マイコバクテリア感染を検出するためのアッセイ
対象においてマイコバクテリア感染を評価する方法であって、ｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、ミコール酸又はミコール酸類似体に曝露するステップと、ｉｉ．その後、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、対象から単離した、少なくとも１つのＴ細胞を含む試料と共にインキュベートするステップと、ｉｉｉ．Ｔ細胞応答及び／又はＴ細胞試料中に存在するミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定するステップとを含む方法。この方法は、活動性及び潜伏性の結核菌感染を識別でき、治療的介入の有効性をモニターするのに使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［概要］
本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで、ミコール酸抗原に特異的なＴ細胞を検出することにより、対象のマイコバクテリア感染を検出するためのアッセイに関する。
【０００２】
［背景］
ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の形態のマイコバクテリア感染は、世界的に重要な問題であり、毎秒１人が新たに感染している。結核は、慢性の感染性疾患であり、一般的には、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染することにより発症する。
【０００３】
結核は、発展途上国における重要な疾患であり、世界の先進地域においても増えつつある問題である。全般的に、世界の人口の１／３は、結核菌に現在感染している。ヒト型結核菌に感染していること以外は健康な人々の５〜１０％が、その人生のある時点で発病又は、他人にうつす恐れがある。しかし、免疫不全の人々、例えばＨＩＶの人々が、さらにヒト型結核菌に感染すると、ＴＢを発症する可能性が非常に高い。
【０００４】
感染はかなりの期間無症状であり得るにもかかわらず、再活動化により、肺の慢性炎症として最も一般的に現れる疾患をもたらし、熱及び咳をもたらし得る。治療せずに放置した場合、通常は深刻な合併症及び死に至る。現時点の推定では、１年に９００万の新たなＴＢ症例及びほぼ２００万の死亡例が存在することが示されている。ＴＢであると明らかに診断されたすべての患者に対して、それより多くの患者がＴＢが疑われると評価されている（世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）、２００６）。
【０００５】
活動性ＴＢの決定的な診断は、臨床材料からのＴＢ菌、ヒト型結核菌の培養によってなされる。しかし、培養は、陽性になるまで２〜８週間かかり、実質的少数の患者（２０〜５０％）の培養物は陰性である。したがって、別の活動性ＴＢのより新規な診断検査が、早急に必要である（Ｄｉｎｎｅｓら、Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ、２００７に総説）。
【０００６】
ＴＢ感染のいくつかの検査は、ヒト型結核菌のタンパク質に対する細胞性免疫系の感作を検査する。これらの最も広範に使用されているものは、ツベルクリン反応（ＰＰＤ検査又はマントー反応又はツベルクリン感受性試験又はピルケ反応としても公知である）であり、１００年以上使用されている。この検査は、結核菌のグリセリン抽出物である、ツベルクリンへの曝露に対する応答の特定に基づいている。この検査に使用する標準材料は、精製タンパク質誘導体ツベルクリン（ＰＰＤ）であり、これは滅菌、濃縮培養物のろ液から得られた、非種特異的分子の沈殿である。
【０００７】
この検査は、標準用量である５ツベルクリン単位（０．１ｍｌ）を、前腕の手掌面へ皮内注射することを含む。結果は、臨床検査の４８〜７２時間後に得られる。細菌に曝露されたことがあるヒトは、細菌タンパク質を含む皮膚の遅延型過敏免疫応答が起こることが期待される。一方、ＴＢに曝露されたことがない個体では、応答が見られないであろう（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｈｓｔｐ／ｔｂ／ｐｕｂｓ／Ｍａｎｔｏｕｘ／ｐａｒｔｌ．ｈｔｍ）。
【０００８】
この検査は、多くの問題を有しており、第１に、ツベルクリンの初回注射の３日後に、患者の再検査が必要であり、必ずしも容易又は便利ではない。第２に、結果は、試験を実施した人物による解釈に左右される。第３に、このことは偽陽性の提示をもたらし得るので、解釈は、ＢＣＧワクチンを接種されることがある、又は他のマイコバクテリアに曝露されたことがある患者においては複雑である。第４に、この検査は、特に感受性が高いわけではなく、それ故多くの偽陰性をもたらし得る（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｎら、１９９２）。
【０００９】
ここ数年、新世代の細胞性免疫に基づく試験が開発されており、臨床診療に参入している。それらは、血液試料を、タンパク質抗原、特に、ヒト型結核菌には存在するが、ＢＣＧには存在しないＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０とともに一晩インキュベートした後で、インターフェロン−γＴ細胞応答をｅｘ ｖｉｖｏで測定する。したがって、検査結果は、以前のＢＣＧワクチン接種と混同されない。２つの市販のアッセイフォーマット：酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）及び酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が存在する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、本発明の発明者らの一人により開発され、特許となり、臨床的に確証された。これらのアッセイは、ヒト型結核菌感染の診断において、大幅な進歩であると思われる。両方のアッセイは皮膚検査より特異的であり、ＥＬＩＳｐｏｔはさらにより感受性が高い。しかし、ＴＢ曝露後の皮膚検査結果が陽性であったヒトは、その後数年にわたって、活動性ＴＢの進行の危険性が増すことは公知であり（その結果、陽性の皮膚検査結果は、休眠しているが疾患発症の可能性を維持している生菌による潜伏性感染に影響を与えることを示している）、最近ＴＢ接触した場合の、陽性Ｔ細胞に基づくインターフェロンγ（ＴＩＧＲＡ）の予後値は未知である。したがって、陽性のＴＩＧＲＡ結果が、休眠しているが疾患発症の可能性を維持している生菌による感染を示すかどうかはまだ確実ではない。
【００１０】
皮膚検査及びＴＩＧＲＡ検査はどちらも重要な欠点を持っている。
【００１１】
第１に、それらは活動性ＴＢ感染と、潜伏性ＴＢ感染を識別できない。
【００１２】
第２に、ＴＩＧＲＡは、応答の強度が、良好な抗ＴＢ治療と共に低下する皮膚検査より動的であるが（Ｌａｌｖａｎｉら、Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓ ２００１；Ｐａｔｈａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；Ｌａｌｖａｎｉら、ａｍ ｊ ｒｅｓｐ ｃｒｉｔ ｃａｒｅ ｍｅｄ ２００１； Ｌａｌｖａｎｉら、ｌａｎｃｅｔ ２００１；Ｅｗｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ２００３）、その低下には、非常に大きな個体間の変動があり、かなりの割合の患者が、治療完了後長期の間、陽性の血液検査結果を有し続ける（Ｅｗｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００６；Ｃｈｅｅら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００６；Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７）。したがって、これらのアッセイ、特にＥＬＩＳｐｏｔが抗ＴＢ治療のモニターに使用でき、又は治癒の検査として使用できるという初期の期待は、長期間の研究によって満たされていない。これはおそらく、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性ペプチド特異的ＣＤ８及びＣＤ４メモリーＴ細胞は、ＴＩＧＲＡにおいて陽性応答を依然として示すのに十分なレベルで、治療後長期にわたって存続するためである（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、２００７）。
【００１３】
第３に、それらは、診断の感受性を制限しており、この検査の臨床的有用性をある程度制限している。このことは、ＴＢの疑わしい診断を排除するために、陰性の検査結果の値が非常に高い診断感受性に依存しているためである。
【００１４】
本発明の目的は、皮膚検査及びＴＩＧＲＡの上記の制限を克服する、マイコバクテリア感染を特定するための、細胞性免疫に基づく改善された検査を提供することである。
【００１５】
本発明によれば、対象においてマイコバクテリア感染を評価する方法であって、
ｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、ミコール酸又はミコール酸類似体に曝露するステップと、
ｉｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、対象から単離した、少なくとも１つのＴ細胞を含む試料と共にインキュベートするステップと、
ｉｉｉ．Ｔ細胞応答及び／又はＴ細胞試料中に存在するミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【００１６】
本明細書で使用する場合、評価という用語は、ＴＢとして現れるマイコバクテリア感染の診断；疾患として現れない潜伏性マイコバクテリア感染の診断、活動性及び潜伏性のマイコバクテリア感染の識別及び時間経過によるマイコバクテリア感染の状態の進行又は変化のモニターを含む。その場合、変化は、自発的に、又は薬剤若しくはワクチン若しくは検査薬若しくは検査ワクチンを用いた治療の結果として起こり得る。
【００１７】
この方法のステップｉｉを、ステップｉと同時、又はステップｉに続いて実施できることは、当業者にはさらに明白であろう。
【００１８】
一実施形態において、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、少なくとも１つの樹状細胞を含む。ＣＤ１分子を提示するために樹状細胞を使用することは、本発明にとって必ずしも必須ではないことは当業者には理解されるであろう。ＣＤ１分子は、当業者に公知の任意の適切な方法により提示され得る。
【００１９】
樹状細胞は、免疫系の一部を形成する細胞である。これらの細胞は、抗原物質を処理し、免疫系の他の細胞により認識されるために、それらの表面に抗原物質を提示する。それらは、血液中に未成熟状態で見出され、活性化されると、免疫応答の開始及び調節に関与するリンパ系組織に移動する。
【００２０】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの樹状細胞は、対象から単離された少なくとも１つの単球を、ｅｘ ｖｉｖｏで培養することによって産生される。
【００２１】
体内において、単球は骨髄の単芽球から産生され、循環の中に放出され、そこで身体の組織に移動する前に１〜３日間血液中を循環する。
【００２２】
或いは、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、人工的に合成されたＣＤ１分子を含む。自己ＤＣ生成の要求を回避するために設計されたこの戦略では、基質上に脂質負荷ＣＤ１ｂモノマーを固定化する。好ましい実施形態において、基質は、ｐｖｄｆをコーティングした基質である。
【００２３】
さらに好ましい実施形態において、脂質負荷ＣＤ１ｂモノマーを、参照により本明細書に組み込まれている、ＳａｖａｇｅらがＭＨＣクラスＩモノマーに使用した同じ方法（Ｏｇｇ ＧＳら、２０００）で、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ陰性細胞の表面に固定化できる。
【００２４】
さらに別の実施形態において、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、ＣＤ１分子を発現する細胞系に由来し得る。この細胞系が、提示の手段として使用できることは明らかであろう。
【００２５】
好ましくは、ＣＤ１発現細胞系は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ陰性でもある。例えば、参照により本明細書中に組み込まれている、Ｄｅ Ｌａ Ｓａｌｌｅらは、ＣＤ１ｂを形質導入したＭＨＣ−陽性ＴＨＰ−１細胞を使用して、ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞クローンを活性化している（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ、Ｍａｒｉｏｔｔｉら、２００５）。
【００２６】
好ましい実施形態において、Ｔ細胞応答を、前記Ｔ細胞と、以前にミコール酸に曝露されていない樹状細胞とを接触させた時に見られるＴ細胞応答と比較する。ミコール酸に曝露された樹状細胞と接触させた場合のＴ細胞応答が、ミコール酸に曝露させていない樹状細胞において見られるＴ細胞応答と比較して増大している場合、マイコバクテリア感染を示していることは理解されるであろう。
【００２７】
好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ１拘束性Ｔ細胞である。
【００２８】
ミコール酸に対するＴ細胞応答の検出を、マイコバクテリア感染を診断するための方法として使用することには、数多くの利点がある。脂質抗原は、すべてのヒトにおいて発現されるＣＤ１分子により提示され、ペプチド抗原（ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０を含む）を提示するＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ分子ほどには多型でない。このことは、すべてのヒトにおける抗原提示細胞が、ミコール酸を潜在的に提示でき、反対にペプチドエピトープをＴ細胞へ提示するタンパク質抗原は、個体の遺伝的構成、すなわち組織型又はＨＬＡハプロタイプにより制限されることを意味する。したがって、ミコール酸に基づく診断検査は、非近交系の遺伝的に異質な集団において、高度な診断感受性を可能にすると思われる。
【００２９】
ＣＤ１分子それ自体は、さまざまなヒト抗原提示細胞の表面上に発現される糖タンパク質のファミリーであり、グループ１及びグループ２のＣＤ１分子に細分される。グループ１ＣＤ１分子は外来脂質抗原、具体的にいくつかのマイコバクテリアの細胞壁成分を、ＣＤ−１特異的Ｔ細胞に提示し、それによって、マイコバクテリア感染の特定における使用に特に適するものとなる（Ｍａｎｆｒｅｄ Ｂｒｉｇｌら、２００４）。
【００３０】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性のＣＤ８及びＣＤ４ペプチド特異的Ｔ細胞の特徴である長期免疫記憶が、先天性免疫及び後天性免疫の間のハイブリッドを表すＣＤ１拘束性Ｔ細胞とは全く異なると思われる。したがって、ＣＤ１拘束性脂質抗原が身体から浄化された場合、例えば、良好なＴＢ治療の後、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞は非常に数が減り、反対に、ペプチド特異的メモリーＴ細胞は、感染の治療後何年もの間増加した数で生存することになる（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７）。
【００３１】
これらの理由から、脂質特異的ＣＤ１拘束性Ｔ細胞（又はそれらの産物）の定量的検出は、一方は活動性ＴＢ疾患（細菌負荷が高い）と、他方は潜伏性ＴＢ感染（細菌負荷が低い）とに識別できる。さらに、未治療の活動性ＴＢと、良好に治療されたＴＢ感染（細菌は生存していないと考えられる）とも識別できる。本発明の方法は、感染レベル、活動性ＴＢ又は潜伏性感染かどうかを、治療の間にモニターすることも可能である。
【００３２】
これらは、ＴＩＧＲＡより非常に有利であり、本発明がタンパク質に基づくＴＩＧＲＡに置き換え可能である、又はそれらの提供する情報と共に相乗的及び相補的方法で機能し得ることを示しているであろう。
【００３３】
ミコール酸に特異的なＴ細胞又はＴ細胞応答を検出することにより、活動性ＴＢ感染及び潜伏性感染を識別することができ、今日までに開発されたＴ細胞に基づく診断検査は双方とも、高い診断感受性を有さず、活動性ＴＢ疾患と、潜伏性ＴＢ感染とを確実に識別しないので、本発明は、既存の検査法を上回る明らかな利点を提供する。
【００３４】
ミコール酸それ自体は、細菌が細胞壁の主要な成分を形成する、細菌のミコラータ類（ｍｙｃｏｌａｔａ ｔａｘｏｎ）の細胞壁において見出される長鎖脂肪酸である。６０〜９０個の間の炭素を有する長鎖ミコール酸は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のすべての属において見出され、したがって、ＴＢを伴う症状を提示しない病気の個体における他のマイコバクテリア（ライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を含む）による感染の診断に有用であり得る。ヒト型結核菌は、３種の主要なミコール酸：α−、メトキシ−及びケト−を産生し、そのうちα−ミコール酸が少なくとも７０％を占める（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９５）。
【００３５】
一実施形態において、Ｔ細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の形態である。
【００３６】
ＰＢＬは、循環血液中に見出される成熟リンパ球であり、リンパ節、脾臓、胸腺、肝臓又は骨髄などの臓器に位置するものとは対照的である。
【００３７】
さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、活動性ＴＢ疾患の部位から採取された体液、例えば気管支肺胞洗浄液（肺の洗浄液）又は胸水又は脳脊髄液又は腹水から単離される。
【００３８】
しかし、Ｔ細胞を含む任意の体液が本発明の方法に使用でき、これらは疾患部位又は血液由来のＴ細胞に制限されないことは理解されるであろう。想定される体液は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、肺生検材料、痰（誘発喀痰を含む）、腹水、胸膜液、胸膜生検材料、リンパ節生検材料、吸引関節液、脳脊髄液、軟部組織膿瘍及び身体の任意の他の患部を含む。好ましくは、測定されたＴ細胞応答は、１つ若しくは複数のサイトカイン及び／若しくはケモカインの分泌、又は１つ若しくは複数のＴ細胞活性化のマーカーの発現である。
【００３９】
好ましくは、サイトカインはＩＦＮγである。しかし、他のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α若しくはＩＬ−２及び／又はケモカイン、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１若しくはＭＩＰ１−αが本発明の方法に用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【００４０】
サイトカイン又はケモカインが、当分野で公知の適切な任意の技術、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ又は細胞内サイトカイン染色、その後のフローサイトメトリー、又はサイトカイン分泌及び捕捉アッセイ、又はＥＬＩＳＡ又は全血ＥＬＩＳＡによって検出できることは、当業者には容易に明らかであろう。
【００４１】
別の実施形態において、ミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定する。このことは、当分野において周知の多くの方法、例えば、四量体又は五量体染色、その後のフローサイトメトリーにより実施できることは、当業者には理解されるであろう（Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ Ｐら、Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ：ｎｅｗ ｔａｌｅｓ ｆｒｏｍ ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［２００２］２（４）：２６３〜７２）。
【００４２】
ミコール酸特異的Ｔ細胞の存在が、マイコバクテリア感染を示すことはさらに明らかであろう。
【００４３】
好ましくは、マイコバクテリア感染は、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＴＢ）感染である。
【００４４】
好ましくは、ミコール酸は、マイコバクテリアから単離される。より好ましくは、マイコバクテリウムは結核菌群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）である。
【００４５】
本発明の方法が、任意の哺乳動物に有用であり得ることは明らかであろう。
【００４６】
好ましい実施形態において、この方法は、医療及び／又は獣医学の分野、例えば、家畜類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ又は動物園に囚われているものなどの野生の哺乳動物）を含む、家畜化された哺乳動物におけるマイコバクテリア感染の診断に有用である。本発明の最も好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、対象は、治療的介入を受けている、又は以前に受けたことがある。
【００４８】
好ましくは、この方法は、感染の状態と、前記個体の前記感染の以前に測定された状態とを比較し、それによって、前記個体における前記治療的介入の有効性をモニターするステップをさらに含む。
【００４９】
本発明のこの方法が、マイコバクテリア感染を診断するための、任意のすでに公知の検査と併用できることは容易に明らかであろう。例えば、本方法は、従来のＴ細胞に基づくＴＢ感染の診断検査、例えば、ＭＴＢのＲｅｇｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ−１にコードされたタンパク質抗原を使用したものの、診断感受性を拡大するために使用できる。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体及びＴ細胞応答検出手段を含む、対象においてマイコバクテリア感染を評価するための製品、組み合わせ又はキットを提供する。
【００５１】
好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞応答検出手段は、少なくとも１つの抗体である。より好ましくは、この抗体は、サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の活性化又は増殖のマーカーに特異的である。さらにより好ましくは、この抗体はｍＡＢである。
【００５２】
第１の態様の方法の任意の特徴を、第２の態様の製品、組み合わせ又はキットに組み込むことができることは理解されるであろう。
【００５３】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照しながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のＰＰＤ応答を示す図である。
【図２】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のミコール酸応答を示す図である。
【図３】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のヒト型結核菌の脂質全溶解物に対する応答を示す図である。
【図４】抗ＣＤ１ｂ抗体によるＴＢ患者のミコール酸特異的応答の遮断を示す図である。
【図５】治療期間中の、ＴＢ患者のＰＰＤ特異的応答の進展を示す図である。
【図６】治療期間中の、ＴＢ患者のヒト型結核菌の脂質溶解物特異的応答の進展を示す図である。
【図７】治療期間中の、ＴＢ患者のミコール酸特異的応答の進展を示す図である。
【図８】治療期間中の、ＴＢ患者のＥＳＡＴ−６特異的応答の進展を示す図である。
【図９】治療期間中の、ＴＢ患者のＣＦＰ１０特異的応答の進展を示す図である。
【図１０】治療６カ月後の、ＴＢ患者の、ミコール酸特異的応答と、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答との比較を示す図である。
【図１１ａ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｂ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｃ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｄ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１２】診断時のＴＢ患者の、ミコール酸、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答を示す図である。
【実施例】
【００５５】
実施例１
方法論
ＭＴＢ感染患者からの血液試料の処理に関する操作プロトコル及びＴ細胞応答の評価
【００５６】
０日目
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（商標）（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ ＵＫ社、ハンティンドン、イギリス）を使用して、密度勾配遠心分離法により単離する。その後、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、２％ヒト血清培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン）に、６×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。その後、ＰＢＭＣを、１時間、３７℃において、培地培養フラスコにおいてインキュベートする。非接着性細胞を、温ＰＢＳ（食塩水）の洗浄液で３回洗い落とし、接着性細胞を３７℃で一晩、ＧＭＣＳＦ（１：１０００希釈）を含む５％ヒト血清培地中においてインキュベートする。洗い落とされたＰＢＬ（末梢血リンパ球）を、１０：１ウシ胎児血清、ＤＭＳＯ溶液中に１５×１０６細胞／ｍｌで、−８０℃において凍結し、翌日液体窒素中に移す。
【００５７】
１日目
単球を、冷ＰＢＳで洗浄することにより回収し、４８ウェル培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで、５％ヒト血清培地＋ＩＬ−４（１：１０００）＋ＧＭＣＳＦ（１：１０００）中の２×１０６／ｍｌを播種する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをＰＢＳで６回洗浄し、５０ｕＬのＰＢＳ溶液中の１：２００の７−Ｂ６−１ＡＬＰ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）をウェルに加え、放置して室温で９０分間インキュベートする。ＰＢＳで６回洗浄後、５０ｕＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を１０分間各ウェルに加えた。その後、プレートを水道水で洗浄し、乾燥させる。
【００５８】
３日目
単球を、１ｍｌの５％ヒト血清＋ＧＭＣＳＦ（１：１０００）を加えることによって培養する。
【００５９】
６日目
培養した単球（ここでは未成熟ＤＣ）を、ＤＭＳＯに可溶化した抗原の１００ｕｇ／ｍｌ溶液の４ｕｌを用いてパルスする。使用した抗原は、ＰＩ、ミコール酸、ＴＢ全脂質溶解物及びＤＭＳＯである。未成熟ＤＣのパルスの前に、ＤＭＳＯに可溶化した脂質を、７０℃のウォーターバスにおいて１０分間加熱し、確実に完全に可溶化する。
【００６０】
７日目
培養したＤＣを、マルチプルサクション（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｃｔｉｏｎ）を介して回収し、１０％ＨＳ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。同じ患者からのＰＢＬを、３７℃のウォーターバスにおいて解凍し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、その後、それらを１０％のＨＳ培地に１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。
２００ｕＬの１０％のＨＳ培地を、サイトカイン特異的捕捉ｍＡｂ（モノクローナル抗体）１Ｄ１−ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）でコーティングした、９６ウェルの、予備コーティングＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブランプレートのウェルに加える。このプレートを、３７℃で６０分間インキュベートする。このウェルを空にして、５０ｕＬのＰＢＬ＋１００ｕＬのＤＣを各ウェルに加える。このプレートを、３７℃で一晩放置する。
【００６１】
８日目
ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＰＢＳで６回洗浄し、ＰＢＳ溶液中の５０ｕＬの１：２００の７−Ｂ６−１ＡＬＰ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）をウェルに加え、室温で９０分間インキュベートする。ＰＢＳで６回洗浄後、５０ｕＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を加えて１０分間置いた。その後、プレートを水道水で洗浄し、乾燥させる。
【００６２】
ＣＤ１分子のリフォールディングのための操作プロトコル
グアニジン変性ＣＤ１ｂタンパク質を、希釈リフォールディングにより、６〜８℃で復元した。５００ｍｌのリフォールディングバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、４００ｍＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン及び０．１ｍＭのＰＭＳＦ）を、５００ｍｌのビーカー中に調製した。リフォールディングバッファーを、マグネチックスターラーを使用して常に攪拌した。５ｍｇのＢ２Ｍを、タンパク質をリフォールディングバッファーで１／５に初回予備希釈することによって、リフォールディングミックスに加えた。４５分後、５００μＭのＣＴＡＢ界面活性剤を、リフォールディングバッファーに加え、その後１．５μｇの脂質を加えた。脂質はあらかじめ乾燥させ、１ｍｌの媒体溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、２０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、６０℃のウォーターバスにおいて１０分間加熱した。リフォールディングバッファーで１／５に希釈した１５ｍｇの変性ＣＤ１ｂを、３日間以上５アリコートに加えた。その後１２モル当量（ＣＴＡＢに対して）のメチル−β−シクロデキストリン（ｍＣＡＢ）を加えた。その後、リフォールドしたタンパク質をアミコン攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）を用いて７ｍｌに濃縮し、０．２μＭのフィルターを介してろ過し、ビオチン化した。その後、複合体を、ファルマシア２６／６０スーパーデックス２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で、ファルマシアＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実施したゲルろ過を使用して精製した。
【００６３】
その後、リフォールドしたＣＤ１分子を、本発明の方法においてＴ細胞応答を評価するために使用できる。
【００６４】
結果
本発明の方法の精度を評価するために、ＰＢＬ中に存在するＴ細胞の、ミコール酸に対する応答を、ヒト型結核菌に曝露されたことが分かっていない健康なドナー（ＢＣＧワクチン接種済み）の数と、活動性ＴＢの患者の数において比較した。表１は、検査対象の人口統計学的特性及び臨床的特性を示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
ミコール酸に関する結果と、他の抗原に対する結果との精度を比較するために、これらのいくつかに対する応答をさらに測定した。測定した他の抗原は、陰性対照としても使用した脂質媒体単体（ＤＭＳＯ）（データ非掲載）、Ｔ細胞の活性化が抗原処理のみによるものではなく、脂質特異性のためでもあることを検証するための陰性対照としても使用したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ＰＰＤ及びヒト型結核菌全脂質溶解物であった。
【００６７】
ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０（Ｍ．ｔｂのＲＤ−１領域由来の２種のタンパク質であり、ＢＣＧにおいて欠失している領域であり、現在２種の異なる診断検査（Ｔ−ＳＰＯＴ及びクォンティフェロン−ゴールド（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ−ｇｏｌｄ））に使用されている）を、比較のための基準として使用した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、すべての実験において陽性対照として使用した（データ非掲載）。
【００６８】
Ｔ細胞応答を、健康な対照及び活動性ＴＢの患者の双方において、ＩＦＮ−γスポット形成細胞数を数え上げることによって測定した。
【００６９】
ミコール酸、ＰＰＤ及びヒト型結核菌全脂質溶解物に対する応答を、ＰＩ応答に対して正規化した。数は、５０００００個のＰＢＬ（末梢血リンパ球）当たりに観察されたスポット数を表す。カットオフポイントの６は、ＴＢ患者と健康な対照に関して、最もよいデータ分割点を提供する値を考慮して選択した。
【００７０】
このデータを、活動性ＴＢ患者は、健康な対照より高い応答を有するだろうという仮説のもとにＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ分析に供した。
【００７１】
図１は、健康な対照及び活動性ＴＢ患者の双方において観察されたＰＰＤ応答を示す。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた場合、ＰＰＤの誘発に対する応答において、２つの群の間に統計的に有意な差異は観察されなかった、ｐ＝０．４５６３。
【００７２】
しかし、図２は、ミコール酸特異的応答が、健康な、ＢＣＧワクチン接種済みの対照と比較して、活動性ＴＢ患者において統計的に有意に高いことを示している（ｐ＝０．０００４）。カットオフ値の６スポットを用いて、それを超える応答を陽性とみなし、８０％（３０例のＴＢ患者のうち２４例が陽性）の高い診断感受性及び１００％（１２例のＢＣＧワクチン接種済みの健康な対照のうち１２例が陰性）の高い診断特異性を得た。
【００７３】
健康な対照及び活動性ＴＢ患者の双方における、ＴＢ全脂質溶解物に対するＴ細胞応答をさらに測定し、結果を図３に示す。活動性ＴＢ患者は、健康な対照より高い応答を有するだろうという仮説のもとにＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を適合させた場合、ｐ＝０．０００７が得られる。
【００７４】
以前の研究（Ｕｌｒｉｃｈら、２００３）により、ヒト型結核菌全脂質溶解物を標的抗原として使用した場合、潜伏性ＴＢ感染（ＰＰＤ＋）と推測されるヒトと、未感染であると推測される（ＰＰＤ−）健康な対照との間で、Ｔ細胞応答において、統計的に有意な差異が示された。本発明者らの結果は、全脂質溶解物に対するＩＦＮ−γＴ細胞応答において、健康な未感染個体と活動性ＴＢ患者との間に、同様の差異が存在することを示唆している。しかし、ヒト型結核菌全脂質溶解物に対する定量的応答は、特異性が低く、５例の未感染対照が陽性に判定されている。
【００７５】
したがって、ミコール酸は、ＴＢ診断検査に使用する、より有利な抗原である。
【００７６】
抗ＣＤ１ｂ抗体を使用して、ミコール酸特異的応答が、ＣＤ１ｂ拘束性であることを究明した。図４を参照されたい。
【００７７】
Ｍ．ｔｂ脂質、ミコール酸、ＰＰＤ、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答は、治療期間に続いて起こった。図６及び７は、それぞれＭ．ｔｂ脂質及びミコール酸に対する応答が、治療期間中に減少しており、診断と６カ月の治療との間にそれぞれｐ＝０．０３及びｐ＝０．０４の統計的差異を与えたことを示しているが、それに対してＰＰＤ特異的応答は、図５に示したように安定して維持されている。ミコール酸の場合、応答は、６カ月の時点で大部分の患者において検出不可のレベルまで達しており、診断後１２カ月でもそのままである様に思われる。
【００７８】
治療期間中の応答の大きさにおけるこの減少は、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０についても観察することができ、それぞれ図８及び９を参照されたい。しかし、大部分の患者は、治療６カ月後にこれら２種のタンパク質抗原のどちらかに陽性応答を未だ有する傾向があり、これらの応答は、診断１２カ月後まで検出可能なままであると思われる。診断６カ月後のミコール酸、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答を直接比較した場合、大部分の患者はミコール酸に対して応答しないが、一方、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答は、検出可能に維持される傾向があり、図１０を参照されたい。したがって、ミコール酸特異的応答は、活動性の疾患の診断において有用であり得る。
【００７９】
図１１を参照すると、以下の個々のＴＢ患者が治療期間を終えた時に、４例の患者のうち３例（Ｂ１６、Ｂ４９及びＢ５５）が、治療６カ月後にはもはやミコール酸に対して応答しないが、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ１０のどちらかに対して検出可能な応答を未だ有していることが見られる。患者Ｂ１６の場合、ミコール酸特異的応答は、診断１２カ月後まで検出不可のままであるが、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答は検出可能に維持されている。患者Ｂ５２において、ミコール酸特異的応答は、治療６カ月後に未だ観察可能であるが、診断時のミコール酸特異的応答の大きさが、他のＴＢ患者と比較した場合、非常に高かった。したがって、この応答は消失するまでに長い時間がかかると思われ、１２カ月の時点では検出不可のレベルに達することを示唆している。これらの結果から、ミコール酸特異的応答の存在が、活動性疾患の有用なマーカーとなり得ることがさらに示唆される。
【００８０】
診断時のミコール酸特異的応答と、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答とを直接比較した場合、１つの抗体に対する強い応答は、他の２つのどちらかに対する強い応答と相関しないことが観察され、図１２を参照されたい。これは、３種すべての抗原を組み合わせると、現在の診断検査の感受性を改善することができることを示唆するものである。
【００８１】
本研究に使用した患者のコホートにおいて、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答が、ミコール酸特異的応答よりも優勢であることが見出され、４例の患者はＥＳＡＴ−６に対して応答したが、ミコール酸に対しては応答せず、３例の患者は、ＣＦＰ１０に対して応答したが、ミコール酸に対しては応答しなかった。１例の患者は、さらにミコール酸に応答したが、ＣＦＰ１０特異的応答が陰性であることが見出されており、表２を参照されたい。
【００８２】
【表２】
【００８３】
誤解を避けるために、すべての引用文献が、本明細書にその全体が組み込まれていることが理解されるであろう。
【００８４】
（参考文献）
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Ｕｌｒｉｃｈｓ， Ｔ． Ｍｏｏｄｙ， Ｄ． Ｂ． Ｇｒａｎｔ， Ｅ． Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｓ． Ｈ． Ｐｏｒｃｅｌｌｉ， Ｓ． Ａ． Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＣＤ１−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ［２００３］ Ｖｏｌｕｍｅ ７１， Ｉｓｓｕｅ ６， ｐａｇｅ ３０７６−８７， Ｊｕｎ．
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【技術分野】
【０００１】
［概要］
本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで、ミコール酸抗原に特異的なＴ細胞を検出することにより、対象のマイコバクテリア感染を検出するためのアッセイに関する。
【０００２】
［背景］
ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の形態のマイコバクテリア感染は、世界的に重要な問題であり、毎秒１人が新たに感染している。結核は、慢性の感染性疾患であり、一般的には、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染することにより発症する。
【０００３】
結核は、発展途上国における重要な疾患であり、世界の先進地域においても増えつつある問題である。全般的に、世界の人口の１／３は、結核菌に現在感染している。ヒト型結核菌に感染していること以外は健康な人々の５〜１０％が、その人生のある時点で発病又は、他人にうつす恐れがある。しかし、免疫不全の人々、例えばＨＩＶの人々が、さらにヒト型結核菌に感染すると、ＴＢを発症する可能性が非常に高い。
【０００４】
感染はかなりの期間無症状であり得るにもかかわらず、再活動化により、肺の慢性炎症として最も一般的に現れる疾患をもたらし、熱及び咳をもたらし得る。治療せずに放置した場合、通常は深刻な合併症及び死に至る。現時点の推定では、１年に９００万の新たなＴＢ症例及びほぼ２００万の死亡例が存在することが示されている。ＴＢであると明らかに診断されたすべての患者に対して、それより多くの患者がＴＢが疑われると評価されている（世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）、２００６）。
【０００５】
活動性ＴＢの決定的な診断は、臨床材料からのＴＢ菌、ヒト型結核菌の培養によってなされる。しかし、培養は、陽性になるまで２〜８週間かかり、実質的少数の患者（２０〜５０％）の培養物は陰性である。したがって、別の活動性ＴＢのより新規な診断検査が、早急に必要である（Ｄｉｎｎｅｓら、Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ、２００７に総説）。
【０００６】
ＴＢ感染のいくつかの検査は、ヒト型結核菌のタンパク質に対する細胞性免疫系の感作を検査する。これらの最も広範に使用されているものは、ツベルクリン反応（ＰＰＤ検査又はマントー反応又はツベルクリン感受性試験又はピルケ反応としても公知である）であり、１００年以上使用されている。この検査は、結核菌のグリセリン抽出物である、ツベルクリンへの曝露に対する応答の特定に基づいている。この検査に使用する標準材料は、精製タンパク質誘導体ツベルクリン（ＰＰＤ）であり、これは滅菌、濃縮培養物のろ液から得られた、非種特異的分子の沈殿である。
【０００７】
この検査は、標準用量である５ツベルクリン単位（０．１ｍｌ）を、前腕の手掌面へ皮内注射することを含む。結果は、臨床検査の４８〜７２時間後に得られる。細菌に曝露されたことがあるヒトは、細菌タンパク質を含む皮膚の遅延型過敏免疫応答が起こることが期待される。一方、ＴＢに曝露されたことがない個体では、応答が見られないであろう（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｃｈｓｔｐ／ｔｂ／ｐｕｂｓ／Ｍａｎｔｏｕｘ／ｐａｒｔｌ．ｈｔｍ）。
【０００８】
この検査は、多くの問題を有しており、第１に、ツベルクリンの初回注射の３日後に、患者の再検査が必要であり、必ずしも容易又は便利ではない。第２に、結果は、試験を実施した人物による解釈に左右される。第３に、このことは偽陽性の提示をもたらし得るので、解釈は、ＢＣＧワクチンを接種されることがある、又は他のマイコバクテリアに曝露されたことがある患者においては複雑である。第４に、この検査は、特に感受性が高いわけではなく、それ故多くの偽陰性をもたらし得る（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｎら、１９９２）。
【０００９】
ここ数年、新世代の細胞性免疫に基づく試験が開発されており、臨床診療に参入している。それらは、血液試料を、タンパク質抗原、特に、ヒト型結核菌には存在するが、ＢＣＧには存在しないＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０とともに一晩インキュベートした後で、インターフェロン−γＴ細胞応答をｅｘ ｖｉｖｏで測定する。したがって、検査結果は、以前のＢＣＧワクチン接種と混同されない。２つの市販のアッセイフォーマット：酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）及び酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が存在する。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、本発明の発明者らの一人により開発され、特許となり、臨床的に確証された。これらのアッセイは、ヒト型結核菌感染の診断において、大幅な進歩であると思われる。両方のアッセイは皮膚検査より特異的であり、ＥＬＩＳｐｏｔはさらにより感受性が高い。しかし、ＴＢ曝露後の皮膚検査結果が陽性であったヒトは、その後数年にわたって、活動性ＴＢの進行の危険性が増すことは公知であり（その結果、陽性の皮膚検査結果は、休眠しているが疾患発症の可能性を維持している生菌による潜伏性感染に影響を与えることを示している）、最近ＴＢ接触した場合の、陽性Ｔ細胞に基づくインターフェロンγ（ＴＩＧＲＡ）の予後値は未知である。したがって、陽性のＴＩＧＲＡ結果が、休眠しているが疾患発症の可能性を維持している生菌による感染を示すかどうかはまだ確実ではない。
【００１０】
皮膚検査及びＴＩＧＲＡ検査はどちらも重要な欠点を持っている。
【００１１】
第１に、それらは活動性ＴＢ感染と、潜伏性ＴＢ感染を識別できない。
【００１２】
第２に、ＴＩＧＲＡは、応答の強度が、良好な抗ＴＢ治療と共に低下する皮膚検査より動的であるが（Ｌａｌｖａｎｉら、Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓ ２００１；Ｐａｔｈａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；Ｌａｌｖａｎｉら、ａｍ ｊ ｒｅｓｐ ｃｒｉｔ ｃａｒｅ ｍｅｄ ２００１； Ｌａｌｖａｎｉら、ｌａｎｃｅｔ ２００１；Ｅｗｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ２００３）、その低下には、非常に大きな個体間の変動があり、かなりの割合の患者が、治療完了後長期の間、陽性の血液検査結果を有し続ける（Ｅｗｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００６；Ｃｈｅｅら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２００６；Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７）。したがって、これらのアッセイ、特にＥＬＩＳｐｏｔが抗ＴＢ治療のモニターに使用でき、又は治癒の検査として使用できるという初期の期待は、長期間の研究によって満たされていない。これはおそらく、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性ペプチド特異的ＣＤ８及びＣＤ４メモリーＴ細胞は、ＴＩＧＲＡにおいて陽性応答を依然として示すのに十分なレベルで、治療後長期にわたって存続するためである（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 、２００７）。
【００１３】
第３に、それらは、診断の感受性を制限しており、この検査の臨床的有用性をある程度制限している。このことは、ＴＢの疑わしい診断を排除するために、陰性の検査結果の値が非常に高い診断感受性に依存しているためである。
【００１４】
本発明の目的は、皮膚検査及びＴＩＧＲＡの上記の制限を克服する、マイコバクテリア感染を特定するための、細胞性免疫に基づく改善された検査を提供することである。
【００１５】
本発明によれば、対象においてマイコバクテリア感染を評価する方法であって、
ｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、ミコール酸又はミコール酸類似体に曝露するステップと、
ｉｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、対象から単離した、少なくとも１つのＴ細胞を含む試料と共にインキュベートするステップと、
ｉｉｉ．Ｔ細胞応答及び／又はＴ細胞試料中に存在するミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定するステップと
を含む方法を提供する。
【００１６】
本明細書で使用する場合、評価という用語は、ＴＢとして現れるマイコバクテリア感染の診断；疾患として現れない潜伏性マイコバクテリア感染の診断、活動性及び潜伏性のマイコバクテリア感染の識別及び時間経過によるマイコバクテリア感染の状態の進行又は変化のモニターを含む。その場合、変化は、自発的に、又は薬剤若しくはワクチン若しくは検査薬若しくは検査ワクチンを用いた治療の結果として起こり得る。
【００１７】
この方法のステップｉｉを、ステップｉと同時、又はステップｉに続いて実施できることは、当業者にはさらに明白であろう。
【００１８】
一実施形態において、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、少なくとも１つの樹状細胞を含む。ＣＤ１分子を提示するために樹状細胞を使用することは、本発明にとって必ずしも必須ではないことは当業者には理解されるであろう。ＣＤ１分子は、当業者に公知の任意の適切な方法により提示され得る。
【００１９】
樹状細胞は、免疫系の一部を形成する細胞である。これらの細胞は、抗原物質を処理し、免疫系の他の細胞により認識されるために、それらの表面に抗原物質を提示する。それらは、血液中に未成熟状態で見出され、活性化されると、免疫応答の開始及び調節に関与するリンパ系組織に移動する。
【００２０】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの樹状細胞は、対象から単離された少なくとも１つの単球を、ｅｘ ｖｉｖｏで培養することによって産生される。
【００２１】
体内において、単球は骨髄の単芽球から産生され、循環の中に放出され、そこで身体の組織に移動する前に１〜３日間血液中を循環する。
【００２２】
或いは、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、人工的に合成されたＣＤ１分子を含む。自己ＤＣ生成の要求を回避するために設計されたこの戦略では、基質上に脂質負荷ＣＤ１ｂモノマーを固定化する。好ましい実施形態において、基質は、ｐｖｄｆをコーティングした基質である。
【００２３】
さらに好ましい実施形態において、脂質負荷ＣＤ１ｂモノマーを、参照により本明細書に組み込まれている、ＳａｖａｇｅらがＭＨＣクラスＩモノマーに使用した同じ方法（Ｏｇｇ ＧＳら、２０００）で、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ陰性細胞の表面に固定化できる。
【００２４】
さらに別の実施形態において、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体は、ＣＤ１分子を発現する細胞系に由来し得る。この細胞系が、提示の手段として使用できることは明らかであろう。
【００２５】
好ましくは、ＣＤ１発現細胞系は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ陰性でもある。例えば、参照により本明細書中に組み込まれている、Ｄｅ Ｌａ Ｓａｌｌｅらは、ＣＤ１ｂを形質導入したＭＨＣ−陽性ＴＨＰ−１細胞を使用して、ＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞クローンを活性化している（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ、Ｍａｒｉｏｔｔｉら、２００５）。
【００２６】
好ましい実施形態において、Ｔ細胞応答を、前記Ｔ細胞と、以前にミコール酸に曝露されていない樹状細胞とを接触させた時に見られるＴ細胞応答と比較する。ミコール酸に曝露された樹状細胞と接触させた場合のＴ細胞応答が、ミコール酸に曝露させていない樹状細胞において見られるＴ細胞応答と比較して増大している場合、マイコバクテリア感染を示していることは理解されるであろう。
【００２７】
好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ１拘束性Ｔ細胞である。
【００２８】
ミコール酸に対するＴ細胞応答の検出を、マイコバクテリア感染を診断するための方法として使用することには、数多くの利点がある。脂質抗原は、すべてのヒトにおいて発現されるＣＤ１分子により提示され、ペプチド抗原（ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０を含む）を提示するＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ分子ほどには多型でない。このことは、すべてのヒトにおける抗原提示細胞が、ミコール酸を潜在的に提示でき、反対にペプチドエピトープをＴ細胞へ提示するタンパク質抗原は、個体の遺伝的構成、すなわち組織型又はＨＬＡハプロタイプにより制限されることを意味する。したがって、ミコール酸に基づく診断検査は、非近交系の遺伝的に異質な集団において、高度な診断感受性を可能にすると思われる。
【００２９】
ＣＤ１分子それ自体は、さまざまなヒト抗原提示細胞の表面上に発現される糖タンパク質のファミリーであり、グループ１及びグループ２のＣＤ１分子に細分される。グループ１ＣＤ１分子は外来脂質抗原、具体的にいくつかのマイコバクテリアの細胞壁成分を、ＣＤ−１特異的Ｔ細胞に提示し、それによって、マイコバクテリア感染の特定における使用に特に適するものとなる（Ｍａｎｆｒｅｄ Ｂｒｉｇｌら、２００４）。
【００３０】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性のＣＤ８及びＣＤ４ペプチド特異的Ｔ細胞の特徴である長期免疫記憶が、先天性免疫及び後天性免疫の間のハイブリッドを表すＣＤ１拘束性Ｔ細胞とは全く異なると思われる。したがって、ＣＤ１拘束性脂質抗原が身体から浄化された場合、例えば、良好なＴＢ治療の後、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞は非常に数が減り、反対に、ペプチド特異的メモリーＴ細胞は、感染の治療後何年もの間増加した数で生存することになる（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７）。
【００３１】
これらの理由から、脂質特異的ＣＤ１拘束性Ｔ細胞（又はそれらの産物）の定量的検出は、一方は活動性ＴＢ疾患（細菌負荷が高い）と、他方は潜伏性ＴＢ感染（細菌負荷が低い）とに識別できる。さらに、未治療の活動性ＴＢと、良好に治療されたＴＢ感染（細菌は生存していないと考えられる）とも識別できる。本発明の方法は、感染レベル、活動性ＴＢ又は潜伏性感染かどうかを、治療の間にモニターすることも可能である。
【００３２】
これらは、ＴＩＧＲＡより非常に有利であり、本発明がタンパク質に基づくＴＩＧＲＡに置き換え可能である、又はそれらの提供する情報と共に相乗的及び相補的方法で機能し得ることを示しているであろう。
【００３３】
ミコール酸に特異的なＴ細胞又はＴ細胞応答を検出することにより、活動性ＴＢ感染及び潜伏性感染を識別することができ、今日までに開発されたＴ細胞に基づく診断検査は双方とも、高い診断感受性を有さず、活動性ＴＢ疾患と、潜伏性ＴＢ感染とを確実に識別しないので、本発明は、既存の検査法を上回る明らかな利点を提供する。
【００３４】
ミコール酸それ自体は、細菌が細胞壁の主要な成分を形成する、細菌のミコラータ類（ｍｙｃｏｌａｔａ ｔａｘｏｎ）の細胞壁において見出される長鎖脂肪酸である。６０〜９０個の間の炭素を有する長鎖ミコール酸は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のすべての属において見出され、したがって、ＴＢを伴う症状を提示しない病気の個体における他のマイコバクテリア（ライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を含む）による感染の診断に有用であり得る。ヒト型結核菌は、３種の主要なミコール酸：α−、メトキシ−及びケト−を産生し、そのうちα−ミコール酸が少なくとも７０％を占める（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９５）。
【００３５】
一実施形態において、Ｔ細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の形態である。
【００３６】
ＰＢＬは、循環血液中に見出される成熟リンパ球であり、リンパ節、脾臓、胸腺、肝臓又は骨髄などの臓器に位置するものとは対照的である。
【００３７】
さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、活動性ＴＢ疾患の部位から採取された体液、例えば気管支肺胞洗浄液（肺の洗浄液）又は胸水又は脳脊髄液又は腹水から単離される。
【００３８】
しかし、Ｔ細胞を含む任意の体液が本発明の方法に使用でき、これらは疾患部位又は血液由来のＴ細胞に制限されないことは理解されるであろう。想定される体液は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、肺生検材料、痰（誘発喀痰を含む）、腹水、胸膜液、胸膜生検材料、リンパ節生検材料、吸引関節液、脳脊髄液、軟部組織膿瘍及び身体の任意の他の患部を含む。好ましくは、測定されたＴ細胞応答は、１つ若しくは複数のサイトカイン及び／若しくはケモカインの分泌、又は１つ若しくは複数のＴ細胞活性化のマーカーの発現である。
【００３９】
好ましくは、サイトカインはＩＦＮγである。しかし、他のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α若しくはＩＬ−２及び／又はケモカイン、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１若しくはＭＩＰ１−αが本発明の方法に用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【００４０】
サイトカイン又はケモカインが、当分野で公知の適切な任意の技術、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ又は細胞内サイトカイン染色、その後のフローサイトメトリー、又はサイトカイン分泌及び捕捉アッセイ、又はＥＬＩＳＡ又は全血ＥＬＩＳＡによって検出できることは、当業者には容易に明らかであろう。
【００４１】
別の実施形態において、ミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定する。このことは、当分野において周知の多くの方法、例えば、四量体又は五量体染色、その後のフローサイトメトリーにより実施できることは、当業者には理解されるであろう（Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ Ｐら、Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ：ｎｅｗ ｔａｌｅｓ ｆｒｏｍ ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．［２００２］２（４）：２６３〜７２）。
【００４２】
ミコール酸特異的Ｔ細胞の存在が、マイコバクテリア感染を示すことはさらに明らかであろう。
【００４３】
好ましくは、マイコバクテリア感染は、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＴＢ）感染である。
【００４４】
好ましくは、ミコール酸は、マイコバクテリアから単離される。より好ましくは、マイコバクテリウムは結核菌群（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）である。
【００４５】
本発明の方法が、任意の哺乳動物に有用であり得ることは明らかであろう。
【００４６】
好ましい実施形態において、この方法は、医療及び／又は獣医学の分野、例えば、家畜類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ又は動物園に囚われているものなどの野生の哺乳動物）を含む、家畜化された哺乳動物におけるマイコバクテリア感染の診断に有用である。本発明の最も好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、対象は、治療的介入を受けている、又は以前に受けたことがある。
【００４８】
好ましくは、この方法は、感染の状態と、前記個体の前記感染の以前に測定された状態とを比較し、それによって、前記個体における前記治療的介入の有効性をモニターするステップをさらに含む。
【００４９】
本発明のこの方法が、マイコバクテリア感染を診断するための、任意のすでに公知の検査と併用できることは容易に明らかであろう。例えば、本方法は、従来のＴ細胞に基づくＴＢ感染の診断検査、例えば、ＭＴＢのＲｅｇｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ−１にコードされたタンパク質抗原を使用したものの、診断感受性を拡大するために使用できる。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体及びＴ細胞応答検出手段を含む、対象においてマイコバクテリア感染を評価するための製品、組み合わせ又はキットを提供する。
【００５１】
好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞応答検出手段は、少なくとも１つの抗体である。より好ましくは、この抗体は、サイトカイン、ケモカイン或いはＴ細胞の活性化又は増殖のマーカーに特異的である。さらにより好ましくは、この抗体はｍＡＢである。
【００５２】
第１の態様の方法の任意の特徴を、第２の態様の製品、組み合わせ又はキットに組み込むことができることは理解されるであろう。
【００５３】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照しながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のＰＰＤ応答を示す図である。
【図２】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のミコール酸応答を示す図である。
【図３】ＴＢに感染した個体と比較した、健康な個体のヒト型結核菌の脂質全溶解物に対する応答を示す図である。
【図４】抗ＣＤ１ｂ抗体によるＴＢ患者のミコール酸特異的応答の遮断を示す図である。
【図５】治療期間中の、ＴＢ患者のＰＰＤ特異的応答の進展を示す図である。
【図６】治療期間中の、ＴＢ患者のヒト型結核菌の脂質溶解物特異的応答の進展を示す図である。
【図７】治療期間中の、ＴＢ患者のミコール酸特異的応答の進展を示す図である。
【図８】治療期間中の、ＴＢ患者のＥＳＡＴ−６特異的応答の進展を示す図である。
【図９】治療期間中の、ＴＢ患者のＣＦＰ１０特異的応答の進展を示す図である。
【図１０】治療６カ月後の、ＴＢ患者の、ミコール酸特異的応答と、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答との比較を示す図である。
【図１１ａ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｂ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｃ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１１ｄ】治療期間中の、個々のＴＢ患者個体のＰＰＤ、ミコール酸、ヒト型結核菌脂質溶解物、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答の進展を示す図である。
【図１２】診断時のＴＢ患者の、ミコール酸、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答を示す図である。
【実施例】
【００５５】
実施例１
方法論
ＭＴＢ感染患者からの血液試料の処理に関する操作プロトコル及びＴ細胞応答の評価
【００５６】
０日目
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（商標）（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ ＵＫ社、ハンティンドン、イギリス）を使用して、密度勾配遠心分離法により単離する。その後、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、２％ヒト血清培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン）に、６×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。その後、ＰＢＭＣを、１時間、３７℃において、培地培養フラスコにおいてインキュベートする。非接着性細胞を、温ＰＢＳ（食塩水）の洗浄液で３回洗い落とし、接着性細胞を３７℃で一晩、ＧＭＣＳＦ（１：１０００希釈）を含む５％ヒト血清培地中においてインキュベートする。洗い落とされたＰＢＬ（末梢血リンパ球）を、１０：１ウシ胎児血清、ＤＭＳＯ溶液中に１５×１０６細胞／ｍｌで、−８０℃において凍結し、翌日液体窒素中に移す。
【００５７】
１日目
単球を、冷ＰＢＳで洗浄することにより回収し、４８ウェル培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで、５％ヒト血清培地＋ＩＬ−４（１：１０００）＋ＧＭＣＳＦ（１：１０００）中の２×１０６／ｍｌを播種する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをＰＢＳで６回洗浄し、５０ｕＬのＰＢＳ溶液中の１：２００の７−Ｂ６−１ＡＬＰ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）をウェルに加え、放置して室温で９０分間インキュベートする。ＰＢＳで６回洗浄後、５０ｕＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を１０分間各ウェルに加えた。その後、プレートを水道水で洗浄し、乾燥させる。
【００５８】
３日目
単球を、１ｍｌの５％ヒト血清＋ＧＭＣＳＦ（１：１０００）を加えることによって培養する。
【００５９】
６日目
培養した単球（ここでは未成熟ＤＣ）を、ＤＭＳＯに可溶化した抗原の１００ｕｇ／ｍｌ溶液の４ｕｌを用いてパルスする。使用した抗原は、ＰＩ、ミコール酸、ＴＢ全脂質溶解物及びＤＭＳＯである。未成熟ＤＣのパルスの前に、ＤＭＳＯに可溶化した脂質を、７０℃のウォーターバスにおいて１０分間加熱し、確実に完全に可溶化する。
【００６０】
７日目
培養したＤＣを、マルチプルサクション（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｃｔｉｏｎ）を介して回収し、１０％ＨＳ培地に、１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。同じ患者からのＰＢＬを、３７℃のウォーターバスにおいて解凍し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、その後、それらを１０％のＨＳ培地に１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。
２００ｕＬの１０％のＨＳ培地を、サイトカイン特異的捕捉ｍＡｂ（モノクローナル抗体）１Ｄ１−ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）でコーティングした、９６ウェルの、予備コーティングＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブランプレートのウェルに加える。このプレートを、３７℃で６０分間インキュベートする。このウェルを空にして、５０ｕＬのＰＢＬ＋１００ｕＬのＤＣを各ウェルに加える。このプレートを、３７℃で一晩放置する。
【００６１】
８日目
ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＰＢＳで６回洗浄し、ＰＢＳ溶液中の５０ｕＬの１：２００の７−Ｂ６−１ＡＬＰ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）をウェルに加え、室温で９０分間インキュベートする。ＰＢＳで６回洗浄後、５０ｕＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を加えて１０分間置いた。その後、プレートを水道水で洗浄し、乾燥させる。
【００６２】
ＣＤ１分子のリフォールディングのための操作プロトコル
グアニジン変性ＣＤ１ｂタンパク質を、希釈リフォールディングにより、６〜８℃で復元した。５００ｍｌのリフォールディングバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８、４００ｍＭのＬ−アルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン及び０．１ｍＭのＰＭＳＦ）を、５００ｍｌのビーカー中に調製した。リフォールディングバッファーを、マグネチックスターラーを使用して常に攪拌した。５ｍｇのＢ２Ｍを、タンパク質をリフォールディングバッファーで１／５に初回予備希釈することによって、リフォールディングミックスに加えた。４５分後、５００μＭのＣＴＡＢ界面活性剤を、リフォールディングバッファーに加え、その後１．５μｇの脂質を加えた。脂質はあらかじめ乾燥させ、１ｍｌの媒体溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、２０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、６０℃のウォーターバスにおいて１０分間加熱した。リフォールディングバッファーで１／５に希釈した１５ｍｇの変性ＣＤ１ｂを、３日間以上５アリコートに加えた。その後１２モル当量（ＣＴＡＢに対して）のメチル−β−シクロデキストリン（ｍＣＡＢ）を加えた。その後、リフォールドしたタンパク質をアミコン攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ ｓｔｉｒｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）を用いて７ｍｌに濃縮し、０．２μＭのフィルターを介してろ過し、ビオチン化した。その後、複合体を、ファルマシア２６／６０スーパーデックス２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で、ファルマシアＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実施したゲルろ過を使用して精製した。
【００６３】
その後、リフォールドしたＣＤ１分子を、本発明の方法においてＴ細胞応答を評価するために使用できる。
【００６４】
結果
本発明の方法の精度を評価するために、ＰＢＬ中に存在するＴ細胞の、ミコール酸に対する応答を、ヒト型結核菌に曝露されたことが分かっていない健康なドナー（ＢＣＧワクチン接種済み）の数と、活動性ＴＢの患者の数において比較した。表１は、検査対象の人口統計学的特性及び臨床的特性を示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
ミコール酸に関する結果と、他の抗原に対する結果との精度を比較するために、これらのいくつかに対する応答をさらに測定した。測定した他の抗原は、陰性対照としても使用した脂質媒体単体（ＤＭＳＯ）（データ非掲載）、Ｔ細胞の活性化が抗原処理のみによるものではなく、脂質特異性のためでもあることを検証するための陰性対照としても使用したホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ＰＰＤ及びヒト型結核菌全脂質溶解物であった。
【００６７】
ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０（Ｍ．ｔｂのＲＤ−１領域由来の２種のタンパク質であり、ＢＣＧにおいて欠失している領域であり、現在２種の異なる診断検査（Ｔ−ＳＰＯＴ及びクォンティフェロン−ゴールド（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ−ｇｏｌｄ））に使用されている）を、比較のための基準として使用した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、すべての実験において陽性対照として使用した（データ非掲載）。
【００６８】
Ｔ細胞応答を、健康な対照及び活動性ＴＢの患者の双方において、ＩＦＮ−γスポット形成細胞数を数え上げることによって測定した。
【００６９】
ミコール酸、ＰＰＤ及びヒト型結核菌全脂質溶解物に対する応答を、ＰＩ応答に対して正規化した。数は、５０００００個のＰＢＬ（末梢血リンパ球）当たりに観察されたスポット数を表す。カットオフポイントの６は、ＴＢ患者と健康な対照に関して、最もよいデータ分割点を提供する値を考慮して選択した。
【００７０】
このデータを、活動性ＴＢ患者は、健康な対照より高い応答を有するだろうという仮説のもとにＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ分析に供した。
【００７１】
図１は、健康な対照及び活動性ＴＢ患者の双方において観察されたＰＰＤ応答を示す。Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた場合、ＰＰＤの誘発に対する応答において、２つの群の間に統計的に有意な差異は観察されなかった、ｐ＝０．４５６３。
【００７２】
しかし、図２は、ミコール酸特異的応答が、健康な、ＢＣＧワクチン接種済みの対照と比較して、活動性ＴＢ患者において統計的に有意に高いことを示している（ｐ＝０．０００４）。カットオフ値の６スポットを用いて、それを超える応答を陽性とみなし、８０％（３０例のＴＢ患者のうち２４例が陽性）の高い診断感受性及び１００％（１２例のＢＣＧワクチン接種済みの健康な対照のうち１２例が陰性）の高い診断特異性を得た。
【００７３】
健康な対照及び活動性ＴＢ患者の双方における、ＴＢ全脂質溶解物に対するＴ細胞応答をさらに測定し、結果を図３に示す。活動性ＴＢ患者は、健康な対照より高い応答を有するだろうという仮説のもとにＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を適合させた場合、ｐ＝０．０００７が得られる。
【００７４】
以前の研究（Ｕｌｒｉｃｈら、２００３）により、ヒト型結核菌全脂質溶解物を標的抗原として使用した場合、潜伏性ＴＢ感染（ＰＰＤ＋）と推測されるヒトと、未感染であると推測される（ＰＰＤ−）健康な対照との間で、Ｔ細胞応答において、統計的に有意な差異が示された。本発明者らの結果は、全脂質溶解物に対するＩＦＮ−γＴ細胞応答において、健康な未感染個体と活動性ＴＢ患者との間に、同様の差異が存在することを示唆している。しかし、ヒト型結核菌全脂質溶解物に対する定量的応答は、特異性が低く、５例の未感染対照が陽性に判定されている。
【００７５】
したがって、ミコール酸は、ＴＢ診断検査に使用する、より有利な抗原である。
【００７６】
抗ＣＤ１ｂ抗体を使用して、ミコール酸特異的応答が、ＣＤ１ｂ拘束性であることを究明した。図４を参照されたい。
【００７７】
Ｍ．ｔｂ脂質、ミコール酸、ＰＰＤ、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０に対する応答は、治療期間に続いて起こった。図６及び７は、それぞれＭ．ｔｂ脂質及びミコール酸に対する応答が、治療期間中に減少しており、診断と６カ月の治療との間にそれぞれｐ＝０．０３及びｐ＝０．０４の統計的差異を与えたことを示しているが、それに対してＰＰＤ特異的応答は、図５に示したように安定して維持されている。ミコール酸の場合、応答は、６カ月の時点で大部分の患者において検出不可のレベルまで達しており、診断後１２カ月でもそのままである様に思われる。
【００７８】
治療期間中の応答の大きさにおけるこの減少は、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０についても観察することができ、それぞれ図８及び９を参照されたい。しかし、大部分の患者は、治療６カ月後にこれら２種のタンパク質抗原のどちらかに陽性応答を未だ有する傾向があり、これらの応答は、診断１２カ月後まで検出可能なままであると思われる。診断６カ月後のミコール酸、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答を直接比較した場合、大部分の患者はミコール酸に対して応答しないが、一方、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答は、検出可能に維持される傾向があり、図１０を参照されたい。したがって、ミコール酸特異的応答は、活動性の疾患の診断において有用であり得る。
【００７９】
図１１を参照すると、以下の個々のＴＢ患者が治療期間を終えた時に、４例の患者のうち３例（Ｂ１６、Ｂ４９及びＢ５５）が、治療６カ月後にはもはやミコール酸に対して応答しないが、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ１０のどちらかに対して検出可能な応答を未だ有していることが見られる。患者Ｂ１６の場合、ミコール酸特異的応答は、診断１２カ月後まで検出不可のままであるが、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答は検出可能に維持されている。患者Ｂ５２において、ミコール酸特異的応答は、治療６カ月後に未だ観察可能であるが、診断時のミコール酸特異的応答の大きさが、他のＴＢ患者と比較した場合、非常に高かった。したがって、この応答は消失するまでに長い時間がかかると思われ、１２カ月の時点では検出不可のレベルに達することを示唆している。これらの結果から、ミコール酸特異的応答の存在が、活動性疾患の有用なマーカーとなり得ることがさらに示唆される。
【００８０】
診断時のミコール酸特異的応答と、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０応答とを直接比較した場合、１つの抗体に対する強い応答は、他の２つのどちらかに対する強い応答と相関しないことが観察され、図１２を参照されたい。これは、３種すべての抗原を組み合わせると、現在の診断検査の感受性を改善することができることを示唆するものである。
【００８１】
本研究に使用した患者のコホートにおいて、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ１０特異的応答が、ミコール酸特異的応答よりも優勢であることが見出され、４例の患者はＥＳＡＴ−６に対して応答したが、ミコール酸に対しては応答せず、３例の患者は、ＣＦＰ１０に対して応答したが、ミコール酸に対しては応答しなかった。１例の患者は、さらにミコール酸に応答したが、ＣＦＰ１０特異的応答が陰性であることが見出されており、表２を参照されたい。
【００８２】
【表２】
【００８３】
誤解を避けるために、すべての引用文献が、本明細書にその全体が組み込まれていることが理解されるであろう。
【００８４】
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Ｕｌｒｉｃｈｓ， Ｔ． Ｍｏｏｄｙ， Ｄ． Ｂ． Ｇｒａｎｔ， Ｅ． Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｓ． Ｈ． Ｐｏｒｃｅｌｌｉ， Ｓ． Ａ． Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＣＤ１−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ［２００３］ Ｖｏｌｕｍｅ ７１， Ｉｓｓｕｅ ６， ｐａｇｅ ３０７６−８７， Ｊｕｎ．
Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． ＷＨＯ Ｒｅｐｏｒｔ ２００６． Ｇｌｏｂａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌ．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてマイコバクテリア感染を評価する方法であって、
ｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、ミコール酸又はミコール酸類似体に曝露するステップと、
ｉｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、対象から単離した、少なくとも１つのＴ細胞を含む試料と共にインキュベートするステップと、
ｉｉｉ．Ｔ細胞応答及び／又はＴ細胞試料中に存在するミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、少なくとも１つの樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの樹状細胞が、対象から単離された少なくとも１つの単球を、ｅｘ ｖｉｖｏで培養することによって産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、人工的に合成されたＣＤ１分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ１分子が、基質上に固定化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、ＣＤ１を発現する細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞が、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞が、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞が、疾患部位又は疾患が疑われる部位から単離されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞応答を、前記Ｔ細胞と、以前にミコール酸又はミコール酸類似体に曝露されていない樹状細胞とを接触させた時に見られる応答と比較する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
測定されたＴ細胞応答が、１つ若しくは複数のサイトカイン及び／若しくはケモカインの分泌、又はＴ細胞の活性化若しくは増殖の１つ若しくは複数のマーカーの発現である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
応答が、ＩＦＮγの産生である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
応答の増大がマイコバクテリア感染を示す、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞試料中のミコール酸特異的Ｔ細胞の数が、ＣＤ１四量体／五量体染色によってカウントされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ミコール酸拘束性Ｔ細胞の存在が、マイコバクテリア感染を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ミコール酸がマイコバクテリアから単離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マイコバクテリア感染が、ヒト型結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＴＢ）感染である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、活動性及び潜伏性のＴＢ感染を識別できる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マイコバクテリアが、結核菌群である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
対象が哺乳動物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、治療的介入を受けている、又は以前に受けたことがある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
感染の状態と、前記個体の前記感染の以前に測定された状態とを比較し、それによって、前記個体における前記治療的介入の有効性をモニターするステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体及びＴ細胞応答検出手段を含む、対象においてマイコバクテリア感染を評価するための製品、組み合わせ又はキット。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞応答検出手段が少なくとも１つの抗体である、請求項２３に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項２５】
少なくとも１つの抗体が、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞の活性化又は増殖のマーカーに特異的である、請求項２４に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項１】
対象においてマイコバクテリア感染を評価する方法であって、
ｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、ミコール酸又はミコール酸類似体に曝露するステップと、
ｉｉ．少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体を、対象から単離した、少なくとも１つのＴ細胞を含む試料と共にインキュベートするステップと、
ｉｉｉ．Ｔ細胞応答及び／又はＴ細胞試料中に存在するミコール酸特異的Ｔ細胞の数を測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、少なくとも１つの樹状細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの樹状細胞が、対象から単離された少なくとも１つの単球を、ｅｘ ｖｉｖｏで培養することによって産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、人工的に合成されたＣＤ１分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ１分子が、基質上に固定化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体が、ＣＤ１を発現する細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞が、ＣＤ１拘束性Ｔ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞が、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞が、疾患部位又は疾患が疑われる部位から単離されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞応答を、前記Ｔ細胞と、以前にミコール酸又はミコール酸類似体に曝露されていない樹状細胞とを接触させた時に見られる応答と比較する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
測定されたＴ細胞応答が、１つ若しくは複数のサイトカイン及び／若しくはケモカインの分泌、又はＴ細胞の活性化若しくは増殖の１つ若しくは複数のマーカーの発現である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
応答が、ＩＦＮγの産生である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
応答の増大がマイコバクテリア感染を示す、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞試料中のミコール酸特異的Ｔ細胞の数が、ＣＤ１四量体／五量体染色によってカウントされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ミコール酸拘束性Ｔ細胞の存在が、マイコバクテリア感染を示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ミコール酸がマイコバクテリアから単離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マイコバクテリア感染が、ヒト型結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ＴＢ）感染である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、活動性及び潜伏性のＴＢ感染を識別できる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マイコバクテリアが、結核菌群である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
対象が哺乳動物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が、治療的介入を受けている、又は以前に受けたことがある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
感染の状態と、前記個体の前記感染の以前に測定された状態とを比較し、それによって、前記個体における前記治療的介入の有効性をモニターするステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのＣＤ１分子又は類似体及びＴ細胞応答検出手段を含む、対象においてマイコバクテリア感染を評価するための製品、組み合わせ又はキット。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞応答検出手段が少なくとも１つの抗体である、請求項２３に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【請求項２５】
少なくとも１つの抗体が、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞の活性化又は増殖のマーカーに特異的である、請求項２４に記載の製品、組み合わせ又はキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５２５８３１（Ｐ２０１０−５２５８３１Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６９９６（Ｐ２０１０−５０６９９６）
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１５９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５７７１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０９０２０）ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１５９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５７７１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０９０２０）ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム (1)
【Ｆターム（参考）】
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