ポリ塩化ビフェニル類の分析方法
【課題】ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢ類）を含む疎水性試料に含まれ、ＰＣＢ類の定量に妨害となる共存物質を、簡便な操作で、十分に除去して、ＰＣＢ類を定量しうる分析方法を提供する。
【解決手段】本発明のＰＣＢ類の分析方法は、(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする。通常、発煙硫酸含浸量はシリカゲルに対して０．５〜５質量倍、カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる。
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【解決手段】本発明のＰＣＢ類の分析方法は、(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする。通常、発煙硫酸含浸量はシリカゲルに対して０．５〜５質量倍、カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる。
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類の分析方法に関し、詳しくは疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量しうる分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスなどに使用されている絶縁油などの疎水性試料に含まれるポリ塩化ビフェニル類〔以下、ＰＣＢ類と略称することがある。〕を定量するに際しては、ＰＣＢ類の定量に妨害となる共存物質を予め除去することが必要であるが、このような共存物質には、カラムクロマトグラフ処理などの通常の処理方法だけでは分離が困難なものもある。このため、非特許文献１〔平成１２年１２月２８日厚生省告示第６３３号で改正された平成４年７月３日厚生省告示第１９２号の別表第二「特別管理一般廃棄物及び特別管理産業廃棄物に係る基準の検定方法」〕に記載された、いわゆる公定法では、疎水性試料を濃硫酸と液−液接触させて処理する操作を繰り返したのちに、共存物質を上記カラムクロマトグラフ処理などの処理方法により除去する方法が開示されており、濃硫酸に代えて遊離ＳＯ3濃度２５質量％の発煙硫酸を用いて疎水性試料を処理する方法も知られている。かかる処理方法によれば、疎水性試料に含まれる分離困難な妨害物質を除去することができる。濃硫酸または発煙硫酸と液−液接触させたのちの疎水性試料は、分液操作により濃硫酸または発煙硫酸から分離される。
【０００３】
しかし、液−液接触させたのちの疎水性試料を濃硫酸または発煙硫酸から分離する操作を繰り返すことは煩雑である。
【０００４】
一方、比較的短時間で、簡便に、妨害物質を除去しうる方法としては、疎水性試料を、珪藻土に濃硫酸単独を含浸させた濃硫酸含浸担体と接触させる方法が知られており、特許文献１〔特開２００１−１１６７２３号公報第９頁の段落番号００８２〕には、この濃硫酸含浸担体を充填したカラムに、疎水性試料を通過させたのちに、シリカゲルカラムクロマトグラフ処理を行うことにより、妨害物質の除去を図っている。
【０００５】
しかし、濃硫酸単独を用いる従来の分解方法では、ＰＣＢ類との分離が困難な妨害物質を十分に除去することができないという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】平成１２年１２月２８日厚生省告示第６３３号で改正された平成４年７月３日厚生省告示第１９２号の別表第二「特別管理一般廃棄物及び特別管理産業廃棄物に係る基準の検定方法」
【特許文献１】特開２００１−１１６７２３号公報第９頁の段落番号００８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明者らは、疎水性試料に含まれ、ＰＣＢ類の定量に妨害となる共存物質を、簡便な操作で、十分に除去して、ＰＣＢ類を定量しうる方法を開発するべく鋭意検討した結果、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、ポリ塩化ビフェニル類を含む疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量するに際し、
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法を提供するものである。
【０００９】
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５質量％〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、遊離ＳＯ3濃度５〜４０質量％の発煙硫酸を用いるので、疎水性試料に含まれる上記妨害物質を十分に除去することができることから、ＰＣＢ類と抗体とのイムノアッセイでの共存物質による妨害を解消することができ、これによりＰＣＢ類を正確に定量できる。また、この発煙硫酸はシリカゲルに含浸されているので、従来の技術のような煩雑な分液操作を必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法に適用される疎水性試料は、疎水性の液体試料であって、例えばトランス、コンデンサーなどの電気機器に絶縁、冷却などのために封入されて使用される絶縁油、該絶縁油を分解処理して得られる分解処理油などの油性試料が挙げられる。かかる油性試料は希釈されることなくそのまま用いられてもよいし、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンなどのような疎水性溶媒で希釈されて用いられてもよい。
【００１２】
また、疎水性試料としては、例えば焼却炉から排出される煤塵、燃え殻、土壌から採取される土質試料などの固形試料、雨水、排水などの水質試料などから、ｎ−ヘキサン、トルエンなどのような疎水性溶媒により抽出されたＰＣＢ類を含む疎水性溶液も挙げられる。
【００１３】
固形試料や水質試料から疎水性溶媒によりＰＣＢ類を抽出するには、例えば固形試料または水質試料を上記のような疎水性溶媒と接触させればよい。
【００１４】
固形試料または水質試料から疎水性溶媒によりＰＣＢ類を抽出することにより得られた疎水性溶媒抽出液は、そのまま疎水性試料として用いてもよいが、通常は、ＰＣＢ類と共に抽出される他の共存物質を分離するために、ｎ−ヘキサン、トルエンなどの疎水性溶媒抽出液からＰＣＢ類を極性有機溶媒でさらに抽出し、得られた極性有機溶媒抽出液からＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させる。かかる極性有機溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノール、ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。極性有機溶媒抽出液から疎水性溶媒に転溶させるには、例えば極性有機溶媒抽出液に水を加えたのち、疎水性溶媒により抽出すればよい。
【００１５】
本発明の方法において前処理工程で用いる発煙硫酸含浸シリカゲルは、シリカゲルに発煙硫酸が含浸されてなるものである。
【００１６】
シリカゲルとしては、ＢＥＴ比表面積が２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、好ましくは２５０ｍ2／ｇ〜３５０ｍ2／ｇであり、細孔容積が１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇ、好ましくは１．６ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのものが用いられる。
【００１７】
発煙硫酸は、濃硫酸に三酸化硫黄〔ＳＯ3〕ガスを吸収させたものであり、その遊離ＳＯ3濃度は、ＪＩＳ Ｋ８７４１に従って測定される。一般に市販されている発煙硫酸の遊離ＳＯ3濃度は１０質量％〜６０質量％であるので、本発明で規定する遊離ＳＯ3濃度の発煙硫酸は、例えば市販の発煙硫酸に、濃硫酸、すなわちＨ2ＳＯ4濃度９８質量％以上の硫酸を加えて希釈する方法、市販の発煙硫酸または濃硫酸に三酸化硫黄ガスを吹き込んで吸収させる方法などにより調製することができる。
【００１８】
発煙硫酸の遊離ＳＯ3濃度は、妨害物質を十分に除去しうる点で、５質量％以上、好ましくは１５質量％以上であり、ＰＣＢ類を精度よく定量できる点で、４０質量％以下、好ましくは３０質量％以下である。
【００１９】
かかる発煙硫酸のシリカゲルに対する含浸量は、シリカゲルに含浸されて保持されうる量であればよく、通常は、シリカゲルに対して０．５質量倍〜５質量倍であるが、含浸された発煙硫酸がほとんど滲み出さず、また粒子同士が互いに粘着せず、粉末状で流動性の発煙硫酸シリカゲルとなって取扱いが容易である点で、２．５質量倍以下であることが好ましい。
【００２０】
疎水性試料と発煙硫酸含浸シリカゲルとの接触は、通常、疎水性試料を、カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させることにより行われ、代表的には、疎水性試料を、発煙硫酸含浸シリカゲルが充填されたカラムを通過させることにより行われる。
【００２１】
また、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムは、カラムに、前記のシリカゲルを充填したのち、上述の発煙硫酸を加えることにより調製することもできる。
【００２２】
より具体的な使用形態としては、あらかじめ前記発煙硫酸含浸シリカゲルを携帯密封容器に収容しておき、使用時にこれを開封し、該発煙硫酸含浸シリカゲルをカラムに充填し、当該カラムを通過させることにより、該疎水性試料を処理する形態が挙げられる。かかる使用形態によれば、発煙硫酸含浸シリカゲルが携帯密封容器に収容されているために、分析対象となる疎水性試料の採取現場においても容易に前処理し得ることから好ましい。
【００２３】
発煙硫酸含浸シリカゲルが収容される携帯密封容器としては、発煙硫酸に対して不活性であり、当該シリカゲルを密封し得るものが挙げられる。
【００２４】
かかる容器としては、その内面がガラスライニング、フッ素樹脂加工になどによりコーティングされているシリンダー型の密封容器、アンプルなどが挙げられ、入手が容易であり、また軽量で取り扱いが容易である点で、アンプルが好ましい。
【００２５】
アンプルとしては、通常は内容物の確認が容易で、開封が容易である点で、ガラス製のものが用いられる。
【００２６】
密封アンプルは、上記の発煙硫酸含浸シリカゲルがアンプルに密封されてなるものであり、例えば投入口が開いたアンプルに、前記シリカゲルおよび発煙硫酸を投入し、投入口を封止することにより調製することができる。前記シリカゲルおよび発煙硫酸は、あらかじめ混合されていてもよいし、アンプルに投入されたのち、アンプルを振とうすることにより撹拌して混合してもよい。
【００２７】
かくして得られる発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルを開封し、密封されていた発煙硫酸含浸担体をカラムに充填するには、通常の方法でアンプルを開封したのち、内部の発煙硫酸含浸担体をカラムに移し替えればよい。
【００２８】
前記のシリカゲルに、このシリカゲルに対して２．５質量倍以下の上述の発煙硫酸が含浸されてなる発煙硫酸含浸シリカゲルは、流動性の粉末状であるので、アンプルからカラムへの移し替えが容易である点で、好ましい。
【００２９】
疎水性試料を発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる際の接触温度は、通常０℃〜５０℃程度である。接触時間は、通常１分〜２０分程度であり、精度が優れ効率的に測定できる点で、３分〜１０分が好ましい。
【００３０】
疎水性試料の粘度によっては、そのままでは発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを通過させることが困難な場合もあるが、このような場合には、適宜、疎水性試料を、例えばｎ−ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの疎水性溶媒で希釈することにより粘度を下げて用いてもよいし、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムに疎水性試料を戴置したのち、さらに疎水性溶媒を流下させることにより希釈させながら通過させてもよい。
【００３１】
疎水性溶媒試料は、あらかじめ脱水されていることが好ましい。脱水させるには、例えば乾燥剤と接触させればよく、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムとして、その上流側にさらに乾燥剤を充填した発煙硫酸含浸シリカゲル層と乾燥剤層との２層構成のカラムを用い、疎水性試料が、この乾燥剤層を通過することにより脱水されてから、発煙硫酸含浸シリカゲル層を通過するように構成してもよいし、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムの上流側に乾燥剤を充填した乾燥剤カラムを接続して、疎水性試料が、乾燥剤カラムを通過したのちに、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを通過するように構成してもよい。乾燥剤として通常は、無水硫酸ナトリウムなどのような発煙硫酸および濃硫酸に対して不活性な乾燥剤が用いられる。
【００３２】
このようにして発煙硫酸含浸シリカゲルと接触したのちの疎水性試料を、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフ処理することにより、妨害物質を除去することができる。シリカゲルカラムクロマトグラフ処理には、通常、カラムにシリカゲルが充填されたシリカゲルカラムが用いられ、通常は、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムの下流側に接続されて用いられる。
【００３３】
このような処理操作を施したのちの疎水性試料は、必要に応じて、例えば溶媒留去などの
方法により濃縮されてもよい。また、通常は、該疎水性試料からＰＣＢ類をジメチルスルホキシド、アセトンなどの極性有機溶媒に転溶させる。極性有機溶媒に転溶させる方法としては、例えば疎水性試料を溶媒留去し、残渣に上記の極性有機溶媒に加えて溶解させる方法が挙げられるが、疎水性試料に残存する他の共存物質のうち、極性有機溶媒に不溶のものをＰＣＢ類と分離し、除去できることから、疎水性試料に対して不溶性の極性有機溶媒を加え、疎水性溶媒層と極性有機溶媒層との２層に層分離させたのち、分液により親水性溶媒層を得る方法が好ましく用いられ、分液前に溶媒留去などの方法により疎水性試料を濃縮してから分液してもよい。
【００３４】
なお、上記の処理操作ののち、疎水性試料に残存する他の共存物質は、必要に応じて更に、通常のカラムクロマトグラフ法などの精製処理を付することにより、除去することができる。
【００３５】
例えば上記他の共存物質のうち親油性のものは、疎水性試料に含まれるＰＣＢ類を極性有機溶媒で抽出し、得られた極性溶媒抽出液を、親油性吸着剤を充填剤とするカラムクロマトグラフ処理することにより、ＰＣＢ類と分離することができる。
極性有機溶媒としては、上記したと同様のものが挙げられる。親油性吸着剤とは、少なくとも表面が油性の物質と親和性のある材料で構成された固形の吸着剤であって、通常は粒状のものが用いられる。かかる親油性吸着剤としては、例えばカラムクロマトグラフ用充填剤、固相抽出用充填剤、逆相液体クロマトグラフィーのカラム充填剤として広く用いられているものが挙げられ、例えばジーエルサイエンス社からカラムクロマト充填剤「Ｃ１８」、米国ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社から「ＳＥＰ−ＰＡＫ−Ｃ１８」、「ＳＥＰ−ＰＡＫ−ｔＣ１８」、「ＳＥＰ−ＰＡＫ−Ｖａｃ ｔＣ１８」などの商品名で市販されているものを用いることができる。
【００３６】
カラムクロマトグラフ処理は、例えば親油性吸着剤を充填したカラムを用い、極性有機溶媒抽出液を流下液として用いることにより行われる。流下後の極性溶媒抽出液は、必要に応じて濃縮してもよい。
【００３７】
親油性吸着剤によりカラムクロマトグラフ処理したのちの極性有機溶媒抽出液に、他の共存物質として親水性のものが含まれる場合には、例えば極性有機溶媒抽出液に含まれるＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させた転溶液を、多層シリカゲルカラムクロマトグラフ処理することにより、ＰＣＢ類から分離することができる。
【００３８】
極性有機溶媒抽出液に含まれるＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させるには、例えば極性有機溶媒抽出液に水を加えたのち、疎水性溶媒で抽出すればよい。多層シリカゲルカラムクロマトグラフ処理は、例えばカラムに無処理のシリカゲル、水酸化カリウム被覆シリカゲル、硫酸被覆シリカゲルなどのシリカゲル充填剤が充填された多層構成の多層シリカゲルカラムに転溶液を通過させることにより行われる。通過後の転溶液は、溶媒留去などの方法により濃縮してもよい。
【００３９】
かかる前処理を施した後、ＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程により、ＰＣＢ類を分析する。
【００４０】
このようなＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程は特に制限されるものではなく、適宜公知の方法を採用し得るが、例えば
(1)前処理工程で得られるＰＣＢ類に、該ＰＣＢ類に対する１次抗体を過剰量加えて混合することにより、当該１次抗体を抗原抗体反応により該ＰＣＢ類と結合させたのち、
(2)該１次抗体との抗原抗体反応能力を有し、蛍光物質で標識化された標識化２次抗体を過剰量加えて混合し、ＰＣＢ類の類似化合物であるハプテン抗原が担体に固定化された抗原固定化担体と接触させることにより、上記でＰＣＢ類と結合しなかった過剰分の１次抗体を抗原固定化担体のハプテン抗原に結合させると共に、この結合した１次抗体に標識化２次抗体を結合させ、
次いで、
(3)このようにして１次抗体を介して抗原固定化担体に担持され標識化２次抗体の担持量を求めればよい。
【００４１】
この方法によれば、ＰＣＢ類の含有量が多い場合には、抗原固定化担体への標識化２次抗体の担持量が少なくなり、ＰＣＢ類の含有量が少ない場合には、標識化２次抗体の担持量が多くなるので、抗原固定化担体への標識化２次抗体の担持量を求めることにより、ＰＣＢ類の含有量を求めることができる。標識化２次抗体の担持量は、担持後の抗原固定化担体に紫外線などを照射して蛍光強度を測定する通常の蛍光分析法により求めることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
なお、実施例で用いたシリカゲルのＢＥＴ比表面積は、MICROMETRICS社製「流動式比表面積自動測定装置 Flow Sorb 2300」を用いて一点法により測定した。
細孔容積は、MICROMETRICS社製社製「自動ポロシメーター オートポアIII 9420」を用いて細孔半径０．００１μｍ〜１００μｍの範囲の細孔容積として求めた。
【００４４】
実施例１
〔模擬絶縁油の調製〕
ＰＣＢ類を含まない市販の絶縁油に、添加後のＰＣＢ類含有量が０．１ｐｐｍとなるように市販の標準ＰＣＢ類を加えて、模擬絶縁油１を調製した。
【００４５】
〔発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルの作製〕
ＢＥＴ比表面積２５２ｍ2／ｇ、細孔容積２．５８ｃｍ2／ｇのシリカゲルを２５０℃で一晩乾燥させた。このシリカゲル１質量部に、遊離ＳＯ3濃度２５質量％の発煙硫酸〔和光純薬工業社製、試薬一級〕２質量部を天秤ではかりとって加え、密栓容器中で２０分間以上振とうして、内容物を十分に混合して、発煙硫酸含浸シリカゲルを調製した。この発煙硫酸含浸シリカゲルは、互いに固着していない流動性の粉末状であった。この発煙硫酸含浸シリカゲル２ｇを、一端を溶封した内径５ｍｍ、長さ１４６ｍｍのガラス管に投入し、開口部を溶封して発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルを作製した。
【００４６】
〔模擬絶縁油の前処理〕
容量１０ｍＬのポリプロピレン製ディスポシリンジをカラムとして用い、その底部にガラス繊維ろ紙〔ADVANTEC社製、ＧＡ−１００〕を敷き、シリカゲル〔和光純薬工業社製、「ワコーゲルＤＸ」〕０．５ｇを充填した。
【００４７】
次に、上記で作製した発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルの一端をアンプルカッターで切断、開封し、発煙硫酸含浸シリカゲルの全量をアンプルから流出させてシリカゲルの上部に積層した。さらに、無水硫酸ナトリウム〔和光純薬工業社製、「残留農薬試験用」〕０．５ｇを充填して、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを調製した。
【００４８】
このカラムに、上から、上記で調製した模擬絶縁油１（２９５μＬ、０．２５ｇ）を加え、その後、ｎ−ヘキサン〔和光純薬工業社製、「ダイオキシン類測定用」〕２００μＬを上から加え、５分間静置した。この間、カラムに加えた模擬絶縁油１およびｎ−ヘキサンは、すべてカラム内に保持されていた。
【００４９】
その後、さらにｎ−ヘキサン〔和光純薬工業社製、「ダイオキシン類測定用」〕１５ｍＬを上から加えたのち、シリンジの底部から流出液として抜出して、内容積３０ｍＬのナスフラスコに回収した。
【００５０】
〔ジメチルスルホキシドへの転溶〕
上記で回収した流出液の全量に、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕０．２５ｍＬを加えたのち、ロータリーエバポレーターにより、減圧下、３０℃の温浴中で、ｎ−ヘキサンが留出しなくなるまで濃縮し、次いで残渣を５分間遠心分離することによりｎ−ヘキサン層（上層）とジメチルスルホキシド層（下層）との２層に層分離させ、分液操作によりジメチルスルホキシド層（下層）を取り出して、ジメチルスルホキシド試料を得た。
【００５１】
〔緩衝水溶液の調製〕
塩化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、残留農薬試験用〕８．０ｇ、
リン酸水素二ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕２．９ｇ、
塩化カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕２．０ｇ、
リン酸二水素カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕０．２ｇ、
アジ化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕０．１ｇおよび
牛血清アルブミン〔SIGMA社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１．０ｇをイオン交換水１Ｌに溶解して緩衝水溶液を調製した。
【００５２】
〔１次抗体の調製〕
ＰＲＭＩ１６４０培地〔Invitrogen社製〕７８質量部にＨＡＴ混合物〔「ＨＡＴサプリメント」Invitorogen社製、ヒポキサンチン５ミリモル／Ｌ、アミノプテリン２０マイクロモル／Ｌ、チミジン０．８ミリモル／Ｌを含む〕２質量部および牛胎児血清２０質量部を加えて調製したＨＡＴ培地にて、３７℃、ＣＯ2５容量％と空気９５容量％との混合雰囲気下に、細胞の密度が１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達するまで、抗体産生細胞〔独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託、微生物寄託番号：FERM P-20744〕を培養した。
【００５３】
次いで、プロテインＡを固定した樹脂〔「アフイゲルプロテインＡ」日本バイオ・ラッド社製〕１ｍＬを充填したカラムに、上記で培養して得た培養液の上清１０ｍＬを流した後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液〔濃度１モル／Ｌ、ｐＨ３．０〕３ｍＬを加えて抗体を溶出させ、得られた溶出液３ｍＬを、脱塩カラム〔「エコノパック１０ＤＧカラム」日本バイオ・ラッド社〕を用いてリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ緩衝液〕に置換して、１次抗体含有ＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５４】
〔１次抗体水溶液および測定試料の調製〕
上記で調製した緩衝水溶液に、上記で得た１次抗体含有ＰＢＳ緩衝液を、１次抗体の濃度が１．０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように加え、溶解させて１次抗体水溶液を調製した。
上記で得たジメチルスルホキシド試料４０μＬに、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕４０μＬを加え、次いで上記で調製した緩衝水溶液３．１２ｍＬを加え、、さらに１次抗体水溶液０．４ｍＬを加えて、測定試料を調製した。
【００５５】
〔２次抗体水溶液の調製〕
２次抗体〔「Ｃｙ５標識モノクローナル ヤギ抗マウス抗体」生化学工業製〕を２．０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように上記緩衝水溶液に溶解して、２次抗体水溶液を調製した。
【００５６】
〔抗原固定化担体の調製〕
式（１）
で示されるジクロロベンゼン誘導体（ハプテン抗原）１ｇをジメチルスルホキシド１ｍＬと混合し、さらにメタノール１００ｍＬを加えて混合した。得られた溶液から１６ｍＬを採取し、濃度１質量％の牛血清アルブミン水溶液〔ＳＩＧＭＡ社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１０ｍＬを加え、生理食塩水〔滅菌した食塩水であり、１００ｍＬ中にＮａＣｌ約０．９ｇを含む〕７４ｍＬを加えて一晩、振盪した。振盪後の溶液１ｍＬを採取し、ビーズ状の担体〔アガロースビーズ、NHS-activatedSepharoseTM ４ fast flow、Amercham Bosciences社製、粒子径約０．１ｍｍ〕を容積で５ｍＬ加え、さらに生理食塩水１０ｍＬを加えて２時間振盪した。その後、濃度１０質量％の牛血清アルブミン水溶液〔ＳＩＧＭＡ社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１ｍＬを加えて、さらに２時間振盪したのち、担体を取り出し、生理食塩水で洗浄して、ジクロロベンゼン誘導体を担体に固定化した抗原固定化担体を得た。
【００５７】
〔イムノアッセイ工程〕
透明管からなり、出口側に篩が設けられた測定セル（内容積１．８μｍ3）を備えた蛍光強度測定装置〔米国Sapidyne社製、「KinExA3000」〕を用意した。
【００５８】
上記で得た抗原固定化担体を、上記で調製した緩衝水溶液３０ｍＬに懸濁させて懸濁液とし、上記測定セルの入口側から送液することにより、懸濁液中の抗原固定化担体を測定セル出口側の篩にせき止め、これにより測定セルの内部に抗原固定化担体を充填した。
上記で得た測定試料１．０ｍＬを流速０．２５ｍＬ／分で、測定セルに送液して通過させた。
【００５９】
次いで、上記で調製した２次抗体水溶液１．０ｍＬを流速０．２５ｍＬ／分で測定セルに送液して通過させた。
【００６０】
その後、測定セルに紫外線を照射し、発生した蛍光をフォトダイオードによって信号強度として測定した。結果を第１表に示す。また、上記の操作を更に２回繰り返し行い、蛍光強度に基づく信号強度の標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を求めた。結果を第１表に併せて示す。
【００６１】
実施例２
実施例１で用いたと同じ市販の絶縁油に、添加後のＰＣＢ類含有量が、それぞれ０．５ｐｐｍ〔模擬絶縁油２〕、１ｐｐｍ〔模擬絶縁油３〕、２ｐｐｍ〔模擬絶縁油４〕、１０ｐｐｍ〔模擬絶縁油５〕となるように市販の標準ＰＣＢ類を加えた以外は実施例１と同様に操作して模擬絶縁油２〜模擬絶縁油５を調製した。また、実施例１で用いたと同じ市販の絶縁油をそのまま模擬絶縁油０とした。
【００６２】
模擬絶縁油１に代えて、上記で得た模擬絶縁油２〜模擬絶縁油５および模擬絶縁油０を用いた以外は実施例１と同様に操作して蛍光強度に基づく信号強度を測定した。結果を第１表に示す。
【００６３】
第 １ 表
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
模擬絶縁油 ＰＣＢ類濃度 信号強度 ＣＶ ＳＤ
番号 （ｐｐｍ） （Ｖ） (％)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
１ ０．１ １．７４ １．７７ １．７９ １．４ ０．０２５
２ ０．５ １．０６ ０．９４ １．１０ ８．１ ０．０８３
３ １ ０．７４ ０．７５ ０．７８ ２．８ ０．０２１
４ ２ ０．４２ ０．４１ ０．４３ ２．４ ０．０１０
５ １０ ０．１９ ０．１９ ０．２０ ３．０ ０．００６
───────────────────────────────────────
０ ０ ２．０７ ２．０６ ２．０６ ０．３ ０．００６
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類の分析方法に関し、詳しくは疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量しうる分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスなどに使用されている絶縁油などの疎水性試料に含まれるポリ塩化ビフェニル類〔以下、ＰＣＢ類と略称することがある。〕を定量するに際しては、ＰＣＢ類の定量に妨害となる共存物質を予め除去することが必要であるが、このような共存物質には、カラムクロマトグラフ処理などの通常の処理方法だけでは分離が困難なものもある。このため、非特許文献１〔平成１２年１２月２８日厚生省告示第６３３号で改正された平成４年７月３日厚生省告示第１９２号の別表第二「特別管理一般廃棄物及び特別管理産業廃棄物に係る基準の検定方法」〕に記載された、いわゆる公定法では、疎水性試料を濃硫酸と液−液接触させて処理する操作を繰り返したのちに、共存物質を上記カラムクロマトグラフ処理などの処理方法により除去する方法が開示されており、濃硫酸に代えて遊離ＳＯ3濃度２５質量％の発煙硫酸を用いて疎水性試料を処理する方法も知られている。かかる処理方法によれば、疎水性試料に含まれる分離困難な妨害物質を除去することができる。濃硫酸または発煙硫酸と液−液接触させたのちの疎水性試料は、分液操作により濃硫酸または発煙硫酸から分離される。
【０００３】
しかし、液−液接触させたのちの疎水性試料を濃硫酸または発煙硫酸から分離する操作を繰り返すことは煩雑である。
【０００４】
一方、比較的短時間で、簡便に、妨害物質を除去しうる方法としては、疎水性試料を、珪藻土に濃硫酸単独を含浸させた濃硫酸含浸担体と接触させる方法が知られており、特許文献１〔特開２００１−１１６７２３号公報第９頁の段落番号００８２〕には、この濃硫酸含浸担体を充填したカラムに、疎水性試料を通過させたのちに、シリカゲルカラムクロマトグラフ処理を行うことにより、妨害物質の除去を図っている。
【０００５】
しかし、濃硫酸単独を用いる従来の分解方法では、ＰＣＢ類との分離が困難な妨害物質を十分に除去することができないという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】平成１２年１２月２８日厚生省告示第６３３号で改正された平成４年７月３日厚生省告示第１９２号の別表第二「特別管理一般廃棄物及び特別管理産業廃棄物に係る基準の検定方法」
【特許文献１】特開２００１−１１６７２３号公報第９頁の段落番号００８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明者らは、疎水性試料に含まれ、ＰＣＢ類の定量に妨害となる共存物質を、簡便な操作で、十分に除去して、ＰＣＢ類を定量しうる方法を開発するべく鋭意検討した結果、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、ポリ塩化ビフェニル類を含む疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量するに際し、
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法を提供するものである。
【０００９】
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５質量％〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、遊離ＳＯ3濃度５〜４０質量％の発煙硫酸を用いるので、疎水性試料に含まれる上記妨害物質を十分に除去することができることから、ＰＣＢ類と抗体とのイムノアッセイでの共存物質による妨害を解消することができ、これによりＰＣＢ類を正確に定量できる。また、この発煙硫酸はシリカゲルに含浸されているので、従来の技術のような煩雑な分液操作を必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法に適用される疎水性試料は、疎水性の液体試料であって、例えばトランス、コンデンサーなどの電気機器に絶縁、冷却などのために封入されて使用される絶縁油、該絶縁油を分解処理して得られる分解処理油などの油性試料が挙げられる。かかる油性試料は希釈されることなくそのまま用いられてもよいし、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサンなどのような疎水性溶媒で希釈されて用いられてもよい。
【００１２】
また、疎水性試料としては、例えば焼却炉から排出される煤塵、燃え殻、土壌から採取される土質試料などの固形試料、雨水、排水などの水質試料などから、ｎ−ヘキサン、トルエンなどのような疎水性溶媒により抽出されたＰＣＢ類を含む疎水性溶液も挙げられる。
【００１３】
固形試料や水質試料から疎水性溶媒によりＰＣＢ類を抽出するには、例えば固形試料または水質試料を上記のような疎水性溶媒と接触させればよい。
【００１４】
固形試料または水質試料から疎水性溶媒によりＰＣＢ類を抽出することにより得られた疎水性溶媒抽出液は、そのまま疎水性試料として用いてもよいが、通常は、ＰＣＢ類と共に抽出される他の共存物質を分離するために、ｎ−ヘキサン、トルエンなどの疎水性溶媒抽出液からＰＣＢ類を極性有機溶媒でさらに抽出し、得られた極性有機溶媒抽出液からＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させる。かかる極性有機溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノール、ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。極性有機溶媒抽出液から疎水性溶媒に転溶させるには、例えば極性有機溶媒抽出液に水を加えたのち、疎水性溶媒により抽出すればよい。
【００１５】
本発明の方法において前処理工程で用いる発煙硫酸含浸シリカゲルは、シリカゲルに発煙硫酸が含浸されてなるものである。
【００１６】
シリカゲルとしては、ＢＥＴ比表面積が２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、好ましくは２５０ｍ2／ｇ〜３５０ｍ2／ｇであり、細孔容積が１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇ、好ましくは１．６ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのものが用いられる。
【００１７】
発煙硫酸は、濃硫酸に三酸化硫黄〔ＳＯ3〕ガスを吸収させたものであり、その遊離ＳＯ3濃度は、ＪＩＳ Ｋ８７４１に従って測定される。一般に市販されている発煙硫酸の遊離ＳＯ3濃度は１０質量％〜６０質量％であるので、本発明で規定する遊離ＳＯ3濃度の発煙硫酸は、例えば市販の発煙硫酸に、濃硫酸、すなわちＨ2ＳＯ4濃度９８質量％以上の硫酸を加えて希釈する方法、市販の発煙硫酸または濃硫酸に三酸化硫黄ガスを吹き込んで吸収させる方法などにより調製することができる。
【００１８】
発煙硫酸の遊離ＳＯ3濃度は、妨害物質を十分に除去しうる点で、５質量％以上、好ましくは１５質量％以上であり、ＰＣＢ類を精度よく定量できる点で、４０質量％以下、好ましくは３０質量％以下である。
【００１９】
かかる発煙硫酸のシリカゲルに対する含浸量は、シリカゲルに含浸されて保持されうる量であればよく、通常は、シリカゲルに対して０．５質量倍〜５質量倍であるが、含浸された発煙硫酸がほとんど滲み出さず、また粒子同士が互いに粘着せず、粉末状で流動性の発煙硫酸シリカゲルとなって取扱いが容易である点で、２．５質量倍以下であることが好ましい。
【００２０】
疎水性試料と発煙硫酸含浸シリカゲルとの接触は、通常、疎水性試料を、カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させることにより行われ、代表的には、疎水性試料を、発煙硫酸含浸シリカゲルが充填されたカラムを通過させることにより行われる。
【００２１】
また、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムは、カラムに、前記のシリカゲルを充填したのち、上述の発煙硫酸を加えることにより調製することもできる。
【００２２】
より具体的な使用形態としては、あらかじめ前記発煙硫酸含浸シリカゲルを携帯密封容器に収容しておき、使用時にこれを開封し、該発煙硫酸含浸シリカゲルをカラムに充填し、当該カラムを通過させることにより、該疎水性試料を処理する形態が挙げられる。かかる使用形態によれば、発煙硫酸含浸シリカゲルが携帯密封容器に収容されているために、分析対象となる疎水性試料の採取現場においても容易に前処理し得ることから好ましい。
【００２３】
発煙硫酸含浸シリカゲルが収容される携帯密封容器としては、発煙硫酸に対して不活性であり、当該シリカゲルを密封し得るものが挙げられる。
【００２４】
かかる容器としては、その内面がガラスライニング、フッ素樹脂加工になどによりコーティングされているシリンダー型の密封容器、アンプルなどが挙げられ、入手が容易であり、また軽量で取り扱いが容易である点で、アンプルが好ましい。
【００２５】
アンプルとしては、通常は内容物の確認が容易で、開封が容易である点で、ガラス製のものが用いられる。
【００２６】
密封アンプルは、上記の発煙硫酸含浸シリカゲルがアンプルに密封されてなるものであり、例えば投入口が開いたアンプルに、前記シリカゲルおよび発煙硫酸を投入し、投入口を封止することにより調製することができる。前記シリカゲルおよび発煙硫酸は、あらかじめ混合されていてもよいし、アンプルに投入されたのち、アンプルを振とうすることにより撹拌して混合してもよい。
【００２７】
かくして得られる発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルを開封し、密封されていた発煙硫酸含浸担体をカラムに充填するには、通常の方法でアンプルを開封したのち、内部の発煙硫酸含浸担体をカラムに移し替えればよい。
【００２８】
前記のシリカゲルに、このシリカゲルに対して２．５質量倍以下の上述の発煙硫酸が含浸されてなる発煙硫酸含浸シリカゲルは、流動性の粉末状であるので、アンプルからカラムへの移し替えが容易である点で、好ましい。
【００２９】
疎水性試料を発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる際の接触温度は、通常０℃〜５０℃程度である。接触時間は、通常１分〜２０分程度であり、精度が優れ効率的に測定できる点で、３分〜１０分が好ましい。
【００３０】
疎水性試料の粘度によっては、そのままでは発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを通過させることが困難な場合もあるが、このような場合には、適宜、疎水性試料を、例えばｎ−ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの疎水性溶媒で希釈することにより粘度を下げて用いてもよいし、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムに疎水性試料を戴置したのち、さらに疎水性溶媒を流下させることにより希釈させながら通過させてもよい。
【００３１】
疎水性溶媒試料は、あらかじめ脱水されていることが好ましい。脱水させるには、例えば乾燥剤と接触させればよく、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムとして、その上流側にさらに乾燥剤を充填した発煙硫酸含浸シリカゲル層と乾燥剤層との２層構成のカラムを用い、疎水性試料が、この乾燥剤層を通過することにより脱水されてから、発煙硫酸含浸シリカゲル層を通過するように構成してもよいし、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムの上流側に乾燥剤を充填した乾燥剤カラムを接続して、疎水性試料が、乾燥剤カラムを通過したのちに、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを通過するように構成してもよい。乾燥剤として通常は、無水硫酸ナトリウムなどのような発煙硫酸および濃硫酸に対して不活性な乾燥剤が用いられる。
【００３２】
このようにして発煙硫酸含浸シリカゲルと接触したのちの疎水性試料を、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフ処理することにより、妨害物質を除去することができる。シリカゲルカラムクロマトグラフ処理には、通常、カラムにシリカゲルが充填されたシリカゲルカラムが用いられ、通常は、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムの下流側に接続されて用いられる。
【００３３】
このような処理操作を施したのちの疎水性試料は、必要に応じて、例えば溶媒留去などの
方法により濃縮されてもよい。また、通常は、該疎水性試料からＰＣＢ類をジメチルスルホキシド、アセトンなどの極性有機溶媒に転溶させる。極性有機溶媒に転溶させる方法としては、例えば疎水性試料を溶媒留去し、残渣に上記の極性有機溶媒に加えて溶解させる方法が挙げられるが、疎水性試料に残存する他の共存物質のうち、極性有機溶媒に不溶のものをＰＣＢ類と分離し、除去できることから、疎水性試料に対して不溶性の極性有機溶媒を加え、疎水性溶媒層と極性有機溶媒層との２層に層分離させたのち、分液により親水性溶媒層を得る方法が好ましく用いられ、分液前に溶媒留去などの方法により疎水性試料を濃縮してから分液してもよい。
【００３４】
なお、上記の処理操作ののち、疎水性試料に残存する他の共存物質は、必要に応じて更に、通常のカラムクロマトグラフ法などの精製処理を付することにより、除去することができる。
【００３５】
例えば上記他の共存物質のうち親油性のものは、疎水性試料に含まれるＰＣＢ類を極性有機溶媒で抽出し、得られた極性溶媒抽出液を、親油性吸着剤を充填剤とするカラムクロマトグラフ処理することにより、ＰＣＢ類と分離することができる。
極性有機溶媒としては、上記したと同様のものが挙げられる。親油性吸着剤とは、少なくとも表面が油性の物質と親和性のある材料で構成された固形の吸着剤であって、通常は粒状のものが用いられる。かかる親油性吸着剤としては、例えばカラムクロマトグラフ用充填剤、固相抽出用充填剤、逆相液体クロマトグラフィーのカラム充填剤として広く用いられているものが挙げられ、例えばジーエルサイエンス社からカラムクロマト充填剤「Ｃ１８」、米国ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社から「ＳＥＰ−ＰＡＫ−Ｃ１８」、「ＳＥＰ−ＰＡＫ−ｔＣ１８」、「ＳＥＰ−ＰＡＫ−Ｖａｃ ｔＣ１８」などの商品名で市販されているものを用いることができる。
【００３６】
カラムクロマトグラフ処理は、例えば親油性吸着剤を充填したカラムを用い、極性有機溶媒抽出液を流下液として用いることにより行われる。流下後の極性溶媒抽出液は、必要に応じて濃縮してもよい。
【００３７】
親油性吸着剤によりカラムクロマトグラフ処理したのちの極性有機溶媒抽出液に、他の共存物質として親水性のものが含まれる場合には、例えば極性有機溶媒抽出液に含まれるＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させた転溶液を、多層シリカゲルカラムクロマトグラフ処理することにより、ＰＣＢ類から分離することができる。
【００３８】
極性有機溶媒抽出液に含まれるＰＣＢ類を疎水性溶媒に転溶させるには、例えば極性有機溶媒抽出液に水を加えたのち、疎水性溶媒で抽出すればよい。多層シリカゲルカラムクロマトグラフ処理は、例えばカラムに無処理のシリカゲル、水酸化カリウム被覆シリカゲル、硫酸被覆シリカゲルなどのシリカゲル充填剤が充填された多層構成の多層シリカゲルカラムに転溶液を通過させることにより行われる。通過後の転溶液は、溶媒留去などの方法により濃縮してもよい。
【００３９】
かかる前処理を施した後、ＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程により、ＰＣＢ類を分析する。
【００４０】
このようなＰＣＢ類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程は特に制限されるものではなく、適宜公知の方法を採用し得るが、例えば
(1)前処理工程で得られるＰＣＢ類に、該ＰＣＢ類に対する１次抗体を過剰量加えて混合することにより、当該１次抗体を抗原抗体反応により該ＰＣＢ類と結合させたのち、
(2)該１次抗体との抗原抗体反応能力を有し、蛍光物質で標識化された標識化２次抗体を過剰量加えて混合し、ＰＣＢ類の類似化合物であるハプテン抗原が担体に固定化された抗原固定化担体と接触させることにより、上記でＰＣＢ類と結合しなかった過剰分の１次抗体を抗原固定化担体のハプテン抗原に結合させると共に、この結合した１次抗体に標識化２次抗体を結合させ、
次いで、
(3)このようにして１次抗体を介して抗原固定化担体に担持され標識化２次抗体の担持量を求めればよい。
【００４１】
この方法によれば、ＰＣＢ類の含有量が多い場合には、抗原固定化担体への標識化２次抗体の担持量が少なくなり、ＰＣＢ類の含有量が少ない場合には、標識化２次抗体の担持量が多くなるので、抗原固定化担体への標識化２次抗体の担持量を求めることにより、ＰＣＢ類の含有量を求めることができる。標識化２次抗体の担持量は、担持後の抗原固定化担体に紫外線などを照射して蛍光強度を測定する通常の蛍光分析法により求めることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
なお、実施例で用いたシリカゲルのＢＥＴ比表面積は、MICROMETRICS社製「流動式比表面積自動測定装置 Flow Sorb 2300」を用いて一点法により測定した。
細孔容積は、MICROMETRICS社製社製「自動ポロシメーター オートポアIII 9420」を用いて細孔半径０．００１μｍ〜１００μｍの範囲の細孔容積として求めた。
【００４４】
実施例１
〔模擬絶縁油の調製〕
ＰＣＢ類を含まない市販の絶縁油に、添加後のＰＣＢ類含有量が０．１ｐｐｍとなるように市販の標準ＰＣＢ類を加えて、模擬絶縁油１を調製した。
【００４５】
〔発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルの作製〕
ＢＥＴ比表面積２５２ｍ2／ｇ、細孔容積２．５８ｃｍ2／ｇのシリカゲルを２５０℃で一晩乾燥させた。このシリカゲル１質量部に、遊離ＳＯ3濃度２５質量％の発煙硫酸〔和光純薬工業社製、試薬一級〕２質量部を天秤ではかりとって加え、密栓容器中で２０分間以上振とうして、内容物を十分に混合して、発煙硫酸含浸シリカゲルを調製した。この発煙硫酸含浸シリカゲルは、互いに固着していない流動性の粉末状であった。この発煙硫酸含浸シリカゲル２ｇを、一端を溶封した内径５ｍｍ、長さ１４６ｍｍのガラス管に投入し、開口部を溶封して発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルを作製した。
【００４６】
〔模擬絶縁油の前処理〕
容量１０ｍＬのポリプロピレン製ディスポシリンジをカラムとして用い、その底部にガラス繊維ろ紙〔ADVANTEC社製、ＧＡ−１００〕を敷き、シリカゲル〔和光純薬工業社製、「ワコーゲルＤＸ」〕０．５ｇを充填した。
【００４７】
次に、上記で作製した発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルの一端をアンプルカッターで切断、開封し、発煙硫酸含浸シリカゲルの全量をアンプルから流出させてシリカゲルの上部に積層した。さらに、無水硫酸ナトリウム〔和光純薬工業社製、「残留農薬試験用」〕０．５ｇを充填して、発煙硫酸含浸シリカゲルカラムを調製した。
【００４８】
このカラムに、上から、上記で調製した模擬絶縁油１（２９５μＬ、０．２５ｇ）を加え、その後、ｎ−ヘキサン〔和光純薬工業社製、「ダイオキシン類測定用」〕２００μＬを上から加え、５分間静置した。この間、カラムに加えた模擬絶縁油１およびｎ−ヘキサンは、すべてカラム内に保持されていた。
【００４９】
その後、さらにｎ−ヘキサン〔和光純薬工業社製、「ダイオキシン類測定用」〕１５ｍＬを上から加えたのち、シリンジの底部から流出液として抜出して、内容積３０ｍＬのナスフラスコに回収した。
【００５０】
〔ジメチルスルホキシドへの転溶〕
上記で回収した流出液の全量に、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕０．２５ｍＬを加えたのち、ロータリーエバポレーターにより、減圧下、３０℃の温浴中で、ｎ−ヘキサンが留出しなくなるまで濃縮し、次いで残渣を５分間遠心分離することによりｎ−ヘキサン層（上層）とジメチルスルホキシド層（下層）との２層に層分離させ、分液操作によりジメチルスルホキシド層（下層）を取り出して、ジメチルスルホキシド試料を得た。
【００５１】
〔緩衝水溶液の調製〕
塩化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、残留農薬試験用〕８．０ｇ、
リン酸水素二ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕２．９ｇ、
塩化カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕２．０ｇ、
リン酸二水素カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕０．２ｇ、
アジ化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕０．１ｇおよび
牛血清アルブミン〔SIGMA社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１．０ｇをイオン交換水１Ｌに溶解して緩衝水溶液を調製した。
【００５２】
〔１次抗体の調製〕
ＰＲＭＩ１６４０培地〔Invitrogen社製〕７８質量部にＨＡＴ混合物〔「ＨＡＴサプリメント」Invitorogen社製、ヒポキサンチン５ミリモル／Ｌ、アミノプテリン２０マイクロモル／Ｌ、チミジン０．８ミリモル／Ｌを含む〕２質量部および牛胎児血清２０質量部を加えて調製したＨＡＴ培地にて、３７℃、ＣＯ2５容量％と空気９５容量％との混合雰囲気下に、細胞の密度が１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達するまで、抗体産生細胞〔独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託、微生物寄託番号：FERM P-20744〕を培養した。
【００５３】
次いで、プロテインＡを固定した樹脂〔「アフイゲルプロテインＡ」日本バイオ・ラッド社製〕１ｍＬを充填したカラムに、上記で培養して得た培養液の上清１０ｍＬを流した後、０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液〔濃度１モル／Ｌ、ｐＨ３．０〕３ｍＬを加えて抗体を溶出させ、得られた溶出液３ｍＬを、脱塩カラム〔「エコノパック１０ＤＧカラム」日本バイオ・ラッド社〕を用いてリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ緩衝液〕に置換して、１次抗体含有ＰＢＳ緩衝液を得た。
【００５４】
〔１次抗体水溶液および測定試料の調製〕
上記で調製した緩衝水溶液に、上記で得た１次抗体含有ＰＢＳ緩衝液を、１次抗体の濃度が１．０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように加え、溶解させて１次抗体水溶液を調製した。
上記で得たジメチルスルホキシド試料４０μＬに、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕４０μＬを加え、次いで上記で調製した緩衝水溶液３．１２ｍＬを加え、、さらに１次抗体水溶液０．４ｍＬを加えて、測定試料を調製した。
【００５５】
〔２次抗体水溶液の調製〕
２次抗体〔「Ｃｙ５標識モノクローナル ヤギ抗マウス抗体」生化学工業製〕を２．０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように上記緩衝水溶液に溶解して、２次抗体水溶液を調製した。
【００５６】
〔抗原固定化担体の調製〕
式（１）
で示されるジクロロベンゼン誘導体（ハプテン抗原）１ｇをジメチルスルホキシド１ｍＬと混合し、さらにメタノール１００ｍＬを加えて混合した。得られた溶液から１６ｍＬを採取し、濃度１質量％の牛血清アルブミン水溶液〔ＳＩＧＭＡ社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１０ｍＬを加え、生理食塩水〔滅菌した食塩水であり、１００ｍＬ中にＮａＣｌ約０．９ｇを含む〕７４ｍＬを加えて一晩、振盪した。振盪後の溶液１ｍＬを採取し、ビーズ状の担体〔アガロースビーズ、NHS-activatedSepharoseTM ４ fast flow、Amercham Bosciences社製、粒子径約０．１ｍｍ〕を容積で５ｍＬ加え、さらに生理食塩水１０ｍＬを加えて２時間振盪した。その後、濃度１０質量％の牛血清アルブミン水溶液〔ＳＩＧＭＡ社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕１ｍＬを加えて、さらに２時間振盪したのち、担体を取り出し、生理食塩水で洗浄して、ジクロロベンゼン誘導体を担体に固定化した抗原固定化担体を得た。
【００５７】
〔イムノアッセイ工程〕
透明管からなり、出口側に篩が設けられた測定セル（内容積１．８μｍ3）を備えた蛍光強度測定装置〔米国Sapidyne社製、「KinExA3000」〕を用意した。
【００５８】
上記で得た抗原固定化担体を、上記で調製した緩衝水溶液３０ｍＬに懸濁させて懸濁液とし、上記測定セルの入口側から送液することにより、懸濁液中の抗原固定化担体を測定セル出口側の篩にせき止め、これにより測定セルの内部に抗原固定化担体を充填した。
上記で得た測定試料１．０ｍＬを流速０．２５ｍＬ／分で、測定セルに送液して通過させた。
【００５９】
次いで、上記で調製した２次抗体水溶液１．０ｍＬを流速０．２５ｍＬ／分で測定セルに送液して通過させた。
【００６０】
その後、測定セルに紫外線を照射し、発生した蛍光をフォトダイオードによって信号強度として測定した。結果を第１表に示す。また、上記の操作を更に２回繰り返し行い、蛍光強度に基づく信号強度の標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を求めた。結果を第１表に併せて示す。
【００６１】
実施例２
実施例１で用いたと同じ市販の絶縁油に、添加後のＰＣＢ類含有量が、それぞれ０．５ｐｐｍ〔模擬絶縁油２〕、１ｐｐｍ〔模擬絶縁油３〕、２ｐｐｍ〔模擬絶縁油４〕、１０ｐｐｍ〔模擬絶縁油５〕となるように市販の標準ＰＣＢ類を加えた以外は実施例１と同様に操作して模擬絶縁油２〜模擬絶縁油５を調製した。また、実施例１で用いたと同じ市販の絶縁油をそのまま模擬絶縁油０とした。
【００６２】
模擬絶縁油１に代えて、上記で得た模擬絶縁油２〜模擬絶縁油５および模擬絶縁油０を用いた以外は実施例１と同様に操作して蛍光強度に基づく信号強度を測定した。結果を第１表に示す。
【００６３】
第 １ 表
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模擬絶縁油 ＰＣＢ類濃度 信号強度 ＣＶ ＳＤ
番号 （ｐｐｍ） （Ｖ） (％)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
１ ０．１ １．７４ １．７７ １．７９ １．４ ０．０２５
２ ０．５ １．０６ ０．９４ １．１０ ８．１ ０．０８３
３ １ ０．７４ ０．７５ ０．７８ ２．８ ０．０２１
４ ２ ０．４２ ０．４１ ０．４３ ２．４ ０．０１０
５ １０ ０．１９ ０．１９ ０．２０ ３．０ ０．００６
───────────────────────────────────────
０ ０ ２．０７ ２．０６ ２．０６ ０．３ ０．００６
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ塩化ビフェニル類を含む疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量するに際し、
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法。
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５質量％〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【請求項２】
発煙硫酸含浸量が、前記シリカゲルに対して０．５質量倍〜５質量倍である請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる請求項１または請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記発煙硫酸含浸シリカゲルが収容されてなる携帯密封容器を開封し、該発煙硫酸含浸シリカゲルをカラムに充填する請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
携帯密封容器がアンプルである請求項４に記載の分析方法。
【請求項１】
ポリ塩化ビフェニル類を含む疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量するに際し、
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法。
発煙硫酸含浸シリカゲル：ＢＥＴ比表面積２５０ｍ2／ｇ〜４５０ｍ2／ｇ、細孔容積１．４ｃｍ3／ｇ〜２．６ｃｍ3／ｇのシリカゲルに遊離ＳＯ3濃度５質量％〜４０質量％の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル
【請求項２】
発煙硫酸含浸量が、前記シリカゲルに対して０．５質量倍〜５質量倍である請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる請求項１または請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記発煙硫酸含浸シリカゲルが収容されてなる携帯密封容器を開封し、該発煙硫酸含浸シリカゲルをカラムに充填する請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
携帯密封容器がアンプルである請求項４に記載の分析方法。
【公開番号】特開２００７−２９８３１８（Ｐ２００７−２９８３１８Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２４９２５（Ｐ２００６−１２４９２５）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【出願人】（３９００００６８６）株式会社住化分析センター (72)
【Ｆターム（参考）】
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