マイクロチップ
【課題】抗原・抗体など試料中のターゲットなどの捕捉率を高め、ターゲットを認識する認識物質とターゲットとの反応生成物の濃度を、反応場の場所にかかわらず均一化する。
【解決手段】遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと認識物質との接触時間が、混合槽１２中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽１２で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽１２の場所にかかわらず均一化される。均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。
【解決手段】遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと認識物質との接触時間が、混合槽１２中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽１２で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽１２の場所にかかわらず均一化される。均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップの使用方法、マイクロ流路及びマイクロチップに関し、生体物質を分離、混合、検出するために利用されるマイクロ流路及びこれを備えたマイクロチップの使用方法、マイクロ流路及びマイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微量試料で簡便に短時間で高精度な免疫分析を可能とすることを目的とする免疫分析装置が開示されている。図７は、この免疫分析装置の構成を示す斜視図である。免疫分析装置１０１の導入部１０５から導入された溶液は、反応場１０３に固定された微粒子１０２と反応する。
【特許文献１】特開２００１−００４６２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、特許文献１の免疫分析装置では、溶液を微粒子１０２と接触させるためには、ポンプが用いられると推測される。この免疫分析装置１０１は、遠心操作可能な構成を有していないからである。しかしポンプでの送液では、流路の位置にかかわらず、流速を一定に制御することが困難である。これは、低流速の場合や、溶液が何らかのジャンクションを通過する場合、顕著に表れる。その結果、溶液中の抗原や抗体を確実に捕捉することができず、試料などの溶液と微粒子との接触時間が、反応場１０３の場所によって変わってしまい、抗原抗体反応などにより生じる反応物の濃度が反応場１０３内で不均一になる。
【０００４】
図８は、インク液と、試料中のターゲットと反応する認識物質が固定された微粒子と、をポンプの送液により接触させた場合の実験例を示す写真である。反応場としてのチャンバＴの導入口ＭからチャンバＴ内に導入された試料溶液は、ポンプ口Ｑに取り付けられるポンプにより、導入口Ｍからポンプ口Ｑに流動する。その途中で、試料溶液とチャンバＴ内の微粒子とが接触することにより、ターゲットと認識物質との反応を生じさせる。ターゲットの濃度は、チャンバＴの粒子の色の変化により示されている。ポンプにより試料溶液を送液するに従い、導入口Ｍを中心としてターゲットがチャンバＴ内に広がっていく。ただし、その濃度は、導入口Ｍ近傍が高く、導入口Ｍから離れるに従い低くなり、チャンバの隅部ではターゲットを目視で確認できないほどである。
【０００５】
図８が示すように、ポンプで反応場に送液した場合、ターゲットと認識物質との反応は反応場内で不均一になってしまう。これでは、反応場内で生成された反応液を部分抽出し、その後の処理に用いることが難しい。反応場内での濃度の不均一さが後段の処理に影響することを防止するためには、反応場内の反応液全てを後段の処理に用いる必要がある。このため、反応場の後段の各部分、例えば検出部や混合槽において、試料や試薬の量を減量することが難しく、マイクロチップ自体の大きさを小型化しにくいという問題がある。
【０００６】
本発明は、抗原・抗体など試料中のターゲットなどの捕捉率を高め、溶液中に存在する物質の濃度を、反応場の場所にかかわらず均一化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明１は、遠心力を用いて試料を処理するマイクロチップを提供する。このマイクロチップは、以下の要素を供えている。
・前記試料中のターゲットを認識する第１認識物質または前記第１認識物質を認識する第２認識物質が粒状担体に固定化されてなる微粒子と、前記試料と、を混合する混合槽、
・前記混合槽に連結されているマイクロ流路。
【０００８】
このマイクロチップにおいて、前記混合槽は、前記微粒子を流動可能な状態に保持している。
遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽の場所にかかわらず均一化される。
【０００９】
上記のように均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ全体を小型化することができる。混合工程の後工程に用いる部分としては、例えば第２の混合槽や検出部を挙げることができる。また、混合槽の下流側にさらにミキシングのための流路を設けている場合、その流路を短くしたり省略するなどにより、マイクロチップ全体を小型化することができる。
【００１０】
微粒子は、予め混合槽に保持されている。混合槽内の微粒子は、予め第１認識物質または第２認識物質が固定化された粒状担体でもよいし、第１認識物質または第２認識物質が固定化されていない粒状担体であってもよい。後者の場合、第１認識物質または第２認識物質を含む試薬を混合槽に導入することにより、混合槽内部で粒状担体に第１認識物質または第２認識物質を固定化し、微粒子を生成することができる。その後、生成された微粒子と、試料と、を遠心力により接触させることで、試料中のターゲットを第１認識物質に、または前記第１認識物質を第２認識物質に認識させることができる。
【００１１】
本発明２は、前記発明１において、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記混合槽内部の前記微粒子の径よりも大きく形成されて居るマイクロチップを提供する。このマイクロチップは、前記連結部分に形成され、前記混合槽からの前記微粒子の流出を防止する流出止め柱をさらに備えている。
マイクロ流路の最小径が微粒子の径よりも大きい場合、流出止め柱を設けておくことにより、マイクロチップの運搬中などに微粒子が混合槽から外部に漏れてしまうことを防ぐ。また、流出止め柱を設けることにより、マイクロ流路の径を大きく設計できるので、マイクロチップ自体の作製が容易になる。
【００１２】
本発明３は、前記発明１において、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記微粒子の径よりも小さく形成されているマイクロチップを提供する。
マイクロ流路の最小径が微粒子の径よりも小さい場合、マイクロチップの運搬中などに微粒子が混合槽から外部に漏れてしまうことを防ぐことができる。
【００１３】
本発明４は、発明１〜３において、前記混合槽の壁面の一部が、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されているマイクロチップを提供する。
混合槽の壁面が回転方向に沿って形成されていると、回転方向に沿ってマイクロチップが回転した場合、混合槽の内容物が湾曲した壁面に沿って移動しやすい。そのため、微粒子と試料とを均一に混合しやすくなる。
【００１４】
２以上の回転軸を中心としてマイクロチップを回転させる場合、それぞれの回転方向に沿った湾曲面を混合槽が有していることが好ましい。異なる回転方向に沿って回転させることにより、それぞれの回転において内容物が混合されやすくなる。その結果、混合液の濃度がさらに均一化されやすくなる。
本発明５は、前記発明１〜４において、前記マイクロ流路が、前記混合槽における混合時に、前記混合槽の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されているマイクロチップを提供する。
【００１５】
マイクロ流路は、混合槽における混合工程で、混合液の圧力を受けない壁面に連結されていることが好ましい。例えば、マイクロ流路は、混合時に混合液の圧力を受ける壁面と対向する壁面などに連結されていることが好ましい。試料を混合槽に導入するマイクロ流路や、混合液を後段の工程のために排出するマイクロ流路から混合槽外部に、混合液が流出することを防止しやすくなる。
【００１６】
本発明６は、前記発明１〜５において、前記マイクロ流路が、所定の第１回転方向と所定の第２回転方向とにマイクロチップ自身が回転している場合に、混合槽内の混合液が漏れない位置に連結されているマイクロチップを提供する。
混合槽内の微粒子と試料とを回転により混合するには、実際にはマイクロチップを少なくとも２方向に回転する必要がある。一方向の回転だけでは、遠心力が一方向にしか働かず、混合液の濃度を均一化することができないからである。そのため、マイクロ流路の連結部分は、第１回転方向と第２回転方向とにマイクロチップが回転しているときに、混合液が漏れない位置に設けられる。なお、マイクロチップの回転軸は、３つ以上あっても構わない。
【００１７】
本発明７は、前記発明１〜６において、前記粒状担体が多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、または磁性ビーズであるマイクロチップを提供する。
多糖類系粒状ゲル、例えばキトパール（富士紡績株式会社製；登録商標）は、抗原や抗体、酵素などを固定化する担体としての機能に加え、回転により破壊されない強度を有している。そのため、本発明の粒状担体として好適に用いることができる。
【００１８】
本発明８は、前記発明１のマイクロチップの使用方法を提供する。この使用方法は、第１の回転方向に前記マイクロチップを回転させ、その後前記第１の回転方向とは異なる第２の回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記微粒子と前記試料とを前記混合槽内で混合する混合ステップを含む。
混合槽に導入された試料と、認識物質が固定化された微粒子と、を２方向の回転により混合する。混合槽の場所にかかわらず、認識物質と試料との接触時間はおおむね均一になる。さらに少なくとも異なる２つの回転方向にマイクロチップを回転させるため、微粒子と試料との混合液の濃度を、混合槽内部の位置にかかわらず均一化することができる。
【００１９】
本発明９は、前記発明８において、以下のステップをさらに含むマイクロチップの使用方法を提供する。
・前記第１及び第２回転方向とは異なる第３回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記混合槽内の混合液の一部を前記マイクロ流路のいずれかにより排出する排出ステップ、
・前記排出ステップで排出された混合液の一部を用い、前記試料中のターゲットの分析を行う分析ステップ。
【００２０】
発明８で得られる混合液の濃度は混合槽の場所にかかわらず均一であるため、混合槽内の混合液の一部を抽出するだけで、後工程を実行することができる。そのため、後工程に必要とされる試薬の量などを削減することができる。
本発明１０は、前記発明８，９において、前記混合ステップを繰り返す混合繰り返しステップをさらに含むマイクロチップの使用方法を提供する。
【００２１】
異なる方向の回転を繰り返すことにより、混合液の濃度の均一化を高めることができる。
本発明１１は、前記発明８〜１０において、前記混合槽内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部が含まれないよう、前記第１回転方向及び前記第２回転方向を調整するマイクロチップの使用方法を提供する。
【００２２】
混合時に、マイクロ流路から混合液が外部に漏れないよう、回転方向を調整する。これにより、遠心分離などに用いられる回転力により、混合槽内の溶液を混合することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のマイクロチップを用いれば、遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽の場所にかかわらず均一化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
＜第１実施形態＞
（１）マイクロチップの全体構成
図１は、第１実施形態にかかるマイクロチップの平面図である。本発明が対象とするマイクロチップは、試料中のターゲットとターゲットを認識する物質と微粒子とを混合する工程において、溶液の移動にポンプを使わず遠心力を用いることを前提としたマイクロチップである。
【００２５】
図１のマイクロチップ１０は、以下の構成要素を有している。
（ａ）試料導入部
試料導入部１１は、試料を外部からマイクロチップ１０内部に導入する。試料導入部１１は、導入した試料を一時的に保持する機能を有していてもよい。
（ｂ）混合槽
混合槽１２は、認識物質が固定化された粒状担体（以下、微粒子という）または認識物質固定化前の粒状担体を、流動可能な状態に保持している。混合槽１２は、少なくとも試料と微粒子とが混合される空間であり、さらに試薬が混合される場合もある。固定化される認識物質は、試料中のターゲットと反応する第１認識物質か、または前記第１認識物質と反応する第２認識物質である。ターゲットと第１認識物質との組み合わせ、及び第１認識物質と第２認識物質との組み合わせは、例えば、酵素−基質、助酵素−酵素、抗原−抗体、リガンド−レセプター、DNA−DNA、DNA−RNA、RNA−RNA、PNA−DNA、PNA−RNAからなる群から選択される少なくとも1種である。混合槽１２については、詳細を後述する。
【００２６】
（ｃ）マイクロ流路
マイクロ流路１３ａ，ｂ（以下、まとめてマイクロ流路１３という）は、混合槽１２に連結され、混合槽１２に試料や試薬を導入したり、混合槽１２内の混合液を外部に排出したりする。マイクロ流路１３において、混合槽１２との連結部分における径は、混合槽１２内部の微粒子の径よりも大きく形成されている。ただし連結部分には、流出止め柱１７ａ，ｂが形成されている。流出止め柱１７ａ，ｂとマイクロ流路１３との間隔は、微粒子の径よりも小さくなるように調整されている。これにより、いかなる回転方向がマイクロチップ１０に印加されても、混合槽１２内部の微粒子がマイクロ流路１３に流出することを防止する。
【００２７】
流出止め柱１７ａ，ｂは、１つの流路１３ａ、ｂに対して複数本設けても良い。その場合には、流出止め柱１７ａ，ｂの間隔が微粒子の径を超えないように調整される。
（ｄ）予備混合槽
予備混合槽１４は、試料導入部１１と混合槽１２との間に設けられた空間である。予備混合槽１４は、試薬を保持している。試料導入部１１から導入された試料と試薬とは、予備混合槽１４で混合される。混合された試料と試薬とは、マイクロ流路１３ａを通って混合槽１２に移動する。予備混合槽１４に保持される試薬は、例えば第１認識物質としての酵素標識抗体である。酵素標識抗体は、試料中のターゲットと反応する。さらに、酵素標識抗体は、酵素の働きによって発色反応を促進する。予備混合槽１４の大きさや形状は特に限定されない。予備混合槽１４は、例えば１０〜３０μＬ程度の体積を有している。
【００２８】
（ｅ）比色反応部
比色反応部１５は、試薬を保持する空間である。混合槽１２から比色反応部１５に導入された混合液と、比色反応部１５内の試薬とは、さらに混合される。試薬としては、混合液内に含まれる酵素などの標識物質と反応し、一定の色を発色する物質が選択される。本発明では、混合槽１２内の混合液の濃度は均一化されており、混合液の全量を比色反応部１５に移動させる必要がないため、比色反応部１５の容量や保持する試薬の量を抑えることができる。比色反応部１５の大きさや形状は特に限定されないが、例えば１０〜１００μＬ程度の体積を有している。
【００２９】
（ｆ）検出部
検出部１６には、比色反応部１５において所定の色を発色した反応物質が導入される。検出部１６に導入された発色反応物質は、所定の検出方法により、その濃度や量などが検出される。検出方法は、光学的方法が一般的に用いられる。光学的検出方法を用いる場合、検出部１６には、内部に光を照射し、その反射光や透過光、散乱光などを検出できるよう、光の入射口や光路、光の出射口が形成されている。検出部１６は、例えば１０ｍｍ程度の長さを有し、断面積が０．２５〜１ｍｍ2程度の一定形状を有している。
【００３０】
（２）混合槽
（２−１）混合槽の形状
前記混合槽１２の壁面の一部は、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されている。混合槽１２の壁面が回転方向に沿って形成されていると、微粒子と試料との混合を促進し、混合液中の反応物の濃度を均一化しやすい。
【００３１】
本発明のマイクロチップ１０は、２以上の異なる回転方向（以下、第１回転方向、第２回転方向という）にマイクロチップ１０を回転させ、混合槽１２内の微粒子と試料とを混合する。混合槽１２内の微粒子と試料とを回転により混合するには、一方向の回転だけでは、混合液の濃度を均一化することができないからである。そのため、混合槽１２は、第１回転方向に沿った湾曲面Ｗ１及び第２回転方向に沿った湾曲面Ｗ２を有していることが好ましい。微粒子と試料との混合を促進することができ、ひいては混合液の濃度の均一性を高めることができる。
【００３２】
第１回転方向の回転で生じる遠心力Ｆ１と、第２回転方向の回転で生じる遠心力Ｆ２とは、なす角度が１８０度に近いほど混合を促進しやすいが、より小さな角度、例えば９０度程度の角度でも混合することができる。しかし、湾曲面Ｗ１、Ｗ２は、滑らかに連続していることが好ましい。回転方向が変わるときに、微粒子が混合槽１２内壁に沿って移動しやすいからである。
【００３３】
（２−２）混合槽とマイクロ流路との連結
マイクロ流路１３は、混合槽１２における混合時に、混合槽１２の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されている。言い換えれば、マイクロ流路１３は、前述の第１回転方向と第２回転方向とにマイクロチップ１０が回転している場合、混合槽１２内の混合液が漏れないような位置に連結されている。この例では、湾曲面Ｗ１，Ｗ２以外の面に、マイクロ流路１３は連結されている。
【００３４】
これにより、試料を混合槽１２に導入するマイクロ流路１３ａや、混合液を比色反応部１５に排出するマイクロ流路１３ｂから混合槽１２外部に、混合液が流出することを防止しやすくなる。
なお、マイクロ流路１３ａは、所定の第３回転方向にマイクロチップ１０を回転させたとき、図中矢印Ｆinの方向に働く遠心力により予備混合槽１４から混合槽１２内部に液体が導入される位置及び向きに、予備混合槽１４と混合槽１２とを連結している。これにより、予備混合槽１４内の液体は、マイクロ流路１３ａを通って混合槽１２に導入される。
【００３５】
また、マイクロ流路１３ｂは、所定の第４回転方向にマイクロチップ１０を回転させたとき、図中矢印Ｆoutの方向に働く遠心力により、混合槽１２内部の混合液が流出可能な位置及び向きに連結されている。これにより、混合液は、マイクロ流路１３ｂを通って比色反応部１５に導入される。
（２−３）混合槽内の粒状担体
粒状担体は、予め混合槽１２に保持されている。粒状担体には、予め第１認識物質または第２認識物質が固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。後者の場合、試料を混合槽１２に導入するに先立ち、第１認識物質または第２認識物質を含む試薬を混合槽１２に導入する。これにより、混合槽１２内部で粒状担体に第１認識物質または第２認識物質を固定化し、微粒子を生成することができる。その後、混合槽１２内に試料を導入し、生成された微粒子と試料とを遠心力により接触させることで、試料中のターゲットを第1認識物質に、または第1認識物質を第2認識物質に、認識させることができる。
【００３６】
第１認識物質または第２認識物質が固定化される粒状担体は、第１認識物質または第２認識物質と共有結合を生成しやすい粒子が好ましい。粒状担体の粒径は、数１００μｍを超えないことが好ましい。さらに、粒状担体は、マイクロチップ１０が遠心分離にかけられても、混合槽１２内部で破壊されない程度の強度を有していることが好ましい。このような条件を充足する粒状担体の一例として、多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、磁性ビーズを挙げることができる。
【００３７】
多糖類系粒状ゲルの好ましい例としては、キトパール（富士紡績株式会社製：登録商標）が挙げられる。なお、キトパールを粒状担体として用いる場合、混合槽１２に緩衝液を保持させ、キトパールの乾燥を防止する。キトパールと緩衝液とを合わせた容量は、例えば１６μリットル程度であり、この中でキトパールが占める容量は１０マイクロリットル程度である。
【００３８】
磁性ビーズの一例としては、Fe3O4, γ-Fe2O3, Co-γ-Fe2O3, (NiCuZn)O・Fe2O3, (CuZn)O・Fe2O3, (Mn・Zn)O・Fe2O3, (NiZn)O・Fe2O3, SrO・6Fe2O3, BaO・6Fe2O3, SiO2で被覆したFe2O3、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、タンパク質など）とフェライトとの複合微粒子、磁性金属微粒子などを挙げることができる。
なお、マイクロチップの各機能部の配置や数、形状などは、上記の例に限定されない。例えば、導入部１１から混合槽１２に至る各機能部の配置や形状、混合槽１２から検出部１６に至る各機能部の配置や形状は、必要に応じて適宜設計変更することができる。
【００３９】
（３）マイクロチップにおける反応プロセス
次に図２及び図３を用い、図１のマイクロチップ１０における反応プロセスの流れについて説明する。
図２は、予備混合槽１４に第１認識物質としての標識抗体が、混合槽１２に第２認識物質を固定化した微粒子が、それぞれ保持されている場合の処理プロセスを示す。この図では、第２認識物質として、第１認識物質と抗原抗体反応を示す固定化抗原／抗体を考える。
【００４０】
まず、試料導入部１１から予備混合槽１４にターゲットを導入し（Ｓ１）、予備混合槽１４でターゲットと第１認識物質とを混合して反応させる（Ｓ２）。次いで、反応液を混合槽１２に導入し（Ｓ３）、固定化抗原／抗体と、ターゲットと第１認識物質との反応物質と、第１認識物質と、を混合する（Ｓ４）。これにより、第１認識物質と固定化抗原／抗体とが反応し、第１認識物質が微粒子に捕捉される。微粒子に捕捉された第１認識物質は混合槽１２内に留まる。一方、第１認識物質と反応したターゲットが微粒子に捕捉されることなく比色反応部１５に導入され、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる（Ｓ５）。その後、比色反応部１５に導入された、標識抗体とターゲットとの反応物質を発色物質と混合し、標識抗体におけるＨＲＰの活性によって発色させる。発色した混合液を例えば吸光度測定し、得られた結果を換算することにより、試料中のターゲットを定量することができる。
【００４１】
図３は、予備混合槽１４に標識ターゲットが、混合槽１２に第１認識物質を固定化した微粒子が、それぞれ保持されている場合の処理プロセスを示す。この図では、第１認識物質として、ターゲットと抗原抗体反応を示す固定化抗原／抗体を考える。
まず、試料導入部１１から予備混合槽１４にターゲットを導入し、予備混合槽１４でターゲットと標識ターゲットとを混合する（Ｓ１１）。次いで、混合液を混合槽１２に導入し（Ｓ１２）、固定化抗原／抗体と、ターゲットと、標識ターゲットと、を混合する（Ｓ１３）。これにより、ターゲット及び標識ターゲットと固定化抗原／抗体とが反応し、ターゲット及び標識ターゲットの一部が微粒子に捕捉される。微粒子に捕捉されたターゲット及び標識ターゲットは混合槽１２内に留まる。一方、残りのターゲット及び標識ターゲットは、微粒子に捕捉されることなく比色反応部１５に導入され、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる（Ｓ１４）。その後、比色反応部１５に導入された、標識ターゲット及びターゲットを発色物質と混合し、標識ターゲットにおけるＨＲＰの活性によって発色させる。発色した混合液を例えば吸光度測定し、得られた結果を換算することにより、標識ターゲットを定量する。最初に用いた標識ターゲットの量と試料の量との比と、定量した標識ターゲットの量と、からターゲットを定量することができる。
【００４２】
（４）マイクロチップの使用方法
図４は、図１のマイクロチップ１０の使用方法の説明図である。ここでは、混合槽１２には、第１認識物質または第２認識物質が固定化された粒状担体が予め保持されている場合を説明する。以下の使用方法は、試料導入ステップ、第１混合ステップ、第２〜第４混合ステップ及び排出ステップを含む。
【００４３】
（４−１）試料導入ステップ
まず、図４（ａ）に示すように、第３回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、図中矢印Ｆinで示す方向の遠心力を印加する。これにより、試料導入部１１の試料及び予備混合槽１４の試薬を、混合槽１２に導入する。これにより、試料中のターゲットと混合槽１２中の第１認識物質と、または予備混合槽１４から導入される第１認識物質と混合槽１２中の第２認識物質と、が接触する。混合槽１２における反応物質同士の接触時間は、混合槽１２内部の場所にかかわらずほぼ均一となる。
【００４４】
（４−２）第１混合ステップ
次いで図４（ｂ）に示すように、第１回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、図中矢印Ｆ１で示す方向の遠心力を印加する。これにより、混合槽１２内の液体と微粒子とを攪拌／混合する。混合液に異なる方向の遠心力が加わることで、被検出物質の濃度の均一性を高めることができる。第１回転方向中の遠心力Ｆ１と、試料を混合槽に導入する時に印加される遠心力Ｆinとが１８０度に近いほど、反応物質の濃度を均一化しやすい傾向にある。 （４−３）第２〜第４混合ステップ
図４（ｃ）に示すように、第２回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、第２混合ステップを行う。これにより、混合槽１２内の液体と微粒子とを攪拌／混合する。混合液に異なる方向の遠心力が加わることで、被検出物質の濃度の均一性をさらに高めることができる。第１回転方向に回転中に働く遠心力Ｆ１と、第２回転方向に回転中に働く遠心力Ｆ２とが１８０度に近いほど、反応物質の濃度を均一化しやすい傾向にある。
【００４５】
なお、混合槽内の微粒子と試料とを回転により混合するには、実際にはマイクロチップを少なくとも異なる２方向に回転する必要がある。一方向の回転だけでは、遠心力が一方向にしか働かず、混合液の濃度を均一化することができないからである。なお、マイクロチップの回転軸は、３つ以上あっても構わない。
その後、再度第１回転方向にマイクロチップ１０を回転させ（図４（ｂ））、第３混合ステップを行う。さらにその後もう一度第２回転方向にマイクロチップ１０を回転させ（図４（ｃ））、第４混合ステップを行う。このように、回転方向を変えることにより遠心力Ｆ１，Ｆ２を繰り返し印加し、混合液中の反応物質の濃度の均一性をさらに高めることができる。
【００４６】
回転方向の変化は少なくとも１回行い（前記第１混合ステップ）、その後は試料や試薬の粘度、粒状担体の大きさや重さ、混合槽１２の形状などに応じ、第２，第３・・・の混合ステップを適宜実行すればよい。必要に応じ、第５，第６・・・混合ステップを実行してもよい。
第１〜第４混合ステップにおいて、混合槽１２内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、マイクロ流路１３ａ，ｂと混合槽１２との連結部が含まれないよう、各今号ステップにおける回転方向を調整する。回転方向が３つ以上の場合も同様である。混合槽１２から混合液が外部に流出するのを防止するためである。
【００４７】
（４−４）排出ステップ
混合の終了後、図４（ｄ）に示すように、第４回転方向にマイクロチップ１０を回転させる。これにより、混合液を混合槽１２から比色反応部１５に移動させる。このとき、混合槽１２中の混合液全てを比色反応部１５に移動させる必要はない。混合液中の反応部の濃度は、混合槽１２の場所によらず均一化されているので、その一部を比色反応部１５に移動させれば足りる。そのため、比色反応用試薬の量を抑えることができる。その後、比色反応部１５で発色した反応液を検出部１６に導入し、反応物質の分析や測定を行うことにより、ターゲットの検出を行う。
【００４８】
なお、混合槽１２の後段の処理は、比色反応や検出・分析・測定処理に限定されない。マイクロチップ１０の使用目的に応じ、必要な機能部をマイクロチップ１０に設け、それらの機能部を用いた処理を実行することができる。
＜実験例＞
本発明に係るマイクロチップ１０を作成し、作成したマイクロチップ１０を用いて実験を行った。図５は、本発明のマイクロチップ１０の一実験例を示す写真である。この実験において、粒状担体としてはキトパールを、認識物質としては抗イディオタイプ抗体を、ターゲットとしてはＣＲＰを、ターゲットを含む試料としてはＰＢＳで調整したＣＲＰ入り溶液を用いた。また、試料溶液の量は１２μＬ、キトパールの量は１０μＬであった。
【００４９】
図５（ａ）は、図中矢印方向の遠心力Ｆinが発生する回転方向にマイクロチップ１０を回転し、混合槽１２に試料を導入した段階を示す。この段階では、微粒子のうち図中上面側に位置するものが、ターゲットと反応している。
図５（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ順に、図中矢印方向の遠心力Ｆ１が発生する第１回転方向、遠心力Ｆ２が発生する第２回転方向、次いでもう一度第１回転方向に、１０秒ずつマイクロチップ１０を回転した後の状態を示す。回転方向を変えて回転する度に、微粒子とターゲットとの反応が進行していることが分かる。また、微粒子の中で反応した微粒子と未反応の微粒子とは、偏りなく均等に分布していることが分かる。
【００５０】
〔効果〕
遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽１２中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽１２で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽１２の場所にかかわらず均一化される。
【００５１】
上記のように均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。混合工程の後工程に用いる部分としては、例えば第２の混合槽や検出部１６を挙げることができる。また、混合槽１２の下流側にさらにミキシングのための流路を設けている場合、その流路を短くしたり省略するなどにより、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。
【００５２】
＜第２実施形態＞
図６は、第２実施形態に係るマイクロチップ２０の平面図である。第１実施形態のマイクロチップ１０と同様の機能を有する構成要素については、同一の符号番号を付して示している。本実施形態のマイクロチップ２０では、マイクロ流路１３の径が、混合槽１２との連結部分において、混合槽１２内部の微粒子の径よりも小さく形成されている。これにより、いかなる回転方向がマイクロチップ１０に印加されても、混合槽１２内部の微粒子がマイクロ流路１３に流出することを防止することができる。本実施形態のマイクロチップ２０の他の構成、マイクロチップ２０を用いた処理プロセス、マイクロチップ２０の使用方法などについては、前記第１実施形態と同様である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のマイクロチップは、医療、食品、創薬などの分野で使用される臨床分析チップ、環境分析チップ、遺伝子分析チップ、タンパク質分析チップ、糖鎖チップ、クロマトグラフチップ、細胞解析チップ、製薬スクリーニングチップ、バイオセンサなどに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のマイクロチップの一実施形態を示す平面図
【図２】本発明のマイクロチップを用いた処理プロセス（１）の説明図
【図３】本発明のマイクロチップを用いた処理プロセス（２）の説明図
【図４】本発明のマイクロチップの使用方法を説明するための一連動作を示す平面図
【図５】本発明に係るマイクロチップの使用方法の実験例における一連の動作を示す平面写真
【図６】第２実施形態に係るマイクロチップの平面図
【図７】従来のマイクロチップの構成を示す斜視図
【図８】従来のマイクロチップの使用方法を説明する平面写真
【符号の説明】
【００５５】
１０：マイクロチップ
１１ 試料導入部
１２：混合槽
１３ａ，１３ｂ：マイクロ流路
１４：予備混合槽
１５：比色反応部
１６：検出部
Ｗ１，Ｗ２：混合槽の湾曲面
Ｆ１：第１回転における遠心力
Ｆ２：第２回転における遠心力
Ｆin：第３回転における遠心力
Ｆout：第４回転における遠心力
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップの使用方法、マイクロ流路及びマイクロチップに関し、生体物質を分離、混合、検出するために利用されるマイクロ流路及びこれを備えたマイクロチップの使用方法、マイクロ流路及びマイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、微量試料で簡便に短時間で高精度な免疫分析を可能とすることを目的とする免疫分析装置が開示されている。図７は、この免疫分析装置の構成を示す斜視図である。免疫分析装置１０１の導入部１０５から導入された溶液は、反応場１０３に固定された微粒子１０２と反応する。
【特許文献１】特開２００１−００４６２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、特許文献１の免疫分析装置では、溶液を微粒子１０２と接触させるためには、ポンプが用いられると推測される。この免疫分析装置１０１は、遠心操作可能な構成を有していないからである。しかしポンプでの送液では、流路の位置にかかわらず、流速を一定に制御することが困難である。これは、低流速の場合や、溶液が何らかのジャンクションを通過する場合、顕著に表れる。その結果、溶液中の抗原や抗体を確実に捕捉することができず、試料などの溶液と微粒子との接触時間が、反応場１０３の場所によって変わってしまい、抗原抗体反応などにより生じる反応物の濃度が反応場１０３内で不均一になる。
【０００４】
図８は、インク液と、試料中のターゲットと反応する認識物質が固定された微粒子と、をポンプの送液により接触させた場合の実験例を示す写真である。反応場としてのチャンバＴの導入口ＭからチャンバＴ内に導入された試料溶液は、ポンプ口Ｑに取り付けられるポンプにより、導入口Ｍからポンプ口Ｑに流動する。その途中で、試料溶液とチャンバＴ内の微粒子とが接触することにより、ターゲットと認識物質との反応を生じさせる。ターゲットの濃度は、チャンバＴの粒子の色の変化により示されている。ポンプにより試料溶液を送液するに従い、導入口Ｍを中心としてターゲットがチャンバＴ内に広がっていく。ただし、その濃度は、導入口Ｍ近傍が高く、導入口Ｍから離れるに従い低くなり、チャンバの隅部ではターゲットを目視で確認できないほどである。
【０００５】
図８が示すように、ポンプで反応場に送液した場合、ターゲットと認識物質との反応は反応場内で不均一になってしまう。これでは、反応場内で生成された反応液を部分抽出し、その後の処理に用いることが難しい。反応場内での濃度の不均一さが後段の処理に影響することを防止するためには、反応場内の反応液全てを後段の処理に用いる必要がある。このため、反応場の後段の各部分、例えば検出部や混合槽において、試料や試薬の量を減量することが難しく、マイクロチップ自体の大きさを小型化しにくいという問題がある。
【０００６】
本発明は、抗原・抗体など試料中のターゲットなどの捕捉率を高め、溶液中に存在する物質の濃度を、反応場の場所にかかわらず均一化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明１は、遠心力を用いて試料を処理するマイクロチップを提供する。このマイクロチップは、以下の要素を供えている。
・前記試料中のターゲットを認識する第１認識物質または前記第１認識物質を認識する第２認識物質が粒状担体に固定化されてなる微粒子と、前記試料と、を混合する混合槽、
・前記混合槽に連結されているマイクロ流路。
【０００８】
このマイクロチップにおいて、前記混合槽は、前記微粒子を流動可能な状態に保持している。
遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽の場所にかかわらず均一化される。
【０００９】
上記のように均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ全体を小型化することができる。混合工程の後工程に用いる部分としては、例えば第２の混合槽や検出部を挙げることができる。また、混合槽の下流側にさらにミキシングのための流路を設けている場合、その流路を短くしたり省略するなどにより、マイクロチップ全体を小型化することができる。
【００１０】
微粒子は、予め混合槽に保持されている。混合槽内の微粒子は、予め第１認識物質または第２認識物質が固定化された粒状担体でもよいし、第１認識物質または第２認識物質が固定化されていない粒状担体であってもよい。後者の場合、第１認識物質または第２認識物質を含む試薬を混合槽に導入することにより、混合槽内部で粒状担体に第１認識物質または第２認識物質を固定化し、微粒子を生成することができる。その後、生成された微粒子と、試料と、を遠心力により接触させることで、試料中のターゲットを第１認識物質に、または前記第１認識物質を第２認識物質に認識させることができる。
【００１１】
本発明２は、前記発明１において、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記混合槽内部の前記微粒子の径よりも大きく形成されて居るマイクロチップを提供する。このマイクロチップは、前記連結部分に形成され、前記混合槽からの前記微粒子の流出を防止する流出止め柱をさらに備えている。
マイクロ流路の最小径が微粒子の径よりも大きい場合、流出止め柱を設けておくことにより、マイクロチップの運搬中などに微粒子が混合槽から外部に漏れてしまうことを防ぐ。また、流出止め柱を設けることにより、マイクロ流路の径を大きく設計できるので、マイクロチップ自体の作製が容易になる。
【００１２】
本発明３は、前記発明１において、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記微粒子の径よりも小さく形成されているマイクロチップを提供する。
マイクロ流路の最小径が微粒子の径よりも小さい場合、マイクロチップの運搬中などに微粒子が混合槽から外部に漏れてしまうことを防ぐことができる。
【００１３】
本発明４は、発明１〜３において、前記混合槽の壁面の一部が、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されているマイクロチップを提供する。
混合槽の壁面が回転方向に沿って形成されていると、回転方向に沿ってマイクロチップが回転した場合、混合槽の内容物が湾曲した壁面に沿って移動しやすい。そのため、微粒子と試料とを均一に混合しやすくなる。
【００１４】
２以上の回転軸を中心としてマイクロチップを回転させる場合、それぞれの回転方向に沿った湾曲面を混合槽が有していることが好ましい。異なる回転方向に沿って回転させることにより、それぞれの回転において内容物が混合されやすくなる。その結果、混合液の濃度がさらに均一化されやすくなる。
本発明５は、前記発明１〜４において、前記マイクロ流路が、前記混合槽における混合時に、前記混合槽の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されているマイクロチップを提供する。
【００１５】
マイクロ流路は、混合槽における混合工程で、混合液の圧力を受けない壁面に連結されていることが好ましい。例えば、マイクロ流路は、混合時に混合液の圧力を受ける壁面と対向する壁面などに連結されていることが好ましい。試料を混合槽に導入するマイクロ流路や、混合液を後段の工程のために排出するマイクロ流路から混合槽外部に、混合液が流出することを防止しやすくなる。
【００１６】
本発明６は、前記発明１〜５において、前記マイクロ流路が、所定の第１回転方向と所定の第２回転方向とにマイクロチップ自身が回転している場合に、混合槽内の混合液が漏れない位置に連結されているマイクロチップを提供する。
混合槽内の微粒子と試料とを回転により混合するには、実際にはマイクロチップを少なくとも２方向に回転する必要がある。一方向の回転だけでは、遠心力が一方向にしか働かず、混合液の濃度を均一化することができないからである。そのため、マイクロ流路の連結部分は、第１回転方向と第２回転方向とにマイクロチップが回転しているときに、混合液が漏れない位置に設けられる。なお、マイクロチップの回転軸は、３つ以上あっても構わない。
【００１７】
本発明７は、前記発明１〜６において、前記粒状担体が多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、または磁性ビーズであるマイクロチップを提供する。
多糖類系粒状ゲル、例えばキトパール（富士紡績株式会社製；登録商標）は、抗原や抗体、酵素などを固定化する担体としての機能に加え、回転により破壊されない強度を有している。そのため、本発明の粒状担体として好適に用いることができる。
【００１８】
本発明８は、前記発明１のマイクロチップの使用方法を提供する。この使用方法は、第１の回転方向に前記マイクロチップを回転させ、その後前記第１の回転方向とは異なる第２の回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記微粒子と前記試料とを前記混合槽内で混合する混合ステップを含む。
混合槽に導入された試料と、認識物質が固定化された微粒子と、を２方向の回転により混合する。混合槽の場所にかかわらず、認識物質と試料との接触時間はおおむね均一になる。さらに少なくとも異なる２つの回転方向にマイクロチップを回転させるため、微粒子と試料との混合液の濃度を、混合槽内部の位置にかかわらず均一化することができる。
【００１９】
本発明９は、前記発明８において、以下のステップをさらに含むマイクロチップの使用方法を提供する。
・前記第１及び第２回転方向とは異なる第３回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記混合槽内の混合液の一部を前記マイクロ流路のいずれかにより排出する排出ステップ、
・前記排出ステップで排出された混合液の一部を用い、前記試料中のターゲットの分析を行う分析ステップ。
【００２０】
発明８で得られる混合液の濃度は混合槽の場所にかかわらず均一であるため、混合槽内の混合液の一部を抽出するだけで、後工程を実行することができる。そのため、後工程に必要とされる試薬の量などを削減することができる。
本発明１０は、前記発明８，９において、前記混合ステップを繰り返す混合繰り返しステップをさらに含むマイクロチップの使用方法を提供する。
【００２１】
異なる方向の回転を繰り返すことにより、混合液の濃度の均一化を高めることができる。
本発明１１は、前記発明８〜１０において、前記混合槽内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部が含まれないよう、前記第１回転方向及び前記第２回転方向を調整するマイクロチップの使用方法を提供する。
【００２２】
混合時に、マイクロ流路から混合液が外部に漏れないよう、回転方向を調整する。これにより、遠心分離などに用いられる回転力により、混合槽内の溶液を混合することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のマイクロチップを用いれば、遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽の場所にかかわらず均一化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
＜第１実施形態＞
（１）マイクロチップの全体構成
図１は、第１実施形態にかかるマイクロチップの平面図である。本発明が対象とするマイクロチップは、試料中のターゲットとターゲットを認識する物質と微粒子とを混合する工程において、溶液の移動にポンプを使わず遠心力を用いることを前提としたマイクロチップである。
【００２５】
図１のマイクロチップ１０は、以下の構成要素を有している。
（ａ）試料導入部
試料導入部１１は、試料を外部からマイクロチップ１０内部に導入する。試料導入部１１は、導入した試料を一時的に保持する機能を有していてもよい。
（ｂ）混合槽
混合槽１２は、認識物質が固定化された粒状担体（以下、微粒子という）または認識物質固定化前の粒状担体を、流動可能な状態に保持している。混合槽１２は、少なくとも試料と微粒子とが混合される空間であり、さらに試薬が混合される場合もある。固定化される認識物質は、試料中のターゲットと反応する第１認識物質か、または前記第１認識物質と反応する第２認識物質である。ターゲットと第１認識物質との組み合わせ、及び第１認識物質と第２認識物質との組み合わせは、例えば、酵素−基質、助酵素−酵素、抗原−抗体、リガンド−レセプター、DNA−DNA、DNA−RNA、RNA−RNA、PNA−DNA、PNA−RNAからなる群から選択される少なくとも1種である。混合槽１２については、詳細を後述する。
【００２６】
（ｃ）マイクロ流路
マイクロ流路１３ａ，ｂ（以下、まとめてマイクロ流路１３という）は、混合槽１２に連結され、混合槽１２に試料や試薬を導入したり、混合槽１２内の混合液を外部に排出したりする。マイクロ流路１３において、混合槽１２との連結部分における径は、混合槽１２内部の微粒子の径よりも大きく形成されている。ただし連結部分には、流出止め柱１７ａ，ｂが形成されている。流出止め柱１７ａ，ｂとマイクロ流路１３との間隔は、微粒子の径よりも小さくなるように調整されている。これにより、いかなる回転方向がマイクロチップ１０に印加されても、混合槽１２内部の微粒子がマイクロ流路１３に流出することを防止する。
【００２７】
流出止め柱１７ａ，ｂは、１つの流路１３ａ、ｂに対して複数本設けても良い。その場合には、流出止め柱１７ａ，ｂの間隔が微粒子の径を超えないように調整される。
（ｄ）予備混合槽
予備混合槽１４は、試料導入部１１と混合槽１２との間に設けられた空間である。予備混合槽１４は、試薬を保持している。試料導入部１１から導入された試料と試薬とは、予備混合槽１４で混合される。混合された試料と試薬とは、マイクロ流路１３ａを通って混合槽１２に移動する。予備混合槽１４に保持される試薬は、例えば第１認識物質としての酵素標識抗体である。酵素標識抗体は、試料中のターゲットと反応する。さらに、酵素標識抗体は、酵素の働きによって発色反応を促進する。予備混合槽１４の大きさや形状は特に限定されない。予備混合槽１４は、例えば１０〜３０μＬ程度の体積を有している。
【００２８】
（ｅ）比色反応部
比色反応部１５は、試薬を保持する空間である。混合槽１２から比色反応部１５に導入された混合液と、比色反応部１５内の試薬とは、さらに混合される。試薬としては、混合液内に含まれる酵素などの標識物質と反応し、一定の色を発色する物質が選択される。本発明では、混合槽１２内の混合液の濃度は均一化されており、混合液の全量を比色反応部１５に移動させる必要がないため、比色反応部１５の容量や保持する試薬の量を抑えることができる。比色反応部１５の大きさや形状は特に限定されないが、例えば１０〜１００μＬ程度の体積を有している。
【００２９】
（ｆ）検出部
検出部１６には、比色反応部１５において所定の色を発色した反応物質が導入される。検出部１６に導入された発色反応物質は、所定の検出方法により、その濃度や量などが検出される。検出方法は、光学的方法が一般的に用いられる。光学的検出方法を用いる場合、検出部１６には、内部に光を照射し、その反射光や透過光、散乱光などを検出できるよう、光の入射口や光路、光の出射口が形成されている。検出部１６は、例えば１０ｍｍ程度の長さを有し、断面積が０．２５〜１ｍｍ2程度の一定形状を有している。
【００３０】
（２）混合槽
（２−１）混合槽の形状
前記混合槽１２の壁面の一部は、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されている。混合槽１２の壁面が回転方向に沿って形成されていると、微粒子と試料との混合を促進し、混合液中の反応物の濃度を均一化しやすい。
【００３１】
本発明のマイクロチップ１０は、２以上の異なる回転方向（以下、第１回転方向、第２回転方向という）にマイクロチップ１０を回転させ、混合槽１２内の微粒子と試料とを混合する。混合槽１２内の微粒子と試料とを回転により混合するには、一方向の回転だけでは、混合液の濃度を均一化することができないからである。そのため、混合槽１２は、第１回転方向に沿った湾曲面Ｗ１及び第２回転方向に沿った湾曲面Ｗ２を有していることが好ましい。微粒子と試料との混合を促進することができ、ひいては混合液の濃度の均一性を高めることができる。
【００３２】
第１回転方向の回転で生じる遠心力Ｆ１と、第２回転方向の回転で生じる遠心力Ｆ２とは、なす角度が１８０度に近いほど混合を促進しやすいが、より小さな角度、例えば９０度程度の角度でも混合することができる。しかし、湾曲面Ｗ１、Ｗ２は、滑らかに連続していることが好ましい。回転方向が変わるときに、微粒子が混合槽１２内壁に沿って移動しやすいからである。
【００３３】
（２−２）混合槽とマイクロ流路との連結
マイクロ流路１３は、混合槽１２における混合時に、混合槽１２の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されている。言い換えれば、マイクロ流路１３は、前述の第１回転方向と第２回転方向とにマイクロチップ１０が回転している場合、混合槽１２内の混合液が漏れないような位置に連結されている。この例では、湾曲面Ｗ１，Ｗ２以外の面に、マイクロ流路１３は連結されている。
【００３４】
これにより、試料を混合槽１２に導入するマイクロ流路１３ａや、混合液を比色反応部１５に排出するマイクロ流路１３ｂから混合槽１２外部に、混合液が流出することを防止しやすくなる。
なお、マイクロ流路１３ａは、所定の第３回転方向にマイクロチップ１０を回転させたとき、図中矢印Ｆinの方向に働く遠心力により予備混合槽１４から混合槽１２内部に液体が導入される位置及び向きに、予備混合槽１４と混合槽１２とを連結している。これにより、予備混合槽１４内の液体は、マイクロ流路１３ａを通って混合槽１２に導入される。
【００３５】
また、マイクロ流路１３ｂは、所定の第４回転方向にマイクロチップ１０を回転させたとき、図中矢印Ｆoutの方向に働く遠心力により、混合槽１２内部の混合液が流出可能な位置及び向きに連結されている。これにより、混合液は、マイクロ流路１３ｂを通って比色反応部１５に導入される。
（２−３）混合槽内の粒状担体
粒状担体は、予め混合槽１２に保持されている。粒状担体には、予め第１認識物質または第２認識物質が固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。後者の場合、試料を混合槽１２に導入するに先立ち、第１認識物質または第２認識物質を含む試薬を混合槽１２に導入する。これにより、混合槽１２内部で粒状担体に第１認識物質または第２認識物質を固定化し、微粒子を生成することができる。その後、混合槽１２内に試料を導入し、生成された微粒子と試料とを遠心力により接触させることで、試料中のターゲットを第1認識物質に、または第1認識物質を第2認識物質に、認識させることができる。
【００３６】
第１認識物質または第２認識物質が固定化される粒状担体は、第１認識物質または第２認識物質と共有結合を生成しやすい粒子が好ましい。粒状担体の粒径は、数１００μｍを超えないことが好ましい。さらに、粒状担体は、マイクロチップ１０が遠心分離にかけられても、混合槽１２内部で破壊されない程度の強度を有していることが好ましい。このような条件を充足する粒状担体の一例として、多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、磁性ビーズを挙げることができる。
【００３７】
多糖類系粒状ゲルの好ましい例としては、キトパール（富士紡績株式会社製：登録商標）が挙げられる。なお、キトパールを粒状担体として用いる場合、混合槽１２に緩衝液を保持させ、キトパールの乾燥を防止する。キトパールと緩衝液とを合わせた容量は、例えば１６μリットル程度であり、この中でキトパールが占める容量は１０マイクロリットル程度である。
【００３８】
磁性ビーズの一例としては、Fe3O4, γ-Fe2O3, Co-γ-Fe2O3, (NiCuZn)O・Fe2O3, (CuZn)O・Fe2O3, (Mn・Zn)O・Fe2O3, (NiZn)O・Fe2O3, SrO・6Fe2O3, BaO・6Fe2O3, SiO2で被覆したFe2O3、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、タンパク質など）とフェライトとの複合微粒子、磁性金属微粒子などを挙げることができる。
なお、マイクロチップの各機能部の配置や数、形状などは、上記の例に限定されない。例えば、導入部１１から混合槽１２に至る各機能部の配置や形状、混合槽１２から検出部１６に至る各機能部の配置や形状は、必要に応じて適宜設計変更することができる。
【００３９】
（３）マイクロチップにおける反応プロセス
次に図２及び図３を用い、図１のマイクロチップ１０における反応プロセスの流れについて説明する。
図２は、予備混合槽１４に第１認識物質としての標識抗体が、混合槽１２に第２認識物質を固定化した微粒子が、それぞれ保持されている場合の処理プロセスを示す。この図では、第２認識物質として、第１認識物質と抗原抗体反応を示す固定化抗原／抗体を考える。
【００４０】
まず、試料導入部１１から予備混合槽１４にターゲットを導入し（Ｓ１）、予備混合槽１４でターゲットと第１認識物質とを混合して反応させる（Ｓ２）。次いで、反応液を混合槽１２に導入し（Ｓ３）、固定化抗原／抗体と、ターゲットと第１認識物質との反応物質と、第１認識物質と、を混合する（Ｓ４）。これにより、第１認識物質と固定化抗原／抗体とが反応し、第１認識物質が微粒子に捕捉される。微粒子に捕捉された第１認識物質は混合槽１２内に留まる。一方、第１認識物質と反応したターゲットが微粒子に捕捉されることなく比色反応部１５に導入され、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる（Ｓ５）。その後、比色反応部１５に導入された、標識抗体とターゲットとの反応物質を発色物質と混合し、標識抗体におけるＨＲＰの活性によって発色させる。発色した混合液を例えば吸光度測定し、得られた結果を換算することにより、試料中のターゲットを定量することができる。
【００４１】
図３は、予備混合槽１４に標識ターゲットが、混合槽１２に第１認識物質を固定化した微粒子が、それぞれ保持されている場合の処理プロセスを示す。この図では、第１認識物質として、ターゲットと抗原抗体反応を示す固定化抗原／抗体を考える。
まず、試料導入部１１から予備混合槽１４にターゲットを導入し、予備混合槽１４でターゲットと標識ターゲットとを混合する（Ｓ１１）。次いで、混合液を混合槽１２に導入し（Ｓ１２）、固定化抗原／抗体と、ターゲットと、標識ターゲットと、を混合する（Ｓ１３）。これにより、ターゲット及び標識ターゲットと固定化抗原／抗体とが反応し、ターゲット及び標識ターゲットの一部が微粒子に捕捉される。微粒子に捕捉されたターゲット及び標識ターゲットは混合槽１２内に留まる。一方、残りのターゲット及び標識ターゲットは、微粒子に捕捉されることなく比色反応部１５に導入され、いわゆるＢ／Ｆ分離が行われる（Ｓ１４）。その後、比色反応部１５に導入された、標識ターゲット及びターゲットを発色物質と混合し、標識ターゲットにおけるＨＲＰの活性によって発色させる。発色した混合液を例えば吸光度測定し、得られた結果を換算することにより、標識ターゲットを定量する。最初に用いた標識ターゲットの量と試料の量との比と、定量した標識ターゲットの量と、からターゲットを定量することができる。
【００４２】
（４）マイクロチップの使用方法
図４は、図１のマイクロチップ１０の使用方法の説明図である。ここでは、混合槽１２には、第１認識物質または第２認識物質が固定化された粒状担体が予め保持されている場合を説明する。以下の使用方法は、試料導入ステップ、第１混合ステップ、第２〜第４混合ステップ及び排出ステップを含む。
【００４３】
（４−１）試料導入ステップ
まず、図４（ａ）に示すように、第３回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、図中矢印Ｆinで示す方向の遠心力を印加する。これにより、試料導入部１１の試料及び予備混合槽１４の試薬を、混合槽１２に導入する。これにより、試料中のターゲットと混合槽１２中の第１認識物質と、または予備混合槽１４から導入される第１認識物質と混合槽１２中の第２認識物質と、が接触する。混合槽１２における反応物質同士の接触時間は、混合槽１２内部の場所にかかわらずほぼ均一となる。
【００４４】
（４−２）第１混合ステップ
次いで図４（ｂ）に示すように、第１回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、図中矢印Ｆ１で示す方向の遠心力を印加する。これにより、混合槽１２内の液体と微粒子とを攪拌／混合する。混合液に異なる方向の遠心力が加わることで、被検出物質の濃度の均一性を高めることができる。第１回転方向中の遠心力Ｆ１と、試料を混合槽に導入する時に印加される遠心力Ｆinとが１８０度に近いほど、反応物質の濃度を均一化しやすい傾向にある。 （４−３）第２〜第４混合ステップ
図４（ｃ）に示すように、第２回転方向にマイクロチップ１０を回転させ、第２混合ステップを行う。これにより、混合槽１２内の液体と微粒子とを攪拌／混合する。混合液に異なる方向の遠心力が加わることで、被検出物質の濃度の均一性をさらに高めることができる。第１回転方向に回転中に働く遠心力Ｆ１と、第２回転方向に回転中に働く遠心力Ｆ２とが１８０度に近いほど、反応物質の濃度を均一化しやすい傾向にある。
【００４５】
なお、混合槽内の微粒子と試料とを回転により混合するには、実際にはマイクロチップを少なくとも異なる２方向に回転する必要がある。一方向の回転だけでは、遠心力が一方向にしか働かず、混合液の濃度を均一化することができないからである。なお、マイクロチップの回転軸は、３つ以上あっても構わない。
その後、再度第１回転方向にマイクロチップ１０を回転させ（図４（ｂ））、第３混合ステップを行う。さらにその後もう一度第２回転方向にマイクロチップ１０を回転させ（図４（ｃ））、第４混合ステップを行う。このように、回転方向を変えることにより遠心力Ｆ１，Ｆ２を繰り返し印加し、混合液中の反応物質の濃度の均一性をさらに高めることができる。
【００４６】
回転方向の変化は少なくとも１回行い（前記第１混合ステップ）、その後は試料や試薬の粘度、粒状担体の大きさや重さ、混合槽１２の形状などに応じ、第２，第３・・・の混合ステップを適宜実行すればよい。必要に応じ、第５，第６・・・混合ステップを実行してもよい。
第１〜第４混合ステップにおいて、混合槽１２内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、マイクロ流路１３ａ，ｂと混合槽１２との連結部が含まれないよう、各今号ステップにおける回転方向を調整する。回転方向が３つ以上の場合も同様である。混合槽１２から混合液が外部に流出するのを防止するためである。
【００４７】
（４−４）排出ステップ
混合の終了後、図４（ｄ）に示すように、第４回転方向にマイクロチップ１０を回転させる。これにより、混合液を混合槽１２から比色反応部１５に移動させる。このとき、混合槽１２中の混合液全てを比色反応部１５に移動させる必要はない。混合液中の反応部の濃度は、混合槽１２の場所によらず均一化されているので、その一部を比色反応部１５に移動させれば足りる。そのため、比色反応用試薬の量を抑えることができる。その後、比色反応部１５で発色した反応液を検出部１６に導入し、反応物質の分析や測定を行うことにより、ターゲットの検出を行う。
【００４８】
なお、混合槽１２の後段の処理は、比色反応や検出・分析・測定処理に限定されない。マイクロチップ１０の使用目的に応じ、必要な機能部をマイクロチップ１０に設け、それらの機能部を用いた処理を実行することができる。
＜実験例＞
本発明に係るマイクロチップ１０を作成し、作成したマイクロチップ１０を用いて実験を行った。図５は、本発明のマイクロチップ１０の一実験例を示す写真である。この実験において、粒状担体としてはキトパールを、認識物質としては抗イディオタイプ抗体を、ターゲットとしてはＣＲＰを、ターゲットを含む試料としてはＰＢＳで調整したＣＲＰ入り溶液を用いた。また、試料溶液の量は１２μＬ、キトパールの量は１０μＬであった。
【００４９】
図５（ａ）は、図中矢印方向の遠心力Ｆinが発生する回転方向にマイクロチップ１０を回転し、混合槽１２に試料を導入した段階を示す。この段階では、微粒子のうち図中上面側に位置するものが、ターゲットと反応している。
図５（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ順に、図中矢印方向の遠心力Ｆ１が発生する第１回転方向、遠心力Ｆ２が発生する第２回転方向、次いでもう一度第１回転方向に、１０秒ずつマイクロチップ１０を回転した後の状態を示す。回転方向を変えて回転する度に、微粒子とターゲットとの反応が進行していることが分かる。また、微粒子の中で反応した微粒子と未反応の微粒子とは、偏りなく均等に分布していることが分かる。
【００５０】
〔効果〕
遠心力により微粒子と試料とを接触させることで、ターゲットと第１認識物質との接触時間または第１認識物質と第２認識物質との接触時間が、混合槽１２中の場所にかかわらず均一化される。さらに、回転方向を変えることにより、微粒子と試料とを混合槽１２で均一に混合するので、混合液中の反応物の濃度が混合槽１２の場所にかかわらず均一化される。
【００５１】
上記のように均一な濃度を有する混合液が得られれば、混合工程後の後工程には、混合液全てを用いなくてもその一部を抽出して用いればよい。従って、混合工程の後工程に用いる部分に導入する溶液の量を減らし、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。混合工程の後工程に用いる部分としては、例えば第２の混合槽や検出部１６を挙げることができる。また、混合槽１２の下流側にさらにミキシングのための流路を設けている場合、その流路を短くしたり省略するなどにより、マイクロチップ１０全体を小型化することができる。
【００５２】
＜第２実施形態＞
図６は、第２実施形態に係るマイクロチップ２０の平面図である。第１実施形態のマイクロチップ１０と同様の機能を有する構成要素については、同一の符号番号を付して示している。本実施形態のマイクロチップ２０では、マイクロ流路１３の径が、混合槽１２との連結部分において、混合槽１２内部の微粒子の径よりも小さく形成されている。これにより、いかなる回転方向がマイクロチップ１０に印加されても、混合槽１２内部の微粒子がマイクロ流路１３に流出することを防止することができる。本実施形態のマイクロチップ２０の他の構成、マイクロチップ２０を用いた処理プロセス、マイクロチップ２０の使用方法などについては、前記第１実施形態と同様である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のマイクロチップは、医療、食品、創薬などの分野で使用される臨床分析チップ、環境分析チップ、遺伝子分析チップ、タンパク質分析チップ、糖鎖チップ、クロマトグラフチップ、細胞解析チップ、製薬スクリーニングチップ、バイオセンサなどに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明のマイクロチップの一実施形態を示す平面図
【図２】本発明のマイクロチップを用いた処理プロセス（１）の説明図
【図３】本発明のマイクロチップを用いた処理プロセス（２）の説明図
【図４】本発明のマイクロチップの使用方法を説明するための一連動作を示す平面図
【図５】本発明に係るマイクロチップの使用方法の実験例における一連の動作を示す平面写真
【図６】第２実施形態に係るマイクロチップの平面図
【図７】従来のマイクロチップの構成を示す斜視図
【図８】従来のマイクロチップの使用方法を説明する平面写真
【符号の説明】
【００５５】
１０：マイクロチップ
１１ 試料導入部
１２：混合槽
１３ａ，１３ｂ：マイクロ流路
１４：予備混合槽
１５：比色反応部
１６：検出部
Ｗ１，Ｗ２：混合槽の湾曲面
Ｆ１：第１回転における遠心力
Ｆ２：第２回転における遠心力
Ｆin：第３回転における遠心力
Ｆout：第４回転における遠心力
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心力を用いて試料を処理するマイクロチップであって、
前記試料中のターゲットを認識する第１認識物質または前記第１認識物質を認識する第２認識物質が粒状担体に固定化されてなる微粒子と、前記試料と、を混合する混合槽と、
前記混合槽に連結されているマイクロ流路と、を備え、
前記混合槽は、前記微粒子を流動可能な状態に保持している、
マイクロチップ。
【請求項２】
前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記混合槽内部の前記微粒子の径よりも大きく形成されており、
前記連結部分に形成され、前記混合槽からの前記微粒子の流出を防止する流出止め柱をさらに備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記微粒子の径よりも小さく形成されている、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記混合槽の壁面の一部は、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記マイクロ流路は、前記混合槽における混合時に、前記混合槽の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されている、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記マイクロ流路は、所定の第１回転方向と所定の第２回転方向とにマイクロチップ自身が回転している場合に、混合槽内の混合液が漏れない位置に連結されている、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項７】
前記粒状担体は、多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、または磁性ビーズである、請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項８】
請求項１に記載のマイクロチップの使用方法であって、
第１の回転方向に前記マイクロチップを回転させ、その後前記第１の回転方向とは異なる第２の回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記微粒子と前記試料とを前記混合槽内で混合する混合ステップを含む、マイクロチップの使用方法。
【請求項９】
前記第１及び第２回転方向とは異なる第３回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記混合槽内の混合液の一部を前記マイクロ流路のいずれかにより排出する排出ステップと、
前記排出ステップで排出された混合液の一部を用い、前記試料中のターゲットの分析を行う分析ステップと、
をさらに含む、請求項８に記載のマイクロチップの使用方法。
【請求項１０】
前記混合ステップを繰り返す混合繰り返しステップをさらに含む、請求項８または９に記載のマイクロチップの使用方法。
【請求項１１】
前記混合ステップにおいて、前記混合槽内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部が含まれないよう、前記第１回転方向及び前記第２回転方向を調整する、請求項８、９または１０に記載のマイクロチップの使用方法。
【請求項１】
遠心力を用いて試料を処理するマイクロチップであって、
前記試料中のターゲットを認識する第１認識物質または前記第１認識物質を認識する第２認識物質が粒状担体に固定化されてなる微粒子と、前記試料と、を混合する混合槽と、
前記混合槽に連結されているマイクロ流路と、を備え、
前記混合槽は、前記微粒子を流動可能な状態に保持している、
マイクロチップ。
【請求項２】
前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記混合槽内部の前記微粒子の径よりも大きく形成されており、
前記連結部分に形成され、前記混合槽からの前記微粒子の流出を防止する流出止め柱をさらに備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部分における前記マイクロ流路の径が、前記微粒子の径よりも小さく形成されている、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記混合槽の壁面の一部は、所定の回転方向に沿って湾曲して形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記マイクロ流路は、前記混合槽における混合時に、前記混合槽の内容物の圧力を受ける壁面以外の壁面に連結されている、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記マイクロ流路は、所定の第１回転方向と所定の第２回転方向とにマイクロチップ自身が回転している場合に、混合槽内の混合液が漏れない位置に連結されている、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項７】
前記粒状担体は、多糖類系粒状ゲル、ラテックス粒子、または磁性ビーズである、請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項８】
請求項１に記載のマイクロチップの使用方法であって、
第１の回転方向に前記マイクロチップを回転させ、その後前記第１の回転方向とは異なる第２の回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記微粒子と前記試料とを前記混合槽内で混合する混合ステップを含む、マイクロチップの使用方法。
【請求項９】
前記第１及び第２回転方向とは異なる第３回転方向に前記マイクロチップを回転させることにより、前記混合槽内の混合液の一部を前記マイクロ流路のいずれかにより排出する排出ステップと、
前記排出ステップで排出された混合液の一部を用い、前記試料中のターゲットの分析を行う分析ステップと、
をさらに含む、請求項８に記載のマイクロチップの使用方法。
【請求項１０】
前記混合ステップを繰り返す混合繰り返しステップをさらに含む、請求項８または９に記載のマイクロチップの使用方法。
【請求項１１】
前記混合ステップにおいて、前記混合槽内の混合液が遠心力を受けて押しつけられる壁面内に、前記マイクロ流路と前記混合槽との連結部が含まれないよう、前記第１回転方向及び前記第２回転方向を調整する、請求項８、９または１０に記載のマイクロチップの使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１５５４８４（Ｐ２００７−１５５４８４Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５０５８５（Ｐ２００５−３５０５８５）
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【出願人】（０００１１６０２４）ローム株式会社 (3,539)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【出願人】（０００１１６０２４）ローム株式会社 (3,539)
【Ｆターム（参考）】
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