ポリオール脱水素酵素の製造方法
【課題】グリセロール等のポリオールの定量に用いられる、ポリオール脱水素酵素の生産量を向上させる方法の提供。
【解決手段】グルコノバクター属に属する微生物による、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールおよび有機酸／塩を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法。また、該酵素を用いるポリオールの定量方法。
【解決手段】グルコノバクター属に属する微生物による、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールおよび有機酸／塩を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法。また、該酵素を用いるポリオールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、ＰＱＱ依存性ＰＤＨとも称する。）の製造方法、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬キット、および該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いたポリオールの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールの定量方法としては、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼとを用いることによる定量方法が知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であった。さらに、グリセロール−３リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点があり、またグリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。
【０００５】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００６】
【化２】
【０００７】
しかし、この方法を用いた場合においても高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。したがって、より安価で簡便なグリセロール測定法が求められてきた。
【０００８】
一方、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、試料中のグリセロール、ソルビトール、および中性脂肪などの定量に利用可能であることが知られている。ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いるグリセロールの定量方法は、下記式（４）の反応によって行われる。
【０００９】
【化３】
【００１０】
該反応においては、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ+を添加する必要がないなどのメリットがあるため、グリセロールの定量方法として非常に有用である。
【００１１】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを細菌によって生産する方法は従来から知られており、該細菌培養培地には、種々の培地が使用されてきた。例えば、特許文献１では、グルコノバクター属によるＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産培地の炭素源として、糖類、有機酸（例えばグルコン酸および酢酸）、アルコール（例えばグリセリンおよびエタノール）および糖アルコール（例えばマンニトールおよびソルビトール）などを含むＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産培地が利用することができるとの記載がある。また、特許文献２においては、グリセリンや糖アルコール(例えばソルビトール、マンニトール)などを炭素源として用いることが記載されている。
【特許文献１】特公昭６１−２２９５２号公報
【特許文献２】特開平８−２４２８５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、例えば、特許文献１や２に具体的に開示されているような公知の培地成分の組合せでは、工業的観点からみた場合、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量は充分とは言いがたく、生産量を向上させる方法が依然求められている。
【００１３】
また、上記特許文献１または２においては、いかなる種の炭素源を培地に添加することによって、微生物が効率よく生産されるかという観点からの記載はなく、また酵素生産向上の観点からはどの程度の炭素源濃度がよいかについての考察や記載はない。また、２種以上の特定種類の化合物を炭素源として組み合わせて用いることに関する詳細な検討はされていない。
【００１４】
そこで本発明は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産量を向上させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み鋭意研究した結果、培地中に特定の炭素源を用いることによって、従来から知られている培地成分で培養した場合と比べてＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産量を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、培地のｐＨが酸性域（ｐＨ４．０〜７．０）である場合に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産量の向上という本発明の効果が顕著に得られることも見出した。
【００１６】
すなわち、上記目的は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールならびに有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法によって解決される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、安価かつ簡便にＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量を向上させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の第一は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールおよび有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法に関するものである。
【００２０】
第一の発明の特徴は、微生物の培養培地中に、炭素源として、ポリオールと有機酸および／または有機酸塩（以下、「有機酸／塩」とも称する）とを必須に組み合わせて用いることにある。ポリオール単独でもＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導性能があることは知られているが（特開２００６−２７１２５７号公報）、本発明のようにさらに有機酸を含む培地で培養することによって、グルコノバクター属に属する微生物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。
【００２１】
本発明で用いられるポリオールとしては、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に限定されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセリンなどのトリトール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも、本発明の効果が顕著に得られることから、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトールを用いることが好ましく、ソルビトールを用いることがより好ましい。なお、糖アルコールを用いる場合は、Ｄ体、Ｌ体、ラセミ体のいずれを用いてもよいが、Ｄ体を用いることが好ましい。ポリオールは単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が増大することから、培地中のポリオール濃度は、培地１Ｌに対して、５〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０〜２５ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００２２】
本発明で用いられる有機酸としては、グルコン酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸などが挙げられる。中でも、本発明の効果が顕著に得られることから、グルコン酸、クエン酸を用いることが好ましく、グルコン酸を用いることがより好ましい。また、有機酸塩としては、上記列挙した有機酸とのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機酸およびその塩は単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が増大することから、培地中の有機酸／塩の濃度（有機酸および有機酸塩の合計の濃度）が、培地１Ｌに対して、１〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、１〜２０ｇ／Ｌであることがより好ましく、２〜１０ｇ／Ｌであることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明において、ポリオールと有機酸／塩（有機酸および有機酸塩の合計）との培地中の含有質量比が、ポリオール：有機酸／塩＝３０：１〜１：１であることが好ましく、２５：１〜１：１であることがより好ましい。かような範囲であれば、グルコノバクター属に属する微生物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。
【００２４】
また、培養段階で用いる培地のｐＨが、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量の向上に非常に重要であることを本発明者らは見出した。特に培地ｐＨが酸性域である場合に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。したがって、培地ｐＨは、４〜７であることが好ましく、４．５〜６．５であることがより好ましい。
【００２５】
本発明で用いられるグルコノバクター属に属する微生物は、従来公知の菌を使用することができ、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。中でも、生産性の観点から、グルコノバクター・オキシダンスを用いることが好ましい。またこれらの自然突然変異株または、人為突然変異株でもよい。人為突然変異処理は、当業者に周知の方法によって行うことができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００２６】
グルコノバクター属に属する微生物の培養にあたって使用する培地としては、グルコノバクター属に属する微生物が資化しうるポリオールおよび有機酸以外の炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用することができる。
【００２７】
炭素源としては、上記ポリオールおよび有機酸以外には、リボース、フルクトース、グルコース、スクロース等の糖類が使用される。
【００２８】
窒素源としては、例えばポリペプトンなどのペプトン類、肉エキス、魚エキス、酵母エキス、尿素、およびコーンスティープリカー等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物等が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等が使用される。
【００２９】
培養は通常、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は通常２０〜５０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２８〜３２℃である。かような条件下以外でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日であり、好ましくは１〜５日である。
【００３０】
本発明の酢酸菌であるグルコノバクター属に属する微生物の培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、本発明の方法による培養を行なってもよい（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）が、微生物を予め液体培地で培養（種培養）したものを、本発明の方法にかかる培養（本培養）に使用することもできる。
【００３１】
本発明の第二は、本発明の第一のＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬キットである。
【００３２】
本発明の第二のポリオール測定試薬キットは、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオール測定用の試薬群からなる。ポリオール脱水素酵素として本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として本発明の第一の発明によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００３３】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオール測定試薬に用いるためには、上記の培養方法の培地中に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製単離することが好ましい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、グルコノバクター属に属する細菌の細胞膜に存在しており、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出、精製する方法は種々の公知の方法がある。したがって、精製単離方法は従来公知の方法により行うことができるが、具体例を以下に述べる。なお、精製方法は下記方法に限定されるものではない。
【００３４】
まず培養終了後、培養液から菌体を遠心分離などにより回収し、ついで集菌した菌体を適当な溶媒で懸濁する。次に、菌体を破砕する。破砕法としては、フレンチプレス法、超音波破砕法等を用いればよい。
【００３５】
次いで破砕された抽出物を精製する。精製法は一般に使用される精製法を用いることができ、例えば硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。
【００３６】
また、上記方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、そのままの形態で使用されても、あるいは化学修飾された形態で使用されてもよい。さらに、例えばスプレードライや凍結乾燥によって粉末化してもよい。
【００３７】
本発明の第三は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法である。本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、下記式（５）のようにポリオールがグリセロールである場合、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。
【００３８】
【化４】
【００３９】
式（５）において電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって簡便にグリセロールが定量できる。
【００４０】
本発明において好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００４１】
本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨが基質とするポリオールとしては、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）などがあり、これらのポリオールを本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨによって定量できる。
【００４２】
本発明の第三の定量方法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００４４】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性を、下記方法により測定した。
【００４５】
５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１％ トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるミリモル吸光係数は１６．３ ｍＭ−１とした。
【００４６】
（参考例１〜８）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）に、本培養液１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、表１に記載の化合物を２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４８】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
上記表１に示される結果から、炭素源としてポリオールであるソルビトールがピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産において、最も有効であることが確認された。また、有機酸塩であるグルコン酸ナトリウムを単独で使用した場合は、ピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産量を著しく低下させることが確認された。
【００５１】
（実施例１〜２および比較例１）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５２】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）に、本培養液１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、表２に記載の有機酸塩 ０．２ｇ(比較例１は未添加)、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ５．５）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５３】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（実施例３〜６）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５６】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトールおよびグルコン酸ナトリウムを表３に記載の質量、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ５．５）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５７】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表３に示す。なお、以下表における比較例２は、上記参考例１である。
【００５８】
【表３】
【００５９】
（実施例７および比較例３）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００６０】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール １．５ｇ、グルコン酸ナトリウム ０．５ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを加え、塩酸（ＨＣｌ）または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液にて表４に記載の各ｐＨに調整して培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。 ３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表４に示す。
【００６１】
なお、比較例３は、実施例７において、ソルビトール１．５ｇ、グルコン酸ナトリウム０．５ｇの代わりにソルビトール２ｇを用いたこと以外は、実施例７と同様に行った。結果を下記表４に示す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
表４に示される結果から、炭素源としてソルビトールのみを単独で使用した場合よりも、炭素源としてソルビトールにグルコン酸ナトリウムを加えた場合、ポリオール脱水素酵素の生産量が著しく向上することが確認された。特にｐＨが低い領域で、ポリオール脱水素酵素の生産量が著しく向上することが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、ＰＱＱ依存性ＰＤＨとも称する。）の製造方法、該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬キット、および該ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いたポリオールの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールの定量方法としては、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼとを用いることによる定量方法が知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であった。さらに、グリセロール−３リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点があり、またグリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。
【０００５】
溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００６】
【化２】
【０００７】
しかし、この方法を用いた場合においても高価なＮＡＤ+を添加する必要がある。したがって、より安価で簡便なグリセロール測定法が求められてきた。
【０００８】
一方、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、試料中のグリセロール、ソルビトール、および中性脂肪などの定量に利用可能であることが知られている。ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いるグリセロールの定量方法は、下記式（４）の反応によって行われる。
【０００９】
【化３】
【００１０】
該反応においては、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ+を添加する必要がないなどのメリットがあるため、グリセロールの定量方法として非常に有用である。
【００１１】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨを細菌によって生産する方法は従来から知られており、該細菌培養培地には、種々の培地が使用されてきた。例えば、特許文献１では、グルコノバクター属によるＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産培地の炭素源として、糖類、有機酸（例えばグルコン酸および酢酸）、アルコール（例えばグリセリンおよびエタノール）および糖アルコール（例えばマンニトールおよびソルビトール）などを含むＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産培地が利用することができるとの記載がある。また、特許文献２においては、グリセリンや糖アルコール(例えばソルビトール、マンニトール)などを炭素源として用いることが記載されている。
【特許文献１】特公昭６１−２２９５２号公報
【特許文献２】特開平８−２４２８５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、例えば、特許文献１や２に具体的に開示されているような公知の培地成分の組合せでは、工業的観点からみた場合、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量は充分とは言いがたく、生産量を向上させる方法が依然求められている。
【００１３】
また、上記特許文献１または２においては、いかなる種の炭素源を培地に添加することによって、微生物が効率よく生産されるかという観点からの記載はなく、また酵素生産向上の観点からはどの程度の炭素源濃度がよいかについての考察や記載はない。また、２種以上の特定種類の化合物を炭素源として組み合わせて用いることに関する詳細な検討はされていない。
【００１４】
そこで本発明は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産量を向上させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み鋭意研究した結果、培地中に特定の炭素源を用いることによって、従来から知られている培地成分で培養した場合と比べてＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産量を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、培地のｐＨが酸性域（ｐＨ４．０〜７．０）である場合に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産量の向上という本発明の効果が顕著に得られることも見出した。
【００１６】
すなわち、上記目的は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールならびに有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法によって解決される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、安価かつ簡便にＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量を向上させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の第一は、グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールおよび有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法に関するものである。
【００２０】
第一の発明の特徴は、微生物の培養培地中に、炭素源として、ポリオールと有機酸および／または有機酸塩（以下、「有機酸／塩」とも称する）とを必須に組み合わせて用いることにある。ポリオール単独でもＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導性能があることは知られているが（特開２００６−２７１２５７号公報）、本発明のようにさらに有機酸を含む培地で培養することによって、グルコノバクター属に属する微生物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。
【００２１】
本発明で用いられるポリオールとしては、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に限定されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセリンなどのトリトール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも、本発明の効果が顕著に得られることから、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトールを用いることが好ましく、ソルビトールを用いることがより好ましい。なお、糖アルコールを用いる場合は、Ｄ体、Ｌ体、ラセミ体のいずれを用いてもよいが、Ｄ体を用いることが好ましい。ポリオールは単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が増大することから、培地中のポリオール濃度は、培地１Ｌに対して、５〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０〜２５ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００２２】
本発明で用いられる有機酸としては、グルコン酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸などが挙げられる。中でも、本発明の効果が顕著に得られることから、グルコン酸、クエン酸を用いることが好ましく、グルコン酸を用いることがより好ましい。また、有機酸塩としては、上記列挙した有機酸とのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機酸およびその塩は単独で用いてもよいし、２種以上併用してもよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が増大することから、培地中の有機酸／塩の濃度（有機酸および有機酸塩の合計の濃度）が、培地１Ｌに対して、１〜３０ｇ／Ｌであることが好ましく、１〜２０ｇ／Ｌであることがより好ましく、２〜１０ｇ／Ｌであることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明において、ポリオールと有機酸／塩（有機酸および有機酸塩の合計）との培地中の含有質量比が、ポリオール：有機酸／塩＝３０：１〜１：１であることが好ましく、２５：１〜１：１であることがより好ましい。かような範囲であれば、グルコノバクター属に属する微生物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。
【００２４】
また、培養段階で用いる培地のｐＨが、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量の向上に非常に重要であることを本発明者らは見出した。特に培地ｐＨが酸性域である場合に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産量が格段に向上する。したがって、培地ｐＨは、４〜７であることが好ましく、４．５〜６．５であることがより好ましい。
【００２５】
本発明で用いられるグルコノバクター属に属する微生物は、従来公知の菌を使用することができ、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ） ＮＢＲＣ ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。中でも、生産性の観点から、グルコノバクター・オキシダンスを用いることが好ましい。またこれらの自然突然変異株または、人為突然変異株でもよい。人為突然変異処理は、当業者に周知の方法によって行うことができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００２６】
グルコノバクター属に属する微生物の培養にあたって使用する培地としては、グルコノバクター属に属する微生物が資化しうるポリオールおよび有機酸以外の炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用することができる。
【００２７】
炭素源としては、上記ポリオールおよび有機酸以外には、リボース、フルクトース、グルコース、スクロース等の糖類が使用される。
【００２８】
窒素源としては、例えばポリペプトンなどのペプトン類、肉エキス、魚エキス、酵母エキス、尿素、およびコーンスティープリカー等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物等が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等が使用される。
【００２９】
培養は通常、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は通常２０〜５０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２８〜３２℃である。かような条件下以外でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日であり、好ましくは１〜５日である。
【００３０】
本発明の酢酸菌であるグルコノバクター属に属する微生物の培養をするにあたって、寒天培地等の固体培地に斜面培養したものを直接培養用の培地に植菌して、本発明の方法による培養を行なってもよい（場合によっては、種培養と区別するために「本培養」とも記載する）が、微生物を予め液体培地で培養（種培養）したものを、本発明の方法にかかる培養（本培養）に使用することもできる。
【００３１】
本発明の第二は、本発明の第一のＰＱＱ依存性ＰＤＨを含むポリオール測定試薬キットである。
【００３２】
本発明の第二のポリオール測定試薬キットは、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオール測定用の試薬群からなる。ポリオール脱水素酵素として本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として本発明の第一の発明によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００３３】
ＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオール測定試薬に用いるためには、上記の培養方法の培地中に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製単離することが好ましい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、グルコノバクター属に属する細菌の細胞膜に存在しており、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出、精製する方法は種々の公知の方法がある。したがって、精製単離方法は従来公知の方法により行うことができるが、具体例を以下に述べる。なお、精製方法は下記方法に限定されるものではない。
【００３４】
まず培養終了後、培養液から菌体を遠心分離などにより回収し、ついで集菌した菌体を適当な溶媒で懸濁する。次に、菌体を破砕する。破砕法としては、フレンチプレス法、超音波破砕法等を用いればよい。
【００３５】
次いで破砕された抽出物を精製する。精製法は一般に使用される精製法を用いることができ、例えば硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。
【００３６】
また、上記方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、そのままの形態で使用されても、あるいは化学修飾された形態で使用されてもよい。さらに、例えばスプレードライや凍結乾燥によって粉末化してもよい。
【００３７】
本発明の第三は、本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨをポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法である。本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、下記式（５）のようにポリオールがグリセロールである場合、グリセロールと酸化型電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。
【００３８】
【化４】
【００３９】
式（５）において電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加、ジヒドロキシアセトンの量を測定することによって簡便にグリセロールが定量できる。
【００４０】
本発明において好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００４１】
本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨが基質とするポリオールとしては、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）などがあり、これらのポリオールを本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨによって定量できる。
【００４２】
本発明の第三の定量方法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血漿、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明の第一によって得られるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いてグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００４４】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性を、下記方法により測定した。
【００４５】
５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、４５０ｍＭ グリセロールを含んだ０．１％ トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるミリモル吸光係数は１６．３ ｍＭ−１とした。
【００４６】
（参考例１〜８）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４７】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）に、本培養液１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、表１に記載の化合物を２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４８】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
上記表１に示される結果から、炭素源としてポリオールであるソルビトールがピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産において、最も有効であることが確認された。また、有機酸塩であるグルコン酸ナトリウムを単独で使用した場合は、ピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素生産量を著しく低下させることが確認された。
【００５１】
（実施例１〜２および比較例１）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５２】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）に、本培養液１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、表２に記載の有機酸塩 ０．２ｇ(比較例１は未添加)、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ５．５）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５３】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（実施例３〜６）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇからなる培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５６】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトールおよびグルコン酸ナトリウムを表３に記載の質量、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ５．５）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００５７】
３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表３に示す。なお、以下表における比較例２は、上記参考例１である。
【００５８】
【表３】
【００５９】
（実施例７および比較例３）
培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール ２ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを含む培地（ｐＨ ７．０）１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００６０】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ） ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。種培養液を検討用の培地（本培養液）１００ｍＬに対して５ｍＬ植菌した。なお、本培養液は、培地全体１００ｍＬに対して、ソルビトール １．５ｇ、グルコン酸ナトリウム ０．５ｇ、酵母エキス ０．３ｇ、肉エキス ０．３ｇ、コーンスティープリカー ０．３ｇ、ポリペプトン １ｇ、尿素 ０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇを加え、塩酸（ＨＣｌ）または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液にて表４に記載の各ｐＨに調整して培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。 ３０℃で２４時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ ７．０で懸濁後、超音波破砕機により菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）して無細胞抽出液を得、その酵素活性を測定した。その結果を表４に示す。
【００６１】
なお、比較例３は、実施例７において、ソルビトール１．５ｇ、グルコン酸ナトリウム０．５ｇの代わりにソルビトール２ｇを用いたこと以外は、実施例７と同様に行った。結果を下記表４に示す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
表４に示される結果から、炭素源としてソルビトールのみを単独で使用した場合よりも、炭素源としてソルビトールにグルコン酸ナトリウムを加えた場合、ポリオール脱水素酵素の生産量が著しく向上することが確認された。特にｐＨが低い領域で、ポリオール脱水素酵素の生産量が著しく向上することが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールならびに有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
前記培地のｐＨが４〜７である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリオールがヘキシトールであり、前記有機酸および有機酸塩がグルコン酸、クエン酸、グルコン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ポリオールがソルビトールであり、前記有機酸および有機酸塩がグルコン酸およびグルコン酸塩の少なくとも一方である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記有機酸および有機酸塩に対する前記ポリオールの培地中質量比が１〜３０である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ポリオール濃度が培地１Ｌに対して５〜３０ｇ／Ｌであり、前記有機酸および有機酸塩の濃度が培地１Ｌに対して１〜３０ｇ／Ｌである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を含む、ポリオール測定試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を、ポリオールと反応させる、ポリオールの定量方法。
【請求項１】
グルコノバクター属に属する微生物による補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法において、炭素源としてポリオールならびに有機酸および有機酸塩の少なくとも一方を含む培地中で前記微生物を培養する段階を有することを特徴とする、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２】
前記培地のｐＨが４〜７である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリオールがヘキシトールであり、前記有機酸および有機酸塩がグルコン酸、クエン酸、グルコン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ポリオールがソルビトールであり、前記有機酸および有機酸塩がグルコン酸およびグルコン酸塩の少なくとも一方である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記有機酸および有機酸塩に対する前記ポリオールの培地中質量比が１〜３０である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ポリオール濃度が培地１Ｌに対して５〜３０ｇ／Ｌであり、前記有機酸および有機酸塩の濃度が培地１Ｌに対して１〜３０ｇ／Ｌである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を含む、ポリオール測定試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で製造されたポリオール脱水素酵素を、ポリオールと反応させる、ポリオールの定量方法。
【公開番号】特開２００８−２２０３６７（Ｐ２００８−２２０３６７Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９５５０（Ｐ２００８−２９５５０）
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
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