ポリメラーゼ安定化
【課題】洗剤は、得られた精製済み種から完全に除去するのが難しいことがありうる。更に、ＤＮＡ配列決定反応などの酵素反応において、洗剤の存在は、結果に影響することがありうる。更に、いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、洗剤の不存在下において、時間経過中に活性を実質的に減少させることがありうる。
【解決手段】本発明は、外因性洗剤を含まない精製済み熱安定性酵素、具体的には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを与えるための方法および組成物に関する。本発明は、更に、一つまたはそれを超える洗剤を加えることによって活性形で検定するこのような精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを与える方法を提供する。本発明は、更に、核酸の増幅および配列決定を含めたいろいろな用途に用いるための精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキットを提供する。
【解決手段】本発明は、外因性洗剤を含まない精製済み熱安定性酵素、具体的には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを与えるための方法および組成物に関する。本発明は、更に、一つまたはそれを超える洗剤を加えることによって活性形で検定するこのような精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを与える方法を提供する。本発明は、更に、核酸の増幅および配列決定を含めたいろいろな用途に用いるための精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキット、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを単離するおよび使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸からの鋳型に支配されたＤＮＡ合成を触媒する酵素である。典型的に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、微生物中のＤＮＡポリメラーゼＩ、IIおよびIII；動物細胞中のＤＮＡポリメラーゼα、βまたはγ）は、ＤＮＡ鋳型からのＤＮＡ鎖の合成を支配するが；しかしながら、いくつかのＤＮＡポリメラーゼ（概して、「逆転写酵素」と称される）は、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ鎖の合成を支配する。概して、これらは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Joint Commission on Biochemical Nomenclature（www.chem.qmul.ac.ulliupac/jcbn/）によって、Enzyme Commission 番号ＥＣ２．７．７．７およびＥＣ２．７．７．４９として認められている。広範囲の探求は、特に、in vitro 反応に用いるための、細菌、酵母およびヒトを含めたいろいろな生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離および特性決定について行われてきた。
【０００３】
特定の in vitro 反応に用いるためのＤＮＡポリメラーゼを選択する場合、当業者は、多数の変数を考慮すべきである。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、その天然の５’−３’または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を（例えば、突然変異誘発によってまたは酵素的消化などの翻訳後修飾によって）欠失しているように、低い誤差率を示すように、高い連続伸長性（processivity）率および伸長率を示すように、および／または好都合な熱安定性を示すように選択されてよい。好熱性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの識別、およびＰＣＲなどの方法における熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＤＮＡを特定し且つ操作する能力の変革をもたらした。多数の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性真正細菌、好熱性アーキアおよびその他から単離された。
【０００４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例には、サームス・エクアティカス（Thermus aquaticus）に由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第４，８８９，８１８号を参照されたい）；サームス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）に由来するＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５，１９２，６７４号；第５，２４２，８１８号；第５，４１３，９２６号を参照されたい）；現在、サームス・オシマイ（Thermus oshimai）と称される Thermus 種ｓｐｓｌ７に由来するＴｓｐ ｓｐｓ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５，４０５，７７４号を参照されたい）；ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）に由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，９４８，６６３号）；バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）に由来するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７４７，２９８号）；サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）に由来するＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３２２，７８５号）；ピロコッカス種（Pyrococcus sp.）ＫＯＤ１に由来するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，０３３，８５９号）；サーモコッカス・バロシイ（Thermococcus barosii）に由来するｎＴｂａおよびＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，６０２，０１１号および第５，８８２，９０４号）；および Thermo SequenaseＴＭ（Amersham）および AmpliTaqＴＭ（Applied Biosystems, Tabor, S. & Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6339-6343）などの商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０００５】
洗剤は、当該技術分野において、膜を可溶化するために、いろいろな化学薬剤の透過性化作用を増強するために、および細菌細胞壁の破壊のために用いられて、ＤＮＡポリメラーゼなどの細胞内タンパク質の微生物からの製造を容易にしてきた。Goldstein et al. は、核酸を実質的に含まない熱安定性酵素を製造する方法を開示している（米国特許第５，８６１，２９５号）。Gelfand et al. は、一つまたはそれを超える非イオン系ポリマー洗剤を含有する緩衝液中の精製済みの安定な熱安定性ポリメラーゼを含む安定な酵素組成物を開示している（米国特許第６，１２７，１５５号）。Simpson et al., Biochem. Cell Biol. 68:1292-6(1990) は、Triton Ｘ−１００などの添加剤によって安定にされているＤＮＡポリメラーゼの精製を開示している。
【０００６】
洗剤は、得られた精製済み種から完全に除去するのが難しいことがありうる。更に、ＤＮＡ配列決定反応などの酵素反応において、洗剤の存在は、結果に影響することがありうる。例えば、Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem. 70:1516-1527,1988 を参照されたい。更に、いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、洗剤の不存在下において、時間経過中に活性を実質的に減少させることがありうる。例えば、非イオン系ポリマー洗剤中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを開示している米国特許第６，１２７，１５５号を参照されたい。Tween ２０は、開示されている一つの具体的な洗剤である。
【０００７】
米国特許第６，２４２，２３５号は、ＤＮＡポリメラーゼ安定化のためのポリエトキシレートアミンを基剤とする陽イオン性界面活性剤の添加を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，８８９，８１８号
【特許文献２】米国特許第５，１９２，６７４号
【特許文献３】米国特許第５，２４２，８１８号
【特許文献４】米国特許第５，４１３，９２６号
【特許文献５】米国特許第５，４０５，７７４号
【特許文献６】米国特許第５，９４８，６６３号
【特許文献７】米国特許第５，７４７，２９８号
【特許文献８】米国特許第５，３２２，７８５号
【特許文献９】米国特許第６，０３３，８５９号
【特許文献１０】米国特許第５，６０２，０１１号
【特許文献１１】米国特許第５，８８２，９０４号
【特許文献１２】Goldstein et al. 米国特許第５，８６１，２９５号
【特許文献１３】Gelfand et al. 米国特許第６，１２７，１５５号
【特許文献１４】米国特許第６，２４２，２３５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tabor, S. & Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6339-6343
【非特許文献２】Simpson et al., Biochem. Cell Biol. 68:1292-6(1990)
【非特許文献３】Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem. 70:1516-1527,1988
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが精製され且つ用いられる環境の制御を可能にする組成物および方法に関する。本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、陰イオン系洗剤の添加を提供する。具体的には、その洗剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホスフェート、例えば、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
この洗剤は、Rhodafac ＲＥ−９６０という商品名またはポリオキシエチレンアルキルエーテルホスフェート、例えば、ポリオキシエチレントリデシルエーテルホスフェートとして販売されている。
【００１３】
【化２】
【００１４】
この洗剤は、Rhodafac ＲＳ−９６０という商品名として販売されている。
このカテゴリーにある他の類似の陰イオン系洗剤は、次のような更に一般的な構造で記載することができる。
【００１５】
−アルキルエトキシル化リン酸エステル（Ｉ）。式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２２の直鎖状、分岐状、環状または多環式炭化水素を含むアルキル基である。その基Ｒは、更に、一つまたはそれを超える不飽和二重結合がその構造内にあるアルケニル基でありうる。Ｎは、３〜１００でありうる。
【００１６】
−アルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（II）。式中、基Ｒは、Ｃ８〜Ｃ１２の直鎖状または分岐状アルキル基である。Ｎは、３〜１００でありうる。
−ジアルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（III）。式中、基ＲおよびＲ’は、それぞれ、Ｃ８〜Ｃ１２基である。Ｎは、３〜１００である。
【００１７】
−トリアルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（IV）。式中、基Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ、Ｃ８〜Ｃ１２アルキル基である。Ｎは、３〜１００である。構造Ｖは、IVの群の特殊な場合である。
【００１８】
【化３】
【００１９】
基Ｒは、アルキル、アリールアルキル、多環式トリスチリルフェノールでありうるが、これに制限されるわけではない。Ｍは、水素；アンモニウム；ナトリウム、リチウムおよびカリウムなどの金属イオンでありうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、洗剤の不存在下および存在下における１ｋｂのλＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を示す。レーン１および７：洗剤不含で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の不存在下におけるＰＣＲ；レーン２および８：洗剤不含で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の存在下におけるＰＣＲ；レーン３および９：洗剤で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の不存在下におけるＰＣＲ；レーン４および１０：洗剤で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の存在下におけるＰＣＲ。
【図２】図２は、陰イオン系ホスフェート洗剤のスクリーニング：０．１％または０．０１％の試験洗剤を用いた１ｋｂのＤＮＡの増幅を示す。上区画：ＰＣＲ産物のゲル様画像。レーン１：正対照（０．０５％ Tween ２０）；レーン２：０．０５％ Rhodafac ＲＥ６１０；レーン３〜８：０．０１％の Rhodafac ＲＥ４１０、Rhodafac ＲＥ９６０、Rhodafac ＲＳ９６０、Rhodafac ＲＳ４１０、Rhodafac ＲＳ７１０および Rhodafac ＲＳ６１０；レーン９〜１２：０．１％の Rhodafac ＲＥ７１０、Rhodafac ＲＥ９６０、Rhodafac ＲＳ９６０および Rhodafac ＲＳ７１０。下区画：各々の試験洗剤でのＰＣＲ収率の棒グラフ。
【図３】図３は、９５℃で１５分間加熱後の１ＸＰＣＲ緩衝液中の残存活性の結果を示す。洗剤％は、ＰＣＲ反応における洗剤の最終量を示す。黒菱形について、各々の洗剤は、指示量で存在する。黒菱形：ＮＰ４０および Tween ２０。黒四角：Rhodafac ＲＥ−９６０。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＩは、Thermus、Pyrococcus、Thermococcus、アクイフェックス（Aquifex）、スルホロブス（Sulfolobus）、サーモプラズマ（Thermoplasma）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、ロドサーマス（Rhodothermus）、メタノコッカス（Methanococcus）およびサーモトガ（Thermotoga）から成る群より選択される属の微生物から得られるまたはに由来する。
【００２２】
本発明の熱安定性酵素は、いずれの源からも得ることができ、しかも天然または組換えタンパク質でありうる。したがって、この段落中に用いられる「に由来する」という句は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、組換え発現されるということを示すものであり、そして発現されたＤＮＡ配列は、好熱性生物またはその突然変異形から得られる野生型配列である。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ源（配列および／またはタンパク質）を与える適する生物の例には、サームス・フラブス（Thermus flavus）、サームス・ルバー（Thermus ruber）、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermophilus、サーモス・エクアティカス（Thermos aquaticus）、サームス・ラクテウス（Thermus lacteus）、メイオサーマス・クバー（Meiothermus cuber）、Thermus oshimai、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrophicum）およびデスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）が含まれる。
【００２３】
好ましいＤＮＡポリメラーゼには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ；ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；ｎＴｂａおよび／またはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに制限されるわけではない。一定の態様において、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ Ａ２７１ Ｆ６６７Ｙ、Ｔｔｈ Ａ２７３ Ｆ６６８ＹおよびＴａｑ Ａ２７１ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｗなど、野生型配列と比較して一つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失、置換または付加によって修飾された。
【００２４】
適する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＪＳＥＲ（ＷＯ２００３／００４６３２号）または Thermococcus barosii（米国特許第５，６０２，０１１号およびＵＳ５，８８２，９０４号）として特性決定された生物に由来することができる。
【００２５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、天然に酵素を発現する細胞かまたは酵素を発現するように遺伝子操作された細胞（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの外因性ＤＮＡポリメラーゼを発現するＥ．cold）から精製される。
【００２６】
いろいろな好ましい態様において、本発明の精製方法は、一つまたはそれを超える次の工程：（ｉ）細胞溶解産物を加熱して、一つまたはそれを超えるタンパク質を変性させること；（ii）細胞溶解産物を遠心分離して、上澄みの全部または一部分を取り出して、透明な溶解産物を与えること；および（iii）透明な溶解産物を、クロマトグラフィー媒質、最も好ましくは、ブチル官能基を含むクロマトグラフィー媒質を用いて分別することを含む。
【００２７】
「熱安定性」という用語は、５０℃を超える温度で活性を保持する酵素を意味する；したがって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖の合成を支配する能力をこの高温で保持する。酵素は、二つ以上の酵素活性を有することがありうる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼも、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性を含むことがありうる。このような酵素は、一つの活性に関して熱安定性能（thermos/ability）を示すことがありうるが、もう一方には示さないことがありうる。好ましくは、熱安定性酵素は、約５０℃〜８０℃、より好ましくは、約５５℃〜７５℃；そして最も好ましくは、約６０℃〜７０℃の温度１０で活性を保持する。更に、これら高温の一つで示される活性は、好ましくは、同じ環境中（例えば、同じ緩衝液組成中）において３７℃での同じ酵素の活性より大である。したがって、特に好ましい熱安定性酵素は、約６０℃〜９５℃の温度で、最も好ましくは、約７０℃〜８０℃の温度で最大触媒活性を示す。この場合の「約」という用語は、与えられた温度の＋／−１０％を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いられる「活性な」という用語は、化学反応を触媒する酵素の能力を意味する。酵素は、最大活性速度を有するであろうが、それは、好ましくは、飽和基質濃度の条件下において、および温度、ｐＨおよび塩濃度を含めた一連の選択された環境条件で測定される。本明細書中に記載のＤＮＡポリメラーゼについて、活性を測定する好ましい条件は、２５ｍＭ ＴＡＰＳ（トリスヒドロキシメチル２５メチルアミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ９．３（２５℃で測定される）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ［α−３３Ｐ］−ｄＡＴＰ（０．０５〜０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および０．４ｍｇ／ｍＬの活性サケ精子ＤＮＡである。反応は、７４℃で進行させる。このような３０条件下において酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する代表的な方法を、以下に与える。
【００２９】
本明細書中で用いられる「不活性な」という用語は、酵素の最大活性速度の１０％未満、より好ましくは、５％未満、そして最も好ましくは、１％未満である活性を意味する。本明細書中に記載のＤＮＡポリメラーゼについて、これは、好ましくは、前の段落に記載の活性を測定する好ましい条件５下で得られる速度に活性を比較することを意味する。最も好ましくは、本発明の熱安定性酵素は、外因的に加えられた洗剤を含まない精製済み熱安定性酵素を含む組成物を得るのに必要な精製工程に供した場合、不可逆的に失活しない。本明細書中の目的についての「不可逆的失活」は、酵素が暴露される条件を変更することによって回収され得ない酵素活性の損失を意味する。
【００３０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅方法に用いるのに必要な条件下において不可逆的に失活しない。
ＰＣＲ中に、例えば、ポリメラーゼは、相補的ＤＮＡ鎖を融解させ且つアニーリングするのに必要な加熱および冷却の反復サイクルに供することができる。このような条件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成に、およびプライマーとして増幅されているまたは用いられている核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存することがありうるが、典型的には、用いられる最高温度は、典型的に、約０．５〜４分間の約９０℃〜約１０５℃である２５。
【００３１】
増加温度は、緩衝液塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加するにつれて必要とされることがありうる。好ましくは、酵素は、９０℃まで、より好ましくは、９５℃まで、なお一層好ましくは、９８℃まで、そして最も好ましくは、１００℃までの温度で不可逆的変性状態になることはない。増加温度に耐える３０能力は、しばしば、一定温度において、一定量の酵素の酵素活性が元の活性の半分に減少した時の時間を意味する「半減期」によっても表される。好ましくは、酵素は、９０℃で３０分より大の半減期を有する。
【００３２】
本明細書中で用いられる「洗剤」という用語は、液体に加えられた場合に、その液体の表面張力を、洗剤の不存在下の同液体と比較して減少させる界面活性剤（surface-active agents（surfactants））を意味する。例えば、Detergents: A guide to the properties and uses of detergents in biological systems, Calbiochem-Novabiochem Corporation, 2001 を参照されたい。
【００３３】
酵素に関して本明細書中で用いられる「精製済み」という用語は、絶対純度を意味することはない。むしろ、「精製済み」は、目的の酵素が由来した生物と比較して、それ以外のタンパク質種を僅かしか含有しない組成物中の実体を意味するものである。好ましくは、酵素は、「実質的に純粋」であり、これは、その酵素が、酵素を含む組成物の質量基準で、タンパク質の少なくとも５０％であることを示している。より好ましくは、実質的に純粋な酵素は、組成物の質量基準で少なくとも７５％、そして最も好ましくは、組成物の質量基準で少なくとも９５％である。
【００３４】
別の側面において、本開示は、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを検定に与える方法を提供する。これら方法は、一つまたはそれを超える洗剤を、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物に加えることを含み、この場合、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物は、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった。最も好ましくは、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに洗剤を加えることは、不活性ＤＮＡポリメラーゼを活性形に変換する、またはＤＮＡポリメラーゼの活性を増加させる。いろいろな側面において、一つまたはそれを超える洗剤は、上記の組成物に加えることができ、そして得られた組成物は、検定に用いるための反応混合物に加えることができる；或いは、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、反応混合物に加えることができ、そして次に、洗剤を加えることができる；および／または洗剤を、反応混合物に加えることができ、そして次に、熱安定性（thennostable）ＤＮＡポリメラーゼを加えることができる。いずれの場合も、それら結果は、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ここで、洗剤を含む組成物中であるということになる。
【００３５】
本明細書中で用いられる「検定」という用語は、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、またはジデオキシリボヌクレオチド三リン酸などの類似体からの鋳型に支配されたＤＮＡ合成を触媒するいずれかの反応混合物を意味する。好ましい検定には、ＤＮＡポリメラーゼ活性検定、一本鎖または二本鎖エキソヌクレアーゼ活性検定、一本鎖または二本鎖エンドヌクレアーゼ活性検定、核酸増幅反応および核酸配列決定反応が含まれる。
【００３６】
陰イオン系洗剤、具体的には、ＲＥ−９６０およびＲＳ−９６０陰イオン系洗剤は、３％まで（０．００２％〜３％の範囲）の最終濃度で用いることができる。０．５％を超える濃度は、安定性を改善することはないが、活性を減少させることがない。有効量の陰イオン系洗剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの安定性および機能に矛盾しない適する陰イオン系洗剤の濃度として定義される。常套実験は、有効量のいずれか具体的な陰イオン系洗剤が何かを決定するであろう。特に断らない限り、濃度は、％Ｗ／Ｖとして与えられる。
【００３７】
ＤＮＡポリメラーゼは、洗剤の存在を伴うことなく精製し且つ貯蔵することができるが、それらポリメラーゼは、既述の陰イオン系洗剤などの洗剤の不存在下で機能することはないということが認められた。
【実施例】
【００３８】
本実施例は、単に例示の目的で与えられていて、請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。下におよび本明細書中の他のところに与えられる参考文献は全て、本明細書中に援用される。
【００３９】
図１は、洗剤の存在下および不存在下におけるλＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡからの１ｋｂフラグメントの増幅の結果を示す。この実験では、洗剤含有／不含緩衝液中で精製され且つ貯蔵された２ロットのＤＮＡポリメラーゼを調べた。最初に、各々の試験ＤＮＡポリメラーゼを、ＰＣＲ前に、Tween ２０含有および不含それぞれの緩衝液中で２０倍に希釈後、等単位の酵素を、ＰＣＲ配合物中に加えた。ＰＣＲは、２００ｎＭの正および逆プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ、１．０単位のＴｂａおよび１．０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む２５μｌ容量中で行った。１ｋｂのヒトゲノムＤＮＡおよび１ｋｂのλＤＮＡのフラグメントを増幅させた。反応緩衝液は、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分の初期加熱によって開始後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で６０秒間を３５サイクル、そして次に、７２℃で５分間の最終伸長を行った。ＰＣＲ産物を、Agilent Bioanalyzer で分析した。それら結果は、ＰＣＲ産物が、洗剤を含有する緩衝液中で酵素を希釈した反応から得られただけであったということを示す。洗剤不含の緩衝液中で希釈されたものについて、酵素は、完全に不活性であったし、そしてＰＣＲ産物が形成されたものはなかった。洗剤を有する緩衝液中で初めに貯蔵されたＤＮＡポリメラーゼについても、洗剤を有していない緩衝液での２０倍希釈後、その酵素は活性を失った。このデータは、ＤＮＡポリメラーゼがその活性を維持するのに洗剤が必要であるということを示している。
【００４０】
多数のイオン系洗剤は、タンパク質に協同的に結合することが知られている。協同的結合は、通常は、タンパク質の変性を引き起こす。協同的結合の発生は、それら洗剤の結合親和性およびＣＭＣに依存する。結合親和性は、洗剤の親水性頭部の極性および疎水性尾部の長さに関係している。
【００４１】
リン酸エステルは、親和性または極性が強すぎてタンパク質の変性を引き起こし得ないと考えられる強力なスルフェートおよびスルホネート基剤界面活性剤と比較したところ、比較的緩和な酸基を有する。リン酸エステルは、更に、いろいろな異なった用途にきわめて有効な界面活性剤ファミリーである。リン酸エステルの特徴的な性質ゆえに、それらは、ポリメラーゼ安定化の用途に適する界面活性剤である。
【００４２】
次の７種類の陰イオン系有機ホスフェート洗剤を、ＤＮＡポリメラーゼを安定化し且つ活性化するそれらの能力について調べた（Rhodafac ＲＥは、ノニルフェノールエトキシレート基剤ホスフェートであり、Rhodafac ＲＳは、トリデシルエトキシル化ホスフェートである）。
【００４３】
Rhodafac ＲＥ−９６０
Rhodafac ＲＥ−６１０
Rhodafac ＲＥ−４１０
Rhodafac ＲＳ−９６０
Rhodafac ＲＳ−７１０
Rhodafac ＲＳ−６１０
Rhodafac ＲＳ−４１０
ＰＣＲ検定を、洗剤スクリーニングに用いた。最初に、試験洗剤を、分子生物学グレード水中に溶解させ、そして水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７へ中和して、５％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度の源溶液とした。次に、それら５％洗剤溶液を、酵素希釈緩衝液中にそれらを加えることによってスクリーニングに用いたかまたはＰＣＲ配合物中に加えた。１ｋｂのλＤＮＡフラグメントの増幅を用いて、Ｔｂａ安定性および活性への各々の洗剤の作用を調べた。ＰＣＲ条件は、前の方に記載したのと同じであった。洗剤の不存在下で精製され且つ貯蔵されたＴｂａを、それら試験に用いた。試験洗剤を、ＰＣＲ反応中に、それぞれ、０．０１％、０．０５％および０．１％の最終濃度で加えた。ＰＣＲ収率は、Agilent Bioanalyzer で定量した。図２は、スクリーニング結果の一部分を示すが、この場合、洗剤は、それぞれ、０．０１％および０．１％の最終濃度でＰＣＲ反応配合物中に直接的に加えた。このデータは、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０が、ＤＮＡポリメラーゼの安定化および活性化にきわめて十分に働くということを示している。
【００４４】
全７種類のホスフェート洗剤の３種類の異なった濃度でのスクリーニング結果を、表１に挙げるが、この場合、各々のＰＣＲ反応のＰＣＲ収率は、Tween ２０に相対する活性％へ変換した。スクリーニングされた７種類の陰イオン系洗剤の内、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０は、ＤＮＡポリメラーゼの安定化および活性化に最良の候補である。Tween ２０（正対照）と比較したところ、これら二つの洗剤を含有する反応からのＰＣＲ収率は、正対照よりも約３０％高く、これら二つの洗剤は、ＤＮＡポリメラーゼの安定化において Tween ２０よりも有効であるということが示唆される。更に、これら二つの洗剤は、広い濃度範囲で働く。全３種類の試験濃度において、それらは、Tween ２０の場合よりもより良い安定化機能または活性化機能を示す。
【００４５】
これら二つの洗剤の安定化機能を、δＪＳＥＲ ＤＮＡポリメラーゼについても調べる。それらは、δＪＳＥＲ ＤＮＡポリメラーゼについて同じ活性化を示す。更に、ＤＮＡポリメラーゼへのこれら二つの洗剤の安定化作用を、活性検定および熱安定性検定でも調べた。活性検定および熱安定性試験双方において、これら二つの洗剤は、Tween ２０の場合と同じまたはより良い安定化作用を示す。それら試験結果は全て、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０が、一般的な非イオン系洗剤への良好な代替品であるということを示す。これら二つの洗剤を用いて、本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのための貯蔵用緩衝液およびＰＣＲ反応緩衝液を配合することができる。
【００４６】
【表１】
【００４７】
図３に示される結果は、ＰＣＲ反応を、適当な洗剤の存在下において９５℃で行った場合、Rhodafac ＲＥ−９６０の存在下でＰＣＲ反応を行った時に、ＮＰ−４０かまたはTween の場合より多くのＤＮＡポリメラーゼが、依然として活性のままであるということを示す。
【００４８】
本明細書中に述べられている特許、特許公報および他の公開参考文献は全て、各々が、本明細書中の参考文献によって個々に且つ具体的に援用されていたかのように、本明細書中にそのまま援用される。本発明の好ましい代表的な態様を記載しているが、当業者は、本発明が、単に例示の目的で与えられ且つ制限によるものではない記載の態様以外で実施することができるということを理解するであろう。本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物およびキット、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを単離するおよび使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸からの鋳型に支配されたＤＮＡ合成を触媒する酵素である。典型的に、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、微生物中のＤＮＡポリメラーゼＩ、IIおよびIII；動物細胞中のＤＮＡポリメラーゼα、βまたはγ）は、ＤＮＡ鋳型からのＤＮＡ鎖の合成を支配するが；しかしながら、いくつかのＤＮＡポリメラーゼ（概して、「逆転写酵素」と称される）は、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ鎖の合成を支配する。概して、これらは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Joint Commission on Biochemical Nomenclature（www.chem.qmul.ac.ulliupac/jcbn/）によって、Enzyme Commission 番号ＥＣ２．７．７．７およびＥＣ２．７．７．４９として認められている。広範囲の探求は、特に、in vitro 反応に用いるための、細菌、酵母およびヒトを含めたいろいろな生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離および特性決定について行われてきた。
【０００３】
特定の in vitro 反応に用いるためのＤＮＡポリメラーゼを選択する場合、当業者は、多数の変数を考慮すべきである。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、その天然の５’−３’または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を（例えば、突然変異誘発によってまたは酵素的消化などの翻訳後修飾によって）欠失しているように、低い誤差率を示すように、高い連続伸長性（processivity）率および伸長率を示すように、および／または好都合な熱安定性を示すように選択されてよい。好熱性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの識別、およびＰＣＲなどの方法における熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＤＮＡを特定し且つ操作する能力の変革をもたらした。多数の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性真正細菌、好熱性アーキアおよびその他から単離された。
【０００４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例には、サームス・エクアティカス（Thermus aquaticus）に由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第４，８８９，８１８号を参照されたい）；サームス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）に由来するＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５，１９２，６７４号；第５，２４２，８１８号；第５，４１３，９２６号を参照されたい）；現在、サームス・オシマイ（Thermus oshimai）と称される Thermus 種ｓｐｓｌ７に由来するＴｓｐ ｓｐｓ１７ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５，４０５，７７４号を参照されたい）；ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）に由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，９４８，６６３号）；バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）に由来するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７４７，２９８号）；サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）に由来するＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３２２，７８５号）；ピロコッカス種（Pyrococcus sp.）ＫＯＤ１に由来するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，０３３，８５９号）；サーモコッカス・バロシイ（Thermococcus barosii）に由来するｎＴｂａおよびＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，６０２，０１１号および第５，８８２，９０４号）；および Thermo SequenaseＴＭ（Amersham）および AmpliTaqＴＭ（Applied Biosystems, Tabor, S. & Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6339-6343）などの商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０００５】
洗剤は、当該技術分野において、膜を可溶化するために、いろいろな化学薬剤の透過性化作用を増強するために、および細菌細胞壁の破壊のために用いられて、ＤＮＡポリメラーゼなどの細胞内タンパク質の微生物からの製造を容易にしてきた。Goldstein et al. は、核酸を実質的に含まない熱安定性酵素を製造する方法を開示している（米国特許第５，８６１，２９５号）。Gelfand et al. は、一つまたはそれを超える非イオン系ポリマー洗剤を含有する緩衝液中の精製済みの安定な熱安定性ポリメラーゼを含む安定な酵素組成物を開示している（米国特許第６，１２７，１５５号）。Simpson et al., Biochem. Cell Biol. 68:1292-6(1990) は、Triton Ｘ−１００などの添加剤によって安定にされているＤＮＡポリメラーゼの精製を開示している。
【０００６】
洗剤は、得られた精製済み種から完全に除去するのが難しいことがありうる。更に、ＤＮＡ配列決定反応などの酵素反応において、洗剤の存在は、結果に影響することがありうる。例えば、Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem. 70:1516-1527,1988 を参照されたい。更に、いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、洗剤の不存在下において、時間経過中に活性を実質的に減少させることがありうる。例えば、非イオン系ポリマー洗剤中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを開示している米国特許第６，１２７，１５５号を参照されたい。Tween ２０は、開示されている一つの具体的な洗剤である。
【０００７】
米国特許第６，２４２，２３５号は、ＤＮＡポリメラーゼ安定化のためのポリエトキシレートアミンを基剤とする陽イオン性界面活性剤の添加を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，８８９，８１８号
【特許文献２】米国特許第５，１９２，６７４号
【特許文献３】米国特許第５，２４２，８１８号
【特許文献４】米国特許第５，４１３，９２６号
【特許文献５】米国特許第５，４０５，７７４号
【特許文献６】米国特許第５，９４８，６６３号
【特許文献７】米国特許第５，７４７，２９８号
【特許文献８】米国特許第５，３２２，７８５号
【特許文献９】米国特許第６，０３３，８５９号
【特許文献１０】米国特許第５，６０２，０１１号
【特許文献１１】米国特許第５，８８２，９０４号
【特許文献１２】Goldstein et al. 米国特許第５，８６１，２９５号
【特許文献１３】Gelfand et al. 米国特許第６，１２７，１５５号
【特許文献１４】米国特許第６，２４２，２３５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tabor, S. & Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,6339-6343
【非特許文献２】Simpson et al., Biochem. Cell Biol. 68:1292-6(1990)
【非特許文献３】Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem. 70:1516-1527,1988
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが精製され且つ用いられる環境の制御を可能にする組成物および方法に関する。本開示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素と、陰イオン系洗剤の添加を提供する。具体的には、その洗剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホスフェート、例えば、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである。
【００１１】
【化１】
【００１２】
この洗剤は、Rhodafac ＲＥ−９６０という商品名またはポリオキシエチレンアルキルエーテルホスフェート、例えば、ポリオキシエチレントリデシルエーテルホスフェートとして販売されている。
【００１３】
【化２】
【００１４】
この洗剤は、Rhodafac ＲＳ−９６０という商品名として販売されている。
このカテゴリーにある他の類似の陰イオン系洗剤は、次のような更に一般的な構造で記載することができる。
【００１５】
−アルキルエトキシル化リン酸エステル（Ｉ）。式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２２の直鎖状、分岐状、環状または多環式炭化水素を含むアルキル基である。その基Ｒは、更に、一つまたはそれを超える不飽和二重結合がその構造内にあるアルケニル基でありうる。Ｎは、３〜１００でありうる。
【００１６】
−アルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（II）。式中、基Ｒは、Ｃ８〜Ｃ１２の直鎖状または分岐状アルキル基である。Ｎは、３〜１００でありうる。
−ジアルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（III）。式中、基ＲおよびＲ’は、それぞれ、Ｃ８〜Ｃ１２基である。Ｎは、３〜１００である。
【００１７】
−トリアルキルフェノールエトキシル化リン酸エステル（IV）。式中、基Ｒ、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ、Ｃ８〜Ｃ１２アルキル基である。Ｎは、３〜１００である。構造Ｖは、IVの群の特殊な場合である。
【００１８】
【化３】
【００１９】
基Ｒは、アルキル、アリールアルキル、多環式トリスチリルフェノールでありうるが、これに制限されるわけではない。Ｍは、水素；アンモニウム；ナトリウム、リチウムおよびカリウムなどの金属イオンでありうる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、洗剤の不存在下および存在下における１ｋｂのλＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を示す。レーン１および７：洗剤不含で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の不存在下におけるＰＣＲ；レーン２および８：洗剤不含で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の存在下におけるＰＣＲ；レーン３および９：洗剤で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の不存在下におけるＰＣＲ；レーン４および１０：洗剤で精製済みのＴｂａを用いた洗剤の存在下におけるＰＣＲ。
【図２】図２は、陰イオン系ホスフェート洗剤のスクリーニング：０．１％または０．０１％の試験洗剤を用いた１ｋｂのＤＮＡの増幅を示す。上区画：ＰＣＲ産物のゲル様画像。レーン１：正対照（０．０５％ Tween ２０）；レーン２：０．０５％ Rhodafac ＲＥ６１０；レーン３〜８：０．０１％の Rhodafac ＲＥ４１０、Rhodafac ＲＥ９６０、Rhodafac ＲＳ９６０、Rhodafac ＲＳ４１０、Rhodafac ＲＳ７１０および Rhodafac ＲＳ６１０；レーン９〜１２：０．１％の Rhodafac ＲＥ７１０、Rhodafac ＲＥ９６０、Rhodafac ＲＳ９６０および Rhodafac ＲＳ７１０。下区画：各々の試験洗剤でのＰＣＲ収率の棒グラフ。
【図３】図３は、９５℃で１５分間加熱後の１ＸＰＣＲ緩衝液中の残存活性の結果を示す。洗剤％は、ＰＣＲ反応における洗剤の最終量を示す。黒菱形について、各々の洗剤は、指示量で存在する。黒菱形：ＮＰ４０および Tween ２０。黒四角：Rhodafac ＲＥ−９６０。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＩは、Thermus、Pyrococcus、Thermococcus、アクイフェックス（Aquifex）、スルホロブス（Sulfolobus）、サーモプラズマ（Thermoplasma）、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）、ロドサーマス（Rhodothermus）、メタノコッカス（Methanococcus）およびサーモトガ（Thermotoga）から成る群より選択される属の微生物から得られるまたはに由来する。
【００２２】
本発明の熱安定性酵素は、いずれの源からも得ることができ、しかも天然または組換えタンパク質でありうる。したがって、この段落中に用いられる「に由来する」という句は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、組換え発現されるということを示すものであり、そして発現されたＤＮＡ配列は、好熱性生物またはその突然変異形から得られる野生型配列である。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ源（配列および／またはタンパク質）を与える適する生物の例には、サームス・フラブス（Thermus flavus）、サームス・ルバー（Thermus ruber）、Thermus thermophilus、Bacillus stearothermophilus、サーモス・エクアティカス（Thermos aquaticus）、サームス・ラクテウス（Thermus lacteus）、メイオサーマス・クバー（Meiothermus cuber）、Thermus oshimai、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fervidus）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Methanobacterium thermoautotrophicum）およびデスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）が含まれる。
【００２３】
好ましいＤＮＡポリメラーゼには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ；ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；ｎＴｂａおよび／またはＴｂａ ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これに制限されるわけではない。一定の態様において、本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ Ａ２７１ Ｆ６６７Ｙ、Ｔｔｈ Ａ２７３ Ｆ６６８ＹおよびＴａｑ Ａ２７１ Ｆ６６７Ｙ Ｅ６８１Ｗなど、野生型配列と比較して一つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失、置換または付加によって修飾された。
【００２４】
適する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ＪＳＥＲ（ＷＯ２００３／００４６３２号）または Thermococcus barosii（米国特許第５，６０２，０１１号およびＵＳ５，８８２，９０４号）として特性決定された生物に由来することができる。
【００２５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、天然に酵素を発現する細胞かまたは酵素を発現するように遺伝子操作された細胞（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの外因性ＤＮＡポリメラーゼを発現するＥ．cold）から精製される。
【００２６】
いろいろな好ましい態様において、本発明の精製方法は、一つまたはそれを超える次の工程：（ｉ）細胞溶解産物を加熱して、一つまたはそれを超えるタンパク質を変性させること；（ii）細胞溶解産物を遠心分離して、上澄みの全部または一部分を取り出して、透明な溶解産物を与えること；および（iii）透明な溶解産物を、クロマトグラフィー媒質、最も好ましくは、ブチル官能基を含むクロマトグラフィー媒質を用いて分別することを含む。
【００２７】
「熱安定性」という用語は、５０℃を超える温度で活性を保持する酵素を意味する；したがって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖の合成を支配する能力をこの高温で保持する。酵素は、二つ以上の酵素活性を有することがありうる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼも、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性を含むことがありうる。このような酵素は、一つの活性に関して熱安定性能（thermos/ability）を示すことがありうるが、もう一方には示さないことがありうる。好ましくは、熱安定性酵素は、約５０℃〜８０℃、より好ましくは、約５５℃〜７５℃；そして最も好ましくは、約６０℃〜７０℃の温度１０で活性を保持する。更に、これら高温の一つで示される活性は、好ましくは、同じ環境中（例えば、同じ緩衝液組成中）において３７℃での同じ酵素の活性より大である。したがって、特に好ましい熱安定性酵素は、約６０℃〜９５℃の温度で、最も好ましくは、約７０℃〜８０℃の温度で最大触媒活性を示す。この場合の「約」という用語は、与えられた温度の＋／−１０％を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いられる「活性な」という用語は、化学反応を触媒する酵素の能力を意味する。酵素は、最大活性速度を有するであろうが、それは、好ましくは、飽和基質濃度の条件下において、および温度、ｐＨおよび塩濃度を含めた一連の選択された環境条件で測定される。本明細書中に記載のＤＮＡポリメラーゼについて、活性を測定する好ましい条件は、２５ｍＭ ＴＡＰＳ（トリスヒドロキシメチル２５メチルアミノプロパンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ９．３（２５℃で測定される）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、各０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ［α−３３Ｐ］−ｄＡＴＰ（０．０５〜０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および０．４ｍｇ／ｍＬの活性サケ精子ＤＮＡである。反応は、７４℃で進行させる。このような３０条件下において酵素のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する代表的な方法を、以下に与える。
【００２９】
本明細書中で用いられる「不活性な」という用語は、酵素の最大活性速度の１０％未満、より好ましくは、５％未満、そして最も好ましくは、１％未満である活性を意味する。本明細書中に記載のＤＮＡポリメラーゼについて、これは、好ましくは、前の段落に記載の活性を測定する好ましい条件５下で得られる速度に活性を比較することを意味する。最も好ましくは、本発明の熱安定性酵素は、外因的に加えられた洗剤を含まない精製済み熱安定性酵素を含む組成物を得るのに必要な精製工程に供した場合、不可逆的に失活しない。本明細書中の目的についての「不可逆的失活」は、酵素が暴露される条件を変更することによって回収され得ない酵素活性の損失を意味する。
【００３０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅方法に用いるのに必要な条件下において不可逆的に失活しない。
ＰＣＲ中に、例えば、ポリメラーゼは、相補的ＤＮＡ鎖を融解させ且つアニーリングするのに必要な加熱および冷却の反復サイクルに供することができる。このような条件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成に、およびプライマーとして増幅されているまたは用いられている核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存することがありうるが、典型的には、用いられる最高温度は、典型的に、約０．５〜４分間の約９０℃〜約１０５℃である２５。
【００３１】
増加温度は、緩衝液塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加するにつれて必要とされることがありうる。好ましくは、酵素は、９０℃まで、より好ましくは、９５℃まで、なお一層好ましくは、９８℃まで、そして最も好ましくは、１００℃までの温度で不可逆的変性状態になることはない。増加温度に耐える３０能力は、しばしば、一定温度において、一定量の酵素の酵素活性が元の活性の半分に減少した時の時間を意味する「半減期」によっても表される。好ましくは、酵素は、９０℃で３０分より大の半減期を有する。
【００３２】
本明細書中で用いられる「洗剤」という用語は、液体に加えられた場合に、その液体の表面張力を、洗剤の不存在下の同液体と比較して減少させる界面活性剤（surface-active agents（surfactants））を意味する。例えば、Detergents: A guide to the properties and uses of detergents in biological systems, Calbiochem-Novabiochem Corporation, 2001 を参照されたい。
【００３３】
酵素に関して本明細書中で用いられる「精製済み」という用語は、絶対純度を意味することはない。むしろ、「精製済み」は、目的の酵素が由来した生物と比較して、それ以外のタンパク質種を僅かしか含有しない組成物中の実体を意味するものである。好ましくは、酵素は、「実質的に純粋」であり、これは、その酵素が、酵素を含む組成物の質量基準で、タンパク質の少なくとも５０％であることを示している。より好ましくは、実質的に純粋な酵素は、組成物の質量基準で少なくとも７５％、そして最も好ましくは、組成物の質量基準で少なくとも９５％である。
【００３４】
別の側面において、本開示は、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを検定に与える方法を提供する。これら方法は、一つまたはそれを超える洗剤を、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物に加えることを含み、この場合、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物は、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった。最も好ましくは、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに洗剤を加えることは、不活性ＤＮＡポリメラーゼを活性形に変換する、またはＤＮＡポリメラーゼの活性を増加させる。いろいろな側面において、一つまたはそれを超える洗剤は、上記の組成物に加えることができ、そして得られた組成物は、検定に用いるための反応混合物に加えることができる；或いは、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、反応混合物に加えることができ、そして次に、洗剤を加えることができる；および／または洗剤を、反応混合物に加えることができ、そして次に、熱安定性（thennostable）ＤＮＡポリメラーゼを加えることができる。いずれの場合も、それら結果は、外因的に加えられる洗剤を以前に含んでいなかった精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ここで、洗剤を含む組成物中であるということになる。
【００３５】
本明細書中で用いられる「検定」という用語は、精製済み熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、またはジデオキシリボヌクレオチド三リン酸などの類似体からの鋳型に支配されたＤＮＡ合成を触媒するいずれかの反応混合物を意味する。好ましい検定には、ＤＮＡポリメラーゼ活性検定、一本鎖または二本鎖エキソヌクレアーゼ活性検定、一本鎖または二本鎖エンドヌクレアーゼ活性検定、核酸増幅反応および核酸配列決定反応が含まれる。
【００３６】
陰イオン系洗剤、具体的には、ＲＥ−９６０およびＲＳ−９６０陰イオン系洗剤は、３％まで（０．００２％〜３％の範囲）の最終濃度で用いることができる。０．５％を超える濃度は、安定性を改善することはないが、活性を減少させることがない。有効量の陰イオン系洗剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの安定性および機能に矛盾しない適する陰イオン系洗剤の濃度として定義される。常套実験は、有効量のいずれか具体的な陰イオン系洗剤が何かを決定するであろう。特に断らない限り、濃度は、％Ｗ／Ｖとして与えられる。
【００３７】
ＤＮＡポリメラーゼは、洗剤の存在を伴うことなく精製し且つ貯蔵することができるが、それらポリメラーゼは、既述の陰イオン系洗剤などの洗剤の不存在下で機能することはないということが認められた。
【実施例】
【００３８】
本実施例は、単に例示の目的で与えられていて、請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。下におよび本明細書中の他のところに与えられる参考文献は全て、本明細書中に援用される。
【００３９】
図１は、洗剤の存在下および不存在下におけるλＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡからの１ｋｂフラグメントの増幅の結果を示す。この実験では、洗剤含有／不含緩衝液中で精製され且つ貯蔵された２ロットのＤＮＡポリメラーゼを調べた。最初に、各々の試験ＤＮＡポリメラーゼを、ＰＣＲ前に、Tween ２０含有および不含それぞれの緩衝液中で２０倍に希釈後、等単位の酵素を、ＰＣＲ配合物中に加えた。ＰＣＲは、２００ｎＭの正および逆プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ、１．０単位のＴｂａおよび１．０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む２５μｌ容量中で行った。１ｋｂのヒトゲノムＤＮＡおよび１ｋｂのλＤＮＡのフラグメントを増幅させた。反応緩衝液は、１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する。ＰＣＲ反応は、９５℃で２分の初期加熱によって開始後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で６０秒間を３５サイクル、そして次に、７２℃で５分間の最終伸長を行った。ＰＣＲ産物を、Agilent Bioanalyzer で分析した。それら結果は、ＰＣＲ産物が、洗剤を含有する緩衝液中で酵素を希釈した反応から得られただけであったということを示す。洗剤不含の緩衝液中で希釈されたものについて、酵素は、完全に不活性であったし、そしてＰＣＲ産物が形成されたものはなかった。洗剤を有する緩衝液中で初めに貯蔵されたＤＮＡポリメラーゼについても、洗剤を有していない緩衝液での２０倍希釈後、その酵素は活性を失った。このデータは、ＤＮＡポリメラーゼがその活性を維持するのに洗剤が必要であるということを示している。
【００４０】
多数のイオン系洗剤は、タンパク質に協同的に結合することが知られている。協同的結合は、通常は、タンパク質の変性を引き起こす。協同的結合の発生は、それら洗剤の結合親和性およびＣＭＣに依存する。結合親和性は、洗剤の親水性頭部の極性および疎水性尾部の長さに関係している。
【００４１】
リン酸エステルは、親和性または極性が強すぎてタンパク質の変性を引き起こし得ないと考えられる強力なスルフェートおよびスルホネート基剤界面活性剤と比較したところ、比較的緩和な酸基を有する。リン酸エステルは、更に、いろいろな異なった用途にきわめて有効な界面活性剤ファミリーである。リン酸エステルの特徴的な性質ゆえに、それらは、ポリメラーゼ安定化の用途に適する界面活性剤である。
【００４２】
次の７種類の陰イオン系有機ホスフェート洗剤を、ＤＮＡポリメラーゼを安定化し且つ活性化するそれらの能力について調べた（Rhodafac ＲＥは、ノニルフェノールエトキシレート基剤ホスフェートであり、Rhodafac ＲＳは、トリデシルエトキシル化ホスフェートである）。
【００４３】
Rhodafac ＲＥ−９６０
Rhodafac ＲＥ−６１０
Rhodafac ＲＥ−４１０
Rhodafac ＲＳ−９６０
Rhodafac ＲＳ−７１０
Rhodafac ＲＳ−６１０
Rhodafac ＲＳ−４１０
ＰＣＲ検定を、洗剤スクリーニングに用いた。最初に、試験洗剤を、分子生物学グレード水中に溶解させ、そして水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７へ中和して、５％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度の源溶液とした。次に、それら５％洗剤溶液を、酵素希釈緩衝液中にそれらを加えることによってスクリーニングに用いたかまたはＰＣＲ配合物中に加えた。１ｋｂのλＤＮＡフラグメントの増幅を用いて、Ｔｂａ安定性および活性への各々の洗剤の作用を調べた。ＰＣＲ条件は、前の方に記載したのと同じであった。洗剤の不存在下で精製され且つ貯蔵されたＴｂａを、それら試験に用いた。試験洗剤を、ＰＣＲ反応中に、それぞれ、０．０１％、０．０５％および０．１％の最終濃度で加えた。ＰＣＲ収率は、Agilent Bioanalyzer で定量した。図２は、スクリーニング結果の一部分を示すが、この場合、洗剤は、それぞれ、０．０１％および０．１％の最終濃度でＰＣＲ反応配合物中に直接的に加えた。このデータは、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０が、ＤＮＡポリメラーゼの安定化および活性化にきわめて十分に働くということを示している。
【００４４】
全７種類のホスフェート洗剤の３種類の異なった濃度でのスクリーニング結果を、表１に挙げるが、この場合、各々のＰＣＲ反応のＰＣＲ収率は、Tween ２０に相対する活性％へ変換した。スクリーニングされた７種類の陰イオン系洗剤の内、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０は、ＤＮＡポリメラーゼの安定化および活性化に最良の候補である。Tween ２０（正対照）と比較したところ、これら二つの洗剤を含有する反応からのＰＣＲ収率は、正対照よりも約３０％高く、これら二つの洗剤は、ＤＮＡポリメラーゼの安定化において Tween ２０よりも有効であるということが示唆される。更に、これら二つの洗剤は、広い濃度範囲で働く。全３種類の試験濃度において、それらは、Tween ２０の場合よりもより良い安定化機能または活性化機能を示す。
【００４５】
これら二つの洗剤の安定化機能を、δＪＳＥＲ ＤＮＡポリメラーゼについても調べる。それらは、δＪＳＥＲ ＤＮＡポリメラーゼについて同じ活性化を示す。更に、ＤＮＡポリメラーゼへのこれら二つの洗剤の安定化作用を、活性検定および熱安定性検定でも調べた。活性検定および熱安定性試験双方において、これら二つの洗剤は、Tween ２０の場合と同じまたはより良い安定化作用を示す。それら試験結果は全て、Rhodafac ＲＥ−９６０および Rhodafac ＲＳ−９６０が、一般的な非イオン系洗剤への良好な代替品であるということを示す。これら二つの洗剤を用いて、本発明者は、ＤＮＡポリメラーゼのための貯蔵用緩衝液およびＰＣＲ反応緩衝液を配合することができる。
【００４６】
【表１】
【００４７】
図３に示される結果は、ＰＣＲ反応を、適当な洗剤の存在下において９５℃で行った場合、Rhodafac ＲＥ−９６０の存在下でＰＣＲ反応を行った時に、ＮＰ−４０かまたはTween の場合より多くのＤＮＡポリメラーゼが、依然として活性のままであるということを示す。
【００４８】
本明細書中に述べられている特許、特許公報および他の公開参考文献は全て、各々が、本明細書中の参考文献によって個々に且つ具体的に援用されていたかのように、本明細書中にそのまま援用される。本発明の好ましい代表的な態様を記載しているが、当業者は、本発明が、単に例示の目的で与えられ且つ制限によるものではない記載の態様以外で実施することができるということを理解するであろう。本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン系洗剤を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項２】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレン（polyoxyethlene）エーテルホスフェートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホスフェートまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルホスフェートである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
陰イオン系洗剤が、０．５％までの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
陰イオン系洗剤が、０．５％まで存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
陰イオン系洗剤が、ポリエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
有効量の陰イオン系洗剤を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を安定化させるおよび／または増強する方法。
【請求項８】
ＰＣＲを実施する方法であって、陰イオン系洗剤を含む方法。
【請求項９】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレン（polyoxyethlene）ホスフェートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン系洗剤が、ポリエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
陰イオン系洗剤を含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項２】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレン（polyoxyethlene）エーテルホスフェートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホスフェートまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルホスフェートである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
陰イオン系洗剤が、０．５％までの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
陰イオン系洗剤が、０．５％まで存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
陰イオン系洗剤が、ポリエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
有効量の陰イオン系洗剤を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を安定化させるおよび／または増強する方法。
【請求項８】
ＰＣＲを実施する方法であって、陰イオン系洗剤を含む方法。
【請求項９】
陰イオン系洗剤が、ポリオキシエチレン（polyoxyethlene）ホスフェートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン系洗剤が、ポリエチレンノニルフェノールエーテルホスフェートである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５２８６６９（Ｐ２０１０−５２８６６９Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１６４４（Ｐ２０１０−５１１６４４）
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７４０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２１０２
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７４０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５２１０２
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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