ペプチド構造物およびそれらの単純ヘルペスウイルス２型の診断における使用
【課題】従来技術の問題を解決するためのペプチド構造物の提供。
【解決手段】 式（１）の複数示されたペプチド構造：［（Ｘ1）p−１６ア
ミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで「１６アミノ酸配列」は、配列
（配列番号６８）：
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ；
１０ １５
を示し、そしてここで、同じでもよいし、異なってもよいＸ1およびＸ2は、同じでもよい
し、異なってもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を表し；Ｓｐは、該コアから外向きに伸長したスペーサー基を示し；ｎは、少なくとも４であり；ｐは、０または１であり；ｑは、０または１であり；
そして該コアと該スペーサー基との間の連結は、化学的または物理的で有り得る、ペプチド構造。
【解決手段】 式（１）の複数示されたペプチド構造：［（Ｘ1）p−１６ア
ミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで「１６アミノ酸配列」は、配列
（配列番号６８）：
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ；
１０ １５
を示し、そしてここで、同じでもよいし、異なってもよいＸ1およびＸ2は、同じでもよい
し、異なってもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を表し；Ｓｐは、該コアから外向きに伸長したスペーサー基を示し；ｎは、少なくとも４であり；ｐは、０または１であり；ｑは、０または１であり；
そして該コアと該スペーサー基との間の連結は、化学的または物理的で有り得る、ペプチド構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、サンプル（特に、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に感染
していると疑われる患者から採取した血清サンプル）における単純ヘルペスウイ
ルス２型抗体の診断に関する。本発明は、この目的のために有用な複数示された
ペプチド構造物を提供し、そしてこれらのペプチド構造物を使用する診断のため
の方法およびキット、ならびに複数示されたペプチドの調製のために有用な単量
体のペプチドもまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の詳細）
単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）は、ヒ
トに感染する２つの密接に関連したウイルスである。ほとんどの１５歳を超える
人々は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に対する抗体を有し、このことは、彼らが
、これらのウイルスに感染し、かつ保有することを示す。どちらのウイルスも、
性器腔（ｏｒｏｇｅｎｉｔａｌ）病変を生じ、そしてまた目、皮膚および神経系
に感染し得る。ＨＳＶ−１は、主に口腔病変の原因となるが、ＨＳＶ−２は、主
に性器病変の原因となる。原発性の感染に続いて、ウイルスは、これが周期的に
活性化し得る、神経組織において、潜伏期に入り、再感染を生じ得る。再活性化
は、ウイルスが、散布性であり得かつ明らかな臨床的病変が欠損して感染し得る
ために頻繁に無症候性である。
【０００３】
簡単でかつ安価な、ＨＳＶ−１抗体をＨＳＶ−２抗体と区別し得る血清診断試
験の必要性が、ＷＨＯの最近の会議において認識された（１９９６）。ＨＳＶの
血清型の決定は、ワクチン接種をする前の個々の免疫学的状態を確立するために
、ＨＳＶワクチンの試みにおいて重要である。無症候性のＨＳＶ−２の感染に対
する妊娠している女性およびその性的なパートナーのスクリーニングにより新生
児ヘルペスを予防することが望まれ、そして感染を予防するために適切な推奨さ
れる予防の設計が、望まれる。
【０００４】
ＨＳＶ−２特異的血清診断試薬に対する進歩は、１０年前より以前に９２Ｋま
たはｇＧ２と呼ばれるＨＳＶ−２糖タンパク質の同定により促進された（Ｍａｒ
ｓｄｅｎら、１９７８、１９８４；Ｒｏｉｚｍａｎら、１９８４）。引き続いて
、ＨＳＶ−１の対応物であるｇＧ１が同定された。ｇＧ１およびｇＧ２をコード
する遺伝子のＤＮＡ配列の決定および比較は、２つのタンパク質が相当に異なっ
ていたことを示した。ｇＧ１およびｇＧ２の血清型特異的エピトープの存在（Ａ
ｃｋｅｒｍａｎら、１９８６；Ｆｒａｍｅら、１９８６；Ｍａｒｓｄｅｎら、１
９８４；Ｒｏｉｚｍａｎら、１９８４）は、血清型特異的診断試薬としてのｇＧ
１およびｇＧ２の使用の可能性を生じた。
【０００５】
ＨＳＶ−２特異的抗体のための種々の血清学的試験は、ｇＧ２を用いて開発さ
れてきた。これらの試験は、血清型特異的モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａ、免疫ドットブロットアッセイおよびウェスタンブロットアッセイならびに血
清ブロッキングアッセイを含む。これらの目的のために、ｇＧ２は、ＨＳＶ−２
に感染した哺乳動物細胞、形質転換した哺乳動物細胞、組換えバキュロウイルス
に感染した昆虫細胞およびいくつかの発現ベクターを用いるＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを含む種々の供給源から得た。Ｅ．ｃｏｌｉはまた、型特異的領
域を含むｇＧ２のフラグメントおよびマルトース結合タンパク質と融合したｇＧ
２のわずかに短縮された、ほぼ全長のフラグメントを発現するために用いた。こ
れらの供給源由来の抗原は、粗抽出液または続く種々の手順（イオン交換クロマ
トグラフィー、モノクローナル抗体−アフィニティークロマトグラフィーおよび
レクチン−アフィニティークロマトグラフィーを含む）による精製物のいずれか
として用いた。
【０００６】
ｇＧ２を用いる血清学的試験を通して、ウェスタンブロットは、最も確実であ
ると考えられている（ＷＨＯ会議、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、１９９５）。しかし
この方法は、わずらわしく、比較的高価であり、そして機器の整った診断研究所
以外において、一般的なスクリーニングの目的のためには適さない。単純で、安
価であり、そしてマイクロタイタープレートでのＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソ
ルベントアッセイ）のように用いられ得る確実な血清診断試験が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって以下が提供される：
（１） 式（１）の複数示されたペプチド構造：［（Ｘ1）p−１６ア
ミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで「１６アミノ酸配列」は、配列
（配列番号６８）：
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ；
１０ １５
を示し、
そしてここで、同じでもよいし、異なってもよいＸ1およびＸ2は、同じでもよい
し、異なってもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を表し；Ｓｐは、該コアから外
向きに伸長したスペーサー基を示し；
ｎは、少なくとも４であり；
ｐは、０または１であり；
ｑは、０または１であり；
そして該コアと該スペーサー基との間の連結は、化学的または物理的で有り得る
、
ペプチド構造。
（２） 前記コアと前記スペーサー基との間の前記連結が、共有結合
である、項目１に従う構造。
（３） 全体として、ペプチドの形態にある、項目１または２に従
う構造。
（４） 項目１、２または３に従う構造であって、以下の式（４）
【化１】
ここでＸ3は、アミノ酸残基であり、そして「ｐｅｐｓｅｑ」は、ペプチド（Ｘ1
）p−１６アミノ酸ペプチド−（Ｘ2）qの配列である、
構造。
（５） ｎが、４から１６である、項目１、２、３または４に従う
構造。
（６） ｐおよびｑが、共に１である、項目１、２、３、４または
５に従う構造。
（７） Ｘ1がＰｒｏであり、そしてＸ2がＳｅｒである、項目６に
従う構造。
（８） 前記スペーサー基Ｓｐが、４〜６のグリシン残基の長さと等
価な長さを有する、項目５、６または７に従う構造。
（９） 単純ヘルペスウイルス２型に対する抗体について試験するた
めの方法であって、結合反応が、該抗体と前記項目のいずれかに記載の構造と
の間で行なわれ、そして該結合の発生または程度を、それぞれ検出または測定す
る、方法。
（１０） 前記結合反応が、ＥＬＩＳＡとして行なわれる、項目９
に従う方法。
（１１） 患者から得た血清のサンプルに対して実行する、項目９
または１０に従う方法。
（１２） 患者の体液を、そこに存在する抗体について試験するため
のキットであって、（１）項目１、２、３、４、５、６、７または８に記載の
複数示されたペプチド構造；および（２）該ペプチド構造物への該抗体の結合を
検出または測定するための標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を含む、キット
。
（１３） 以下の一般式のペプチド
（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−（Ｓｐ）r
ここで、Ｘ1、Ｘ2、ｐ、ｑおよび「１６アミノ酸配列」が、項目１、６または
７において定義され、ｒが、０または１である、
ペプチドならびにそれらのアミノ基誘導体およびカルボキシル基誘導体。
（発明の要旨）
驚くべきことに、各分岐が、コアにペプチド配列を含む別々の複数の分岐とし
て内在する場合、１６アミノ酸ペプチド、より好ましくは１８アミノ酸ペプチド
が、ＨＳＶ−２抗体に対して高い特異性を有し、そして特に偽陽性または偽陰性
をほとんど与えないことが、見出された。結果的に、このようなペプチド構造は
、ＨＳＶ−２抗体の試験において、特に患者からの体液サンプルでの、および最
も特に、血清サンプルでの試験に役立つ。１６アミノ酸ペプチドは、ｇＧ２のア
ミノ酸５６２〜５７７に由来し、かつ明細書内で後に示す配列番号１の配列を有
する。さらに、このペプチドのいずれかの末端あるいは両端に少数のさらなるア
ミノ酸を含むかまたはわずかに短縮することが可能である。ｇＧ２の５６１〜５
７８アミノ酸由来の１８アミノ酸ペプチド（明細書で後に示す配列番号５５を有
する）は、最も好ましい。
【０００８】
本発明は、これが、ＨＳＶ−１糖タンパク質ｇＧ１と高い相同性を有するＨＳ
Ｖ−２糖タンパク質ｇＧ２の領域である（ＭｃＧｅｏｃｈら、（１９８７））た
めに特に驚きであり、さらに本発明のペプチドは、ＨＳＶ−２抗血清に対して高
度に特異的であり、ＨＳＶ−１の抗血清とごくわずかしか偽陽性を示さない。
【０００９】
１つの局面において、本発明は、式（１）の複数示されたペプチド構造を提供
する：［（Ｘ1）p−（１６アミノ酸配列）−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで
「１６アミノ酸配列」は、以下の配列（配列番号６８）
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ
１０ １５
を示し、そしてここで、同じであっても異なっていてもよいＸ1およびＸ2は、同
じであっても異なっていてもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を示し；
Ｓｐは、コアから外側に向かって伸長するスペーサー基を示し；
ｎは、少なくとも４であり；
ｐは、０または１であり；
ｑは、０または１であり；
そしてコアとスペ−サー基との間の連結は、化学的または物理的であり得る。
【００１０】
本発明は、ＨＳＶ−２に対する抗体の診断における本発明のペプチド構造物の
使用を含む。特に、本発明は、結合反応が、抗体と本発明のペプチド構造物との
間で行われる単純ヘルペスウイルス２型に対する抗体の試験方法を提供し、そし
て結合の存在または程度が、それぞれ検出または測定される。
【００１１】
さらに、本発明は、以下を含む、患者の体液を、そこに存在する抗体について
試験するためのキットを含む：（１）本発明の複数示されたペプチド構造物；お
よび（２）ペプチド構造物に対する抗体の結合の検出または測定のための標識さ
れた抗ヒト免疫グロブリン抗体。
【００１２】
本発明はまた、式（２）のペプチド自身：
（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−（Ｓｐ）r、ここで、「１６アミノ
酸配列」、Ｘ1、Ｘ2、ｐおよびｑは、上記の定義したものであり、そしてｒは、
０または１であり、ならびにそれらのＮ末端およびＣ末端の機能的な誘導体を含
む。
【００１３】
（好適な実施態様の説明）
本発明の複数示されたペプチド構造物は、好ましくは分岐したリジンのコアに
基づく。リジンは、ペプチド結合のために２つの部位を提供する二塩基性のアミ
ノ酸である。これらのリジンコア構造は、周知であり、Ｔａｍ（１９８８）およ
びＴａｍら（１９８９）、米国特許番号第５，２２９，４９０号（Ｔａｍ、１９
９３）、ヨーロッパ特許３３９，６９５（Ｓｔｉｃｈｔｕｎｇ ｖｏｏｒ ｄｅ
Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ）ならびにＰＣＴ公開
ＷＯ９２／１８５２８（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）
によって記載されている。これらは、本発明に用いられ得る。好ましくは、この
構造は、式（３）の全ペプチドであり：
［（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−
（Ｌｙｓ）n-1−（Ｘ3）m （３）
ここで、ｎは２aであり（ａは、２〜５の数字である）（すなわち、ｎ＝４、８
、１６、または３２）、リジン残基は分岐している（Ｌｙｓ）n-1で示され、Ｘ3
は、同じであってもよいし、異なってもよい１〜４のアミノ酸残基を示し、ｍは
０または１であり、そして他の文字は上記で定義される。好ましくは、ｐは０ま
たは１であり、ｑは０または１であり、Ｓｐは４〜６のグリシン残基の長さと等
価な長さのスペーサーであり（そして最も好ましくは、Ｓｐは実際に４〜６のグ
リシン残基を示す）、そしてｍは、０または１である。最も好ましくは、本発明
のペプチド構造物は、以下の式（４）であり：
【００１４】
【化２】
ここで、Ｘ3は、アミノ酸残基であり、そして「ｐｅｐｓｅｑ」は、上記で定義
したペプチド配列（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）qである。
【００１５】
分岐したリジンコアを用いることは、本質的なことではない。コアは、多くの
形態を取り得る。例えば、分子の残りが物理的に吸着されるかまたは化学的に結
合される（通常は、共有結合によって）固体不活性原料であり得る。それは、例
えば、直鎖状または分岐したポリマーであり得、それには例えば、トリメチロー
ルプロパンのポリエステルまたは低分子量のポリアミドもしくはポリアクリルア
ミドあるいは樹状の分岐を含むポリマー（例えば、米国特許第４，５０７，４６
６号（Ｔｏｍａｌｉａら、１９８５））が挙げられる。それは、プリントされた
回路基板またはシリコンチップのアレイであり得、それによって試験される抗体
が、ペプチド構造物に結合する場合、電荷または電流の変化が生じ、これが検出
され得る。コアへの好ましい連結は、共有結合を介してである。
【００１６】
ペプチド構造物の分子全体がアミノ酸から構成されることが、必要なわけでは
ないことが、上記より明らかであるはずである。１つの分岐と別の分岐との間の
非ペプチドコアまたは非ペプチドスペーサーあるいは非ペプチド結合が、挙げら
れ得る。しかし、ペプチド全体またはアミノ酸構造全体は、合成の観点から非常
に便利である。
【００１７】
スペーサーアームは、構造物のコアから外側に向かって伸長し、そして任意の
適合性の残基を包含する。最も好ましくは、スペーサーアーム分子はアミノ酸残
基を含む。好ましくは、スペーサーアームは、グリシン残基（これは、非電荷の
極性アミノ酸である）または非極性アミノ酸の大多数を含む。本明細書中で使用
される用語、「非極性アミノ酸」は、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロ
イシンを含む。好ましいスペーサーアームの長さは、少なくとも４つのグリシン
残基であるが、さらに短いスペーサー（例えば、１つのグリシン残基と等価な長
さ）は、小さな効果を有す。６つを超えるグリシン残基に等価な長さを持つこと
にはあまり利点がないと考えられる。なぜなら、そのような高度に可撓性の分岐
間には互いに干渉する可能性が高すぎるかもしれないからである。
【００１８】
１６アミノ酸配列の配列番号６８は、その左側（Ｎ末端）もしくは右側（Ｃ末
端）または両方のいずれかにおいて高い特異性を有するＨＳＶ−２抗体に結合す
るその能力を阻害しないいくつかのアミノ酸残基を用いて伸長され得る。これら
は、「天然」のｇＧ２配列にあり得る。従って、Ｘ1は、Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ（配列番号６９）、Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ（配列番号７０）、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ（配列番号７１
）、３アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ、２アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｐｒｏま
たは単一のアミノ酸Ｐｒｏであり得、そしてＸ2は、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ（配列番号７２）、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ（配列番号７３）、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ（配列番号７４）、
３アミノ酸配列Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ、２アミノ酸配列Ｓｅｒ Ａｌａまたは
単一のアミノ酸Ｓｅｒであり得る。あるいは、Ｘ1およびＸ2は、他のアミノ酸を
含み得、この場合、それらは、好ましくは非極性アミノ酸またはグリシンもしく
はセリンである。最も好ましくは、１６アミノ酸配列が、片方または両方の末端
の１つのアミノ酸により、特にＮ末端がＰｒｏであり、かつＣ末端がＳｅｒであ
る天然の配列の隣接するアミノ酸の片方もしくは両方により、伸長される。従っ
て、以下の１７アミノ酸配列および１８アミノ酸配列は、特に好ましい：
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１ ５
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ
１０ １５
（配列番号７５）
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ
１０ １５
（配列番号７６）
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１ ５
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ
１０ １５
（配列番号５５）
予備的な結果は、Ｃ末端またはＮ末端に伸長したペプチド配列を有するペプチ
ド構造物が、１８アミノ酸の配列番号５５を含む「ペプチド構造物５５」よりも
いくつか多い偽陽性の点から、わずかにより良くない診断結果を与えることを示
す。
【００１９】
ペプチド構造物が、全体的にペプチドである場合、ペプチド配列が由来し、か
つ実際にペプチド配列自身がペプチド構造物であるペプチドは、任意の周知であ
る上述の合成方法により作製され得るが、特に持続的なフローバージョンである
Ｆｍｏｃ法が、特に簡便である。
【００２０】
本発明は、抗体（特に、任意の適切な液体の、特に、抗体を含むような体液の
の検出に適切な任意の方法において実行され得る。血清は、通常の体液であるが
、免疫グロブリンを含む他の液体（例えば、涙、唾液または乳汁）が、アッセイ
され得る。
【００２１】
通常の試験において、このアッセイは、マイクロプレートのプラスチック表面
のような不溶性キャリアに、本発明のペプチド構造物を付着させることにより不
均一に実施されるが、本発明は、そのようなアッセイに限定されない。サンドイ
ッチアッセイにおいて、抗血清は、結合可能にする適切な期間ペプチド構造物と
インキュベートされ、そして免疫グロブリンに対する抗体と適切な期間インキュ
ベートされる。従って、例えば、患者が、ヒトであり、そして抗体が、ＩｇＧク
ラスの抗体であると仮定して、適切に標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、プ
レートを洗浄し、そしてプレートに結合した標識の量（抗体およびペプチド構造
物を介して）を測定する。本発明は、第２の抗体として抗ヒトＩｇＭを用いてＩ
ｇＭ抗体の検出に適用し得る。あるいは、競合アッセイにおいて、血清と競合し
得るか、またはその結合から置換し得る標識された抗体の公知の量で行ない得る
。しかし、そのようなアッセイは、低濃度の抗体の検出にはやや不向きである。
任意の普通の標識（例えば、放射性標識および酵素標識）が、用いられ得る（特
に、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）。ビオチンのような間接
的な標識はまた、適切な直接標識された結合パートナー（例えば、標識ストレプ
トアビジンまたは標識アビジン）との結合において用いられ得る。放射性標識は
、放射性計数および例えば、比色シグナル、蛍光シグナルまたは化学発光シグナ
ルにより標識される酵素によりアッセイされ得る。アルカリホスファターゼ酵素
標識を必要とするＮｏｒｄｉｓｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．の「Ａｍ
ｐａｋ」（登録商標）のような検出の増幅方法は、アッセイをさらに敏感にする
（ｓｅｎｓｉｔｉｓｅ）ために用いられ得る。
【００２２】
次いで、１回のアッセイにつき使用するためのペプチド構造物の量（例えば、
プレートの１ウェルにつき）は、通常は１μｇ未満、好ましくは０．１μｇ未満
、そして好ましくは０．０５〜０．５μｇである。任意の特定の場合、最も適切
な量は、関連するペプチド構造物の性質に依存する。
【００２３】
このアッセイを行なうためのキットにおいて、この基本的な成分は、ほとんど
の場合、本発明のペプチド構造物および抗ヒト免疫グロブリン標識抗体である。
これらは、もちろん通常はキット内の個別の容器内に提供される。
【００２４】
本発明は、本発明のペプチド構造物の作製において中間体として有用であるた
め、式（２）のペプチド自身を含む。例えば、分子（コアおよびスペーサー）の
残りに結合させるために準備したスペーサーを欠いたペプチド（すなわち、ｒが
０である）を提供するために便利であり得る。これは、供給業者からコアとスペ
ーサーを得るためにより便利である場合、特にコアとスペーサーが、ペプチド結
合によってＣ末端のペプチドに結合させるために用意されたアミノエチル基のよ
うなペンダント基を含む非アミノ酸ポリマーである場合、特に有用である。ある
いは、このペプチドは、コアに結合するために用意されたスペーサー（式（２）
においてｒ＝１）を用いて合成され得る。このような好ましいペプチドは、上述
のように、１８アミノ酸ペプチドの配列の配列番号５５が最も好ましい。
【００２５】
本発明にはまた、特にカルボキシ保護基およびアミノ保護基を有するペプチド
、アミノ酸側鎖がｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護され、かつＮ末端が、９
−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）により保護されるペプチドを特
に含むこのようなペプチドの誘導体が含まれる。本発明は、エステル、（特にペ
ンタフルオロフェニルエステル、特にスペーサーを欠いたペプチド（ｒ＝０）の
ために）のような、「反応性の」Ｃ末端基を有するペプチドをさらに含む。「反
応性の」とは、それらとアミド結合を形成するためのスペーサーの遊離アミノ基
と反応し得ることを意味する。他のこのような反応誘導体は、当該分野で周知で
あり、かつ本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００２７】
（実施例）
（材料および方法）
（血清および予備的血清学）
合計１７４の血清標本を１１８個体から採取した。これらのうち、１５５の血
清を１００人の患者から採取した。対の血清を、これらの患者のうち５５人から
採取した。さらに１８の血清を、ＨＳＶとは関連しない種々の状態の１８人の子
供から採取した。エジンバラで採取した血清のＨＳＶ特異的抗体の力価を、補体
結合アッセイ（Ｓｍｉｔｈら、１９６７）によって決定し、一方で、グラスゴー
で採取した血清における力価を、抗ＨＳＶ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（「Ｅｎ
ｚｇｎｏｓｔ」［登録商標］、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使
用してスクリーニングした。血清が採取されたＨＳＶ感染患者は、成人の平均年
齢が約２７歳、および男女ほぼ同数であった。
【００２８】
（ウイルス単離およびタイプ分け）
全てのウイルス単離物を、１つが患者の口唇から単離された単離物であること
除いて、生殖器病変から得た。ウイルスは、タイプ特異的モノクローナル抗体の
パネル（「Ｓｙｖａ Ｍｉｃｒｏ Ｔｒａｃｋ」［登録商標］、Ｂｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、間接蛍光によってタイプ分けした
。
【００２９】
（ペプチド合成）
ｇＧ２の予測されるオープンリーディングフレームのアミノ酸２１〜６９９に
またがる、一連の６７のペプチド（大部分は、１０アミノ酸が重複する１８アミ
ノ酸長）を連続フローＦｍｏｃ化学によって合成した。残基１〜２０は、成熟タ
ンパク質から切り出されるシグナル配列を含むと考えられたため、これらは合成
しなかった。このペプチドを、本発明の複数の提示されたペプチド構造物として
作製した。各々の構造は、分岐したリジンコア上で範囲が定まった各アミノ酸配
列の４つのコピーからなる（Ｔａｍ、１９８８）が、このようなアミノ酸配列の
各々は、感度を増加させるために、４つのグリシン残基によりコアから分離され
る。このようなペプチド構造物は、式（５）：
【００３０】
【化３】
によって表され得る。ここで、「ｐｅｐｓｅｑ」は、処方物内の各存在における
同じアミノ酸配列を示し、そして以下の表１および配列識別番号１〜６７の１文
字表記で示されるペプチドの配列から選択される。それらを、製造業者によって
記載される標準的なＦｍｏｃ手順および製造業者の指示に従うカップリング試薬
としてＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，
３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート］またはＴＢＴＵ［
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル
ウロニウム テトラフルオロボレート］のいずれかを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚ
ｕ ＰＳＳＭ−８ペプチド合成機で作製する。ペプチドを、逆相ＨＰＬＣによっ
て分析し、そして少なくとも８０％純粋であることを判断する。
【００３１】
【表１】
（実施例１：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
血清を、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２ｔ）の短縮型バージョンおよびｇ
Ｇ２ペプチド配列を含むペプチド構造物を用いて反応性について試験した。ＨＳ
Ｖ−１の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ１）およびＨＳＶ−２の糖タンパク質（ｇＤ２）
は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方によって惹起される抗体によって認識さ
れる多くのエピトープと非常に相同性である。糖タンパク質Ｄもまた、免疫優性
タンパク質である。これらの２つのｇＤの特性によって、ｇＤが高感度になり、
かつＨＳＶ特異的抗体の診断のための有用な試薬になる。短縮型形態は、ｇＤの
最初の３２６アミノ酸を含むが、カルボキシ末端の膜貫通ドメインを欠失し、結
論として細胞から分泌される。この特性は、分泌タンパク質を細胞膜からｇＤ全
体を精製するよりも、細胞培養培地からより容易に精製し得るために、都合がよ
い。しかし、この特性は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２抗体の間を識別しない。
ｇＤ２ｔ（チャイニーズハムスター卵巣細胞中でＤＮＡからの発現後に均質にま
で精製された）を、６６０μｇ／ｍｌの濃度でＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃ
ｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によ
って提供した。これを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、そして
マイクロタイターウェル（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ １、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、５
０μｌ中０．５μｇまたは０．２５μｇでコーティングするために使用した。
【００３２】
ペプチド構造物（表１を参照のこと）を可能であるときは常に水に溶解した。
水不溶性のペプチド構造物を、３０％酢酸（配列番号７、８、１２、１４、１５
、２１、２５、２６、６２の配列を有するペプチド構造物）中、またはペプチド
構造物水懸濁物によってアンモニア蒸気の少量（２ｍｌ）を通気することによる
かのいずれかで可溶化した。その際に、ペプチド構造物は、透明な溶液を形成し
た（配列番号１６、１７および１８の配列を有するペプチド構造物）。次いで、
可溶化したペプチド構造は、本文中に示される濃度までＰＢＳ中に希釈し、そし
て５０μｌをウェルに添加した。ｇＤ２ｔおよびペプチド構造物の両方を、４℃
で一晩プレートに吸着させた。抗原溶液をプレートから除去し、そしてプレート
上の占有されていない結合部位を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１．５〜２時間ブロ
ッキングした。ウェルを０．０５％「Ｔｗｅｅｎ ２０」を含む１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（「ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ」）（Ｔｗｅｅｎは、登録商標である）で６回
洗浄し、そして本文中に示したように希釈した５０μｌの血清とともに、旋回式
シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で室温で１．５時間インキュベー
トした。血清を取り除き、そしてウェルをさらに６回「ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ」
で洗浄した。抗体の結合を検出するために、順に、ウェルを５０μｌのビオチン
化ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１／１０００希釈）および５０μｌ
のストレプトアビジン結合体化セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ、１／１０００希釈）とともに、各々１．５時間３７℃でインキュベートし
、次いで、ＮａＣｌ−「Ｔｗｅｅｎ」で６回洗浄した。０．０１％過酸化水素含
有クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中（５０μｌ）、色素産生性基質である
ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤＡ）を添加し、そして１０分
後、５０μｌの２Ｎ 硫酸（ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を添加することに
よって、発色を停止させた。プレートを、４９２ｎｍで「Ｔｉｔｅｒｔｅｋ」マ
ルチスキャンプレートリーダーで読みとった。
【００３３】
（結果）
（血清のサブセットに対する、全てのペプチドの予備スクリーニング）
この最初の実験において、全てのペプチド構造物を、２４の血清のセットに対
してスクリーニングした。ウイルスを単離した患者由来の４つの血清は１型であ
ることが見いだされ、そして抗体陽性であり、ＣＦ力価は１６〜２５６の範囲で
あった。ウイルスを単離した患者由来の１５の血清は２型であることが見いださ
れ、そして抗体陽性であり、ＣＦ力価は１６〜２５６の範囲であった。３つの血
清は、ウイルス単離においてＨＳＶ感染の実験的証明がなされず、および抗体陰
性である患者由来であった。２つの血清は抗体陰性であったが、ウイルスが単離
された患者由来のものであった：ＨＳＶ−１を一方の患者から培養し、そしてＨ
ＳＶ−２を他方の患者から培養した。この血清もまた、ｇＤ２ｔ（５００ｎｇ／
ウェル）に対してスクリーニングし、ＨＳＶ特異的抗体の存在を確認した。抗原
を全く有さないＰＢＳで処理したウェルを、コントロールとして供した。最初の
スクリーニングにおいて、ウェルを１．０μｇのペプチドでコーティングし、そ
して４９２ｎｍでの吸光度値を記録した。
【００３４】
ＨＳＶ−２に対して特異的なペプチドは、以下の特性を有するべきである。Ｈ
ＳＶ−２感染によって惹起された抗体を含む血清と反応すべきである。さらに、
このペプチドはＨＳＶ特異的抗体を含まない血清またはＨＳＶ−２感染の非存在
下でＨＳＶ−１感染によって惹起された抗体を含む血清と反応すべきではない。
【００３５】
このペプチドの反応性について任意の先のデータの非存在下で、このデータは
、２つの方法によって分析された。第１の方法において、ＨＳＶ抗体陽性と陰性
血清との間を識別するために適切な値として供され得るという根拠に基づいて、
０．２５のカットオフ値が選択された。ペプチド配列（配列番号３、７、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１７、２１、２６、５５、５７、６２、および、
６６、６７）を含むペプチド構造物のみが、１５のＨＳＶ−２血清全てと０．２
５より大きな吸光度値を生成した一方で、配列（配列番号３９、５０、５１、５
５、５６、６３および６４）を含むペプチド構造物のみが、５つの抗体陰性血清
全てと０．２５未満の吸光度値を与えた。そして配列番号３８、５０および５５
の配列を含むこのペプチド構造のみが４つのＨＳＶ−１血清すべてと０．２５未
満の吸光度値を与えた。従って、「ペプチド構造物５５」（配列番号５５の配列
を有する）のみが、ＨＳＶ−２抗体特異的試薬に必要な、上記の規定された基準
の全てを満たした。第２の方法において、コントロールのＰＢＳコーティングウ
ェルでの各血清の吸光度値を、ペプチドコーティングウェルでの吸光度値から差
し引き、そして０．１のカットオフ値を選択した。配列番号７、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１７、２３、２６、３９、５７、６２、６６および６７の
配列を含むペプチド構造物のみが、１５のＨＳＶ−２血清全てと０．１より大き
な吸光度値を生成した一方で、配列番号５０、５１、５５、５６および６４の配
列を含むペプチド構造物のみが、５つの抗体陰性血清すべてと０．１未満の吸光
度値を与えた。そして配列番号３７、３８、３９、５０、５５および６４の配列
を含むペプチド構造物のみが、４つのＨＳＶ−１血清全てと０．１未満の吸光度
値を与えた。従って、ペプチドのいずれもが全ての基準を満たさなかった。しか
し、５つの抗体陰性血清全てかつ４つのＨＳＶ−１血清全てと０．１未満の吸光
度値を与えた配列番号３９、５０、５５および６４の配列を含む４つのペプチド
構造物のうち、配列番号３９、５０および６４の配列を有するペプチド構造物は
、１５のＨＳＶ−２血清のうち、それぞれ、５、１、および４つと反応性を示し
た。一方で、「ペプチド構造物５５」は、１５の血清のうち１４と反応性を示し
た。従って、「ペプチド構造物５５」は、ＨＳＶの型特異的血清診断のためのあ
り得る候補物と考えられた。
【００３６】
（実施例２：使用されるペプチドおよび血清の量の最適化）
図面の図１を参照すると、ウェルを、本発明のペプチド構造物５５の４つの異
なる量でコーティングした：５μｇ（四角）、１μｇ（菱形）、１００ｎｇ（丸
）および１０ｎｇ（三角）。７つの血清を２０倍に希釈し、次いで、６回さらに
２倍希釈した。ペプチド構造物および／または血清を欠くウェルをコントロール
（４つの四角格子）として供した。３つのＨＳＶ−２血清について（ＣＦ力価１
６、２５６、および１６）の結果ならびに３つのＨＣＶ−１血清について（ＣＦ
力価８未満、２５６、および１６）の結果を図１に示す（パネルＡ、Ｃ、Ｅ＝Ｈ
ＳＶ−２；Ｂ、ＤおよびＦ＝ＨＳＶ−１）。ＨＳＶ−２血清は全て、ペプチド構
造物５５でコーティングしたウェルとより大きな反応性を示したのに対して、Ｈ
ＳＶ−１血清は、ＰＢＳコントロールでみられるバックグラウンドレベルを超え
て、ペプチド構造物５５と反応しなかった。全部で４つの濃度のペプチド構造物
５５を試験したが、血清との反応性は非常に類似した。１：４０以下で希釈した
場合、１より大きな吸光度が生成されるか、またはより少なく、そしてプラトー
に達するようであった。対照的に、血清ＣおよびＥの両方は、より低い反応性を
示し、そして曲線の形状は、より高い反応性がより低く希釈した血清で達成され
得ることを示唆した。より低いペプチド量でさえも使用され得るか否かを調べる
ために、ウェルを、１００ｎｇ〜５ｐｇの範囲の異なる量でコーティングし、そ
して血清ＡおよびＥとの反応性について試験した。５ｎｇ／ウェル未満では、シ
グナルに顕著な減少が認められ、１００ｐｇ未満では、全く応答が認められなか
った（データは示さず）。
【００３７】
（実施例３）
これらの観察に基づいて、次いで、全ての血清を１００ｎｇおよび１０ｎｇの
ペプチド構造物５５でコーティングしたウェル上およびｇＤ２ｔでコーティング
したウェル上でスクリーニングした：ｇＤ２ｔの量を２５０ｎｇ／ウェルまで減
少させて、ほぼ、１００ｎｇのペプチド構造物でみられるシグナルまで減少させ
た。血清を５倍、１０倍、および２０倍の希釈物で試験した。ペプチド構造物も
タンパク質も含まないウェルを、全ての血清の希釈物に含めた。
【００３８】
（カットオフ値の確立）
ＨＳＶ陰性コントロールとして使用した２１の血清を、エジンバラからの３つ
およびグラスゴーからの１８で構成した。それらを、ＨＳＶに関連するいずれの
臨床的兆候も示さないことおよびＥＬＩＳＡまたは補体結合アッセイ（実施例１
の方法を参照のこと）における反応性がないかによって陰性の判断をした。血清
を５倍希釈し、そしてｇＤ２ｔ（２５０ｎｇ）またはペプチド構造物５５（１０
０ｎｇもしくは１０ｎｇのいずれか）または抗原なし（ＰＢＳコントロール）で
コーティングしたウェル上でＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ｇＤ２ｔ
および１００ｎｇのペプチド構造物５５についてのデータを、図２に示す。平均
＋５×標準偏差に対応するカットオフ値（ｇＤ２ｔについては０．１６６そして
ペプチド構造物５５については０．１６７）を、引き続く他の血清の分析に使用
し、そして図面中、点線によって示す。
【００３９】
（ＨＳＶ陽性患者由来の血清分析）
全ての血清をペプチド５５の１００ｎｇおよび１０ｎｇの両方、２５０ｎｇの
ｇＤ２ｔならびに抗原なし（ＰＢＳコントロール）でコーティングしたウェルに
対してスクリーニングした。大部分の血清を３つの異なる希釈物でスクリーニン
グした：５倍、１０倍、および２０倍であるが、ある血清では５倍希釈物のみを
用いてスクリーニングした。各血清について、抗原なしで観察されたバックグラ
ウンド吸光度を、異なる抗原について観察された値から差し引いた。これらの補
正された値でデータセットを構築した。
【００４０】
分析のために、血清を５つのクラスにグループ分けした。クラス１および２は
臨床的病変を示す患者から採取された血清を含む：クラス１血清は、８未満のＣ
Ｆ力価を有したが、クラス２血清は、８以上のＣＦ力価を有した。クラス３およ
び４を含む血清を、最初の病変提示から７〜２０日の間（クラス３）または２０
日より後（クラス４）に採取した。クラス５の血清は、原発性病変を提示せず、
かつ以前の血清が少なくとも８のＣＦ力価を有する患者に由来した。ここで、原
発性病変は、８未満のＣＦ力価または２０日以内に４倍上昇するＣＦ力価を有す
る、臨床的に明らかな病変として規定される。
【００４１】
血清を５倍希釈し、そして最も少ない偽陽性の数を与えた１００ｎｇペプチド
でコーティングされたウェル上でスクリーニングした。これらの結果を、以下の
表２にまとめる。陽性結果を、吸光度が０．１６６を超えた場合に記録した（平
均＋５×標準偏差を用いる）。
【００４２】
【表２】
表２を参照すると、ペプチド構造物５５は、ＨＳＶ−１血清で偽陽性を与えな
かった。第２に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２血清の両方とｇＤ２ｔ、ならびに
ＨＳＶ−２血清とペプチド構造物５５との反応性は、第１の提示の時点（クラス
１および２血清）で得られた血清についての反応性について、続いてサンプリン
グされた血清（クラス３、４および５の血清）の反応性より低かった。全体とし
ては、クラス３、４および５由来のＨＳＶ−１血清の９５％（４１／４３）およ
びＨＳＶ−２血清の９８％（５０／５１）はｇＤ２ｔと反応したが、一方、ＨＳ
Ｖ−２のクラス３、４および５の血清の９２％（４７／５１）は、ペプチド構造
物５５と反応した。第３に、全て（２２／２２）のＨＳＶ−２のクラス５血清は
、ｇＤ２ｔおよびペプチド構造物５５の両方と反応した。
【００４３】
従って、ペプチド５５は、ヒト血清においてＨＳＶ−２抗体に対して完全に型
特異的であることが示され、特に、臨床的病変の最初の提示から７日の間隔後に
抗体を検出するために完全に型特異的であることが示された。
【００４４】
（実施例４）
配列番号５５のペプチド配列を含む「ペプチド構造物５５」のＮ末端およびＣ
末端での伸長に対応するさらなるペプチド構造を合成し、そして４−グリシンス
ペーサーを有する、上記の式（５）の４−分岐形態において作製した。これらを
、（ａ）１μｇ／ウェルまたは（ｂ）１００ｎｇ／ウェルでペプチド構造物また
はタンパク質を使用して、ｇＤ２ｔとともに試験した。そして各々の場合におい
て、２０倍希釈した血清を使用した。そうでなければ、条件は、実施例３と同様
であった。結果を、以下の表３に示す。ペプチド構造物５５は、ＨＳＶ−１につ
いて擬陽性を与えないという観点から最良に機能した。
【００４５】
（実施例５）
本発明の２つのペプチド構造物（ペプチド構造物５５および各末端で２つのア
ミノ酸の「天然」配列によって伸長されたペプチド配列を含むペプチド構造物）
を、ペプチド配列がＮ末端で伸長されたがＣ末端で短縮された（それぞれ、１０
アミノ酸および８アミノ酸）ペプチド構造物と比較した。この比較は、本発明の
１６アミノ酸コア配列の臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌｉｔｙ）を示す。３つのペプチ
ド全てを、式（５）の４−分岐、４つのグリシンスペーサー形態で作製した。そ
れらを、実施例３のようにタンパク質ｇＤ２ｔと、１００ｎｇ／ウェルのペプチ
ド構造および２５０μｇ／ウェルのタンパク質および血清の５倍希釈物と全て比
較した。本発明の２つのペプチド構造物は、全ての観点から配列番号８６の比較
ペプチド配列を有するペプチド構造よりはるかに良好に機能し、そして本発明の
ペプチド構造物が、ほとんどまたは全くＨＳＶ−１について偽陽性を与えないこ
とが認められた。
【００４６】
以下の請求の範囲は、本発明のいくつかの重要な局面を規定するが、あらゆる
考え得る局面を含むことは意図されず、そのために引き続く継続特許出願および
外国特許出願において保護が求められ得、そして本明細書で先に記載した本発明
の概念の普遍性を減ずると解釈されるべきではない。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明の方法によるＨＳＶ−２抗血清およびＨＳＶ−１抗血清の検出を示す：パネルＡ、Ｃ、Ｅ＝ＨＳＶ−２：パネルＢ、ＤおよびＦ＝ＨＳＶ−１。
【図２】図２は、ＨＳＶに感染していない個体からの血清のＥＬＩＳＡによるスクリーニングを示す。 （配列表）
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【表１−１３】
【表１−１４】
【表１−１５】
【表１−１６】
【表１−１７】
【表１−１８】
【表１−１９】
【表１−２０】
【表１−２１】
【表１−２２】
【表１−２３】
【表１−２４】
【表１−２５】
【表１−２６】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、サンプル（特に、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に感染
していると疑われる患者から採取した血清サンプル）における単純ヘルペスウイ
ルス２型抗体の診断に関する。本発明は、この目的のために有用な複数示された
ペプチド構造物を提供し、そしてこれらのペプチド構造物を使用する診断のため
の方法およびキット、ならびに複数示されたペプチドの調製のために有用な単量
体のペプチドもまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の詳細）
単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）は、ヒ
トに感染する２つの密接に関連したウイルスである。ほとんどの１５歳を超える
人々は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２に対する抗体を有し、このことは、彼らが
、これらのウイルスに感染し、かつ保有することを示す。どちらのウイルスも、
性器腔（ｏｒｏｇｅｎｉｔａｌ）病変を生じ、そしてまた目、皮膚および神経系
に感染し得る。ＨＳＶ−１は、主に口腔病変の原因となるが、ＨＳＶ−２は、主
に性器病変の原因となる。原発性の感染に続いて、ウイルスは、これが周期的に
活性化し得る、神経組織において、潜伏期に入り、再感染を生じ得る。再活性化
は、ウイルスが、散布性であり得かつ明らかな臨床的病変が欠損して感染し得る
ために頻繁に無症候性である。
【０００３】
簡単でかつ安価な、ＨＳＶ−１抗体をＨＳＶ−２抗体と区別し得る血清診断試
験の必要性が、ＷＨＯの最近の会議において認識された（１９９６）。ＨＳＶの
血清型の決定は、ワクチン接種をする前の個々の免疫学的状態を確立するために
、ＨＳＶワクチンの試みにおいて重要である。無症候性のＨＳＶ−２の感染に対
する妊娠している女性およびその性的なパートナーのスクリーニングにより新生
児ヘルペスを予防することが望まれ、そして感染を予防するために適切な推奨さ
れる予防の設計が、望まれる。
【０００４】
ＨＳＶ−２特異的血清診断試薬に対する進歩は、１０年前より以前に９２Ｋま
たはｇＧ２と呼ばれるＨＳＶ−２糖タンパク質の同定により促進された（Ｍａｒ
ｓｄｅｎら、１９７８、１９８４；Ｒｏｉｚｍａｎら、１９８４）。引き続いて
、ＨＳＶ−１の対応物であるｇＧ１が同定された。ｇＧ１およびｇＧ２をコード
する遺伝子のＤＮＡ配列の決定および比較は、２つのタンパク質が相当に異なっ
ていたことを示した。ｇＧ１およびｇＧ２の血清型特異的エピトープの存在（Ａ
ｃｋｅｒｍａｎら、１９８６；Ｆｒａｍｅら、１９８６；Ｍａｒｓｄｅｎら、１
９８４；Ｒｏｉｚｍａｎら、１９８４）は、血清型特異的診断試薬としてのｇＧ
１およびｇＧ２の使用の可能性を生じた。
【０００５】
ＨＳＶ−２特異的抗体のための種々の血清学的試験は、ｇＧ２を用いて開発さ
れてきた。これらの試験は、血清型特異的モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａ、免疫ドットブロットアッセイおよびウェスタンブロットアッセイならびに血
清ブロッキングアッセイを含む。これらの目的のために、ｇＧ２は、ＨＳＶ−２
に感染した哺乳動物細胞、形質転換した哺乳動物細胞、組換えバキュロウイルス
に感染した昆虫細胞およびいくつかの発現ベクターを用いるＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉを含む種々の供給源から得た。Ｅ．ｃｏｌｉはまた、型特異的領
域を含むｇＧ２のフラグメントおよびマルトース結合タンパク質と融合したｇＧ
２のわずかに短縮された、ほぼ全長のフラグメントを発現するために用いた。こ
れらの供給源由来の抗原は、粗抽出液または続く種々の手順（イオン交換クロマ
トグラフィー、モノクローナル抗体−アフィニティークロマトグラフィーおよび
レクチン−アフィニティークロマトグラフィーを含む）による精製物のいずれか
として用いた。
【０００６】
ｇＧ２を用いる血清学的試験を通して、ウェスタンブロットは、最も確実であ
ると考えられている（ＷＨＯ会議、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、１９９５）。しかし
この方法は、わずらわしく、比較的高価であり、そして機器の整った診断研究所
以外において、一般的なスクリーニングの目的のためには適さない。単純で、安
価であり、そしてマイクロタイタープレートでのＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソ
ルベントアッセイ）のように用いられ得る確実な血清診断試験が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって以下が提供される：
（１） 式（１）の複数示されたペプチド構造：［（Ｘ1）p−１６ア
ミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで「１６アミノ酸配列」は、配列
（配列番号６８）：
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ；
１０ １５
を示し、
そしてここで、同じでもよいし、異なってもよいＸ1およびＸ2は、同じでもよい
し、異なってもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を表し；Ｓｐは、該コアから外
向きに伸長したスペーサー基を示し；
ｎは、少なくとも４であり；
ｐは、０または１であり；
ｑは、０または１であり；
そして該コアと該スペーサー基との間の連結は、化学的または物理的で有り得る
、
ペプチド構造。
（２） 前記コアと前記スペーサー基との間の前記連結が、共有結合
である、項目１に従う構造。
（３） 全体として、ペプチドの形態にある、項目１または２に従
う構造。
（４） 項目１、２または３に従う構造であって、以下の式（４）
【化１】
ここでＸ3は、アミノ酸残基であり、そして「ｐｅｐｓｅｑ」は、ペプチド（Ｘ1
）p−１６アミノ酸ペプチド−（Ｘ2）qの配列である、
構造。
（５） ｎが、４から１６である、項目１、２、３または４に従う
構造。
（６） ｐおよびｑが、共に１である、項目１、２、３、４または
５に従う構造。
（７） Ｘ1がＰｒｏであり、そしてＸ2がＳｅｒである、項目６に
従う構造。
（８） 前記スペーサー基Ｓｐが、４〜６のグリシン残基の長さと等
価な長さを有する、項目５、６または７に従う構造。
（９） 単純ヘルペスウイルス２型に対する抗体について試験するた
めの方法であって、結合反応が、該抗体と前記項目のいずれかに記載の構造と
の間で行なわれ、そして該結合の発生または程度を、それぞれ検出または測定す
る、方法。
（１０） 前記結合反応が、ＥＬＩＳＡとして行なわれる、項目９
に従う方法。
（１１） 患者から得た血清のサンプルに対して実行する、項目９
または１０に従う方法。
（１２） 患者の体液を、そこに存在する抗体について試験するため
のキットであって、（１）項目１、２、３、４、５、６、７または８に記載の
複数示されたペプチド構造；および（２）該ペプチド構造物への該抗体の結合を
検出または測定するための標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を含む、キット
。
（１３） 以下の一般式のペプチド
（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−（Ｓｐ）r
ここで、Ｘ1、Ｘ2、ｐ、ｑおよび「１６アミノ酸配列」が、項目１、６または
７において定義され、ｒが、０または１である、
ペプチドならびにそれらのアミノ基誘導体およびカルボキシル基誘導体。
（発明の要旨）
驚くべきことに、各分岐が、コアにペプチド配列を含む別々の複数の分岐とし
て内在する場合、１６アミノ酸ペプチド、より好ましくは１８アミノ酸ペプチド
が、ＨＳＶ−２抗体に対して高い特異性を有し、そして特に偽陽性または偽陰性
をほとんど与えないことが、見出された。結果的に、このようなペプチド構造は
、ＨＳＶ−２抗体の試験において、特に患者からの体液サンプルでの、および最
も特に、血清サンプルでの試験に役立つ。１６アミノ酸ペプチドは、ｇＧ２のア
ミノ酸５６２〜５７７に由来し、かつ明細書内で後に示す配列番号１の配列を有
する。さらに、このペプチドのいずれかの末端あるいは両端に少数のさらなるア
ミノ酸を含むかまたはわずかに短縮することが可能である。ｇＧ２の５６１〜５
７８アミノ酸由来の１８アミノ酸ペプチド（明細書で後に示す配列番号５５を有
する）は、最も好ましい。
【０００８】
本発明は、これが、ＨＳＶ−１糖タンパク質ｇＧ１と高い相同性を有するＨＳ
Ｖ−２糖タンパク質ｇＧ２の領域である（ＭｃＧｅｏｃｈら、（１９８７））た
めに特に驚きであり、さらに本発明のペプチドは、ＨＳＶ−２抗血清に対して高
度に特異的であり、ＨＳＶ−１の抗血清とごくわずかしか偽陽性を示さない。
【０００９】
１つの局面において、本発明は、式（１）の複数示されたペプチド構造を提供
する：［（Ｘ1）p−（１６アミノ酸配列）−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−コア、ここで
「１６アミノ酸配列」は、以下の配列（配列番号６８）
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ
１０ １５
を示し、そしてここで、同じであっても異なっていてもよいＸ1およびＸ2は、同
じであっても異なっていてもよい１〜６の非干渉アミノ酸残基を示し；
Ｓｐは、コアから外側に向かって伸長するスペーサー基を示し；
ｎは、少なくとも４であり；
ｐは、０または１であり；
ｑは、０または１であり；
そしてコアとスペ−サー基との間の連結は、化学的または物理的であり得る。
【００１０】
本発明は、ＨＳＶ−２に対する抗体の診断における本発明のペプチド構造物の
使用を含む。特に、本発明は、結合反応が、抗体と本発明のペプチド構造物との
間で行われる単純ヘルペスウイルス２型に対する抗体の試験方法を提供し、そし
て結合の存在または程度が、それぞれ検出または測定される。
【００１１】
さらに、本発明は、以下を含む、患者の体液を、そこに存在する抗体について
試験するためのキットを含む：（１）本発明の複数示されたペプチド構造物；お
よび（２）ペプチド構造物に対する抗体の結合の検出または測定のための標識さ
れた抗ヒト免疫グロブリン抗体。
【００１２】
本発明はまた、式（２）のペプチド自身：
（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−（Ｓｐ）r、ここで、「１６アミノ
酸配列」、Ｘ1、Ｘ2、ｐおよびｑは、上記の定義したものであり、そしてｒは、
０または１であり、ならびにそれらのＮ末端およびＣ末端の機能的な誘導体を含
む。
【００１３】
（好適な実施態様の説明）
本発明の複数示されたペプチド構造物は、好ましくは分岐したリジンのコアに
基づく。リジンは、ペプチド結合のために２つの部位を提供する二塩基性のアミ
ノ酸である。これらのリジンコア構造は、周知であり、Ｔａｍ（１９８８）およ
びＴａｍら（１９８９）、米国特許番号第５，２２９，４９０号（Ｔａｍ、１９
９３）、ヨーロッパ特許３３９，６９５（Ｓｔｉｃｈｔｕｎｇ ｖｏｏｒ ｄｅ
Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｎ）ならびにＰＣＴ公開
ＷＯ９２／１８５２８（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）
によって記載されている。これらは、本発明に用いられ得る。好ましくは、この
構造は、式（３）の全ペプチドであり：
［（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）q−Ｓｐ］n−
（Ｌｙｓ）n-1−（Ｘ3）m （３）
ここで、ｎは２aであり（ａは、２〜５の数字である）（すなわち、ｎ＝４、８
、１６、または３２）、リジン残基は分岐している（Ｌｙｓ）n-1で示され、Ｘ3
は、同じであってもよいし、異なってもよい１〜４のアミノ酸残基を示し、ｍは
０または１であり、そして他の文字は上記で定義される。好ましくは、ｐは０ま
たは１であり、ｑは０または１であり、Ｓｐは４〜６のグリシン残基の長さと等
価な長さのスペーサーであり（そして最も好ましくは、Ｓｐは実際に４〜６のグ
リシン残基を示す）、そしてｍは、０または１である。最も好ましくは、本発明
のペプチド構造物は、以下の式（４）であり：
【００１４】
【化２】
ここで、Ｘ3は、アミノ酸残基であり、そして「ｐｅｐｓｅｑ」は、上記で定義
したペプチド配列（Ｘ1）p−１６アミノ酸配列−（Ｘ2）qである。
【００１５】
分岐したリジンコアを用いることは、本質的なことではない。コアは、多くの
形態を取り得る。例えば、分子の残りが物理的に吸着されるかまたは化学的に結
合される（通常は、共有結合によって）固体不活性原料であり得る。それは、例
えば、直鎖状または分岐したポリマーであり得、それには例えば、トリメチロー
ルプロパンのポリエステルまたは低分子量のポリアミドもしくはポリアクリルア
ミドあるいは樹状の分岐を含むポリマー（例えば、米国特許第４，５０７，４６
６号（Ｔｏｍａｌｉａら、１９８５））が挙げられる。それは、プリントされた
回路基板またはシリコンチップのアレイであり得、それによって試験される抗体
が、ペプチド構造物に結合する場合、電荷または電流の変化が生じ、これが検出
され得る。コアへの好ましい連結は、共有結合を介してである。
【００１６】
ペプチド構造物の分子全体がアミノ酸から構成されることが、必要なわけでは
ないことが、上記より明らかであるはずである。１つの分岐と別の分岐との間の
非ペプチドコアまたは非ペプチドスペーサーあるいは非ペプチド結合が、挙げら
れ得る。しかし、ペプチド全体またはアミノ酸構造全体は、合成の観点から非常
に便利である。
【００１７】
スペーサーアームは、構造物のコアから外側に向かって伸長し、そして任意の
適合性の残基を包含する。最も好ましくは、スペーサーアーム分子はアミノ酸残
基を含む。好ましくは、スペーサーアームは、グリシン残基（これは、非電荷の
極性アミノ酸である）または非極性アミノ酸の大多数を含む。本明細書中で使用
される用語、「非極性アミノ酸」は、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロ
イシンを含む。好ましいスペーサーアームの長さは、少なくとも４つのグリシン
残基であるが、さらに短いスペーサー（例えば、１つのグリシン残基と等価な長
さ）は、小さな効果を有す。６つを超えるグリシン残基に等価な長さを持つこと
にはあまり利点がないと考えられる。なぜなら、そのような高度に可撓性の分岐
間には互いに干渉する可能性が高すぎるかもしれないからである。
【００１８】
１６アミノ酸配列の配列番号６８は、その左側（Ｎ末端）もしくは右側（Ｃ末
端）または両方のいずれかにおいて高い特異性を有するＨＳＶ−２抗体に結合す
るその能力を阻害しないいくつかのアミノ酸残基を用いて伸長され得る。これら
は、「天然」のｇＧ２配列にあり得る。従って、Ｘ1は、Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ（配列番号６９）、Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｐｒｏ（配列番号７０）、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ（配列番号７１
）、３アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ、２アミノ酸配列Ｇｌｙ Ｐｒｏま
たは単一のアミノ酸Ｐｒｏであり得、そしてＸ2は、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ（配列番号７２）、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ（配列番号７３）、Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ（配列番号７４）、
３アミノ酸配列Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ、２アミノ酸配列Ｓｅｒ Ａｌａまたは
単一のアミノ酸Ｓｅｒであり得る。あるいは、Ｘ1およびＸ2は、他のアミノ酸を
含み得、この場合、それらは、好ましくは非極性アミノ酸またはグリシンもしく
はセリンである。最も好ましくは、１６アミノ酸配列が、片方または両方の末端
の１つのアミノ酸により、特にＮ末端がＰｒｏであり、かつＣ末端がＳｅｒであ
る天然の配列の隣接するアミノ酸の片方もしくは両方により、伸長される。従っ
て、以下の１７アミノ酸配列および１８アミノ酸配列は、特に好ましい：
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１ ５
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ
１０ １５
（配列番号７５）
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ
１ ５
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ
１０ １５
（配列番号７６）
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ
１ ５
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ
１０ １５
（配列番号５５）
予備的な結果は、Ｃ末端またはＮ末端に伸長したペプチド配列を有するペプチ
ド構造物が、１８アミノ酸の配列番号５５を含む「ペプチド構造物５５」よりも
いくつか多い偽陽性の点から、わずかにより良くない診断結果を与えることを示
す。
【００１９】
ペプチド構造物が、全体的にペプチドである場合、ペプチド配列が由来し、か
つ実際にペプチド配列自身がペプチド構造物であるペプチドは、任意の周知であ
る上述の合成方法により作製され得るが、特に持続的なフローバージョンである
Ｆｍｏｃ法が、特に簡便である。
【００２０】
本発明は、抗体（特に、任意の適切な液体の、特に、抗体を含むような体液の
の検出に適切な任意の方法において実行され得る。血清は、通常の体液であるが
、免疫グロブリンを含む他の液体（例えば、涙、唾液または乳汁）が、アッセイ
され得る。
【００２１】
通常の試験において、このアッセイは、マイクロプレートのプラスチック表面
のような不溶性キャリアに、本発明のペプチド構造物を付着させることにより不
均一に実施されるが、本発明は、そのようなアッセイに限定されない。サンドイ
ッチアッセイにおいて、抗血清は、結合可能にする適切な期間ペプチド構造物と
インキュベートされ、そして免疫グロブリンに対する抗体と適切な期間インキュ
ベートされる。従って、例えば、患者が、ヒトであり、そして抗体が、ＩｇＧク
ラスの抗体であると仮定して、適切に標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、プ
レートを洗浄し、そしてプレートに結合した標識の量（抗体およびペプチド構造
物を介して）を測定する。本発明は、第２の抗体として抗ヒトＩｇＭを用いてＩ
ｇＭ抗体の検出に適用し得る。あるいは、競合アッセイにおいて、血清と競合し
得るか、またはその結合から置換し得る標識された抗体の公知の量で行ない得る
。しかし、そのようなアッセイは、低濃度の抗体の検出にはやや不向きである。
任意の普通の標識（例えば、放射性標識および酵素標識）が、用いられ得る（特
に、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）。ビオチンのような間接
的な標識はまた、適切な直接標識された結合パートナー（例えば、標識ストレプ
トアビジンまたは標識アビジン）との結合において用いられ得る。放射性標識は
、放射性計数および例えば、比色シグナル、蛍光シグナルまたは化学発光シグナ
ルにより標識される酵素によりアッセイされ得る。アルカリホスファターゼ酵素
標識を必要とするＮｏｒｄｉｓｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．の「Ａｍ
ｐａｋ」（登録商標）のような検出の増幅方法は、アッセイをさらに敏感にする
（ｓｅｎｓｉｔｉｓｅ）ために用いられ得る。
【００２２】
次いで、１回のアッセイにつき使用するためのペプチド構造物の量（例えば、
プレートの１ウェルにつき）は、通常は１μｇ未満、好ましくは０．１μｇ未満
、そして好ましくは０．０５〜０．５μｇである。任意の特定の場合、最も適切
な量は、関連するペプチド構造物の性質に依存する。
【００２３】
このアッセイを行なうためのキットにおいて、この基本的な成分は、ほとんど
の場合、本発明のペプチド構造物および抗ヒト免疫グロブリン標識抗体である。
これらは、もちろん通常はキット内の個別の容器内に提供される。
【００２４】
本発明は、本発明のペプチド構造物の作製において中間体として有用であるた
め、式（２）のペプチド自身を含む。例えば、分子（コアおよびスペーサー）の
残りに結合させるために準備したスペーサーを欠いたペプチド（すなわち、ｒが
０である）を提供するために便利であり得る。これは、供給業者からコアとスペ
ーサーを得るためにより便利である場合、特にコアとスペーサーが、ペプチド結
合によってＣ末端のペプチドに結合させるために用意されたアミノエチル基のよ
うなペンダント基を含む非アミノ酸ポリマーである場合、特に有用である。ある
いは、このペプチドは、コアに結合するために用意されたスペーサー（式（２）
においてｒ＝１）を用いて合成され得る。このような好ましいペプチドは、上述
のように、１８アミノ酸ペプチドの配列の配列番号５５が最も好ましい。
【００２５】
本発明にはまた、特にカルボキシ保護基およびアミノ保護基を有するペプチド
、アミノ酸側鎖がｔ−ブチルオキシカルボニル基で保護され、かつＮ末端が、９
−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）により保護されるペプチドを特
に含むこのようなペプチドの誘導体が含まれる。本発明は、エステル、（特にペ
ンタフルオロフェニルエステル、特にスペーサーを欠いたペプチド（ｒ＝０）の
ために）のような、「反応性の」Ｃ末端基を有するペプチドをさらに含む。「反
応性の」とは、それらとアミド結合を形成するためのスペーサーの遊離アミノ基
と反応し得ることを意味する。他のこのような反応誘導体は、当該分野で周知で
あり、かつ本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００２７】
（実施例）
（材料および方法）
（血清および予備的血清学）
合計１７４の血清標本を１１８個体から採取した。これらのうち、１５５の血
清を１００人の患者から採取した。対の血清を、これらの患者のうち５５人から
採取した。さらに１８の血清を、ＨＳＶとは関連しない種々の状態の１８人の子
供から採取した。エジンバラで採取した血清のＨＳＶ特異的抗体の力価を、補体
結合アッセイ（Ｓｍｉｔｈら、１９６７）によって決定し、一方で、グラスゴー
で採取した血清における力価を、抗ＨＳＶ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（「Ｅｎ
ｚｇｎｏｓｔ」［登録商標］、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使
用してスクリーニングした。血清が採取されたＨＳＶ感染患者は、成人の平均年
齢が約２７歳、および男女ほぼ同数であった。
【００２８】
（ウイルス単離およびタイプ分け）
全てのウイルス単離物を、１つが患者の口唇から単離された単離物であること
除いて、生殖器病変から得た。ウイルスは、タイプ特異的モノクローナル抗体の
パネル（「Ｓｙｖａ Ｍｉｃｒｏ Ｔｒａｃｋ」［登録商標］、Ｂｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、間接蛍光によってタイプ分けした
。
【００２９】
（ペプチド合成）
ｇＧ２の予測されるオープンリーディングフレームのアミノ酸２１〜６９９に
またがる、一連の６７のペプチド（大部分は、１０アミノ酸が重複する１８アミ
ノ酸長）を連続フローＦｍｏｃ化学によって合成した。残基１〜２０は、成熟タ
ンパク質から切り出されるシグナル配列を含むと考えられたため、これらは合成
しなかった。このペプチドを、本発明の複数の提示されたペプチド構造物として
作製した。各々の構造は、分岐したリジンコア上で範囲が定まった各アミノ酸配
列の４つのコピーからなる（Ｔａｍ、１９８８）が、このようなアミノ酸配列の
各々は、感度を増加させるために、４つのグリシン残基によりコアから分離され
る。このようなペプチド構造物は、式（５）：
【００３０】
【化３】
によって表され得る。ここで、「ｐｅｐｓｅｑ」は、処方物内の各存在における
同じアミノ酸配列を示し、そして以下の表１および配列識別番号１〜６７の１文
字表記で示されるペプチドの配列から選択される。それらを、製造業者によって
記載される標準的なＦｍｏｃ手順および製造業者の指示に従うカップリング試薬
としてＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，
３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート］またはＴＢＴＵ［
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル
ウロニウム テトラフルオロボレート］のいずれかを使用して、Ｓｈｉｍａｄｚ
ｕ ＰＳＳＭ−８ペプチド合成機で作製する。ペプチドを、逆相ＨＰＬＣによっ
て分析し、そして少なくとも８０％純粋であることを判断する。
【００３１】
【表１】
（実施例１：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
血清を、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２ｔ）の短縮型バージョンおよびｇ
Ｇ２ペプチド配列を含むペプチド構造物を用いて反応性について試験した。ＨＳ
Ｖ−１の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ１）およびＨＳＶ−２の糖タンパク質（ｇＤ２）
は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方によって惹起される抗体によって認識さ
れる多くのエピトープと非常に相同性である。糖タンパク質Ｄもまた、免疫優性
タンパク質である。これらの２つのｇＤの特性によって、ｇＤが高感度になり、
かつＨＳＶ特異的抗体の診断のための有用な試薬になる。短縮型形態は、ｇＤの
最初の３２６アミノ酸を含むが、カルボキシ末端の膜貫通ドメインを欠失し、結
論として細胞から分泌される。この特性は、分泌タンパク質を細胞膜からｇＤ全
体を精製するよりも、細胞培養培地からより容易に精製し得るために、都合がよ
い。しかし、この特性は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２抗体の間を識別しない。
ｇＤ２ｔ（チャイニーズハムスター卵巣細胞中でＤＮＡからの発現後に均質にま
で精製された）を、６６０μｇ／ｍｌの濃度でＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃ
ｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によ
って提供した。これを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、そして
マイクロタイターウェル（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ １、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、５
０μｌ中０．５μｇまたは０．２５μｇでコーティングするために使用した。
【００３２】
ペプチド構造物（表１を参照のこと）を可能であるときは常に水に溶解した。
水不溶性のペプチド構造物を、３０％酢酸（配列番号７、８、１２、１４、１５
、２１、２５、２６、６２の配列を有するペプチド構造物）中、またはペプチド
構造物水懸濁物によってアンモニア蒸気の少量（２ｍｌ）を通気することによる
かのいずれかで可溶化した。その際に、ペプチド構造物は、透明な溶液を形成し
た（配列番号１６、１７および１８の配列を有するペプチド構造物）。次いで、
可溶化したペプチド構造は、本文中に示される濃度までＰＢＳ中に希釈し、そし
て５０μｌをウェルに添加した。ｇＤ２ｔおよびペプチド構造物の両方を、４℃
で一晩プレートに吸着させた。抗原溶液をプレートから除去し、そしてプレート
上の占有されていない結合部位を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１．５〜２時間ブロ
ッキングした。ウェルを０．０５％「Ｔｗｅｅｎ ２０」を含む１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（「ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ」）（Ｔｗｅｅｎは、登録商標である）で６回
洗浄し、そして本文中に示したように希釈した５０μｌの血清とともに、旋回式
シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で室温で１．５時間インキュベー
トした。血清を取り除き、そしてウェルをさらに６回「ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ」
で洗浄した。抗体の結合を検出するために、順に、ウェルを５０μｌのビオチン
化ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１／１０００希釈）および５０μｌ
のストレプトアビジン結合体化セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ、１／１０００希釈）とともに、各々１．５時間３７℃でインキュベートし
、次いで、ＮａＣｌ−「Ｔｗｅｅｎ」で６回洗浄した。０．０１％過酸化水素含
有クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中（５０μｌ）、色素産生性基質である
ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤＡ）を添加し、そして１０分
後、５０μｌの２Ｎ 硫酸（ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を添加することに
よって、発色を停止させた。プレートを、４９２ｎｍで「Ｔｉｔｅｒｔｅｋ」マ
ルチスキャンプレートリーダーで読みとった。
【００３３】
（結果）
（血清のサブセットに対する、全てのペプチドの予備スクリーニング）
この最初の実験において、全てのペプチド構造物を、２４の血清のセットに対
してスクリーニングした。ウイルスを単離した患者由来の４つの血清は１型であ
ることが見いだされ、そして抗体陽性であり、ＣＦ力価は１６〜２５６の範囲で
あった。ウイルスを単離した患者由来の１５の血清は２型であることが見いださ
れ、そして抗体陽性であり、ＣＦ力価は１６〜２５６の範囲であった。３つの血
清は、ウイルス単離においてＨＳＶ感染の実験的証明がなされず、および抗体陰
性である患者由来であった。２つの血清は抗体陰性であったが、ウイルスが単離
された患者由来のものであった：ＨＳＶ−１を一方の患者から培養し、そしてＨ
ＳＶ−２を他方の患者から培養した。この血清もまた、ｇＤ２ｔ（５００ｎｇ／
ウェル）に対してスクリーニングし、ＨＳＶ特異的抗体の存在を確認した。抗原
を全く有さないＰＢＳで処理したウェルを、コントロールとして供した。最初の
スクリーニングにおいて、ウェルを１．０μｇのペプチドでコーティングし、そ
して４９２ｎｍでの吸光度値を記録した。
【００３４】
ＨＳＶ−２に対して特異的なペプチドは、以下の特性を有するべきである。Ｈ
ＳＶ−２感染によって惹起された抗体を含む血清と反応すべきである。さらに、
このペプチドはＨＳＶ特異的抗体を含まない血清またはＨＳＶ−２感染の非存在
下でＨＳＶ−１感染によって惹起された抗体を含む血清と反応すべきではない。
【００３５】
このペプチドの反応性について任意の先のデータの非存在下で、このデータは
、２つの方法によって分析された。第１の方法において、ＨＳＶ抗体陽性と陰性
血清との間を識別するために適切な値として供され得るという根拠に基づいて、
０．２５のカットオフ値が選択された。ペプチド配列（配列番号３、７、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１７、２１、２６、５５、５７、６２、および、
６６、６７）を含むペプチド構造物のみが、１５のＨＳＶ−２血清全てと０．２
５より大きな吸光度値を生成した一方で、配列（配列番号３９、５０、５１、５
５、５６、６３および６４）を含むペプチド構造物のみが、５つの抗体陰性血清
全てと０．２５未満の吸光度値を与えた。そして配列番号３８、５０および５５
の配列を含むこのペプチド構造のみが４つのＨＳＶ−１血清すべてと０．２５未
満の吸光度値を与えた。従って、「ペプチド構造物５５」（配列番号５５の配列
を有する）のみが、ＨＳＶ−２抗体特異的試薬に必要な、上記の規定された基準
の全てを満たした。第２の方法において、コントロールのＰＢＳコーティングウ
ェルでの各血清の吸光度値を、ペプチドコーティングウェルでの吸光度値から差
し引き、そして０．１のカットオフ値を選択した。配列番号７、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１７、２３、２６、３９、５７、６２、６６および６７の
配列を含むペプチド構造物のみが、１５のＨＳＶ−２血清全てと０．１より大き
な吸光度値を生成した一方で、配列番号５０、５１、５５、５６および６４の配
列を含むペプチド構造物のみが、５つの抗体陰性血清すべてと０．１未満の吸光
度値を与えた。そして配列番号３７、３８、３９、５０、５５および６４の配列
を含むペプチド構造物のみが、４つのＨＳＶ−１血清全てと０．１未満の吸光度
値を与えた。従って、ペプチドのいずれもが全ての基準を満たさなかった。しか
し、５つの抗体陰性血清全てかつ４つのＨＳＶ−１血清全てと０．１未満の吸光
度値を与えた配列番号３９、５０、５５および６４の配列を含む４つのペプチド
構造物のうち、配列番号３９、５０および６４の配列を有するペプチド構造物は
、１５のＨＳＶ−２血清のうち、それぞれ、５、１、および４つと反応性を示し
た。一方で、「ペプチド構造物５５」は、１５の血清のうち１４と反応性を示し
た。従って、「ペプチド構造物５５」は、ＨＳＶの型特異的血清診断のためのあ
り得る候補物と考えられた。
【００３６】
（実施例２：使用されるペプチドおよび血清の量の最適化）
図面の図１を参照すると、ウェルを、本発明のペプチド構造物５５の４つの異
なる量でコーティングした：５μｇ（四角）、１μｇ（菱形）、１００ｎｇ（丸
）および１０ｎｇ（三角）。７つの血清を２０倍に希釈し、次いで、６回さらに
２倍希釈した。ペプチド構造物および／または血清を欠くウェルをコントロール
（４つの四角格子）として供した。３つのＨＳＶ−２血清について（ＣＦ力価１
６、２５６、および１６）の結果ならびに３つのＨＣＶ−１血清について（ＣＦ
力価８未満、２５６、および１６）の結果を図１に示す（パネルＡ、Ｃ、Ｅ＝Ｈ
ＳＶ−２；Ｂ、ＤおよびＦ＝ＨＳＶ−１）。ＨＳＶ−２血清は全て、ペプチド構
造物５５でコーティングしたウェルとより大きな反応性を示したのに対して、Ｈ
ＳＶ−１血清は、ＰＢＳコントロールでみられるバックグラウンドレベルを超え
て、ペプチド構造物５５と反応しなかった。全部で４つの濃度のペプチド構造物
５５を試験したが、血清との反応性は非常に類似した。１：４０以下で希釈した
場合、１より大きな吸光度が生成されるか、またはより少なく、そしてプラトー
に達するようであった。対照的に、血清ＣおよびＥの両方は、より低い反応性を
示し、そして曲線の形状は、より高い反応性がより低く希釈した血清で達成され
得ることを示唆した。より低いペプチド量でさえも使用され得るか否かを調べる
ために、ウェルを、１００ｎｇ〜５ｐｇの範囲の異なる量でコーティングし、そ
して血清ＡおよびＥとの反応性について試験した。５ｎｇ／ウェル未満では、シ
グナルに顕著な減少が認められ、１００ｐｇ未満では、全く応答が認められなか
った（データは示さず）。
【００３７】
（実施例３）
これらの観察に基づいて、次いで、全ての血清を１００ｎｇおよび１０ｎｇの
ペプチド構造物５５でコーティングしたウェル上およびｇＤ２ｔでコーティング
したウェル上でスクリーニングした：ｇＤ２ｔの量を２５０ｎｇ／ウェルまで減
少させて、ほぼ、１００ｎｇのペプチド構造物でみられるシグナルまで減少させ
た。血清を５倍、１０倍、および２０倍の希釈物で試験した。ペプチド構造物も
タンパク質も含まないウェルを、全ての血清の希釈物に含めた。
【００３８】
（カットオフ値の確立）
ＨＳＶ陰性コントロールとして使用した２１の血清を、エジンバラからの３つ
およびグラスゴーからの１８で構成した。それらを、ＨＳＶに関連するいずれの
臨床的兆候も示さないことおよびＥＬＩＳＡまたは補体結合アッセイ（実施例１
の方法を参照のこと）における反応性がないかによって陰性の判断をした。血清
を５倍希釈し、そしてｇＤ２ｔ（２５０ｎｇ）またはペプチド構造物５５（１０
０ｎｇもしくは１０ｎｇのいずれか）または抗原なし（ＰＢＳコントロール）で
コーティングしたウェル上でＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ｇＤ２ｔ
および１００ｎｇのペプチド構造物５５についてのデータを、図２に示す。平均
＋５×標準偏差に対応するカットオフ値（ｇＤ２ｔについては０．１６６そして
ペプチド構造物５５については０．１６７）を、引き続く他の血清の分析に使用
し、そして図面中、点線によって示す。
【００３９】
（ＨＳＶ陽性患者由来の血清分析）
全ての血清をペプチド５５の１００ｎｇおよび１０ｎｇの両方、２５０ｎｇの
ｇＤ２ｔならびに抗原なし（ＰＢＳコントロール）でコーティングしたウェルに
対してスクリーニングした。大部分の血清を３つの異なる希釈物でスクリーニン
グした：５倍、１０倍、および２０倍であるが、ある血清では５倍希釈物のみを
用いてスクリーニングした。各血清について、抗原なしで観察されたバックグラ
ウンド吸光度を、異なる抗原について観察された値から差し引いた。これらの補
正された値でデータセットを構築した。
【００４０】
分析のために、血清を５つのクラスにグループ分けした。クラス１および２は
臨床的病変を示す患者から採取された血清を含む：クラス１血清は、８未満のＣ
Ｆ力価を有したが、クラス２血清は、８以上のＣＦ力価を有した。クラス３およ
び４を含む血清を、最初の病変提示から７〜２０日の間（クラス３）または２０
日より後（クラス４）に採取した。クラス５の血清は、原発性病変を提示せず、
かつ以前の血清が少なくとも８のＣＦ力価を有する患者に由来した。ここで、原
発性病変は、８未満のＣＦ力価または２０日以内に４倍上昇するＣＦ力価を有す
る、臨床的に明らかな病変として規定される。
【００４１】
血清を５倍希釈し、そして最も少ない偽陽性の数を与えた１００ｎｇペプチド
でコーティングされたウェル上でスクリーニングした。これらの結果を、以下の
表２にまとめる。陽性結果を、吸光度が０．１６６を超えた場合に記録した（平
均＋５×標準偏差を用いる）。
【００４２】
【表２】
表２を参照すると、ペプチド構造物５５は、ＨＳＶ−１血清で偽陽性を与えな
かった。第２に、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２血清の両方とｇＤ２ｔ、ならびに
ＨＳＶ−２血清とペプチド構造物５５との反応性は、第１の提示の時点（クラス
１および２血清）で得られた血清についての反応性について、続いてサンプリン
グされた血清（クラス３、４および５の血清）の反応性より低かった。全体とし
ては、クラス３、４および５由来のＨＳＶ−１血清の９５％（４１／４３）およ
びＨＳＶ−２血清の９８％（５０／５１）はｇＤ２ｔと反応したが、一方、ＨＳ
Ｖ−２のクラス３、４および５の血清の９２％（４７／５１）は、ペプチド構造
物５５と反応した。第３に、全て（２２／２２）のＨＳＶ−２のクラス５血清は
、ｇＤ２ｔおよびペプチド構造物５５の両方と反応した。
【００４３】
従って、ペプチド５５は、ヒト血清においてＨＳＶ−２抗体に対して完全に型
特異的であることが示され、特に、臨床的病変の最初の提示から７日の間隔後に
抗体を検出するために完全に型特異的であることが示された。
【００４４】
（実施例４）
配列番号５５のペプチド配列を含む「ペプチド構造物５５」のＮ末端およびＣ
末端での伸長に対応するさらなるペプチド構造を合成し、そして４−グリシンス
ペーサーを有する、上記の式（５）の４−分岐形態において作製した。これらを
、（ａ）１μｇ／ウェルまたは（ｂ）１００ｎｇ／ウェルでペプチド構造物また
はタンパク質を使用して、ｇＤ２ｔとともに試験した。そして各々の場合におい
て、２０倍希釈した血清を使用した。そうでなければ、条件は、実施例３と同様
であった。結果を、以下の表３に示す。ペプチド構造物５５は、ＨＳＶ−１につ
いて擬陽性を与えないという観点から最良に機能した。
【００４５】
（実施例５）
本発明の２つのペプチド構造物（ペプチド構造物５５および各末端で２つのア
ミノ酸の「天然」配列によって伸長されたペプチド配列を含むペプチド構造物）
を、ペプチド配列がＮ末端で伸長されたがＣ末端で短縮された（それぞれ、１０
アミノ酸および８アミノ酸）ペプチド構造物と比較した。この比較は、本発明の
１６アミノ酸コア配列の臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌｉｔｙ）を示す。３つのペプチ
ド全てを、式（５）の４−分岐、４つのグリシンスペーサー形態で作製した。そ
れらを、実施例３のようにタンパク質ｇＤ２ｔと、１００ｎｇ／ウェルのペプチ
ド構造および２５０μｇ／ウェルのタンパク質および血清の５倍希釈物と全て比
較した。本発明の２つのペプチド構造物は、全ての観点から配列番号８６の比較
ペプチド配列を有するペプチド構造よりはるかに良好に機能し、そして本発明の
ペプチド構造物が、ほとんどまたは全くＨＳＶ−１について偽陽性を与えないこ
とが認められた。
【００４６】
以下の請求の範囲は、本発明のいくつかの重要な局面を規定するが、あらゆる
考え得る局面を含むことは意図されず、そのために引き続く継続特許出願および
外国特許出願において保護が求められ得、そして本明細書で先に記載した本発明
の概念の普遍性を減ずると解釈されるべきではない。
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明の方法によるＨＳＶ−２抗血清およびＨＳＶ−１抗血清の検出を示す：パネルＡ、Ｃ、Ｅ＝ＨＳＶ−２：パネルＢ、ＤおよびＦ＝ＨＳＶ−１。
【図２】図２は、ＨＳＶに感染していない個体からの血清のＥＬＩＳＡによるスクリーニングを示す。 （配列表）
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【表１−１０】
【表１−１１】
【表１−１２】
【表１−１３】
【表１−１４】
【表１−１５】
【表１−１６】
【表１−１７】
【表１−１８】
【表１−１９】
【表１−２０】
【表１−２１】
【表１−２２】
【表１−２３】
【表１−２４】
【表１−２５】
【表１−２６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるようなペプチド。
【請求項１】
本明細書に記載されるようなペプチド。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２２４０４３（Ｐ２００７−２２４０４３Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０９９２４（Ｐ２００７−１０９９２４）
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【分割の表示】特願２０００−５２９３５２（Ｐ２０００−５２９３５２）の分割
【原出願日】平成１０年２月２日（１９９８．２．２）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【分割の表示】特願２０００−５２９３５２（Ｐ２０００−５２９３５２）の分割
【原出願日】平成１０年２月２日（１９９８．２．２）
【出願人】（５９７１６６５７８）メディカル リサーチ カウンシル (60)
【Ｆターム（参考）】
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