マイクロチップ、マスターチップ
【課題】複数の液体導入口より導入された濃度の異なる溶液を複数の分岐点と合流点を有する微小流路網において分配と混合を繰り返して溶液の濃度を多段階に調整するマイクロチップに関して、送液の一時停止時や、送液の液流の速度が非常に遅い場合でも、所望の濃度プロファイルを安定に維持できる技術の開発。
【解決手段】液体混合用の主流路２４（混合部）同士を、この主流路２４よりも流路断面積が小さい接続流路２５によって接続したマイクロチップ１、このマイクロチップ１の樹脂成形用のマスターチップを提供する。
【解決手段】液体混合用の主流路２４（混合部）同士を、この主流路２４よりも流路断面積が小さい接続流路２５によって接続したマイクロチップ１、このマイクロチップ１の樹脂成形用のマスターチップを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料の分析等に用いられるマイクロチップに係り、特に、複数の液体導入口より導入された濃度の異なる溶液を複数の分岐点と合流点を有する微小流路網において分配と混合を繰り返して溶液の濃度を多段階に調整するマイクロチップ、該マイクロチップの作成用のマスターチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞アッセイを行うためのマイクロチップは、従来のマイクロウエルプレートと比べて高い集積度を実現できる分析方法として期待されている。発明者らが公開している非特許文献１やアメリカのグループの公開している非特許文献２では複数の薬剤の細胞毒性を一度に試験することのできるマイクロチップが記載されている。
一方、一般的に細胞毒性試験を行うにあたっては、非特許文献３に記載されているように広範な濃度範囲での試験を行う必要がある。しかしながら、マイクロチップで取り扱う液体は数ナノリットルのオーダーであり、このような微量の液体を正確に秤量して希釈するのは非常に困難である。
このような問題を解決するために、分岐と合流を繰り返す微小流路網を用いて、濃度の異なる複数の液体の流れを作り出す方法が知られている（例えば、非特許文献４）。
また、この原理に基づき、流路網のデザインを工夫することにより、複雑な様々な濃度プロファイルの溶液を調整する方法が報告されている（例えば、非特許文献５−８）。
【０００３】
一般的にこれらの方法では流路網を形成する各流路の流路抵抗を適切に設定し、液体導入口よりシリンジポンプ等を用いて適切な流量で液体を導入することにより、濃度の異なる液体同士を分岐点において適切な比率で分配し、混合部において適切な比率で混合することを可能とし、最下流に存在する液体排出口において望みの濃度の液体を得ることができる。しかしながら、このような分岐点における適切な分配と混合部における適切な混合は、あらかじめ設定された流量で液体導入口より液体を導入している状態においてのみ実現するため、シリンジポンプ内の液が不足し、液体導入口の流量が著しく下がった際に望みの濃度の液体を得ることができない。このことは、多段階の濃度プロファイルを持つ細胞培養用培養液を微量流路網で調整し、その下流で長期間細胞を培養する細胞培養チップに応用する場合に大きな問題となる。つまり、長期間細胞を培養するためにはシリンジポンプ等に適宜培養液を補充する必要があるが、培養液を補充する際に液体の流れが止まると、溶質が拡散によって微小流路内を移動してしまい、各流路の溶質濃度が変化してしまうという問題がある。このことは微量の溶質に短時間暴露されるだけで細胞の状態が変化してしまう細胞毒性試験チップにおいては致命的な問題となる。
また、これらの方法とは異なるが、類似した方法として、分岐と合流を一段階だけ行って多段の濃度プロファイルを作成する方法も報告されている（例えば、非特許文献９−１１）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では濃度が三桁以上異なる濃度プロファイルを作製することは難しい。一般的な細胞毒性試験に適したマイクロチップのための濃度範囲が数桁に及ぶ多段階の濃度プロファイルを作製するためには分岐と合流を繰り返す構造の利用が望ましい。
さらに、これらの方法とは異なるが、類似した方法として、拡散現象を利用した濃度勾配を作製する方法も報告されている（例えば、非特許文献１２）。
しかしながら、拡散現象によって濃度勾配を作製する場合にも、いったんポンプや加圧装置を止めた際に、時間経過に伴って濃度プロファイルが大きく変化してしまうといった欠点がある。
【非特許文献１】Sugiura S., Edahiro J., Kikuchi K., Sumaru K., and Kanamori T.:Cell Culture Microchamber Array with Independent Perfusion Channel for Parallel Drug Toxicity Assay, The proceedings of microTAS 2007, Chemical and Biological Microsystems Society, pp1321-1323 (2007)
【非特許文献２】Wang Z., Kim M.-C., Marquez M. and Thorsen T.: High-Density Microfluidic Arrays for Cell Cytotoxicity Analysis, Lab Chip, 7, 740-745 (2007)
【非特許文献３】Takara K., Sakaeda T., Yagami T., Kobayashi H., Ohmoto N., Horinouchi M., Nishiguchi K. and Okumura K.: Cytotoxic Effects of 27 Anticancer Drugs in Hela and Mdr1-Overexpressing Derivative Cell Lines, Biol. Pharm. Bull., 25, 771-778 (2002)
【非特許文献４】N. L. Jeon, S. K. W. Dertinger, D. T. Chiu, I. S. Choi, A. D. Stroock and G. M. Whitesides: "Generation of Solution and Surface Gradients Using Microfluidic Systems", Langmuir, 16(22), 8311-8316 (2000)。
【非特許文献５】S. K. W. Dertinger, D. T. Chiu, N. L. Jeon, G. M. Whitesides, Generation of gradients having complex shapes using microfluidic networks, Anal. Chem. 73 (2001) 1240-1246.
【非特許文献６】X. Y. Jiang, J. M. K. Ng, A. D. Stroock, S. K. W. Dertinger and G. M. Whitesides: "A Miniaturized, Parallel, Serially Diluted Immunoassay for Analyzing Multiple Antigens", J. Am. Chem. Soc., 125(18), 5294-5295 (2003)
【非特許文献７】K. Campbell, A. Groisman, Generation of complex concentration profiles in microchannels in a logarithmically small number of steps, Lab Chip 7 (2007) 264-272.
【非特許文献８】F. Lin, W. Saadi, S. W. Rhee, S. J. Wang, S. Mittal and N. L. Jeon: "Generation of Dynamic Temporal and Spatial Concentration Gradients Using Microfluidic Devices", Lab Chip, 4(3), 164-167 (2004)
【非特許文献９】M. Yamada, T. Hirano, M. Yasuda and M. Seki: "A Microfluidic Flow Distributor Generating Stepwise Concentrations for High-Throughput Biochemical Processing", Lab Chip, 6(2), 179-184 (2006)
【非特許文献１０】H. Bang, S. H. Lim, Y. K. Lee, S. Chung, C. Chung, D. C. Han and J. K. Chang: "Serial Dilution Microchip for Cytotoxicity Test", J. Micromech. Microeng., 14(8), 1165-1170 (2004)
【非特許文献１１】#2286 G. M. Walker, N. Monteiro-Riviere, J. Rouse and A. T. O'Neill: "A Linear Dilution Microfluidic Device for Cytotoxicity Assays", Lab Chip, 7(2), 226-232 (2007)
【非特許文献１２】B. G. Chung, F. Lin and N. L. Jeon: "A Microfluidic Multi-Injector for Gradient Generation", Lab Chip, 6(6), 764-768 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、マイクロチップ上で細胞毒性試験を行う際には培養液を長期間にわたって供給し続ける必要がある。そのため、一時的に培養液の供給を止めた後も適切な濃度の培養液を供給することのできる流路網の構成が求められる。
【０００６】
本発明では、複数の液体導入口より導入された濃度の異なる溶液を複数の分岐点と合流点を有する微小流路網において分配と混合を繰り返して多段階の濃度プロファイルを持つ液体を調整するマイクロチップにおいて、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても濃度プロファイルを維持できる構成のマイクロチップの提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明では以下の構成を提供する。
第１の発明は、互いに異なる濃度の液体が導入される複数の液体導入口と、４以上の液体排出口とを具備し、前記液体導入口から導入された液体を前記液体排出口へ導く微小流路網が形成され、前記微小流路網が、複数の分岐点と、複数の合流点とを有し、複数の液体導入口から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されているマイクロチップであって、前記微小流路網は、互いに異なる濃度の液体を混合するための主流路同士を、前記主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路を介して接続して構成され、
前記接続流路が、前記微小流路網における、前記分岐点から送液方向上流側に延在する主流路と、前記合流点から送液方向下流側に延在する主流路との間の液体流路を構成していることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第２の発明は、第１の発明のマイクロチップにおいて、接続流路の前記狭隘部が、主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第３の発明は、第１又は第２の発明のマイクロチップにおいて、前記微小流路網は、前記主流路と、この主流路の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路と、前記主流路の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路とを有し、前記液体導入口から延在する送液ラインを複数具備し、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路は、前記主流路よりも流路断面積が小さく形成され、各送液ラインは、その送液方向上流端が前記液体導入口と連通され、送液方向下流端が前記液体排出口と連通されており、前記接続流路は、その送液方向上流端が、前記送液ラインの前記主流路の送液方向下流端の前記分岐点にて前記主流路に連通され、送液方向下流端が、別の送液ラインの前記主流路の送液方向上流端の前記合流点にて前記主流路に連通されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第４の発明は、第３記載のマイクロチップにおいて、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路と、前記接続流路の前記狭隘部とが、互いの深さを揃えて、前記主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第５の発明は、第１〜４のいずれかの発明のマイクロチップにおいて、液体排出口の下流に微小容器が接続されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第６の発明は、第５の発明のマイクロチップにおいて、前記微小容器が、細胞培養用容器であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第７の発明は、第１〜６のいずれかの発明のマイクロチップにおいて、前記微小流路網が、各液体導入口に同じ圧力をかけることよって所定の濃度の溶液を調整することができるように設計されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第８の発明は、第１〜７のいずれかの発明のマイクロチップをレプリカモールディングによって作製するためのマスターチップであって、ベース基板上に形成した、互いに厚さの異なる樹脂層によって、前記主流路を形成するための主流路形成用突条と、前記接続流路を形成するための接続流路形成用突条とが形成され、前記接続流路形成用突条は、前記主流路形成用突条に比べて厚さが小さい樹脂層によって形成され、前記ベース基板からの突出寸法が前記主流路形成用突条に比べて小さいことを特徴とするマスターチップを提供する。
第９の発明は、第８に記載のマスターチップにおいて、前記樹脂層がフォトレジスト層であることを特徴とするマスターチップを提供する。
第１０の発明は、第４の発明のマイクロチップを作成するための第８又は第９の発明のマスターチップであって、さらに、前記第１抵抗流路を形成するための第１抵抗流路形成用突条と、前記第２抵抗流路を形成するための第２抵抗流路形成用突条とが、主流路形成用突条に比べて前記ベース基板上の厚さが小さい樹脂層によって形成され、しかも、これら第１、第２抵抗流路形成用突条の前記ベース基板からの突出寸法が前記接続流路形成用突条と同じに揃えられていることを特徴とするマスターチップを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、液体混合用の主流路同士を、主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路によって接続した構成により、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても、微小流路網における濃度プロファイルを維持することができる。
各主流路における所望濃度の溶液の調整は、微小流路網の分岐点における溶液の分配と合流点における溶液の混合とを対流によって行うことが前提である。前記狭隘部を有する接続流路の採用は、接続流路を介した拡散による主流路間での物質移動を、対流による物質移動に比べて小さくするものである。これにより、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても、濃度プロファイルを維持することを可能にする。
また、液体導入口からの液体の導入を一時的に止める場合以外、例えば、細胞培養のため、微小流路網によって濃度調整した培養液を液体排出口から培養容器へ、非常にゆっくりと長期間に渡って供給する必要がある場合など、微小流路網に液体を非常にゆっくりとした速度で連続的に流す場合も、微小流路網の分岐点と合流点との間における拡散による物質移動が接続流路（詳細には狭隘部）によって抑制されることで、所望の濃度プロファイルを維持できる、といった利点がある。
また、前記狭隘部を有する接続流路の採用は、接続流路の流路長が短くて済むことになり、チップサイズの小型化に寄与する。
また、接続流路の深さを主流路に比べて浅く形成し、接続流路の深さを抵抗流路と深さと揃えた構成は、流路断面積比の大きな流路網を加工する際の加工上の利便性に寄与するとともに、流路網の設計の際に各流路を流れる溶液の流速の予測を可能とするため、各主流路において所望の濃度の溶液の調整が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施したマイクロチップ、マスターチップについて、図面を参照して説明する。
図１、図２に多段階の濃度の溶液を調整する微小流路網の模式図を示す。
図１、図２において、マイクロチップ１は、溝状の微小流路網２０が形成されたチップ基板２（図１０（ｇ）参照）に、カバープレート３を貼り合わせた構造になっている。微小流路網２０は、チップ基板２の片面（以下、流路形成面２ａとも言う）に形成されており、前記カバープレート３は、前記チップ基板２に、前記流路形成面２ａを覆うようにして貼り合わされている。
なお、チップ基板２、カバープレート３としては、例えば、ポリジメチルシロキシサン（以下、ＰＤＭＳとも言う）等の、微小流路を持つマイクロチップの材質として周知の合成樹脂製のものを採用できる。
【００１０】
図１に示すように、前記微小流路網２０は、液体が導入される複数（図１においては２つ）の液体導入口２１と、４以上（図１においては８つ）の液体排出口２２とを有し、前記液体導入口２１から導入された液体を前記液体排出口２２へ導くようになっている。
この微小流路網２０は、複数の液体導入口２１から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口２２毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されている。
【００１１】
図１、図２に示す微小流路網２０について、具体的に説明する。
図１、図２において、符号２３は送液ライン、２４は主流路（混合部）、２５は主流路２４同士を接続する接続流路、２６は合流点、２７は分岐点、２８は第１抵抗流路、２９は第２抵抗流路である。
【００１２】
微小流路網２０は、２つの液体導入口２１の一方（以下、第１液体導入口とも言う。図中、符号２１１を付す。）に連通された１本の送液ライン２３（図中、符号２３１）と、他方の液体導入口２１（以下、第２液体導入口とも言う。図中、符号２１２を付す）から延びる液体供給流路２１ｂに連通され、この液体供給流路２１ｂを介して第２液体導入口２１２に連通された複数の送液ライン２３（図中、符号２３２〜２３８）とを具備する。
各送液ライン２３の、液体導入口２１とは反対側の端部（送液方向下流端）には、それぞれ、液体排出口２２が設けられている。
【００１３】
各送液ライン２３は、主流路２４と、この主流路２４の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路２８と、前記主流路２４の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路２９とを具備して構成されている。
第１抵抗流路２８及び第２抵抗流路２９は、主流路２４よりも流路断面積が小さく形成されており、微小流路網２０を流れる液体に主流路２４よりも大きい流路抵抗を与える。
【００１４】
第１液体導入口２１１に連通する送液ライン２３１は、その第１抵抗流路２８の送液方向上流端が、第１液体導入口２１１から延びる液体供給流路２１ａに連通され、この液体供給流路２１ａを介して第１液体導入口２１１に連通されている。また、この送液ライン２３１は、その第２抵抗流路２９の送液方向下流端が、液体排出口２２に連通されている。
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８は、その第１抵抗流路２８の送液方向上流端が、第２液体導入口２１２から延びる液体供給流路２１ｂに連通され、この液体供給流路２１ｂを介して第２液体導入口２１２に連通されている。また、この送液ライン２３２〜２３８は、その第２抵抗流路２９の送液方向下流端が、液体排出口２２に連通されている。
【００１５】
なお、各送液ライン２３の主流路２４はその流路断面積が同じに揃えられている。
また、微小流路網２０において、接続流路２５、第１、第２抵抗流路２８、２９以外の流路（例えば、液体供給流路２１ａ、２１ｂ）は、その流路断面積が、各送液ライン２３の主流路２４と同じに揃えられている。
但し、本発明は、各送液ライン２３の主流路２４の流路断面積にばらつきがある構成や、微小流路網２０における、主流路２４、接続流路２５、第１、第２抵抗流路２８、２９以外の流路の流路断面積が主流路２４の流路断面積と異なっている構成を排除するものではない。
【００１６】
この微小流路網２０において、符号２７を付した分岐点は、送液ライン２３の主流路２４の送液方向下流端と前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とが互いに連通された連通箇所である。
また、符号２６を付した合流点は、送液ライン２３の主流路２４の送液方向上流端と前記第１抵抗流路２８と接続流路２５とが互いに連通された連通箇所である。
【００１７】
第１液体導入口２１１に連通する送液ライン２３１には、主流路２４の送液方向下流端を、前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とに分岐した分岐点２７が設けられている。この分岐点２７では、前記第２抵抗流路２９と接続流路２５と主流路２４とが互いに連通されている。この送液ライン２３１の主流路２４に連通された接続流路２５は、第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内の一つ（送液ライン２３２）の主流路２４の送液方向上流端の合流点２６にて、第１抵抗流路２８とともに、主流路２４に連通されており、送液ライン２３１の主流路２４から送液ライン２３２の主流路２４へ液体を導入するための液体流路として機能する。
【００１８】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内、符号２３２〜２３６の送液ライン２３は、主流路２４の送液方向下流端を前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とに分岐（２つの流路２９、２５と主流路２４の送液方向下流端とを互いに連通）した分岐点２７と、第１抵抗流路２８と接続流路２５と主流路２４の送液方向上流端とを互いに連通させた合流点２６とを有し、各送液ライン２３２〜２３６の主流路２４が、接続流路２５を介して縦続に接続されている。また、送液ライン２３７には、合流点２６、分岐点２７の内、合流点２６のみが設けられている。この送液ライン２３７の前記合流点２６にて、第１抵抗流路２８とともに主流路２４の送液方向上流端と連通された接続流路２５は、接続流路２５を介して縦続に接続された送液ライン２３２〜２３６の主流路２４の内の、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最下流に位置する主流路２４（送液ライン２３６の主流路２４）の送液方向下流端の分岐点２７にて主流路２４と連通されており、送液ライン２３６の主流路２４から送液ライン２３７の主流路２４へ液体を導入するための液体流路として機能する。
これにより、この微小流路網２０にあっては、第１液体導入口２１１に導入した液体を、送液ライン２３１〜２３７の主流路２４に流入させることができる。
また、各接続流路２５は、分岐点２７側の端部が送液方向上流端、合流点２６側の端部が送液方向下流端となっている。
【００１９】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内、符号２３８の送液ライン２３には、接続流路２５は接続されていない。この送液ライン２３８には、他の送液ラインからの液体の導入は無い。
【００２０】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８は、これら送液ライン２３２〜２３７の内、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３２から、下流側に位置する送液ラインに行くほど、順次、第１抵抗流路２８の液体に与える流路抵抗が大きくなるように形成されている。
送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８が発生する流路抵抗の違いは、例えば、各送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８の流路断面積の違いによって実現することも可能であるが、ここでは、各送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８として、流路断面積が同じものを採用し、この第１抵抗流路２８の流路長の違いによって流路抵抗の違いを実現している。
なお、送液ライン２３１〜２３８の第１抵抗流路２８は、流路断面積が同じに揃えられ、それぞれ、流路長全長にわたって流路断面積が一定に形成されている。
【００２１】
また、送液ライン２３１〜２３７の第２抵抗流路２９は、これら送液ライン２３１〜２３７の内、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３１から、下流側に位置する送液ラインに行くほど、順次、第２抵抗流路２９の液体に与える流路抵抗が小さくなるように形成されている。
送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９が発生する流路抵抗の違いは、例えば、各送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９の流路断面積の違いによって実現することも可能であるが、ここでは、各送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９として、流路断面積が同じものを採用し、この第２抵抗流路２９の流路長の違いによって流路抵抗の違いを実現している。
【００２２】
但し、送液ライン２３７の第２抵抗流路２９については、送液ライン２３６の第２抵抗流路２９に比べて流路断面積を大きくすることで、その流路抵抗を、送液ライン２３６よりも小さくしている。
しかし、この送液ライン２３７の第２抵抗流路２９についても、送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９と同じ流路断面積とし、流路長の違いによって（送液ライン２３６の第２抵抗流路２９よりも流路長を短くする）、送液ライン２３６の第２抵抗流路２９よりも小さい流路抵抗を実現した構成とすることも可能であることは言うまでもない。
各送液ライン２３１〜２３８の第２抵抗流路２９は、それぞれ、流路長全長にわたって流路断面積が一定に形成されている。
【００２３】
図示例のマイクロチップ１の微小流路網２０は、２つの液体導入口２１１、２１２から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口２２毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されている。
２つの液体導入口２１１、２１２から微小流路網２０に導入した液体の種類が互いに異なるとき、第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３７の主流路２４が、第２液体導入口２１２から送液ラインに導入された液体と、接続流路２５から導入された液体とを混合する混合部として機能する。各主流路２４における所望濃度の溶液の調整は、微小流路網２０の分岐点２７における溶液の分配と、合流点２６における溶液の混合とを、それぞれ主流路２４内での拡散によって行うことで実現される。
また、主流路２４内に混合を促進する機構を設けても良い。例えば攪拌子等を主流路２４の中に導入しても良い。
【００２４】
送液ライン２３毎に設けられた液体排出口２２からは、第１液体導入口２１１から導入した液体と、第２液体導入口２１２から導入した液体とが混合された液体が排出（供給）される。送液ライン２３毎に設けられた液体排出口２２から排出される溶液は、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３１から、下流側に位置する送液ラインへ行くほど、順次、第１液体導入口２１１から導入した液体の濃度が低くなり、第２液体導入口２１２から導入した液体の濃度が高くなる。
また、この微小流路網２０は、各液体導入口２１１、２１２に同じ圧力をかけることよって、各液体排出口２２について個々に設定した所望濃度の溶液を調整することができるように設計されている。
【００２５】
前記微小流路網２０の接続流路２５は、各送液ライン２３の主流路２４に比べて、流路断面積が小さく形成されている。主流路２４に比べて流路断面積が小さい接続流路２５は、その全長が、狭隘部（主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部）として機能する。また、図４に示すように、接続流路２５としては、その長手方向の一部分に、主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部２５ａを具備する構成ものであっても良い。
この微小流路網２０では、接続流路２５を介した拡散による主流路２４間での物質移動が、対流による物質移動に比べて小さい。このため、液体導入口２１１、２１２からの液体の導入を一時的に止めても、微小流路網２０における濃度プロファイルを維持することが可能となる。濃度プロファイルを維持できる時間（以下、プロファイル維持時間とも言う）の長さは、接続流路２５の流路断面積によって調整可能である。
プロファイル維持時間を長くするには、接続流路２５の流路長を大きくすることでも可能であるが、接続流路２５の流路断面積によって調整（流路断面積を小さくする）するのであれば、接続流路２５の流路長が短くて済み、マイクロチップ１全体の小型化に寄与する。
【００２６】
また、全長又は一部が主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部である接続流路２５の採用は、微小流路網２０を流れる液体の流速が非常に遅い場合に、微小流路網２０の分岐点２７と合流点２６との間における拡散による物質移動が接続流路２５（詳細には狭隘部）によって抑制されることで、所望の濃度プロファイルを安定に維持できる、といった利点がある。
【００２７】
図１に示したマイクロチップを用いて、液体導入口より８０ｋＰａで加圧して濃度の異なる２種類の液体を送液して濃度プロファイルを確認した後に、一時的に加圧を停止して３時間放置した後に再度８０ｋＰａで加圧して濃度プロファイルを確認したところ、加圧停止による濃度プロファイルの変化は確認されなかった。
【００２８】
以下、各液体排出口２２から細胞培養用の培養液を得るために、微小流路網２０に、第１液体導入口２１１から溶質が高濃度の培養液を導入し、第２液体導入口２１２から希釈液（以下、希釈用液体とも言う）を導入する場合を例に、全長又は一部が主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部である接続流路２５の採用による効果を検討する。
なお、送液ライン２３２〜２３７の主流路２４について、以下、混合部２４とも言う。
また、微小流路網２０の液体排出口２２、混合部２４、接続流路２５、分岐点２７、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９に関して、分岐点２７を、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入される順で、一段目、二段目…として説明することとし、この分岐点２７から送液方向上流側に延在する混合部２４及び該混合部２４の送液方向上流端に連通する第１抵抗流路２８、分岐点２７から送液方向下流側に延在する第２抵抗流路２９及び接続流路２５、第２抵抗流路２９の送液方向下流端の液体排出口２２についても、それぞれ、分岐点２７に対応させて、一段目、二段目…として説明することとする。合流点２６に関しては、二段目分岐点２７から送液方向上流側に延在する混合部２４の上流端の合流点２６を二段目合流点２６と称し、以下、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入される順で、三段目、四段目…として説明することとする。
送液ライン２３１〜２３８も、図１、図２において上から、つまり、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順で、一段目、二段目…として説明することとする。液体排出口２２、混合部２４、合流点２６、分岐点２７、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９に関しては、送液ライン２３に対応して、一段目、二段目…と称する。
【００２９】
図３は、一段目送液ライン２３１、二段目送液ライン２３２の付近を拡大して示したものである。
図３に示すように、第１液体導入口２１１より導入された液体は、一段目分岐点２７（図３中、符号２７１を付す）において分岐し、一段目接続流路２５（図３中、符号２５１）を介して二段目合流点２６（図３中、符号２６２）において希釈用液体と合流する。
なお、図３において、符号２４１は一段目主流路、２４２は二段目主流路（混合部）、２５２は二段目接続流路、２７２は二段目分岐点、２８１は一段目第１抵抗流路、２９１は一段目第２抵抗流路、２８２は二段目第１抵抗流路、２９２は二段目第２抵抗流路である。
【００３０】
図３に示すように、高濃度液体導入口（第１液体導入口２１）より導入された液体が一段目分岐点２７１において分岐し、一部は一段目液体排出口２２１に流れ、一部は一段目接続流路２５１に流れる。一段目接続流路２５１に流れた液体は二段目合流点２６２において希釈用液体と合流し、合流点２６２で希釈された液体は二段目混合部２４２において混合される。二段目混合部２４２において混合された液体は二段目分岐点２７２おいて分岐し、一部は二段目液体排出口２２２に流れ、一部は二段目接続流路２５２に流れる。この際に一段目混合部２４１および二段目混合部２４２を流れる液体は異なる濃度の液体が流れており、各液体排出口２２の下流に微小容器３１を設けて細胞を培養することにより、異なる濃度の培養液で細胞を培養することができる。
【００３１】
一般に、細胞培養を行う場合、数日から数ヶ月の間培養液を供給し続けなければならない。従って、液体を供給するポンプ等に培養液を補充する際には、一時的に液体を止める必要がある。従来技術においては、この際に、各混合部に存在する液体が混合部間の流路を介して混ざってしまい、溶液の濃度が望まれる濃度と異なってしまうが、本発明においては、接続流路の断面積を小さくすることによってこの問題を回避することができる。また、接続流路を浅くすることによって、断面積が小さく、しかも、深さ・幅の差が小さい接続流路を容易に得ることができる。
【００３２】
また、図１、図２の構成の流路網においては各段目の分岐点において培養液を所定の比率で分配し、合流点および混合部において所定の比率で混合することにより、望ましい濃度の溶液を調整する。この分配と合流の比率は各流路を流れる溶液の流量によって決定されるが、これは各段目の第１抵抗流路、第２抵抗流路および接続流路部の流路抵抗を適切に設計することで自在に設定することができる。この際に、接続流路部、第１抵抗流路および第２抵抗流路の流路断面積が他の流路の流路断面積に比べて小さいと流路網の設計の際に他の流路の流路抵抗を無視して計算することができるので、流路網の設計が容易となる。また、接続流路、第１抵抗流路および第２抵抗流路よりも大に抵抗流路を浅くすることによって、断面積が小さく、しかも、深さ・幅の差が小さい接続流路を容易に得ることができる。
【００３３】
以下、接続流路の流路断面積と拡散による物質移動との関係について詳細に検討する。
まず、培養液の流れを止めた場合に、Ｎ段目（Ｎ＝１、２、３・・・Ｎｍａｘ）の混合部２４の液体中の溶質の接続流路２５を介した移動を考える。つまり、Ｎ段目の混合部２４とＮ−１段目およびＮ＋１段目の混合部２４との接続流路２５を介した拡散による物質移動を考える。Ｎ段目の混合部２４の溶液の濃度をＣＮ［ｋｇ／ｍ３］とする。一般に、溶液が停止している場合の拡散による物質移動の流束Ｊ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は、以下の式で表される。
【数１】
【００３４】
ここで、Ｄ［ｍ２／ｓ］は拡散定数、ｃ［ｋｇ／ｍ３］は溶質の濃度、ｘ［ｍ］は接続流路２５の長さ方向の座標である。従って、Ｎ段目の接続流路２５の平均的な流束ＪＮは、接続流路２５の長さをＬｃ［ｍ］とすると、以下の式で見積もることができる。
【数２】
【００３５】
ここで、接続流路２５の断面積をＡｃ［ｍ２］、混合部の幅、深さ、断面積および長さをＷｍ［ｍ］、Ｈｍ［ｍ］、Ａｍ［ｍ２］およびＬｍ［ｍ］とする。また、議論を簡略化するために、混合部にミキサーが設置されているとし、溶液を止めた後も混合部において溶液が完全に混合していると仮定すると、接続流路を介した拡散によるＮ段目の混合部の濃度変化は以下の式で表される。
Ｎ＝１、つまり一段目の混合部の濃度については以下の式である。
【数３】
Ｎ＞１、つまり二段目以降の混合部の濃度については以下の式である。
【数４】
Ｎ＝Ｎｍａｘ、つまりＮｍａｘ段目の混合部の濃度については以下の式である。
【数５】
【００３６】
Ｎｍａｘ＝２、つまり、流路が二段の時、これらの微分方程式は容易に解くことができ、溶液を止めた瞬間のＮ段目の混合部の溶液の濃度をＣＮ，０［ｋｇ／ｍ３］とすると、送液停止後の一段目と二段目の混合部の濃度変化の解として、以下のような解が得られる。
【数６】
【数７】
【００３７】
ここで、本発明を低分子の溶質の広範な濃度範囲における微小容器内での細胞応答を試験すると想定し、各段の希釈率を１０倍と想定する、つまり、一段目、二段目の混合部の溶質濃度Ｃ１，０およびＣ２，０を１［ｋｇ／ｍ３］および０．１［ｋｇ／ｍ３］とする。また、拡散定数Ｄをショ糖の水中での拡散定数０．５ｘ１０−９［ｍ２／ｓ］程度と想定し、混合部の幅Ｗｍ［ｍ］、深さＨｍ［ｍ］、断面積Ａｍ［ｍ２］、および長さＬｍ［ｍ］を、１ｘ１０−４［ｍ］、５ｘ１０−５［ｍ］、５ｘ１０−９［ｍ］、および１ｘ１０−３［ｍ］とし、接続流路の長さＬｃ［ｍ］を１ｘ１０−４［ｍ］と設定する。
【００３８】
図５に送液停止後の各段の混合部の濃度変化に対する接続流路と混合部の断面積比（混合部／接続流路）の影響をプロットした図を示す。
接続流路と混合部の断面積比が１の場合は、送液停止後数分で一段目および二段目の混合部の濃度が接続流路を介した拡散によって変化するが、接続流路と混合部の断面積比を１０、または１００とすることで、つまり、接続流路を混合部に比べて細くすることで、各段の混合部の濃度変化が抑制されることが読み取れる。
【００３９】
また、図６に送液停止後１０分後の各段の濃度に対する接続流路と混合部の断面積比（混合部／接続流路）の影響を示す。
接続流路と混合部の断面積比が大きくなるにつれて、つまり、接続流路を混合部に比べて細くすることで送液停止後１０分後における各段の濃度変化を抑制できることが読み取れる。図６より、接続流路の断面積を混合部の断面積に対して１／１０以下とすることで、１０分後においても各段の溶質濃度の変化を抑制することが読み取れる。
【００４０】
Ｎｍａｘ＞２の時、つまり、流路が三段以上の時、これらの微分方程式（３）、（４）、（５）を解くことは容易でなくなるが、少なくとも一段目の流路に関しては図５、図６に示したような現象が起こることは容易に理解できる。
また、段階希釈によって広範な濃度範囲において多段階の濃度の溶液を調整することを想定している場合、例えば、非特許文献３のように６から８桁ほどの広範な濃度範囲で実験を行う場合には、各段において比較的大きな希釈率で溶液を調整する必要がある。つまり、ＣＮがＣＮ＋１に比べて非常に大きいので、Ｃ１＞＞Ｃ２ ＞＞ Ｃ３＞＞， ・・・， ＞＞Ｃｍａｘと考えて良く、一段目の混合部の濃度に関しては図５、図６とほぼ同じグラフが得られる。
【００４１】
次に、ある流量で溶液を流した場合の各段の接続流路の物質移動を考える。
図１，図２に示すＮ段目の第１抵抗流路、混合部、第２抵抗流路、接続流路を流れる液体の流量をそれぞれＱＮ，１、ＱＮ，２、ＱＮ，３、ＱＮ，４とする。また、Ｎ段目の混合部より下流、つまり、混合部、第２抵抗流路、液体排出口の溶液の濃度をＣＮとする。
図１、図２の構成の流路網では溶液を調整するために分岐点および合流点において溶液を所定の比率で分配、混合しており、望ましい濃度の溶液を調整するためには、この分配、混合の際に対流によって物質移動が行われる必要がある。ここでＮ段目の接続流路における対流による物質移動の流束ＪＮ，Ｃ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は接続流路内の平均流速ｖＮ，４を用いて以下の式で表される。
【数８】
【００４２】
また、拡散による物質移動の流束はＪＮ，Ｄ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は式（１）と同様に以下の式で表される。
【数９】
【００４３】
上述のように、望ましい濃度の溶液を調整するためには、対流による物質移動に比べて拡散による物質移動が支配的である必要があり、そのためには一般にＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄ＞１０となるのが好ましい。（８）、（９）式より以下の式が導かれる。
【数１０】
【００４４】
ここで、上述のように一段目、二段目の混合部の溶質濃度Ｃ１，０およびＣ２，０を１［ｋｇ／ｍ３］および０．１［ｋｇ／ｍ３］とし、接続流路の長さＬｃ［ｍ］を１ｘ１０−４［ｍ］と設定、拡散定数Ｄをショ糖の水中での拡散定数０．５ｘ１０−９［ｍ２／ｓ］程度と想定する。
一方、本発明においては、液体排出口の下流に微小容器（図２の符号３１）を設けて細胞を培養することを想定している。
ここでは液体排出口の下流に直径１．５ｍｍの微小容器を設けて細胞を培養することを想定する。この大きさは非特許文献１で用いている微小容器の大きさである。一般的な細胞培養では直径１０ｃｍの培養皿に１０ｍＬ程度の培養液を入れ２日間おきに培養液を交換する。この培養液の交換速度は６ｍｌ／ｍｍ２／ｄａｙ程度の速度に相当する。従って、直径１．５ｍｍの微小容器に供給されるべき培養液の供給速度は１．４ｘ１０−１４［ｍ３／ｓ］となる。上述のような希釈率が１０倍の微小流路網においては、接続流路には液体排出口の１／１０程度の流量の培養液が通過するため、ＱＮ，４＝１．４ｘ１０−１５［ｍ３／ｓ］となる。以上の条件を式（１０）に代入して計算したＪＮ，Ｃ／ＪＮ，ＤとＡｃの関係を図７に示す。
【００４５】
この図より、ＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となるためには接続流路断面積Ａｃが３．１ｘ１０−１０ｍ２以下である必要がある。接続流路の深さが上述の混合部の深さと同様に５ｘ１０−５［ｍ］と仮定すると接続流路の幅は６．２ｘ１０−６［ｍ］以下である必要があるが、このように深さ／幅の比率が８程度の流路は現実的に加工が困難である。
この場合、接続流路の幅と深さの比率が１とすると接続流路の幅および深さは１．８ｘ１０−５［ｍ］以下であればＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となり、接続流路を混合部に比べて浅くすることにより、現実的に加工できる流路構成が可能となる。
接続流路を混合部に比べて浅くすることは、混合部よりも流路断面積が小さい接続流路の形成を容易にする。
【００４６】
また、図８にＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０の場合について、式（１０）より導き出した接続流路の断面積Ａｃ［ｍ２］と接続流路を流れる溶液の流量ＱＮ，４［ｍ３／ｓ］の関係を示す。
この図より接続流路内の物質移動が対流によって支配されるために要求される接続流路断面積Ａｃの範囲が読みとれる。接続流路内の物質移動が対流によって支配されるためにはＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上であることが好ましいため、ある接続流路を流れる液体の流量ＱＮ，４についてこの図より読みとれるＡｃに比べて小さな値のＡｃであれば良い。
上述の議論と同様に直径１．５ｍｍの微小容器に培養液を供給することを想定すると、接続流路を流れる液体の流量ＱＮ，４は１．４ｘ１０−１５［ｍ３／ｓ］となる。この場合、図８より、接続流路断面積Ａｃは３．１ｘ１０−１０［ｍ２］以下であることが好ましい。接続流路の深さが混合部の深さと同様に５ｘ１０−５［ｍ］と仮定すると接続流路の幅は６．２ｘ１０−６［ｍ］以下である必要があるが、このように深さ／幅の比率が８程度の流路は現実的に加工が困難である。接続流路の幅と深さの比率が１とすると接続流路の幅および深さは１．８ｘ１０−５［ｍ］以下であればＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となり、接続流路を混合部に比べて浅くすることにより、現実的に加工できる流路構成が可能となる。
このことからも、接続流路を混合部に比べて浅くすることで、混合部よりも流路断面積が小さい接続流路の形成が容易になることが判る。
【００４７】
次に、混合部に比べて深さが浅い溝である接続流路を持つマイクロチップ１を、レプリカモールディング法により、作成（製造）する場合について説明する。
【００４８】
図１０（ｅ）、（ｆ）において、符号４は、マイクロチップ１のチップ基板２の作成に用いるマスターチップである。このマスターチップ４は、ベース基板４１の片面に互いに厚さが異なる樹脂層４２、４３が設けられた構成になっている。
ベース基板４１は、例えばシリコンウェハ、あるいは、シリコンウェハをダイシングして得たチップ（シリコンチップ）等の板状部材である。
【００４９】
樹脂層４２、４３は、チップ基板２の微小流路網２０のうち、浅い構造の流路である接続流路２５，抵抗流路２８および２９を形成するための樹脂層４２（以下、浅い流路形成用樹脂層とも言う）と、深い構造の流路である混合部２４および液体供給流路２１を形成するための樹脂層４３（以下、深い流路形成用樹脂層とも言う）とに大別される。深い流路形成用の樹脂層４３は、浅い流路形成用樹脂層４２に比べて厚さが大きい。そして、このマスターチップ４は、面形成用ベース基板４１の表面を基準面４Ｓとしたとき、前記基準面４Ｓから突出された部分が、微細流路網２０を形成するための流路形成用突条として機能する。
【００５０】
前記マスターチップ４の作成方法の一例としては、ベース基板４１の片面（樹脂層形成面４１ａ）に塗布したレジストを加熱硬化させてフォトレジスト層４４（以下、第１フォトレジスト層とも言う）を形成（図１０（ａ））し、次いで、図１０（ｂ）に示すように、フォトマスク４５を用いた露光と加熱により、第１フォトレジスト層４４に、浅い流路形成用樹脂層４２のパターンを焼き付ける。
次に、第１フォトレジスト層４４の上に、レジストを塗布して第２フォトレジスト層４６を形成する（図１０（ｃ））。この第２フォトレジスト層４６は、第１フォトレジスト層４４（面形成用樹脂層４２）よりも膜厚で、第１フォトレジスト層４４全体を覆うように形成する。
次いで、図１０（ｄ）に示すように、フォトマスク４７を用いた露光と加熱により、第２フォトレジスト層４６に樹脂層４３パターンを焼き付ける。
その後、図１０（ｅ）に示す現像工程にて、樹脂層４２、４３の焼き付け部分を残して、第１、第２フォトレジスト層４４、４６を除去する。
これにより、所望パターンの樹脂層４２、４３を有するマスターチップ４が得られる。
【００５１】
マスターチップ４を用いて、マイクロチップ１のチップ基板２を、レプリカモールディング法により作成（製造）するには、例えば、マスターチップ４を金型内にセットした状態で、例えばＰＤＭＳ等を用いてチップ基板２の樹脂成形を行う（図１０（ｆ））。これにより、樹脂層４２（浅い流路形成用樹脂層）および樹脂層４３（深い流路形成用樹脂層）が形成する流路形成用突条によって、微細流路網２０を持つチップ基板２が得られる。
そして、図１０（ｇ）に示すように、得られたチップ基板２にカバープレート３を貼り合わせることで、マイクロチップ１を組み立てることができる。
【００５２】
上述の手法によれば、樹脂層４２および樹脂層４３の内、流路形成用突条として機能する部分は断面矩形の突条に形成されるため、微細流路網を構成する液体流路は、断面矩形の溝状に形成される。
【００５３】
ここで、微細流路網を構成する液体流路の内、主流路２４（混合部）よりも流路断面積が小さい接続流路２５を、主流路２４（混合部）よりも深さが浅い溝として形成するには、図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、ベース基板４１に、流路形成用樹脂層として、互いに厚さの異なる樹脂層４２、４３を形成して、前記主流路２４を形成するための主流路形成用突条４３ａと、前記接続流路２５を形成するための接続流路形成用突条４２ａとを得る。接続流路形成用突条４２ａは、ベース基板４１からの突出寸法、基準面４Ｓからの突出寸法を、主流路形成用突条４３ａよりも小さくする。
【００５４】
また、図１１（ａ）、（ｂ）では、樹脂層４２によって、第２抵抗流路２９の形成用の第２抵抗流路形成用突条４２ｂをも形成されている構成を例示している。
この場合、第２抵抗流路形成用突条４２ｂは、前記ベース基板４１からの突出寸法（換言すれば基準面４Ｓからの突出寸法）が前記接続流路形成用突条４２ａと同じに揃っていることになる。
微小流路網２０を、接続流路２５と第２抵抗流路２９とを同じ深さとした構成の場合、上述のように、一つの樹脂層４２によって、接続流路形成用突条４２ａと第２抵抗流路形成用突条４２ｂとを得ることができる。
このことは、接続流路２５と第１抵抗流路２８、マスターチップ４に形成する第１抵抗流路形成用突条と接続流路形成用突条４２ａとの関係についても、同様に言える。
【００５５】
また、図１１（ａ）、（ｂ）では、主流路形成用突条４３ａの幅Ｗ１、接続流路形成用突条４２ａの幅Ｗ２、第２抵抗流路形成用突条４２ｂの幅Ｗ３が同じになっている構成を例示している。
この場合、チップ基板２の微小流路網２０として、主流路２４、接続流路２５、第２抵抗流路２９の溝幅が同じに揃ったものが得られることになる。各流路の流路断面積は、各流路の深さによって調整される。
このことは、接続流路２５と第１抵抗流路２８、マスターチップ４に形成する第１抵抗流路形成用突条と接続流路形成用突条４２ａとの関係についても、同様に言える。
本発明は、接続流路２５、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９のいずれか１以上の幅が、主流路２４の幅と揃っている構成を含む。
【００５６】
図９に、試作したマイクロチップの濃度グラジエント生成機構を評価した結果を示す。
ＰＤＭＳを用いてマイクロチップを試作した。
接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路は、幅が２０μｍ、深さが１０μｍの断面矩形の溝（角溝）であり、断面寸法を揃えた。微小流路網における接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路以外の流路は、幅が１００μｍ、深さが５０μｍの断面矩形の溝（角溝）とした。接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路の、主流路に対する断面積比は２５倍である。また、微小流路網は、ｎ段目の混合部における希釈率Ｄが１／２となるように設計した。
試作したマイクロチップに、第１液体導入口から濃度１７ｗｔ％のニューコクシン水溶液を送液し、第２液体導入口から希釈用の超純水を送液した。いずれも、送液を７５ｋＰａで行った。１２時間経過後に、液体排出口から排出された溶液を採取し、吸光度を測定して、検線量から濃度を算出した。得られた結果から、濃度グラジエント生成機構を評価した。図９の結果、ニューコクシン濃度は設定した希釈率にほぼ一致した単調減少を示した。また、混合部の滞留時間を充分に長く設定したことで、高圧（高流量）で薬剤を流しても、充分に２液の拡散混合が生じることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によって開示される多段階の濃度の溶液を調整する微小流路網は、広範な濃度範囲において薬剤の細胞毒性を試験するマイクロチップに応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明のマイクロチップ、該マイクロチップの微小流路網を模式的に示す図である。
【図２】図１の微小流路網を拡大して模式的に示した図である。
【図３】図２の微小流路網の一段目、二段目の送液ラインの付近を拡大して示した図である。
【図４】微小流路網の接続流路の長手方向の一部のみに狭隘部を設けた例を示す図である。
【図５】送液停止後の各段の混合部の濃度変化を示すグラフである。
【図６】送液停止１０分後の各段の混合部の濃度と、接続流路の混合部に対する断面積比との関係を示すグラフである。
【図７】接続流路の断面積ＡｃとＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄとの関係を示すグラフである。
【図８】接続流路を流れる溶液の流量と接続流路断面積との関係を示すグラフである。
【図９】試作したマイクロチップの濃度グラジエント生成機構を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｇ）は、マイクロチップの製造に用いるマスターチップの作成、マスターチップの製造（組立）手順を説明する図である。
【図１１】（ａ）、（ｂ）は、マスターチップにおいて、接続流路形成用突条、第２抵抗流路形成用突条を、同一の樹脂層によって形成した例を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…マイクロチップ、２…チップ基板、２０…微小流路網、２１…液体導入口、２１１…液体導入口（第１液体導入口）、２１２…液体導入口（第１液体導入口）、２３、２３１〜２３８…送液ライン、２４…主流路（混合部）、２５…接続流路、２５１…狭隘部、２６…合流部、２７…分岐部、２８…第１抵抗流路、２９…第２抵抗流路、４…マスターチップ、４１…ベース基板、４２…樹脂層、４３…樹脂層（流路形成用樹脂層）、４４…フォトレジスト層（第１フォトレジスト層）、４６…フォトレジスト層（第２フォトレジスト層）、４２ａ…接続流路形成用突条、４２ｂ…第２抵抗流路形成用突条。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料の分析等に用いられるマイクロチップに係り、特に、複数の液体導入口より導入された濃度の異なる溶液を複数の分岐点と合流点を有する微小流路網において分配と混合を繰り返して溶液の濃度を多段階に調整するマイクロチップ、該マイクロチップの作成用のマスターチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞アッセイを行うためのマイクロチップは、従来のマイクロウエルプレートと比べて高い集積度を実現できる分析方法として期待されている。発明者らが公開している非特許文献１やアメリカのグループの公開している非特許文献２では複数の薬剤の細胞毒性を一度に試験することのできるマイクロチップが記載されている。
一方、一般的に細胞毒性試験を行うにあたっては、非特許文献３に記載されているように広範な濃度範囲での試験を行う必要がある。しかしながら、マイクロチップで取り扱う液体は数ナノリットルのオーダーであり、このような微量の液体を正確に秤量して希釈するのは非常に困難である。
このような問題を解決するために、分岐と合流を繰り返す微小流路網を用いて、濃度の異なる複数の液体の流れを作り出す方法が知られている（例えば、非特許文献４）。
また、この原理に基づき、流路網のデザインを工夫することにより、複雑な様々な濃度プロファイルの溶液を調整する方法が報告されている（例えば、非特許文献５−８）。
【０００３】
一般的にこれらの方法では流路網を形成する各流路の流路抵抗を適切に設定し、液体導入口よりシリンジポンプ等を用いて適切な流量で液体を導入することにより、濃度の異なる液体同士を分岐点において適切な比率で分配し、混合部において適切な比率で混合することを可能とし、最下流に存在する液体排出口において望みの濃度の液体を得ることができる。しかしながら、このような分岐点における適切な分配と混合部における適切な混合は、あらかじめ設定された流量で液体導入口より液体を導入している状態においてのみ実現するため、シリンジポンプ内の液が不足し、液体導入口の流量が著しく下がった際に望みの濃度の液体を得ることができない。このことは、多段階の濃度プロファイルを持つ細胞培養用培養液を微量流路網で調整し、その下流で長期間細胞を培養する細胞培養チップに応用する場合に大きな問題となる。つまり、長期間細胞を培養するためにはシリンジポンプ等に適宜培養液を補充する必要があるが、培養液を補充する際に液体の流れが止まると、溶質が拡散によって微小流路内を移動してしまい、各流路の溶質濃度が変化してしまうという問題がある。このことは微量の溶質に短時間暴露されるだけで細胞の状態が変化してしまう細胞毒性試験チップにおいては致命的な問題となる。
また、これらの方法とは異なるが、類似した方法として、分岐と合流を一段階だけ行って多段の濃度プロファイルを作成する方法も報告されている（例えば、非特許文献９−１１）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では濃度が三桁以上異なる濃度プロファイルを作製することは難しい。一般的な細胞毒性試験に適したマイクロチップのための濃度範囲が数桁に及ぶ多段階の濃度プロファイルを作製するためには分岐と合流を繰り返す構造の利用が望ましい。
さらに、これらの方法とは異なるが、類似した方法として、拡散現象を利用した濃度勾配を作製する方法も報告されている（例えば、非特許文献１２）。
しかしながら、拡散現象によって濃度勾配を作製する場合にも、いったんポンプや加圧装置を止めた際に、時間経過に伴って濃度プロファイルが大きく変化してしまうといった欠点がある。
【非特許文献１】Sugiura S., Edahiro J., Kikuchi K., Sumaru K., and Kanamori T.:Cell Culture Microchamber Array with Independent Perfusion Channel for Parallel Drug Toxicity Assay, The proceedings of microTAS 2007, Chemical and Biological Microsystems Society, pp1321-1323 (2007)
【非特許文献２】Wang Z., Kim M.-C., Marquez M. and Thorsen T.: High-Density Microfluidic Arrays for Cell Cytotoxicity Analysis, Lab Chip, 7, 740-745 (2007)
【非特許文献３】Takara K., Sakaeda T., Yagami T., Kobayashi H., Ohmoto N., Horinouchi M., Nishiguchi K. and Okumura K.: Cytotoxic Effects of 27 Anticancer Drugs in Hela and Mdr1-Overexpressing Derivative Cell Lines, Biol. Pharm. Bull., 25, 771-778 (2002)
【非特許文献４】N. L. Jeon, S. K. W. Dertinger, D. T. Chiu, I. S. Choi, A. D. Stroock and G. M. Whitesides: "Generation of Solution and Surface Gradients Using Microfluidic Systems", Langmuir, 16(22), 8311-8316 (2000)。
【非特許文献５】S. K. W. Dertinger, D. T. Chiu, N. L. Jeon, G. M. Whitesides, Generation of gradients having complex shapes using microfluidic networks, Anal. Chem. 73 (2001) 1240-1246.
【非特許文献６】X. Y. Jiang, J. M. K. Ng, A. D. Stroock, S. K. W. Dertinger and G. M. Whitesides: "A Miniaturized, Parallel, Serially Diluted Immunoassay for Analyzing Multiple Antigens", J. Am. Chem. Soc., 125(18), 5294-5295 (2003)
【非特許文献７】K. Campbell, A. Groisman, Generation of complex concentration profiles in microchannels in a logarithmically small number of steps, Lab Chip 7 (2007) 264-272.
【非特許文献８】F. Lin, W. Saadi, S. W. Rhee, S. J. Wang, S. Mittal and N. L. Jeon: "Generation of Dynamic Temporal and Spatial Concentration Gradients Using Microfluidic Devices", Lab Chip, 4(3), 164-167 (2004)
【非特許文献９】M. Yamada, T. Hirano, M. Yasuda and M. Seki: "A Microfluidic Flow Distributor Generating Stepwise Concentrations for High-Throughput Biochemical Processing", Lab Chip, 6(2), 179-184 (2006)
【非特許文献１０】H. Bang, S. H. Lim, Y. K. Lee, S. Chung, C. Chung, D. C. Han and J. K. Chang: "Serial Dilution Microchip for Cytotoxicity Test", J. Micromech. Microeng., 14(8), 1165-1170 (2004)
【非特許文献１１】#2286 G. M. Walker, N. Monteiro-Riviere, J. Rouse and A. T. O'Neill: "A Linear Dilution Microfluidic Device for Cytotoxicity Assays", Lab Chip, 7(2), 226-232 (2007)
【非特許文献１２】B. G. Chung, F. Lin and N. L. Jeon: "A Microfluidic Multi-Injector for Gradient Generation", Lab Chip, 6(6), 764-768 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、マイクロチップ上で細胞毒性試験を行う際には培養液を長期間にわたって供給し続ける必要がある。そのため、一時的に培養液の供給を止めた後も適切な濃度の培養液を供給することのできる流路網の構成が求められる。
【０００６】
本発明では、複数の液体導入口より導入された濃度の異なる溶液を複数の分岐点と合流点を有する微小流路網において分配と混合を繰り返して多段階の濃度プロファイルを持つ液体を調整するマイクロチップにおいて、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても濃度プロファイルを維持できる構成のマイクロチップの提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明では以下の構成を提供する。
第１の発明は、互いに異なる濃度の液体が導入される複数の液体導入口と、４以上の液体排出口とを具備し、前記液体導入口から導入された液体を前記液体排出口へ導く微小流路網が形成され、前記微小流路網が、複数の分岐点と、複数の合流点とを有し、複数の液体導入口から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されているマイクロチップであって、前記微小流路網は、互いに異なる濃度の液体を混合するための主流路同士を、前記主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路を介して接続して構成され、
前記接続流路が、前記微小流路網における、前記分岐点から送液方向上流側に延在する主流路と、前記合流点から送液方向下流側に延在する主流路との間の液体流路を構成していることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第２の発明は、第１の発明のマイクロチップにおいて、接続流路の前記狭隘部が、主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第３の発明は、第１又は第２の発明のマイクロチップにおいて、前記微小流路網は、前記主流路と、この主流路の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路と、前記主流路の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路とを有し、前記液体導入口から延在する送液ラインを複数具備し、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路は、前記主流路よりも流路断面積が小さく形成され、各送液ラインは、その送液方向上流端が前記液体導入口と連通され、送液方向下流端が前記液体排出口と連通されており、前記接続流路は、その送液方向上流端が、前記送液ラインの前記主流路の送液方向下流端の前記分岐点にて前記主流路に連通され、送液方向下流端が、別の送液ラインの前記主流路の送液方向上流端の前記合流点にて前記主流路に連通されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第４の発明は、第３記載のマイクロチップにおいて、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路と、前記接続流路の前記狭隘部とが、互いの深さを揃えて、前記主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第５の発明は、第１〜４のいずれかの発明のマイクロチップにおいて、液体排出口の下流に微小容器が接続されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第６の発明は、第５の発明のマイクロチップにおいて、前記微小容器が、細胞培養用容器であることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第７の発明は、第１〜６のいずれかの発明のマイクロチップにおいて、前記微小流路網が、各液体導入口に同じ圧力をかけることよって所定の濃度の溶液を調整することができるように設計されていることを特徴とするマイクロチップを提供する。
第８の発明は、第１〜７のいずれかの発明のマイクロチップをレプリカモールディングによって作製するためのマスターチップであって、ベース基板上に形成した、互いに厚さの異なる樹脂層によって、前記主流路を形成するための主流路形成用突条と、前記接続流路を形成するための接続流路形成用突条とが形成され、前記接続流路形成用突条は、前記主流路形成用突条に比べて厚さが小さい樹脂層によって形成され、前記ベース基板からの突出寸法が前記主流路形成用突条に比べて小さいことを特徴とするマスターチップを提供する。
第９の発明は、第８に記載のマスターチップにおいて、前記樹脂層がフォトレジスト層であることを特徴とするマスターチップを提供する。
第１０の発明は、第４の発明のマイクロチップを作成するための第８又は第９の発明のマスターチップであって、さらに、前記第１抵抗流路を形成するための第１抵抗流路形成用突条と、前記第２抵抗流路を形成するための第２抵抗流路形成用突条とが、主流路形成用突条に比べて前記ベース基板上の厚さが小さい樹脂層によって形成され、しかも、これら第１、第２抵抗流路形成用突条の前記ベース基板からの突出寸法が前記接続流路形成用突条と同じに揃えられていることを特徴とするマスターチップを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、液体混合用の主流路同士を、主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路によって接続した構成により、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても、微小流路網における濃度プロファイルを維持することができる。
各主流路における所望濃度の溶液の調整は、微小流路網の分岐点における溶液の分配と合流点における溶液の混合とを対流によって行うことが前提である。前記狭隘部を有する接続流路の採用は、接続流路を介した拡散による主流路間での物質移動を、対流による物質移動に比べて小さくするものである。これにより、液体導入口からの液体の導入を一時的に止めても、濃度プロファイルを維持することを可能にする。
また、液体導入口からの液体の導入を一時的に止める場合以外、例えば、細胞培養のため、微小流路網によって濃度調整した培養液を液体排出口から培養容器へ、非常にゆっくりと長期間に渡って供給する必要がある場合など、微小流路網に液体を非常にゆっくりとした速度で連続的に流す場合も、微小流路網の分岐点と合流点との間における拡散による物質移動が接続流路（詳細には狭隘部）によって抑制されることで、所望の濃度プロファイルを維持できる、といった利点がある。
また、前記狭隘部を有する接続流路の採用は、接続流路の流路長が短くて済むことになり、チップサイズの小型化に寄与する。
また、接続流路の深さを主流路に比べて浅く形成し、接続流路の深さを抵抗流路と深さと揃えた構成は、流路断面積比の大きな流路網を加工する際の加工上の利便性に寄与するとともに、流路網の設計の際に各流路を流れる溶液の流速の予測を可能とするため、各主流路において所望の濃度の溶液の調整が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を実施したマイクロチップ、マスターチップについて、図面を参照して説明する。
図１、図２に多段階の濃度の溶液を調整する微小流路網の模式図を示す。
図１、図２において、マイクロチップ１は、溝状の微小流路網２０が形成されたチップ基板２（図１０（ｇ）参照）に、カバープレート３を貼り合わせた構造になっている。微小流路網２０は、チップ基板２の片面（以下、流路形成面２ａとも言う）に形成されており、前記カバープレート３は、前記チップ基板２に、前記流路形成面２ａを覆うようにして貼り合わされている。
なお、チップ基板２、カバープレート３としては、例えば、ポリジメチルシロキシサン（以下、ＰＤＭＳとも言う）等の、微小流路を持つマイクロチップの材質として周知の合成樹脂製のものを採用できる。
【００１０】
図１に示すように、前記微小流路網２０は、液体が導入される複数（図１においては２つ）の液体導入口２１と、４以上（図１においては８つ）の液体排出口２２とを有し、前記液体導入口２１から導入された液体を前記液体排出口２２へ導くようになっている。
この微小流路網２０は、複数の液体導入口２１から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口２２毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されている。
【００１１】
図１、図２に示す微小流路網２０について、具体的に説明する。
図１、図２において、符号２３は送液ライン、２４は主流路（混合部）、２５は主流路２４同士を接続する接続流路、２６は合流点、２７は分岐点、２８は第１抵抗流路、２９は第２抵抗流路である。
【００１２】
微小流路網２０は、２つの液体導入口２１の一方（以下、第１液体導入口とも言う。図中、符号２１１を付す。）に連通された１本の送液ライン２３（図中、符号２３１）と、他方の液体導入口２１（以下、第２液体導入口とも言う。図中、符号２１２を付す）から延びる液体供給流路２１ｂに連通され、この液体供給流路２１ｂを介して第２液体導入口２１２に連通された複数の送液ライン２３（図中、符号２３２〜２３８）とを具備する。
各送液ライン２３の、液体導入口２１とは反対側の端部（送液方向下流端）には、それぞれ、液体排出口２２が設けられている。
【００１３】
各送液ライン２３は、主流路２４と、この主流路２４の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路２８と、前記主流路２４の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路２９とを具備して構成されている。
第１抵抗流路２８及び第２抵抗流路２９は、主流路２４よりも流路断面積が小さく形成されており、微小流路網２０を流れる液体に主流路２４よりも大きい流路抵抗を与える。
【００１４】
第１液体導入口２１１に連通する送液ライン２３１は、その第１抵抗流路２８の送液方向上流端が、第１液体導入口２１１から延びる液体供給流路２１ａに連通され、この液体供給流路２１ａを介して第１液体導入口２１１に連通されている。また、この送液ライン２３１は、その第２抵抗流路２９の送液方向下流端が、液体排出口２２に連通されている。
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８は、その第１抵抗流路２８の送液方向上流端が、第２液体導入口２１２から延びる液体供給流路２１ｂに連通され、この液体供給流路２１ｂを介して第２液体導入口２１２に連通されている。また、この送液ライン２３２〜２３８は、その第２抵抗流路２９の送液方向下流端が、液体排出口２２に連通されている。
【００１５】
なお、各送液ライン２３の主流路２４はその流路断面積が同じに揃えられている。
また、微小流路網２０において、接続流路２５、第１、第２抵抗流路２８、２９以外の流路（例えば、液体供給流路２１ａ、２１ｂ）は、その流路断面積が、各送液ライン２３の主流路２４と同じに揃えられている。
但し、本発明は、各送液ライン２３の主流路２４の流路断面積にばらつきがある構成や、微小流路網２０における、主流路２４、接続流路２５、第１、第２抵抗流路２８、２９以外の流路の流路断面積が主流路２４の流路断面積と異なっている構成を排除するものではない。
【００１６】
この微小流路網２０において、符号２７を付した分岐点は、送液ライン２３の主流路２４の送液方向下流端と前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とが互いに連通された連通箇所である。
また、符号２６を付した合流点は、送液ライン２３の主流路２４の送液方向上流端と前記第１抵抗流路２８と接続流路２５とが互いに連通された連通箇所である。
【００１７】
第１液体導入口２１１に連通する送液ライン２３１には、主流路２４の送液方向下流端を、前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とに分岐した分岐点２７が設けられている。この分岐点２７では、前記第２抵抗流路２９と接続流路２５と主流路２４とが互いに連通されている。この送液ライン２３１の主流路２４に連通された接続流路２５は、第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内の一つ（送液ライン２３２）の主流路２４の送液方向上流端の合流点２６にて、第１抵抗流路２８とともに、主流路２４に連通されており、送液ライン２３１の主流路２４から送液ライン２３２の主流路２４へ液体を導入するための液体流路として機能する。
【００１８】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内、符号２３２〜２３６の送液ライン２３は、主流路２４の送液方向下流端を前記第２抵抗流路２９と接続流路２５とに分岐（２つの流路２９、２５と主流路２４の送液方向下流端とを互いに連通）した分岐点２７と、第１抵抗流路２８と接続流路２５と主流路２４の送液方向上流端とを互いに連通させた合流点２６とを有し、各送液ライン２３２〜２３６の主流路２４が、接続流路２５を介して縦続に接続されている。また、送液ライン２３７には、合流点２６、分岐点２７の内、合流点２６のみが設けられている。この送液ライン２３７の前記合流点２６にて、第１抵抗流路２８とともに主流路２４の送液方向上流端と連通された接続流路２５は、接続流路２５を介して縦続に接続された送液ライン２３２〜２３６の主流路２４の内の、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最下流に位置する主流路２４（送液ライン２３６の主流路２４）の送液方向下流端の分岐点２７にて主流路２４と連通されており、送液ライン２３６の主流路２４から送液ライン２３７の主流路２４へ液体を導入するための液体流路として機能する。
これにより、この微小流路網２０にあっては、第１液体導入口２１１に導入した液体を、送液ライン２３１〜２３７の主流路２４に流入させることができる。
また、各接続流路２５は、分岐点２７側の端部が送液方向上流端、合流点２６側の端部が送液方向下流端となっている。
【００１９】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３８の内、符号２３８の送液ライン２３には、接続流路２５は接続されていない。この送液ライン２３８には、他の送液ラインからの液体の導入は無い。
【００２０】
第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８は、これら送液ライン２３２〜２３７の内、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３２から、下流側に位置する送液ラインに行くほど、順次、第１抵抗流路２８の液体に与える流路抵抗が大きくなるように形成されている。
送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８が発生する流路抵抗の違いは、例えば、各送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８の流路断面積の違いによって実現することも可能であるが、ここでは、各送液ライン２３２〜２３７の第１抵抗流路２８として、流路断面積が同じものを採用し、この第１抵抗流路２８の流路長の違いによって流路抵抗の違いを実現している。
なお、送液ライン２３１〜２３８の第１抵抗流路２８は、流路断面積が同じに揃えられ、それぞれ、流路長全長にわたって流路断面積が一定に形成されている。
【００２１】
また、送液ライン２３１〜２３７の第２抵抗流路２９は、これら送液ライン２３１〜２３７の内、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３１から、下流側に位置する送液ラインに行くほど、順次、第２抵抗流路２９の液体に与える流路抵抗が小さくなるように形成されている。
送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９が発生する流路抵抗の違いは、例えば、各送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９の流路断面積の違いによって実現することも可能であるが、ここでは、各送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９として、流路断面積が同じものを採用し、この第２抵抗流路２９の流路長の違いによって流路抵抗の違いを実現している。
【００２２】
但し、送液ライン２３７の第２抵抗流路２９については、送液ライン２３６の第２抵抗流路２９に比べて流路断面積を大きくすることで、その流路抵抗を、送液ライン２３６よりも小さくしている。
しかし、この送液ライン２３７の第２抵抗流路２９についても、送液ライン２３１〜２３６の第２抵抗流路２９と同じ流路断面積とし、流路長の違いによって（送液ライン２３６の第２抵抗流路２９よりも流路長を短くする）、送液ライン２３６の第２抵抗流路２９よりも小さい流路抵抗を実現した構成とすることも可能であることは言うまでもない。
各送液ライン２３１〜２３８の第２抵抗流路２９は、それぞれ、流路長全長にわたって流路断面積が一定に形成されている。
【００２３】
図示例のマイクロチップ１の微小流路網２０は、２つの液体導入口２１１、２１２から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口２２毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されている。
２つの液体導入口２１１、２１２から微小流路網２０に導入した液体の種類が互いに異なるとき、第２液体導入口２１２に連通する送液ライン２３２〜２３７の主流路２４が、第２液体導入口２１２から送液ラインに導入された液体と、接続流路２５から導入された液体とを混合する混合部として機能する。各主流路２４における所望濃度の溶液の調整は、微小流路網２０の分岐点２７における溶液の分配と、合流点２６における溶液の混合とを、それぞれ主流路２４内での拡散によって行うことで実現される。
また、主流路２４内に混合を促進する機構を設けても良い。例えば攪拌子等を主流路２４の中に導入しても良い。
【００２４】
送液ライン２３毎に設けられた液体排出口２２からは、第１液体導入口２１１から導入した液体と、第２液体導入口２１２から導入した液体とが混合された液体が排出（供給）される。送液ライン２３毎に設けられた液体排出口２２から排出される溶液は、第１液体導入口２１１から導入した液体の移動方向（第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順番）において最上流に位置する送液ライン２３１から、下流側に位置する送液ラインへ行くほど、順次、第１液体導入口２１１から導入した液体の濃度が低くなり、第２液体導入口２１２から導入した液体の濃度が高くなる。
また、この微小流路網２０は、各液体導入口２１１、２１２に同じ圧力をかけることよって、各液体排出口２２について個々に設定した所望濃度の溶液を調整することができるように設計されている。
【００２５】
前記微小流路網２０の接続流路２５は、各送液ライン２３の主流路２４に比べて、流路断面積が小さく形成されている。主流路２４に比べて流路断面積が小さい接続流路２５は、その全長が、狭隘部（主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部）として機能する。また、図４に示すように、接続流路２５としては、その長手方向の一部分に、主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部２５ａを具備する構成ものであっても良い。
この微小流路網２０では、接続流路２５を介した拡散による主流路２４間での物質移動が、対流による物質移動に比べて小さい。このため、液体導入口２１１、２１２からの液体の導入を一時的に止めても、微小流路網２０における濃度プロファイルを維持することが可能となる。濃度プロファイルを維持できる時間（以下、プロファイル維持時間とも言う）の長さは、接続流路２５の流路断面積によって調整可能である。
プロファイル維持時間を長くするには、接続流路２５の流路長を大きくすることでも可能であるが、接続流路２５の流路断面積によって調整（流路断面積を小さくする）するのであれば、接続流路２５の流路長が短くて済み、マイクロチップ１全体の小型化に寄与する。
【００２６】
また、全長又は一部が主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部である接続流路２５の採用は、微小流路網２０を流れる液体の流速が非常に遅い場合に、微小流路網２０の分岐点２７と合流点２６との間における拡散による物質移動が接続流路２５（詳細には狭隘部）によって抑制されることで、所望の濃度プロファイルを安定に維持できる、といった利点がある。
【００２７】
図１に示したマイクロチップを用いて、液体導入口より８０ｋＰａで加圧して濃度の異なる２種類の液体を送液して濃度プロファイルを確認した後に、一時的に加圧を停止して３時間放置した後に再度８０ｋＰａで加圧して濃度プロファイルを確認したところ、加圧停止による濃度プロファイルの変化は確認されなかった。
【００２８】
以下、各液体排出口２２から細胞培養用の培養液を得るために、微小流路網２０に、第１液体導入口２１１から溶質が高濃度の培養液を導入し、第２液体導入口２１２から希釈液（以下、希釈用液体とも言う）を導入する場合を例に、全長又は一部が主流路２４に比べて流路断面積が小さい狭隘部である接続流路２５の採用による効果を検討する。
なお、送液ライン２３２〜２３７の主流路２４について、以下、混合部２４とも言う。
また、微小流路網２０の液体排出口２２、混合部２４、接続流路２５、分岐点２７、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９に関して、分岐点２７を、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入される順で、一段目、二段目…として説明することとし、この分岐点２７から送液方向上流側に延在する混合部２４及び該混合部２４の送液方向上流端に連通する第１抵抗流路２８、分岐点２７から送液方向下流側に延在する第２抵抗流路２９及び接続流路２５、第２抵抗流路２９の送液方向下流端の液体排出口２２についても、それぞれ、分岐点２７に対応させて、一段目、二段目…として説明することとする。合流点２６に関しては、二段目分岐点２７から送液方向上流側に延在する混合部２４の上流端の合流点２６を二段目合流点２６と称し、以下、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入される順で、三段目、四段目…として説明することとする。
送液ライン２３１〜２３８も、図１、図２において上から、つまり、第１液体導入口２１１から導入した液体が流入する順で、一段目、二段目…として説明することとする。液体排出口２２、混合部２４、合流点２６、分岐点２７、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９に関しては、送液ライン２３に対応して、一段目、二段目…と称する。
【００２９】
図３は、一段目送液ライン２３１、二段目送液ライン２３２の付近を拡大して示したものである。
図３に示すように、第１液体導入口２１１より導入された液体は、一段目分岐点２７（図３中、符号２７１を付す）において分岐し、一段目接続流路２５（図３中、符号２５１）を介して二段目合流点２６（図３中、符号２６２）において希釈用液体と合流する。
なお、図３において、符号２４１は一段目主流路、２４２は二段目主流路（混合部）、２５２は二段目接続流路、２７２は二段目分岐点、２８１は一段目第１抵抗流路、２９１は一段目第２抵抗流路、２８２は二段目第１抵抗流路、２９２は二段目第２抵抗流路である。
【００３０】
図３に示すように、高濃度液体導入口（第１液体導入口２１）より導入された液体が一段目分岐点２７１において分岐し、一部は一段目液体排出口２２１に流れ、一部は一段目接続流路２５１に流れる。一段目接続流路２５１に流れた液体は二段目合流点２６２において希釈用液体と合流し、合流点２６２で希釈された液体は二段目混合部２４２において混合される。二段目混合部２４２において混合された液体は二段目分岐点２７２おいて分岐し、一部は二段目液体排出口２２２に流れ、一部は二段目接続流路２５２に流れる。この際に一段目混合部２４１および二段目混合部２４２を流れる液体は異なる濃度の液体が流れており、各液体排出口２２の下流に微小容器３１を設けて細胞を培養することにより、異なる濃度の培養液で細胞を培養することができる。
【００３１】
一般に、細胞培養を行う場合、数日から数ヶ月の間培養液を供給し続けなければならない。従って、液体を供給するポンプ等に培養液を補充する際には、一時的に液体を止める必要がある。従来技術においては、この際に、各混合部に存在する液体が混合部間の流路を介して混ざってしまい、溶液の濃度が望まれる濃度と異なってしまうが、本発明においては、接続流路の断面積を小さくすることによってこの問題を回避することができる。また、接続流路を浅くすることによって、断面積が小さく、しかも、深さ・幅の差が小さい接続流路を容易に得ることができる。
【００３２】
また、図１、図２の構成の流路網においては各段目の分岐点において培養液を所定の比率で分配し、合流点および混合部において所定の比率で混合することにより、望ましい濃度の溶液を調整する。この分配と合流の比率は各流路を流れる溶液の流量によって決定されるが、これは各段目の第１抵抗流路、第２抵抗流路および接続流路部の流路抵抗を適切に設計することで自在に設定することができる。この際に、接続流路部、第１抵抗流路および第２抵抗流路の流路断面積が他の流路の流路断面積に比べて小さいと流路網の設計の際に他の流路の流路抵抗を無視して計算することができるので、流路網の設計が容易となる。また、接続流路、第１抵抗流路および第２抵抗流路よりも大に抵抗流路を浅くすることによって、断面積が小さく、しかも、深さ・幅の差が小さい接続流路を容易に得ることができる。
【００３３】
以下、接続流路の流路断面積と拡散による物質移動との関係について詳細に検討する。
まず、培養液の流れを止めた場合に、Ｎ段目（Ｎ＝１、２、３・・・Ｎｍａｘ）の混合部２４の液体中の溶質の接続流路２５を介した移動を考える。つまり、Ｎ段目の混合部２４とＮ−１段目およびＮ＋１段目の混合部２４との接続流路２５を介した拡散による物質移動を考える。Ｎ段目の混合部２４の溶液の濃度をＣＮ［ｋｇ／ｍ３］とする。一般に、溶液が停止している場合の拡散による物質移動の流束Ｊ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は、以下の式で表される。
【数１】
【００３４】
ここで、Ｄ［ｍ２／ｓ］は拡散定数、ｃ［ｋｇ／ｍ３］は溶質の濃度、ｘ［ｍ］は接続流路２５の長さ方向の座標である。従って、Ｎ段目の接続流路２５の平均的な流束ＪＮは、接続流路２５の長さをＬｃ［ｍ］とすると、以下の式で見積もることができる。
【数２】
【００３５】
ここで、接続流路２５の断面積をＡｃ［ｍ２］、混合部の幅、深さ、断面積および長さをＷｍ［ｍ］、Ｈｍ［ｍ］、Ａｍ［ｍ２］およびＬｍ［ｍ］とする。また、議論を簡略化するために、混合部にミキサーが設置されているとし、溶液を止めた後も混合部において溶液が完全に混合していると仮定すると、接続流路を介した拡散によるＮ段目の混合部の濃度変化は以下の式で表される。
Ｎ＝１、つまり一段目の混合部の濃度については以下の式である。
【数３】
Ｎ＞１、つまり二段目以降の混合部の濃度については以下の式である。
【数４】
Ｎ＝Ｎｍａｘ、つまりＮｍａｘ段目の混合部の濃度については以下の式である。
【数５】
【００３６】
Ｎｍａｘ＝２、つまり、流路が二段の時、これらの微分方程式は容易に解くことができ、溶液を止めた瞬間のＮ段目の混合部の溶液の濃度をＣＮ，０［ｋｇ／ｍ３］とすると、送液停止後の一段目と二段目の混合部の濃度変化の解として、以下のような解が得られる。
【数６】
【数７】
【００３７】
ここで、本発明を低分子の溶質の広範な濃度範囲における微小容器内での細胞応答を試験すると想定し、各段の希釈率を１０倍と想定する、つまり、一段目、二段目の混合部の溶質濃度Ｃ１，０およびＣ２，０を１［ｋｇ／ｍ３］および０．１［ｋｇ／ｍ３］とする。また、拡散定数Ｄをショ糖の水中での拡散定数０．５ｘ１０−９［ｍ２／ｓ］程度と想定し、混合部の幅Ｗｍ［ｍ］、深さＨｍ［ｍ］、断面積Ａｍ［ｍ２］、および長さＬｍ［ｍ］を、１ｘ１０−４［ｍ］、５ｘ１０−５［ｍ］、５ｘ１０−９［ｍ］、および１ｘ１０−３［ｍ］とし、接続流路の長さＬｃ［ｍ］を１ｘ１０−４［ｍ］と設定する。
【００３８】
図５に送液停止後の各段の混合部の濃度変化に対する接続流路と混合部の断面積比（混合部／接続流路）の影響をプロットした図を示す。
接続流路と混合部の断面積比が１の場合は、送液停止後数分で一段目および二段目の混合部の濃度が接続流路を介した拡散によって変化するが、接続流路と混合部の断面積比を１０、または１００とすることで、つまり、接続流路を混合部に比べて細くすることで、各段の混合部の濃度変化が抑制されることが読み取れる。
【００３９】
また、図６に送液停止後１０分後の各段の濃度に対する接続流路と混合部の断面積比（混合部／接続流路）の影響を示す。
接続流路と混合部の断面積比が大きくなるにつれて、つまり、接続流路を混合部に比べて細くすることで送液停止後１０分後における各段の濃度変化を抑制できることが読み取れる。図６より、接続流路の断面積を混合部の断面積に対して１／１０以下とすることで、１０分後においても各段の溶質濃度の変化を抑制することが読み取れる。
【００４０】
Ｎｍａｘ＞２の時、つまり、流路が三段以上の時、これらの微分方程式（３）、（４）、（５）を解くことは容易でなくなるが、少なくとも一段目の流路に関しては図５、図６に示したような現象が起こることは容易に理解できる。
また、段階希釈によって広範な濃度範囲において多段階の濃度の溶液を調整することを想定している場合、例えば、非特許文献３のように６から８桁ほどの広範な濃度範囲で実験を行う場合には、各段において比較的大きな希釈率で溶液を調整する必要がある。つまり、ＣＮがＣＮ＋１に比べて非常に大きいので、Ｃ１＞＞Ｃ２ ＞＞ Ｃ３＞＞， ・・・， ＞＞Ｃｍａｘと考えて良く、一段目の混合部の濃度に関しては図５、図６とほぼ同じグラフが得られる。
【００４１】
次に、ある流量で溶液を流した場合の各段の接続流路の物質移動を考える。
図１，図２に示すＮ段目の第１抵抗流路、混合部、第２抵抗流路、接続流路を流れる液体の流量をそれぞれＱＮ，１、ＱＮ，２、ＱＮ，３、ＱＮ，４とする。また、Ｎ段目の混合部より下流、つまり、混合部、第２抵抗流路、液体排出口の溶液の濃度をＣＮとする。
図１、図２の構成の流路網では溶液を調整するために分岐点および合流点において溶液を所定の比率で分配、混合しており、望ましい濃度の溶液を調整するためには、この分配、混合の際に対流によって物質移動が行われる必要がある。ここでＮ段目の接続流路における対流による物質移動の流束ＪＮ，Ｃ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は接続流路内の平均流速ｖＮ，４を用いて以下の式で表される。
【数８】
【００４２】
また、拡散による物質移動の流束はＪＮ，Ｄ［ｋｇ／ｍ２／ｓ］は式（１）と同様に以下の式で表される。
【数９】
【００４３】
上述のように、望ましい濃度の溶液を調整するためには、対流による物質移動に比べて拡散による物質移動が支配的である必要があり、そのためには一般にＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄ＞１０となるのが好ましい。（８）、（９）式より以下の式が導かれる。
【数１０】
【００４４】
ここで、上述のように一段目、二段目の混合部の溶質濃度Ｃ１，０およびＣ２，０を１［ｋｇ／ｍ３］および０．１［ｋｇ／ｍ３］とし、接続流路の長さＬｃ［ｍ］を１ｘ１０−４［ｍ］と設定、拡散定数Ｄをショ糖の水中での拡散定数０．５ｘ１０−９［ｍ２／ｓ］程度と想定する。
一方、本発明においては、液体排出口の下流に微小容器（図２の符号３１）を設けて細胞を培養することを想定している。
ここでは液体排出口の下流に直径１．５ｍｍの微小容器を設けて細胞を培養することを想定する。この大きさは非特許文献１で用いている微小容器の大きさである。一般的な細胞培養では直径１０ｃｍの培養皿に１０ｍＬ程度の培養液を入れ２日間おきに培養液を交換する。この培養液の交換速度は６ｍｌ／ｍｍ２／ｄａｙ程度の速度に相当する。従って、直径１．５ｍｍの微小容器に供給されるべき培養液の供給速度は１．４ｘ１０−１４［ｍ３／ｓ］となる。上述のような希釈率が１０倍の微小流路網においては、接続流路には液体排出口の１／１０程度の流量の培養液が通過するため、ＱＮ，４＝１．４ｘ１０−１５［ｍ３／ｓ］となる。以上の条件を式（１０）に代入して計算したＪＮ，Ｃ／ＪＮ，ＤとＡｃの関係を図７に示す。
【００４５】
この図より、ＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となるためには接続流路断面積Ａｃが３．１ｘ１０−１０ｍ２以下である必要がある。接続流路の深さが上述の混合部の深さと同様に５ｘ１０−５［ｍ］と仮定すると接続流路の幅は６．２ｘ１０−６［ｍ］以下である必要があるが、このように深さ／幅の比率が８程度の流路は現実的に加工が困難である。
この場合、接続流路の幅と深さの比率が１とすると接続流路の幅および深さは１．８ｘ１０−５［ｍ］以下であればＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となり、接続流路を混合部に比べて浅くすることにより、現実的に加工できる流路構成が可能となる。
接続流路を混合部に比べて浅くすることは、混合部よりも流路断面積が小さい接続流路の形成を容易にする。
【００４６】
また、図８にＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０の場合について、式（１０）より導き出した接続流路の断面積Ａｃ［ｍ２］と接続流路を流れる溶液の流量ＱＮ，４［ｍ３／ｓ］の関係を示す。
この図より接続流路内の物質移動が対流によって支配されるために要求される接続流路断面積Ａｃの範囲が読みとれる。接続流路内の物質移動が対流によって支配されるためにはＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上であることが好ましいため、ある接続流路を流れる液体の流量ＱＮ，４についてこの図より読みとれるＡｃに比べて小さな値のＡｃであれば良い。
上述の議論と同様に直径１．５ｍｍの微小容器に培養液を供給することを想定すると、接続流路を流れる液体の流量ＱＮ，４は１．４ｘ１０−１５［ｍ３／ｓ］となる。この場合、図８より、接続流路断面積Ａｃは３．１ｘ１０−１０［ｍ２］以下であることが好ましい。接続流路の深さが混合部の深さと同様に５ｘ１０−５［ｍ］と仮定すると接続流路の幅は６．２ｘ１０−６［ｍ］以下である必要があるが、このように深さ／幅の比率が８程度の流路は現実的に加工が困難である。接続流路の幅と深さの比率が１とすると接続流路の幅および深さは１．８ｘ１０−５［ｍ］以下であればＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄが１０以上となり、接続流路を混合部に比べて浅くすることにより、現実的に加工できる流路構成が可能となる。
このことからも、接続流路を混合部に比べて浅くすることで、混合部よりも流路断面積が小さい接続流路の形成が容易になることが判る。
【００４７】
次に、混合部に比べて深さが浅い溝である接続流路を持つマイクロチップ１を、レプリカモールディング法により、作成（製造）する場合について説明する。
【００４８】
図１０（ｅ）、（ｆ）において、符号４は、マイクロチップ１のチップ基板２の作成に用いるマスターチップである。このマスターチップ４は、ベース基板４１の片面に互いに厚さが異なる樹脂層４２、４３が設けられた構成になっている。
ベース基板４１は、例えばシリコンウェハ、あるいは、シリコンウェハをダイシングして得たチップ（シリコンチップ）等の板状部材である。
【００４９】
樹脂層４２、４３は、チップ基板２の微小流路網２０のうち、浅い構造の流路である接続流路２５，抵抗流路２８および２９を形成するための樹脂層４２（以下、浅い流路形成用樹脂層とも言う）と、深い構造の流路である混合部２４および液体供給流路２１を形成するための樹脂層４３（以下、深い流路形成用樹脂層とも言う）とに大別される。深い流路形成用の樹脂層４３は、浅い流路形成用樹脂層４２に比べて厚さが大きい。そして、このマスターチップ４は、面形成用ベース基板４１の表面を基準面４Ｓとしたとき、前記基準面４Ｓから突出された部分が、微細流路網２０を形成するための流路形成用突条として機能する。
【００５０】
前記マスターチップ４の作成方法の一例としては、ベース基板４１の片面（樹脂層形成面４１ａ）に塗布したレジストを加熱硬化させてフォトレジスト層４４（以下、第１フォトレジスト層とも言う）を形成（図１０（ａ））し、次いで、図１０（ｂ）に示すように、フォトマスク４５を用いた露光と加熱により、第１フォトレジスト層４４に、浅い流路形成用樹脂層４２のパターンを焼き付ける。
次に、第１フォトレジスト層４４の上に、レジストを塗布して第２フォトレジスト層４６を形成する（図１０（ｃ））。この第２フォトレジスト層４６は、第１フォトレジスト層４４（面形成用樹脂層４２）よりも膜厚で、第１フォトレジスト層４４全体を覆うように形成する。
次いで、図１０（ｄ）に示すように、フォトマスク４７を用いた露光と加熱により、第２フォトレジスト層４６に樹脂層４３パターンを焼き付ける。
その後、図１０（ｅ）に示す現像工程にて、樹脂層４２、４３の焼き付け部分を残して、第１、第２フォトレジスト層４４、４６を除去する。
これにより、所望パターンの樹脂層４２、４３を有するマスターチップ４が得られる。
【００５１】
マスターチップ４を用いて、マイクロチップ１のチップ基板２を、レプリカモールディング法により作成（製造）するには、例えば、マスターチップ４を金型内にセットした状態で、例えばＰＤＭＳ等を用いてチップ基板２の樹脂成形を行う（図１０（ｆ））。これにより、樹脂層４２（浅い流路形成用樹脂層）および樹脂層４３（深い流路形成用樹脂層）が形成する流路形成用突条によって、微細流路網２０を持つチップ基板２が得られる。
そして、図１０（ｇ）に示すように、得られたチップ基板２にカバープレート３を貼り合わせることで、マイクロチップ１を組み立てることができる。
【００５２】
上述の手法によれば、樹脂層４２および樹脂層４３の内、流路形成用突条として機能する部分は断面矩形の突条に形成されるため、微細流路網を構成する液体流路は、断面矩形の溝状に形成される。
【００５３】
ここで、微細流路網を構成する液体流路の内、主流路２４（混合部）よりも流路断面積が小さい接続流路２５を、主流路２４（混合部）よりも深さが浅い溝として形成するには、図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、ベース基板４１に、流路形成用樹脂層として、互いに厚さの異なる樹脂層４２、４３を形成して、前記主流路２４を形成するための主流路形成用突条４３ａと、前記接続流路２５を形成するための接続流路形成用突条４２ａとを得る。接続流路形成用突条４２ａは、ベース基板４１からの突出寸法、基準面４Ｓからの突出寸法を、主流路形成用突条４３ａよりも小さくする。
【００５４】
また、図１１（ａ）、（ｂ）では、樹脂層４２によって、第２抵抗流路２９の形成用の第２抵抗流路形成用突条４２ｂをも形成されている構成を例示している。
この場合、第２抵抗流路形成用突条４２ｂは、前記ベース基板４１からの突出寸法（換言すれば基準面４Ｓからの突出寸法）が前記接続流路形成用突条４２ａと同じに揃っていることになる。
微小流路網２０を、接続流路２５と第２抵抗流路２９とを同じ深さとした構成の場合、上述のように、一つの樹脂層４２によって、接続流路形成用突条４２ａと第２抵抗流路形成用突条４２ｂとを得ることができる。
このことは、接続流路２５と第１抵抗流路２８、マスターチップ４に形成する第１抵抗流路形成用突条と接続流路形成用突条４２ａとの関係についても、同様に言える。
【００５５】
また、図１１（ａ）、（ｂ）では、主流路形成用突条４３ａの幅Ｗ１、接続流路形成用突条４２ａの幅Ｗ２、第２抵抗流路形成用突条４２ｂの幅Ｗ３が同じになっている構成を例示している。
この場合、チップ基板２の微小流路網２０として、主流路２４、接続流路２５、第２抵抗流路２９の溝幅が同じに揃ったものが得られることになる。各流路の流路断面積は、各流路の深さによって調整される。
このことは、接続流路２５と第１抵抗流路２８、マスターチップ４に形成する第１抵抗流路形成用突条と接続流路形成用突条４２ａとの関係についても、同様に言える。
本発明は、接続流路２５、第１抵抗流路２８、第２抵抗流路２９のいずれか１以上の幅が、主流路２４の幅と揃っている構成を含む。
【００５６】
図９に、試作したマイクロチップの濃度グラジエント生成機構を評価した結果を示す。
ＰＤＭＳを用いてマイクロチップを試作した。
接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路は、幅が２０μｍ、深さが１０μｍの断面矩形の溝（角溝）であり、断面寸法を揃えた。微小流路網における接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路以外の流路は、幅が１００μｍ、深さが５０μｍの断面矩形の溝（角溝）とした。接続流路、第１抵抗流路、第２抵抗流路の、主流路に対する断面積比は２５倍である。また、微小流路網は、ｎ段目の混合部における希釈率Ｄが１／２となるように設計した。
試作したマイクロチップに、第１液体導入口から濃度１７ｗｔ％のニューコクシン水溶液を送液し、第２液体導入口から希釈用の超純水を送液した。いずれも、送液を７５ｋＰａで行った。１２時間経過後に、液体排出口から排出された溶液を採取し、吸光度を測定して、検線量から濃度を算出した。得られた結果から、濃度グラジエント生成機構を評価した。図９の結果、ニューコクシン濃度は設定した希釈率にほぼ一致した単調減少を示した。また、混合部の滞留時間を充分に長く設定したことで、高圧（高流量）で薬剤を流しても、充分に２液の拡散混合が生じることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によって開示される多段階の濃度の溶液を調整する微小流路網は、広範な濃度範囲において薬剤の細胞毒性を試験するマイクロチップに応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明のマイクロチップ、該マイクロチップの微小流路網を模式的に示す図である。
【図２】図１の微小流路網を拡大して模式的に示した図である。
【図３】図２の微小流路網の一段目、二段目の送液ラインの付近を拡大して示した図である。
【図４】微小流路網の接続流路の長手方向の一部のみに狭隘部を設けた例を示す図である。
【図５】送液停止後の各段の混合部の濃度変化を示すグラフである。
【図６】送液停止１０分後の各段の混合部の濃度と、接続流路の混合部に対する断面積比との関係を示すグラフである。
【図７】接続流路の断面積ＡｃとＪＮ，Ｃ／ＪＮ，Ｄとの関係を示すグラフである。
【図８】接続流路を流れる溶液の流量と接続流路断面積との関係を示すグラフである。
【図９】試作したマイクロチップの濃度グラジエント生成機構を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｇ）は、マイクロチップの製造に用いるマスターチップの作成、マスターチップの製造（組立）手順を説明する図である。
【図１１】（ａ）、（ｂ）は、マスターチップにおいて、接続流路形成用突条、第２抵抗流路形成用突条を、同一の樹脂層によって形成した例を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…マイクロチップ、２…チップ基板、２０…微小流路網、２１…液体導入口、２１１…液体導入口（第１液体導入口）、２１２…液体導入口（第１液体導入口）、２３、２３１〜２３８…送液ライン、２４…主流路（混合部）、２５…接続流路、２５１…狭隘部、２６…合流部、２７…分岐部、２８…第１抵抗流路、２９…第２抵抗流路、４…マスターチップ、４１…ベース基板、４２…樹脂層、４３…樹脂層（流路形成用樹脂層）、４４…フォトレジスト層（第１フォトレジスト層）、４６…フォトレジスト層（第２フォトレジスト層）、４２ａ…接続流路形成用突条、４２ｂ…第２抵抗流路形成用突条。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なる濃度の液体が導入される複数の液体導入口と、４以上の液体排出口とを具備し、前記液体導入口から導入された液体を前記液体排出口へ導く微小流路網が形成され、前記微小流路網が、複数の分岐点と、複数の合流点とを有し、複数の液体導入口から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されているマイクロチップであって、
前記微小流路網は、互いに異なる濃度の液体を混合するための主流路同士を、前記主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路を介して接続して構成され、
前記接続流路が、前記微小流路網における、前記分岐点から送液方向上流側に延在する主流路と、前記合流点から送液方向下流側に延在する主流路との間の液体流路を構成していることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロチップにおいて、接続流路の前記狭隘部が、主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマイクロチップにおいて、
前記微小流路網は、前記主流路と、この主流路の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路と、前記主流路の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路とを有し、前記液体導入口から延在する送液ラインを複数具備し、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路は、前記主流路よりも流路断面積が小さく形成され、
各送液ラインは、その送液方向上流端が前記液体導入口と連通され、送液方向下流端が前記液体排出口と連通されており、
前記接続流路は、その送液方向上流端が、前記送液ラインの前記主流路の送液方向下流端の前記分岐点にて前記主流路に連通され、送液方向下流端が、別の送液ラインの前記主流路の送液方向上流端の前記合流点にて前記主流路に連通されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項４】
請求項３記載のマイクロチップにおいて、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路と、前記接続流路の前記狭隘部とが、互いの深さを揃えて、前記主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップにおいて、液体排出口の下流に微小容器が接続されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項６】
請求項５に記載のマイクロチップにおいて、前記微小容器が、細胞培養用容器であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロチップにおいて、前記微小流路網が、各液体導入口に同じ圧力をかけることよって所定の濃度の溶液を調整することができるように設計されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロチップをレプリカモールディングによって作製するためのマスターチップであって、
ベース基板上に形成した、互いに厚さの異なる樹脂層によって、前記主流路を形成するための主流路形成用突条と、前記接続流路を形成するための接続流路形成用突条とが形成され、
前記接続流路形成用突条は、前記主流路形成用突条に比べて厚さが小さい樹脂層によって形成され、前記ベース基板からの突出寸法が前記主流路形成用突条に比べて小さいことを特徴とするマスターチップ。
【請求項９】
請求項８に記載のマスターチップにおいて、前記樹脂層がフォトレジスト層であることを特徴とするマスターチップ。
【請求項１０】
請求項４記載のマイクロチップを作成するための請求項８又は９記載のマスターチップであって、
さらに、前記第１抵抗流路を形成するための第１抵抗流路形成用突条と、前記第２抵抗流路を形成するための第２抵抗流路形成用突条とが、主流路形成用突条に比べて前記ベース基板上の厚さが小さい樹脂層によって形成され、しかも、これら第１、第２抵抗流路形成用突条の前記ベース基板からの突出寸法が前記接続流路形成用突条と同じに揃えられていることを特徴とするマスターチップ。
【請求項１】
互いに異なる濃度の液体が導入される複数の液体導入口と、４以上の液体排出口とを具備し、前記液体導入口から導入された液体を前記液体排出口へ導く微小流路網が形成され、前記微小流路網が、複数の分岐点と、複数の合流点とを有し、複数の液体導入口から導入された液体を、分岐と合流を二回以上繰り返すことにより、液体排出口毎に互いに異なる多段階の濃度の溶液を調整するように構成されているマイクロチップであって、
前記微小流路網は、互いに異なる濃度の液体を混合するための主流路同士を、前記主流路よりも流路断面積が小さい狭隘部を有する接続流路を介して接続して構成され、
前記接続流路が、前記微小流路網における、前記分岐点から送液方向上流側に延在する主流路と、前記合流点から送液方向下流側に延在する主流路との間の液体流路を構成していることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロチップにおいて、接続流路の前記狭隘部が、主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマイクロチップにおいて、
前記微小流路網は、前記主流路と、この主流路の送液方向上流端に接続された第１抵抗流路と、前記主流路の送液方向下流端に接続された第２抵抗流路とを有し、前記液体導入口から延在する送液ラインを複数具備し、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路は、前記主流路よりも流路断面積が小さく形成され、
各送液ラインは、その送液方向上流端が前記液体導入口と連通され、送液方向下流端が前記液体排出口と連通されており、
前記接続流路は、その送液方向上流端が、前記送液ラインの前記主流路の送液方向下流端の前記分岐点にて前記主流路に連通され、送液方向下流端が、別の送液ラインの前記主流路の送液方向上流端の前記合流点にて前記主流路に連通されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項４】
請求項３記載のマイクロチップにおいて、前記第１抵抗流路及び前記第２抵抗流路と、前記接続流路の前記狭隘部とが、互いの深さを揃えて、前記主流路に比べて深さが浅く形成された溝であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップにおいて、液体排出口の下流に微小容器が接続されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項６】
請求項５に記載のマイクロチップにおいて、前記微小容器が、細胞培養用容器であることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロチップにおいて、前記微小流路網が、各液体導入口に同じ圧力をかけることよって所定の濃度の溶液を調整することができるように設計されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロチップをレプリカモールディングによって作製するためのマスターチップであって、
ベース基板上に形成した、互いに厚さの異なる樹脂層によって、前記主流路を形成するための主流路形成用突条と、前記接続流路を形成するための接続流路形成用突条とが形成され、
前記接続流路形成用突条は、前記主流路形成用突条に比べて厚さが小さい樹脂層によって形成され、前記ベース基板からの突出寸法が前記主流路形成用突条に比べて小さいことを特徴とするマスターチップ。
【請求項９】
請求項８に記載のマスターチップにおいて、前記樹脂層がフォトレジスト層であることを特徴とするマスターチップ。
【請求項１０】
請求項４記載のマイクロチップを作成するための請求項８又は９記載のマスターチップであって、
さらに、前記第１抵抗流路を形成するための第１抵抗流路形成用突条と、前記第２抵抗流路を形成するための第２抵抗流路形成用突条とが、主流路形成用突条に比べて前記ベース基板上の厚さが小さい樹脂層によって形成され、しかも、これら第１、第２抵抗流路形成用突条の前記ベース基板からの突出寸法が前記接続流路形成用突条と同じに揃えられていることを特徴とするマスターチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−１０９２４９（Ｐ２００９−１０９２４９Ａ）
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７９７１１（Ｐ２００７−２７９７１１）
【出願日】平成１９年１０月２６日（２００７．１０．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構委託研究、「二次元培養細胞マニピュレーション装置の開発」、産業活力再生特別措置法第１９条の適用を受けるもの。
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２６日（２００７．１０．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構委託研究、「二次元培養細胞マニピュレーション装置の開発」、産業活力再生特別措置法第１９条の適用を受けるもの。
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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