ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド
本発明は、ホスホリパーゼ阻害活性を有するリパーゼ由来のＣ−末端ペプチド、ホスホリパーゼ阻害活性を含んでなるポリペプチド、及びホスホリパーゼ阻害活性を含んでなる単離ペプチド及び／又はポリペプチドにより阻害され得るリパーゼを提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、組換え発現ベクター、及び組換え宿主細胞、並びに、リパーゼ阻害活性を有するペプチド及びポリペプチドの製造方法及び使用方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼの分野に関する。特に、それはホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ポリペプチド、及び当該ペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに当該ペプチドの製造方法及び使用方法に関する。それはさらに、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチド、及びかかるペプチド及び／又はポリペプチドにより阻害され得るリパーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）は、トリアシルグリセロールの結合を加水分解し、及び非水系において、エステル化及びエステル転移（酸分解、アルコール分解、及びエステル交換）を触媒する。ホスホリパーゼ等のリパーゼには、細胞膜の構造と機能のために非常に重要であり、且つ最も豊富な膜脂質である、極性脂質のリン脂質におけるエステル結合を加水分解する。フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）ホスホリパーゼの２６アミノ酸Ｃ末端ペプチドは、Nagao et al., 1998, J. Biochem. 124:1124-29において、当該酵素活性に影響を及ぼすペプチド不存在下でリパーゼの熱安定性の向上に非常に重要な役割を果たすことが報告された。
【０００３】
例えば消化剤として、香料剤の作製のため、パン生地及びパン生地の焼き製品において、診断試薬として、洗剤の成分、光学分割の触媒として、等の脂質の広範囲に及ぶ使用の観点から、リパーゼの酵素活性を制御する意味を有することは望ましい。さらに、酵素活性について再生可能である酵素製剤を作製するという選択肢のために、製造の観点から、脂質分解活性の制御が好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、リパーゼ阻害活性を有するペプチド、及び当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター及び宿主細胞、及び当該ペプチドの製造方法及び使用方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、リパーゼ阻害活性を有するポリペプチド、及びかかるペプチド及び／又はポリペプチドにより阻害され得るリパーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、（ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号９の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；（ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；（ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は（ｄ）以下のアミノ酸配列：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチドに関する。
【０００６】
本発明はまた、ペプチド及びリパーゼを含んでなるポリペプチドに関し、ここでリパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【０００７】
本発明はまた、タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒近接可能な残基を有するタンパク質が、前記モチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正させている、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明はまた、前記ペプチド又はポリペプチドを含んでなる、単離ポリヌクレオチド、核酸構築物、組換え発現ベクター、組換え宿主細胞、及びホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド又はポリペプチドの製造方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ペプチド又はポリペプチドが、リパーゼに結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、前記ペプチド又はポリペプチドの使用に関する。
【００１０】
本発明はまた、前記ペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）ポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、リパーゼの活性が阻害される、リパーゼに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｆ．オキシスポラム（oxysporum）に対する、ホスホリパーゼの配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、オールベータ及びオールアルファタンパク質配列を示す。
【図３】図３は、Ｆ．オキシスポラムアルファヘリックスからの、残基の溶媒近接可能性を示す。
【図４】図４は、ＧＺＥＬの結晶を示す。
【図５】図５は、ＧＺＥＬ結晶の典型的な回折パターンを示す。
【図６】図６は、ＦｏＬ ＰＩのペプチド誘導性変化を示す。
【図７】図７は、モネリン変種１、ＭＯＮ１、及びモネリン変種２、ＭＯＮ２配列を示す。
【図８】図８は、様々なペプチドについての初期反応率における変化を示す。
【図９】図９は、様々なペプチド及びリパーゼについての、阻害％における変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
ホスホリパーゼ活性：本明細書において「ホスホリパーゼ活性」なる用語は、リン脂質を、脂肪酸及び他のリン脂質物質へ変換する、リン脂質分解（ＥＣ番号３．１．１．４）活性と定義される。本発明の目的として、ホスホリパーゼ活性は、ＰＨＬＵとして記載される手法、及び以下の「原料と方法」の段落で記載されるプレートアッセイにより決定される。
【００１３】
ホスホリパーゼ阻害活性：本明細書において「ホスホリパーゼ阻害活性」なる用語は、ホスホリパーゼ活性を阻害する活性として定義される。本発明のペプチドは、配列番号１の成熟ペプチドの、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％のホスホリパーゼ阻害活性を有する。
【００１４】
単離ペプチド／ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」なる用語は、それぞれ供給源から単離された、ペプチド又はポリペプチドのことを言う。ある態様によれば、前記ペプチド／ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣにより決定した場合、少なくとも１％純粋、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、又は少なくとも９０％純粋である。
【００１５】
同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列の関連性は、「同一性」により記載される。本発明の目的として、２つのアミノ酸間の同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降において実施される場合、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。使用される選択パラメータは、ｇａｐオープンペナルティ１０、ｇａｐ伸長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識化「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力は、同一性割合として使用され、且つ以下の通りに計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるＧａｐの総数）。本発明の目的として、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、上記の通り）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降において実施される場合、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970，上記の通り）を用いて決定される。使用される選択パラメータは、ｇａｐオープンペナルティ１０、ｇａｐ伸長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識化「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力は、同一性割合として使用され、且つ以下の通りに計算される：（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるＧａｐの総数）。
【００１６】
相同配列：本明細書で「相同配列」なる用語は、ｔｆａｓｔｙサーチ（Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219）において０．００１以上のＥ値（又は期待値）を提供する予測されたタンパク質として定義される。相同性の度合いは、ＧＣＧプロフラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45)等の当該技術分野で既知のコンピュータプログラムにより好適に決定されてよい。本発明において、フサリウム・グラミネアリウム（Fusarium graminearium）、ネクトリアリパーゼ、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フサリウム・セミテクタム（Fusarium semitectum）、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・ヘテロスポラム、及びサーモマイセス・ラヌギノーサス（Thermomyces lanoginosus）（類義語：フミコラ・ラヌギノース（Humicola lanuginose））のリパーゼ配列における対応する（又は相同な）位置は、図１において示されるアラインメントにより規定される。アラインメントに示されないリパーゼ配列における相同位置を発見するために、注目の配列は、図１に示される配列に対して整列させる。新規な配列は、ＧＡＰプログラムにより発見される最も相同な配列に対しするＧＡＰアラインメントを用いて、図１における現在のアラインメントに対して整列させる。以下の設定は、ポリペプチド配列比較について使用される：３．０のＧＡＰ創出ペナルティ及び０．１のＧＡＰ伸長ペナルティ。
【００１７】
単離ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合「単離ポリヌクレオチド」は、供給源から単離されるポリヌクレオチドのことを言う。特定の態様によれば、当該ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で決定した場合、少なくとも１％純粋、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、又は少なくとも９０％純粋である。
【００１８】
コード配列：本明細書で使用される場合、「コード配列」なる用語は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する、ヌクレオチド配列のことを意味する。コード配列の境界は、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧ及びＴＴＧ等の代替的開始コドンで通常開始し、且つＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ等の終止コドンで終結する、オープンリーディングフレームにより一般的に決定される。当該コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成又は組換えヌクレオチド配列であってよい。
【００１９】
核酸構築物：本明細書で使用される場合「核酸構築物」なる用語は、一本鎖か二本鎖のいずれかであり、天然の遺伝子から単離されるか、そうでなければ天然に存在するはずの手順で核酸のセグメントを含有するように修正されるか、又は合成される、核酸分子のことを言う。核酸構築物なる用語は、当該核酸が、本発明のコード配列の発現のために必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」なる用語と類義語である。
【００２０】
制御配列：本明細書において「制御配列」なる用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同質であるか異質であるか、又は互いに同質であるか異質であってよい。かかる制御配列には、限定するものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、単一ペプチド配列、及び転写ターミネーターがある。最低でも、当該制御配列には、プロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルがある。当該制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域を有する制御配列のライゲーションを促進する特定の制限部位を誘導する目的で、リンカーを有してもよい。
【００２１】
作動的に結合する：本明細書において「作動的に結合する」なる用語は、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を方向付けるように、制御配列が、ポリヌクレオチド配列のコード配列と比較して適切な位置に置かれる配置のことを言う。
【００２２】
発現：「発現」なる用語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップであり、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌がある。
【００２３】
本明細書では「発現ベクター」なる用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、且つその発現のために提供する追加のヌクレオチドと作動的に結合される、直線又は環状分子として定義される。
【００２４】
宿主細胞：本明細書で使用される場合「宿主細胞」なる用語には、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物又は発現ベクターを伴う、形質転換、形質移入、形質導入等の影響を受け易い任意の細胞型が含まれる。
【００２５】
変更：本明細書において「変更」なる用語は、配列番号１の成熟ポリペプチド、又はその相同配列からなるポリペプチドの、任意の化学的変更；及びかかるポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝的操作のことを意味する。当該変更は、１以上の（複数の）アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入、及び１以上の（複数の）アミノ酸側鎖の置換えがあり得る。本発明の修正されたアミノ酸について言及する際に、以下の命名を参照の簡略として使用する。「オリジナルアミノ酸：位置：（１又は複数の）置換アミノ酸」。この命名に従うと、例えば、位置１９５でのグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換は、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置におけるグリシンの欠失は、Ｇ１９５*、リジン（Ｋ）等の追加のアミノ酸残基の挿入は、Ｇ１９５ＧＫと示される。特定のリパーゼが、他のリパーゼと比較して「欠失」を含み、且つ挿入がかかる位置でなされる場合、位置３６でのアスパラギン酸（Ｄ）の挿入は、*３６Ｄとして示される。多重変異は、プラスで分離され、位置１７０及び１９５で、それぞれアルギニン（Ｒ）及びグルタミン酸（Ｅ）の、チロシン（Ｙ）及びグリシン（Ｇ）への置換する変異を表す、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅがある。Ｘ２３１は、記載のアラインメント手法を適用すると、位置２３１に対応する親ポリペプチドにおけるアミノ酸を示す。Ｘ２３１Ｒは、当該アミノ酸がＲで置換されることを示す。配列番号２について、ＸはＴであり、すなわち、Ｘ２３１Ｒは、位置２３１におけるＴの、Ｒでの置換を示す。ある位置（例えば２３１）におけるアミノ酸が、例えば、Ｒ及びＰ及びＹからなる群等のアミノ酸群から選択される別のアミノ酸により置換されてもよい場合、これは、Ｘ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙと示されることになる。全ての場合において、受容されるＩＵＰＡＣの一文字又は３文字アミノ酸略字が使用される。
【００２６】
所与のアミノ酸残基が、酵素の表面に存在しているか否かに関係なく、例えば、プログラムＤＳＳＰで計算されるその溶媒接近可能表面が３０Å2の場合、W. Kabsch and C. Sander (1983) Biopolymers 22, pp. 2577-2637、タンパク質二次構造の辞書：水素結合及び幾何学的特徴のパターン認識に従って決定されてよい。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者等は、フサリウム・オキシスポラム又はフサリウム・グラミネアリウム（ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae））のＣ末端から単離され得るペプチドは、リパーゼと結合できることを見出した。彼等はさらに、フサリウム・オキシスポラムのペプチドは、ホスホリパーゼ阻害活性を有することを示した。すなわち、例えば、ネクトリアリパーゼ；ネクトリア・ヘマトコッカ（Nectria haematococca）（フサリウム・エウマルチイ（Fusarium eumartii)）；フサリウム・ソラニ；フサリウム・クルモルム；フサリウム・セミテクタム；及びフサリウム・ヘテロスポラム等の任意の好適なホスホリパーゼから単離される類似のＣ末端ペプチドは、ホスホリパーゼ活性を阻害するために使用できることを示す。
【００２８】
第一の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号９の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；（ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；（ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は（ｄ）以下のアミノ酸配列：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチドに関する。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、長さが、５５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、又は３０アミノ酸未満であるペプチドに関する。
【００３０】
別の態様によれば、本発明は、アルファヘリックスの二次構造を有するペプチドに関する。
【００３１】
別の態様によれば、本発明は、モチーフ中に存在する、位置Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21の各々のアミノ酸が、Ｘ4がＡ又はＥ、Ｘ5がＥ又はＱ、Ｘ8がＫ又はＡ、Ｘ12がＳ又はＮ、Ｘ15がＥ、Ｑ又はＡ、Ｘ16がＬ又はＭ、Ｘ18がＫ又はＱ、及びＸ21がＩ又はＶ、から独立に選択されるペプチドに関する。
【００３２】
フサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）のペプチドは、当該リパーゼを阻害するペプチドの能力を増加又は低減するように変更されてよい。かかる変更の例を表１に示す。
【００３３】
表１：変化したペプチドにより野生型リパーゼの阻害を向上又は低減させるための、配列番号１の残基３１７〜３４６に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼ由来のホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチドにおける変更。
【００３４】
【表１】
【００３５】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１、Ｌ２９４、Ｅ２９５、Ｋ２９７、Ｌ２９８、Ｎ２９９、Ｙ３０１、Ｄ３０５、Ｋ３０６、Ｙ３０８、又はＶ３０９に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなるペプチドに関する。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１Ｅ；Ｌ２９４Ａ；Ｅ２９５Ｔ，Ｓ；Ｋ２９７Ｒ；Ｌ２９８Ａ；Ｎ２９９Ｄ，Ｅ；Ｙ３０１Ｗ；Ｄ３０５Ａ；Ｋ３０６Ｒ；Ｙ３０８Ｅ，Ｄ；又はＶ３０９Ｉ，Ｎ，Ｑに対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなるペプチドに関する。
【００３７】
ある場合には、ペプチドにおける変更は、ペプチドとリパーゼ間の結合における変化となってもよく、他の場合には変化がなくてもよいことは想定される。変化は、結合の向上又は低減を導いてもよく、したがって、当該ペプチドによるリパーゼの阻害の向上又は低減をもたらしてもよい。
【００３８】
ペプチドにおける変更に加えて、ペプチドとリパーゼとの間の相互作用は、リパーゼにおける変化により影響を受けてもよい。かかる変更は、向上した阻害又は低減した阻害の原因となってよい。フサリウム・オキシスポラムリパーゼのアミノ酸配列における変更の例を表２に示す。
【００３９】
表２：野生型ペプチドより、変化したリパーゼの向上又は低減した阻害を得るための、配列番号１の残基１〜３１６に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼにおける変更。
【００４０】
【表２】
【００４１】
別の態様によれば、本発明は、ペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
別の態様によれば、本発明は、発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも１つの制御配列に作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。
別の態様によれば、本発明は、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関する。
別の態様によれば、本発明は、核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞に関する。
【００４２】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）ペプチドの産生を行うための条件下、前記ペプチドの少なくとも１つの複製物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含んでなる、宿主細胞を培養するステップ、及び（ｂ）前記ペプチドを回収するステップ、
を含んでなる単離ペプチドの調製方法に関する。
【００４３】
あるいは、本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の従来的方法を用いて、インビトロ（in vitro）合成により調製されてよい。様々な市販の合成装置が利用可能であり、例えば、Applied Biosystems Inc., Beckman等による自動化合成装置がある。合成装置の使用により、天然のアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ−体）、例えば、Ｄ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、ジアステレオマー、異なる長さ又は機能を有する側鎖等で置換されてよい。特定の配列及び調製手法は、便利さ、経済的、純度の高さ等により決定されることになる。
【００４４】
当該ペプチドは、組換え合成の従来的方法に従って、単離及び精製してもよい。発現宿主の可溶化液を調製してもよく、且つ当該可溶化液は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、又は他の精製技術を用いて精製されてよい。ほとんどは、使用される組成物は、生成物の調製及びその精製の方法に関連する混入物に関して、所望の産物が、少なくとも２０重量％、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、及び治療目的では、通常少なくとも約９９．５重量％含まれることになる。通常、当該割合は、総タンパク質に基づくことになる。
【００４５】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼへペプチドが結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するためのペプチドの使用に関する。
【００４６】
リパーゼにはホスホリパーゼとして分類されないものもあり、及びホスホリパーゼ活性を持たないか、又はほとんど持たない親脂質分解酵素由来のホスホリパーゼ活性を有する変種から得ることが好ましく、例えば、当該変種は、リパーゼ活性に対するホスホリパーゼ活性の比率未満に対応するもの、又は５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないものである。
【００４７】
さらなる態様によれば、本発明は、前記ペプチドを含んでなるポリペプチド及びリパーゼに関し、ここで当該リパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【００４８】
別の態様によれば、本発明は、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼを含んでなるポリペプチドに関する。
【００４９】
阻害活性を有するペプチドを本来含まないリパーゼは、本発明の単離ペプチドにより阻害されるリパーゼ変種を得る目的で変更されてよい。これらのリパーゼ変種は、（ａ）単離ペプチド；（ｂ）かかるリパーゼ変種に付加するペプチド、又は（ｃ）阻害活性を有するペプチドを含んでなるポリペプチドのいずれかによって阻害されてよい。ペプチドとリパーゼ変種との間の結合相互作用は、ペプチドのアミノ酸配列を修正することによりさらに改変されてよい。
【００５０】
サーモマイセス・ラヌギノーサスリパーゼ（ＴＬＬ）は、本質的にはホスホリパーゼ活性を持たず、且つ現在のところ、このリパーゼが、任意のＣ−又はＮ−末端ペプチドを含んでなりその活性を制御及び／又は阻害することを示す情報はない。このリパーゼは、ＴＬＬを、フサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）ペプチドの結合の影響を受けやすくし、それによりその脂肪分解活性を阻害するアミノ酸変更を誘導するのに適するようにさせる構造を有する。かかる変更の例を表３（Ａ）に開示する。ＴＬＬ及び本発明の単離ペプチドの相互作用は、当該ペプチドにおける変更の導入によりさらに最適化されてよい。ＦｏＬのＣ末端ペプチドにおける変更の例を、表３（Ｂ）に示す。
【００５１】
表３：（Ａ）野生型ＦｏＬペプチドにより阻害されるリパーゼを産生する配列番号９の残基１〜２６９に対応するサーモマイセス・ラヌギノーサスリパーゼ（ＴＬＬ）における変更、及び（Ｂ）ＴＬＬの向上した阻害を得るための、配列番号１の残基２８８〜３１７に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）由来のホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチドにおける変更。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＴＬＬ残基がＦｏＬ残基で置換される場合、全ての残基が、又は代替的に、ＴＬＬ配列から選択される少なくとも１つの残基が、以下のアラインメントによりＦｏＬ配列から選択される対応する残基で置換されてよい。
【００５４】
【表４】
【００５５】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼが、独立に、挿入、欠失、又は置換である少なくとも１つの変更を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５６】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼの少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｅ８７Ｒ、Ｉ９０Ｌ、Ｇ９１Ｔ、Ｉ２０２Ｐ、Ｒ２０９Ｌ、Ｅ２１０Ｉ、又はＴ２４４Ｌに対応する１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５７】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼが、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５５に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４６〜２５４での置換か、又はサーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５３に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４７〜２５２での置換を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５８】
さらなる態様によれば、本発明は、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドに関し、ここでタンパク質の表面に局在するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒接近可能な残基を有するタンパク質は、記載される本発明のモチーフの、位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正されている。
【００５９】
別の態様によれば、本発明は前記ポリペプチドに関し、ここでタンパク質は、プレタシン（Plectasin）（配列番号１１）；モネリン（Monellin）（配列番号１２）；プロテグリン（Protegrin）（配列番号１３）；バルナーゼ（Barnase）（配列番号１４）；シトスタチン（Cytostatins）（配列番号１５）；又はアポリポタンパク質Ｅ（配列番号１６）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６０】
ホスホリパーゼ阻害か活性を有するポリペプチドを産生するのに適するタンパク質は、当該タンパク質の表面に暴露される少なくとも１つのアルファヘリックスを含まなければならない。当該アルファヘリックスに含まれるアミノ酸のいくつかは、リパーゼに結合でき、且つその阻害効果を発揮するために溶媒近接可能であることが必要である。アルファヘリックスのサイズは、２２アミノ酸、又は２０、１８、１６、１４、１２、又は１０アミノ酸であってよい。当該少なくとも１つのアルファヘリックスに加え、例えばベータストランド等の他の二次構造要素が存在してもよい。それらの二次構造に基づき、タンパク質の３つの主要な群：オールアルファ群、オールベータ群、及びアルファベータ群を規定できる。図２は、例えば、プレクタシン、モネリン、プロテグリン、バルナーゼ、及びシスタチン等のアルファベータ群に属するタンパク質の例、及びアポリポタンパク質Ｅ等のオールアルファ群に属するタンパク質の例を示す。当該アミノ酸配列は、第二列に示され、第一列は、プログラムDictionary of Secondary Structure Prediction (ＤＳＳＰ)により計算された二次構造のことを言い、ここでａ／Ａはアルファヘリックスを示し、且つｂ／Ｂはベータストランドのことを言う。
【００６１】
ホスホリパーゼ阻害ペプチドのアルファヘリックスは、以下のモネリンで例示されるような、２ステップの手法で、選択されたタンパク質のアルファヘリックスと（下線）重ね合わせてよく、且つ一緒に整列させてよい。
【００６２】
整列される配列の平行、又は逆平行のいずれかの方向の選択
【００６３】
【化１】
【００６４】
当該方向が選択されると、アルファヘリックスの配列を整列させる複数の可能性が存在する。最適なアラインメントは、共通する最大長さを含んでなり、且つ困難が（クラッシュ）最低数である。
【００６５】
【化２】
【００６６】
最適アラインメントの同定後、タンパク質アルファヘリックスにおける改変は、ホスホリパーゼ阻害ペプチドのアルファヘリックスへ、アミノ酸残基を変化させるようなされてもよい。図３に一例を示し、ここで、ＦｏＬのペプチドは、アルファヘリックスのどの部分とどのアミノ酸残基が酵素に面するか、且つどれが溶媒に面するか、を例示するために描かれている。特に、足場タンパク質の表面に面し、且つ溶媒近接可能であり、したがって、接触及びリパーゼの阻害に関与してもよい残基を考慮しなければならない。これらの残基は、モチーフ：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22の、位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する。任意に、タンパク質の表面の端に見られ、且つ潜在的に溶媒近接可能であり、したがって、接触及びリパーゼの阻害に関与してもよい残基も考慮すべきである。これらの残基は、前記モチーフの、位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する。
【００６７】
最終的に、足場タンパク質のアルファヘリックスの、リパーゼへの結合に影響を及ぼすか、タンパク質内のアルファヘリックスの適応に影響を及ぼす可能性のある、他の及び／又は新規なクラッシュが存在する場合、タンパク質におけるアルファヘリックス外の部分を分析して同定する。その後、かかる残基は、ホスホリパーゼ阻害活性を最大化するよう任意に変化させる。これらはヘリックス外の変異である。
【００６８】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼへのペプチドの付加のステップを含んでなる、本発明のポリペプチドの調製方法に関し、ここで当該リパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【００６９】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスを有するタンパク質を選択するステップであって、前記アルファヘリックスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの残基は、溶媒接近可能である；（ｂ）前記ペプチドを、前記タンパク質のアルファヘリックスと整列させるステップ；（ｃ）前記モチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒接近可能であるタンパク質のアルファヘリックスにおける残基を同定するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）において同定されたタンパク質における、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのアミノ酸を変更するステップ；（ｅ）前記ポリペプチドを、ホスホリパーゼ阻害活性について試験するステップ；（ｆ）ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを選択するステップ；及び（ｇ）（ｆ）において選択されたポリペプチドを作製するステップ、を含んでなるポリペプチドの調製方法に関する。
【００７０】
別の態様によれば、本発明は、ステップ（ｃ）において、前記モチーフの位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する潜在的に溶媒接近可能なタンパク質のアルファヘリックスにおける残基をさらに同定する方法に関する。
【００７１】
別の態様によれば、本発明は、前記タンパク質における１又は複数の位置で、少なくとも１つの変更がなされるステップをさらに含んでなる方法に関する。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドに含まれるペプチドがリパーゼへ結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、前記ポリペプチドの使用に関する。
【００７３】
さらなる態様によれば、本発明は、前記ペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）ポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、リパーゼの活性が阻害される、リパーゼに関する。
【００７４】
別の態様によれば、本発明は、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼに関する。
【００７５】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｌ９２；Ｒ９６；Ｌ２０３；Ｉ２０７；Ｒ２１１；Ｌ２４３；Ｌ２５０；又はＬ２５２に対応する置換である、リパーゼに関する。
【００７６】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサ（配列番号９）の残基Ｌ９２Ｄ，Ｅ，Ｗ；Ｒ９６Ｅ，Ｄ，Ａ；Ｌ２０３Ｗ，Ｋ，Ｍ；Ｉ２０７Ｄ，Ｅ；Ｒ２１１Ｈ；Ｌ２４３Ｗ，Ｋ；Ｌ２５０Ｄ，Ｅ，Ｒ；及びＬ２５２Ｓ，Ｔに対応する置換である、リパーゼに関する。
【００７７】
原料及び方法
ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）
ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）を、レシチンからの遊離脂肪酸の放出として測定する。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７中の、５０μｌの４％ Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（Avantiからの植物レシチン）、５ｍＭ ＣａＣｌ2を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７中で適切な濃度に希釈した５０μｌ酵素溶液に添加する。サンプルを、１０分間３０℃でインキュベートし、９５℃、５分間で反応を停止させた後、遠心分離した（７０００ｒｐｍで５分間）。遊離脂肪酸を、ＮＥＦＡ Ｃキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ製）を用いて決定する；２５μｌ反応混合物を、２５０μｌの試薬Ａに添加し、１０分間３７℃でインキュベーションする。その後、５００μｌの試薬Ｂを添加し、当該サンプルを再び１０分間３７℃でインキュベートする。５５０ｎｍでの吸収を、ＨＰ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度器を用いて測定する。サンプルは、少なくとも２重に試験する。基質及び酵素ブラインド（blinds)（予備加熱した（９５℃で１０分）酵素サンプル＋基質）を含有させる。オレイン酸を脂肪酸標準として使用する。１ＰＨＴＵは、これらの条件で、１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を放出できる酵素量と等しい。特定のホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ／ｍｇ）を、タンパク質量（ｍｇ）当たりのホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）で計算する。
【００７８】
精製水中で、５０ｍｌの２％アガロースを、５分間加熱により溶解させ、その後、６０〜６３℃に冷却する。０．２Ｍ ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．５中、５０ｍｌの２％植物Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン９５％を、３０分間６０℃で、１５秒間ｕｌｔｒａｔｈｏｒａｘで混合する。等量の２％アガロース及び２％レシチンを混合する。精製水中の２５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレットを、指標として添加する。混合物を適切なペトリ皿（例えば、１４ｃｍφ皿における３０ｍｌ）に注ぎ、酵素溶液のアプライのために、適切な穴（３〜５ｍｍ）を寒天に作製する。当該酵素サンプルを、ＯＤ280＝０．５に相当する濃度に希釈し、１０マイクロリットルを、アガロース／レシチン−マトリックス中の穴にアプライする。プレートを３０℃でインキュベートし、プレートにおける反応ゾーンを、およそ４〜５時間、及び／又はおよそ２０時間インキュベーション後に確認する。フミコラ・ラヌギノーサリパーゼを、コントロールとして使用し、コントロールより大きなクリーニングゾーンの存在を、ホスホリパーゼ活性のポジティブな結果として採用する。
【実施例】
【００７９】
本発明を、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに記載する。
【００８０】
実施例１−ＧＺＥＬ結晶構造
タンパク質発現及び精製：ジベレラ・ゼアエ／フサリウム・グラミネアリウムリパーゼ（ＧＺＥＬ）遺伝子を、ＰＣＲで増幅し、さらに配列決定により確認した。その後、ＣＺＥＬ遺伝子を酵母において発現し、これはクマシー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで顕著なタンパク質バンドを示した。そして、活性は、ｐＨ７で、オリーブ油／ブライトグリーンプレートで検出した。ポジティブ候補クローンは、穴の周辺に暗緑色ゾーンを示した。
【００８１】
培養上清を遠心分離により細胞から分離し、及び上清のｐＨをｐＨ７．０に調節した。その後、当該上清を濾過し、そして０．３Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＮｉ−セファロースＦＦにアプライした。カラムから得たフラクションの活性を分析した。酵素活性を有するフラクションを、貯めて濃縮した。その後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５に、サンプルをロードした。溶出された活性リパーゼを濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で透析した。リパーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、純粋なフラクションを結晶化試験（crystallization trails）用に準備した。
【００８２】
結晶化：新たに調製したタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、懸濁蒸気拡散法を用いて、２９１Ｋで結晶化した。複数の結晶スクリーンキット（Hampton Researchスクリーンキット１及び２、Indexスクリーンキット、MembFacスクリーンキット）を用いて、初期結晶化条件をスクリーニングした。１マイクロリットルのタンパク質溶液を、１マイクロリットルの貯蔵溶液と混合し、２００マイクロリットルの貯蔵溶液に対して平衡化した。３日以内に、多くの異なる条件において、小結晶が見出された。当該結晶の多くは、中空の棒であり、且つ回折の質が不良である。適切な形状且つ良好な質の結晶を、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）、２５％ ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０、２〜４日以内（図３を参照されたい）の条件から選択し、これにより、空間群Ｐ２1２1２1を有する、約５０*５０*２００マイクロメートルの最終容量に到達できる。
【００８３】
データ収集及び加工：回折データセットの２．８Å分解能セットを、単一ＧＺＬＥ誘導体結晶から、自社製のＲｉｇａｋｕ ＭＭ−００８発生器及びＭａｒ３４５ｄｔｂ検出器を用いて、１００Ｋで収集した。オスミニウム鏡によりビームの焦点を合わせた。より詳細な分析のために、急速冷却した結晶を使用した。結晶を、抗凍結剤中に５〜１０秒浸漬させ、ループで取り出し、且つ１００Ｋまで冷却した窒素ガス流中で急速冷却した。抗凍結剤は、マザー液体貯蔵物に、２５％グリセロールを添加することにより調製された。結晶形は、非対称ユニット当たり４つのＧＺＬＥ分子を有する空間群Ｐ２1２1２1（ａ＝７８．４、ｂ＝９１．０、ｃ＝１９５．８、α＝β＝γ＝９０°）、且つ２．６Å３Ｄａ−１のＶＭ（Matthews 1968）に属し、４８％の溶媒含量に相当する。回折画像の加工及び積分強度のスケーリングを、ＨＫＬ２０００ソフトウェアパッケージ（Otwinowski et al. 1997）を用いて行った。
【００８４】
結果：当初、我々は多くのスクリーニングキットの条件で多数のＧＺＬＥ結晶を得られていたが、これらはＸ線結晶解析に不適である。多くの結晶は、中空の繊維である。したがって、さらなる結晶化の最適化を行い、そしてより良好な結晶を、以下の条件で得た。０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５、２５％ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０である。２μｌのタンパク質溶液及び２μｌの貯蔵溶液を含有する液滴を、２００μｌの貯蔵溶液に対して平衡化した。最適化貯蔵溶液（０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５、２５％ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０）からの結晶の成長は、Ｘ線結晶回折に適しており、且つ２．８Åで回折した。その後、データセットを単一の結晶から収集した（ＧＺＬＥ結晶の典型的な回折パターンを示す図４を参照されたい。暴露時間は３００秒、検出器距離は１５０ミリメーター、且つ１フレーム当たりの振動幅は１°であった）。非対称ユニット当たり４つの分子が存在する。完全なデータ収集統計を表４に示す。ＧＺＬＥの構造を決定し、これを別表１に開示する。
【００８５】
参考文献：Matthews, B.W., Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 1968. 33: p. 491-497。Otwinowski, Z. and W. Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode, in Macromolecular Crystallography, part A, C.W. Carter Jr. and R.M. Sweet, Editors. 1997, Academic Press. p. 307-326。
【００８６】
【表５】
【００８７】
実施例２−ＧＺＬＥへのペプチド結合
結晶構造の非対称ユニットにおいて、４つのＧＺＬＥ−ペプチド複合体が存在する。当該４つの複合体は、互いに独立に精製された。これらは、４つの異なる物体を構成する。この４つの異なる複合体において、ペプチドは、リパーゼコアドメインに対して正確に同じように置かれた。以下の表５を参照されたい。これは、リパーゼコアに対するペプチドの特異的結合についての別の証拠セットを提供する。
【００８８】
表５：最適重ね合わせでのＧＺＬＥ−ペプチドＣ−アルファ標準偏差。自社製の設計されたプログラムは、タンパク質原子座標の２つのセットを最適に重ね合わせ、４つのＧＺＬＥ−ペプチド対の各々において使用された。表の記入は、オングストローム単位での、重ね合わせにおける、Ｃ−アルファ原子の剰余（標準偏差）を示す。
【００８９】
【表６】
【００９０】
実施例３：結合実験のための、ペプチド欠失ＦｏＬの調製
ＦｏＬを、ＰｉｌｏｔファーメンテーションＬＶＦ５７ＵＦ濃縮ＰＰＷ６５２３から精製した。ＰＰＷ６５２３を、０．２２μｍで濾過し、且つブチルセファロースファストフローカラムにロードし、１．８Ｍ 酢酸ＮＨ4で洗浄し、且つＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで溶出した。精製ＦｏＬ：２００３−０４３１７−０１でのデータシート。ゲル等電点電気泳動ＩＥＦｐＨ３〜１０（Ｎｏｖｅｘプレキャスト）２００７０６２８において、サンプルは単一バンドを呈した。当該バンドのＮ−末端配列は、１つの配列、期待されるＦｏＬ Ｎ−末端のみを示し、Ｃ−末端ペプチドが結合していないことを示す。
【００９１】
実施例４：阻害アッセイ
これらの実験で使用される基質は、Sigma Aldrich製のブチル酸パラ−ニトロフェニル（ｐ−ＮＰ）であった。基質ストック溶液を、１８μＬのブチル酸ｐ−ＮＰを、１ｍｌの２−プロパノールに添加して調製し、１００ｍＭのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、１０μＬのストック溶液を、最終容量１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７バッファで希釈することにより調製した。５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファｐＨ７中の４５μＬのＦｏＬ １ｍｇ／ｍＬを、２つの濃度のペプチドで予備インキュベートし、コントロールは同じバッファを用いてペプチドの不存在下で行われた。室温で５分の予備インキュベーション後、酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７バッファで希釈し、１００μＬの希釈酵素溶液を、１００μＬの基質溶液と混合し、そしてその後、室温で一定に振とうしながら、マイクロタイタープレート分光光度計において反応を行った。以下の表６は、２つの異なる濃度でペプチドと共に予備インキュベートされた酵素、及びペプチド不存在下、正確に同じ方法で処理されたコントロールにより遊離された、ブチル酸ｐ−ＮＰの分解産物の１つであるｐ−ニトロフェノールを、Ａ405で観察した経時での（１０分間で３０秒毎）色発現を示す。
【００９２】
表６：ペプチド存在下及び不存在下での、ＦｏＬの活性のデータ。ＦｏＬの活性は、ペプチドの添加が、色発現の低減として決定される活性の阻害を引き起こしたことを実証した。ペプチド存在下でのＦｏＬは、最低の色発現を示したが、一方５×希釈ペプチドの存在下でのＦｏＬは、より高い色発現であり、さらに、水存在下のＦｏＬであるコントロールサンプルは、最高の色発現であった。
【００９３】
【表７】
【００９４】
実施例５−等電点測定
実施例４で調製したサンプルを、ＮｏｗｅｘゲルＩＥＦ３−１０にロードした。レーン１：マーカー、レーン２：サンプル１（１０μｌ）、レーン３：サンプル１（２０μｌ）、レーン４：サンプル２（１０μｌ）、レーン５：サンプル２（２０μｌ）、レーン６：サンプル３（１０μｌ）、レーン７：サンプル３（２０μｌ）。ゲルの写真を図６に示す。当該ゲルから、ペプチドの添加により、ｐＩに変化が引き起こされることが、ペプチド存在下のサンプル（レーン２〜５）より低いｐＩを有するバンド（レーン６及び７）により明らかになった。これは、酵素へのペプチドの結合の明確な指標である。
【００９５】
実施例６−レシチンプレートアッセイにおけるＴＬＬ及びＦｏＬの活性
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００不存在のレシチンプレートを、原料と方法に記載した通りに調製した。精製ＴＬＬ及びＦｏＬのＯＤ280に基づき同じ量を、２つの頂部の穴にＴＬＬを、２つの底部の穴にＦｏＬを；左の穴（低濃度、ＯＤ280が０．２に等しい）；右の穴（高濃度、ＯＤ280が０．５に等しい）として添加した。２０時間インキュベーション後、ＦｏＬは、低／高濃度で、７／１０ｍｍクリーニングゾーンを呈した。ＴＬＬは、クリーニングゾーンを示さなかった。
【００９６】
【表８】
【００９７】
実施例７−ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを産生するモネリンにおけるアルファヘリックスの改変方法
最近解析された、フサリウム・グラミネアリウム、別名ジベレラ・ゼアエの構造は、酵素の成熟のために通常切断されるＣ末端ペプチドが、当該構造に存在することを示している。当該ペプチドは、アルファヘリックス構造を採用し、且つホスホリパーゼの触媒ドメインに対して密集する。当該ペプチドは、小エステル対するホスホリパーゼ活性を阻害することが示されている。
【００９８】
モネリンは、アフリカン・セレンディピティ・ベリー由来の糖風味のタンパク質である。モネリンの構造は、５本のベータシートに対して垂直に密集した、長く部分的に露出したアルファヘリックスからなる。溶媒接近可能なアルファヘリックスの存在により、フサリウム・グラミネアリウムリパーゼ（ＦＧＬ）の非常に近いホモログであるフサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）のＣ末端ペプチドの阻害特性を移転する試みにおいて、タンパク質を、アルファヘリックスを改変する目的に十分適するものとする。２つの異なるモネリン変種を、ＦｏＬ阻害剤として設計した。
【００９９】
変種の概要：モネリンのアルファヘリックスじょうにＦｏＬのＣ末端ペプチドアルファヘリックスを重ね合わせることが可能な全ての方法を解析した後、２つの変種を見出した。変種の選択において、ウイルス検査は、ａ）モネリンのアルファヘリックスと、リパーゼの触媒ドメインと相互作用するＣ末端ペプチド残基のアラインメントを最大化すること、及びｂ）触媒ドメインを有するモネリンの他の部分の不一致を最小化すること、に焦点を当てた。ＮからＣ末端方向（平行）又はその逆（逆平行）のいずれかに適合する、ヘリックスの重ね合わせの２つの異なる可能性を確認した。
【０１００】
配列／構造：本研究において使用されるモネリンの配列を、図２（第二列）で示し、また、W. Kabsch and C. Sander, Biopolymers (1983) 22:2577-2637によって公開されたプログラムDictionary of Secondary Structure Prediction (ＤＳＳＰ)で計算された二次構造（第一列）を一緒に示す。ｂ／Ｂはベータストランドのことであり、ａ／Ａはアルファヘリックスのことである。重ね合わせのために使用したＲＣＳＢ ＰＤＢファイルは、１ＩＶ７であった。
【０１０１】
変種：２つのモネリン変種は、本研究の結果であった。これらを以下に記載する。
【０１０２】
ＭＯＮ１変種：リパーゼペプチドアルファヘリックスの重ね合わせが、モネリンアルファヘリックスと平行に整列させる場合、アミノ酸置換Ｆ１１Ｅ＋Ｑ１３Ｋ＋Ｎ１４Ｌ＋Ｌ１５Ｖ＋Ｋ１７Ｙ＋Ｆ１８Ｖ＋Ｎ２４Ｙ＋Ｋ２５Ｖ＋Ｉ７４Ａ＋Ｅ７７Ｒ＋Ｒ８２Ｇ＋Ｒ８３Ｇが作製される。これらの置換は、リパーゼ触媒ドメインとペプチドの相互作用を模倣することになり、且つ分子の残りの部分の可能性ある不一致を除去することになる。ＭＯＮ１の完全な配列は、図６に示される置換アミノ酸が赤のボールド体である。Ｐ１０をロイシンに変化させる（Ｐ１０Ｌ）ことは必要であってもよいが、この変化は、モネリンの全体的な安定性に有害となることが予想される。
【０１０３】
ＭＯＮ２変種：リパーゼペプチドアルファヘリックスの重ね合わせが、モネリンアルファヘリックスと逆平行に整列させる場合、アミノ酸置換は、Ｆ１１Ｙ＋Ｑ１３Ｎ＋Ｎ１４Ｌ＋Ｋ１７Ａ＋Ｆ１８Ｌ＋Ｋ２５Ｈ＋Ｆ３４Ｖ＋Ｒ８１Ｇ＋Ｒ８４Ｇが作製される。これらの置換は、リパーゼ触媒ドメインとペプチドの相互作用を模倣することになり、且つ分子の残りの部分の可能性ある不一致を除去することになる。ＭＯＮ２の完全な配列は、図７に示される置換アミノ酸が赤のボールド体である。
【０１０４】
実施例８−ＦｏＬ野生型及びＦｏＬ変種Ｉ２０７Ｅへの、様々なペプチドの阻害効果
酵素アッセイ：これらの実験で使用される基質は、ブチル酸パラ−ニトロフェニル（ｐ−ＮＰ）（N9876 Sigma Aldrich）であった。基質ストック溶液を、１８μＬのブチル酸ｐ−ＮＰを、１ｍｌの２−プロパノールに添加して調製し、１００ｍＭのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、５００μＬのストック溶液を、最終容量５０ｍｌの５００ｍＭ リン酸 ｐＨ７．０、０．４％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈することにより調製した。５００ｍＭ リン酸 ｐＨ７．０、０．４％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の４０μＬの酵素 ３８ｎｇ／ｍＬを、２から１２ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が０．５〜１０００となる様々な濃度を有する２０μＬのペプチドと予備インキュベートした。酵素基質ブランク含有の６０μｌをインキュベートした。最低でも１５分間予備加熱後、１００μＬの基質を添加し、室温で初期振とう（５秒）後、マイクロタイタープレート分光光度計（Molecular Devices製のSPECTRAmax PLUS 3）で反応を続けた。加水分解により遊離したブチル酸ｐ−ＮＰの分解産物の１つであるｐ−ニトロフェノールを測定し、Ａ405で経時での色発現を観察した（３０分間で１０秒毎）。
【０１０５】
初期反応率（時間に対してプロットされたＡ405の直線初期傾斜として決定される）を、阻害剤／リパーゼ比率の対数に対してプロットした。以下のモデルからＩＣ50値を決定した。
【０１０６】
【数１】
【０１０７】
ｖ0は初期反応率、ｖmaxは最大率、ｖminは最低反応率、及びＩＣ50は、最大阻害濃度の半分である。GraphPad Software, Inc.製のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（２００７年３月１２日、ｖ５．００）を回帰のために使用した。
【０１０８】
阻害％は、初期反応率の低減割合であり、ここで０％阻害はペプチド不存在下での初期反応率として定義される。
【０１０９】
【表９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
結果：図８は、初期反応率が様々なペプチド濃度（Ａ＆Ｂ）によりどれだけ変更されるかを示す。ペプチドの最低濃度で０％阻害であることを前提とすると、Ｐ０について曲線をプロットすると、（Ｃ）から、ＦｏＬ変種：Ｉ２０７Ｅが、野生型酵素よりペプチドの結合が良好であったことが明確である。
【０１１２】
実施例９−ＴＬＬ野生型及びＴＬＬ変種への、様々なペプチドの阻害効果
酵素アッセイ：上記のとおり、ペプチドＰ１１及びＰ１３を、２から１０ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が５〜５０００となる濃度で試験した。ペプチドＰ１２を、２から１０ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が６〜６０００となる濃度で試験した。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
結果：図９は、阻害％が、様々なペプチド濃度によりどれだけ変更されるかを示す（ペプチドブランクは０％阻害）。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
【表１６】
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
【表１８】
【０１２２】
【表１９】
【０１２３】
【表２０】
【０１２４】
【表２１】
【０１２５】
【表２２】
【０１２６】
【表２３】
【０１２７】
【表２４】
【０１２８】
【表２５】
【０１２９】
【表２６】
【０１３０】
【表２７】
【０１３１】
【表２８】
【０１３２】
【表２９】
【０１３３】
【表３０】
【０１３４】
【表３１】
【０１３５】
【表３２】
【０１３６】
【表３３】
【０１３７】
【表３４】
【０１３８】
【表３５】
【０１３９】
【表３６】
【０１４０】
【表３７】
【０１４１】
【表３８】
【０１４２】
【表３９】
【０１４３】
【表４０】
【０１４４】
【表４１】
【０１４５】
【表４２】
【０１４６】
【表４３】
【０１４７】
【表４４】
【０１４８】
【表４５】
【０１４９】
【表４６】
【０１５０】
【表４７】
【０１５１】
【表４８】
【０１５２】
【表４９】
【０１５３】
【表５０】
【０１５４】
【表５１】
【０１５５】
【表５２】
【０１５６】
【表５３】
【０１５７】
【表５４】
【０１５８】
【表５５】
【０１５９】
【表５６】
【０１６０】
【表５７】
【０１６１】
【表５８】
【０１６２】
【表５９】
【０１６３】
【表６０】
【０１６４】
【表６１】
【０１６５】
【表６２】
【０１６６】
【表６３】
【０１６７】
【表６４】
【０１６８】
【表６５】
【０１６９】
【表６６】
【０１７０】
【表６７】
【０１７１】
【表６８】
【０１７２】
【表６９】
【０１７３】
【表７０】
【配列表フリーテキスト】
【０１７４】
本出願は、コンピュータ読取可能な形式での配列リストを含む。当該コンピュータ読取可能な形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
配列番号１：フサリウム・オキシスポラム、ＦｏＬ
配列番号２：フサリウム・グラミネアリウム（graminearium）
配列番号３：ネクトリアリパーゼ１
配列番号４：ネクトリアリパーゼ２
配列番号５：フサリウム・ヘテロスポラム
配列番号６：フサリウム・セミテクタム（semitectum）
配列番号７：フサリウム・ソラニ ＬｉｐＣ
配列番号８：フサリウム・ソラニ ＬｉｐＤ
配列番号９：サーモマイセス・ラヌギノーサス，ＴＬＬ
配列番号１０：フサリウム・ベネナタム（venenatum）ＰＬＡ２、ＦＶＰＬＡ２
配列番号１１：プレクタシン
配列番号１２：モネリン
配列番号１３：プロテグリン
配列番号１４：バルナーゼ
配列番号１５：シスタチン
配列番号１６：アポリポタンパク質Ｅ
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リパーゼの分野に関する。特に、それはホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ポリペプチド、及び当該ペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに当該ペプチドの製造方法及び使用方法に関する。それはさらに、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチド、及びかかるペプチド及び／又はポリペプチドにより阻害され得るリパーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）は、トリアシルグリセロールの結合を加水分解し、及び非水系において、エステル化及びエステル転移（酸分解、アルコール分解、及びエステル交換）を触媒する。ホスホリパーゼ等のリパーゼには、細胞膜の構造と機能のために非常に重要であり、且つ最も豊富な膜脂質である、極性脂質のリン脂質におけるエステル結合を加水分解する。フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）ホスホリパーゼの２６アミノ酸Ｃ末端ペプチドは、Nagao et al., 1998, J. Biochem. 124:1124-29において、当該酵素活性に影響を及ぼすペプチド不存在下でリパーゼの熱安定性の向上に非常に重要な役割を果たすことが報告された。
【０００３】
例えば消化剤として、香料剤の作製のため、パン生地及びパン生地の焼き製品において、診断試薬として、洗剤の成分、光学分割の触媒として、等の脂質の広範囲に及ぶ使用の観点から、リパーゼの酵素活性を制御する意味を有することは望ましい。さらに、酵素活性について再生可能である酵素製剤を作製するという選択肢のために、製造の観点から、脂質分解活性の制御が好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、リパーゼ阻害活性を有するペプチド、及び当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター及び宿主細胞、及び当該ペプチドの製造方法及び使用方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、リパーゼ阻害活性を有するポリペプチド、及びかかるペプチド及び／又はポリペプチドにより阻害され得るリパーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、（ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号９の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；（ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；（ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は（ｄ）以下のアミノ酸配列：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチドに関する。
【０００６】
本発明はまた、ペプチド及びリパーゼを含んでなるポリペプチドに関し、ここでリパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【０００７】
本発明はまた、タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒近接可能な残基を有するタンパク質が、前記モチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正させている、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明はまた、前記ペプチド又はポリペプチドを含んでなる、単離ポリヌクレオチド、核酸構築物、組換え発現ベクター、組換え宿主細胞、及びホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド又はポリペプチドの製造方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ペプチド又はポリペプチドが、リパーゼに結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、前記ペプチド又はポリペプチドの使用に関する。
【００１０】
本発明はまた、前記ペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）ポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、リパーゼの活性が阻害される、リパーゼに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｆ．オキシスポラム（oxysporum）に対する、ホスホリパーゼの配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、オールベータ及びオールアルファタンパク質配列を示す。
【図３】図３は、Ｆ．オキシスポラムアルファヘリックスからの、残基の溶媒近接可能性を示す。
【図４】図４は、ＧＺＥＬの結晶を示す。
【図５】図５は、ＧＺＥＬ結晶の典型的な回折パターンを示す。
【図６】図６は、ＦｏＬ ＰＩのペプチド誘導性変化を示す。
【図７】図７は、モネリン変種１、ＭＯＮ１、及びモネリン変種２、ＭＯＮ２配列を示す。
【図８】図８は、様々なペプチドについての初期反応率における変化を示す。
【図９】図９は、様々なペプチド及びリパーゼについての、阻害％における変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
ホスホリパーゼ活性：本明細書において「ホスホリパーゼ活性」なる用語は、リン脂質を、脂肪酸及び他のリン脂質物質へ変換する、リン脂質分解（ＥＣ番号３．１．１．４）活性と定義される。本発明の目的として、ホスホリパーゼ活性は、ＰＨＬＵとして記載される手法、及び以下の「原料と方法」の段落で記載されるプレートアッセイにより決定される。
【００１３】
ホスホリパーゼ阻害活性：本明細書において「ホスホリパーゼ阻害活性」なる用語は、ホスホリパーゼ活性を阻害する活性として定義される。本発明のペプチドは、配列番号１の成熟ペプチドの、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％のホスホリパーゼ阻害活性を有する。
【００１４】
単離ペプチド／ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」なる用語は、それぞれ供給源から単離された、ペプチド又はポリペプチドのことを言う。ある態様によれば、前記ペプチド／ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣにより決定した場合、少なくとも１％純粋、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、又は少なくとも９０％純粋である。
【００１５】
同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列の関連性は、「同一性」により記載される。本発明の目的として、２つのアミノ酸間の同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降において実施される場合、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて決定される。使用される選択パラメータは、ｇａｐオープンペナルティ１０、ｇａｐ伸長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識化「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力は、同一性割合として使用され、且つ以下の通りに計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるＧａｐの総数）。本発明の目的として、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、上記の通り）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降において実施される場合、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970，上記の通り）を用いて決定される。使用される選択パラメータは、ｇａｐオープンペナルティ１０、ｇａｐ伸長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識化「最長同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力は、同一性割合として使用され、且つ以下の通りに計算される：（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるＧａｐの総数）。
【００１６】
相同配列：本明細書で「相同配列」なる用語は、ｔｆａｓｔｙサーチ（Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219）において０．００１以上のＥ値（又は期待値）を提供する予測されたタンパク質として定義される。相同性の度合いは、ＧＣＧプロフラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45)等の当該技術分野で既知のコンピュータプログラムにより好適に決定されてよい。本発明において、フサリウム・グラミネアリウム（Fusarium graminearium）、ネクトリアリパーゼ、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フサリウム・セミテクタム（Fusarium semitectum）、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・ヘテロスポラム、及びサーモマイセス・ラヌギノーサス（Thermomyces lanoginosus）（類義語：フミコラ・ラヌギノース（Humicola lanuginose））のリパーゼ配列における対応する（又は相同な）位置は、図１において示されるアラインメントにより規定される。アラインメントに示されないリパーゼ配列における相同位置を発見するために、注目の配列は、図１に示される配列に対して整列させる。新規な配列は、ＧＡＰプログラムにより発見される最も相同な配列に対しするＧＡＰアラインメントを用いて、図１における現在のアラインメントに対して整列させる。以下の設定は、ポリペプチド配列比較について使用される：３．０のＧＡＰ創出ペナルティ及び０．１のＧＡＰ伸長ペナルティ。
【００１７】
単離ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合「単離ポリヌクレオチド」は、供給源から単離されるポリヌクレオチドのことを言う。特定の態様によれば、当該ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動で決定した場合、少なくとも１％純粋、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、又は少なくとも９０％純粋である。
【００１８】
コード配列：本明細書で使用される場合、「コード配列」なる用語は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定する、ヌクレオチド配列のことを意味する。コード配列の境界は、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧ及びＴＴＧ等の代替的開始コドンで通常開始し、且つＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ等の終止コドンで終結する、オープンリーディングフレームにより一般的に決定される。当該コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成又は組換えヌクレオチド配列であってよい。
【００１９】
核酸構築物：本明細書で使用される場合「核酸構築物」なる用語は、一本鎖か二本鎖のいずれかであり、天然の遺伝子から単離されるか、そうでなければ天然に存在するはずの手順で核酸のセグメントを含有するように修正されるか、又は合成される、核酸分子のことを言う。核酸構築物なる用語は、当該核酸が、本発明のコード配列の発現のために必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」なる用語と類義語である。
【００２０】
制御配列：本明細書において「制御配列」なる用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同質であるか異質であるか、又は互いに同質であるか異質であってよい。かかる制御配列には、限定するものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、単一ペプチド配列、及び転写ターミネーターがある。最低でも、当該制御配列には、プロモーター、及び転写及び翻訳終止シグナルがある。当該制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域を有する制御配列のライゲーションを促進する特定の制限部位を誘導する目的で、リンカーを有してもよい。
【００２１】
作動的に結合する：本明細書において「作動的に結合する」なる用語は、制御配列がポリペプチドのコード配列の発現を方向付けるように、制御配列が、ポリヌクレオチド配列のコード配列と比較して適切な位置に置かれる配置のことを言う。
【００２２】
発現：「発現」なる用語は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップであり、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌がある。
【００２３】
本明細書では「発現ベクター」なる用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、且つその発現のために提供する追加のヌクレオチドと作動的に結合される、直線又は環状分子として定義される。
【００２４】
宿主細胞：本明細書で使用される場合「宿主細胞」なる用語には、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物又は発現ベクターを伴う、形質転換、形質移入、形質導入等の影響を受け易い任意の細胞型が含まれる。
【００２５】
変更：本明細書において「変更」なる用語は、配列番号１の成熟ポリペプチド、又はその相同配列からなるポリペプチドの、任意の化学的変更；及びかかるポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝的操作のことを意味する。当該変更は、１以上の（複数の）アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入、及び１以上の（複数の）アミノ酸側鎖の置換えがあり得る。本発明の修正されたアミノ酸について言及する際に、以下の命名を参照の簡略として使用する。「オリジナルアミノ酸：位置：（１又は複数の）置換アミノ酸」。この命名に従うと、例えば、位置１９５でのグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換は、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置におけるグリシンの欠失は、Ｇ１９５*、リジン（Ｋ）等の追加のアミノ酸残基の挿入は、Ｇ１９５ＧＫと示される。特定のリパーゼが、他のリパーゼと比較して「欠失」を含み、且つ挿入がかかる位置でなされる場合、位置３６でのアスパラギン酸（Ｄ）の挿入は、*３６Ｄとして示される。多重変異は、プラスで分離され、位置１７０及び１９５で、それぞれアルギニン（Ｒ）及びグルタミン酸（Ｅ）の、チロシン（Ｙ）及びグリシン（Ｇ）への置換する変異を表す、Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅがある。Ｘ２３１は、記載のアラインメント手法を適用すると、位置２３１に対応する親ポリペプチドにおけるアミノ酸を示す。Ｘ２３１Ｒは、当該アミノ酸がＲで置換されることを示す。配列番号２について、ＸはＴであり、すなわち、Ｘ２３１Ｒは、位置２３１におけるＴの、Ｒでの置換を示す。ある位置（例えば２３１）におけるアミノ酸が、例えば、Ｒ及びＰ及びＹからなる群等のアミノ酸群から選択される別のアミノ酸により置換されてもよい場合、これは、Ｘ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙと示されることになる。全ての場合において、受容されるＩＵＰＡＣの一文字又は３文字アミノ酸略字が使用される。
【００２６】
所与のアミノ酸残基が、酵素の表面に存在しているか否かに関係なく、例えば、プログラムＤＳＳＰで計算されるその溶媒接近可能表面が３０Å2の場合、W. Kabsch and C. Sander (1983) Biopolymers 22, pp. 2577-2637、タンパク質二次構造の辞書：水素結合及び幾何学的特徴のパターン認識に従って決定されてよい。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者等は、フサリウム・オキシスポラム又はフサリウム・グラミネアリウム（ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae））のＣ末端から単離され得るペプチドは、リパーゼと結合できることを見出した。彼等はさらに、フサリウム・オキシスポラムのペプチドは、ホスホリパーゼ阻害活性を有することを示した。すなわち、例えば、ネクトリアリパーゼ；ネクトリア・ヘマトコッカ（Nectria haematococca）（フサリウム・エウマルチイ（Fusarium eumartii)）；フサリウム・ソラニ；フサリウム・クルモルム；フサリウム・セミテクタム；及びフサリウム・ヘテロスポラム等の任意の好適なホスホリパーゼから単離される類似のＣ末端ペプチドは、ホスホリパーゼ活性を阻害するために使用できることを示す。
【００２８】
第一の態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号９の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；（ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；（ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は（ｄ）以下のアミノ酸配列：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチドに関する。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、長さが、５５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、又は３０アミノ酸未満であるペプチドに関する。
【００３０】
別の態様によれば、本発明は、アルファヘリックスの二次構造を有するペプチドに関する。
【００３１】
別の態様によれば、本発明は、モチーフ中に存在する、位置Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21の各々のアミノ酸が、Ｘ4がＡ又はＥ、Ｘ5がＥ又はＱ、Ｘ8がＫ又はＡ、Ｘ12がＳ又はＮ、Ｘ15がＥ、Ｑ又はＡ、Ｘ16がＬ又はＭ、Ｘ18がＫ又はＱ、及びＸ21がＩ又はＶ、から独立に選択されるペプチドに関する。
【００３２】
フサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）のペプチドは、当該リパーゼを阻害するペプチドの能力を増加又は低減するように変更されてよい。かかる変更の例を表１に示す。
【００３３】
表１：変化したペプチドにより野生型リパーゼの阻害を向上又は低減させるための、配列番号１の残基３１７〜３４６に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼ由来のホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチドにおける変更。
【００３４】
【表１】
【００３５】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１、Ｌ２９４、Ｅ２９５、Ｋ２９７、Ｌ２９８、Ｎ２９９、Ｙ３０１、Ｄ３０５、Ｋ３０６、Ｙ３０８、又はＶ３０９に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなるペプチドに関する。
【００３６】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１Ｅ；Ｌ２９４Ａ；Ｅ２９５Ｔ，Ｓ；Ｋ２９７Ｒ；Ｌ２９８Ａ；Ｎ２９９Ｄ，Ｅ；Ｙ３０１Ｗ；Ｄ３０５Ａ；Ｋ３０６Ｒ；Ｙ３０８Ｅ，Ｄ；又はＶ３０９Ｉ，Ｎ，Ｑに対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなるペプチドに関する。
【００３７】
ある場合には、ペプチドにおける変更は、ペプチドとリパーゼ間の結合における変化となってもよく、他の場合には変化がなくてもよいことは想定される。変化は、結合の向上又は低減を導いてもよく、したがって、当該ペプチドによるリパーゼの阻害の向上又は低減をもたらしてもよい。
【００３８】
ペプチドにおける変更に加えて、ペプチドとリパーゼとの間の相互作用は、リパーゼにおける変化により影響を受けてもよい。かかる変更は、向上した阻害又は低減した阻害の原因となってよい。フサリウム・オキシスポラムリパーゼのアミノ酸配列における変更の例を表２に示す。
【００３９】
表２：野生型ペプチドより、変化したリパーゼの向上又は低減した阻害を得るための、配列番号１の残基１〜３１６に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼにおける変更。
【００４０】
【表２】
【００４１】
別の態様によれば、本発明は、ペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
別の態様によれば、本発明は、発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも１つの制御配列に作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。
別の態様によれば、本発明は、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関する。
別の態様によれば、本発明は、核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞に関する。
【００４２】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）ペプチドの産生を行うための条件下、前記ペプチドの少なくとも１つの複製物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含んでなる、宿主細胞を培養するステップ、及び（ｂ）前記ペプチドを回収するステップ、
を含んでなる単離ペプチドの調製方法に関する。
【００４３】
あるいは、本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の従来的方法を用いて、インビトロ（in vitro）合成により調製されてよい。様々な市販の合成装置が利用可能であり、例えば、Applied Biosystems Inc., Beckman等による自動化合成装置がある。合成装置の使用により、天然のアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ−体）、例えば、Ｄ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、ジアステレオマー、異なる長さ又は機能を有する側鎖等で置換されてよい。特定の配列及び調製手法は、便利さ、経済的、純度の高さ等により決定されることになる。
【００４４】
当該ペプチドは、組換え合成の従来的方法に従って、単離及び精製してもよい。発現宿主の可溶化液を調製してもよく、且つ当該可溶化液は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、又は他の精製技術を用いて精製されてよい。ほとんどは、使用される組成物は、生成物の調製及びその精製の方法に関連する混入物に関して、所望の産物が、少なくとも２０重量％、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、及び治療目的では、通常少なくとも約９９．５重量％含まれることになる。通常、当該割合は、総タンパク質に基づくことになる。
【００４５】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼへペプチドが結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するためのペプチドの使用に関する。
【００４６】
リパーゼにはホスホリパーゼとして分類されないものもあり、及びホスホリパーゼ活性を持たないか、又はほとんど持たない親脂質分解酵素由来のホスホリパーゼ活性を有する変種から得ることが好ましく、例えば、当該変種は、リパーゼ活性に対するホスホリパーゼ活性の比率未満に対応するもの、又は５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないものである。
【００４７】
さらなる態様によれば、本発明は、前記ペプチドを含んでなるポリペプチド及びリパーゼに関し、ここで当該リパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【００４８】
別の態様によれば、本発明は、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼを含んでなるポリペプチドに関する。
【００４９】
阻害活性を有するペプチドを本来含まないリパーゼは、本発明の単離ペプチドにより阻害されるリパーゼ変種を得る目的で変更されてよい。これらのリパーゼ変種は、（ａ）単離ペプチド；（ｂ）かかるリパーゼ変種に付加するペプチド、又は（ｃ）阻害活性を有するペプチドを含んでなるポリペプチドのいずれかによって阻害されてよい。ペプチドとリパーゼ変種との間の結合相互作用は、ペプチドのアミノ酸配列を修正することによりさらに改変されてよい。
【００５０】
サーモマイセス・ラヌギノーサスリパーゼ（ＴＬＬ）は、本質的にはホスホリパーゼ活性を持たず、且つ現在のところ、このリパーゼが、任意のＣ−又はＮ−末端ペプチドを含んでなりその活性を制御及び／又は阻害することを示す情報はない。このリパーゼは、ＴＬＬを、フサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）ペプチドの結合の影響を受けやすくし、それによりその脂肪分解活性を阻害するアミノ酸変更を誘導するのに適するようにさせる構造を有する。かかる変更の例を表３（Ａ）に開示する。ＴＬＬ及び本発明の単離ペプチドの相互作用は、当該ペプチドにおける変更の導入によりさらに最適化されてよい。ＦｏＬのＣ末端ペプチドにおける変更の例を、表３（Ｂ）に示す。
【００５１】
表３：（Ａ）野生型ＦｏＬペプチドにより阻害されるリパーゼを産生する配列番号９の残基１〜２６９に対応するサーモマイセス・ラヌギノーサスリパーゼ（ＴＬＬ）における変更、及び（Ｂ）ＴＬＬの向上した阻害を得るための、配列番号１の残基２８８〜３１７に対応するフサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）由来のホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチドにおける変更。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＴＬＬ残基がＦｏＬ残基で置換される場合、全ての残基が、又は代替的に、ＴＬＬ配列から選択される少なくとも１つの残基が、以下のアラインメントによりＦｏＬ配列から選択される対応する残基で置換されてよい。
【００５４】
【表４】
【００５５】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼが、独立に、挿入、欠失、又は置換である少なくとも１つの変更を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５６】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼの少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｅ８７Ｒ、Ｉ９０Ｌ、Ｇ９１Ｔ、Ｉ２０２Ｐ、Ｒ２０９Ｌ、Ｅ２１０Ｉ、又はＴ２４４Ｌに対応する１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５７】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼが、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５５に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４６〜２５４での置換か、又はサーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５３に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４７〜２５２での置換を含んでなる、ポリペプチドに関する。
【００５８】
さらなる態様によれば、本発明は、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドに関し、ここでタンパク質の表面に局在するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒接近可能な残基を有するタンパク質は、記載される本発明のモチーフの、位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正されている。
【００５９】
別の態様によれば、本発明は前記ポリペプチドに関し、ここでタンパク質は、プレタシン（Plectasin）（配列番号１１）；モネリン（Monellin）（配列番号１２）；プロテグリン（Protegrin）（配列番号１３）；バルナーゼ（Barnase）（配列番号１４）；シトスタチン（Cytostatins）（配列番号１５）；又はアポリポタンパク質Ｅ（配列番号１６）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６０】
ホスホリパーゼ阻害か活性を有するポリペプチドを産生するのに適するタンパク質は、当該タンパク質の表面に暴露される少なくとも１つのアルファヘリックスを含まなければならない。当該アルファヘリックスに含まれるアミノ酸のいくつかは、リパーゼに結合でき、且つその阻害効果を発揮するために溶媒近接可能であることが必要である。アルファヘリックスのサイズは、２２アミノ酸、又は２０、１８、１６、１４、１２、又は１０アミノ酸であってよい。当該少なくとも１つのアルファヘリックスに加え、例えばベータストランド等の他の二次構造要素が存在してもよい。それらの二次構造に基づき、タンパク質の３つの主要な群：オールアルファ群、オールベータ群、及びアルファベータ群を規定できる。図２は、例えば、プレクタシン、モネリン、プロテグリン、バルナーゼ、及びシスタチン等のアルファベータ群に属するタンパク質の例、及びアポリポタンパク質Ｅ等のオールアルファ群に属するタンパク質の例を示す。当該アミノ酸配列は、第二列に示され、第一列は、プログラムDictionary of Secondary Structure Prediction (ＤＳＳＰ)により計算された二次構造のことを言い、ここでａ／Ａはアルファヘリックスを示し、且つｂ／Ｂはベータストランドのことを言う。
【００６１】
ホスホリパーゼ阻害ペプチドのアルファヘリックスは、以下のモネリンで例示されるような、２ステップの手法で、選択されたタンパク質のアルファヘリックスと（下線）重ね合わせてよく、且つ一緒に整列させてよい。
【００６２】
整列される配列の平行、又は逆平行のいずれかの方向の選択
【００６３】
【化１】
【００６４】
当該方向が選択されると、アルファヘリックスの配列を整列させる複数の可能性が存在する。最適なアラインメントは、共通する最大長さを含んでなり、且つ困難が（クラッシュ）最低数である。
【００６５】
【化２】
【００６６】
最適アラインメントの同定後、タンパク質アルファヘリックスにおける改変は、ホスホリパーゼ阻害ペプチドのアルファヘリックスへ、アミノ酸残基を変化させるようなされてもよい。図３に一例を示し、ここで、ＦｏＬのペプチドは、アルファヘリックスのどの部分とどのアミノ酸残基が酵素に面するか、且つどれが溶媒に面するか、を例示するために描かれている。特に、足場タンパク質の表面に面し、且つ溶媒近接可能であり、したがって、接触及びリパーゼの阻害に関与してもよい残基を考慮しなければならない。これらの残基は、モチーフ：Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22の、位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する。任意に、タンパク質の表面の端に見られ、且つ潜在的に溶媒近接可能であり、したがって、接触及びリパーゼの阻害に関与してもよい残基も考慮すべきである。これらの残基は、前記モチーフの、位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する。
【００６７】
最終的に、足場タンパク質のアルファヘリックスの、リパーゼへの結合に影響を及ぼすか、タンパク質内のアルファヘリックスの適応に影響を及ぼす可能性のある、他の及び／又は新規なクラッシュが存在する場合、タンパク質におけるアルファヘリックス外の部分を分析して同定する。その後、かかる残基は、ホスホリパーゼ阻害活性を最大化するよう任意に変化させる。これらはヘリックス外の変異である。
【００６８】
別の態様によれば、本発明は、リパーゼへのペプチドの付加のステップを含んでなる、本発明のポリペプチドの調製方法に関し、ここで当該リパーゼは、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない。
【００６９】
別の態様によれば、本発明は、（ａ）タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスを有するタンパク質を選択するステップであって、前記アルファヘリックスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの残基は、溶媒接近可能である；（ｂ）前記ペプチドを、前記タンパク質のアルファヘリックスと整列させるステップ；（ｃ）前記モチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒接近可能であるタンパク質のアルファヘリックスにおける残基を同定するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）において同定されたタンパク質における、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのアミノ酸を変更するステップ；（ｅ）前記ポリペプチドを、ホスホリパーゼ阻害活性について試験するステップ；（ｆ）ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを選択するステップ；及び（ｇ）（ｆ）において選択されたポリペプチドを作製するステップ、を含んでなるポリペプチドの調製方法に関する。
【００７０】
別の態様によれば、本発明は、ステップ（ｃ）において、前記モチーフの位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する潜在的に溶媒接近可能なタンパク質のアルファヘリックスにおける残基をさらに同定する方法に関する。
【００７１】
別の態様によれば、本発明は、前記タンパク質における１又は複数の位置で、少なくとも１つの変更がなされるステップをさらに含んでなる方法に関する。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドに含まれるペプチドがリパーゼへ結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、前記ポリペプチドの使用に関する。
【００７３】
さらなる態様によれば、本発明は、前記ペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）ポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、リパーゼの活性が阻害される、リパーゼに関する。
【００７４】
別の態様によれば、本発明は、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼに関する。
【００７５】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｌ９２；Ｒ９６；Ｌ２０３；Ｉ２０７；Ｒ２１１；Ｌ２４３；Ｌ２５０；又はＬ２５２に対応する置換である、リパーゼに関する。
【００７６】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサ（配列番号９）の残基Ｌ９２Ｄ，Ｅ，Ｗ；Ｒ９６Ｅ，Ｄ，Ａ；Ｌ２０３Ｗ，Ｋ，Ｍ；Ｉ２０７Ｄ，Ｅ；Ｒ２１１Ｈ；Ｌ２４３Ｗ，Ｋ；Ｌ２５０Ｄ，Ｅ，Ｒ；及びＬ２５２Ｓ，Ｔに対応する置換である、リパーゼに関する。
【００７７】
原料及び方法
ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）
ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）を、レシチンからの遊離脂肪酸の放出として測定する。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７中の、５０μｌの４％ Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（Avantiからの植物レシチン）、５ｍＭ ＣａＣｌ2を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７中で適切な濃度に希釈した５０μｌ酵素溶液に添加する。サンプルを、１０分間３０℃でインキュベートし、９５℃、５分間で反応を停止させた後、遠心分離した（７０００ｒｐｍで５分間）。遊離脂肪酸を、ＮＥＦＡ Ｃキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ製）を用いて決定する；２５μｌ反応混合物を、２５０μｌの試薬Ａに添加し、１０分間３７℃でインキュベーションする。その後、５００μｌの試薬Ｂを添加し、当該サンプルを再び１０分間３７℃でインキュベートする。５５０ｎｍでの吸収を、ＨＰ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度器を用いて測定する。サンプルは、少なくとも２重に試験する。基質及び酵素ブラインド（blinds)（予備加熱した（９５℃で１０分）酵素サンプル＋基質）を含有させる。オレイン酸を脂肪酸標準として使用する。１ＰＨＴＵは、これらの条件で、１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を放出できる酵素量と等しい。特定のホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ／ｍｇ）を、タンパク質量（ｍｇ）当たりのホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）で計算する。
【００７８】
精製水中で、５０ｍｌの２％アガロースを、５分間加熱により溶解させ、その後、６０〜６３℃に冷却する。０．２Ｍ ＮａＯＡｃ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．５中、５０ｍｌの２％植物Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン９５％を、３０分間６０℃で、１５秒間ｕｌｔｒａｔｈｏｒａｘで混合する。等量の２％アガロース及び２％レシチンを混合する。精製水中の２５０μｌの４ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレットを、指標として添加する。混合物を適切なペトリ皿（例えば、１４ｃｍφ皿における３０ｍｌ）に注ぎ、酵素溶液のアプライのために、適切な穴（３〜５ｍｍ）を寒天に作製する。当該酵素サンプルを、ＯＤ280＝０．５に相当する濃度に希釈し、１０マイクロリットルを、アガロース／レシチン−マトリックス中の穴にアプライする。プレートを３０℃でインキュベートし、プレートにおける反応ゾーンを、およそ４〜５時間、及び／又はおよそ２０時間インキュベーション後に確認する。フミコラ・ラヌギノーサリパーゼを、コントロールとして使用し、コントロールより大きなクリーニングゾーンの存在を、ホスホリパーゼ活性のポジティブな結果として採用する。
【実施例】
【００７９】
本発明を、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに記載する。
【００８０】
実施例１−ＧＺＥＬ結晶構造
タンパク質発現及び精製：ジベレラ・ゼアエ／フサリウム・グラミネアリウムリパーゼ（ＧＺＥＬ）遺伝子を、ＰＣＲで増幅し、さらに配列決定により確認した。その後、ＣＺＥＬ遺伝子を酵母において発現し、これはクマシー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで顕著なタンパク質バンドを示した。そして、活性は、ｐＨ７で、オリーブ油／ブライトグリーンプレートで検出した。ポジティブ候補クローンは、穴の周辺に暗緑色ゾーンを示した。
【００８１】
培養上清を遠心分離により細胞から分離し、及び上清のｐＨをｐＨ７．０に調節した。その後、当該上清を濾過し、そして０．３Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＮｉ−セファロースＦＦにアプライした。カラムから得たフラクションの活性を分析した。酵素活性を有するフラクションを、貯めて濃縮した。その後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５に、サンプルをロードした。溶出された活性リパーゼを濃縮し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で透析した。リパーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、純粋なフラクションを結晶化試験（crystallization trails）用に準備した。
【００８２】
結晶化：新たに調製したタンパク質を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、懸濁蒸気拡散法を用いて、２９１Ｋで結晶化した。複数の結晶スクリーンキット（Hampton Researchスクリーンキット１及び２、Indexスクリーンキット、MembFacスクリーンキット）を用いて、初期結晶化条件をスクリーニングした。１マイクロリットルのタンパク質溶液を、１マイクロリットルの貯蔵溶液と混合し、２００マイクロリットルの貯蔵溶液に対して平衡化した。３日以内に、多くの異なる条件において、小結晶が見出された。当該結晶の多くは、中空の棒であり、且つ回折の質が不良である。適切な形状且つ良好な質の結晶を、０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）、２５％ ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０、２〜４日以内（図３を参照されたい）の条件から選択し、これにより、空間群Ｐ２1２1２1を有する、約５０*５０*２００マイクロメートルの最終容量に到達できる。
【００８３】
データ収集及び加工：回折データセットの２．８Å分解能セットを、単一ＧＺＬＥ誘導体結晶から、自社製のＲｉｇａｋｕ ＭＭ−００８発生器及びＭａｒ３４５ｄｔｂ検出器を用いて、１００Ｋで収集した。オスミニウム鏡によりビームの焦点を合わせた。より詳細な分析のために、急速冷却した結晶を使用した。結晶を、抗凍結剤中に５〜１０秒浸漬させ、ループで取り出し、且つ１００Ｋまで冷却した窒素ガス流中で急速冷却した。抗凍結剤は、マザー液体貯蔵物に、２５％グリセロールを添加することにより調製された。結晶形は、非対称ユニット当たり４つのＧＺＬＥ分子を有する空間群Ｐ２1２1２1（ａ＝７８．４、ｂ＝９１．０、ｃ＝１９５．８、α＝β＝γ＝９０°）、且つ２．６Å３Ｄａ−１のＶＭ（Matthews 1968）に属し、４８％の溶媒含量に相当する。回折画像の加工及び積分強度のスケーリングを、ＨＫＬ２０００ソフトウェアパッケージ（Otwinowski et al. 1997）を用いて行った。
【００８４】
結果：当初、我々は多くのスクリーニングキットの条件で多数のＧＺＬＥ結晶を得られていたが、これらはＸ線結晶解析に不適である。多くの結晶は、中空の繊維である。したがって、さらなる結晶化の最適化を行い、そしてより良好な結晶を、以下の条件で得た。０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５、２５％ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０である。２μｌのタンパク質溶液及び２μｌの貯蔵溶液を含有する液滴を、２００μｌの貯蔵溶液に対して平衡化した。最適化貯蔵溶液（０．２Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ビス−Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．５、２５％ｗ／ｗ ＰＥＧ３３５０）からの結晶の成長は、Ｘ線結晶回折に適しており、且つ２．８Åで回折した。その後、データセットを単一の結晶から収集した（ＧＺＬＥ結晶の典型的な回折パターンを示す図４を参照されたい。暴露時間は３００秒、検出器距離は１５０ミリメーター、且つ１フレーム当たりの振動幅は１°であった）。非対称ユニット当たり４つの分子が存在する。完全なデータ収集統計を表４に示す。ＧＺＬＥの構造を決定し、これを別表１に開示する。
【００８５】
参考文献：Matthews, B.W., Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 1968. 33: p. 491-497。Otwinowski, Z. and W. Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode, in Macromolecular Crystallography, part A, C.W. Carter Jr. and R.M. Sweet, Editors. 1997, Academic Press. p. 307-326。
【００８６】
【表５】
【００８７】
実施例２−ＧＺＬＥへのペプチド結合
結晶構造の非対称ユニットにおいて、４つのＧＺＬＥ−ペプチド複合体が存在する。当該４つの複合体は、互いに独立に精製された。これらは、４つの異なる物体を構成する。この４つの異なる複合体において、ペプチドは、リパーゼコアドメインに対して正確に同じように置かれた。以下の表５を参照されたい。これは、リパーゼコアに対するペプチドの特異的結合についての別の証拠セットを提供する。
【００８８】
表５：最適重ね合わせでのＧＺＬＥ−ペプチドＣ−アルファ標準偏差。自社製の設計されたプログラムは、タンパク質原子座標の２つのセットを最適に重ね合わせ、４つのＧＺＬＥ−ペプチド対の各々において使用された。表の記入は、オングストローム単位での、重ね合わせにおける、Ｃ−アルファ原子の剰余（標準偏差）を示す。
【００８９】
【表６】
【００９０】
実施例３：結合実験のための、ペプチド欠失ＦｏＬの調製
ＦｏＬを、ＰｉｌｏｔファーメンテーションＬＶＦ５７ＵＦ濃縮ＰＰＷ６５２３から精製した。ＰＰＷ６５２３を、０．２２μｍで濾過し、且つブチルセファロースファストフローカラムにロードし、１．８Ｍ 酢酸ＮＨ4で洗浄し、且つＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで溶出した。精製ＦｏＬ：２００３−０４３１７−０１でのデータシート。ゲル等電点電気泳動ＩＥＦｐＨ３〜１０（Ｎｏｖｅｘプレキャスト）２００７０６２８において、サンプルは単一バンドを呈した。当該バンドのＮ−末端配列は、１つの配列、期待されるＦｏＬ Ｎ−末端のみを示し、Ｃ−末端ペプチドが結合していないことを示す。
【００９１】
実施例４：阻害アッセイ
これらの実験で使用される基質は、Sigma Aldrich製のブチル酸パラ−ニトロフェニル（ｐ−ＮＰ）であった。基質ストック溶液を、１８μＬのブチル酸ｐ−ＮＰを、１ｍｌの２−プロパノールに添加して調製し、１００ｍＭのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、１０μＬのストック溶液を、最終容量１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７バッファで希釈することにより調製した。５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファｐＨ７中の４５μＬのＦｏＬ １ｍｇ／ｍＬを、２つの濃度のペプチドで予備インキュベートし、コントロールは同じバッファを用いてペプチドの不存在下で行われた。室温で５分の予備インキュベーション後、酵素溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７バッファで希釈し、１００μＬの希釈酵素溶液を、１００μＬの基質溶液と混合し、そしてその後、室温で一定に振とうしながら、マイクロタイタープレート分光光度計において反応を行った。以下の表６は、２つの異なる濃度でペプチドと共に予備インキュベートされた酵素、及びペプチド不存在下、正確に同じ方法で処理されたコントロールにより遊離された、ブチル酸ｐ−ＮＰの分解産物の１つであるｐ−ニトロフェノールを、Ａ405で観察した経時での（１０分間で３０秒毎）色発現を示す。
【００９２】
表６：ペプチド存在下及び不存在下での、ＦｏＬの活性のデータ。ＦｏＬの活性は、ペプチドの添加が、色発現の低減として決定される活性の阻害を引き起こしたことを実証した。ペプチド存在下でのＦｏＬは、最低の色発現を示したが、一方５×希釈ペプチドの存在下でのＦｏＬは、より高い色発現であり、さらに、水存在下のＦｏＬであるコントロールサンプルは、最高の色発現であった。
【００９３】
【表７】
【００９４】
実施例５−等電点測定
実施例４で調製したサンプルを、ＮｏｗｅｘゲルＩＥＦ３−１０にロードした。レーン１：マーカー、レーン２：サンプル１（１０μｌ）、レーン３：サンプル１（２０μｌ）、レーン４：サンプル２（１０μｌ）、レーン５：サンプル２（２０μｌ）、レーン６：サンプル３（１０μｌ）、レーン７：サンプル３（２０μｌ）。ゲルの写真を図６に示す。当該ゲルから、ペプチドの添加により、ｐＩに変化が引き起こされることが、ペプチド存在下のサンプル（レーン２〜５）より低いｐＩを有するバンド（レーン６及び７）により明らかになった。これは、酵素へのペプチドの結合の明確な指標である。
【００９５】
実施例６−レシチンプレートアッセイにおけるＴＬＬ及びＦｏＬの活性
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００不存在のレシチンプレートを、原料と方法に記載した通りに調製した。精製ＴＬＬ及びＦｏＬのＯＤ280に基づき同じ量を、２つの頂部の穴にＴＬＬを、２つの底部の穴にＦｏＬを；左の穴（低濃度、ＯＤ280が０．２に等しい）；右の穴（高濃度、ＯＤ280が０．５に等しい）として添加した。２０時間インキュベーション後、ＦｏＬは、低／高濃度で、７／１０ｍｍクリーニングゾーンを呈した。ＴＬＬは、クリーニングゾーンを示さなかった。
【００９６】
【表８】
【００９７】
実施例７−ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを産生するモネリンにおけるアルファヘリックスの改変方法
最近解析された、フサリウム・グラミネアリウム、別名ジベレラ・ゼアエの構造は、酵素の成熟のために通常切断されるＣ末端ペプチドが、当該構造に存在することを示している。当該ペプチドは、アルファヘリックス構造を採用し、且つホスホリパーゼの触媒ドメインに対して密集する。当該ペプチドは、小エステル対するホスホリパーゼ活性を阻害することが示されている。
【００９８】
モネリンは、アフリカン・セレンディピティ・ベリー由来の糖風味のタンパク質である。モネリンの構造は、５本のベータシートに対して垂直に密集した、長く部分的に露出したアルファヘリックスからなる。溶媒接近可能なアルファヘリックスの存在により、フサリウム・グラミネアリウムリパーゼ（ＦＧＬ）の非常に近いホモログであるフサリウム・オキシスポラムリパーゼ（ＦｏＬ）のＣ末端ペプチドの阻害特性を移転する試みにおいて、タンパク質を、アルファヘリックスを改変する目的に十分適するものとする。２つの異なるモネリン変種を、ＦｏＬ阻害剤として設計した。
【００９９】
変種の概要：モネリンのアルファヘリックスじょうにＦｏＬのＣ末端ペプチドアルファヘリックスを重ね合わせることが可能な全ての方法を解析した後、２つの変種を見出した。変種の選択において、ウイルス検査は、ａ）モネリンのアルファヘリックスと、リパーゼの触媒ドメインと相互作用するＣ末端ペプチド残基のアラインメントを最大化すること、及びｂ）触媒ドメインを有するモネリンの他の部分の不一致を最小化すること、に焦点を当てた。ＮからＣ末端方向（平行）又はその逆（逆平行）のいずれかに適合する、ヘリックスの重ね合わせの２つの異なる可能性を確認した。
【０１００】
配列／構造：本研究において使用されるモネリンの配列を、図２（第二列）で示し、また、W. Kabsch and C. Sander, Biopolymers (1983) 22:2577-2637によって公開されたプログラムDictionary of Secondary Structure Prediction (ＤＳＳＰ)で計算された二次構造（第一列）を一緒に示す。ｂ／Ｂはベータストランドのことであり、ａ／Ａはアルファヘリックスのことである。重ね合わせのために使用したＲＣＳＢ ＰＤＢファイルは、１ＩＶ７であった。
【０１０１】
変種：２つのモネリン変種は、本研究の結果であった。これらを以下に記載する。
【０１０２】
ＭＯＮ１変種：リパーゼペプチドアルファヘリックスの重ね合わせが、モネリンアルファヘリックスと平行に整列させる場合、アミノ酸置換Ｆ１１Ｅ＋Ｑ１３Ｋ＋Ｎ１４Ｌ＋Ｌ１５Ｖ＋Ｋ１７Ｙ＋Ｆ１８Ｖ＋Ｎ２４Ｙ＋Ｋ２５Ｖ＋Ｉ７４Ａ＋Ｅ７７Ｒ＋Ｒ８２Ｇ＋Ｒ８３Ｇが作製される。これらの置換は、リパーゼ触媒ドメインとペプチドの相互作用を模倣することになり、且つ分子の残りの部分の可能性ある不一致を除去することになる。ＭＯＮ１の完全な配列は、図６に示される置換アミノ酸が赤のボールド体である。Ｐ１０をロイシンに変化させる（Ｐ１０Ｌ）ことは必要であってもよいが、この変化は、モネリンの全体的な安定性に有害となることが予想される。
【０１０３】
ＭＯＮ２変種：リパーゼペプチドアルファヘリックスの重ね合わせが、モネリンアルファヘリックスと逆平行に整列させる場合、アミノ酸置換は、Ｆ１１Ｙ＋Ｑ１３Ｎ＋Ｎ１４Ｌ＋Ｋ１７Ａ＋Ｆ１８Ｌ＋Ｋ２５Ｈ＋Ｆ３４Ｖ＋Ｒ８１Ｇ＋Ｒ８４Ｇが作製される。これらの置換は、リパーゼ触媒ドメインとペプチドの相互作用を模倣することになり、且つ分子の残りの部分の可能性ある不一致を除去することになる。ＭＯＮ２の完全な配列は、図７に示される置換アミノ酸が赤のボールド体である。
【０１０４】
実施例８−ＦｏＬ野生型及びＦｏＬ変種Ｉ２０７Ｅへの、様々なペプチドの阻害効果
酵素アッセイ：これらの実験で使用される基質は、ブチル酸パラ−ニトロフェニル（ｐ−ＮＰ）（N9876 Sigma Aldrich）であった。基質ストック溶液を、１８μＬのブチル酸ｐ−ＮＰを、１ｍｌの２−プロパノールに添加して調製し、１００ｍＭのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、５００μＬのストック溶液を、最終容量５０ｍｌの５００ｍＭ リン酸 ｐＨ７．０、０．４％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈することにより調製した。５００ｍＭ リン酸 ｐＨ７．０、０．４％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の４０μＬの酵素 ３８ｎｇ／ｍＬを、２から１２ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が０．５〜１０００となる様々な濃度を有する２０μＬのペプチドと予備インキュベートした。酵素基質ブランク含有の６０μｌをインキュベートした。最低でも１５分間予備加熱後、１００μＬの基質を添加し、室温で初期振とう（５秒）後、マイクロタイタープレート分光光度計（Molecular Devices製のSPECTRAmax PLUS 3）で反応を続けた。加水分解により遊離したブチル酸ｐ−ＮＰの分解産物の１つであるｐ−ニトロフェノールを測定し、Ａ405で経時での色発現を観察した（３０分間で１０秒毎）。
【０１０５】
初期反応率（時間に対してプロットされたＡ405の直線初期傾斜として決定される）を、阻害剤／リパーゼ比率の対数に対してプロットした。以下のモデルからＩＣ50値を決定した。
【０１０６】
【数１】
【０１０７】
ｖ0は初期反応率、ｖmaxは最大率、ｖminは最低反応率、及びＩＣ50は、最大阻害濃度の半分である。GraphPad Software, Inc.製のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（２００７年３月１２日、ｖ５．００）を回帰のために使用した。
【０１０８】
阻害％は、初期反応率の低減割合であり、ここで０％阻害はペプチド不存在下での初期反応率として定義される。
【０１０９】
【表９】
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
結果：図８は、初期反応率が様々なペプチド濃度（Ａ＆Ｂ）によりどれだけ変更されるかを示す。ペプチドの最低濃度で０％阻害であることを前提とすると、Ｐ０について曲線をプロットすると、（Ｃ）から、ＦｏＬ変種：Ｉ２０７Ｅが、野生型酵素よりペプチドの結合が良好であったことが明確である。
【０１１２】
実施例９−ＴＬＬ野生型及びＴＬＬ変種への、様々なペプチドの阻害効果
酵素アッセイ：上記のとおり、ペプチドＰ１１及びＰ１３を、２から１０ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が５〜５０００となる濃度で試験した。ペプチドＰ１２を、２から１０ステップの因子で増加する、ペプチド／リパーゼ比率が６〜６０００となる濃度で試験した。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】
結果：図９は、阻害％が、様々なペプチド濃度によりどれだけ変更されるかを示す（ペプチドブランクは０％阻害）。
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
【表１６】
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
【表１８】
【０１２２】
【表１９】
【０１２３】
【表２０】
【０１２４】
【表２１】
【０１２５】
【表２２】
【０１２６】
【表２３】
【０１２７】
【表２４】
【０１２８】
【表２５】
【０１２９】
【表２６】
【０１３０】
【表２７】
【０１３１】
【表２８】
【０１３２】
【表２９】
【０１３３】
【表３０】
【０１３４】
【表３１】
【０１３５】
【表３２】
【０１３６】
【表３３】
【０１３７】
【表３４】
【０１３８】
【表３５】
【０１３９】
【表３６】
【０１４０】
【表３７】
【０１４１】
【表３８】
【０１４２】
【表３９】
【０１４３】
【表４０】
【０１４４】
【表４１】
【０１４５】
【表４２】
【０１４６】
【表４３】
【０１４７】
【表４４】
【０１４８】
【表４５】
【０１４９】
【表４６】
【０１５０】
【表４７】
【０１５１】
【表４８】
【０１５２】
【表４９】
【０１５３】
【表５０】
【０１５４】
【表５１】
【０１５５】
【表５２】
【０１５６】
【表５３】
【０１５７】
【表５４】
【０１５８】
【表５５】
【０１５９】
【表５６】
【０１６０】
【表５７】
【０１６１】
【表５８】
【０１６２】
【表５９】
【０１６３】
【表６０】
【０１６４】
【表６１】
【０１６５】
【表６２】
【０１６６】
【表６３】
【０１６７】
【表６４】
【０１６８】
【表６５】
【０１６９】
【表６６】
【０１７０】
【表６７】
【０１７１】
【表６８】
【０１７２】
【表６９】
【０１７３】
【表７０】
【配列表フリーテキスト】
【０１７４】
本出願は、コンピュータ読取可能な形式での配列リストを含む。当該コンピュータ読取可能な形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
配列番号１：フサリウム・オキシスポラム、ＦｏＬ
配列番号２：フサリウム・グラミネアリウム（graminearium）
配列番号３：ネクトリアリパーゼ１
配列番号４：ネクトリアリパーゼ２
配列番号５：フサリウム・ヘテロスポラム
配列番号６：フサリウム・セミテクタム（semitectum）
配列番号７：フサリウム・ソラニ ＬｉｐＣ
配列番号８：フサリウム・ソラニ ＬｉｐＤ
配列番号９：サーモマイセス・ラヌギノーサス，ＴＬＬ
配列番号１０：フサリウム・ベネナタム（venenatum）ＰＬＡ２、ＦＶＰＬＡ２
配列番号１１：プレクタシン
配列番号１２：モネリン
配列番号１３：プロテグリン
配列番号１４：バルナーゼ
配列番号１５：シスタチン
配列番号１６：アポリポタンパク質Ｅ
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号１０の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；
ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；
ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は
ｄ）以下のアミノ酸配列：
Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22
（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、
から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド。
【請求項２】
長さが、５５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、又は３０アミノ酸未満である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
長さが、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、又は少なくとも２５アミノ酸である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
アルファヘリックスの二次構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記モチーフ中に存在する、位置Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21の各々のアミノ酸が、Ｘ4がＡ又はＥ、Ｘ5がＥ又はＱ、Ｘ8がＫ又はＡ、Ｘ12がＳ又はＮ、Ｘ15がＥ、Ｑ又はＡ、Ｘ16がＬ又はＭ、Ｘ18がＫ又はＱ、及びＸ21がＩ又はＶ、から独立に選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１、Ｌ２９４、Ｅ２９５、Ｋ２９７、Ｌ２９８、Ｎ２９９、Ｙ３０１、Ｄ３０５、Ｋ３０６、Ｙ３０８、又はＶ３０９に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１Ｅ；Ｌ２９４Ａ；Ｅ２９５Ｔ，Ｓ；Ｋ２９７Ｒ；Ｌ２９８Ａ；Ｎ２９９Ｄ，Ｅ；Ｙ３０１Ｗ；Ｄ３０５Ａ；Ｋ３０６Ｒ；Ｙ３０８Ｅ，Ｄ；又はＶ３０９Ｉ，Ｎ，Ｑに対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する請求項８に記載のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸構築物又は請求項１０に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）前記ペプチドの産生を行うための条件下、前記ペプチドの少なくとも１つの複製物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含んでなる、宿主細胞を培養するステップ、及び
ｂ）前記ペプチドを回収するステップ、
を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ペプチドの調製方法。
【請求項１３】
リパーゼに前記ペプチドが結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド及びリパーゼを含んでなり、前記リパーゼが、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、ポリペプチド。
【請求項１５】
サーモマイセス・ラヌギノーサス（Thermomyces lanuginosus）（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼを含んでなる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記リパーゼが、独立に、挿入、欠失、又は置換である少なくとも１つの変更を含んでなる、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記リパーゼの少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｅ８７Ｒ、Ｉ９０Ｌ、Ｇ９１Ｔ、Ｉ２０２Ｐ、Ｒ２０９Ｌ、Ｅ２１０Ｉ、又はＴ２４４Ｌに対応する１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記リパーゼが、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５５に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（配列番号１）の残基２４６〜２５４での置換か、又はサーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５３に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４７〜２５２での置換を含んでなる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
タンパク質の表面に局在するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒接近可能な残基を有するタンパク質が、請求項１に記載のモチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正されている、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項２０】
前記親タンパク質が、プレタシン（Plectasin）（配列番号１１）；モネリン（Monellin）（配列番号１２）；プロテグリン（Protegrin）（配列番号１３）；バルナーゼ（Barnase）（配列番号１４）；シトスタチン（Cytostatins）（配列番号１５）；又はアポリポタンパク質Ｅ（配列番号１６）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドがリパーゼに付加するステップを含んでなり、前記リパーゼが、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項２２】
ａ）タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスを有するタンパク質を選択するステップであって、前記アルファヘリックスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの残基は、溶媒接近可能である；
ｂ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを、前記タンパク質のアルファヘリックスと整列させるステップ；
ｃ）請求項１に記載のモチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒接近可能であるタンパク質のアルファヘリックスにおける残基を同定するステップ；
ｄ）ステップ（ｃ）において同定されたタンパク質における、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのアミノ酸を変更するステップ；
ｅ）前記ポリペプチドを、ホスホリパーゼ阻害活性について試験するステップ；
ｆ）ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを選択するステップ；及び
ｇ）（ｆ）において選択されたポリペプチドを作製するステップ、
を含んでなるポリペプチドの調製方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）において、請求項１に記載のモチーフの位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する潜在的に溶媒接近可能なタンパク質のアルファヘリックスにおける残基をさらに同定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質における１又は複数の位置で、少なくとも１つの変更がなされるステップをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドに含まれるペプチドがリパーゼへ結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、ここで前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、前記リパーゼの活性が阻害される、リパーゼ。
【請求項２７】
サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一である、請求項２６に記載のリパーゼ。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｌ９２；Ｒ９６；Ｌ２０３；Ｉ２０７；Ｒ２１１；Ｌ２４３；Ｌ２５０；又はＬ２５２に対応する置換である、請求項２７に記載のリパーゼ。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサ（配列番号９）の残基Ｌ９２Ｄ，Ｅ，Ｗ；Ｒ９６Ｅ，Ｄ，Ａ；Ｌ２０３Ｗ，Ｋ，Ｍ；Ｉ２０７Ｄ，Ｅ；Ｒ２１１Ｈ；Ｌ２４３Ｗ，Ｋ；Ｌ２５０Ｄ，Ｅ，Ｒ；及びＬ２５２Ｓ，Ｔに対応する置換である、請求項２８に記載のリパーゼ。
【請求項１】
ａ）配列番号１の残基２８９〜３１０又は配列番号１０の残基１５４〜１７５と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド；
ｂ）配列番号１のペプチドコード配列、又は当該配列番号１のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド；
ｃ）配列番号１の残基２８９〜３１０と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド；又は
ｄ）以下のアミノ酸配列：
Ｍ1Ｔ2Ｄ3Ｘ4Ｘ5Ｌ6Ｅ7Ｘ8Ｋ9Ｌ10Ｎ11Ｘ12Ｙ13Ｖ14Ｘ15Ｘ16Ｄ17Ｘ18Ｅ19Ｙ20Ｘ21Ｋ22
（式中、Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21は、独立に任意のアミノ酸であってよい）を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、
から選択され、サイズが６０アミノ酸（ａａ）未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド。
【請求項２】
長さが、５５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、又は３０アミノ酸未満である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
長さが、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、又は少なくとも２５アミノ酸である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
アルファヘリックスの二次構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記モチーフ中に存在する、位置Ｘ4,、Ｘ5、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ18,、及びＸ21の各々のアミノ酸が、Ｘ4がＡ又はＥ、Ｘ5がＥ又はＱ、Ｘ8がＫ又はＡ、Ｘ12がＳ又はＮ、Ｘ15がＥ、Ｑ又はＡ、Ｘ16がＬ又はＭ、Ｘ18がＫ又はＱ、及びＸ21がＩ又はＶ、から独立に選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１、Ｌ２９４、Ｅ２９５、Ｋ２９７、Ｌ２９８、Ｎ２９９、Ｙ３０１、Ｄ３０５、Ｋ３０６、Ｙ３０８、又はＶ３０９に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号１と比較して、ＦｏＬ残基Ｄ２９１Ｅ；Ｌ２９４Ａ；Ｅ２９５Ｔ，Ｓ；Ｋ２９７Ｒ；Ｌ２９８Ａ；Ｎ２９９Ｄ，Ｅ；Ｙ３０１Ｗ；Ｄ３０５Ａ；Ｋ３０６Ｒ；Ｙ３０８Ｅ，Ｄ；又はＶ３０９Ｉ，Ｎ，Ｑに対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも１つの制御配列に作動的に結合する請求項８に記載のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸構築物又は請求項１０に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）前記ペプチドの産生を行うための条件下、前記ペプチドの少なくとも１つの複製物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含んでなる、宿主細胞を培養するステップ、及び
ｂ）前記ペプチドを回収するステップ、
を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ペプチドの調製方法。
【請求項１３】
リパーゼに前記ペプチドが結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド及びリパーゼを含んでなり、前記リパーゼが、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、ポリペプチド。
【請求項１５】
サーモマイセス・ラヌギノーサス（Thermomyces lanuginosus）（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるリパーゼを含んでなる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記リパーゼが、独立に、挿入、欠失、又は置換である少なくとも１つの変更を含んでなる、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記リパーゼの少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｅ８７Ｒ、Ｉ９０Ｌ、Ｇ９１Ｔ、Ｉ２０２Ｐ、Ｒ２０９Ｌ、Ｅ２１０Ｉ、又はＴ２４４Ｌに対応する１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記リパーゼが、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５５に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（配列番号１）の残基２４６〜２５４での置換か、又はサーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の２４８〜２５３に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム（配列番号１）の残基２４７〜２５２での置換を含んでなる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
タンパク質の表面に局在するアルファヘリックスの少なくとも３つの溶媒接近可能な残基を有するタンパク質が、請求項１に記載のモチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒近接可能な残基、及び／又は位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する末端残基の少なくとも１つで、アルファヘリックスにおいて修正されている、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチド。
【請求項２０】
前記親タンパク質が、プレタシン（Plectasin）（配列番号１１）；モネリン（Monellin）（配列番号１２）；プロテグリン（Protegrin）（配列番号１３）；バルナーゼ（Barnase）（配列番号１４）；シトスタチン（Cytostatins）（配列番号１５）；又はアポリポタンパク質Ｅ（配列番号１６）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドがリパーゼに付加するステップを含んでなり、前記リパーゼが、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項２２】
ａ）タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスを有するタンパク質を選択するステップであって、前記アルファヘリックスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの残基は、溶媒接近可能である；
ｂ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを、前記タンパク質のアルファヘリックスと整列させるステップ；
ｃ）請求項１に記載のモチーフの位置Ｄ3、Ｌ6、Ｌ10、Ｙ13、Ｖ14、Ｄ17、及びＸ21に対応する溶媒接近可能であるタンパク質のアルファヘリックスにおける残基を同定するステップ；
ｄ）ステップ（ｃ）において同定されたタンパク質における、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのアミノ酸を変更するステップ；
ｅ）前記ポリペプチドを、ホスホリパーゼ阻害活性について試験するステップ；
ｆ）ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを選択するステップ；及び
ｇ）（ｆ）において選択されたポリペプチドを作製するステップ、
を含んでなるポリペプチドの調製方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）において、請求項１に記載のモチーフの位置Ｅ7、Ｋ9、Ｎ11、Ｘ18、及びＹ20に対応する潜在的に溶媒接近可能なタンパク質のアルファヘリックスにおける残基をさらに同定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質における１又は複数の位置で、少なくとも１つの変更がなされるステップをさらに含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドに含まれるペプチドがリパーゼへ結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドにより阻害され得る、５０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、４０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、３０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、２０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、１０ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、５ＰＨＬＵ／ｍｇ未満、又は１ＰＨＬＵ／ｍｇ未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び／又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、ここで前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも１つの変更を含んでなり、それにより、（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド；又は（ｂ）請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも１つが結合する際に、前記リパーゼの活性が阻害される、リパーゼ。
【請求項２７】
サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％同一である、請求項２６に記載のリパーゼ。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（配列番号９）の残基Ｌ９２；Ｒ９６；Ｌ２０３；Ｉ２０７；Ｒ２１１；Ｌ２４３；Ｌ２５０；又はＬ２５２に対応する置換である、請求項２７に記載のリパーゼ。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサ（配列番号９）の残基Ｌ９２Ｄ，Ｅ，Ｗ；Ｒ９６Ｅ，Ｄ，Ａ；Ｌ２０３Ｗ，Ｋ，Ｍ；Ｉ２０７Ｄ，Ｅ；Ｒ２１１Ｈ；Ｌ２４３Ｗ，Ｋ；Ｌ２５０Ｄ，Ｅ，Ｒ；及びＬ２５２Ｓ，Ｔに対応する置換である、請求項２８に記載のリパーゼ。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５１８５７２（Ｐ２０１１−５１８５７２Ａ）
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６７２３（Ｐ２０１１−５０６７２３）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５２８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３１７７
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５２８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３１７７
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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