ポリシアル酸誘導体
ポリシアル酸化合物は、ヘテロ二官能性試薬と反応し、スルフヒドリル基に対する部位特異的な結合のための側鎖官能基を導入する（例えば、薬物、ドラッグデリバリーシステム、タンパク質またはペプチド中のシステインユニットの側鎖）。該官能基は、例えば、Ｎ−マレイミド基である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物、タンパク質及びペプチドとのコンジュゲーションに有用なポリシアル酸誘導体、または、スルフヒドリル基を有するリポソームのようなドラッグデリバリーシステム、並びに、該誘導体、複合体並びに新規な合成中間体の合成のための複合化プロダクトプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管系内または脈管外での使用のいずれかにおける薬物の延長された存在は、多くの場合、それらの最適の使用のための前提条件である。例えば、様々な治療ペプチド及びタンパク質、並びにリポソームと同様に、多くの抗生物質及び細胞増殖抑制剤は、循環から、時期尚早に及び標的組織における有効濃度が得られる前に除去される。多くの短命なタンパク質（例えば酵素、サイトカイン等）の半減期は、これらを低分子量ポリ（エチレングリコール）に結合させることにより増大される。ＰＥＧ分子は、タンパク質と粒子の表面周囲にクラウド(cloud)を形成し、それによってそれらのクリアランス(clearance)の原因である因子との相互作用を立体的に妨害することにより、それらの循環時間を延長すると思われる。しかしながら、ＰＥＧは、非生物分解性であり、ＰＥＧ化されたタンパク質の細胞内への蓄積は、特に長期にわたる使用において不適当かもしれない（Bendele, A., Seely, J., Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol conjugated proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152-157; Convers, C. D. , Lejeune, L. , Shum, K. , Gilbert, C. , Shorr, R.G.L, Physiological effect of polyethylene glycol conjugation on stroma-free bovine hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion, Artificial organ, 21 (1997) 369-378）。
【０００３】
我々は、タンパク質と結合してそれらの半減期を増大させ、それらの免疫原性／抗原性を減少させる、または、様々なタンパク質の安定性を増大させる、２→８及び／または２→９（例えば、交互に２→８及び２→９）結合したシアル酸ユニットを含むポリサッカライドの複合化について記載した。ＷＯ９２／２２３３１において、ポリシアル酸はモデル薬物と反応させられ、マウスの循環中において半減期を延長することが示されている。Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓらは、アスパラギナーゼ及びカタラーゼに対するポリシアル酸の結合について記述し、酵素活性が保たれている一方で、循環からのクリアランス速度が減少することを示した（Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1964 to 1969 and in Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16 (1999) 203 to 215）。さらに、我々は、インシュリンをポリシアリル化し（Biochim. Biophys. Acta 1622 (2003) 42-49）、それが活性であることを示した。さらに、我々は、インターフェロンをポリシアリル化した（AAPS Annual meeting 2002, Toronto, Canada, M1056）。さらに、我々は、抗体フラグメントＦａｂをポリシアリル化した（Epenetos, A. et al., Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy) 21 (2002) 2186）。
【０００４】
これらすべての刊行物において、ポリシアル酸は、７，８−ビシナルジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して非還元性末端にアルデヒド基を生成することにより、反応性にされる。その後、アルデヒド基は、一般にタンパク質のリシン部分のイプシロンアミノ基またはＮ−末端アミン基であると推測される、タンパク質上の第一級アミン基と反応させられた。該反応は、シアノボロヒドリドによって第２級アミンに還元される、シッフ塩基を形成する。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−０１／８７９２２において、我々は、誘導体化の増大したレベルを達成するために、変性剤の存在下で、他の分子を用いた誘導体化を実施することができることをさらに提案する。他の誘導体化剤の例は、ポリエチレングリコール化合物である。トレシル(tresyl)−ＰＥＧ及びＰＥＧのスクシンイミジルスクシナートエステルのような活性化されたＰＥＧ化合物は、言及された。実施例では、アミン基と反応すると考えられている、スクシンイミジルスクシナート活性化ＰＥＧを用いた。
【０００６】
チオール基にカップリングするために官能基を持っているＰＥＧ誘導体は市販されている。該官能基はマレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはオルトピリジルジスルフィド基であり得る。これらの試薬はシステインと特異的に反応するため、そしてタンパク質はその表面にリシン基よりも少ないシステインを有するため、誘導体化はより制御しやすい。さらに、天然タンパク質中に遊離システインがない場合、１以上の遊離システインを遺伝子工学によって加え得る。このアプローチの利点は、生物学的活性の損失を最小限にする、タンパク質上の領域における部位特異的な誘導体化を可能にすることである。
【０００７】
ＰＥＧ化されたタンパク質は、血液循環中における複合体の滞留時間(residence time)にも影響を及ぼすことができる抗ＰＥＧ抗体を生じることが見出された（Cheng T, Wu, M., Wu,P., Chern, J, Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified proteins by anti-polyethylene glycol IgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520-528）。治療剤(therapeutics)に結合し、非経口投与されるポリマーとしてのＰＥＧの確立した歴史にもかかわらず、その免疫毒性学、薬理学及び代謝についてのよりよい理解が求められるだろう(Hunter, A. C, Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998-1001; Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111-112)。
【０００８】
ポリシアル酸による修飾のためには、チオール(スルフヒドリル)基が標的とされるのが有用だろう。また、シアル酸による誘導体化の効率を増大させるためには、大過剰の活性化ポリシアル酸を要求する、上述の我々の先行技術に記載された方法も望ましいだろう。さらに、シアノボロヒドリドの使用を回避することも望ましいだろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基及びオルトピリジルジスルフィド基から選択される官能基を含む1または各末端ユニットで結合した部分を有するポリシアル酸を含む新規な化合物が提供される。
【００１０】
該部分が結合する末端ユニットは、ポリシアル酸の非還元性末端またはポリシアル酸の還元性末端であり得る。通常、マレイミド基含有試薬が結合し得る有用な官能基を生成するため、末端シアル酸ユニットは予備化学反応に供される。我々は、マレイミド部分が結合し得る官能基を生成するための予備ステップとしてアルデヒド基が生成される、我々の以前の刊行物で開示された化学物質(chemistry)を使用することが好都合であることを見出した。
【００１１】
上述の我々の以前の刊行物において、それは、７位炭素のアルデヒド化合物(carbon 7-aldehyde compound)を形成するために、７，８−ビシナルジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することによりアルデヒド部分に変換される、非還元性末端ユニットである。これは、本発明のために適切な反応である。
【００１２】
代替として、還元性末端ユニットにおいてアルデヒド部分を提供することは可能である。この場合、予備酸化及び還元ステップによって、非還元性末端が非活性化される予備ステップを実施するのが好ましい（しかし必須ではない）。最初の還元ステップは、還元性末端のケタールユニットを、ビシナルジオールを有する還元された開環形態に変換する。ビシナルジオールは続いて、以前に還元性末端ユニットの７−炭素を形成していた炭素原子においてアルデヒド部分を形成するために、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化される。非還元性末端グリコシル（通常、シアル酸）が予備酸化ステップによって非活性化されない場合、該末端ユニットは同時に活性化されるだろう。
【００１３】
本発明において、官能基を含む部分は、ポリシアル酸ユニットに直接結合され得、または、さらに都合よくは、アルカンジイル基、アリーレン基またはオリゴ(アルキレンオキシ)アルカン基のような二官能性有機基あるいはオリゴぺプチジル基を介して結合され得る。ポリシアル酸への結合（リンカーまたは官能基を含む部分からの）は、第２級アミン、ヒドラゾン、アルキルヒドラジン、エステルまたはぺプチジル基であり得る。該部分は、ヘテロ二官能性試薬とのポリシアル酸基質の反応によって生成され得る。該方法は、本発明のさらなる側面を形成する。
【００１４】
選択された官能基を導入するのに有用な試薬は市販されている。いかなる追加のリンカー部分も導入することなく、アミン部分上にマレイミド基を導入するであろう化合物は、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミドである。一般に、試薬は、上述のアルデヒド基またはアミン基であり得るポリシアル酸上の基との反応のための第２官能基を含む。好適な第２官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びそれらのスルホスクシミド(sulfosuccimide)類似体並びにヒドラジドを含む。好ましくは、該化合物は、Ｎ−マレイミドアルカン酸ヒドラジドまたはＮ−マレイミドアリールアルカン酸ヒドラジド、即ち、一般式
Ｘ−Ｒ−Ｙ
を有する化合物であり、ここで：
Ｘは、Ｎ−マレイミド、Ｎ−ヨードアセトアミド、Ｓ−ビニルスルホニルまたはＳ−オルトピリジルジスルフィド基であり、
Ｒは、アルカンジイル、アリーレンまたはアラルキレンアルカリーレン(aralkylene alkarylene)、アルキレンオキサアルキレン、あるいは、アルキレンオリゴオキサアルキレンまたはアルキルオリゴぺプチジルアルキル基であり、
そして
Ｙは、ヒドラジド、アミンまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である。
【００１５】
好ましくは、ＲはＣ１−６アルカンジイル、Ｃ２−３アルキルオキサＣ２−３アルキレン、Ｃ２−３アルキルオリゴ（オキサＣ２−３アルキレン）、またはＣ２−６アルキレンフェニル基である。
【００１６】
好ましくは、ＸはＮ−マレイミドまたはオルトピリジルジスルフィドである。
【００１７】
好ましくは、Ｙはヒドラジドまたはヒドロキシルスクシンイミドである。
【００１８】
アルデヒド基と反応し得、リンカー部分を含みマレイミド基を導入する化合物は、
Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド及び４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドを含む。該ヒドラジド基はアルデヒドと反応し、安定なヒドラゾン基を形成する。オリゴ(エチレンオキシ)エチレン基を含む好適なヘテロ二官能性化合物は、１つの末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有し、他の末端に官能基を有する、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレンオキシ））基を含む化合物である。ＮＨＳ基はアミン基と反応し、安定したアミド結合を形成する。１つの末端にＮＨＳを有し、他の末端にビニルスルホンまたはマレイミドのいずれかを有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールは入手可能である。ヘテロ二官能性試薬の他の例は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート、スクシンイミジル−Ｈ―［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−［４−ヨードアセチル］アミノベンゾアート、Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル及びＮ−スクシンイミジルヨードアセタートを含む。他の試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポリエチレングリコールに基づく）から入手可能である。
【００１９】
シアル酸（ノヌロソン酸(nonulosonic acid)としても知られている）は、９以上の炭素原子を含むアミノ含有糖類のメンバーである。最も重要なシアル酸は、下記の式：
【００２０】
【化１】
【００２１】
を有するＮ−アセチルノイラミン酸（５−（アセチルアミノ）−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロソン酸、ラクタミン酸及びＯ−シアル酸としても知られている）である。
【００２２】
ポリシアル酸は、２→８及び／または２→９結合し得、通常α配置である。いくつかのポリシアル酸において、結合は、２→８及び２→９交互である。本発明は、シアル酸ユニットの他にグリコシルユニットを含むヘテロ多量体である(heteropolymeric)ポリサッカライドにも有用である。
【００２３】
ポリシアル酸は通常非毒性であり、実質的に非免疫原性であることが見出されている。また、生分解ユニットであるシアル酸は毒性であるとは知れておらず、実際、シアル酸は血液細胞及び循環タンパク質(circulating proteins)を含む動物のタンパク質及び細胞中に広く見出すことができる。
【００２４】
多数のシアル酸ユニットを含むポリサッカライド化合物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｏｇｉｎｏｓｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって産生されるポリサッカライドまたはその誘導体である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋlから（加水分解し鎖長を短縮することによって）得られるコロミン酸はα２→８結合シアル酸ユニットを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２株由来のポリサッカライドは、交互に２→８及び２→９結合したシアル酸ユニットを含む。Ｎ．メニンギティディスグループＣのポリサッカライドＣは２→９結合したシアル酸ユニットを有する。
【００２５】
本発明において特に有用であることが見出されたポリサッカライド化合物のグループの１つは、グループＢポリサッカライドである。これらの化合物はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ａｅｒｏｇｉｎｏｓｉｓ Ａ２及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１によって産生される。これらの化合物は、シアル酸残基を含むポリサッカライド成分及びリン脂質成分を含む。該シアル酸残基は（２→８）−α結合しており、該天然由来のポリマーは約２００の残基からなる。糖脂質分子の一部、特に高分子量化合物は、ポリサッカライド成分の還元性末端に共有結合したリン脂質を有していると思われる。
【００２６】
ポリサッカライド化合物の由来源である細菌については、製造時の便宜上、非病原体であるのが好ましい。従って、ポリサッカライドについては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２のようなＥ．ｃｏｌｉの非病原株または、好ましくは、非免疫原性であるＫ１に由来するものが特に好適である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２及びＫ１分離株はよく知られており、この種の任意の株の任意のタイプを好適なポリサッカライドの由来源として使用することができる。好ましくは、ポリシアル酸は少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、例えば５０以上のシアル酸ユニットを有するのがよい。
【００２７】
本発明により、タンパク質及び新規な活性化されたポリサッカライドの複合体がさらに提供される。該新規化合物は、少なくとも１つのシステインユニットを有し、チオエーテル結合を介してシステインユニットの側鎖に結合するタンパク質、該部分を介してポリシアル酸の１または両方の末端ユニットで結合するポリシアル酸を含む。
【００２８】
ポリシアル酸誘導体がＮ−マレイミド基である場合、該部分は、α−炭素原子に結合するチオエステルとともに、Ｎ−スクシンイミジル基を含む。好ましくは、該部分は第２級アミン、ヒドラゾンまたはアミド結合をさらに含む。
【００２９】
本発明において、ポリシアル酸が、スルフヒドリル基と反応するための第一官能基及びポリシアル酸の末端ユニットと反応して共有結合を形成するとともにスルフヒドリル基官能性ポリシアル酸との反応可能にする、第一官能基と異なる第二官能基を有するヘテロ二官能性試薬と反応させられる新規な方法がさらに提供される。
【００３０】
１つの実施形態において、第２官能基は求核基であり、好ましくはヒドラジンである。これは、ポリシアル酸が、カルボニル基が求核基によって攻撃される末端ユニットにおいてアルデヒド基を含む場合に、特に有用である。
【００３１】
本方法の他の実施形態において、第２官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステまたはスルホスクシンイミドエステル、もしくはカルボジイミドのような、Ｎ−アルコキシルカルボニルイミドのような、求電子性である。そのような場合の末端基は、好ましくはアミンのような求核基である。
【００３２】
該方法において、試薬は、第一及び第二の官能基に結合する二官能性有機基を含むのが好ましい。好ましくは、該二官能性有機基は、Ｃ２−１８アルカンジイル基、アリーレン基、オリゴペプチド及びオリゴ(アルコキシ)アルキル基から選択される。
【００３３】
好適な試薬の例は前記に挙げられる。
【００３４】
最も有益には、該方法は、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有し、それによって該官能基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリシアル化されたポリペプチドまたはタンパク質を形成するポリペプチドまたはタンパク質と、官能性ポリシアル酸が反応させられる、その後に続くステップを含む。該方法は、タンパク質が単一のＣｙｓユニットを含み、それによって部位−制御された誘導体化を得る場合に特に好適である。
【００３５】
本発明は、添付の実施例において例証される。
【実施例１】
【００３６】
【化２】
【００３７】
１．１ 合成
別個の3つの調製が以下のように行なわれた。
【００３８】
ＷＯ−Ａ−９２２２３３１に基づいて製造されたコロミン酸アルデヒド（ＣＡＯ）（１００ｍｇ、４．４×１０−６ｍｏｌ）を、５００μｌの０．１M酢酸ナトリウムに溶解し、これに５ｍｏｌａｒ当量のＮ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（６．５ｍｇ、２．２×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その後、この混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で２時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。その後、該ポリマーを、２容量（１．０ｍｌ）のエタノールを添加することにより沈殿させた。該沈殿を、ベンチトップ遠心機(bench top microcentrifuge)で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ ２分間）することにより収集した。上清を廃棄し、ペレットを５００μｍｌの０．１Ｍアセタートに溶解した。この方法をさらに２回繰り返し、最終的なペレットを脱イオン水に溶解し、終夜凍結乾燥した。
【００３９】
１．２ マレイミド含有量の分析
この分析において、システインは、芳香環に隣接していないチオールと置換された場合に濃い黄色を形成するジスルフィドを含むエルマン試薬(Ellman’s Reagent)（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））でさらなる反応を妨げて、ポリマー上のマレイミドと反応される。従って、マレイミド含有量は、システインとエルマン試薬アッセイ間の反応の阻害を測定することにより、計算することができる。
【００４０】
まず、１２×１０−３Ｍ（０．１４５ｍｇ／ｍｌ）のシステインの初期ストック(initial stock)を、ＰＢＳ中で調製した。クリーンなマイクロタイタープレート中で、体積１００μｌの、１２×１０−３Ｍ〜０．３７５×１０−３Ｍの２倍希釈液を、列Ｂから列Ｈまで作った。列Ａにおいて、１００μｌＰＢＳをゼロ標準として用いた。ＣＡ及びＣＡ−マレイミド（ＣＡＭ）の試料を、５または１０ｍｇ／ｍｌで調製し、各試料１００μｌを、システイン希釈液の二重カラムに添加した。いずれのＣＡも含まない１セットの１００μｌＰＢＳを、コントロールとして加えた。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートした。その後、２０μｌのエルマン試薬（ＰＢＳ中に４ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５時間、暗所でインキュベートした。吸光度を、ウェル中で、４０５ｎｍで測定した。その後、試料について標準曲線をプロットし、シグナルの阻害から、存在するマレイミドの量を計算した。
【００４１】
１．４ ＦＡｂのチオール化及びＣＡＭへの結合
第一のステップにおいて、チオール基は、リシンのアミンのチオール化によってモデルタンパク質へ導入される。
【００４２】
羊ＦＡｂ（抗デシプラミン／ノリチルプタリン(Norityrptaline)、４ｍｇ、７．２×１０−８ｍｏｌ）を０．２５ｍｌのＰＢＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡに溶解し、これに０．４９８ｍｇの２−イミノチオラン（２−ＩＴ、トラウトの試薬(Traut’s reagent)５０ｍｏｌ当量 ３．６×１０−６ｍｏｌ）を含有する同じ緩衝液０．２５ｍｌを添加した。該試験管をフォイルで包み、端から端まで攪拌しながら、３７℃で１時間インキュベートした。
【００４３】
【化３】
【００４４】
チオール化されたＦａｂを、ゲル濾過（ＰＤ−１０）により、フリーの２−ＩＴトラウト試薬(Traut’s reagent)から精製し、０．５ｍｌの画分を、タンパク質（ＢＣＡアッセイ）またはチオール（エルマンアッセイ）の存在についてアッセイした。両者を含む最初の溶出ピークをプールし、タンパク質及びチオールを定量した。
【００４５】
１．５ Ｆａｂ−チオールのＣＡＭへの結合
２ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ中のチオール化されたＦＡｂ（３．６ｍｇ、６．６×１０−８ｍｏｌ）に、２２．５ｍｇのＣＡＭを添加した（９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、穏やかに混合しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた複合体を、フリーのＣＡＭを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。複合体におけるＣＡ及びタンパク質両者の含有量をアッセイし、結合比を計算した。
【００４６】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。
【００４７】
様々なチオール化の程度を有しているが、１５：１のＣＡＭ：Ｆａｂの比が維持されている、ＣＡＭ−Ｆａｂのいくつかのバッチを調製した。結果を第１表に示す：
【００４８】
【表１】
【００４９】
図１は、３回反復試料及び関連するコントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００５０】
１．６ 結論
結果は、すべてのコントロールウェル（チオール化されたＦＡｂの試料）において、試料の移動が、新鮮なＦＡｂ（５０のｋＤａマーカーのそれより下の）のそれに似ていることを示し、結合のプロセスの間にＦＡｂ分子の架橋が起こらないことを示す。反復試料のレーンには、ポリシアリル化された生成物を示す質量の増大を典型的に示す、９８及び２５０ＫＤａのマーカー間に最大強度を有する、顕著なバンドの広がりが存在する。
【００５１】
１．７ ＣＡＭのベータガラクトシダーゼへの結合
１ｍｌＰＢＳ中のＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）（５．０ｍｇ、４．３×１０−８ｍｏｌ）に、１５ｍｇのＣＡＭを添加した（６．５９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、フォイルで包み、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。得られた複合体を、ＳＤＳ ｐａｇｅにより分析し、その後、フリーのＣＡＭを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。試料を、他に概説されるようにして、ポリマー及びタンパク質の含有量についてアッセイした。
【００５２】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。
【００５３】
１．８ 酵素活性アッセイ
ＰＢＳ中で、６０μｇ／ｍｌ〜３．７５μｇ／ｍｌの新鮮なβ−ガラクトシダーゼの標準液(standards)を調製した。ＣＡＭ−β−ｇａｌの試料を、同バッファー中で６０μｇ／ｍｌに希釈した。複合体の酵素活性を、以下のようにして測定した：
マイクロタイタープレート中で、１００μｌの試料または標準液に、１００μｌのオールインワンβ−ｇａｌ基質(All-in-One β-gal substrate)（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。該プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液からキャリブレーションカーブを作成し、試料の活性を、該カーブの線形回帰についての方程式から計算した。
【００５４】
１．９ 結果
タンパク質及びポリマーのアッセイから、結合比は１．２３ ＣＡＭ：１ β−ｇａｌであると測定された。また、試料のＳＤＳ ｐａｇｅから、対応する見かけの分子量の増大もあった（図２）。精製された試料における酵素活性は、フリーの酵素と比較して、１００．４％と計算された。
【実施例２】
【００５５】
合成経路２
ステップ１ ＣＡ−アルデヒド（ＣＨＯ）のアミノ化
【００５６】
【化４】
【００５７】
ステップ２ マレイミド環の導入
【００５８】
【化５】
【００５９】
合成
２．１． ステップ１ 酸化されたＣＡのアミノ化
５０ｍｌ試験管中で、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの酸化されたコロミン酸（ＣＡＯ）を、３００倍モル過剰(300-fold molar excess)のＮＨ４Ｃｌとともに、２ｍｌの脱イオン水に溶解し、その後、ＮａＣＮＢＨ３（１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中、５Ｍストック）を最終濃度５ｍｇ／ｍｌで添加した。該混合物を室温で５日間インキュベートした。コントロール反応も、ＣＡＯの代わりにコロミン酸（Ａ）を用いて準備された。生成したコロミン酸アミン誘導体を、５ｍｌの氷冷エタノールを添加することにより沈殿させた。該沈殿を、室温で３０分間、４０００ｒｐｍで卓上遠心機中で遠心分離することにより回収した。該ペレットを、２ｍｌの脱イオン水中に保持及び再懸濁し、その後、１０ｍｌの超遠心管中で５ｍｌの氷冷エタノールを用いて再び沈殿させた。該沈殿を、室温で３０分間、３００００ｒｐｍで遠心分離することにより、収集した。該ペレットを２ｍｌの脱イオン水に再び再懸濁し、凍結乾燥した。
【００６０】
２．２．アミン含量についてのアッセイ
ＴＮＢＳ（ピクリルスルホン酸または２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを、該生成物中に存在するアミノ基の量を測定するために用いた。
【００６１】
マイクロタイタープレートのウェル中で、９０μｌの０．１Ｍホウ酸塩バッファー（ｐＨ９．５）に、ＴＮＢＳ（０．５μｌの１５ｍＭ ＴＮＢＳ）を添加した。これに、１０μｌのＣＡ−アミドの５０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する前に、該プレートを室温で２０分間放置した。グリシンを、０．１〜１ｍＭの濃度範囲で、標準液として用いた。ＴＮＢＳは第１級アミン基をトリニトロフェニル化する。アミンのＴＮＰ付加物が検出される。
【００６２】
２回の冷エタノール沈殿を用いて精製された生成物の、ＴＮＢＳアッセイを用いたテストは、９０％近くの転化を示した。
【００６３】
２．３．ＣＡ−アミンのマレイミド化
ＣＡ−アミン（１７ｍｇ）を１ｍｌの脱イオン水に溶解し、これに６ｍｇのメトキシカルボニルマレイミド（ＭＣＭ）を添加した。該混合物を室温で３０分間放置して反応させた。該試料に、１ １００μｌの水及び２００μｌのアセトニトリルを添加し、その後、室温で４時間インキュベートした後、３００μｌのＣＨＣｌ３を添加し、該試験管を振り混ぜ、水性画分を収集した。その後、該画分をＰＤ−１０カラムで精製し、低分子を除去した。該溶出液を凍結乾燥し、マレイミド含有量についてアッセイした。マレイミドのモル濃度は４４モル％であった。
【実施例３】
【００６４】
コロミン酸のヨードアセタート誘導体（ＣＡＩ）の調製。
【００６５】
【化６】
【００６６】
３．１ 合成
１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４０ｍｇのコロミン酸アミン（８５モル％アミン）（実施例２．１に記載される）に、５ｍｇのＮ−スクシンイミジルヨードアセタート（ＳＩＡ）を添加した。該混合物を３７℃で１時間放置して反応させた後、過剰のＳＩＡを、５ｍｌのＨｉｇｈｔｒａｐ（登録商標）脱塩カラム（ＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＰＢＳを用いて溶出するゲル濾過により除去した。０．５ｍｌの画分をカラムから収集し、各画分からの試料をコロミン酸含有量（レゾルシノールアッセイ）及びヨウ化物を示すシステインとの反応性（エルマンアッセイ）についてテストした。ヨウ化物及びＣＡ両者について陽性の画分をプールした。
【００６７】
３．２ ＣＡＩのβ−ガラクトシダーゼへの結合
１ｍｌＰＢＳ中のＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（５．０ｍｇ、４．３×１０−８ｍｏｌ）に、１５ｍｇのＣＡＩを添加した（６．５９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、フォイルで包み、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。得られた複合体を、ＳＤＳ ｐａｇｅにより分析し、その後、フリーのＣＡＩを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。試料を、他に概説されるようにして、ポリマー及びタンパク質の含有量について分析した。
【００６８】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。上述の実施例１．８のようにして、全ての試料を、β−ｇａｌ活性について分析した。
【００６９】
３．３ 結論
画分３〜６は、ポリマー及びヨードアセタート両者について陽性であり、プールされた。ＳＤＳ ｐａｇｅ（４〜１２％ ビス／トリスゲル；図２）は、コントロールポリマーと共にではなく、ヨードアセトアミド誘導体と共にインキュベートされた試料について、見かけの分子量の増加を示した。タンパク質及びポリマーのアッセイから、結合比は１．６３ ＣＡＩ：１ β−ｇａｌであると測定された。β−ｇａｌ活性は、フリーの酵素と比較して、結合した試料について１００．９％であると計算された。
【実施例４】
【００７０】
４．１ 合成：４（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＣＡ−ＭＢＰＨ）及び３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＣＡ−ＰＤＰＨ）を用いた非還元性末端の活性化
調製は、以下のように行われた：
ＷＯ−Ａ−９２２２３３１に従って製造されたコロミン酸アルデヒド（ＣＡＯ；２２．７ｋＤａ、Ｃａｍｉｄａ、Ｉｒｅｌａｎｄ）（ＭＢＰＨ用に７３ｍｇ、試験管Ａ；ＰＤＰＨ用に９９．３ｍｇ、試験管Ｂ）を、８００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）にそれぞれ溶解した。試験管Ａに、２００μｌのＤＭＳＯに溶解した１５ｍｇのＭＢＰＨ（１５：１ リンカー：ＣＡ比）を添加した。試験管Ｂに、２００μｌのＤＭＳＯに溶解した１５ｍｇのＰＤＰＨ（１５：１ リンカー：ＣＡ比）を添加した。各反応管の各場合について、ｐＨを５．５に調整した。その後、これらの混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で２時間、オービタルミキサー上でインキュベートした。各ポリマー溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出してゲル濾過（ＰＤ １０カラム）することにより精製し、ＣＡ（レゾルシノールアッセイによる）を含む画分１ｍｌを収集した。これらの試料を終夜凍結乾燥し、実施例１．２に記載されているようにして、マレイミド含有量についてアッセイした。
【００７１】
４．２ 合成：４（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＢＰＨ−ＣＡ）、（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ−ＣＡ）及びＮ−β−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ヒドラジド（ＢＭＰＨ−ＣＡ）を用いた還元性末端の活性化
調製は、全てリンカーのＣＡに対するモル比が２５：１で、以下のように行われた：
コロミン酸（ＣＡ；２２．７Ｋ；ＭＢＰＨ用に７３ｍｇ、試験管Ａ；ＰＤＰＨ用に９９．３ｍｇ、試験管ＢそしてＢＭＰＨ用に７６．６ｍｇ；試験管Ｃ）を、８００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）にそれぞれ溶解した。試験管Ａに、２５ｍｇのＭＢＰＨ（２００μｌのＤＭＳＯに溶解した）を、試験管Ｂに、２５ｍｇのＰＤＰＨ（２００μｌのＤＭＳＯに溶解した）を、そして、バイアルＣに、２５ｍｇのＢＭＰＨ（２００μｌの酢酸ナトリウムバッファーに溶解した）を添加した。反応混合物のｐＨを５．５に調整した。その後、これらの混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で７２時間、オービタルミキサー上でインキュベートした。各ポリマー溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出するゲル濾過（ＰＤ１０カラム）により精製し、ＣＡ（レゾルシナルアッセイによる）を含む画分１ｍｌを収集した。これらの試料を終夜凍結乾燥し、実施例１．２に記載されているようにして、マレイミド含有量についてアッセイした。
【００７２】
４．３ 結果
非還元性末端（高反応性）におけるマレイミドのモル濃度は、ＭＢＰＨ及びＰＤＰＨそれぞれについて４９．０及び３５．０モル％であった。還元性末端（弱反応性）におけるマレイミドのモル濃度は、ＭＢＰＨ、ＰＤＰＨ及びＢＭＰＨそれぞれについて４１．５、３２．５及び４８．３モル％であった。還元性末端における値は、各場合における２つの値の平均値である。
【００７３】
４．４ β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）のマレイミド活性化コロミン酸（還元性末端及び非還元性末端）への結合
セパレートチューブ中のβ−ｇａｌ（１．０ｍｇ；１ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ中）に、１５モル過剰の各マレイミド活性化ＣＡ（非還元性末端または還元性末端におけるＭＢＰＨ、ＰＤＰＨ及びＢＭＰＨ、前記実施例から得られる）を別々に添加した。各チューブに封をし、穏やかに混合しながら、３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた複合体を、フリーの活性化ポリマーを除去するための、認められているプロトコルに従って精製した。全ての試料を、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、そして、実施例１．８のようにして、β−ｇａｌ活性について分析した。
【００７４】
４．５ 結果
結果（図３）は、全ての対照ウェル（β−ｇａｌを有する）において、試料の移動は、新鮮なβ−ｇａｌについてのそれと似ていることを示す。複合体のレーンには、ポリシアリル化されたβ−ｇａｌを示す量の増大を典型的に示す、９８ｋＤａマーカーと２５０ｋＤａマーカーとの間に最大強度を有する顕著なバンドの広がりが存在する。β−ｇａｌ活性は、結合された試料について、９１．０〜１０６％と計算された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、３回反復試料及び関連するコントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】試料のＳＤＳ ｐａｇｅから、対応する見かけの分子量の増大もあった
【図３】全ての対照ウェル（β−ｇａｌを有する）において、試料の移動は、新鮮なβ−ｇａｌについてのそれと似ていることを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物、タンパク質及びペプチドとのコンジュゲーションに有用なポリシアル酸誘導体、または、スルフヒドリル基を有するリポソームのようなドラッグデリバリーシステム、並びに、該誘導体、複合体並びに新規な合成中間体の合成のための複合化プロダクトプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管系内または脈管外での使用のいずれかにおける薬物の延長された存在は、多くの場合、それらの最適の使用のための前提条件である。例えば、様々な治療ペプチド及びタンパク質、並びにリポソームと同様に、多くの抗生物質及び細胞増殖抑制剤は、循環から、時期尚早に及び標的組織における有効濃度が得られる前に除去される。多くの短命なタンパク質（例えば酵素、サイトカイン等）の半減期は、これらを低分子量ポリ（エチレングリコール）に結合させることにより増大される。ＰＥＧ分子は、タンパク質と粒子の表面周囲にクラウド(cloud)を形成し、それによってそれらのクリアランス(clearance)の原因である因子との相互作用を立体的に妨害することにより、それらの循環時間を延長すると思われる。しかしながら、ＰＥＧは、非生物分解性であり、ＰＥＧ化されたタンパク質の細胞内への蓄積は、特に長期にわたる使用において不適当かもしれない（Bendele, A., Seely, J., Richey, C., Sennello, G., Shopp, G., Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol conjugated proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152-157; Convers, C. D. , Lejeune, L. , Shum, K. , Gilbert, C. , Shorr, R.G.L, Physiological effect of polyethylene glycol conjugation on stroma-free bovine hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion, Artificial organ, 21 (1997) 369-378）。
【０００３】
我々は、タンパク質と結合してそれらの半減期を増大させ、それらの免疫原性／抗原性を減少させる、または、様々なタンパク質の安定性を増大させる、２→８及び／または２→９（例えば、交互に２→８及び２→９）結合したシアル酸ユニットを含むポリサッカライドの複合化について記載した。ＷＯ９２／２２３３１において、ポリシアル酸はモデル薬物と反応させられ、マウスの循環中において半減期を延長することが示されている。Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓらは、アスパラギナーゼ及びカタラーゼに対するポリシアル酸の結合について記述し、酵素活性が保たれている一方で、循環からのクリアランス速度が減少することを示した（Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1964 to 1969 and in Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16 (1999) 203 to 215）。さらに、我々は、インシュリンをポリシアリル化し（Biochim. Biophys. Acta 1622 (2003) 42-49）、それが活性であることを示した。さらに、我々は、インターフェロンをポリシアリル化した（AAPS Annual meeting 2002, Toronto, Canada, M1056）。さらに、我々は、抗体フラグメントＦａｂをポリシアリル化した（Epenetos, A. et al., Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy) 21 (2002) 2186）。
【０００４】
これらすべての刊行物において、ポリシアル酸は、７，８−ビシナルジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して非還元性末端にアルデヒド基を生成することにより、反応性にされる。その後、アルデヒド基は、一般にタンパク質のリシン部分のイプシロンアミノ基またはＮ−末端アミン基であると推測される、タンパク質上の第一級アミン基と反応させられた。該反応は、シアノボロヒドリドによって第２級アミンに還元される、シッフ塩基を形成する。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−０１／８７９２２において、我々は、誘導体化の増大したレベルを達成するために、変性剤の存在下で、他の分子を用いた誘導体化を実施することができることをさらに提案する。他の誘導体化剤の例は、ポリエチレングリコール化合物である。トレシル(tresyl)−ＰＥＧ及びＰＥＧのスクシンイミジルスクシナートエステルのような活性化されたＰＥＧ化合物は、言及された。実施例では、アミン基と反応すると考えられている、スクシンイミジルスクシナート活性化ＰＥＧを用いた。
【０００６】
チオール基にカップリングするために官能基を持っているＰＥＧ誘導体は市販されている。該官能基はマレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはオルトピリジルジスルフィド基であり得る。これらの試薬はシステインと特異的に反応するため、そしてタンパク質はその表面にリシン基よりも少ないシステインを有するため、誘導体化はより制御しやすい。さらに、天然タンパク質中に遊離システインがない場合、１以上の遊離システインを遺伝子工学によって加え得る。このアプローチの利点は、生物学的活性の損失を最小限にする、タンパク質上の領域における部位特異的な誘導体化を可能にすることである。
【０００７】
ＰＥＧ化されたタンパク質は、血液循環中における複合体の滞留時間(residence time)にも影響を及ぼすことができる抗ＰＥＧ抗体を生じることが見出された（Cheng T, Wu, M., Wu,P., Chern, J, Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified proteins by anti-polyethylene glycol IgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520-528）。治療剤(therapeutics)に結合し、非経口投与されるポリマーとしてのＰＥＧの確立した歴史にもかかわらず、その免疫毒性学、薬理学及び代謝についてのよりよい理解が求められるだろう(Hunter, A. C, Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998-1001; Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111-112)。
【０００８】
ポリシアル酸による修飾のためには、チオール(スルフヒドリル)基が標的とされるのが有用だろう。また、シアル酸による誘導体化の効率を増大させるためには、大過剰の活性化ポリシアル酸を要求する、上述の我々の先行技術に記載された方法も望ましいだろう。さらに、シアノボロヒドリドの使用を回避することも望ましいだろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基及びオルトピリジルジスルフィド基から選択される官能基を含む1または各末端ユニットで結合した部分を有するポリシアル酸を含む新規な化合物が提供される。
【００１０】
該部分が結合する末端ユニットは、ポリシアル酸の非還元性末端またはポリシアル酸の還元性末端であり得る。通常、マレイミド基含有試薬が結合し得る有用な官能基を生成するため、末端シアル酸ユニットは予備化学反応に供される。我々は、マレイミド部分が結合し得る官能基を生成するための予備ステップとしてアルデヒド基が生成される、我々の以前の刊行物で開示された化学物質(chemistry)を使用することが好都合であることを見出した。
【００１１】
上述の我々の以前の刊行物において、それは、７位炭素のアルデヒド化合物(carbon 7-aldehyde compound)を形成するために、７，８−ビシナルジオール部分を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することによりアルデヒド部分に変換される、非還元性末端ユニットである。これは、本発明のために適切な反応である。
【００１２】
代替として、還元性末端ユニットにおいてアルデヒド部分を提供することは可能である。この場合、予備酸化及び還元ステップによって、非還元性末端が非活性化される予備ステップを実施するのが好ましい（しかし必須ではない）。最初の還元ステップは、還元性末端のケタールユニットを、ビシナルジオールを有する還元された開環形態に変換する。ビシナルジオールは続いて、以前に還元性末端ユニットの７−炭素を形成していた炭素原子においてアルデヒド部分を形成するために、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化される。非還元性末端グリコシル（通常、シアル酸）が予備酸化ステップによって非活性化されない場合、該末端ユニットは同時に活性化されるだろう。
【００１３】
本発明において、官能基を含む部分は、ポリシアル酸ユニットに直接結合され得、または、さらに都合よくは、アルカンジイル基、アリーレン基またはオリゴ(アルキレンオキシ)アルカン基のような二官能性有機基あるいはオリゴぺプチジル基を介して結合され得る。ポリシアル酸への結合（リンカーまたは官能基を含む部分からの）は、第２級アミン、ヒドラゾン、アルキルヒドラジン、エステルまたはぺプチジル基であり得る。該部分は、ヘテロ二官能性試薬とのポリシアル酸基質の反応によって生成され得る。該方法は、本発明のさらなる側面を形成する。
【００１４】
選択された官能基を導入するのに有用な試薬は市販されている。いかなる追加のリンカー部分も導入することなく、アミン部分上にマレイミド基を導入するであろう化合物は、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミドである。一般に、試薬は、上述のアルデヒド基またはアミン基であり得るポリシアル酸上の基との反応のための第２官能基を含む。好適な第２官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びそれらのスルホスクシミド(sulfosuccimide)類似体並びにヒドラジドを含む。好ましくは、該化合物は、Ｎ−マレイミドアルカン酸ヒドラジドまたはＮ−マレイミドアリールアルカン酸ヒドラジド、即ち、一般式
Ｘ−Ｒ−Ｙ
を有する化合物であり、ここで：
Ｘは、Ｎ−マレイミド、Ｎ−ヨードアセトアミド、Ｓ−ビニルスルホニルまたはＳ−オルトピリジルジスルフィド基であり、
Ｒは、アルカンジイル、アリーレンまたはアラルキレンアルカリーレン(aralkylene alkarylene)、アルキレンオキサアルキレン、あるいは、アルキレンオリゴオキサアルキレンまたはアルキルオリゴぺプチジルアルキル基であり、
そして
Ｙは、ヒドラジド、アミンまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である。
【００１５】
好ましくは、ＲはＣ１−６アルカンジイル、Ｃ２−３アルキルオキサＣ２−３アルキレン、Ｃ２−３アルキルオリゴ（オキサＣ２−３アルキレン）、またはＣ２−６アルキレンフェニル基である。
【００１６】
好ましくは、ＸはＮ−マレイミドまたはオルトピリジルジスルフィドである。
【００１７】
好ましくは、Ｙはヒドラジドまたはヒドロキシルスクシンイミドである。
【００１８】
アルデヒド基と反応し得、リンカー部分を含みマレイミド基を導入する化合物は、
Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド及び４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドを含む。該ヒドラジド基はアルデヒドと反応し、安定なヒドラゾン基を形成する。オリゴ(エチレンオキシ)エチレン基を含む好適なヘテロ二官能性化合物は、１つの末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有し、他の末端に官能基を有する、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレンオキシ））基を含む化合物である。ＮＨＳ基はアミン基と反応し、安定したアミド結合を形成する。１つの末端にＮＨＳを有し、他の末端にビニルスルホンまたはマレイミドのいずれかを有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールは入手可能である。ヘテロ二官能性試薬の他の例は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート、スクシンイミジル−Ｈ―［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−［４−ヨードアセチル］アミノベンゾアート、Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル及びＮ−スクシンイミジルヨードアセタートを含む。他の試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポリエチレングリコールに基づく）から入手可能である。
【００１９】
シアル酸（ノヌロソン酸(nonulosonic acid)としても知られている）は、９以上の炭素原子を含むアミノ含有糖類のメンバーである。最も重要なシアル酸は、下記の式：
【００２０】
【化１】
【００２１】
を有するＮ−アセチルノイラミン酸（５−（アセチルアミノ）−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロソン酸、ラクタミン酸及びＯ−シアル酸としても知られている）である。
【００２２】
ポリシアル酸は、２→８及び／または２→９結合し得、通常α配置である。いくつかのポリシアル酸において、結合は、２→８及び２→９交互である。本発明は、シアル酸ユニットの他にグリコシルユニットを含むヘテロ多量体である(heteropolymeric)ポリサッカライドにも有用である。
【００２３】
ポリシアル酸は通常非毒性であり、実質的に非免疫原性であることが見出されている。また、生分解ユニットであるシアル酸は毒性であるとは知れておらず、実際、シアル酸は血液細胞及び循環タンパク質(circulating proteins)を含む動物のタンパク質及び細胞中に広く見出すことができる。
【００２４】
多数のシアル酸ユニットを含むポリサッカライド化合物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｅｒｏｇｉｎｏｓｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって産生されるポリサッカライドまたはその誘導体である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋlから（加水分解し鎖長を短縮することによって）得られるコロミン酸はα２→８結合シアル酸ユニットを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２株由来のポリサッカライドは、交互に２→８及び２→９結合したシアル酸ユニットを含む。Ｎ．メニンギティディスグループＣのポリサッカライドＣは２→９結合したシアル酸ユニットを有する。
【００２５】
本発明において特に有用であることが見出されたポリサッカライド化合物のグループの１つは、グループＢポリサッカライドである。これらの化合物はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ａｅｒｏｇｉｎｏｓｉｓ Ａ２及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１によって産生される。これらの化合物は、シアル酸残基を含むポリサッカライド成分及びリン脂質成分を含む。該シアル酸残基は（２→８）−α結合しており、該天然由来のポリマーは約２００の残基からなる。糖脂質分子の一部、特に高分子量化合物は、ポリサッカライド成分の還元性末端に共有結合したリン脂質を有していると思われる。
【００２６】
ポリサッカライド化合物の由来源である細菌については、製造時の便宜上、非病原体であるのが好ましい。従って、ポリサッカライドについては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２のようなＥ．ｃｏｌｉの非病原株または、好ましくは、非免疫原性であるＫ１に由来するものが特に好適である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ９２及びＫ１分離株はよく知られており、この種の任意の株の任意のタイプを好適なポリサッカライドの由来源として使用することができる。好ましくは、ポリシアル酸は少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、例えば５０以上のシアル酸ユニットを有するのがよい。
【００２７】
本発明により、タンパク質及び新規な活性化されたポリサッカライドの複合体がさらに提供される。該新規化合物は、少なくとも１つのシステインユニットを有し、チオエーテル結合を介してシステインユニットの側鎖に結合するタンパク質、該部分を介してポリシアル酸の１または両方の末端ユニットで結合するポリシアル酸を含む。
【００２８】
ポリシアル酸誘導体がＮ−マレイミド基である場合、該部分は、α−炭素原子に結合するチオエステルとともに、Ｎ−スクシンイミジル基を含む。好ましくは、該部分は第２級アミン、ヒドラゾンまたはアミド結合をさらに含む。
【００２９】
本発明において、ポリシアル酸が、スルフヒドリル基と反応するための第一官能基及びポリシアル酸の末端ユニットと反応して共有結合を形成するとともにスルフヒドリル基官能性ポリシアル酸との反応可能にする、第一官能基と異なる第二官能基を有するヘテロ二官能性試薬と反応させられる新規な方法がさらに提供される。
【００３０】
１つの実施形態において、第２官能基は求核基であり、好ましくはヒドラジンである。これは、ポリシアル酸が、カルボニル基が求核基によって攻撃される末端ユニットにおいてアルデヒド基を含む場合に、特に有用である。
【００３１】
本方法の他の実施形態において、第２官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステまたはスルホスクシンイミドエステル、もしくはカルボジイミドのような、Ｎ−アルコキシルカルボニルイミドのような、求電子性である。そのような場合の末端基は、好ましくはアミンのような求核基である。
【００３２】
該方法において、試薬は、第一及び第二の官能基に結合する二官能性有機基を含むのが好ましい。好ましくは、該二官能性有機基は、Ｃ２−１８アルカンジイル基、アリーレン基、オリゴペプチド及びオリゴ(アルコキシ)アルキル基から選択される。
【００３３】
好適な試薬の例は前記に挙げられる。
【００３４】
最も有益には、該方法は、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有し、それによって該官能基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリシアル化されたポリペプチドまたはタンパク質を形成するポリペプチドまたはタンパク質と、官能性ポリシアル酸が反応させられる、その後に続くステップを含む。該方法は、タンパク質が単一のＣｙｓユニットを含み、それによって部位−制御された誘導体化を得る場合に特に好適である。
【００３５】
本発明は、添付の実施例において例証される。
【実施例１】
【００３６】
【化２】
【００３７】
１．１ 合成
別個の3つの調製が以下のように行なわれた。
【００３８】
ＷＯ−Ａ−９２２２３３１に基づいて製造されたコロミン酸アルデヒド（ＣＡＯ）（１００ｍｇ、４．４×１０−６ｍｏｌ）を、５００μｌの０．１M酢酸ナトリウムに溶解し、これに５ｍｏｌａｒ当量のＮ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（６．５ｍｇ、２．２×１０−５ｍｏｌ）を添加した。その後、この混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で２時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。その後、該ポリマーを、２容量（１．０ｍｌ）のエタノールを添加することにより沈殿させた。該沈殿を、ベンチトップ遠心機(bench top microcentrifuge)で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ ２分間）することにより収集した。上清を廃棄し、ペレットを５００μｍｌの０．１Ｍアセタートに溶解した。この方法をさらに２回繰り返し、最終的なペレットを脱イオン水に溶解し、終夜凍結乾燥した。
【００３９】
１．２ マレイミド含有量の分析
この分析において、システインは、芳香環に隣接していないチオールと置換された場合に濃い黄色を形成するジスルフィドを含むエルマン試薬(Ellman’s Reagent)（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））でさらなる反応を妨げて、ポリマー上のマレイミドと反応される。従って、マレイミド含有量は、システインとエルマン試薬アッセイ間の反応の阻害を測定することにより、計算することができる。
【００４０】
まず、１２×１０−３Ｍ（０．１４５ｍｇ／ｍｌ）のシステインの初期ストック(initial stock)を、ＰＢＳ中で調製した。クリーンなマイクロタイタープレート中で、体積１００μｌの、１２×１０−３Ｍ〜０．３７５×１０−３Ｍの２倍希釈液を、列Ｂから列Ｈまで作った。列Ａにおいて、１００μｌＰＢＳをゼロ標準として用いた。ＣＡ及びＣＡ−マレイミド（ＣＡＭ）の試料を、５または１０ｍｇ／ｍｌで調製し、各試料１００μｌを、システイン希釈液の二重カラムに添加した。いずれのＣＡも含まない１セットの１００μｌＰＢＳを、コントロールとして加えた。プレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートした。その後、２０μｌのエルマン試薬（ＰＢＳ中に４ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１５時間、暗所でインキュベートした。吸光度を、ウェル中で、４０５ｎｍで測定した。その後、試料について標準曲線をプロットし、シグナルの阻害から、存在するマレイミドの量を計算した。
【００４１】
１．４ ＦＡｂのチオール化及びＣＡＭへの結合
第一のステップにおいて、チオール基は、リシンのアミンのチオール化によってモデルタンパク質へ導入される。
【００４２】
羊ＦＡｂ（抗デシプラミン／ノリチルプタリン(Norityrptaline)、４ｍｇ、７．２×１０−８ｍｏｌ）を０．２５ｍｌのＰＢＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡに溶解し、これに０．４９８ｍｇの２−イミノチオラン（２−ＩＴ、トラウトの試薬(Traut’s reagent)５０ｍｏｌ当量 ３．６×１０−６ｍｏｌ）を含有する同じ緩衝液０．２５ｍｌを添加した。該試験管をフォイルで包み、端から端まで攪拌しながら、３７℃で１時間インキュベートした。
【００４３】
【化３】
【００４４】
チオール化されたＦａｂを、ゲル濾過（ＰＤ−１０）により、フリーの２−ＩＴトラウト試薬(Traut’s reagent)から精製し、０．５ｍｌの画分を、タンパク質（ＢＣＡアッセイ）またはチオール（エルマンアッセイ）の存在についてアッセイした。両者を含む最初の溶出ピークをプールし、タンパク質及びチオールを定量した。
【００４５】
１．５ Ｆａｂ−チオールのＣＡＭへの結合
２ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ中のチオール化されたＦＡｂ（３．６ｍｇ、６．６×１０−８ｍｏｌ）に、２２．５ｍｇのＣＡＭを添加した（９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、穏やかに混合しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた複合体を、フリーのＣＡＭを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。複合体におけるＣＡ及びタンパク質両者の含有量をアッセイし、結合比を計算した。
【００４６】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。
【００４７】
様々なチオール化の程度を有しているが、１５：１のＣＡＭ：Ｆａｂの比が維持されている、ＣＡＭ−Ｆａｂのいくつかのバッチを調製した。結果を第１表に示す：
【００４８】
【表１】
【００４９】
図１は、３回反復試料及び関連するコントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００５０】
１．６ 結論
結果は、すべてのコントロールウェル（チオール化されたＦＡｂの試料）において、試料の移動が、新鮮なＦＡｂ（５０のｋＤａマーカーのそれより下の）のそれに似ていることを示し、結合のプロセスの間にＦＡｂ分子の架橋が起こらないことを示す。反復試料のレーンには、ポリシアリル化された生成物を示す質量の増大を典型的に示す、９８及び２５０ＫＤａのマーカー間に最大強度を有する、顕著なバンドの広がりが存在する。
【００５１】
１．７ ＣＡＭのベータガラクトシダーゼへの結合
１ｍｌＰＢＳ中のＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）（５．０ｍｇ、４．３×１０−８ｍｏｌ）に、１５ｍｇのＣＡＭを添加した（６．５９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、フォイルで包み、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。得られた複合体を、ＳＤＳ ｐａｇｅにより分析し、その後、フリーのＣＡＭを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。試料を、他に概説されるようにして、ポリマー及びタンパク質の含有量についてアッセイした。
【００５２】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。
【００５３】
１．８ 酵素活性アッセイ
ＰＢＳ中で、６０μｇ／ｍｌ〜３．７５μｇ／ｍｌの新鮮なβ−ガラクトシダーゼの標準液(standards)を調製した。ＣＡＭ−β−ｇａｌの試料を、同バッファー中で６０μｇ／ｍｌに希釈した。複合体の酵素活性を、以下のようにして測定した：
マイクロタイタープレート中で、１００μｌの試料または標準液に、１００μｌのオールインワンβ−ｇａｌ基質(All-in-One β-gal substrate)（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。該プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準液からキャリブレーションカーブを作成し、試料の活性を、該カーブの線形回帰についての方程式から計算した。
【００５４】
１．９ 結果
タンパク質及びポリマーのアッセイから、結合比は１．２３ ＣＡＭ：１ β−ｇａｌであると測定された。また、試料のＳＤＳ ｐａｇｅから、対応する見かけの分子量の増大もあった（図２）。精製された試料における酵素活性は、フリーの酵素と比較して、１００．４％と計算された。
【実施例２】
【００５５】
合成経路２
ステップ１ ＣＡ−アルデヒド（ＣＨＯ）のアミノ化
【００５６】
【化４】
【００５７】
ステップ２ マレイミド環の導入
【００５８】
【化５】
【００５９】
合成
２．１． ステップ１ 酸化されたＣＡのアミノ化
５０ｍｌ試験管中で、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの酸化されたコロミン酸（ＣＡＯ）を、３００倍モル過剰(300-fold molar excess)のＮＨ４Ｃｌとともに、２ｍｌの脱イオン水に溶解し、その後、ＮａＣＮＢＨ３（１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中、５Ｍストック）を最終濃度５ｍｇ／ｍｌで添加した。該混合物を室温で５日間インキュベートした。コントロール反応も、ＣＡＯの代わりにコロミン酸（Ａ）を用いて準備された。生成したコロミン酸アミン誘導体を、５ｍｌの氷冷エタノールを添加することにより沈殿させた。該沈殿を、室温で３０分間、４０００ｒｐｍで卓上遠心機中で遠心分離することにより回収した。該ペレットを、２ｍｌの脱イオン水中に保持及び再懸濁し、その後、１０ｍｌの超遠心管中で５ｍｌの氷冷エタノールを用いて再び沈殿させた。該沈殿を、室温で３０分間、３００００ｒｐｍで遠心分離することにより、収集した。該ペレットを２ｍｌの脱イオン水に再び再懸濁し、凍結乾燥した。
【００６０】
２．２．アミン含量についてのアッセイ
ＴＮＢＳ（ピクリルスルホン酸または２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを、該生成物中に存在するアミノ基の量を測定するために用いた。
【００６１】
マイクロタイタープレートのウェル中で、９０μｌの０．１Ｍホウ酸塩バッファー（ｐＨ９．５）に、ＴＮＢＳ（０．５μｌの１５ｍＭ ＴＮＢＳ）を添加した。これに、１０μｌのＣＡ−アミドの５０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する前に、該プレートを室温で２０分間放置した。グリシンを、０．１〜１ｍＭの濃度範囲で、標準液として用いた。ＴＮＢＳは第１級アミン基をトリニトロフェニル化する。アミンのＴＮＰ付加物が検出される。
【００６２】
２回の冷エタノール沈殿を用いて精製された生成物の、ＴＮＢＳアッセイを用いたテストは、９０％近くの転化を示した。
【００６３】
２．３．ＣＡ−アミンのマレイミド化
ＣＡ−アミン（１７ｍｇ）を１ｍｌの脱イオン水に溶解し、これに６ｍｇのメトキシカルボニルマレイミド（ＭＣＭ）を添加した。該混合物を室温で３０分間放置して反応させた。該試料に、１ １００μｌの水及び２００μｌのアセトニトリルを添加し、その後、室温で４時間インキュベートした後、３００μｌのＣＨＣｌ３を添加し、該試験管を振り混ぜ、水性画分を収集した。その後、該画分をＰＤ−１０カラムで精製し、低分子を除去した。該溶出液を凍結乾燥し、マレイミド含有量についてアッセイした。マレイミドのモル濃度は４４モル％であった。
【実施例３】
【００６４】
コロミン酸のヨードアセタート誘導体（ＣＡＩ）の調製。
【００６５】
【化６】
【００６６】
３．１ 合成
１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４０ｍｇのコロミン酸アミン（８５モル％アミン）（実施例２．１に記載される）に、５ｍｇのＮ−スクシンイミジルヨードアセタート（ＳＩＡ）を添加した。該混合物を３７℃で１時間放置して反応させた後、過剰のＳＩＡを、５ｍｌのＨｉｇｈｔｒａｐ（登録商標）脱塩カラム（ＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＰＢＳを用いて溶出するゲル濾過により除去した。０．５ｍｌの画分をカラムから収集し、各画分からの試料をコロミン酸含有量（レゾルシノールアッセイ）及びヨウ化物を示すシステインとの反応性（エルマンアッセイ）についてテストした。ヨウ化物及びＣＡ両者について陽性の画分をプールした。
【００６７】
３．２ ＣＡＩのβ−ガラクトシダーゼへの結合
１ｍｌＰＢＳ中のＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（５．０ｍｇ、４．３×１０−８ｍｏｌ）に、１５ｍｇのＣＡＩを添加した（６．５９×１０−７ｍｏｌ、１５ｍｏｌａｒ当量）。該試験管に封をし、フォイルで包み、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。得られた複合体を、ＳＤＳ ｐａｇｅにより分析し、その後、フリーのＣＡＩを除去するための、一般に認められているプロトコルに従って精製した。試料を、他に概説されるようにして、ポリマー及びタンパク質の含有量について分析した。
【００６８】
コントロール反応は、ネガティブコントロールとしてのＣＡを用いて行われた。上述の実施例１．８のようにして、全ての試料を、β−ｇａｌ活性について分析した。
【００６９】
３．３ 結論
画分３〜６は、ポリマー及びヨードアセタート両者について陽性であり、プールされた。ＳＤＳ ｐａｇｅ（４〜１２％ ビス／トリスゲル；図２）は、コントロールポリマーと共にではなく、ヨードアセトアミド誘導体と共にインキュベートされた試料について、見かけの分子量の増加を示した。タンパク質及びポリマーのアッセイから、結合比は１．６３ ＣＡＩ：１ β−ｇａｌであると測定された。β−ｇａｌ活性は、フリーの酵素と比較して、結合した試料について１００．９％であると計算された。
【実施例４】
【００７０】
４．１ 合成：４（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＣＡ−ＭＢＰＨ）及び３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＣＡ−ＰＤＰＨ）を用いた非還元性末端の活性化
調製は、以下のように行われた：
ＷＯ−Ａ−９２２２３３１に従って製造されたコロミン酸アルデヒド（ＣＡＯ；２２．７ｋＤａ、Ｃａｍｉｄａ、Ｉｒｅｌａｎｄ）（ＭＢＰＨ用に７３ｍｇ、試験管Ａ；ＰＤＰＨ用に９９．３ｍｇ、試験管Ｂ）を、８００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）にそれぞれ溶解した。試験管Ａに、２００μｌのＤＭＳＯに溶解した１５ｍｇのＭＢＰＨ（１５：１ リンカー：ＣＡ比）を添加した。試験管Ｂに、２００μｌのＤＭＳＯに溶解した１５ｍｇのＰＤＰＨ（１５：１ リンカー：ＣＡ比）を添加した。各反応管の各場合について、ｐＨを５．５に調整した。その後、これらの混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で２時間、オービタルミキサー上でインキュベートした。各ポリマー溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出してゲル濾過（ＰＤ １０カラム）することにより精製し、ＣＡ（レゾルシノールアッセイによる）を含む画分１ｍｌを収集した。これらの試料を終夜凍結乾燥し、実施例１．２に記載されているようにして、マレイミド含有量についてアッセイした。
【００７１】
４．２ 合成：４（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＢＰＨ−ＣＡ）、（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ−ＣＡ）及びＮ−β−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド）ヒドラジド（ＢＭＰＨ−ＣＡ）を用いた還元性末端の活性化
調製は、全てリンカーのＣＡに対するモル比が２５：１で、以下のように行われた：
コロミン酸（ＣＡ；２２．７Ｋ；ＭＢＰＨ用に７３ｍｇ、試験管Ａ；ＰＤＰＨ用に９９．３ｍｇ、試験管ＢそしてＢＭＰＨ用に７６．６ｍｇ；試験管Ｃ）を、８００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）にそれぞれ溶解した。試験管Ａに、２５ｍｇのＭＢＰＨ（２００μｌのＤＭＳＯに溶解した）を、試験管Ｂに、２５ｍｇのＰＤＰＨ（２００μｌのＤＭＳＯに溶解した）を、そして、バイアルＣに、２５ｍｇのＢＭＰＨ（２００μｌの酢酸ナトリウムバッファーに溶解した）を添加した。反応混合物のｐＨを５．５に調整した。その後、これらの混合物をボルテックス混合し、フォイルで包み、３７℃で７２時間、オービタルミキサー上でインキュベートした。各ポリマー溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出するゲル濾過（ＰＤ１０カラム）により精製し、ＣＡ（レゾルシナルアッセイによる）を含む画分１ｍｌを収集した。これらの試料を終夜凍結乾燥し、実施例１．２に記載されているようにして、マレイミド含有量についてアッセイした。
【００７２】
４．３ 結果
非還元性末端（高反応性）におけるマレイミドのモル濃度は、ＭＢＰＨ及びＰＤＰＨそれぞれについて４９．０及び３５．０モル％であった。還元性末端（弱反応性）におけるマレイミドのモル濃度は、ＭＢＰＨ、ＰＤＰＨ及びＢＭＰＨそれぞれについて４１．５、３２．５及び４８．３モル％であった。還元性末端における値は、各場合における２つの値の平均値である。
【００７３】
４．４ β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）のマレイミド活性化コロミン酸（還元性末端及び非還元性末端）への結合
セパレートチューブ中のβ−ｇａｌ（１．０ｍｇ；１ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ中）に、１５モル過剰の各マレイミド活性化ＣＡ（非還元性末端または還元性末端におけるＭＢＰＨ、ＰＤＰＨ及びＢＭＰＨ、前記実施例から得られる）を別々に添加した。各チューブに封をし、穏やかに混合しながら、３７℃で１時間インキュベートした。その後、得られた複合体を、フリーの活性化ポリマーを除去するための、認められているプロトコルに従って精製した。全ての試料を、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、そして、実施例１．８のようにして、β−ｇａｌ活性について分析した。
【００７４】
４．５ 結果
結果（図３）は、全ての対照ウェル（β−ｇａｌを有する）において、試料の移動は、新鮮なβ−ｇａｌについてのそれと似ていることを示す。複合体のレーンには、ポリシアリル化されたβ−ｇａｌを示す量の増大を典型的に示す、９８ｋＤａマーカーと２５０ｋＤａマーカーとの間に最大強度を有する顕著なバンドの広がりが存在する。β−ｇａｌ活性は、結合された試料について、９１．０〜１０６％と計算された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、３回反復試料及び関連するコントロールのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】試料のＳＤＳ ｐａｇｅから、対応する見かけの分子量の増大もあった
【図３】全ての対照ウェル（β−ｇａｌを有する）において、試料の移動は、新鮮なβ−ｇａｌについてのそれと似ていることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペンダント部分(pendant moiety)が、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基、オルトピリジルジスルフィド基から選択される官能基を含むシアル酸ユニット由来の末端ユニットの少なくとも１つに結合する、ポリサッカライド酸を含む化合物。
【請求項２】
ペンダント部分がポリサッカライドの還元性末端ユニットに結合している請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該部分がポリサッカライドの非還元性末端ユニットに結合している請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
該部分が、アルカンジイル基及び／またはアリーレン基、並びに、オキサアルキレン(oxalkylene)またはオリゴアキサアルキレン(oligoaxa-alkylene)基と任意に組み合わされる結合を含み、該結合が、第２級アミン結合、ヒドラゾン、アルキルヒドラジド結合またはペプチド結合である、上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項５】
官能基がＮ−マレイミドである上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項６】
ポリサッカライドがポリシアル酸であり、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる上記いずれかの請求項に記載の化合物
【請求項７】
式
【化１】
ここで、下記の定義の群の１つを適用する：
ｉ）Ｒ１がＨまたは−ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、そして、Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨＲ４Ｒ５または−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨＲ４Ｒ５のいずれかであり、ここで、Ｒ４とＲ５が一緒になって＝Ｎ−ＮＲ６を表す、あるいは、Ｒ４がＨであり、Ｒ５が−ＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６は上記官能基を含む有機基またはＨであり、そして、Ｒ７はＨである、または、Ｒ６とＲ７は一緒になって１，３−ブト−２−エンジオイル基であり；
ｉｉ）Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｎ−ＮＲ６を表す、または、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は−ＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６は上記官能基を含む有機基またはＨであり、そして、Ｒ７はＨである、または、Ｒ６とＲ７は一緒になって１，３−ブト−２−エンジオイル基であり；
Ｇｌｙ−Ｏはグリコシル（サッカライド）基であり；
ｎは０以上であり；そして、
Ａｃはアセチルである、
を有する化合物。
【請求項８】
各Ｇｌｙがシアル酸ユニットである請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
少なくとも１つのフリーのシステインユニットを有し、チオエステル結合を介してシステインユニットの側鎖に結合し、ポリシアル酸の１つまたは各末端ユニットにおいて結合する部分を介してポリシアル酸を有するタンパク質を含む化合物。
【請求項１０】
ポリサッカライドが、少なくとも２、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも５０のサッカライドユニットを有し、好ましくは互いに２，８及び／または２，９結合したシアル酸ユニットを有する、上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項１１】
シアル酸ユニットに由来する少なくとも１つの末端ユニットを含むポリサッカライドが、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基、オルトピリジルジスルフィド基から選択される第一官能基及び第一基と異なる第二官能基を有するヘテロ二官能性試薬と反応し、それにより、該第二官能基が末端シアル酸誘導体ユニットと反応して共有結合を形成し、チオール基への選択的な結合に好適な官能性ポリサッカライドを形成する、方法。
【請求項１２】
前記第二の官能基が、求核基、好ましくはヒドラジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリサッカライドの末端ユニットが、前記求核基と反応するカルボニル基を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二官能基が、求電子基、好ましくはＮ−アルコキシカルボニルイミドまたはカルボジイミド部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリサッカライドの末端ユニットが、前記求電子基と反応し、好ましくはペプチドまたはウレタン結合を形成するアミン基を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試薬が、第一官能基及び第二官能基に結合する二官能性有機基を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
二官能性有機基が、Ｃ２−１８アルカンジイル基、アリーレン基、オリゴペプチド及びオリゴ（アルコキシ）アルキル基から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第一官能基が、Ｎ−マレイミド基である、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
試薬が、一般式
Ｘ−Ｒ−Ｙ
を有し、ここで、
Ｘは、Ｎ−マレイミド、Ｎ−ヨードアセトアミド、Ｓ−ビニルスルホニルまたはＳ−オルトピリジルジスルフィド基であり、
Ｒは、アルカンジイル、アリーレンまたはアラルキレンアルカリーレン(aralkylene alkarylene)、アルキレンオキサアルキレン、あるいはアルキレンオリゴオキサアルキレンまたはアルキルオリゴペプチジルアルキル基であり、
そして、
Ｙはヒドラジド、アミンまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ポリサッカライド酸が、少なくとも２、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも５０の、好ましくは互いに２→８及び２→９結合しているシアル酸ユニットを有する、請求項１１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
マレイミド官能性ポリシアル酸が、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質と反応し、それによって、マレイミド基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリシアル化されたポリペプチドまたはタンパク質を形成する、請求項１１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物が、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質と反応し、それによって、前記官能基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリペプチドまたはタンパク質とポリサッカライドとの複合体を形成する方法。
【請求項１】
ペンダント部分(pendant moiety)が、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基、オルトピリジルジスルフィド基から選択される官能基を含むシアル酸ユニット由来の末端ユニットの少なくとも１つに結合する、ポリサッカライド酸を含む化合物。
【請求項２】
ペンダント部分がポリサッカライドの還元性末端ユニットに結合している請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
該部分がポリサッカライドの非還元性末端ユニットに結合している請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
該部分が、アルカンジイル基及び／またはアリーレン基、並びに、オキサアルキレン(oxalkylene)またはオリゴアキサアルキレン(oligoaxa-alkylene)基と任意に組み合わされる結合を含み、該結合が、第２級アミン結合、ヒドラゾン、アルキルヒドラジド結合またはペプチド結合である、上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項５】
官能基がＮ−マレイミドである上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項６】
ポリサッカライドがポリシアル酸であり、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる上記いずれかの請求項に記載の化合物
【請求項７】
式
【化１】
ここで、下記の定義の群の１つを適用する：
ｉ）Ｒ１がＨまたは−ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、そして、Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨＲ４Ｒ５または−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨＲ４Ｒ５のいずれかであり、ここで、Ｒ４とＲ５が一緒になって＝Ｎ−ＮＲ６を表す、あるいは、Ｒ４がＨであり、Ｒ５が−ＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６は上記官能基を含む有機基またはＨであり、そして、Ｒ７はＨである、または、Ｒ６とＲ７は一緒になって１，３−ブト−２−エンジオイル基であり；
ｉｉ）Ｒ１とＲ２は一緒になって＝Ｎ−ＮＲ６を表す、または、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は−ＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６は上記官能基を含む有機基またはＨであり、そして、Ｒ７はＨである、または、Ｒ６とＲ７は一緒になって１，３−ブト−２−エンジオイル基であり；
Ｇｌｙ−Ｏはグリコシル（サッカライド）基であり；
ｎは０以上であり；そして、
Ａｃはアセチルである、
を有する化合物。
【請求項８】
各Ｇｌｙがシアル酸ユニットである請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
少なくとも１つのフリーのシステインユニットを有し、チオエステル結合を介してシステインユニットの側鎖に結合し、ポリシアル酸の１つまたは各末端ユニットにおいて結合する部分を介してポリシアル酸を有するタンパク質を含む化合物。
【請求項１０】
ポリサッカライドが、少なくとも２、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも５０のサッカライドユニットを有し、好ましくは互いに２，８及び／または２，９結合したシアル酸ユニットを有する、上記いずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項１１】
シアル酸ユニットに由来する少なくとも１つの末端ユニットを含むポリサッカライドが、Ｎ−マレイミド基、ビニルスルホン基、Ｎ−ヨードアセトアミド基、オルトピリジルジスルフィド基から選択される第一官能基及び第一基と異なる第二官能基を有するヘテロ二官能性試薬と反応し、それにより、該第二官能基が末端シアル酸誘導体ユニットと反応して共有結合を形成し、チオール基への選択的な結合に好適な官能性ポリサッカライドを形成する、方法。
【請求項１２】
前記第二の官能基が、求核基、好ましくはヒドラジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリサッカライドの末端ユニットが、前記求核基と反応するカルボニル基を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二官能基が、求電子基、好ましくはＮ−アルコキシカルボニルイミドまたはカルボジイミド部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリサッカライドの末端ユニットが、前記求電子基と反応し、好ましくはペプチドまたはウレタン結合を形成するアミン基を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試薬が、第一官能基及び第二官能基に結合する二官能性有機基を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
二官能性有機基が、Ｃ２−１８アルカンジイル基、アリーレン基、オリゴペプチド及びオリゴ（アルコキシ）アルキル基から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第一官能基が、Ｎ−マレイミド基である、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
試薬が、一般式
Ｘ−Ｒ−Ｙ
を有し、ここで、
Ｘは、Ｎ−マレイミド、Ｎ−ヨードアセトアミド、Ｓ−ビニルスルホニルまたはＳ−オルトピリジルジスルフィド基であり、
Ｒは、アルカンジイル、アリーレンまたはアラルキレンアルカリーレン(aralkylene alkarylene)、アルキレンオキサアルキレン、あるいはアルキレンオリゴオキサアルキレンまたはアルキルオリゴペプチジルアルキル基であり、
そして、
Ｙはヒドラジド、アミンまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ポリサッカライド酸が、少なくとも２、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも５０の、好ましくは互いに２→８及び２→９結合しているシアル酸ユニットを有する、請求項１１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
マレイミド官能性ポリシアル酸が、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質と反応し、それによって、マレイミド基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリシアル化されたポリペプチドまたはタンパク質を形成する、請求項１１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物が、少なくとも１つのフリーで保護されていないＣｙｓユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質と反応し、それによって、前記官能基がＣｙｓユニットのチオール基とチオエーテル結合を形成し、ポリペプチドまたはタンパク質とポリサッカライドとの複合体を形成する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５０１８８８（Ｐ２００７−５０１８８８Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３０５４（Ｐ２００６−５２３０５４）
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３４８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６９７３
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６０４５６９１）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３４８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６９７３
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６０４５６９１）リポクセン テクノロジーズ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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