各ＯＭＰＣ分子に結合する。さらに、多価直鎖状構築物およびＭＡＰの使用は溶解度、製剤安定性、免疫原性およびポリクローナル応答の多様性を増大させる、と当業者により理解されるであろう。
【００４７】
ＯＭＰＣコンジュゲートワクチンの免疫原性
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの免疫原性を評価するために、およびこのワクチン構築物に伴うアジュバントの利益を更に評価するために、アカゲザルにおける研究を開始した。アカゲザルを、Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント（ＭＡＡ）またはＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のいずれかにおいて製剤化されたＡβ（１−１８）−ＯＭＰＣコンジュゲート（Ａβペプチド含量に基づく用量）でワクチン接種した。血液サンプルを集め、これを使用してＡβ４０に対する抗体価を決定した。第１投与後（ＰＤ１）、ミョウバン中の５μｇのワクチンを投与したサルは、検出可能な力価を生成しないが、ミョウバン中の３０μｇのワクチンを投与したサルは低いＡβ４０特異的力価を生成することを、この進行中の研究の暫定的分析は示した。ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤を投与した全てのサルは有意な抗体価を生成した。第２投与後（ＰＤ２）、ミョウバンの単体中のＡβコンジュゲートの両方の用量は、類似した力価レベルを生成し、一方、ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を投与したコホートは、ミョウバン単体のコホートより１０倍高い抗体価を生成した。この研究の結果は、Ａβ−ＯＭＰＣコンジュゲートが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明した。該データは更に、そのようなコンジュゲートワクチンの効力が、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）により、有意に増強されることを示した。
【００４８】
実施例
【実施例１】
【００４９】
Ａβコンジュゲートの製造
この実施例は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するためのＡβコンジュゲートのために後に使用するＡβペプチド断片の製造を記載する。
【００５０】
Ａ．Ａβ（８−ｍｅｒ）ペプチド（配列番号３７〜６５；図２Ａ）の製造
マレイミド誘導体化担体タンパク質に対するコンジュゲート化を意図した、カルボキシ末端にシステイン残基を有するペプチドを合成した。コンジュゲート化中の担体タンパク質への立体的接近可能性を最小にするための構造要素として、一次ペプチド配列とカルボキシ末端システインとの間にスペーサーＡｈａ（６−アミノヘキサン酸）を組込んだ。また、ＥＥＥ、ＫＫＫまたはＰＥＧにより表される可溶化残基を配列１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９内のＣ末端に導入した。Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコール［Ｆｍｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１０ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ］としてＰＥＧ単位を導入した。
【００５１】
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂から出発して、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から提供されたＦｍｏｃ化学法を用いて、自動ペプチド合成装置で固相合成によりＡβペプチドを製造した。合体後、樹脂に結合したペプチドを脱保護し、樹脂から切断した（９４．５％ トリフルオロ酢酸、２．５％ １，２−エタンジチオール、１％ トリイソプロピルシランおよび２．５％ Ｈ２Ｏの混合物を使用して行った）。２時間の処理の後、該反応物を濾過し、濃縮し、得られた油をエチルエーテルでトリチュレーションした。該固体生成物を濾過し、５０％ 酢酸／Ｈ２Ｏに溶解させ、凍結乾燥させた。該半純粋生成物の精製を、Ｃ−１８支持体上で０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配を用いるＲＰＨＰＬＣにより行った。画分を分析用ＨＰＬＣにより評価した。純粋な画分（＞９８％）をプールし、凍結乾燥させた。アミノ酸分析および質量分析により同一性が証明された。
【００５２】
Ｂ．Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号３７−６５；図２Ａ）の製造
ＫＬＨコンジュゲートを製造するために、Ｃ末端システインを含有するＡβペプチド（８−ｍｅｒ）２ｍｇを１ｍｌの市販のマレイミドコンジュゲート化バッファー（８３ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に懸濁させた。市販のマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のサンプル２ｍｇを該ペプチドに加え、２５℃で４時間反応させた。１００，０００Ｄａ透析管を使用するＰＢＳバッファーに対する徹底的な透析により、該コンジュゲートを未反応ペプチドおよび試薬から分離した。該コンジュゲート内に取り込まれたペプチドの量を、７０時間の酸加水分解の後のアミノ酸分析により評価した。ペプチド濃度は０．２４〜０．０３ｍｇ／ｍｌであると決定された。
【００５３】
Ｃ．ブロモアセチル化Ａβペプチド（配列番号６７−７７；図２Ｂ）の合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ自動合成装置上でアミノ酸を導入するために二重カップリング法を用いる標準的なｔ−Ｂｏｃ固相合成により、ブロモアセチル化ペプチドを製造した。ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂から出発して、カルボキシ末端アミノ酸ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを導入し、ついで該配列内のアミノ酸を導入した。これらの配列の全てにスペーサーとしてＡｈａを導入し、配列３５および３７においては、水性可溶化を補助するためにＰＥＧ単位を導入した。Ｏ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘキサエチレングリコール［Ｂｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ］としてＰＥＧ単位を導入した。該アミノ末端を酢酸のカップリングによりキャップ化した。一次配列の合体後、カルボキシ末端リシンのイプシロンアミノ基上のＦｍｏｃ保護基をピペリジンでの処理により除去した。ついでＮεアミノ基を溶媒としての塩化メチレン中のブロモ酢酸無水物と３０分間反応させた。脱保護、および樹脂からの該ペプチドの取り出しを、液体フッ化水素酸および捕捉剤としての１０％ アニソールでの処理により行った。０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ−１８シリカカラム上の分取ＨＰＬＣにより該ペプチドを精製した。分析用ＨＰＬＣおよび質量分析により該ペプチドの同一性および均一性が証明された。
【００５４】
Ｄ．ブロモアセチル化二価ＭＡＰ（構築物番号８、図６Ａ）の合成
ブロモアセチル化分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）の合成は、実施例１．Ｃに記載されているものと同様である。ＭＢＨＡ樹脂へのカルボキシ末端Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ［ｉｖＤｄｅ＝１，（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル］のカップリングの後、ピペリジンを使用してα−アミノＦｍｏｃ保護基を除去し、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの導入を行いながら合成を継続した。ｔ−Ｂｏｃ基の脱保護の後、該配列を以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｅで伸長させ、ＡＢＩ合成装置上で酢酸をカップリングさせることによりアミノ末端をキャップ化した。側鎖リシンＦｍｏｃ保護基をピペリジンで除去し、リシンのＮεアームをＡＢＩ合成装置上で以下の保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄの導入により伸長させ、酢酸をカップリングすることによりアミノ末端をキャップ化した。ジメチルホルムアミド中の５％ ヒドラジンでの５分間の処理によりｉｖＤｄｅ保護基の除去を行って、カルボキシ末端リシン上に非遮蔽Ｎεアミノ基を得、これをブロモ酢酸無水物で更に修飾した（実施例１．Ｃに記載されているとおり）。樹脂からの該ペプチドの切断、その後続の精製および特徴づけは、実施例１．Ｃに記載されているとおりである。
【００５５】
Ｅ．ブロモアセチル化ＭＡＰ（構築物番号１１および１２、図６Ａ）の合成
ＭＡＰ構築物番号１１および１２を、実施例１．Ｄに記載されているとおりに製造した。
【００５６】
Ｆ．システイン多価ＭＡＰ（構築物番号９、図６Ａ）の合成
ＭＢＨＡ樹脂から出発して、以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ｃ、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、ＥをＡＢＩ自動合成装置上で合体させ、ついで酢酸とのカップリングを行った。リシンのＮεアミノＦｍｏｃ保護基を除去し、以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄを導入しながら合成を継続し、ついで酢酸とのカップリングを行った。実施例１．Ｃと同様にして、樹脂に結合したペプチドを単離し、精製し、特徴づけした。（注）：実施例１．Ｃにおける１０％ アニソールの代わりに、ｐ−クレゾール：ｐ−チオクレゾールの１：１混合物をＨＦ切断中の捕捉剤として使用した。
【００５７】
Ｇ．システイン二価ＭＡＰ（構築物番号１０、１３および１４、図６Ａ）の合成
二価ＭＡＰ（構築物番号１０、１３および１４、図６Ａ）を、実施例６．Ｆに記載されているとおりに製造した。Ｏ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘキサエチレングリコール（ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ）としてＰＥＧ単位を導入した。
【００５８】
Ｈ．ブロモアセチル化多価ＭＡＰ（構築物番号１６、図６Ｂ）の合成
ＡＢＩ自動合成装置を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨをＭＢＨＡ樹脂にカップリングさせた。リシンのＮεアミノ基上のｔ−ＢＯＣ保護基の除去の後、該配列を以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｅの導入により伸長させ、ついで酢酸のカップリングを行った。リシン上のＮα Ｆｍｏｃ保護基をピペリジンでの手動処理により除去した。該配列をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨおよび以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄの導入により（ＡＢＩ合成装置上で）更に修飾し、ついで酢酸のカップリングを行った。リシンＦｍｏｃ Ｎαアミノ保護基を、既に記載されているとおりに除去し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨの導入およびそれに続く以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ａの導入を行いながら合成を継続し、ついで酢酸カップリングを行った。リシン上のＮα Ｆｍｏｃ保護基を除去し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨの導入およびそれに続く以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｖ、Ｖ、Ｇ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｇの導入を行いながら合成を継続し、ついで酢酸カップリングを行った。リシンのＮαＦｍｏｃ保護基の除去の後、樹脂に結合したペプチドを実施例１．Ｃの場合と同様にしてブロモ酢酸無水物と反応させた。最終生成物の単離および特徴づけは実施例１．Ｃの場合と同様であった。
【００５９】
Ｉ．多価ＭＡＰ（構築物番号１５および１７、図６Ｂ）の合成
ＭＡＰ Ａβコンジュゲート（構築物番号１５および１７、図６Ｂ）の合成は、実施例１．Ｆおよび１．Ｈに記載されているとおりである。
【００６０】
Ｊ．ブロモアセチル化多価直鎖状ペプチド（構築物番号１、図５）の合成
ＭＢＨＡ樹脂から出発して、実施例６．Ａに記載されているとおりにＡＢＩ自動合成装置上でｔ−ＢＯＣ化学法を用いて一次配列を合成した。カップリング試薬としてＢＯＰ試薬を使用して、Ｆｍｏｃ−ｌ−アミノ−４，７，１０−トリオキサ １３−トリデカンアミンコハク酸［Ｆｍｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ］として介在ＰＥＧ単位を手動で導入した。Ｆｍｏｃ基の脱保護に、ピペリジンを使用した。アミノ末端のブロモアセチル化は、実施例１．Ｃに記載されているとおりであった。所望の生成物の単離および特徴づけは実施例１．Ｃの場合と同様であった。
【００６１】
Ｋ．多価直鎖状Ａβペプチド（構築物番号２、５、６および７、図５）の合成
多価直鎖状Ａβペプチド（構築物番号２、５、６および７、図５）の合成は、実施例１．Ｊに記載されているとおりである。
【実施例２】
【００６２】
ＯＭＰＣへのＡβペプチドの化学コンジュゲート化
この実施例は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）Ｂ型の精製外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）への、ヒトＡβ４２に由来するペプチドの化学コンジュゲート化を示す。該カップリングの化学的本質は、ハロアセチル誘導体化ペプチドと該膜複合体のチオール誘導体化タンパク質との反応である。前記のとおりに、二価直鎖状エピトープペプチドの場合にはＮ末端上にブロモアセチル官能基を有する、あるいは一価直鎖状および分枝状ＭＡＰ形態の場合にはＣ末端上に又はリシン残基のイプシロンアミノ基を介して結合したブロモアセチル官能基を有する、アミロイドペプチドを合成した。該ＢｒＡｃ基は、６−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）からなるスペーサーにより成熟ペプチドから分離されていた。前記配列を参照されたい。代表的なペプチドであるＡβ（３−１０）に関して、コンジュゲート化を説明する。ＯＭＰＣ含有溶液の全ての操作は、標準的な無菌技術に従う層流環境中で行った。
【００６３】
Ａ．ＯＭＰＣのチオール化
例えばＰｅｄｖａｘＨＩＢ（登録商標）および肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造に用いられるＦｕ，米国特許第５，４９４，８０８号に記載されているような方法により入手可能な精製無菌ＯＭＰＣを、試薬Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、その表面の接近可能なリシン残基の一部においてチオール化した。水中のＯＭＰＣ（１１７ｍｇ）を２８９，０００×ｇ、４℃で６０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を捨てた。窒素分散（スパージ）活性化バッファー（０．１１Ｍ ホウ酸ナトリウム，ｐＨ１１）を該遠心管に加え、該ペレットをガラス攪拌棒で取り除いた。上清をガラスＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、３０ストローク（行程）で再懸濁させた。該遠心管を洗浄し、洗液を３０ストロークでドゥーンス（ｄｏｕｎｃｅ）処理した。再懸濁化ペレットおよび洗液を、１０ｍｇ／ｍＬのＯＭＰＣ濃度となるよう、清潔な容器内で一緒にした。固体ＤＴＴおよびＥＤＴＡを窒素分散活性化バッファーに溶解させ、０．１０６ｍｇ ＤＴＴ／ｍｇ ＯＭＰＣおよび０．５７ｍｇ ＥＤＴＡ／ｍｇ ＯＭＰＣの比で反応溶液に充填した。穏やかに混合した後、ＮＡＴＨを窒素分散水に溶解させ、０．８９ｍｇ ＮＡＨＴ／ｍｇ ＯＭＰＣの比で反応に仕込んだ。遮光条件下の窒素フード内で、室温で３時間、反応を進行させた。完了時に、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー（２５ｍＭ ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により６ｍｇ／ｍＬで再懸濁させて、ペレットを洗浄した。最終再懸濁のために、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。アリコートを取り出して、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイによる遊離チオール測定に付し、該バルク生成物を、使用するまで、暗所の氷上で保存した。測定されたチオール含量は０．２〜０．３μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００６４】
Ｂ．ＯＭＰＣへのＡβペプチドのコンジュゲート化
ペプチドに対する機能性ＢｒＡｃ含量はモル比で１：１であると推定された。十分なペプチドを秤量して全チオールに対して１．６モル過剰のｂｒＡｃを得た。各コンジュゲート化において標的化される全ＯＭＰＣタンパク質は１５ｍｇであった。ペプチドを窒素分散コンジュゲート化バッファーに２．６ｍｇ／ｍＬで再懸濁させ、チオール化ＯＭＰＣ溶液にゆっくりと加えた。該反応を遮光し、室温で約２２時間インキュベートした。残留遊離ＯＭＰＣチオール基を５倍モル過剰のＮ−エチルマレイミドで室温で１８時間クエンチした。該コンジュゲート化法の全体にわたり、平行して、チオール化ＯＭＰＣのみの対照を使用した。クエンチが完了したら、コンジュゲートおよび対照を１００，０００Ｄａ分子量のカットオフの透析ユニットに移し、少なくとも５回交換するコンジュゲート化バッファーに対して徹底的に透析した。透析が完了したら、サンプルを１５ｍｌのポリプロピレン遠心管に移し、２，２８０×ｇ、４℃で５分間遠心分離して凝集物を除去した。アリコートを分析用に取り出し、該バルクを４℃で保存した。
【００６５】
Ｃ．Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの分析
ローリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイの変法により全タンパク質を測定し、コンジュゲートおよび対照のサンプルを定量的アミノ酸分析（ＡＡＡ）により分析した。ＯＭＰＣに対するペプチドのモル比を、新生ペプチド−ＯＭＰＣ結合の酸加水分解に際して遊離される特有の残基であるＳ−カルボキシメチルホモシステインの定量から決定した。該ペプチド配列には存在しないためＯＭＰＣタンパク質に特有のものである加水分解安定残基から、ＯＭＰＣ比濃度を決定した。ＳＣＭＨＣの１モル当たりにペプチドが１モルだとすると、ＳＣＭＨＣ／ＯＭＰＣの比はペプチド／ＯＭＰＣ含量と等価となった。ペプチド分子量および平均ＯＭＰＣ質量（４０，０００，０００Ｄａ）を用いて、この比からペプチドの質量ローディングを計算することが可能であろう。
【００６６】
コンジュゲート化の共有結合性を、４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により定量的に確認した。この場合、クーマシー染色コンジュゲートのバンドにおいて、対照と比較して移動度における上方へのシフトが認められた。
【００６７】
すべてのコンジュゲート化ＢｒＡｃペプチドに関する算出モルローディング比（ｍｏｌ ペプチド／ｍｏｌ ＯＭＰＣ）は以下のとおりであった。
【００６８】
【表１】
【実施例３】
【００６９】
Ａβコンジュゲートの免疫原性
この実施例は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるＡβコンジュゲートの製剤化および投与を記載する。
【００７０】
Ａ．ワクチンコンジュゲートの製剤化
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートワクチンをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で製剤化した。すべてのＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートワクチンを、ミョウバン中、第２のアジュバント、例えば、サポニン系アジュバントであるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の存在下または非存在下で製剤化した。サンプルの操作の全ては無菌条件下で行った。
【００７１】
ミョウバン製剤の場合、コンジュゲートを１倍の食塩水で、定められたペプチド濃度に希釈し、無菌食塩水（１５０ｍＭ 無菌塩化ナトリウム溶液）中で調製された９００μｇ／ｍＬ Ｍｅｒｃｋミョウバンに相当する２倍のミョウバン（Ｍｅｒｃｋ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．３９９４３）と混合する。したがって、該ワクチン中の目標濃度は４５０μｇ／ｍＬ Ｍｅｒｃｋミョウバンまたは１倍Ｍｅｒｃｋミョウバンである。動物研究のための目標ペプチド（抗原）濃度は以下のとおりであった：マウスの場合−１２．１μｇ／Ｌ（用量０．１ｍＬ）；サルの場合−１０μｇ／ｍＬまたは６０μｇ／ｍＬ（用量０．５ｍＬ）；およびモルモットの場合−１２．５μｇ／ｍＬ（用量０．４ｍＬ）。該混合物を室温で２時間インキュベートする。注射用量を得るために、ミョウバン吸収コンジュゲートを１倍のミョウバンで希釈して目標ペプチド濃度にする。第２のアジュバント、すなわち、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が必要な場合には、目標濃度は、マウス研究では１０μｇ／ｍＬ、サル研究では０、１００または２００μ／ｍＬ、そしてモルモット研究では１２５μｇ／ｍＬであった。
【００７２】
１．ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の調製
カセット膜（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔ，１０Ｋ ＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を２〜８℃で無菌食塩水溶液中に透析する。透析中に無菌食塩水溶液を２〜３回、交換する。透析の完了後、シリンジフィルター（０．２２μＭ Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジフィルター，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用してＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を濾過滅菌する。無菌の透析されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定する。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を、使用するまで、無菌条件中、２〜８℃で保存する。
【００７３】
２．Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートおよびＭｅｒｃｋミョウバン製剤
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートストックを無菌の１×食塩水溶液中に希釈する。ついで、希釈されたＡＤペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートストックを１×無菌食塩水溶液中の２×Ｍｅｒｃｋミョウバンに加え、回転盤上で室温で１時間混合する。該混合物をベンチ上で室温で１５分間静置沈降させ、ついで１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を穏やかに捨て（ミョウバンに結合したＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの比率を決定するために上清のＵＶ分析を行う）、ペレットを無菌１×食塩水に再懸濁させる。該混合物を無菌の３ｍＬのチューブガラスバイアル中にアリコート化し、ついで、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）での最終的な製剤化まで２〜８℃で保存する。
【００７４】
３．Ａβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ワクチンの製剤化
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）での最終製剤化の前に、結合を確認し粒子安定性をモニターするために、食塩水中のＡβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンの粒径を静的（ｓｔａｔｉｃ）光散乱により測定する。１×食塩水中の無菌の透析されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を、ボルテックスしながら、無菌の１５０ｍＭ ＮａＣｌ中のＡβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンに加える。バイアルに栓をし、キャップをし、クリンプして完全に密封する。ワクチンを、注射に使用するまで２〜８℃で保存する。注射前に、各ワクチンを３〜５分間ボルテックスする。
【００７５】
Ｂ．モルモットにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性
６〜１０週齢の雌モルモットをＨａｒｌａｎ Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＡから入手し、制度化された指針に従いＭｅｒｃｋ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設内で飼育した。すべての動物実験はＭｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。抗原をリン酸緩衝食塩水中で調製し、示されたアジュバント中で製剤化した。
【００７６】
図２Ａに示すＡβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで、２匹／群の動物を、４０μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の存在下、４００μｌのコンジュゲートワクチン（ペプチド含量で８μｇまたは全コンジュゲートで５０μｇ）で筋肉内に免疫化した。該免疫化は４週間隔で３回行った。血清サンプルを、初回免疫化前（前採血）および各免疫化の３週間後に集め、抗体価の測定まで４℃で保存した。標的抗原としてＡβ４０を使用するプロトコールに従うＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。
【００７７】
ＥＬＩＳＡに基づく分析は以下のとおりである。９６ウェルプレートを５０ｍＭ 炭酸水素塩バッファー（ｐＨ９．６）中の４μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌ／ウェルのＡβで４℃で一晩コートした。プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有するＰＢＳ中の３％ 脱脂乳（乳−ＰＢＳＴ）でブロッキングした。試験サンプルをＰＢＳＴ中の４倍系列で希釈した。１００μｌの希釈サンプルを各ウェルに加え、該プレートを２４℃で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴで６回洗浄した。乳−ＰＢＳＴ中の１：５０００希釈の５０μｌのＨＲＰ−コンジュゲート化二次抗体をウェルごとに加え、該プレートを２４℃で１時間インキュベートした。該プレートを３回洗浄し、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩１００μｌをウェルごとに加えた。２４℃で３０分間のインキュベーションの後、ウェルごとに１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより該反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して該プレートを４９０ｎｍで読み取った。抗体価は、コンジュゲート対照ウェルの平均＋２標準偏差を超えるＯＤ４９０ｎｍ値を与える最高希釈度の逆数と定義した。
【００７８】
図３に示すこの分析の結果は、第１注射後（ＰＤ１）、いくつかのペプチド領域が、１８−ｍｅｒ対照と同様に、明らかな抗体価を惹起することを示した。特に、Ａβアミノ酸１−８、２−９、３−１０、１７−２４、２１−２８および３３−４０に対応するＡβペプチド断片は全て、１：８００を超える力価を示した。第２注射後（ＰＤ２）、該８−ｍｅｒコンジュゲートのうちの１５個が、１：１０００を超える抗体価を惹起した。第３投与後（ＰＤ３）の分析は更に、Ａβペプチドの或る領域がその他のものより免疫原性であることを証明した。１１個の領域が、１：６０００より大きな力価を示した。これらには、Ａβアミノ酸１−８、３−１０、７−１４、１１−１８、１３−２０、１５−２２、１９−２６、２１−２８、２３−３０、２７−３４および２９−３６に対応する領域が含まれた。これらの領域のうち、領域１−８、１５−２２、２１−２８、２３−３０および２９−３６を含む５領域は高度に免疫原性（＞１：１００００）であった。これらの結果は、８−ｍｅｒコンジュゲートがＡβ４０特異的抗体応答を惹起しうることを示している。意外にも、かつ、従前の教示に反して、Ａβの全ての断片が同等に免疫原性であったわけではなかった。実際、ある８−ｍｅｒは高度に免疫原性であり、一方、Ａβの他の領域（例えば、５−１２、２５−３２、３１−３８および３５−４２）は非免疫原性（力価＜１：３００）であることを、これらのデータは示唆している。
【００７９】
Ｃ．アカゲザルにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートならびにミョウバンおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが免疫応答を与えるかどうかを判定するために、モルモットで行った研究と比較されうる非ヒト霊長類（すなわち、アカゲザル）における研究を行った。Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＮｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の、制度化された動物取扱いプロトコールに従い、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を飼育した。
【００８０】
モデル抗原として、図２Ｂに示す以下の８−ｍｅｒ：Ａβ（１−８）（配列番号６７）、Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、Ａβ（７−１４）（配列番号７０）、Ａβ（１７−２４）（配列番号７２）、Ａβ（２１−２８）（配列番号７３）およびＡβ（３３−４０）（配列番号７４）；図５に示す以下の二価直鎖状ペプチド：Ａβ（３−１０）（７−１４）（構築物番号１）、Ａβ（３−１０）（２１−２８）（構築物番号２）、Ａβ（ｌ−８）（２１−２８）（構築物番号５）；ならびに図６Ａに示す以下の多価分枝状ＭＡＰ：Ａβ（３−１０）（７−１４）（構築物番号８）、Ａβ（ｌ−８）（２１−２８）（構築物番号１１）、Ａβ（３−１０）（２１−２８）（構築物番号１２）を含む、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβペプチドを使用した。
【００８１】
Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント（ＭＡＡ）＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で製剤化されたワクチンのそれぞれの５μｇでアカゲザル（Ｎ＝３）を４週間ごとに免疫化した。血清サンプルを各注射の４週間後に集め、ＥＬＩＳＡによりＡβ特異的抗体応答に関して測定した。モルモットでの研究からの結果に合致して、すべてのコンジュゲートがサルにおいて免疫原性であることが判明した。Ａβ特異的抗体価は１回の注射に後に検出可能であり、後続の注射の後に更に増強された。試験したコンジュゲートに関しては概ね、第２または第３免疫化の後にピーク力価に達し、この場合、幾何平均力価は２５，０００〜５００，０００の範囲であった。これらの結果は、本明細書に記載のＡβコンジュゲートがＡβ特異的抗体応答を惹起しうるという知見を証明している。
【００８２】
Ｄ．アカゲザルにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性に対するアジュバント効果
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートおよびサポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が免疫応答の改善をもたらしうるかどうかを判定するために、非ヒト霊長類（すなわち、アカゲザル）において追加的な研究を行った。モデル抗原として、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（１−１８）ペプチドを使用した。Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＮｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の、制度化された動物取扱いプロトコールに従い、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を飼育した。
【００８３】
１群３頭の５群のサルに以下のＡβ（１−１８）−ＯＭＰＣコンジュゲートを投与した：（１）ミョウバン中の５μｇのコンジュゲート（ペプチド含量に基づく）、（２）ミョウバン＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の５μｇのコンジュゲート、（３）ミョウバン＋５０ｍｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の５μｇのコンジュゲート、（４）ミョウバン中の３０μｇのコンジュゲート、（２）ミョウバン＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の３０μｇのコンジュゲート。該免疫化は、第０、８および２４週に、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、０．５ｍｌのアリコートでの筋肉内注射により行った。血清サンプルを第０週（前採血）から４週間隔で集め、ＥＬＩＳＡによりＡβ４０に対する抗体価に関して試験した（前実施例に記載されているとおりに行った）。
【００８４】
ＰＤ１において、ミョウバン中の５μｇのコンジュゲートワクチンを投与したサルは、検出可能な力価を生成しないが、ミョウバン中の３０μｇのコンジュゲートワクチンを投与したサルは低いＡβ４０特異的力価を生成することを、この進行中の研究の暫定的分析は示した。ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤を投与した全てのサルは有意な抗体価を生成した。ＰＤ２において、ミョウバンの単体中のＡβコンジュゲートの両方の用量は、類似した力価レベルを生成し、一方、ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を投与したコホートは、ミョウバン単体の条件より１０倍高い抗体価を生成した。この研究の結果は、このＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明した。該データは更に、そのようなコンジュゲートワクチンの効力が、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）により、有意に増強されることを示している。
【実施例４】
【００８５】
モルモットポリクローナル血清の免疫反応性
８−ｍｅｒＫＬＨコンジュゲートでの免疫化の後で前記（実施例３．Ｂ）モルモットから産生された免疫血清がヒトＡＤに関連していることを判定するために、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ免疫原で免疫化されたモルモットからのポリクローナル血清の免疫反応性を評価するための研究を行った。この構築物の第２注射の４週間後、以下の方法に従い代表的なモルモットから血液を集めた。
【００８６】
ヒトＡＤ脳切片（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）上でポリクローナル血清の反応性を評価した。ヒト脳切片は、６０℃で３０分間のインキュベーションおよびそれに続く室温で２回の５分間のキシレン洗浄により調製した。ついで切片を１００％ ＥｔＯＨに２回（それぞれ５分間）浸漬し、ついでｄｄＨ２Ｏに５分間浸漬した。切片を９９％ ギ酸に３分間浸漬し、ついでｄｄＨ２Ｏ中で手短に洗浄し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に５分間浸漬した。ついで切片をペルオキシダーゼブロッカーと共に１０分間インキュベートし、ついでＰＢＳで５分間洗浄した。１０％ ヤギ血清に対する１０分間の曝露およびそれに続くＰＢＳでの５分間の洗浄により、切片をブロッキングした。ついで切片を希釈モルモット血清と共に４℃で一晩または室温で１時間インキュベートした。５分間のＰＢＳでの洗浄の後、切片を希釈ビオチン化ヤギ抗モルモットＩｇＧまたはビオチン化ウマ抗マウス抗体（５ｍｌ ＰＢＳ中の１滴）と共に１０分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で５分間洗浄し、ついでＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ ＡＢＣキット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳで５分間洗浄した。ついで切片をＤＡＤ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で５分間染色し、ｄｄＨ２Ｏで洗浄した。ついで切片をヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、段階的なＥｔＯＨおよびキシレン（７０％ ＥｔＯＨで５分間、８０％ ＥｔＯＨで５分間、１００％ ＥｔＯＨで５分間およびキシレンで５分間）で脱水させた。ついで切片をカバーガラスで覆い、光学顕微鏡検査により評価した。
【００８７】
Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲートにより生じた免疫原性応答はヒトＡＤ脳組織に対する抗体応答をもたらした。図４に示すとおり、このヒト脳切片は、ヒトＡＤに予想されるものに典型的な様態の広範なＡβ沈着を有する。免疫前モルモット血清は、この組織に曝露された場合の免疫反応性の欠如を示しているが、Ａβ（３−１０）＝−ＫＬＨ構築物の２回の注射の後、この同じモルモットからの血清の陽性免疫反応性が認められる。これらのデータは、ＥＬＩＳＡにより見出された及び図３に示された免疫原性が、このＡＤ組織において見出されたヒトＡβに対する有意な抗体応答を含むことを示している。したがって、これらの結果は、いくつかのＡβ断片による示差的免疫原性の予想外の知見を拡張して、この応答が治療用途に合致した様態でもたらされることを示している。
【実施例５】
【００８８】
Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片の特定
本発明において使用する、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片を特定するために、特定の抗原に対するＴ細胞応答を評価するための方法として以下の酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いることが可能である。Ｔ細胞エピトープを有する免疫原断片は、白い膜の表面上の濃いスポットの存在により特定される。各スポットは、抗原（すなわち、免疫原性断片）に応答してインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌しているＴ細胞の存在を示す。このアッセイはワクチンおよび免疫学の分野の当業者に良く知られており、例えば、Ｌａｒｓｓｏｎら，ＡＩＤＳ ３：７６７−７７７，１９９９、およびＭｗａｕら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １８：６１１−６１８，２００２を参照されたい。最近の総説はＡ．Ｅ．Ｋａｌｙｕｚｈｎｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０２：１５−３１，２００５に見出されうる。
【００８９】
ペプチドＡβ１−４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）（アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＥＦＡＥＤＶＧ ＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ）（配列番号７８）およびＡβ１−２０（Ｓｙｎｐｅｐ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）（アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧ ＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ）（配列番号７９）に対する応答のためにアカゲザル（Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の末梢血単球（ＰＢＭＣ）を使用した。
【００９０】
精製されたモノクローナルマウス抗サルＩＦＮ−γ（クローンＭＤ−Ｉ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＴ ５２５，Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、１％ ペニシリンおよび硫酸ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、ついで９６ウェル ＨＴＳ ＩＰ無菌プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に加え、４℃で１２時間以上インキュベートした。プレートを洗浄し、Ｒ１０［ＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８７５−０９３）、１０％ ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．１％ ５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９８５−０２３）、１％ １Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ＧＩＢＣＯ（登録商標）１５６３０−０８０）、１％ ２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、１％ １００ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０−０７０）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）］を加えた後、３７℃で少なくとも２時間のインキュベーションを行った。ＰＢＭＣを遠心分離し、Ｒ１０に再懸濁させた。ＰＢＭＣをＺ２ Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で計数した。吸引されたプレートの各ウェルに０．４μｇのＡβ １−４０、Ａβ １−２０、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ−８９０２，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，陽性対照）または希釈ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，陰性対照）を加え、ついで４０００００個のＰＢＭＣを各ウェルに加えた。プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。プレートを、５％ ＦＢＳおよび０．００５％ Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ中で洗浄した。ビオチン結合抗サルＩＦＮγポリクローナル抗体（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を同じ培地中で希釈し、各プレートに加えた。ついでプレートを４℃で１８〜２４時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＡＰ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｌ３０４３Ｅ，ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を同じ培地中で希釈し、洗浄されたプレートに加えた。プレートを室温で暗所にて２時間インキュベートした。濾過１−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｆｉｌｔｅｒｅｄ １−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０４２）を加え、さらに、室温で暗所にて１０分間のインキュベーションを行った。洗浄後、プレートを乾燥させ、ついでＣＣＤカメラでイメージングし、各ウェル内のスポットをコンピューターにより自動的に計数した。
【００９１】
陽性結果と判定されるためには、百万個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣ）が５５を超えていなければならず、陰性対照の４倍を超えていなければならず、これらの基準のいずれかが満たされていない場合には陰性結果と判定される、と本出願人は定めている。ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）を含むＭＡＰ構築物、またはＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）の２つの単量体構築物の両方で、アカゲザルにワクチン接種した。該ワクチン接種計画の実施中、１ヵ月間隔で３〜４ヶ月間、各アカゲザルをアッセイした。Ａβ １−４０またはＡβ １−２０に対するこれまでに記録された最高シグナルは僅か１８ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣであり、５５ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣの基準より有意に低い。したがって、すべては陰性評価となった。このことは、該ワクチンがＴ細胞応答を惹起せず、したがってＴ細胞エピトープを含まなかったという有力な証拠となる。
【実施例６】
【００９２】
血漿Ａβの上昇
５μｇのＭＡＰ Ａβ（３−１０）／（２１−２８）コンジュゲート（構築物番号１２、図６Ａ）、またはその単量体成分コンジュゲートＡβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）（担体としてのＯＭＰＣに連結されＭＡＡ＋１００μｇ ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で製剤化されたもの）で、アカゲザル非ヒト霊長類（Ｎ＝３）を免疫化した。該サル霊長類に４週間ごとにワクチン接種を行い、各注射の４週間後に血液を集め分析した。抗Ａβ４０力価および全Ａβ１−４０レベルを測定した。
【００９３】
６Ｅ１０／Ｇ２１０ ＥＬＩＳＡを用いて、これらの免疫化動物において血漿Ａβ１−４０レベルを測定した。このアッセイは、Ｎ末端捕捉抗体６Ｅ１０（Ａβ１−８）（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）、およびアルカリホスファターゼに結合したＣ末端Ａβ４０ ｎｅｏ−エピトープ抗体（Ｇ２１０）（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、Ａβ１−４０を測定する。抗体６Ｅ１０を５μｇ／ｍｌの濃度でプレート上にコートした。希釈血漿サンプル（１：３）を５０μｌ／ウェルで三重に使用した。６Ｅ１０免疫喪失アカゲザル血漿マトリックス（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｒｈｅｓｕｓ ｐｌａｓｍａ ｍａｔｒｉｘ）中、Ａβ１−４０標準を４００ｐＭから３ｐＭまで調製した。このアッセイは約５〜２０のシグナル対ノイズ比を有する。ＣＤＰ−ｓｔａｒアルカリホスファターゼ基質をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手した。予め製剤化されたブロッキングバッファーであるＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）をＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（Ｃａｔ＃３７５１５）から入手した。三重の実施から得た、個々のサンプルからの計数を、該標準に対する３次スプラインフィットを用いて実際のアナライト濃度に変換した。プレート間のシグナルのばらつきを評価するために、ＱＣサンプルを使用した。
【００９４】
図８Ａに示すとおり、これらの分析の結果は、ＭＡＰ Ａβ（３−１０）／（２１−２８）構築物（構築物番号１２、図６Ａ）で免疫化した後のＰＤ３での血漿Ａβ４０における３倍を超える増加を示した。血漿Ａβ４０におけるこの増加は、単量体Ａβコンジュゲート／ＯＭＰＣワクチン構築物で免疫化された動物においては観察されなかった。特に、Ａβ（３−１０）（配列番号６９）またはＡβ（２１−２８）（配列番号７３）のいずれかを使用した免疫化は、この測定において、応答の欠如、または明らかに低い応答を示した。図８Ｂに示すとおり、これらの相違が力価レベルに無関係であったことは注目に値するものであった。
【００９５】
総合すると、これらのデータは、いくつかの構築物が、血漿Ａβレベルを上昇させるそれらの能力に関して、他の免疫原性構築物と比較した場合の利点を有することを示している。免疫原性断片のこの選択性（すなわち、血漿Ａβレベルを上昇させうること）は本発明の前には示されておらず、先行技術から予測できなかった、と当業者は理解するであろう。したがって、免疫化後に血漿Ａβを上昇させる、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原（８−ｍｅｒまたはＭＡＰ）の特定は、ワクチン構築物において使用する８−ｍｅｒまたはＭＡＰを選択するための方法を提供するものである。本発明の結果として、当業者は該ワクチン構築物を定量的（すなわち、免疫原性）および定性的（すなわち、ポリクローナル抗体応答の性質−血漿Ａβレベルを上昇させる能力）の両方で特徴づけることが今や可能となった。さらに、本発明は８アミノ酸Ａβ断片に限定されるものではなく、Ａβに対して反応性である宿主生物におけるポリクローナル抗体応答を誘導しうる任意の抗原を含む、と当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、Ａβのエピトープを特定するために直鎖状ペプチドの走査（ｓｃａｎ）を行うために選択した、Ａβ（１−４２）（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１）から誘導された８アミノ酸の合成ペプチド（８−ｍｅｒ）（配列番号２〜３６）を示す。
【図２Ａ】図２は、ＫＬＨ（図２Ａ）およびＯＭＰＣ（図２Ｂ）に対するコンジュゲート化のために選択した８−ｍｅｒを示す。
【図２Ｂ】図２は、ＫＬＨ（図２Ａ）およびＯＭＰＣ（図２Ｂ）に対するコンジュゲート化のために選択した８−ｍｅｒを示す。
【図３】図３は、第１（ＰＤ１）、第２（ＰＤ２）および第３（ＰＤ３）の投与後の、図２に記載の選択したＡβコンジュゲートの免疫原性を示す。
【図４Ａ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ａは、抗Ａβモノクローナル抗体６Ｆ３Ｄ（これはＡβのアミノ酸８−１７を認識する）の免疫反応性を示す。染色パターンはこのヒト脳における広範なアミロイド病変を示している。
【図４Ｂ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ｂは、免疫前の該免疫モルモットの免疫前血清に対する、この同じ脳の免疫反応性の欠如を示す。
【図４Ｃ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ｃは、免疫後の免疫モルモットの血清の免疫反応性を示す。
【図５】図５は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価直鎖状８−ｍｅｒペプチドを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例１．Ｊおよび１．Ｋ）。
【図６Ａ】図６は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価分枝状ＭＡＰコンジュゲートを示す。図６Ａは代表的な２価ＭＡＰを示し、図６Ｂは代表的なブロモアセチル−システインＭＡＰを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例２）。
【図６Ｂ】図６は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価分枝状ＭＡＰコンジュゲートを示す。図６Ａは代表的な２価ＭＡＰを示し、図６Ｂは代表的なブロモアセチル−システインＭＡＰを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例２）。
【図７】図７は、アジュバントとしてのＭｅｒｃｋミョウバンのみ又はＭｅｒｃｋミョウバン＋ＩＭＸ（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に製剤化されたＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（１−１８）ペプチドの第１（ＰＤ１）または第２（ＰＤ２）の注射の後の、アカゲザルから集めた血清の抗Ａβ４０力価を示す。
【図８Ａ】図８はＡβコンジュゲートの投与の後の血漿Ａβレベルの増加を示す。図８Ａは、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）を含むＭＡＰ構築物の投与の後の、単量体構築物Ａβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）（□，構築物番号１２、図６Ａ；●，Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、▲，Ａβ（２１−２８）（配列番号７３）と比較した場合の、３倍を超える上昇を示す。
【図８Ｂ】図８はＡβコンジュゲートの投与の後の血漿Ａβレベルの増加を示す。図８Ｂは、血漿Ａβレベルが力価レベルに無関係であることを示している（□，構築物番号１２、図６Ａ；●，Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、▲，Ａβ（２１−２８）（配列番号７３））。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド形成性疾患、特にアルツハイマー病の予防および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行的な記憶障害および認知低下により特徴づけられる。その特徴的な病変はアミロイド沈着（老人斑）、神経原線維変化および特定の脳領域におけるニューロン喪失である。アミロイド沈着は４０〜４３アミノ酸残基のアミロイドベータペプチド（Ａβ）から構成され、これはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。神経原線維変化は高リン酸化タウタンパク質の細胞内線維状凝集物である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：６３０−６３１，１９９７）。
【０００３】
ＡＤの病因は完全には理解されていないが、多因性事象であると予想される。脳組織内のＡβの蓄積および凝集は、アミロイドカスケード仮説としても公知のとおり（Ｇｏｌｄｅ，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１５：８４−８７，１９９５）、疾患過程において中心的な役割を果たすと考えられている。この仮説によれば、Ａβ、特にＡβ４２は、小さなオリゴマーから、大きな伸長した前線維（ｐｒｏｆｉｂｒｉｌｅ）構造体に至る、種々の形態の凝集物を形成する傾向にある。これらの凝集物は神経毒性であり、該疾患の初期段階における記憶喪失および認知低下に関連したシナプス病態を引き起こす（Ｋｌｅｉｎら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２５：５６９−５８０，２００４）。最近の刊行物は、三重トランスジェニックマウスモデルにおけるＡβの減少が細胞内タウ沈着をも妨げることを示唆している（Ｏｄｄｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎｅｕｒｏｎ，４３：３２１−３３２，２００４）。この知見は、細胞外アミロイド沈着が、ニューロン喪失を引き起こしうる後続の神経原線維のもつれ形成の原因となりうることを示唆している。
【０００４】
Ａβ抗原でのＡＰＰトランスジェニックマウスの免疫化は脳Ａβ沈着を減少させ、疾患の進行を軽減しうる。これはＳｈｅｎｋら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：１７３−１７７，１９９９により最初に報告され、現在では、種々のトランスジェニック動物モデル、種々の能動ワクチンおよびＡβ特異的モノクローナル抗体での受動免疫を含む多数の研究により裏付けられている（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃｋら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。これらの動物データに合致して、凝集前（ｐｒｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）Ａβ（１−４２）免疫原（ＡＮ１７９２，Ｂｅｔａｂｌｏｃ）での能動免疫を既に受けていた患者からの死後ヒト脳組織の、３つの公開されている評価は、老人斑の局所的消失を示した（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．．１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）。総合すると、このデータは、Ａβ抗原に対する抗体応答を有効に惹起するワクチンが、ＡＤにおいて見出される病的老人斑に対して有効であることを示している。しかし、ワクチンまたは抗体の効力のメカニズムは依然として明らかでない。
【０００５】
公共の領域（公有財産）における、免疫療法に基づく最も進んだＡＤ対策は、アジュバントＱＳ−２１（商標）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）と共に投与される凝集前（ｐｒｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）Ａβ（１−４２）から構成されるワクチンであるＡＮ１７９２（Ｂｅｔａｂｌｏｃ）を使用する能動免疫第ＩＩ相ワクチン治験であった。２００２年１月に、４名の患者が、髄膜脳炎に合致した症状を示した際に、この研究は打ち切られた（Ｓｅｎｉｏｒ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１：３，２００２）。最終的に、治療された２９８名中１８名の患者が髄膜脳炎の徴候を現した（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。脳炎と抗体価との間に相関性は存在しなかった。この作用の考えられうる原因メカニズムは自己免疫原、特に、Ａβ４２ペプチドの中央およびカルボキシ末端部分に対するＴ細胞の活性化であったと報告されている（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：４１５−４２２，２００３）。この結論を支持するものとして、脳炎を発症した２名のワクチン被投与者からの脳組織の死後検査は、一方の患者においてはＣＤ４＋Ｔ細胞の相当な髄膜浸潤を示し（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．．９：４４８−４５２，２００３）、もう一方の患者においてはＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋Ｔ細胞を示した（Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）。
【０００６】
現在の証拠は、受動または能動免疫後の血漿Ａβレベルの増加が、後の脳Ａβの減少の前兆としての末梢流出（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｓｉｎｋ）の開始を反映することを示唆している。末梢流出は、末梢への中枢Ａβの正味の流出を引き起こす、脳および血漿Ａβ貯蔵の平衡における変化を意味する（例えば、Ｄｅａｎｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５：１１４９５−１１５０３，２００５；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８：８９３１−８９３２，２００１を参照されたい）。他の研究は、抗Ａβ免疫療法後に観察された血漿Ａβのこの増加が中枢Ａβの後続の減少の実現に必要であることを示唆している（Ｃｒｉｂｂｓら，７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＤ／ＰＤ，Ｓｏｒｒｅｎｔｏ，Ｉｔａｌｙ，２００５）。したがって、血漿Ａβレベルの上昇をもたらす免疫応答を生成しうるいずれかの能動ワクチン免疫原が、アルツハイマー病および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連障害の治療に有用であると予想される。
【０００７】
驚くべきことに、本出願人は、自己Ｔ細胞応答を回避するためにＴ細胞エピトープを除去する抗原が免疫原性であり血漿Ａβレベルを上昇させることを見出した。これは、安全かつ有効なＡＤワクチンを得る可能性を意味する。本出願人は、ＡＤワクチンとして使用するためのそのような抗原および製剤を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
１つの実施形態において、本発明は、Ａβに対する抗体の形態で免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含む医薬組成物を提供する。１つの態様においては、この組成物はＡβの直鎖状の８アミノ酸のペプチド（８−ｍｅｒ）を含む。もう１つの態様においては、この組成物は、少なくとも１つのスペーサーが介在する多価直鎖状８−ｍｅｒ、または多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）を含む。該医薬組成物はＡＤおよび関連アミロイド疾患用のワクチンとして使用されうる。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、血漿Ａβレベルを上昇させるＡβに対する抗体の形態で免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含むＡβ血漿上昇性物質である。該医薬組成物は、ＡＤ、および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連アミロイド疾患用のワクチンとして使用されうる。
【００１０】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、コンジュゲートを形成するよう担体分子に連結されており、ここで、該担体は、該Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を惹起するのを補助する。本発明の好ましい実施形態においては、該担体はナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＳ）である。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態においては、該医薬組成物は、医薬上許容されるアジュバントと共に投与される。好ましい実施形態においては、該アジュバントはアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント，ＭＡＡ）、またはサポニン系アジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００１２】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に関連した疾患の予防または治療方法を提供する。そのような疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群、認知障害または他の形態の老人性痴呆が含まれる。該方法は、直鎖状の８アミノ酸のペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在する多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を投与することを含む。好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含有する多価直鎖状ペプチドを含む。より好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価分枝状ＭＡＰ、Ａβ（３−１０）／（２１−２８）コンジュゲート、構築物番号１２、図６Ａを含む。
【００１３】
そのような方法は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するＴ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片の有効量を、治療を要する患者に投与することを含む。該抗体応答は血漿Ａβレベルを上昇させうる。この実施形態のもう１つの態様においては、投与する免疫原性断片は担体分子に連結されている。この実施形態の更にもう１つの態様においては、該免疫原性断片をアジュバントと共に投与する。
【００１４】
定義
「８−ｍｅｒ」なる語は、Ａβの断片、天然Ａβペプチドの類似体またはペプチド模倣体のに対応する８アミノ酸のペプチドを意味する。１以上の８−ｍｅｒを少なくとも１つのスペーサーと組合せて、多価直鎖状ペプチドを形成させ又は多価分枝状ＭＡＰを形成させることが可能である。
【００１５】
「Ａβ」コンジュゲートなる語は、担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニンまたはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）に化学的または生物学的に連結された、Ａβの８−ｍｅｒまたは免疫原性断片を意味する。
【００１６】
「Ａβペプチド」なる語は、直鎖状８−ｍｅｒ、少なくとも１つのスペーサーを含有する多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を含む（これらに限定されるものではない）、本明細書に記載のＡβペプチドのいずれかを意味する。
【００１７】
「エピトープ」なる語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次フォールディング（三次折り畳み）により配置された不連続的なアミノ酸または連続的なアミノ酸の両方から形成されうる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に対する露出に際しても維持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、変性溶媒での処理に際して失われる。Ｔ細胞エピトープは、宿主ＭＨＣ分子と複合体を形成しうるペプチドよりなる。ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対するＴ細胞エピトープはＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導をもたらし、一般には、９〜１１アミノ酸残基を含み、一方、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に対するエピトープはＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導をもたらし、典型的には、１２以上のアミノ酸残基を含む（Ｂｊｏｒｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６−５１２，１９８７；Ｍａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ ７５：６９３−７０８；ＢａｔａｌｉａおよびＣｏｌｌｉｎｓ；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１８１−２０７−６２２．１９９５；Ｍａｄｄｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：５８７−６２２．１９９５）。Ｔ細胞と違い、Ｂ細胞は僅か４アミノ酸長のペプチドを認識しうる。Ｔ細胞活性化を引き起こすためにＴ細胞受容体により認識されるのはＴ細胞エピトープ／ＭＨＣ複合体である。
【００１８】
本明細書中で用いる「Ａβの免疫原性断片」または「Ｔ細胞応答を欠く、Ａβの免疫原性断片」なる語は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるがその応答に自己抗原Ａβに対するＴ細胞応答を含まない８−ｍｅｒまたはＡβ断片を意味する。
【００１９】
「免疫学的」または「免疫」または「免疫原性」応答なる語は、脊椎動物個体における抗原に対する体液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはその分泌産物により媒介される）応答を意味する。そのような応答は、免疫原の投与により誘導される能動応答、または抗体の投与により誘導される受動応答でありうる。
【００２０】
「多価ペプチド」なる語は、２以上の抗原決定基を有するペプチドを意味する。
【００２１】
「医薬組成物」なる語は、哺乳動物個体への投与に適した化学的または生物学的組成物を意味する。本明細書中で用いる場合、それは、アジュバントの存在下または非存在下で投与される本明細書に記載の８−ｍｅｒ、Ａβの免疫原性断片およびＡβコンジュゲートを含む組成物を意味する。
【００２２】
発明の詳細な説明
既に記載されているとおり、前臨床研究は、抗Ａβポリクローナル抗体応答をもたらす能動免疫が、アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＡＤに関連した病的症状および認知症状に対する有効性をもたらすことを示唆している（Ｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，６：９１６−９１９，２０００；Ｊａｎｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９７９−９８２，２０００；Ｍｏｒｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９８２−９８５，２０００；ＤｅＭａｔｔｏｓら，Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：８８５０−８８５５，２００１；Ｂａｃｓｋａｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７８７３−７８７８，２００２；Ｗｉｌｃｏｃら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２３：３７４５−３７５１，２００３）。これらの前臨床研究は、能動免疫原としてＡβ４２の凝集形態を使用した単一の臨床試験により裏付けられている。この研究からの予備的証拠は、病理学的（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４；Ｍａｓｌｉａｈら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４：１２９−１３１，２００５）および認知的な改善（Ｇｉｌｍａｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６４（９）：１５５３−１５６２，２００５）が治療後に見られたことを示唆している。これらの治験は励みになるものであり、また、前臨床研究に合致しているが、該治療は安全でないことが判明し、治療患者の約６％に髄膜脳炎が現れた後に打ち切られた（Ｏｒｇｏｇｏｚｏら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４，２００３）。したがって、有害な安全性の問題を伴わずに有効な免疫応答をもたらしうる能動免疫法が必要とされている。
【００２３】
この予備臨床試験における有害事象の性質の理解が進みつつある。現在、数名の研究者が、死後評価の際のＣＤ４＋およびＣＤ８＋陽性髄膜浸潤物の存在を報告しており（Ｎｉｃｏｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２，２００３；Ｆｅｒｒｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，１４：１１−２０，２００４）、これは自己ペプチドＡβ４２に対するＴ細胞応答を示唆している。しかし、かなりの程度の抗体応答（Ｂ細胞媒介性）を維持しつつ自己Ｔ細胞応答を回避する必要性を当業者が認識しているものの、この性質を有する物質を得るための手段は公知でない。この難題は、予測のための動物モデル、またはこれらの活性に関する予測のための妥当性を有する他の前臨床アッセイが存在しないことにより、より一層深刻となる。
【００２４】
この目的のために、本出願人は、本発明に使用するペプチドを設計するためにＴおよびＢ細胞エピトープの種々の性質を用いた。直鎖状ペプチドのサイズを８アミノ酸に限定し、必要に応じて、いずれかの潜在的なＣ末端Ｔ細胞エピトープアンカー残基を除去することにより、ワクチン構築物を設計した。
【００２５】
したがって、本発明の１つの態様は、ＡＤワクチンとして使用するための、免疫原性であるがＴ細胞エピトープを欠くＡβ断片の特定である。本出願前には、Ａβペプチドのどのアミノ酸断片が、Ｔ細胞エピトープを欠くと同時に免疫原性応答を引き起こすのかが明らかには知られていなかった。この分野における従前の教示は、例えば、８−ｍｅｒが免疫原性応答をもたらすことを予測させるものではなく、また、Ａβペプチドの別の領域からの断片の有用性を識別させるものではないと、当業者は理解するであろう。例えば、米国特許第６，８０８，７１２号および第６，７８７，１４４号を参照されたい。
【００２６】
本明細書における本発明のもう１つの態様は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導し血漿Ａβレベルを上昇させる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片を含むＡβ血漿上昇性物質の特定を含む。そのような物質は、ＡＤワクチンとして、および脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる関連アミロイド疾患に対して使用されうる。本出願人の発明の前には、Ａβのどの免疫原性断片が血漿Ａβレベルの上昇をもたらすのかが公知でなく、かつ、予測可能でなかった。いずれの理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載のＡβ血漿上昇性物質は、Ａβ消失の末梢流出説によれば血漿Ａβのレベルの上昇およびそれに続く脳Ａβの減少をもたらす、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するよう作用すると考えられている。さらに、個々の８−ｍｅｒまたはＡβの免疫原性断片は、血漿Ａβレベルを上昇させるよう免疫応答を誘導しうるが、本出願人は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価分枝状ＭＡＰであるＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）が、その構成単量体構築物であるＡβ（３−１０）（配列番号６９）またはＡβ（２１−２８）（配列番号７３）の場合と比較して血漿Ａβレベルの上昇において特に有効であることを見出した。
【００２７】
アミロイド疾患
本発明は、アミロイド沈着の蓄積により特徴づけられる疾患の予防および治療のための組成物および方法を提供する。アミロイド沈着は、不溶性塊へと凝集したペプチドを含む。該ペプチドの性質は疾患によって様々であるが、ほとんどの場合、該凝集物はβプリーツシート構造を有し、コンゴ・レッド（Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ）色素で染色される。アミロイド沈着により特徴づけられる疾患には、早発性および遅発性の両方のアルツハイマー病（ＡＤ）が含まれる。どちらの疾患においても、アミロイド沈着は、罹患個体の脳内に蓄積する、アミロイドベータ（Ａβ）と称されるペプチドを含む。したがって、「アミロイド疾患」なる語は、脳Ａβレベルの上昇により特徴づけられる疾患をも意味する。
【００２８】
治療用物質
本発明において使用する治療用物質はＡβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導する。免疫応答の誘導は、Ａβに対して反応性の抗体またはＴ細胞を誘導するために免疫原を投与した場合のように能動的であることが可能であり、あるいはそれ自体が個体内のＡβに結合する抗体を投与した場合のように受動的であることが可能である。
【００２９】
ＡＤのようなアミロイド疾患の予防または治療において使用する治療用物質には、Ａβのペプチド断片が含まれ、これは、天然に存在する形態（すなわち、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４２、Ａβ４２またはＡβ４３）のいずれかでありうる。これらの配列は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｄｙら，ＴＩＮＳ ２０：１５５−１５８，１９９７を参照されたい。
【００３０】
本明細書中で用いる治療用物質は、好ましい実施形態においては、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片である。Ａβの免疫原性断片は８−ｍｅｒ、少なくとも１つのＰＥＧスペーサーを有する多価直鎖状Ａβコンジュゲート、または多価分枝状ＭＡＰ Ａβコンジュゲートの形態でありうる。該治療用物質は医薬組成物の形態で投与されうる。もう１つの実施形態においては、該治療用物質は、個体における血漿Ａβレベルを上昇させる、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるＡβ血漿上昇性物質である。そのような物質は、天然に存在するペプチド断片を含むことが可能であり、あるいは１以上の置換、付加または欠失を含むことが可能であり、合成アミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含みうる。断片および構築物は、本明細書中の実施例に記載のアッセイにおいて、予防および治療効力に関してスクリーニングされうる。
【００３１】
好ましい実施形態においては、該治療用物質はＡβのペプチド断片を含むが、そのような物質は、Ａβに対する有意なアミノ酸配列類似性を必ずしも有さないが尚もＡβの模倣体として作用し類似した免疫応答を誘導しうるペプチドおよび他の化合物をも含みうる。例えば、βプリーツシートを形成するペプチドおよびタンパク質を、本明細書に記載の本発明に対する適合性に関してスクリーニングすることが可能である。同様に、コンビナトリアル（組合せ）ライブラリーおよび他の化合物を、本発明に対する適合性に関してスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
そのような特定された治療用物質は、免疫原としてのその使用を促進する担体に化学的または生物学的に連結されうる。そのような担体には、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、オボアルブミン、破傷風毒素タンパク質、または他の病原性細菌、例えばジフテリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コレラもしくはエイチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に由来するトキソイド、または弱毒化毒素誘導体が含まれる。本発明の好ましい実施形態においては、該担体はナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＳ）である。
【００３３】
本発明は、所望によりアジュバントと共に投与される、担体に連結されていてもよい８−ｍｅｒまたはＡβの免疫原性断片を含む医薬組成物における、そのような治療用物質の使用をも含む。適当なアジュバントには、アルミニウム塩（ミョウバン）、脂質、例えば３ デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、またはサポニン系アジュバントが含まれる。好ましい実施形態においては、該アジュバントはアルミニウムアジュバント（Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント，ＭＡＡ）、またはサポニン系アジュバント（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ Ｌｔｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
【００３４】
治療計画
ＡＤまたは他のアミロイド疾患の予防または治療処置のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、他の投薬、および処置が治療用（すなわち、疾患症状の発現後）であるか予防用（すなわち、疾患症状の発現を予防するためのもの）であるかを含む（これらに限定されるものではない）多数の要因に応じて様々なものとなろう。好ましい実施形態においては、患者はヒトであり、治療用物質を注射により投与する。
【００３５】
使用する免疫原または治療用物質の量は、アジュバントを同時または連続的に投与するかどうかにも左右され、アジュバントの非存在下では、より高い用量を使用する。
【００３６】
投与する免疫原または治療用物質の量は様々となるが、注射当たりペプチド０．５〜５０μｇ（Ａβペプチド含量に基づく）の範囲の量がヒトに対する使用に想定される。本明細書に記載のタイプの抗原を含む組成物の製剤化方法は当業者に公知であろう。
【００３７】
投与計画は、初回免疫、およびそれに続く、一定の間隔を空けた追加（ブースター）注射よりなるであろう。初回免疫と追加免疫との間の間隔、追加注射間の間隔、および追加免疫の回数は、該ワクチンにより惹起される抗体価および持続時間に左右されるであろう。それは、抗体応答の機能的効力、すなわち、ＡＤの発生を予防するのに必要な抗体価のレベル、あるいはＡＤ患者において発揮される治療効果にも左右されるであろう。典型的な計画は１、２および６ヶ月の時点の初期の一連の注射よりなるであろう。もう１つの計画は１および２ヶ月の時点の初期の注射よりなるであろう。いずれの計画の場合も、抗体価および持続時間に応じて、追加注射を６ヶ月または１年ごとに行うことになろう。投与計画は、患者における免疫応答のモニターにより判断して必要に応じて実施することも可能である。
【００３８】
ＡＤワクチンエピトープの特定
免疫原性応答を得るためにはＡβペプチドのどの８アミノ酸断片（「８−ｍｅｒ」）で十分なのかを決定するために、本出願人は、天然に存在するＡβ配列（配列番号１）に由来する小さな（８アミノ酸）の重複合成ペプチド（図１（配列番号２〜３７）に示すとおり）でＡβ４２の全長を系統的にスキャン（走査）した。Ａβ４２の全長に及ぶ２９個の重複する８アミノ酸ペプチドを、抗原として使用するために合成した（図２Ａ）。可溶性を改善するために、該ペプチドの幾つかを三重リシン（ＫＫＫ）（配列番号５２、５３、５４、５６、５９、６０、６２、６４および６５）もしくはグルタミン（ＥＥＥ）（配列番号５０、５１および６１）残基の付加またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（配列番号５５および６３）スペーサーの使用により修飾した。この理由により、残基（１１−１８）および（１３−２０）に対応するＡβの配列に伸長するペプチドは、複数の形態のものとして製造した。その第１のものは６−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）スペーサー＋Ｎ末端における化学的架橋用の官能基を有し、その他のものはＡｈａおよびＣ末端における官能基を有する。対照として、より長いペプチドＡβ（１−１８）を含めた。
【００３９】
本明細書に記載の免疫原性断片は、天然に存在する（すなわち、野生型）または合成されたＡβ（配列番号１）あるいはその突然変異または変異に由来する８−ｍｅｒペプチド（８アミノ酸残基）でありうる。そのような突然変異または変異は、当業者に公知の合成または組換え手段により得られうる。そのような変異体の一例として、野生型Ａβの１位および２位が変異している、Ａβ（１−４２）に対応するＥＶ基質（ＥＶＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ）（配列番号６６）が挙げられる。
【００４０】
ワクチン製剤において使用するＡβコンジュゲート
ワクチンの製剤化に使用するＡβコンジュゲートの選択は８−ｍｅｒの免疫原性に基づくものであった。ヒトＡβ配列と同一の配列を有する種における８−ｍｅｒの免疫原性を決定するために、２９個のペプチド（図２Ａ）をＫＬＨにコンジュゲート化してＡβコンジュゲートを形成させ、モルモットにおいて試験した（図３）。対照免疫原として、Ａβ（１−１８）−ＫＬＨ（配列番号３７）をこの分析に含めた。
【００４１】
モルモットを、実施例３．Ｂに記載のとおり、ミョウバン＋５０μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中に製剤化されたコンジュゲート化免疫原で免疫化した。非免疫原性Ａβ４２断片から免疫原性のものを区別するために、モルモットを３週間隔で３回免疫化した。各免疫化の３週間後、血液サンプルを集め、Ａβ４０ペプチドに対する抗体価に関してＥＬＩＳＡにより試験した。これらの力価を、それぞれ第１投与後（ＰＤ１）、第２投与後（ＰＤ２）および第３投与後（ＰＤ３）として図３に示す。
【００４２】
最初の注射後（ＰＤ１）、いくつかのペプチド領域が、１８−ｍｅｒ対照と同様に、明らかな抗体価を惹起した。特に、Ａβアミノ酸１−８、２−９、３−１０、１７−２４、２１−２８および３３−４０に対応するＡβコンジュゲートは全て、１：８００を超える力価を示した。二回目の注射後（ＰＤ２）、該Ａβコンジュゲートのうちの１５個が、１：１０００を超える抗体価を惹起した。第３投与後（ＰＤ３）の分析は更に、Ａβの或る領域がその他のものより免疫原性であることを証明した。１１個の領域が、１：６０００より大きな力価を示した。これらには、Ａβアミノ酸１−８、３−１０、７−１４、１１−１８、１３−２０、１５−２２、１９−２６、２１−２８、２３−３０、２７−３４および２９−３６に対応する領域が含まれた。これらの領域のうち、領域１−８、１５−２２、２１−２８、２３−３０および２９−３６を含む５個は高度に免疫原性（＞１：１００００）であった。Ａβの或る８−アミノ酸領域は高度に免疫原性であり、一方、他の領域（例えば、５−１２、２５−３２、３１−３８および３５−４２）は非免疫原性（力価＜１：３００）であることを、このデータは示唆している。また、該ＡβコンジュゲートはＡβ４０ペプチド特異的抗体応答を惹起することが可能であったが、Ａβの全ての断片が同等に免疫原性であったわけではないことを、これらの結果は示している。
【００４３】
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートの免疫反応性
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートでの免疫化の後にモルモットから得た免疫血清がヒトＡＤに関連していることを示すために、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートで免疫化したモルモットからのポリクローナル血清の免疫原性を評価するための研究を行った。Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートの第２注射の４週間後にモルモットから集めた血清サンプルを免疫組織化学法によりヒトＡＤ脳組織に対する反応性に関して試験した（実施例４）。
【００４４】
図４に示すとおり、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートにより生じた免疫原性応答はヒトＡＤ脳組織に対する抗体応答をもたらした。図４Ａはモノクローナル抗Ａβ抗体６Ｆ３Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の免疫反応性を示す。示されているとおり、この脳は、ヒトＡＤに典型的であると予想される様態の広範なＡβ沈着を有する。図４Ｂは免疫前モルモットからの血清の免疫反応性の欠如を示す。図４Ｃは、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ（配列番号４０）コンジュゲートの２回の注射の後のこの同じモルモットからの血清の陽性免疫反応性を示す。総合すると、このデータは、ＥＬＩＳＡにより見出された免疫原性が、このＡＤ組織において見出されたヒトＡβに対する有意な抗体応答を含むことを示している。これらの結果は、Ａβの個々の断片により付与される示差的免疫原性の予想外の知見を証明し拡張して、この応答が治療用途に合致した様態でもたらされることを示している。
【００４５】
ＯＭＰＣコンジュゲートおよび多抗原コンジュゲートの作製
モルモットにおける免疫原性、Ａβ４２アミノ酸配列内のペプチド断片の相対位置、Ａβ断片の溶解度、および担体タンパク質としてのＯＭＰＣの使用の実施可能性に基づき、ＯＭＰＣコンジュゲート化のための幾つかの８−ｍｅｒ（図２Ｂ）を選択した。これらのペプチド断片はＡβの以下のアミノ酸領域に対応した：１−８、２−９、３−１０、７−１４、１７−２４、２１−２８および３３−４０。
【００４６】
本発明は、例えば図５、６Ａおよび６Ｂに示されているような多価ペプチドコンジュゲートを含む。多価分枝状ＭＡＰ−ＯＭＰＣコンジュゲート（図６Ａおよび６Ｂ）は、リシンに基づく骨格を使用することにより作製し、一方、多価直鎖状８−ｍｅｒ−ＯＭＰＣコンジュゲート（図５）は、ＰＥＧリンカーを使用して調製した。ＰＥＧリンカーは、本発明において同様に使用されうる通常のアミノ酸リンカーと比較して、より低い免疫原性およびより大きなペプチド溶解度という利点をもたらす、と当業者は理解するであろう。本発明の好ましい実施形態においては、該免疫原性断片は、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化された多価ＭＡＰである。そのようなコンジュゲート化はペプチド：担体の１：１の比ではない、と当業者により理解されるはずである。むしろ、複数のペプチドが球状に各ＯＭＰＣ分子に結合する。さらに、多価直鎖状構築物およびＭＡＰの使用は溶解度、製剤安定性、免疫原性およびポリクローナル応答の多様性を増大させる、と当業者により理解されるであろう。
【００４７】
ＯＭＰＣコンジュゲートワクチンの免疫原性
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの免疫原性を評価するために、およびこのワクチン構築物に伴うアジュバントの利益を更に評価するために、アカゲザルにおける研究を開始した。アカゲザルを、Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント（ＭＡＡ）またはＭＡＡおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のいずれかにおいて製剤化されたＡβ（１−１８）−ＯＭＰＣコンジュゲート（Ａβペプチド含量に基づく用量）でワクチン接種した。血液サンプルを集め、これを使用してＡβ４０に対する抗体価を決定した。第１投与後（ＰＤ１）、ミョウバン中の５μｇのワクチンを投与したサルは、検出可能な力価を生成しないが、ミョウバン中の３０μｇのワクチンを投与したサルは低いＡβ４０特異的力価を生成することを、この進行中の研究の暫定的分析は示した。ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤を投与した全てのサルは有意な抗体価を生成した。第２投与後（ＰＤ２）、ミョウバンの単体中のＡβコンジュゲートの両方の用量は、類似した力価レベルを生成し、一方、ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を投与したコホートは、ミョウバン単体のコホートより１０倍高い抗体価を生成した。この研究の結果は、Ａβ−ＯＭＰＣコンジュゲートが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明した。該データは更に、そのようなコンジュゲートワクチンの効力が、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）により、有意に増強されることを示した。
【００４８】
実施例
【実施例１】
【００４９】
Ａβコンジュゲートの製造
この実施例は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導するためのＡβコンジュゲートのために後に使用するＡβペプチド断片の製造を記載する。
【００５０】
Ａ．Ａβ（８−ｍｅｒ）ペプチド（配列番号３７〜６５；図２Ａ）の製造
マレイミド誘導体化担体タンパク質に対するコンジュゲート化を意図した、カルボキシ末端にシステイン残基を有するペプチドを合成した。コンジュゲート化中の担体タンパク質への立体的接近可能性を最小にするための構造要素として、一次ペプチド配列とカルボキシ末端システインとの間にスペーサーＡｈａ（６−アミノヘキサン酸）を組込んだ。また、ＥＥＥ、ＫＫＫまたはＰＥＧにより表される可溶化残基を配列１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９内のＣ末端に導入した。Ｏ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）−ウンデカエチレングリコール［Ｆｍｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１０ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ］としてＰＥＧ単位を導入した。
【００５１】
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂から出発して、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から提供されたＦｍｏｃ化学法を用いて、自動ペプチド合成装置で固相合成によりＡβペプチドを製造した。合体後、樹脂に結合したペプチドを脱保護し、樹脂から切断した（９４．５％ トリフルオロ酢酸、２．５％ １，２−エタンジチオール、１％ トリイソプロピルシランおよび２．５％ Ｈ２Ｏの混合物を使用して行った）。２時間の処理の後、該反応物を濾過し、濃縮し、得られた油をエチルエーテルでトリチュレーションした。該固体生成物を濾過し、５０％ 酢酸／Ｈ２Ｏに溶解させ、凍結乾燥させた。該半純粋生成物の精製を、Ｃ−１８支持体上で０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／アセトニトリル勾配を用いるＲＰＨＰＬＣにより行った。画分を分析用ＨＰＬＣにより評価した。純粋な画分（＞９８％）をプールし、凍結乾燥させた。アミノ酸分析および質量分析により同一性が証明された。
【００５２】
Ｂ．Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号３７−６５；図２Ａ）の製造
ＫＬＨコンジュゲートを製造するために、Ｃ末端システインを含有するＡβペプチド（８−ｍｅｒ）２ｍｇを１ｍｌの市販のマレイミドコンジュゲート化バッファー（８３ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に懸濁させた。市販のマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のサンプル２ｍｇを該ペプチドに加え、２５℃で４時間反応させた。１００，０００Ｄａ透析管を使用するＰＢＳバッファーに対する徹底的な透析により、該コンジュゲートを未反応ペプチドおよび試薬から分離した。該コンジュゲート内に取り込まれたペプチドの量を、７０時間の酸加水分解の後のアミノ酸分析により評価した。ペプチド濃度は０．２４〜０．０３ｍｇ／ｍｌであると決定された。
【００５３】
Ｃ．ブロモアセチル化Ａβペプチド（配列番号６７−７７；図２Ｂ）の合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ自動合成装置上でアミノ酸を導入するために二重カップリング法を用いる標準的なｔ−Ｂｏｃ固相合成により、ブロモアセチル化ペプチドを製造した。ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂から出発して、カルボキシ末端アミノ酸ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを導入し、ついで該配列内のアミノ酸を導入した。これらの配列の全てにスペーサーとしてＡｈａを導入し、配列３５および３７においては、水性可溶化を補助するためにＰＥＧ単位を導入した。Ｏ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘキサエチレングリコール［Ｂｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ］としてＰＥＧ単位を導入した。該アミノ末端を酢酸のカップリングによりキャップ化した。一次配列の合体後、カルボキシ末端リシンのイプシロンアミノ基上のＦｍｏｃ保護基をピペリジンでの処理により除去した。ついでＮεアミノ基を溶媒としての塩化メチレン中のブロモ酢酸無水物と３０分間反応させた。脱保護、および樹脂からの該ペプチドの取り出しを、液体フッ化水素酸および捕捉剤としての１０％ アニソールでの処理により行った。０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いる逆相Ｃ−１８シリカカラム上の分取ＨＰＬＣにより該ペプチドを精製した。分析用ＨＰＬＣおよび質量分析により該ペプチドの同一性および均一性が証明された。
【００５４】
Ｄ．ブロモアセチル化二価ＭＡＰ（構築物番号８、図６Ａ）の合成
ブロモアセチル化分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）の合成は、実施例１．Ｃに記載されているものと同様である。ＭＢＨＡ樹脂へのカルボキシ末端Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ［ｉｖＤｄｅ＝１，（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル］のカップリングの後、ピペリジンを使用してα−アミノＦｍｏｃ保護基を除去し、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの導入を行いながら合成を継続した。ｔ−Ｂｏｃ基の脱保護の後、該配列を以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｅで伸長させ、ＡＢＩ合成装置上で酢酸をカップリングさせることによりアミノ末端をキャップ化した。側鎖リシンＦｍｏｃ保護基をピペリジンで除去し、リシンのＮεアームをＡＢＩ合成装置上で以下の保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄの導入により伸長させ、酢酸をカップリングすることによりアミノ末端をキャップ化した。ジメチルホルムアミド中の５％ ヒドラジンでの５分間の処理によりｉｖＤｄｅ保護基の除去を行って、カルボキシ末端リシン上に非遮蔽Ｎεアミノ基を得、これをブロモ酢酸無水物で更に修飾した（実施例１．Ｃに記載されているとおり）。樹脂からの該ペプチドの切断、その後続の精製および特徴づけは、実施例１．Ｃに記載されているとおりである。
【００５５】
Ｅ．ブロモアセチル化ＭＡＰ（構築物番号１１および１２、図６Ａ）の合成
ＭＡＰ構築物番号１１および１２を、実施例１．Ｄに記載されているとおりに製造した。
【００５６】
Ｆ．システイン多価ＭＡＰ（構築物番号９、図６Ａ）の合成
ＭＢＨＡ樹脂から出発して、以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ｃ、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、ＥをＡＢＩ自動合成装置上で合体させ、ついで酢酸とのカップリングを行った。リシンのＮεアミノＦｍｏｃ保護基を除去し、以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄを導入しながら合成を継続し、ついで酢酸とのカップリングを行った。実施例１．Ｃと同様にして、樹脂に結合したペプチドを単離し、精製し、特徴づけした。（注）：実施例１．Ｃにおける１０％ アニソールの代わりに、ｐ−クレゾール：ｐ−チオクレゾールの１：１混合物をＨＦ切断中の捕捉剤として使用した。
【００５７】
Ｇ．システイン二価ＭＡＰ（構築物番号１０、１３および１４、図６Ａ）の合成
二価ＭＡＰ（構築物番号１０、１３および１４、図６Ａ）を、実施例６．Ｆに記載されているとおりに製造した。Ｏ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘキサエチレングリコール（ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ）としてＰＥＧ単位を導入した。
【００５８】
Ｈ．ブロモアセチル化多価ＭＡＰ（構築物番号１６、図６Ｂ）の合成
ＡＢＩ自動合成装置を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨをＭＢＨＡ樹脂にカップリングさせた。リシンのＮεアミノ基上のｔ−ＢＯＣ保護基の除去の後、該配列を以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、Ｅの導入により伸長させ、ついで酢酸のカップリングを行った。リシン上のＮα Ｆｍｏｃ保護基をピペリジンでの手動処理により除去した。該配列をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨおよび以下のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｈ、Ｈ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ｇ、Ｓ、Ｄの導入により（ＡＢＩ合成装置上で）更に修飾し、ついで酢酸のカップリングを行った。リシンＦｍｏｃ Ｎαアミノ保護基を、既に記載されているとおりに除去し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨの導入およびそれに続く以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｄ、Ｅ、Ａの導入を行いながら合成を継続し、ついで酢酸カップリングを行った。リシン上のＮα Ｆｍｏｃ保護基を除去し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔ−Ｂｏｃ）−ＯＨの導入およびそれに続く以下のｔ−ＢＯＣ保護アミノ酸：Ａｈａ、Ｖ、Ｖ、Ｇ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｇの導入を行いながら合成を継続し、ついで酢酸カップリングを行った。リシンのＮαＦｍｏｃ保護基の除去の後、樹脂に結合したペプチドを実施例１．Ｃの場合と同様にしてブロモ酢酸無水物と反応させた。最終生成物の単離および特徴づけは実施例１．Ｃの場合と同様であった。
【００５９】
Ｉ．多価ＭＡＰ（構築物番号１５および１７、図６Ｂ）の合成
ＭＡＰ Ａβコンジュゲート（構築物番号１５および１７、図６Ｂ）の合成は、実施例１．Ｆおよび１．Ｈに記載されているとおりである。
【００６０】
Ｊ．ブロモアセチル化多価直鎖状ペプチド（構築物番号１、図５）の合成
ＭＢＨＡ樹脂から出発して、実施例６．Ａに記載されているとおりにＡＢＩ自動合成装置上でｔ−ＢＯＣ化学法を用いて一次配列を合成した。カップリング試薬としてＢＯＰ試薬を使用して、Ｆｍｏｃ−ｌ−アミノ−４，７，１０−トリオキサ １３−トリデカンアミンコハク酸［Ｆｍｏｃ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ］として介在ＰＥＧ単位を手動で導入した。Ｆｍｏｃ基の脱保護に、ピペリジンを使用した。アミノ末端のブロモアセチル化は、実施例１．Ｃに記載されているとおりであった。所望の生成物の単離および特徴づけは実施例１．Ｃの場合と同様であった。
【００６１】
Ｋ．多価直鎖状Ａβペプチド（構築物番号２、５、６および７、図５）の合成
多価直鎖状Ａβペプチド（構築物番号２、５、６および７、図５）の合成は、実施例１．Ｊに記載されているとおりである。
【実施例２】
【００６２】
ＯＭＰＣへのＡβペプチドの化学コンジュゲート化
この実施例は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）Ｂ型の精製外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）への、ヒトＡβ４２に由来するペプチドの化学コンジュゲート化を示す。該カップリングの化学的本質は、ハロアセチル誘導体化ペプチドと該膜複合体のチオール誘導体化タンパク質との反応である。前記のとおりに、二価直鎖状エピトープペプチドの場合にはＮ末端上にブロモアセチル官能基を有する、あるいは一価直鎖状および分枝状ＭＡＰ形態の場合にはＣ末端上に又はリシン残基のイプシロンアミノ基を介して結合したブロモアセチル官能基を有する、アミロイドペプチドを合成した。該ＢｒＡｃ基は、６−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）からなるスペーサーにより成熟ペプチドから分離されていた。前記配列を参照されたい。代表的なペプチドであるＡβ（３−１０）に関して、コンジュゲート化を説明する。ＯＭＰＣ含有溶液の全ての操作は、標準的な無菌技術に従う層流環境中で行った。
【００６３】
Ａ．ＯＭＰＣのチオール化
例えばＰｅｄｖａｘＨＩＢ（登録商標）および肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造に用いられるＦｕ，米国特許第５，４９４，８０８号に記載されているような方法により入手可能な精製無菌ＯＭＰＣを、試薬Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、その表面の接近可能なリシン残基の一部においてチオール化した。水中のＯＭＰＣ（１１７ｍｇ）を２８９，０００×ｇ、４℃で６０分間の遠心分離によりペレット化し、上清を捨てた。窒素分散（スパージ）活性化バッファー（０．１１Ｍ ホウ酸ナトリウム，ｐＨ１１）を該遠心管に加え、該ペレットをガラス攪拌棒で取り除いた。上清をガラスＤｏｕｎｃｅホモジナイザーに移し、３０ストローク（行程）で再懸濁させた。該遠心管を洗浄し、洗液を３０ストロークでドゥーンス（ｄｏｕｎｃｅ）処理した。再懸濁化ペレットおよび洗液を、１０ｍｇ／ｍＬのＯＭＰＣ濃度となるよう、清潔な容器内で一緒にした。固体ＤＴＴおよびＥＤＴＡを窒素分散活性化バッファーに溶解させ、０．１０６ｍｇ ＤＴＴ／ｍｇ ＯＭＰＣおよび０．５７ｍｇ ＥＤＴＡ／ｍｇ ＯＭＰＣの比で反応溶液に充填した。穏やかに混合した後、ＮＡＴＨを窒素分散水に溶解させ、０．８９ｍｇ ＮＡＨＴ／ｍｇ ＯＭＰＣの比で反応に仕込んだ。遮光条件下の窒素フード内で、室温で３時間、反応を進行させた。完了時に、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー（２５ｍＭ ホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により６ｍｇ／ｍＬで再懸濁させて、ペレットを洗浄した。最終再懸濁のために、ＯＭＰＣを前記のとおりにペレット化し、窒素分散コンジュゲート化バッファー中、Ｄｏｕｎｃｅ均一化により１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。アリコートを取り出して、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイによる遊離チオール測定に付し、該バルク生成物を、使用するまで、暗所の氷上で保存した。測定されたチオール含量は０．２〜０．３μｍｏｌ／ｍＬであった。
【００６４】
Ｂ．ＯＭＰＣへのＡβペプチドのコンジュゲート化
ペプチドに対する機能性ＢｒＡｃ含量はモル比で１：１であると推定された。十分なペプチドを秤量して全チオールに対して１．６モル過剰のｂｒＡｃを得た。各コンジュゲート化において標的化される全ＯＭＰＣタンパク質は１５ｍｇであった。ペプチドを窒素分散コンジュゲート化バッファーに２．６ｍｇ／ｍＬで再懸濁させ、チオール化ＯＭＰＣ溶液にゆっくりと加えた。該反応を遮光し、室温で約２２時間インキュベートした。残留遊離ＯＭＰＣチオール基を５倍モル過剰のＮ−エチルマレイミドで室温で１８時間クエンチした。該コンジュゲート化法の全体にわたり、平行して、チオール化ＯＭＰＣのみの対照を使用した。クエンチが完了したら、コンジュゲートおよび対照を１００，０００Ｄａ分子量のカットオフの透析ユニットに移し、少なくとも５回交換するコンジュゲート化バッファーに対して徹底的に透析した。透析が完了したら、サンプルを１５ｍｌのポリプロピレン遠心管に移し、２，２８０×ｇ、４℃で５分間遠心分離して凝集物を除去した。アリコートを分析用に取り出し、該バルクを４℃で保存した。
【００６５】
Ｃ．Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの分析
ローリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイの変法により全タンパク質を測定し、コンジュゲートおよび対照のサンプルを定量的アミノ酸分析（ＡＡＡ）により分析した。ＯＭＰＣに対するペプチドのモル比を、新生ペプチド−ＯＭＰＣ結合の酸加水分解に際して遊離される特有の残基であるＳ−カルボキシメチルホモシステインの定量から決定した。該ペプチド配列には存在しないためＯＭＰＣタンパク質に特有のものである加水分解安定残基から、ＯＭＰＣ比濃度を決定した。ＳＣＭＨＣの１モル当たりにペプチドが１モルだとすると、ＳＣＭＨＣ／ＯＭＰＣの比はペプチド／ＯＭＰＣ含量と等価となった。ペプチド分子量および平均ＯＭＰＣ質量（４０，０００，０００Ｄａ）を用いて、この比からペプチドの質量ローディングを計算することが可能であろう。
【００６６】
コンジュゲート化の共有結合性を、４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により定量的に確認した。この場合、クーマシー染色コンジュゲートのバンドにおいて、対照と比較して移動度における上方へのシフトが認められた。
【００６７】
すべてのコンジュゲート化ＢｒＡｃペプチドに関する算出モルローディング比（ｍｏｌ ペプチド／ｍｏｌ ＯＭＰＣ）は以下のとおりであった。
【００６８】
【表１】
【実施例３】
【００６９】
Ａβコンジュゲートの免疫原性
この実施例は、Ａβに対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうるＡβコンジュゲートの製剤化および投与を記載する。
【００７０】
Ａ．ワクチンコンジュゲートの製剤化
Ａβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートワクチンをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で製剤化した。すべてのＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートワクチンを、ミョウバン中、第２のアジュバント、例えば、サポニン系アジュバントであるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の存在下または非存在下で製剤化した。サンプルの操作の全ては無菌条件下で行った。
【００７１】
ミョウバン製剤の場合、コンジュゲートを１倍の食塩水で、定められたペプチド濃度に希釈し、無菌食塩水（１５０ｍＭ 無菌塩化ナトリウム溶液）中で調製された９００μｇ／ｍＬ Ｍｅｒｃｋミョウバンに相当する２倍のミョウバン（Ｍｅｒｃｋ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．３９９４３）と混合する。したがって、該ワクチン中の目標濃度は４５０μｇ／ｍＬ Ｍｅｒｃｋミョウバンまたは１倍Ｍｅｒｃｋミョウバンである。動物研究のための目標ペプチド（抗原）濃度は以下のとおりであった：マウスの場合−１２．１μｇ／Ｌ（用量０．１ｍＬ）；サルの場合−１０μｇ／ｍＬまたは６０μｇ／ｍＬ（用量０．５ｍＬ）；およびモルモットの場合−１２．５μｇ／ｍＬ（用量０．４ｍＬ）。該混合物を室温で２時間インキュベートする。注射用量を得るために、ミョウバン吸収コンジュゲートを１倍のミョウバンで希釈して目標ペプチド濃度にする。第２のアジュバント、すなわち、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が必要な場合には、目標濃度は、マウス研究では１０μｇ／ｍＬ、サル研究では０、１００または２００μ／ｍＬ、そしてモルモット研究では１２５μｇ／ｍＬであった。
【００７２】
１．ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の調製
カセット膜（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔ，１０Ｋ ＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を２〜８℃で無菌食塩水溶液中に透析する。透析中に無菌食塩水溶液を２〜３回、交換する。透析の完了後、シリンジフィルター（０．２２μＭ Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジフィルター，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用してＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を濾過滅菌する。無菌の透析されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定する。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を、使用するまで、無菌条件中、２〜８℃で保存する。
【００７３】
２．Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートおよびＭｅｒｃｋミョウバン製剤
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートストックを無菌の１×食塩水溶液中に希釈する。ついで、希釈されたＡＤペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートストックを１×無菌食塩水溶液中の２×Ｍｅｒｃｋミョウバンに加え、回転盤上で室温で１時間混合する。該混合物をベンチ上で室温で１５分間静置沈降させ、ついで１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を穏やかに捨て（ミョウバンに結合したＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートの比率を決定するために上清のＵＶ分析を行う）、ペレットを無菌１×食塩水に再懸濁させる。該混合物を無菌の３ｍＬのチューブガラスバイアル中にアリコート化し、ついで、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）での最終的な製剤化まで２〜８℃で保存する。
【００７４】
３．Ａβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ワクチンの製剤化
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）での最終製剤化の前に、結合を確認し粒子安定性をモニターするために、食塩水中のＡβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンの粒径を静的（ｓｔａｔｉｃ）光散乱により測定する。１×食塩水中の無菌の透析されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を、ボルテックスしながら、無菌の１５０ｍＭ ＮａＣｌ中のＡβペプチド−ＯＭＰＣ／ミョウバンに加える。バイアルに栓をし、キャップをし、クリンプして完全に密封する。ワクチンを、注射に使用するまで２〜８℃で保存する。注射前に、各ワクチンを３〜５分間ボルテックスする。
【００７５】
Ｂ．モルモットにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性
６〜１０週齢の雌モルモットをＨａｒｌａｎ Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＡから入手し、制度化された指針に従いＭｅｒｃｋ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設内で飼育した。すべての動物実験はＭｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。抗原をリン酸緩衝食塩水中で調製し、示されたアジュバント中で製剤化した。
【００７６】
図２Ａに示すＡβペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで、２匹／群の動物を、４０μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）の存在下、４００μｌのコンジュゲートワクチン（ペプチド含量で８μｇまたは全コンジュゲートで５０μｇ）で筋肉内に免疫化した。該免疫化は４週間隔で３回行った。血清サンプルを、初回免疫化前（前採血）および各免疫化の３週間後に集め、抗体価の測定まで４℃で保存した。標的抗原としてＡβ４０を使用するプロトコールに従うＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。
【００７７】
ＥＬＩＳＡに基づく分析は以下のとおりである。９６ウェルプレートを５０ｍＭ 炭酸水素塩バッファー（ｐＨ９．６）中の４μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌ／ウェルのＡβで４℃で一晩コートした。プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有するＰＢＳ中の３％ 脱脂乳（乳−ＰＢＳＴ）でブロッキングした。試験サンプルをＰＢＳＴ中の４倍系列で希釈した。１００μｌの希釈サンプルを各ウェルに加え、該プレートを２４℃で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴで６回洗浄した。乳−ＰＢＳＴ中の１：５０００希釈の５０μｌのＨＲＰ−コンジュゲート化二次抗体をウェルごとに加え、該プレートを２４℃で１時間インキュベートした。該プレートを３回洗浄し、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩１００μｌをウェルごとに加えた。２４℃で３０分間のインキュベーションの後、ウェルごとに１００μｌの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより該反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して該プレートを４９０ｎｍで読み取った。抗体価は、コンジュゲート対照ウェルの平均＋２標準偏差を超えるＯＤ４９０ｎｍ値を与える最高希釈度の逆数と定義した。
【００７８】
図３に示すこの分析の結果は、第１注射後（ＰＤ１）、いくつかのペプチド領域が、１８−ｍｅｒ対照と同様に、明らかな抗体価を惹起することを示した。特に、Ａβアミノ酸１−８、２−９、３−１０、１７−２４、２１−２８および３３−４０に対応するＡβペプチド断片は全て、１：８００を超える力価を示した。第２注射後（ＰＤ２）、該８−ｍｅｒコンジュゲートのうちの１５個が、１：１０００を超える抗体価を惹起した。第３投与後（ＰＤ３）の分析は更に、Ａβペプチドの或る領域がその他のものより免疫原性であることを証明した。１１個の領域が、１：６０００より大きな力価を示した。これらには、Ａβアミノ酸１−８、３−１０、７−１４、１１−１８、１３−２０、１５−２２、１９−２６、２１−２８、２３−３０、２７−３４および２９−３６に対応する領域が含まれた。これらの領域のうち、領域１−８、１５−２２、２１−２８、２３−３０および２９−３６を含む５領域は高度に免疫原性（＞１：１００００）であった。これらの結果は、８−ｍｅｒコンジュゲートがＡβ４０特異的抗体応答を惹起しうることを示している。意外にも、かつ、従前の教示に反して、Ａβの全ての断片が同等に免疫原性であったわけではなかった。実際、ある８−ｍｅｒは高度に免疫原性であり、一方、Ａβの他の領域（例えば、５−１２、２５−３２、３１−３８および３５−４２）は非免疫原性（力価＜１：３００）であることを、これらのデータは示唆している。
【００７９】
Ｃ．アカゲザルにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートならびにミョウバンおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが免疫応答を与えるかどうかを判定するために、モルモットで行った研究と比較されうる非ヒト霊長類（すなわち、アカゲザル）における研究を行った。Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＮｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の、制度化された動物取扱いプロトコールに従い、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を飼育した。
【００８０】
モデル抗原として、図２Ｂに示す以下の８−ｍｅｒ：Ａβ（１−８）（配列番号６７）、Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、Ａβ（７−１４）（配列番号７０）、Ａβ（１７−２４）（配列番号７２）、Ａβ（２１−２８）（配列番号７３）およびＡβ（３３−４０）（配列番号７４）；図５に示す以下の二価直鎖状ペプチド：Ａβ（３−１０）（７−１４）（構築物番号１）、Ａβ（３−１０）（２１−２８）（構築物番号２）、Ａβ（ｌ−８）（２１−２８）（構築物番号５）；ならびに図６Ａに示す以下の多価分枝状ＭＡＰ：Ａβ（３−１０）（７−１４）（構築物番号８）、Ａβ（ｌ−８）（２１−２８）（構築物番号１１）、Ａβ（３−１０）（２１−２８）（構築物番号１２）を含む、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβペプチドを使用した。
【００８１】
Ｍｅｒｃｋミョウバンアジュバント（ＭＡＡ）＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で製剤化されたワクチンのそれぞれの５μｇでアカゲザル（Ｎ＝３）を４週間ごとに免疫化した。血清サンプルを各注射の４週間後に集め、ＥＬＩＳＡによりＡβ特異的抗体応答に関して測定した。モルモットでの研究からの結果に合致して、すべてのコンジュゲートがサルにおいて免疫原性であることが判明した。Ａβ特異的抗体価は１回の注射に後に検出可能であり、後続の注射の後に更に増強された。試験したコンジュゲートに関しては概ね、第２または第３免疫化の後にピーク力価に達し、この場合、幾何平均力価は２５，０００〜５００，０００の範囲であった。これらの結果は、本明細書に記載のＡβコンジュゲートがＡβ特異的抗体応答を惹起しうるという知見を証明している。
【００８２】
Ｄ．アカゲザルにおけるコンジュゲートワクチンの免疫原性に対するアジュバント効果
Ａβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートおよびサポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が免疫応答の改善をもたらしうるかどうかを判定するために、非ヒト霊長類（すなわち、アカゲザル）において追加的な研究を行った。モデル抗原として、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（１−１８）ペプチドを使用した。Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＮｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の、制度化された動物取扱いプロトコールに従い、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）を飼育した。
【００８３】
１群３頭の５群のサルに以下のＡβ（１−１８）−ＯＭＰＣコンジュゲートを投与した：（１）ミョウバン中の５μｇのコンジュゲート（ペプチド含量に基づく）、（２）ミョウバン＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の５μｇのコンジュゲート、（３）ミョウバン＋５０ｍｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の５μｇのコンジュゲート、（４）ミョウバン中の３０μｇのコンジュゲート、（２）ミョウバン＋１００μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中の３０μｇのコンジュゲート。該免疫化は、第０、８および２４週に、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、０．５ｍｌのアリコートでの筋肉内注射により行った。血清サンプルを第０週（前採血）から４週間隔で集め、ＥＬＩＳＡによりＡβ４０に対する抗体価に関して試験した（前実施例に記載されているとおりに行った）。
【００８４】
ＰＤ１において、ミョウバン中の５μｇのコンジュゲートワクチンを投与したサルは、検出可能な力価を生成しないが、ミョウバン中の３０μｇのコンジュゲートワクチンを投与したサルは低いＡβ４０特異的力価を生成することを、この進行中の研究の暫定的分析は示した。ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤を投与した全てのサルは有意な抗体価を生成した。ＰＤ２において、ミョウバンの単体中のＡβコンジュゲートの両方の用量は、類似した力価レベルを生成し、一方、ミョウバン＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を投与したコホートは、ミョウバン単体の条件より１０倍高い抗体価を生成した。この研究の結果は、このＡβペプチド−ＯＭＰＣコンジュゲートが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明した。該データは更に、そのようなコンジュゲートワクチンの効力が、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）により、有意に増強されることを示している。
【実施例４】
【００８５】
モルモットポリクローナル血清の免疫反応性
８−ｍｅｒＫＬＨコンジュゲートでの免疫化の後で前記（実施例３．Ｂ）モルモットから産生された免疫血清がヒトＡＤに関連していることを判定するために、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨ免疫原で免疫化されたモルモットからのポリクローナル血清の免疫反応性を評価するための研究を行った。この構築物の第２注射の４週間後、以下の方法に従い代表的なモルモットから血液を集めた。
【００８６】
ヒトＡＤ脳切片（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）上でポリクローナル血清の反応性を評価した。ヒト脳切片は、６０℃で３０分間のインキュベーションおよびそれに続く室温で２回の５分間のキシレン洗浄により調製した。ついで切片を１００％ ＥｔＯＨに２回（それぞれ５分間）浸漬し、ついでｄｄＨ２Ｏに５分間浸漬した。切片を９９％ ギ酸に３分間浸漬し、ついでｄｄＨ２Ｏ中で手短に洗浄し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に５分間浸漬した。ついで切片をペルオキシダーゼブロッカーと共に１０分間インキュベートし、ついでＰＢＳで５分間洗浄した。１０％ ヤギ血清に対する１０分間の曝露およびそれに続くＰＢＳでの５分間の洗浄により、切片をブロッキングした。ついで切片を希釈モルモット血清と共に４℃で一晩または室温で１時間インキュベートした。５分間のＰＢＳでの洗浄の後、切片を希釈ビオチン化ヤギ抗モルモットＩｇＧまたはビオチン化ウマ抗マウス抗体（５ｍｌ ＰＢＳ中の１滴）と共に１０分間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で５分間洗浄し、ついでＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ ＡＢＣキット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳで５分間洗浄した。ついで切片をＤＡＤ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で５分間染色し、ｄｄＨ２Ｏで洗浄した。ついで切片をヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、段階的なＥｔＯＨおよびキシレン（７０％ ＥｔＯＨで５分間、８０％ ＥｔＯＨで５分間、１００％ ＥｔＯＨで５分間およびキシレンで５分間）で脱水させた。ついで切片をカバーガラスで覆い、光学顕微鏡検査により評価した。
【００８７】
Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲートにより生じた免疫原性応答はヒトＡＤ脳組織に対する抗体応答をもたらした。図４に示すとおり、このヒト脳切片は、ヒトＡＤに予想されるものに典型的な様態の広範なＡβ沈着を有する。免疫前モルモット血清は、この組織に曝露された場合の免疫反応性の欠如を示しているが、Ａβ（３−１０）＝−ＫＬＨ構築物の２回の注射の後、この同じモルモットからの血清の陽性免疫反応性が認められる。これらのデータは、ＥＬＩＳＡにより見出された及び図３に示された免疫原性が、このＡＤ組織において見出されたヒトＡβに対する有意な抗体応答を含むことを示している。したがって、これらの結果は、いくつかのＡβ断片による示差的免疫原性の予想外の知見を拡張して、この応答が治療用途に合致した様態でもたらされることを示している。
【実施例５】
【００８８】
Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片の特定
本発明において使用する、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原性断片を特定するために、特定の抗原に対するＴ細胞応答を評価するための方法として以下の酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いることが可能である。Ｔ細胞エピトープを有する免疫原断片は、白い膜の表面上の濃いスポットの存在により特定される。各スポットは、抗原（すなわち、免疫原性断片）に応答してインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を分泌しているＴ細胞の存在を示す。このアッセイはワクチンおよび免疫学の分野の当業者に良く知られており、例えば、Ｌａｒｓｓｏｎら，ＡＩＤＳ ３：７６７−７７７，１９９９、およびＭｗａｕら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １８：６１１−６１８，２００２を参照されたい。最近の総説はＡ．Ｅ．Ｋａｌｙｕｚｈｎｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０２：１５−３１，２００５に見出されうる。
【００８９】
ペプチドＡβ１−４０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）（アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＥＦＡＥＤＶＧ ＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ）（配列番号７８）およびＡβ１−２０（Ｓｙｎｐｅｐ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）（アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧ ＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ）（配列番号７９）に対する応答のためにアカゲザル（Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ ａｔ Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，ＬＡ）の末梢血単球（ＰＢＭＣ）を使用した。
【００９０】
精製されたモノクローナルマウス抗サルＩＦＮ−γ（クローンＭＤ−Ｉ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＴ ５２５，Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、１％ ペニシリンおよび硫酸ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、ついで９６ウェル ＨＴＳ ＩＰ無菌プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に加え、４℃で１２時間以上インキュベートした。プレートを洗浄し、Ｒ１０［ＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８７５−０９３）、１０％ ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００７０．０３，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．１％ ５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．２１９８５−０２３）、１％ １Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ＧＩＢＣＯ（登録商標）１５６３０−０８０）、１％ ２００ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、１％ １００ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１１３６０−０７０）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）］を加えた後、３７℃で少なくとも２時間のインキュベーションを行った。ＰＢＭＣを遠心分離し、Ｒ１０に再懸濁させた。ＰＢＭＣをＺ２ Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で計数した。吸引されたプレートの各ウェルに０．４μｇのＡβ １−４０、Ａβ １−２０、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ−８９０２，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，陽性対照）または希釈ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，陰性対照）を加え、ついで４０００００個のＰＢＭＣを各ウェルに加えた。プレートを湿潤ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。プレートを、５％ ＦＢＳおよび０．００５％ Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ中で洗浄した。ビオチン結合抗サルＩＦＮγポリクローナル抗体（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を同じ培地中で希釈し、各プレートに加えた。ついでプレートを４℃で１８〜２４時間インキュベートした。ストレプトアビジン−ＡＰ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｌ３０４３Ｅ，ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を同じ培地中で希釈し、洗浄されたプレートに加えた。プレートを室温で暗所にて２時間インキュベートした。濾過１−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｆｉｌｔｅｒｅｄ １−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０４２）を加え、さらに、室温で暗所にて１０分間のインキュベーションを行った。洗浄後、プレートを乾燥させ、ついでＣＣＤカメラでイメージングし、各ウェル内のスポットをコンピューターにより自動的に計数した。
【００９１】
陽性結果と判定されるためには、百万個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣ）が５５を超えていなければならず、陰性対照の４倍を超えていなければならず、これらの基準のいずれかが満たされていない場合には陰性結果と判定される、と本出願人は定めている。ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）を含むＭＡＰ構築物、またはＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）の２つの単量体構築物の両方で、アカゲザルにワクチン接種した。該ワクチン接種計画の実施中、１ヵ月間隔で３〜４ヶ月間、各アカゲザルをアッセイした。Ａβ １−４０またはＡβ １−２０に対するこれまでに記録された最高シグナルは僅か１８ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣであり、５５ ＳＦＣ／１０６ ＰＢＭＣの基準より有意に低い。したがって、すべては陰性評価となった。このことは、該ワクチンがＴ細胞応答を惹起せず、したがってＴ細胞エピトープを含まなかったという有力な証拠となる。
【実施例６】
【００９２】
血漿Ａβの上昇
５μｇのＭＡＰ Ａβ（３−１０）／（２１−２８）コンジュゲート（構築物番号１２、図６Ａ）、またはその単量体成分コンジュゲートＡβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）（担体としてのＯＭＰＣに連結されＭＡＡ＋１００μｇ ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で製剤化されたもの）で、アカゲザル非ヒト霊長類（Ｎ＝３）を免疫化した。該サル霊長類に４週間ごとにワクチン接種を行い、各注射の４週間後に血液を集め分析した。抗Ａβ４０力価および全Ａβ１−４０レベルを測定した。
【００９３】
６Ｅ１０／Ｇ２１０ ＥＬＩＳＡを用いて、これらの免疫化動物において血漿Ａβ１−４０レベルを測定した。このアッセイは、Ｎ末端捕捉抗体６Ｅ１０（Ａβ１−８）（Ｓｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）、およびアルカリホスファターゼに結合したＣ末端Ａβ４０ ｎｅｏ−エピトープ抗体（Ｇ２１０）（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、Ａβ１−４０を測定する。抗体６Ｅ１０を５μｇ／ｍｌの濃度でプレート上にコートした。希釈血漿サンプル（１：３）を５０μｌ／ウェルで三重に使用した。６Ｅ１０免疫喪失アカゲザル血漿マトリックス（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｒｈｅｓｕｓ ｐｌａｓｍａ ｍａｔｒｉｘ）中、Ａβ１−４０標準を４００ｐＭから３ｐＭまで調製した。このアッセイは約５〜２０のシグナル対ノイズ比を有する。ＣＤＰ−ｓｔａｒアルカリホスファターゼ基質をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手した。予め製剤化されたブロッキングバッファーであるＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）をＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（Ｃａｔ＃３７５１５）から入手した。三重の実施から得た、個々のサンプルからの計数を、該標準に対する３次スプラインフィットを用いて実際のアナライト濃度に変換した。プレート間のシグナルのばらつきを評価するために、ＱＣサンプルを使用した。
【００９４】
図８Ａに示すとおり、これらの分析の結果は、ＭＡＰ Ａβ（３−１０）／（２１−２８）構築物（構築物番号１２、図６Ａ）で免疫化した後のＰＤ３での血漿Ａβ４０における３倍を超える増加を示した。血漿Ａβ４０におけるこの増加は、単量体Ａβコンジュゲート／ＯＭＰＣワクチン構築物で免疫化された動物においては観察されなかった。特に、Ａβ（３−１０）（配列番号６９）またはＡβ（２１−２８）（配列番号７３）のいずれかを使用した免疫化は、この測定において、応答の欠如、または明らかに低い応答を示した。図８Ｂに示すとおり、これらの相違が力価レベルに無関係であったことは注目に値するものであった。
【００９５】
総合すると、これらのデータは、いくつかの構築物が、血漿Ａβレベルを上昇させるそれらの能力に関して、他の免疫原性構築物と比較した場合の利点を有することを示している。免疫原性断片のこの選択性（すなわち、血漿Ａβレベルを上昇させうること）は本発明の前には示されておらず、先行技術から予測できなかった、と当業者は理解するであろう。したがって、免疫化後に血漿Ａβを上昇させる、Ｔ細胞エピトープを欠く免疫原（８−ｍｅｒまたはＭＡＰ）の特定は、ワクチン構築物において使用する８−ｍｅｒまたはＭＡＰを選択するための方法を提供するものである。本発明の結果として、当業者は該ワクチン構築物を定量的（すなわち、免疫原性）および定性的（すなわち、ポリクローナル抗体応答の性質−血漿Ａβレベルを上昇させる能力）の両方で特徴づけることが今や可能となった。さらに、本発明は８アミノ酸Ａβ断片に限定されるものではなく、Ａβに対して反応性である宿主生物におけるポリクローナル抗体応答を誘導しうる任意の抗原を含む、と当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、Ａβのエピトープを特定するために直鎖状ペプチドの走査（ｓｃａｎ）を行うために選択した、Ａβ（１−４２）（配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１）から誘導された８アミノ酸の合成ペプチド（８−ｍｅｒ）（配列番号２〜３６）を示す。
【図２Ａ】図２は、ＫＬＨ（図２Ａ）およびＯＭＰＣ（図２Ｂ）に対するコンジュゲート化のために選択した８−ｍｅｒを示す。
【図２Ｂ】図２は、ＫＬＨ（図２Ａ）およびＯＭＰＣ（図２Ｂ）に対するコンジュゲート化のために選択した８−ｍｅｒを示す。
【図３】図３は、第１（ＰＤ１）、第２（ＰＤ２）および第３（ＰＤ３）の投与後の、図２に記載の選択したＡβコンジュゲートの免疫原性を示す。
【図４Ａ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ａは、抗Ａβモノクローナル抗体６Ｆ３Ｄ（これはＡβのアミノ酸８−１７を認識する）の免疫反応性を示す。染色パターンはこのヒト脳における広範なアミロイド病変を示している。
【図４Ｂ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ｂは、免疫前の該免疫モルモットの免疫前血清に対する、この同じ脳の免疫反応性の欠如を示す。
【図４Ｃ】図４は、ヒトＡＤ脳組織上の、Ａβ（３−１０）−ＫＬＨコンジュゲート（配列番号４０）で予め免疫されたモルモットから抽出した血清の交差反応性を示す。図４Ｃは、免疫後の免疫モルモットの血清の免疫反応性を示す。
【図５】図５は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価直鎖状８−ｍｅｒペプチドを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例１．Ｊおよび１．Ｋ）。
【図６Ａ】図６は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価分枝状ＭＡＰコンジュゲートを示す。図６Ａは代表的な２価ＭＡＰを示し、図６Ｂは代表的なブロモアセチル−システインＭＡＰを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例２）。
【図６Ｂ】図６は、モルモットでの研究（実施例３）における別々の８−ｍｅｒの免疫原性に基づいて選択した、代表的な多価分枝状ＭＡＰコンジュゲートを示す。図６Ａは代表的な２価ＭＡＰを示し、図６Ｂは代表的なブロモアセチル−システインＭＡＰを示す。これらのコンジュゲートは、記載されているとおりに合成し、ＯＭＰＣにコンジュゲート化した（実施例２）。
【図７】図７は、アジュバントとしてのＭｅｒｃｋミョウバンのみ又はＭｅｒｃｋミョウバン＋ＩＭＸ（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標），ＣＳＬ，Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に製剤化されたＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（１−１８）ペプチドの第１（ＰＤ１）または第２（ＰＤ２）の注射の後の、アカゲザルから集めた血清の抗Ａβ４０力価を示す。
【図８Ａ】図８はＡβコンジュゲートの投与の後の血漿Ａβレベルの増加を示す。図８Ａは、ＯＭＰＣに対してコンジュゲート化されたＡβ（３−１０）／（２１−２８）（構築物番号１２、図６Ａ）を含むＭＡＰ構築物の投与の後の、単量体構築物Ａβ（３−１０）（配列番号６９）およびＡβ（２１−２８）（配列番号７３）（□，構築物番号１２、図６Ａ；●，Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、▲，Ａβ（２１−２８）（配列番号７３）と比較した場合の、３倍を超える上昇を示す。
【図８Ｂ】図８はＡβコンジュゲートの投与の後の血漿Ａβレベルの増加を示す。図８Ｂは、血漿Ａβレベルが力価レベルに無関係であることを示している（□，構築物番号１２、図６Ａ；●，Ａβ（３−１０）（配列番号６９）、▲，Ａβ（２１−２８）（配列番号７３））。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβの免疫原性断片を含む医薬組成物であり、該Ａβ断片に対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、医薬組成物。
【請求項２】
血漿Ａβレベルを上昇させうる、請求項１記載の免疫原性断片。
【請求項３】
該免疫原性断片が、Ａβの直鎖状８アミノ酸ペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在している多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、請求項２の組成物。
【請求項４】
コンジュゲートを形成するよう組成物に連結された担体分子を更に含み、担体が、Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を促進する、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
担体分子が、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子およびナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）よりなる群から選ばれる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
担体分子がＯＭＰＣである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬上許容されるアジュバントを更に含む、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬上許容されるアジュバントが、水酸化アルミニウム、およびサポニン系アジュバントよりなる群から選ばれる、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬上許容されるアジュバントが、サポニン系アジュバントである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に関連した疾患の予防または治療方法であり、Ａβ断片に対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
免疫原性断片が血漿Ａβレベルを上昇させうる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
免疫原性断片が、Ａβの直鎖状８アミノ酸ペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在している多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
免疫原性断片が、コンジュゲートを形成するよう担体分子に連結されており、該担体が、Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を促進する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該担体分子が、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子およびナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）よりなる群から選ばれる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
担体分子がＯＭＰＣである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
コンジュゲートを、医薬上許容されるアジュバントと共に投与する、請求項１３の方法。
【請求項１７】
医薬上許容されるアジュバントが、水酸化アルミニウム、およびサポニン系アジュバントよりなる群から選ばれる、請求項１４の方法。
【請求項１８】
医薬上許容されるアジュバントが、サポニン系アジュバントである、請求項１７９の方法。
【請求項１】
Ａβの免疫原性断片を含む医薬組成物であり、該Ａβ断片に対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、医薬組成物。
【請求項２】
血漿Ａβレベルを上昇させうる、請求項１記載の免疫原性断片。
【請求項３】
該免疫原性断片が、Ａβの直鎖状８アミノ酸ペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在している多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、請求項２の組成物。
【請求項４】
コンジュゲートを形成するよう組成物に連結された担体分子を更に含み、担体が、Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を促進する、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
担体分子が、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子およびナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）よりなる群から選ばれる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
担体分子がＯＭＰＣである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬上許容されるアジュバントを更に含む、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬上許容されるアジュバントが、水酸化アルミニウム、およびサポニン系アジュバントよりなる群から選ばれる、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬上許容されるアジュバントが、サポニン系アジュバントである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者の脳内のＡβのアミロイド沈着に関連した疾患の予防または治療方法であり、Ａβ断片に対する抗体の形態の免疫応答を誘導しうる、Ｔ細胞エピトープを欠く、Ａβの免疫原性断片の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
免疫原性断片が血漿Ａβレベルを上昇させうる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
免疫原性断片が、Ａβの直鎖状８アミノ酸ペプチド（８−ｍｅｒ）、少なくとも１つのスペーサーが介在している多価直鎖状ペプチド、および多価分枝状多抗原ペプチド（ＭＡＰ）よりなる群から選ばれる、請求項１１の方法。
【請求項１３】
免疫原性断片が、コンジュゲートを形成するよう担体分子に連結されており、該担体が、Ａβ断片に対する抗体を含む免疫応答を促進する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該担体分子が、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子およびナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｅｓ）外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）よりなる群から選ばれる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
担体分子がＯＭＰＣである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
コンジュゲートを、医薬上許容されるアジュバントと共に投与する、請求項１３の方法。
【請求項１７】
医薬上許容されるアジュバントが、水酸化アルミニウム、およびサポニン系アジュバントよりなる群から選ばれる、請求項１４の方法。
【請求項１８】
医薬上許容されるアジュバントが、サポニン系アジュバントである、請求項１７９の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５４０４１７（Ｐ２００８−５４０４１７Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１００８７（Ｐ２００８−５１００８７）
【出願日】平成１８年５月１日（２００６．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２１６５６
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１日（２００６．５．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１６４８１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２１６５６
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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