ポリアクリル酸塩および化学誘引物質を含む粘膜付着性組成物
本発明は、ポリマーを含むアクリル酸および化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６またはそれ未満である、該組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達系またはこれに関連する改良に関し、特に生殖器薬物送達系に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、上皮細胞が、サイトカインの産生による粘膜扁平上皮における免疫反応に影響を与え得るという証拠が蓄積されつつある。角化細胞によって産生される顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞（ＤＣ）の上皮細胞への移行およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）へのその分化のための選択的化学誘引分子として作用する（Kaplan et al，１９９２； Pastore et al，１９９７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＭ−ＣＳＦへのＬＣ／ＤＣの曝露により、その生存が延長され、リンパ球への抗原提示能力が増大する（Koch et al，１９９０）。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでは、いくつかの癌腫によって産生されたＧＭ−ＣＳＦの量と腫瘍関連ＤＣの分布／分化との間に相関関係が認められている（Colasante et al，１９９５）。本発明者らは、以前に、器官型ラフト培養（raft culture）系の使用によって、ＧＭ−ＣＳＦがｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された（前）癌上皮におけるＬＣ／ＤＣのコロニー形成増強の強力な因子であることを証明した（Hubert et al，１９９９）。さらに、ＤＣによる器官型培養の浸潤によって、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）によって形質転換された角化細胞のアポトーシスが特に誘導されるのに対して、ＤＣは影響を受けなかった（Hubert et al，２００１）。
【０００３】
これらのデータにより、ＤＣのウイルス感染上皮および／または（前）癌上皮への動員が、抗ウイルス免疫応答および抗腫瘍免疫応答の刺激だけでなく、ウイルス感染細胞および形質転換細胞の死滅の誘導によっても有益であり得ることが示唆される。
【０００４】
ＨＰＶ感染に起因する罹患率および死亡率は、開発途上国および先進工業国における主な健康上の問題であり、この疾患に起因する直接または間接的費用は非常に高い。ＨＰＶは、良性の性器疣から浸潤癌までの範囲の疾患を誘導する、一般的な性感染性病原体である。いくつかのＨＰＶ型は、特に子宮頸部における悪性腫瘍形質転換過程に直接関与することが示されている。９９％までの子宮頸癌およびその前駆物質（扁平上皮内病変；ＳＩＬ）は、発癌性ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）による感染に起因し得る（Bosch et al，１９９５）。しかし、ＨＰＶのみでは、腫瘍の進行に十分ではない（Herrington, １９９５）。ＨＰＶ感染およびその後のＳＩＬ発症の制御における内因性免疫の役割は、細胞性免疫が低下した患者におけるＨＰＶ関連病変の頻度の増加によって間接的に示されている（Petry et al，１９９４；Ellerbrock et al，２０００）。ウイルス抗原が大部分の前癌性病変で発現しているにもかかわらず、浸潤癌へ進行し得え、これは抗原提示機能におけるいくつかの定性的および／または定量的混乱の存在が示唆される。この仮説は、ほとんどの性器疣およびＳＩＬが正常な対合（paired）扁平上皮と比較したＬＣの密度および機能の低下によって特徴づけられるという所見によって強化される（Giannini et al，２００２；McArdle and Muller，１９８６；Morelli et al，１９９４）。免疫系が明らかに疾患の自然な経過に対する影響で重要な役割を果たすので、免疫応答調整物質がこれらの病変に対して治療的価値を有し得るといういくつかの証拠が存在する。細胞性免疫応答の誘導および調節におけるＤＣ／ＬＣの中心的役割のために、これらの細胞の動員および機能を調整する薬物は臨床的に興味深い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生殖器薬送達に関連する１つの主な問題は、子宮頸部または膣の防御機構によって課された生理学的状態により、投与した薬物の粘膜への接触時間が制限されて治療有効性の持続時間が短くなり、投与計画を頻繁にする必要が頻繁にあることである（Robinson and Bologna，１９９４；Valenta et al，２００１）。患者は、挿入物または軟膏などの他の従来の投薬形態よりも良好にゲルに耐えられることが公知である。いくつかの生体接着性ポリマー（bioadhesive polymer）は、上皮に局所的副作用を誘導することなく薬物の粘膜表面との接触を延長する機会について非常に注目されている（Richardson at al，１９９６）。
【０００６】
これらの問題を改善する方法を模索した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、アクリル酸含有ポリマーおよび化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６またはそれ未満である、粘膜付着性医薬組成物が提供される。
【０００８】
化学誘引物質は、一般に、樹状細胞および／またはランゲルハンス細胞などの免疫細胞の動員を調整する薬物であると理解されている。本発明で使用される化学誘引物質は、好ましくは、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、モルグラモスチム（molgramostim））、ＭＩＰ３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）、ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）、および／またはＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）である。より好ましくは、化学誘引物質は、ＧＭ−ＣＳＦである。
【０００９】
本発明の化学誘引物質は、大腸菌（E. coli）などの細菌発現系で産生される。
【００１０】
化学誘引物質は、医薬組成物中に３０００００国際単位（ＩＵ）から１００００００国際単位（ＩＵ）までの濃度で存在する。
【００１１】
アクリル酸含有ポリマーは、好ましくは、ポリカルボフィル（ジビニルグリコールと架橋した高分子量の合成アクリル酸ポリマー）である。
【００１２】
より好ましくは、９７．〜９９．９％の精製水と混合してヒドロゲルを形成する。ヒドロゲルの粘度は、１００００ｃＰと１１００００ｃＰ（ブルックフィールド粘度）との間である。
【００１３】
組成物のｐＨは、好ましくは５．５またはそれ未満である。より好ましくは、５から５．５までである。ゲルのｐＨを、トロメタモールまたは水酸化ナトリウムなどのアルカリで至適化する。
【００１４】
本発明による組成物は、任意選択的に、メチルパラヒドロベンゾエートまたはプロピルパラヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤および／または安定剤をさらに含む。
【００１５】
適切なキャリア、賦形剤、および他の薬剤を、組成物に組み込んで、輸送および送達などを改良することもできる。
【００１６】
また本発明によれば、粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための、本発明による組成物を提供する。
【００１７】
肛門性器疾患は、膣、子宮頸部、または直腸の疾患を意味する。
【００１８】
本発明によれば、粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための薬物の製造における、本発明による組成物の使用をさらに提供する。
【００１９】
本発明によれば、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法であって、医学的有効量の本発明による組成物をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法も提供する。典型的には、直接投与による治療を、症状を軽減、防止、または改善するのに十分な期間で毎日、毎週、または毎月行う。
【００２０】
本発明の組成物はまた、組成物を持続放出または徐放するための持続型デバイス、インプラント、またはカプセル化処方物で投与することもできる。
【００２１】
驚いたことに、アクリル酸含有ポリマー、特に、ｐＨ５．５でヒドロゲルの形態のポリカルボフィルが、４℃または３７℃で化学誘引分子（ＧＭ−ＣＳＦ）の生物活性を少なくとも２１日間保持するのに対して、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポロクサマーヒドロゲルへの組み込み後に両温度での化学誘引分子（ＧＭ−ＣＳＦ）の生物活性が減少することが見出された。
【００２２】
驚いたことに、ｐＨ６．９で両ゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの残存生物活性が異なっていた。これらのデータは、ポリカルボフィルゲル中に存在し、且つヒドロキシプロピルセルロースおよびポロクサマー処方物中に存在しないカルボキシル基部分のイオン化に起因し得る。
【００２３】
ｐＨ値５．５で処方されたポリカルボフィルヒドロゲル中での貯蔵後に評価されたＧＭ−ＣＳＦの生物活性は、溶液中のＧＭ−ＣＳＦで認められた生物活性よりも良好であった。
【発明の効果】
【００２４】
実施例におけるこれらの結果は、ポリカルボフィルゲル（Ｎｏｖｅｏｎ）が生物活性ＧＭ−ＣＳＦの拡散に適合してタンパク質を有利に安定化することを示す。さらに、このゲル処方物中に含まれるＧＭ−ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＨＰＶ形質転換（前）癌上皮組織へＤＣを動員することもできる。したがって、生殖器適用に適切なこの処方物は、ＨＰＶ関連病変で変化したことが示された免疫機能を回復する。
【００２５】
本発明を、以下の図面を参照して例示する。
【００２６】
本発明を、以下の実施例を参照して例示するが、本実施例は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）
以下の実施例では、ポロクサマーＰ４０７（Ｌｕｔｒｏｌ）は、ＢＡＳＦ（Ludwigshafen, Germany）から提供された。カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ）およびポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ ＡＡ１）は、Noveon（Brussels, Belgium）から贈与された。ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ ＧＦ）を、Hercules（Dusseldorf, Germany）から入手した。ＧＭ−ＣＳＦを、Novartis（Brussels, Belgium）から授与された。全ての他の化学物質は、分析用（grade）であった。
【００２８】
カルボポールゲル（１．３％ ｗ／ｗ）を、精製水中へのカルボポール樹脂の分散によって調製した。混合物を、粘性が高くなるまで撹拌し、透明なゲルが出現するまで、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。トロメタモールの量を、ゲルのｐＨが６．９または５．５になるように調整した。
【００２９】
ポリカルボフィルゲル（１．０％ｗ／ｗ）を、精製水中へのＮｏｖｅｏｎ ＡＡ１の分散によって調整した。混合物を、粘性が高くなるまで撹拌し、透明なゲルが出現するまで、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。トロメタモールの量を、ゲルのｐＨが６．９または５．５になるように調整した。
【００３０】
ポロクサマーゲルを、冷却方法（cold method）を使用して調製した。ポロクサマーＰ４０７（２０％ｗ／ｗ）を、穏やかに混合しながら、４℃で０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）にゆっくり添加した。混合物を、透明な溶液が得られるまで４℃で一晩溶解させた。最後に、７％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルセルロースを、穏やかに混合しながら、透明なゲルが出現するまで０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）にゆっくり添加した。
【００３１】
（実施例２）
ＴＦ−１細胞を使用して、ＧＭ−ＣＳＦバイオアッセイを行った。
【００３２】
１ｇの異なるゲルあたり、２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ（培養培地）で希釈した９００ｐｇのＧＭ−ＣＳＦを、穏やかな混合によって組み込んだ。ゲルを、暗所にて３７℃または４℃で異なる期間維持した。次いで、ゲルを、２％ＦＣＳを含む６ｍｌのＲＰＭＩで希釈し、ＧＭ−ＣＳＦを抽出した。ＧＭ−ＣＳＦの最終濃度は、１５０ｎｇ／ｍｌであった。ＴＦ１細胞の指数増殖曲線が得られるようにこの濃度を選択した（データを示さず）。孔径０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ，Millipore,Bedford,MA）での濾過後、バイオアッセイ前に溶液を−２０℃で保存した。ＧＭ−ＣＳＦ溶液（１５０ｎｇ／ｍｌ）も異なる時間間隔で３７℃および４℃に保持し、保存前に濾過した。
【００３３】
凍結乾燥後の安定性実験のために、９００ｐｇのＧＭ−ＣＳＦを含む１ｇのポリカルボフィルゲル（ｐＨ５．５）を、１０ｍｌのガラスバイアルに充填した。サンプルを、ＨＥＴＯ ＦＤ８凍結乾燥機（Ｊｏｕａｎ Ｎｏｒｄｉｃ Ａ／Ｓ, Allerd, Denmark）の乾燥室に入れ、−３５℃で３時間３０分間予備冷却した。−１５℃にて０．８ｂａｒの圧力で３時間および０．０１ｂａｒの圧力で１２時間乾燥させた。その後、２５℃で５時間の二次乾燥工程を適用し、バイアルを密封して取り出した。凍結乾燥したゲルを、暗所にて室温または４℃で異なる期間保持した。次いで、凍結乾燥サンプルを、１ｍｌの脱塩水に再懸濁し、ＧＭ−ＣＳＦを抽出するために、２％ＦＣＳを含む６ｍｌのＲＰＭＩで希釈した。
【００３４】
因子依存性ヒト細胞株ＴＦ−１（ＡＴＣＣ, ＣＲＬ−２００３）を、以前に公開された提案（２０）をわずかに修正して培養した。簡単に述べれば、細胞を、１０％ウシ仔胎血清および５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ １６４０培地中にて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞からＧＭ−ＣＳＦを２４時間枯渇させ、２％ＦＣＳの存在下で培養した。細腔を、５０，０００細胞／ウェルの濃度で、２％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩおよび１００μｌの異なるポリマー中に含まれるＧＭ−ＣＳＦに、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中の種々の時間間隔で入れた。試験を５連で行った。培養物を、３Ｈ−ＴｄＲ（２μＣｉ／ウェル、７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Moravek Biochemicals, CA）の存在下で２４時間インキュベートした。細胞を、自動サンプル採取機（Packard, Canberra, Tilburg, The Netherlands）によって回収し、液体シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ, Packard, Canberra）で計数した。
【００３５】
（実施例３）
以下の実施例では、樹状細胞培養物の調製および親油性蛍光細胞トレーサーでの標識を記載する。
【００３６】
以前に記載のように（１６）、８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Novartis, Brussels）および２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４（Biosource Europe, Nivelles, Belgium）を使用して、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の接着性画分からＤＣを生成した。この研究のために生成したＤＣは、形態学、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析によって認められた前方散乱値および側方散乱値、ならびに表面表現型（ＣＤｌａ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ４＋、ＣＤ５４＋、．．．）を含むいくつかの基準に基づいて純度９０％の細胞集団から構成されていた。
【００３７】
以前に記載の手順にしたがって（わずかな修正を伴い）、ＤＣを、親油性蛍光マーカー（ＣＭ−ＤｉＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Leiden, The Netherlands）で標識した。簡単に述べれば、４×１０６個のＤＣを、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃に加熱した。ＣＭ−ＤｉＬを、３７℃に予熱した１ｍｌのＰＢＳで希釈して１６μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。色素が均一に分布するまで色素を数秒間混合した。この溶液を直ちに細胞懸濁液に移し、ピペッティングによって迅速に混合した。細胞を、３７℃で２分間、その後氷上で２分間インキュベートした。最後に、細胞を４℃で４０ｍｌのＰＢＳに移し、遠心分離し、適切な培地に再懸濁した。
【００３８】
（実施例４）
以下の実施例では、ランゲルハンス細胞培養物の調製を記載する。
【００３９】
回収後２４時間以内に、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Nycomed Pharma As, Oslo, Norway）を使用した不連続密度勾配遠心分離後に臍帯血単核細胞（ＣＢ ＭＮＣ）を採取した。製造者のプロトコールにしたがって、ＭＡＣＳ Ｄｉｒｅｃｔ ＣＤ３４前駆細胞単離キット（Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany）およびＭｉｎｉＭＡＣＳ分離カラム（Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ３４＋細胞をＣＢ ＭＮＣから単離した。１５個の１０４ＣＤ３４＋細胞を、１０％ＦＣＳ、抗生物質、および５０□Ｍメルカプトエタノール（全てＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Gaithersburg, MO）を補足した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を含むＴ２５フラスコ（Sarstedt, Inc, Newton, NC）に播種した。培養物に、予め最適化した濃度の以下のヒト分子を補足した：ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、比活性（ＳＡ）＞５ １０５Ｕ／ｍｇ）、ＴＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞１ １０６Ｕ／ｍｇ）、Ｆ１Ｔ３−Ｌ（２５ｎｇ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０５Ｕ／ｍｇ）、ＧＭ−ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ：１１，１ １０６Ｕ／ｍｇ）、ＴＮＦ□（５０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０７Ｕ／ｍｇ）、ＩＬ４（１００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０６Ｕ／ｍｌ）、およびＴＧＦ−□１（５ｎｇ／ｍｌまたは１２．５ｎｇ／ｍｌ，ＳＡ＞２ １０８Ｕ／ｍｇ）。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４をそれぞれAmoytop（Amoytop Biotech, Xiamen, China）およびBiosource（Nivelles, Belgium）から入手したこと以外は、これらの全薬剤をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Rockey Hill, NJ）から購入した。細胞を、３７℃の加湿および５％ＣＯ２存在下で培養した。７日目に、細胞密度を、２×１０４／ｃｍ２に調整し、７日目および１４日目に、細胞に、培養開始時に使用した濃度と同一濃度のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦα、およびＴＧＦ−β１を供給したが、ＴＧＦ−β１については、全培養で１４日目に１２．５ｎｇ／ｍｌを供給することを例外とする。１８日目に、細胞を、強いピペッティングによって培養物から回収して単一の細胞集団を調製した。
【００４０】
（実施例５）
以下の実施例では、器官型培養物の調製を記載する。
【００４１】
ＨＰＶ形質転換角化細胞（ＳｉＨａ細胞株（１０））の器官型培養物を、以前に報告されているように（１７）調製した。２週間の角化細胞の層形成後、標識ＤＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された上皮の上部に２×１０５細胞／５０μｌ培養培地の濃度で播種した。次いで、器官型培養物を、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むか含まないポリカルボフィルゲル上に入れた。培養を維持するために、ポリカルボフィルゲル（１，５ｗ／ｗ）を、角化細胞成長培地へのＮｏｖｅｏｎ ＡＡ１の分散によって調製した。混合物を、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。ポジティブコントロール（陽性対照）は、８００Ｕ／ｍｌの液体ＧＭ−ＣＳＦ溶液であった。更なる実験において、５００ｎｇ／ｍｌの単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１，PeproTech, Rocky Hill, NJ）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒト好中球ペプチド２（ＨＮＰ２，Sigma-Aldrich, St Louis, MO）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒトβデフェンシン２（ＨＯＤ−２，PeproTech, Rocky Hill, NJ）、または５００ｎｇ／ｍｌのマクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰＳα，PeproTech, Rocky Hill, NJ）も、同一濃度の液体培養培地またはポリカルボフィルゲル中に含まれる化学誘引物質として試験した。３７℃で４８時間後、コラーゲンラフトを採取した。次いで、培養物を、−７０℃でＯ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ，Sakura, Netherlands）に包埋し、低温保持装置を使用して切片にした。器官型培養物を、蛍光色素４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸（ＤＡＰＩ，Roche Diagnostics, Brussels, Belgium）で対比染色した。蛍光ＤＣの浸潤を、４０倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ顕微鏡、Heidelberg GmBH, Germany）で視覚化した。
【００４２】
（実施例６）
以下の実施例では、器官型培養物におけるＣＤ１ａ＋細胞浸潤の評価のために使用した方法を記載する。
【００４３】
上皮層に移動したＤＣの密度を、抗ＣＤ１ａモノクローナル抗体（Dako, Glostrup, DenmarkのクローンＮＡ１／３４）を使用したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｋｉｔ，Vector laboratories, Burlingame, CA）によって評価した。９μｍの凍結切片を、冷アセトン中で３分間固定し、内因性ペルオキシダーゼを、０．１％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロッキングした。次いで、切片を、抗ＣＤ１ａ抗体（２％ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＮａＮ３を含むＰＢＳで４０倍希釈）またはアイソタイプ適合コントロール抗体と１時間、ビオチン化マウス抗Ｉｇ抗体と３０分間、およびストレプトアビジンＨＲＰ ＡＢ複合体とさらに３０分間連続的にインキュベートした。陽性細胞を、３，３’−ジアミノベンジジン基質（ＤＡＢ）によって視覚化した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。器官型培養物へのＤＣ浸潤を、以下の以前に記載の方法（６）に従ったコンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ，Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用した免疫染色細胞表面の測定によって評価した。各培養物切片の全表面を分析し、各培養物の５つの切片を、抗ＣＤ１ａで染色した。陽性の表面を、総分析表面に対する比率として示した。更なる実験において、器官型培養物におけるＬＣ／ＤＣ浸潤の深さを、コンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ，Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用した上皮の上部と各ＤＣとの間の距離の測定によって評価した。次いで、浸潤の深さと培養物の厚さとの間の比を計算した。培養物切片中で見出された全ＬＣ／ＤＣの浸潤の深さを分析し、各培養物の４つの切片を、抗ＣＤ１ａ抗体で染色した。百分率は、培養物の上部にあるＬＣ／ＤＣについては０％であり、上皮の下部に到達したＬＣ／ＤＣについては１００％であった。スチューデントｔ検定（Ｉｎｓｔａｔ Ｍａｃ ２．０１ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Graph-Pad Software, San Diego, CA）を使用して統計分析を行った。
【００４４】
（実施例７）
以下の実施例では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片アッセイのために使用した方法を記載する。
【００４５】
ＨＰＶ形質転換角化細胞（２×１０５、ＣａｓＫｉ細胞株、ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５５０）を、コラーゲンゲル（ラット尾腱から単離した２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン）に入れ、テフロン（登録商標）リング（Ｔｅｆｌｏｎ ｒｉｎｇ）（Renner, Dannstadt, Germany）に挿入し、マウスへの移植１日前に培養物中に維持した。１２週齢のＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスをこの研究に使用した。マウスを、滅菌条件下で飼育し、水および飼料を適宜与えた。移植前に、細胞を洗浄し、培地を排出した。次いで、細胞コーティングコラーゲンゲルを、以前に記載のように（２、１１）、シリコーン移植チャンバー（Renner, Dannstadt, Germany）で覆い、マウスの背部の筋膜上にｉｎ ｔｏｔｏで移植した。マウスを、２４時間後に頸部脱臼によって屠殺した。移植片を切り出し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ， Sakura, Netherlands）に包埋し、低温保持装置による切片形成のためにドライアイス上で凍結した。ＤＣ動員実験では、２×１０６個の蛍光標識ＤＣを２１日目に静脈内注射し、ＰＢＳ、ポリカルボフィルゲルのみ、または化学誘引物質（ＧＭ−ＣＳＦ液：４×１０５Ｕ／ｍｌ；ポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦ：４×１０５Ｕ／ｇゲル）と共に、移植チャンバー（マウス屠殺の２４時間前および４８時間前）に２回（それぞれ２００μｌ）注射した。移植片の切片を、蛍光色素４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸（ＤＡＰＩ，Roche Diagnostics, Brussels, Belgium）で対比染色した。蛍光ＤＣの浸潤を、４０倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ顕微鏡、Heidelberg GmBH, Germany）で視覚化した。上皮中の蛍光ＤＣを計数し、抗ケラチン免疫標識後、上皮表面を、コンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ， Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用して評価した。浸潤の結果を、上皮１ｍｍ２あたりのＤＣ数として示した。スチューデントｔ検定（Ｉｎｓｔａｔ Ｍａｃ ２．０１ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Graph-Pad Software, San Diego, CA）を使用して統計分析を行った。
【００４６】
（実施例８）
以下の実施例では、免疫蛍光標識で使用した方法論を記載する。
【００４７】
移植片の凍結切片（厚さ５μｍ）を、−２０℃のアセトンおよび４℃の８０％メタノール中で固定した。次いで、これらを、以下の一次抗体と共に室温で６０分間インキュベートした：抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（ＳＩＦ１０５ウサギ抗マウス、Ｄｒ．Ａ．Ｎｏｅｌからの贈与）および抗ヒトケラチン抗体（ＫＬ１、マウス抗ヒト、Immunotech, Marseille, France）。次いで、以下の適切な二次抗体を、３０分間適用した：テキサスレッドに抱合したブタ抗ウサギ抗体（Dako, Glostrup, Denmark）およびフルオレセイン−イソチオシアネートに抱合したヒツジ抗マウス抗体（Sigma-Aldrich）。二重免疫蛍光標識研究のために、切片を最初に２つの一次抗体とインキュベートし、その後、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド抱合二次抗体とインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、カバースリップをのせ、落射蛍光光学素子（epifluorescence optic）を備えた顕微鏡下で標識を分析した。
【００４８】
（実施例９）
以下の実施例では、ＴＦ−１細胞でのバイオアッセイを使用した、４℃および３７℃での異なるポリマーへの組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ生物活性の測定を記載し、分析する。
【００４９】
異なるヒドロゲルへの組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ生物活性を、異なる時間間隔で、ＧＭ−ＣＳＦ依存性ＴＦ−１細胞株を使用した成長刺激のバイオアッセイを使用して測定した。注射剤（Ｌｅｕｃｏｍａｘ， Novartis, Brussels, Belgium）を、ポジティブコントロールとして選択した。４つのポリマーをｐＨ６．９で試験し、このｐＨは、ＧＭ−ＣＳＦの安定性に最適であり、注射剤のｐＨ値に対応すると報告されている（Novartisからのデータ）。ポリカルボフィルが子宮頸部−膣用処方物のための特に都合の良いポリマーであることが見出され、そして通常酸性ｐＨ値で子宮頸部−膣用処方物を開発することが推奨されているので、ポリカルボフィルヒドロゲルをｐＨ５．５でも試験した。
【００５０】
図１に示すように、ＧＭ−ＣＳＦの注射剤の生物活性の減少は４℃よりも３７℃で顕著であり、これは以前のデータ（３０）と一致する。両温度でのヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ）またはポロクサマーヒドロゲル（Ｌｕｔｒｏｌ）への組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ活性の顕著な減少も認められた。対照的に、ポリカルボフィルゲル（Ｎｏｖｅｏｎ）（ｐＨ５．５）は、ＧＭ−ＣＳＦ分解に対する防御を誘導した。しかし、この防御効果は、ｐＨ６．９では認められなかった。カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）は、両温度および少なくとも１週間中に、注射剤で認められた活性に類似のＧＭ−ＣＳＦ活性が認められた。
【００５１】
１週間を超える期間中に、ポリカルボフィルゲルの防御効果を評価するために、さらなる実験を行った。同時に、カルボマーゲル中のＧＭ−ＣＳＦ安定性に対するｐＨ減少の影響を試験した。図２に示すように、基準として使用したＧＭ−ＣＳＦの注射剤の生物活性は、３週間で規則正しく減少し、このことは、文献のデータ（３０）と一致していた。先に観察されたように、ｐＨ５．５でのポリカルボフィルゲルの防御効果は、保存の最初の１週間で見出された。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦ生物活性は、３週間にわたって安定なままであり、注射剤よりもｐＨ５．５のポリカルボフィルゲルでより顕著であった。カルボマーにより、少なくとも３週間注射剤で認められた活性に類似するＧＭ−ＣＳＦ活性が付与されるが、驚いたことに、ｐを５．５に減少させると、ＧＭ−ＣＳＦをカルボマーに組み込んだ場合に活性の急速な喪失が誘導された。ヒドロゲルを３７℃で保存した場合、類似の所見が認められた（データを示さず）。
【００５２】
これらの結果により、ｐＨ５．５でのポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ）は、生殖器粘膜の扁平上皮へのＧＭ−ＣＳＦの局所適用に都合がよいことが示唆される。
【００５３】
（実施例１０）
凍結乾燥は、滅菌条件下での十分に確立された保存方法である。ポリカルボフィルゲルの、凍結乾燥後および異なる時間間隔、および異なる温度での保存後のＧＭ−ＣＳＦの生物活性を試験した。凍結乾燥後、残渣は、かさ高く且つ雪のようであった。凍結乾燥物を水に再懸濁することができた。しかし、震盪およびボルテックスなどのさらなる操作を行って、１ｇのゲルにつき１ｍｌの水の添加後に完全に再懸濁するが必要であった。首尾の良い再懸濁後、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を再試験し、非凍結乾燥サンプル後に得られた生物活性と比較した（図３）。凍結乾燥は、どのような保存温度でも少なくとも５週間活性の喪失を防止することが見出された。
【００５４】
これらの結果により、ｐＨ５．５でのポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ）が生殖器粘膜上皮へのＧＭ−ＣＳＦの局所適用に都合がよいことがさらに確認される。
【００５５】
（実施例１１）
以下の実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成（前）癌上皮へのＤＣ動員に対するポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの影響を説明する。
【００５６】
ポリマー中に含まれるＧＭ−ＣＳＦが、ｉｎ ｖｉｖｏで認められた高悪性度の（前）癌病変に類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（前）癌上皮に浸潤するＤＣの能力を調整するかどうかを調査した。８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４の存在下で７日間培養したヒト末梢血単核細胞の可塑性の接着性画分由来の単球前駆体は、豊富な樹状の膜突起部を有するＤＣの形態学的性質を示した（データを示さず）。ＦＡＣＳ分析により、これらの細胞は、ＤＣに典型的な表現型の特徴（ＣＤ１ａ抗原、ＣＤ４抗原、ＣＤ８６抗原、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原の存在、クラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の中程度の発現、およびマクロファージ（ＣＤ１４）、Ｂ（ＣＤ２０）、およびＴ（ＣＤ３）細胞マーカーの非存在）も示した。ＤＣを、ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていないＧＭ−ＣＳＦの存在下で、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物の上部に重層した。ＤＣ浸潤に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を、ＧＭ−ＣＳＦ添加から４８時間後に凍結した器官型培養物の凍結切片の試験によって評価した。ＤＣの浸潤を調整するＧＭ−ＣＳＦゲルの能力を、器官型培養物への蛍光ＤＣの評価によって決定した。図４は、ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていない外因性ＧＭ−ＣＳＦとインキュベートしているかインキュベートしていない、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物中の蛍光標識ＤＣの密度を示す代表的実験を例示する。ＳｉＨａの器官型培養物上に重層したＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下では上皮細胞層をあまり浸潤しないのに対して、溶液中またはゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦは、上皮層内に認められたＤＣの密度を有意に増加させた。ＨＰＶ形質転換細胞株ＳｉＨａに由来する器官型培養物に対してＤＣ浸潤の定量分析を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された上皮中のＤＣの密度を、器官型培養物の全厚さにおける抗ＣＤ１ａ抗体で標識した表面の評価によって定量した。基本条件下（液体またはゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの非存在下）で、培養物中のＤＣ浸潤レベルは低かった（ＣＤ１ａ標識表面の１．６４±０．７８％）。ＨＰＶ＋細胞株の器官型培養物にＧＭ−ＣＳＦを補足した場合、ＤＣの浸潤は有意に改善し（ＣＤ１ａ標識表面の２８．３３±８．１１％）、これらの条件下で認められたＤＣの密度は、ゲルに含まれるＧＭ−ＣＳＦによって誘導されたＤＣ密度に類似していた（ＣＤ１ａ標識表面の２５．３８±５．８１％）。
【００５７】
（実施例１２）
以下の実施例では、ＨＰＶ形質転換角化細胞の異種移植片中のヒトＤＣの移動の刺激に対する、ポリカルボフィルゲル中のＧＭ−ＣＳＦの封入の影響を調査した。
【００５８】
ポリカルボフィルゲル中に含まれたＧＭ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を検討するために、コラーゲンゲル上で培養した移植ＨＰＶ形質転換角化細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの背部に存在させた。移植２４日後、マウスを屠殺し、免疫組織学的分析のために移植片を取り出した。薄片の組織学的試験により、移植片の成長パターンが高悪性度の扁平上皮（前）癌病変を再現し、コラーゲンゲルが肉芽組織に置き換わることが明らかとなった。ＨＰＶ＋角化細胞の移植によって、背部の筋肉の血管から始まる宿主組織における血管由来の応答を誘導し、その後コラーゲンゲルにまで広がった。血管は腫瘍上皮に出現し、新規に形成された肉芽組織に侵入し始めた。
【００５９】
ポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの有効性を証明するために、５匹のマウスから構成される２群を、マウス屠殺の２日前の間、毎日、（前）癌上皮を被覆した移植チャンバーへ２００μｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＰＢＳまたはゲルの注射によって処置した。コントロールマウス群を、ＰＢＳのみで処置した。最初のＧＭ−ＣＳＦの適用時に、蛍光トレーサーで予め標識した２×１０６個のヒトＤＣをマウスに静脈内注射した。移植片を、ＧＭ−ＣＳＦの最後の投与から１日後に採取し、顕微鏡試験用に処理した。移植片中のＤＣ浸潤を、組織学的切片中の染色ＤＣの観察によって評価した。図５に示すように、移植チャンバー中へのＧＭ−ＣＳＦの適用により、処置動物の腫瘍移植片への有意な（ｐ＜０．００１）ＤＣ動員が認められる一方で、コントロールマウスの上皮ではＤＣはわずかしか検出されなかった。ＤＣ浸潤の定量的分析を、１ｍｍ２の上皮組織あたりのＤＣ数の決定によって行った。移植片中のＤＣ浸潤は、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下では非常に低く（１．１±１．４ＤＣ／ｍｍ２）、液体ＧＭ−ＣＳＦでの処置後に劇的に増加した（１６．６±１４．６ＤＣ／ｍｍ２）。ＧＭ−ＣＳＦをポリカルボフィルゲルに組み込んだ場合に類似の結果が認められた（１７．５±１４．６ＤＣ／ｍｍ２）。
【００６０】
（実施例１３）
以下の実施例では、ポリカルボフィルゲルに組み込まれた他の化学誘引分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（前）癌上皮中へのＤＣおよびランゲルハンス細胞（ＬＣ）の浸潤を誘導する能力を調査した。
【００６１】
ＧＭ−ＣＳＦがＬＣ／ＤＣ上皮内移動の調節に関与する唯一の因子ではないかもしれないので（１２）、本発明者らは、ＬＣ／ＤＣの移動を刺激することができ、且つ／またはその産生がＨＰＶ＋角化細胞に影響を与え得る他の分子を同定しなければならなかった。
【００６２】
ＭＩＰ３αおよびＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）は共に、ＣＣＲ６との相互作用を介して未熟樹状細胞に対して走化性を示すことが示されている（４４、４１、３９、４２）。興味深いことに、ＳＩＬは、正常な子宮頸外部と比較してＭＩＰ３αの断続的染色パターンに関連していた。ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）は、ＣＣＲ６受容体と無関係に未熟ヒトＤＣの移動を選択的に誘導する（４３）。ＭＣＰ−１は、ＬＣ／ＤＣおよび単球の動員で重要な役割を果たし（３８）、ＭＣＰ−１遺伝子とＨＰＶ癌遺伝子Ｅ６／Ｅ７との間の発現の逆相間が、子宮頸癌細胞株で記載されていた（４０）。単球由来のＤＣは、ＣＣＲ６（ＭＩＰ３αおよびＨβＤ−２の受容体）を欠損しているので（３７）、本発明者らは、ＣＤ３４＋前駆体から多数のＬＣを作製するプロトコールを開発した（Hubert et al、提出）。
【００６３】
本発明者らは、ＭＩＰ３αおよびＨβＤ−２、またはＭＣＰ−１およびＨＮＰ２の添加によって、ＬＣおよびＤＣが、それぞれｉｎ ｖｉｖｏで認められる子宮頸部の高悪性度ＳＩＬに類似するｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された（前）癌上皮を浸潤する能力を調整することができるかどうかを調査した。ＤＣまたはＬＣを、ポリカルボフィルゲルに含まれるか含まれない化学誘引分子を含むか含まないこれらの培養物の上部に重層した。ＬＣ／ＤＣ浸潤を、化学誘引物質の添加から４８時間後に器官型培養物の免疫組織学的切片の試験によって評価した。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された上皮中のＬＣ／ＤＣの移動を、器官型培養物の全厚さをにわたる抗ＣＤ１ａ抗体で標識した全細胞の浸潤の深さの測定によって定量した。ＬＣ／ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下で上皮層をあまり浸潤しないのに対して（図６）、ＧＭ−ＣＳＦの添加により、上皮層で認められたＤＣの密度が有意に増加した。ＬＣ／ＤＣは、ポリカルボフィルゲル中に含まれるか含まれないＧＭ−ＣＳＦの存在下にて類似の様式で移動した。
【００６５】
器官型培養培地にＭＣＰ１またはＨＮＰ２を補足した場合（図６Ａ）、化学誘引物質を使用しない基礎浸潤と比較してＤＣの浸潤が改良され、ＧＭ−ＣＳＦを使用して得た浸潤レベルと等価な浸潤レベルに到達した。ポリカルボフィルゲル中への化学誘引分子の封入により、化学誘引物質溶液の存在下で認められた場合と比較してＤＣ浸潤は改変されなかった。
【００６６】
ＬＣを使用するか、器官型培養培地にＭＩＰ３□またはＨ□Ｄ−２を補足した場合に、類似の結果が得られた（図６Ｂ）。
【００６７】
これらの結果は、ポリカルボフィルゲル中に含まれるＭＩＰ３α、ＨβＤ−２、ＭＣＰ−１、およびＨＮＰ２を使用して、粘膜表面にＬＣ／ＤＣを動員することもでき、これは、生殖器ＨＰＶ関連（前）癌病変のための新規の免疫治療アプローチとして有用であり得ることを示す。
【００６８】
（実施例１４）
以下の実施例では、活性物質としてＧＭ−ＣＳＦを含む医薬組成物の処方物を、活性物質を含む精製水と１．４％ポリカルボフィル、０．０８％メチルヒドロキシベンゾエート、および０．０２％プロピルパラヒドロキシベンゾエートとの混合によって調製した。処方物のｐＨを、トロメタモールでｐＨ５．５に調節する。
【００６９】
（実施例１５）
以下の実施例では、活性物質としてモルグラモスチム（Ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｎ）を含む医薬組成物の処方物を、活性物質を含む精製水と１．４％ポリカルボフィル、０．０８％メチルヒドロキシベンゾエート、および０．０２％プロピルパラヒドロキシベンゾエートとの混合によって調製した。処方物のｐＨを、トロメタモールでｐＨ５．５に調節する。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】１週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃または３７℃で保存したヒドロゲルから異なる時間間隔（Ｔ０から１週間まで）で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定し、各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図２】３週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃で保存したヒドロゲルから異なる時間間隔（Ｔ０から３週間まで）で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定した。各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図３】凍結乾燥ポリカルボフィルゲルの５週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃または室温で保存したｐＨ５．５の凍結乾燥ポリカルボフィルゲルから異なる時間間隔で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定した。各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図４】ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていないＧＭ−ＣＳＦの影響下での、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物へのＤＣ浸潤の定量的評価を示す図である。ＤＣの浸透後に抗ＣＤ１ａで免疫標識する。結果を、上皮層の非標識表面に対する抗ＣＤ１ａで標識した表面の比率±ＳＤ（ｎ＝５）として示す。星印は、統計的有意差（＊＊＊：ｐ＜０．００１）を示す。
【図５】ＨＰＶ形質転換角化細胞の移植片へのＤＣ浸潤の定量的評価を示す。結果を、ＨＰＶ＋上皮のｍｍ２あたりのＤＣ数±ＳＤ（各条件につきｎ＝５）として示す。星印は、統計的有意差（＊＊＊：ｐ＜０．００１）を示す。
【図６】ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物へのＤＣおよびＬＣ浸潤の定量的評価を示す図である。ＤＣの浸透（Ａ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（コントロールとして使用）、ポリカルボフィルゲル中に含まれているか含まれていない、ＭＣＰ−１およびＨＮＰ２の非存在下または存在下で試験する。ＬＣの浸潤（Ｂ）を、ポリカルボフィルゲル中に含まれているか含まれていない、ＭＩＰ３αおよびＨβＤ２の非存在下または存在下で分析する。ＤＣおよびＬＣを、抗ＣＤ１ａ抗体での免疫標識によって検出した。結果を、上皮層の厚さあたりの浸潤の深さの比率で示す（各培養条件についてｎ＝４）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達系またはこれに関連する改良に関し、特に生殖器薬物送達系に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、上皮細胞が、サイトカインの産生による粘膜扁平上皮における免疫反応に影響を与え得るという証拠が蓄積されつつある。角化細胞によって産生される顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞（ＤＣ）の上皮細胞への移行およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）へのその分化のための選択的化学誘引分子として作用する（Kaplan et al，１９９２； Pastore et al，１９９７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＭ−ＣＳＦへのＬＣ／ＤＣの曝露により、その生存が延長され、リンパ球への抗原提示能力が増大する（Koch et al，１９９０）。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでは、いくつかの癌腫によって産生されたＧＭ−ＣＳＦの量と腫瘍関連ＤＣの分布／分化との間に相関関係が認められている（Colasante et al，１９９５）。本発明者らは、以前に、器官型ラフト培養（raft culture）系の使用によって、ＧＭ−ＣＳＦがｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された（前）癌上皮におけるＬＣ／ＤＣのコロニー形成増強の強力な因子であることを証明した（Hubert et al，１９９９）。さらに、ＤＣによる器官型培養の浸潤によって、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）によって形質転換された角化細胞のアポトーシスが特に誘導されるのに対して、ＤＣは影響を受けなかった（Hubert et al，２００１）。
【０００３】
これらのデータにより、ＤＣのウイルス感染上皮および／または（前）癌上皮への動員が、抗ウイルス免疫応答および抗腫瘍免疫応答の刺激だけでなく、ウイルス感染細胞および形質転換細胞の死滅の誘導によっても有益であり得ることが示唆される。
【０００４】
ＨＰＶ感染に起因する罹患率および死亡率は、開発途上国および先進工業国における主な健康上の問題であり、この疾患に起因する直接または間接的費用は非常に高い。ＨＰＶは、良性の性器疣から浸潤癌までの範囲の疾患を誘導する、一般的な性感染性病原体である。いくつかのＨＰＶ型は、特に子宮頸部における悪性腫瘍形質転換過程に直接関与することが示されている。９９％までの子宮頸癌およびその前駆物質（扁平上皮内病変；ＳＩＬ）は、発癌性ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）による感染に起因し得る（Bosch et al，１９９５）。しかし、ＨＰＶのみでは、腫瘍の進行に十分ではない（Herrington, １９９５）。ＨＰＶ感染およびその後のＳＩＬ発症の制御における内因性免疫の役割は、細胞性免疫が低下した患者におけるＨＰＶ関連病変の頻度の増加によって間接的に示されている（Petry et al，１９９４；Ellerbrock et al，２０００）。ウイルス抗原が大部分の前癌性病変で発現しているにもかかわらず、浸潤癌へ進行し得え、これは抗原提示機能におけるいくつかの定性的および／または定量的混乱の存在が示唆される。この仮説は、ほとんどの性器疣およびＳＩＬが正常な対合（paired）扁平上皮と比較したＬＣの密度および機能の低下によって特徴づけられるという所見によって強化される（Giannini et al，２００２；McArdle and Muller，１９８６；Morelli et al，１９９４）。免疫系が明らかに疾患の自然な経過に対する影響で重要な役割を果たすので、免疫応答調整物質がこれらの病変に対して治療的価値を有し得るといういくつかの証拠が存在する。細胞性免疫応答の誘導および調節におけるＤＣ／ＬＣの中心的役割のために、これらの細胞の動員および機能を調整する薬物は臨床的に興味深い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生殖器薬送達に関連する１つの主な問題は、子宮頸部または膣の防御機構によって課された生理学的状態により、投与した薬物の粘膜への接触時間が制限されて治療有効性の持続時間が短くなり、投与計画を頻繁にする必要が頻繁にあることである（Robinson and Bologna，１９９４；Valenta et al，２００１）。患者は、挿入物または軟膏などの他の従来の投薬形態よりも良好にゲルに耐えられることが公知である。いくつかの生体接着性ポリマー（bioadhesive polymer）は、上皮に局所的副作用を誘導することなく薬物の粘膜表面との接触を延長する機会について非常に注目されている（Richardson at al，１９９６）。
【０００６】
これらの問題を改善する方法を模索した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、アクリル酸含有ポリマーおよび化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６またはそれ未満である、粘膜付着性医薬組成物が提供される。
【０００８】
化学誘引物質は、一般に、樹状細胞および／またはランゲルハンス細胞などの免疫細胞の動員を調整する薬物であると理解されている。本発明で使用される化学誘引物質は、好ましくは、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、モルグラモスチム（molgramostim））、ＭＩＰ３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）、ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）、および／またはＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）である。より好ましくは、化学誘引物質は、ＧＭ−ＣＳＦである。
【０００９】
本発明の化学誘引物質は、大腸菌（E. coli）などの細菌発現系で産生される。
【００１０】
化学誘引物質は、医薬組成物中に３０００００国際単位（ＩＵ）から１００００００国際単位（ＩＵ）までの濃度で存在する。
【００１１】
アクリル酸含有ポリマーは、好ましくは、ポリカルボフィル（ジビニルグリコールと架橋した高分子量の合成アクリル酸ポリマー）である。
【００１２】
より好ましくは、９７．〜９９．９％の精製水と混合してヒドロゲルを形成する。ヒドロゲルの粘度は、１００００ｃＰと１１００００ｃＰ（ブルックフィールド粘度）との間である。
【００１３】
組成物のｐＨは、好ましくは５．５またはそれ未満である。より好ましくは、５から５．５までである。ゲルのｐＨを、トロメタモールまたは水酸化ナトリウムなどのアルカリで至適化する。
【００１４】
本発明による組成物は、任意選択的に、メチルパラヒドロベンゾエートまたはプロピルパラヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤および／または安定剤をさらに含む。
【００１５】
適切なキャリア、賦形剤、および他の薬剤を、組成物に組み込んで、輸送および送達などを改良することもできる。
【００１６】
また本発明によれば、粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための、本発明による組成物を提供する。
【００１７】
肛門性器疾患は、膣、子宮頸部、または直腸の疾患を意味する。
【００１８】
本発明によれば、粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための薬物の製造における、本発明による組成物の使用をさらに提供する。
【００１９】
本発明によれば、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法であって、医学的有効量の本発明による組成物をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法も提供する。典型的には、直接投与による治療を、症状を軽減、防止、または改善するのに十分な期間で毎日、毎週、または毎月行う。
【００２０】
本発明の組成物はまた、組成物を持続放出または徐放するための持続型デバイス、インプラント、またはカプセル化処方物で投与することもできる。
【００２１】
驚いたことに、アクリル酸含有ポリマー、特に、ｐＨ５．５でヒドロゲルの形態のポリカルボフィルが、４℃または３７℃で化学誘引分子（ＧＭ−ＣＳＦ）の生物活性を少なくとも２１日間保持するのに対して、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポロクサマーヒドロゲルへの組み込み後に両温度での化学誘引分子（ＧＭ−ＣＳＦ）の生物活性が減少することが見出された。
【００２２】
驚いたことに、ｐＨ６．９で両ゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの残存生物活性が異なっていた。これらのデータは、ポリカルボフィルゲル中に存在し、且つヒドロキシプロピルセルロースおよびポロクサマー処方物中に存在しないカルボキシル基部分のイオン化に起因し得る。
【００２３】
ｐＨ値５．５で処方されたポリカルボフィルヒドロゲル中での貯蔵後に評価されたＧＭ−ＣＳＦの生物活性は、溶液中のＧＭ−ＣＳＦで認められた生物活性よりも良好であった。
【発明の効果】
【００２４】
実施例におけるこれらの結果は、ポリカルボフィルゲル（Ｎｏｖｅｏｎ）が生物活性ＧＭ−ＣＳＦの拡散に適合してタンパク質を有利に安定化することを示す。さらに、このゲル処方物中に含まれるＧＭ−ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＨＰＶ形質転換（前）癌上皮組織へＤＣを動員することもできる。したがって、生殖器適用に適切なこの処方物は、ＨＰＶ関連病変で変化したことが示された免疫機能を回復する。
【００２５】
本発明を、以下の図面を参照して例示する。
【００２６】
本発明を、以下の実施例を参照して例示するが、本実施例は、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）
以下の実施例では、ポロクサマーＰ４０７（Ｌｕｔｒｏｌ）は、ＢＡＳＦ（Ludwigshafen, Germany）から提供された。カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ）およびポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ ＡＡ１）は、Noveon（Brussels, Belgium）から贈与された。ヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ ＧＦ）を、Hercules（Dusseldorf, Germany）から入手した。ＧＭ−ＣＳＦを、Novartis（Brussels, Belgium）から授与された。全ての他の化学物質は、分析用（grade）であった。
【００２８】
カルボポールゲル（１．３％ ｗ／ｗ）を、精製水中へのカルボポール樹脂の分散によって調製した。混合物を、粘性が高くなるまで撹拌し、透明なゲルが出現するまで、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。トロメタモールの量を、ゲルのｐＨが６．９または５．５になるように調整した。
【００２９】
ポリカルボフィルゲル（１．０％ｗ／ｗ）を、精製水中へのＮｏｖｅｏｎ ＡＡ１の分散によって調整した。混合物を、粘性が高くなるまで撹拌し、透明なゲルが出現するまで、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。トロメタモールの量を、ゲルのｐＨが６．９または５．５になるように調整した。
【００３０】
ポロクサマーゲルを、冷却方法（cold method）を使用して調製した。ポロクサマーＰ４０７（２０％ｗ／ｗ）を、穏やかに混合しながら、４℃で０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）にゆっくり添加した。混合物を、透明な溶液が得られるまで４℃で一晩溶解させた。最後に、７％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピルセルロースを、穏やかに混合しながら、透明なゲルが出現するまで０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）にゆっくり添加した。
【００３１】
（実施例２）
ＴＦ−１細胞を使用して、ＧＭ−ＣＳＦバイオアッセイを行った。
【００３２】
１ｇの異なるゲルあたり、２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ（培養培地）で希釈した９００ｐｇのＧＭ−ＣＳＦを、穏やかな混合によって組み込んだ。ゲルを、暗所にて３７℃または４℃で異なる期間維持した。次いで、ゲルを、２％ＦＣＳを含む６ｍｌのＲＰＭＩで希釈し、ＧＭ−ＣＳＦを抽出した。ＧＭ−ＣＳＦの最終濃度は、１５０ｎｇ／ｍｌであった。ＴＦ１細胞の指数増殖曲線が得られるようにこの濃度を選択した（データを示さず）。孔径０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ，Millipore,Bedford,MA）での濾過後、バイオアッセイ前に溶液を−２０℃で保存した。ＧＭ−ＣＳＦ溶液（１５０ｎｇ／ｍｌ）も異なる時間間隔で３７℃および４℃に保持し、保存前に濾過した。
【００３３】
凍結乾燥後の安定性実験のために、９００ｐｇのＧＭ−ＣＳＦを含む１ｇのポリカルボフィルゲル（ｐＨ５．５）を、１０ｍｌのガラスバイアルに充填した。サンプルを、ＨＥＴＯ ＦＤ８凍結乾燥機（Ｊｏｕａｎ Ｎｏｒｄｉｃ Ａ／Ｓ, Allerd, Denmark）の乾燥室に入れ、−３５℃で３時間３０分間予備冷却した。−１５℃にて０．８ｂａｒの圧力で３時間および０．０１ｂａｒの圧力で１２時間乾燥させた。その後、２５℃で５時間の二次乾燥工程を適用し、バイアルを密封して取り出した。凍結乾燥したゲルを、暗所にて室温または４℃で異なる期間保持した。次いで、凍結乾燥サンプルを、１ｍｌの脱塩水に再懸濁し、ＧＭ−ＣＳＦを抽出するために、２％ＦＣＳを含む６ｍｌのＲＰＭＩで希釈した。
【００３４】
因子依存性ヒト細胞株ＴＦ−１（ＡＴＣＣ, ＣＲＬ−２００３）を、以前に公開された提案（２０）をわずかに修正して培養した。簡単に述べれば、細胞を、１０％ウシ仔胎血清および５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＲＰＭＩ １６４０培地中にて３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞からＧＭ−ＣＳＦを２４時間枯渇させ、２％ＦＣＳの存在下で培養した。細腔を、５０，０００細胞／ウェルの濃度で、２％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩおよび１００μｌの異なるポリマー中に含まれるＧＭ−ＣＳＦに、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中の種々の時間間隔で入れた。試験を５連で行った。培養物を、３Ｈ−ＴｄＲ（２μＣｉ／ウェル、７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Moravek Biochemicals, CA）の存在下で２４時間インキュベートした。細胞を、自動サンプル採取機（Packard, Canberra, Tilburg, The Netherlands）によって回収し、液体シンチレーションカウンター（Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ, Packard, Canberra）で計数した。
【００３５】
（実施例３）
以下の実施例では、樹状細胞培養物の調製および親油性蛍光細胞トレーサーでの標識を記載する。
【００３６】
以前に記載のように（１６）、８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（Novartis, Brussels）および２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４（Biosource Europe, Nivelles, Belgium）を使用して、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の接着性画分からＤＣを生成した。この研究のために生成したＤＣは、形態学、ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析によって認められた前方散乱値および側方散乱値、ならびに表面表現型（ＣＤｌａ＋、ＣＤ１４−、ＣＤ４＋、ＣＤ５４＋、．．．）を含むいくつかの基準に基づいて純度９０％の細胞集団から構成されていた。
【００３７】
以前に記載の手順にしたがって（わずかな修正を伴い）、ＤＣを、親油性蛍光マーカー（ＣＭ−ＤｉＬ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Leiden, The Netherlands）で標識した。簡単に述べれば、４×１０６個のＤＣを、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃に加熱した。ＣＭ−ＤｉＬを、３７℃に予熱した１ｍｌのＰＢＳで希釈して１６μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。色素が均一に分布するまで色素を数秒間混合した。この溶液を直ちに細胞懸濁液に移し、ピペッティングによって迅速に混合した。細胞を、３７℃で２分間、その後氷上で２分間インキュベートした。最後に、細胞を４℃で４０ｍｌのＰＢＳに移し、遠心分離し、適切な培地に再懸濁した。
【００３８】
（実施例４）
以下の実施例では、ランゲルハンス細胞培養物の調製を記載する。
【００３９】
回収後２４時間以内に、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Nycomed Pharma As, Oslo, Norway）を使用した不連続密度勾配遠心分離後に臍帯血単核細胞（ＣＢ ＭＮＣ）を採取した。製造者のプロトコールにしたがって、ＭＡＣＳ Ｄｉｒｅｃｔ ＣＤ３４前駆細胞単離キット（Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany）およびＭｉｎｉＭＡＣＳ分離カラム（Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ３４＋細胞をＣＢ ＭＮＣから単離した。１５個の１０４ＣＤ３４＋細胞を、１０％ＦＣＳ、抗生物質、および５０□Ｍメルカプトエタノール（全てＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Gaithersburg, MO）を補足した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を含むＴ２５フラスコ（Sarstedt, Inc, Newton, NC）に播種した。培養物に、予め最適化した濃度の以下のヒト分子を補足した：ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、比活性（ＳＡ）＞５ １０５Ｕ／ｍｇ）、ＴＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞１ １０６Ｕ／ｍｇ）、Ｆ１Ｔ３−Ｌ（２５ｎｇ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０５Ｕ／ｍｇ）、ＧＭ−ＣＳＦ（２００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ：１１，１ １０６Ｕ／ｍｇ）、ＴＮＦ□（５０Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０７Ｕ／ｍｇ）、ＩＬ４（１００Ｕ／ｍｌ、ＳＡ＞２ １０６Ｕ／ｍｌ）、およびＴＧＦ−□１（５ｎｇ／ｍｌまたは１２．５ｎｇ／ｍｌ，ＳＡ＞２ １０８Ｕ／ｍｇ）。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４をそれぞれAmoytop（Amoytop Biotech, Xiamen, China）およびBiosource（Nivelles, Belgium）から入手したこと以外は、これらの全薬剤をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Rockey Hill, NJ）から購入した。細胞を、３７℃の加湿および５％ＣＯ２存在下で培養した。７日目に、細胞密度を、２×１０４／ｃｍ２に調整し、７日目および１４日目に、細胞に、培養開始時に使用した濃度と同一濃度のＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦα、およびＴＧＦ−β１を供給したが、ＴＧＦ−β１については、全培養で１４日目に１２．５ｎｇ／ｍｌを供給することを例外とする。１８日目に、細胞を、強いピペッティングによって培養物から回収して単一の細胞集団を調製した。
【００４０】
（実施例５）
以下の実施例では、器官型培養物の調製を記載する。
【００４１】
ＨＰＶ形質転換角化細胞（ＳｉＨａ細胞株（１０））の器官型培養物を、以前に報告されているように（１７）調製した。２週間の角化細胞の層形成後、標識ＤＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された上皮の上部に２×１０５細胞／５０μｌ培養培地の濃度で播種した。次いで、器官型培養物を、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含むか含まないポリカルボフィルゲル上に入れた。培養を維持するために、ポリカルボフィルゲル（１，５ｗ／ｗ）を、角化細胞成長培地へのＮｏｖｅｏｎ ＡＡ１の分散によって調製した。混合物を、４０％（ｗ／ｗ）のトロメタモールの滴下によって中和した。ポジティブコントロール（陽性対照）は、８００Ｕ／ｍｌの液体ＧＭ−ＣＳＦ溶液であった。更なる実験において、５００ｎｇ／ｍｌの単球化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１，PeproTech, Rocky Hill, NJ）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒト好中球ペプチド２（ＨＮＰ２，Sigma-Aldrich, St Louis, MO）、７５０ｎｇ／ｍｌのヒトβデフェンシン２（ＨＯＤ−２，PeproTech, Rocky Hill, NJ）、または５００ｎｇ／ｍｌのマクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰＳα，PeproTech, Rocky Hill, NJ）も、同一濃度の液体培養培地またはポリカルボフィルゲル中に含まれる化学誘引物質として試験した。３７℃で４８時間後、コラーゲンラフトを採取した。次いで、培養物を、−７０℃でＯ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ，Sakura, Netherlands）に包埋し、低温保持装置を使用して切片にした。器官型培養物を、蛍光色素４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸（ＤＡＰＩ，Roche Diagnostics, Brussels, Belgium）で対比染色した。蛍光ＤＣの浸潤を、４０倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ顕微鏡、Heidelberg GmBH, Germany）で視覚化した。
【００４２】
（実施例６）
以下の実施例では、器官型培養物におけるＣＤ１ａ＋細胞浸潤の評価のために使用した方法を記載する。
【００４３】
上皮層に移動したＤＣの密度を、抗ＣＤ１ａモノクローナル抗体（Dako, Glostrup, DenmarkのクローンＮＡ１／３４）を使用したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｋｉｔ，Vector laboratories, Burlingame, CA）によって評価した。９μｍの凍結切片を、冷アセトン中で３分間固定し、内因性ペルオキシダーゼを、０．１％Ｈ２Ｏ２で３０分間ブロッキングした。次いで、切片を、抗ＣＤ１ａ抗体（２％ＢＳＡ、０．０１Ｍ ＮａＮ３を含むＰＢＳで４０倍希釈）またはアイソタイプ適合コントロール抗体と１時間、ビオチン化マウス抗Ｉｇ抗体と３０分間、およびストレプトアビジンＨＲＰ ＡＢ複合体とさらに３０分間連続的にインキュベートした。陽性細胞を、３，３’−ジアミノベンジジン基質（ＤＡＢ）によって視覚化した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。器官型培養物へのＤＣ浸潤を、以下の以前に記載の方法（６）に従ったコンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ，Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用した免疫染色細胞表面の測定によって評価した。各培養物切片の全表面を分析し、各培養物の５つの切片を、抗ＣＤ１ａで染色した。陽性の表面を、総分析表面に対する比率として示した。更なる実験において、器官型培養物におけるＬＣ／ＤＣ浸潤の深さを、コンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ，Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用した上皮の上部と各ＤＣとの間の距離の測定によって評価した。次いで、浸潤の深さと培養物の厚さとの間の比を計算した。培養物切片中で見出された全ＬＣ／ＤＣの浸潤の深さを分析し、各培養物の４つの切片を、抗ＣＤ１ａ抗体で染色した。百分率は、培養物の上部にあるＬＣ／ＤＣについては０％であり、上皮の下部に到達したＬＣ／ＤＣについては１００％であった。スチューデントｔ検定（Ｉｎｓｔａｔ Ｍａｃ ２．０１ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Graph-Pad Software, San Diego, CA）を使用して統計分析を行った。
【００４４】
（実施例７）
以下の実施例では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種移植片アッセイのために使用した方法を記載する。
【００４５】
ＨＰＶ形質転換角化細胞（２×１０５、ＣａｓＫｉ細胞株、ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５５０）を、コラーゲンゲル（ラット尾腱から単離した２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン）に入れ、テフロン（登録商標）リング（Ｔｅｆｌｏｎ ｒｉｎｇ）（Renner, Dannstadt, Germany）に挿入し、マウスへの移植１日前に培養物中に維持した。１２週齢のＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスをこの研究に使用した。マウスを、滅菌条件下で飼育し、水および飼料を適宜与えた。移植前に、細胞を洗浄し、培地を排出した。次いで、細胞コーティングコラーゲンゲルを、以前に記載のように（２、１１）、シリコーン移植チャンバー（Renner, Dannstadt, Germany）で覆い、マウスの背部の筋膜上にｉｎ ｔｏｔｏで移植した。マウスを、２４時間後に頸部脱臼によって屠殺した。移植片を切り出し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ， Sakura, Netherlands）に包埋し、低温保持装置による切片形成のためにドライアイス上で凍結した。ＤＣ動員実験では、２×１０６個の蛍光標識ＤＣを２１日目に静脈内注射し、ＰＢＳ、ポリカルボフィルゲルのみ、または化学誘引物質（ＧＭ−ＣＳＦ液：４×１０５Ｕ／ｍｌ；ポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦ：４×１０５Ｕ／ｇゲル）と共に、移植チャンバー（マウス屠殺の２４時間前および４８時間前）に２回（それぞれ２００μｌ）注射した。移植片の切片を、蛍光色素４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸（ＤＡＰＩ，Roche Diagnostics, Brussels, Belgium）で対比染色した。蛍光ＤＣの浸潤を、４０倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＢ顕微鏡、Heidelberg GmBH, Germany）で視覚化した。上皮中の蛍光ＤＣを計数し、抗ケラチン免疫標識後、上皮表面を、コンピュータ化画像分析システム（ＣＡＳ， Becton Dikinson, Erembodegem, Belgium）を使用して評価した。浸潤の結果を、上皮１ｍｍ２あたりのＤＣ数として示した。スチューデントｔ検定（Ｉｎｓｔａｔ Ｍａｃ ２．０１ ｓｏｆｔｗａｒｅ；Graph-Pad Software, San Diego, CA）を使用して統計分析を行った。
【００４６】
（実施例８）
以下の実施例では、免疫蛍光標識で使用した方法論を記載する。
【００４７】
移植片の凍結切片（厚さ５μｍ）を、−２０℃のアセトンおよび４℃の８０％メタノール中で固定した。次いで、これらを、以下の一次抗体と共に室温で６０分間インキュベートした：抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（ＳＩＦ１０５ウサギ抗マウス、Ｄｒ．Ａ．Ｎｏｅｌからの贈与）および抗ヒトケラチン抗体（ＫＬ１、マウス抗ヒト、Immunotech, Marseille, France）。次いで、以下の適切な二次抗体を、３０分間適用した：テキサスレッドに抱合したブタ抗ウサギ抗体（Dako, Glostrup, Denmark）およびフルオレセイン−イソチオシアネートに抱合したヒツジ抗マウス抗体（Sigma-Aldrich）。二重免疫蛍光標識研究のために、切片を最初に２つの一次抗体とインキュベートし、その後、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド抱合二次抗体とインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、カバースリップをのせ、落射蛍光光学素子（epifluorescence optic）を備えた顕微鏡下で標識を分析した。
【００４８】
（実施例９）
以下の実施例では、ＴＦ−１細胞でのバイオアッセイを使用した、４℃および３７℃での異なるポリマーへの組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ生物活性の測定を記載し、分析する。
【００４９】
異なるヒドロゲルへの組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ生物活性を、異なる時間間隔で、ＧＭ−ＣＳＦ依存性ＴＦ−１細胞株を使用した成長刺激のバイオアッセイを使用して測定した。注射剤（Ｌｅｕｃｏｍａｘ， Novartis, Brussels, Belgium）を、ポジティブコントロールとして選択した。４つのポリマーをｐＨ６．９で試験し、このｐＨは、ＧＭ−ＣＳＦの安定性に最適であり、注射剤のｐＨ値に対応すると報告されている（Novartisからのデータ）。ポリカルボフィルが子宮頸部−膣用処方物のための特に都合の良いポリマーであることが見出され、そして通常酸性ｐＨ値で子宮頸部−膣用処方物を開発することが推奨されているので、ポリカルボフィルヒドロゲルをｐＨ５．５でも試験した。
【００５０】
図１に示すように、ＧＭ−ＣＳＦの注射剤の生物活性の減少は４℃よりも３７℃で顕著であり、これは以前のデータ（３０）と一致する。両温度でのヒドロキシプロピルセルロース（Ｋｌｕｃｅｌ）またはポロクサマーヒドロゲル（Ｌｕｔｒｏｌ）への組み込み後のＧＭ−ＣＳＦ活性の顕著な減少も認められた。対照的に、ポリカルボフィルゲル（Ｎｏｖｅｏｎ）（ｐＨ５．５）は、ＧＭ−ＣＳＦ分解に対する防御を誘導した。しかし、この防御効果は、ｐＨ６．９では認められなかった。カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）は、両温度および少なくとも１週間中に、注射剤で認められた活性に類似のＧＭ−ＣＳＦ活性が認められた。
【００５１】
１週間を超える期間中に、ポリカルボフィルゲルの防御効果を評価するために、さらなる実験を行った。同時に、カルボマーゲル中のＧＭ−ＣＳＦ安定性に対するｐＨ減少の影響を試験した。図２に示すように、基準として使用したＧＭ−ＣＳＦの注射剤の生物活性は、３週間で規則正しく減少し、このことは、文献のデータ（３０）と一致していた。先に観察されたように、ｐＨ５．５でのポリカルボフィルゲルの防御効果は、保存の最初の１週間で見出された。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦ生物活性は、３週間にわたって安定なままであり、注射剤よりもｐＨ５．５のポリカルボフィルゲルでより顕著であった。カルボマーにより、少なくとも３週間注射剤で認められた活性に類似するＧＭ−ＣＳＦ活性が付与されるが、驚いたことに、ｐを５．５に減少させると、ＧＭ−ＣＳＦをカルボマーに組み込んだ場合に活性の急速な喪失が誘導された。ヒドロゲルを３７℃で保存した場合、類似の所見が認められた（データを示さず）。
【００５２】
これらの結果により、ｐＨ５．５でのポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ）は、生殖器粘膜の扁平上皮へのＧＭ−ＣＳＦの局所適用に都合がよいことが示唆される。
【００５３】
（実施例１０）
凍結乾燥は、滅菌条件下での十分に確立された保存方法である。ポリカルボフィルゲルの、凍結乾燥後および異なる時間間隔、および異なる温度での保存後のＧＭ−ＣＳＦの生物活性を試験した。凍結乾燥後、残渣は、かさ高く且つ雪のようであった。凍結乾燥物を水に再懸濁することができた。しかし、震盪およびボルテックスなどのさらなる操作を行って、１ｇのゲルにつき１ｍｌの水の添加後に完全に再懸濁するが必要であった。首尾の良い再懸濁後、ＧＭ−ＣＳＦの生物活性を再試験し、非凍結乾燥サンプル後に得られた生物活性と比較した（図３）。凍結乾燥は、どのような保存温度でも少なくとも５週間活性の喪失を防止することが見出された。
【００５４】
これらの結果により、ｐＨ５．５でのポリカルボフィル（Ｎｏｖｅｏｎ）が生殖器粘膜上皮へのＧＭ−ＣＳＦの局所適用に都合がよいことがさらに確認される。
【００５５】
（実施例１１）
以下の実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成（前）癌上皮へのＤＣ動員に対するポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの影響を説明する。
【００５６】
ポリマー中に含まれるＧＭ−ＣＳＦが、ｉｎ ｖｉｖｏで認められた高悪性度の（前）癌病変に類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（前）癌上皮に浸潤するＤＣの能力を調整するかどうかを調査した。８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４の存在下で７日間培養したヒト末梢血単核細胞の可塑性の接着性画分由来の単球前駆体は、豊富な樹状の膜突起部を有するＤＣの形態学的性質を示した（データを示さず）。ＦＡＣＳ分析により、これらの細胞は、ＤＣに典型的な表現型の特徴（ＣＤ１ａ抗原、ＣＤ４抗原、ＣＤ８６抗原、およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）抗原の存在、クラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の中程度の発現、およびマクロファージ（ＣＤ１４）、Ｂ（ＣＤ２０）、およびＴ（ＣＤ３）細胞マーカーの非存在）も示した。ＤＣを、ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていないＧＭ−ＣＳＦの存在下で、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物の上部に重層した。ＤＣ浸潤に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を、ＧＭ−ＣＳＦ添加から４８時間後に凍結した器官型培養物の凍結切片の試験によって評価した。ＤＣの浸潤を調整するＧＭ−ＣＳＦゲルの能力を、器官型培養物への蛍光ＤＣの評価によって決定した。図４は、ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていない外因性ＧＭ−ＣＳＦとインキュベートしているかインキュベートしていない、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物中の蛍光標識ＤＣの密度を示す代表的実験を例示する。ＳｉＨａの器官型培養物上に重層したＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下では上皮細胞層をあまり浸潤しないのに対して、溶液中またはゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦは、上皮層内に認められたＤＣの密度を有意に増加させた。ＨＰＶ形質転換細胞株ＳｉＨａに由来する器官型培養物に対してＤＣ浸潤の定量分析を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された上皮中のＤＣの密度を、器官型培養物の全厚さにおける抗ＣＤ１ａ抗体で標識した表面の評価によって定量した。基本条件下（液体またはゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの非存在下）で、培養物中のＤＣ浸潤レベルは低かった（ＣＤ１ａ標識表面の１．６４±０．７８％）。ＨＰＶ＋細胞株の器官型培養物にＧＭ−ＣＳＦを補足した場合、ＤＣの浸潤は有意に改善し（ＣＤ１ａ標識表面の２８．３３±８．１１％）、これらの条件下で認められたＤＣの密度は、ゲルに含まれるＧＭ−ＣＳＦによって誘導されたＤＣ密度に類似していた（ＣＤ１ａ標識表面の２５．３８±５．８１％）。
【００５７】
（実施例１２）
以下の実施例では、ＨＰＶ形質転換角化細胞の異種移植片中のヒトＤＣの移動の刺激に対する、ポリカルボフィルゲル中のＧＭ−ＣＳＦの封入の影響を調査した。
【００５８】
ポリカルボフィルゲル中に含まれたＧＭ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を検討するために、コラーゲンゲル上で培養した移植ＨＰＶ形質転換角化細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの背部に存在させた。移植２４日後、マウスを屠殺し、免疫組織学的分析のために移植片を取り出した。薄片の組織学的試験により、移植片の成長パターンが高悪性度の扁平上皮（前）癌病変を再現し、コラーゲンゲルが肉芽組織に置き換わることが明らかとなった。ＨＰＶ＋角化細胞の移植によって、背部の筋肉の血管から始まる宿主組織における血管由来の応答を誘導し、その後コラーゲンゲルにまで広がった。血管は腫瘍上皮に出現し、新規に形成された肉芽組織に侵入し始めた。
【００５９】
ポリカルボフィルゲルに組み込まれたＧＭ−ＣＳＦの有効性を証明するために、５匹のマウスから構成される２群を、マウス屠殺の２日前の間、毎日、（前）癌上皮を被覆した移植チャンバーへ２００μｌのＧＭ−ＣＳＦを含むＰＢＳまたはゲルの注射によって処置した。コントロールマウス群を、ＰＢＳのみで処置した。最初のＧＭ−ＣＳＦの適用時に、蛍光トレーサーで予め標識した２×１０６個のヒトＤＣをマウスに静脈内注射した。移植片を、ＧＭ−ＣＳＦの最後の投与から１日後に採取し、顕微鏡試験用に処理した。移植片中のＤＣ浸潤を、組織学的切片中の染色ＤＣの観察によって評価した。図５に示すように、移植チャンバー中へのＧＭ−ＣＳＦの適用により、処置動物の腫瘍移植片への有意な（ｐ＜０．００１）ＤＣ動員が認められる一方で、コントロールマウスの上皮ではＤＣはわずかしか検出されなかった。ＤＣ浸潤の定量的分析を、１ｍｍ２の上皮組織あたりのＤＣ数の決定によって行った。移植片中のＤＣ浸潤は、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下では非常に低く（１．１±１．４ＤＣ／ｍｍ２）、液体ＧＭ−ＣＳＦでの処置後に劇的に増加した（１６．６±１４．６ＤＣ／ｍｍ２）。ＧＭ−ＣＳＦをポリカルボフィルゲルに組み込んだ場合に類似の結果が認められた（１７．５±１４．６ＤＣ／ｍｍ２）。
【００６０】
（実施例１３）
以下の実施例では、ポリカルボフィルゲルに組み込まれた他の化学誘引分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（前）癌上皮中へのＤＣおよびランゲルハンス細胞（ＬＣ）の浸潤を誘導する能力を調査した。
【００６１】
ＧＭ−ＣＳＦがＬＣ／ＤＣ上皮内移動の調節に関与する唯一の因子ではないかもしれないので（１２）、本発明者らは、ＬＣ／ＤＣの移動を刺激することができ、且つ／またはその産生がＨＰＶ＋角化細胞に影響を与え得る他の分子を同定しなければならなかった。
【００６２】
ＭＩＰ３αおよびＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）は共に、ＣＣＲ６との相互作用を介して未熟樹状細胞に対して走化性を示すことが示されている（４４、４１、３９、４２）。興味深いことに、ＳＩＬは、正常な子宮頸外部と比較してＭＩＰ３αの断続的染色パターンに関連していた。ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）は、ＣＣＲ６受容体と無関係に未熟ヒトＤＣの移動を選択的に誘導する（４３）。ＭＣＰ−１は、ＬＣ／ＤＣおよび単球の動員で重要な役割を果たし（３８）、ＭＣＰ−１遺伝子とＨＰＶ癌遺伝子Ｅ６／Ｅ７との間の発現の逆相間が、子宮頸癌細胞株で記載されていた（４０）。単球由来のＤＣは、ＣＣＲ６（ＭＩＰ３αおよびＨβＤ−２の受容体）を欠損しているので（３７）、本発明者らは、ＣＤ３４＋前駆体から多数のＬＣを作製するプロトコールを開発した（Hubert et al、提出）。
【００６３】
本発明者らは、ＭＩＰ３αおよびＨβＤ−２、またはＭＣＰ−１およびＨＮＰ２の添加によって、ＬＣおよびＤＣが、それぞれｉｎ ｖｉｖｏで認められる子宮頸部の高悪性度ＳＩＬに類似するｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された（前）癌上皮を浸潤する能力を調整することができるかどうかを調査した。ＤＣまたはＬＣを、ポリカルボフィルゲルに含まれるか含まれない化学誘引分子を含むか含まないこれらの培養物の上部に重層した。ＬＣ／ＤＣ浸潤を、化学誘引物質の添加から４８時間後に器官型培養物の免疫組織学的切片の試験によって評価した。
【００６４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された上皮中のＬＣ／ＤＣの移動を、器官型培養物の全厚さをにわたる抗ＣＤ１ａ抗体で標識した全細胞の浸潤の深さの測定によって定量した。ＬＣ／ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下で上皮層をあまり浸潤しないのに対して（図６）、ＧＭ−ＣＳＦの添加により、上皮層で認められたＤＣの密度が有意に増加した。ＬＣ／ＤＣは、ポリカルボフィルゲル中に含まれるか含まれないＧＭ−ＣＳＦの存在下にて類似の様式で移動した。
【００６５】
器官型培養培地にＭＣＰ１またはＨＮＰ２を補足した場合（図６Ａ）、化学誘引物質を使用しない基礎浸潤と比較してＤＣの浸潤が改良され、ＧＭ−ＣＳＦを使用して得た浸潤レベルと等価な浸潤レベルに到達した。ポリカルボフィルゲル中への化学誘引分子の封入により、化学誘引物質溶液の存在下で認められた場合と比較してＤＣ浸潤は改変されなかった。
【００６６】
ＬＣを使用するか、器官型培養培地にＭＩＰ３□またはＨ□Ｄ−２を補足した場合に、類似の結果が得られた（図６Ｂ）。
【００６７】
これらの結果は、ポリカルボフィルゲル中に含まれるＭＩＰ３α、ＨβＤ−２、ＭＣＰ−１、およびＨＮＰ２を使用して、粘膜表面にＬＣ／ＤＣを動員することもでき、これは、生殖器ＨＰＶ関連（前）癌病変のための新規の免疫治療アプローチとして有用であり得ることを示す。
【００６８】
（実施例１４）
以下の実施例では、活性物質としてＧＭ−ＣＳＦを含む医薬組成物の処方物を、活性物質を含む精製水と１．４％ポリカルボフィル、０．０８％メチルヒドロキシベンゾエート、および０．０２％プロピルパラヒドロキシベンゾエートとの混合によって調製した。処方物のｐＨを、トロメタモールでｐＨ５．５に調節する。
【００６９】
（実施例１５）
以下の実施例では、活性物質としてモルグラモスチム（Ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｎ）を含む医薬組成物の処方物を、活性物質を含む精製水と１．４％ポリカルボフィル、０．０８％メチルヒドロキシベンゾエート、および０．０２％プロピルパラヒドロキシベンゾエートとの混合によって調製した。処方物のｐＨを、トロメタモールでｐＨ５．５に調節する。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】１週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃または３７℃で保存したヒドロゲルから異なる時間間隔（Ｔ０から１週間まで）で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定し、各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図２】３週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃で保存したヒドロゲルから異なる時間間隔（Ｔ０から３週間まで）で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定した。各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図３】凍結乾燥ポリカルボフィルゲルの５週間の貯蔵後の残存生物活性データを示し、４℃または室温で保存したｐＨ５．５の凍結乾燥ポリカルボフィルゲルから異なる時間間隔で抽出したＧＭ−ＣＳＦとのインキュベーション後のＴＦ−１細胞株の増殖応答のグラフを示す図である。３Ｈ−ｄＴＲ組み込みによって成長を測定した。各点は、６つの複製物の平均を示し、バーは標準誤差を示す。
【図４】ポリカルボフィルゲル中に組み込まれているか組み込まれていないＧＭ−ＣＳＦの影響下での、ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物へのＤＣ浸潤の定量的評価を示す図である。ＤＣの浸透後に抗ＣＤ１ａで免疫標識する。結果を、上皮層の非標識表面に対する抗ＣＤ１ａで標識した表面の比率±ＳＤ（ｎ＝５）として示す。星印は、統計的有意差（＊＊＊：ｐ＜０．００１）を示す。
【図５】ＨＰＶ形質転換角化細胞の移植片へのＤＣ浸潤の定量的評価を示す。結果を、ＨＰＶ＋上皮のｍｍ２あたりのＤＣ数±ＳＤ（各条件につきｎ＝５）として示す。星印は、統計的有意差（＊＊＊：ｐ＜０．００１）を示す。
【図６】ＨＰＶ形質転換角化細胞の器官型培養物へのＤＣおよびＬＣ浸潤の定量的評価を示す図である。ＤＣの浸透（Ａ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（コントロールとして使用）、ポリカルボフィルゲル中に含まれているか含まれていない、ＭＣＰ−１およびＨＮＰ２の非存在下または存在下で試験する。ＬＣの浸潤（Ｂ）を、ポリカルボフィルゲル中に含まれているか含まれていない、ＭＩＰ３αおよびＨβＤ２の非存在下または存在下で分析する。ＤＣおよびＬＣを、抗ＣＤ１ａ抗体での免疫標識によって検出した。結果を、上皮層の厚さあたりの浸潤の深さの比率で示す（各培養条件についてｎ＝４）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸含有ポリマーおよび化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６またはそれ未満である、該組成物。
【請求項２】
前記化学誘引物質が、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、モルグラモスチム（molgramostim））、ＭＩＰ３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）、ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）、および／またはＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アクリル酸含有ポリマーがポリカルボフィルである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーがヒドロゲルの形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物のｐＨが好ましくは５．５またはそれ未満である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物のｐＨが５から５．５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための薬物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法であって、医学的有効量の請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法。
【請求項１】
アクリル酸含有ポリマーおよび化学誘引物質を含む粘膜付着性医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６またはそれ未満である、該組成物。
【請求項２】
前記化学誘引物質が、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、モルグラモスチム（molgramostim））、ＭＩＰ３α（マクロファージ炎症性タンパク質３α）、ＨβＤ２（ヒトβデフェンシン２）、ＨＮＰ２（ヒト好中球デフェンシン２）、および／またはＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アクリル酸含有ポリマーがポリカルボフィルである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーがヒドロゲルの形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物のｐＨが好ましくは５．５またはそれ未満である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物のｐＨが５から５．５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
粘膜の扁平上皮の治療、好ましくは肛門性器疾患または口腔疾患、特にヒト乳頭腫ウイルスの治療で使用するための薬物の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法であって、医学的有効量の請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、肛門性器疾患または口腔疾患の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５００６７３（Ｐ２００７−５００６７３Ａ）
【公表日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２１４３１（Ｐ２００６−５２１４３１）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７６１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９３３
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０００２９９２５）ユニベルシテ・ド・リエージュ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＥＧＥ
【住所又は居所原語表記】Ｑｕａｉ Ｖａｎ Ｂｅｎｅｄｅｎ ２５， ４０２０ Ｌｉｅｇｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７６１７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９３３
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０００２９９２５）ユニベルシテ・ド・リエージュ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＥＧＥ
【住所又は居所原語表記】Ｑｕａｉ Ｖａｎ Ｂｅｎｅｄｅｎ ２５， ４０２０ Ｌｉｅｇｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ
【Ｆターム（参考）】
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