マクロライドおよびその不純物を検出、同定および定量化するための方法ならびにシステム
本発明は、マクロライドを検出するため、ならびにマクロライドを含むサンプル中の不純物を検出、同定および定量するための逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）方法およびシステムに関する。本発明は、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中のマクロライドを検出する方法を提供し、該方法は、以下：ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；ならびにｃ）該カラムからの流出液を電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングして、該マクロライドに対応するピーク電流または質量ピークをそれぞれ検出する工程；を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００４年５月６日に出願された米国特許出願第６０／５６８，６３７号の利益を主張し、その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出または質量分析検出を含む、例えば、エリスロマイシルアミンおよび関連化合物などのマクロライドを検出、同定および定量するための分析方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
マクロライドは、種々の細菌感染を処置するために使用される抗体のファミリーを表す。マクロライドは、１４〜１６原子の大環状ラクトン環構造および通常少なくとも一つのペンダント糖部分、アミノ糖部分または関連する部分により化学的に特徴付けられる。マクロライドは、転移ＲＮＡの解離を引き起こす細菌の５０Ｓリボソームおよびペプチド結合の末端の二つの部位での結合の結果として細菌のタンパク質合成を阻害すると考えられている。最初のマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンは、１９５２年に発見され、その後すぐに臨床的に使用された。エリスロマイシンおよびその初期の誘導体（例えば、種々の塩およびエステル）は、代表的にほとんどのグラム陰性細菌（特に連鎖球菌）に対する静菌活性または殺菌活性、ならびに呼吸器系の病原体に対する良好な活性によって特徴付けられる。マクロライドは、安全で、多くの呼吸器系の感染症に対して有効であることが証明されており、ペニシリンアレルギーを有する患者に有用である。
【０００４】
マクロライドは代表的に、光度検出方法の限界に近い非常に低い波長範囲（例えば、＜２２０ｎｍ）に紫外線（ＵＶ）の吸光度を有する。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ−ＮＦ）のエリスロマイシン（以下の構造を参照のこと）のための簡潔なアッセイ方法は、２１５ｎｍでのＵＶ検出を用いるＬ２１固定相（逆相、柔軟性のない、球状のスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、５〜１０μｍの粒径）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣを包含する（例えば、非特許文献１を参照のこと）。実際、多くの還元されたエリスロマイシン誘導体および関連する分子（例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン（エリアミンすなわちＰＡ２７９４；以下の構造：
【０００５】
【化４】
を参照のこと））は、２１５ｎｍよりかなり低いＵＶ最大吸収帯（ＵＶｍａｘ）を有する。例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＵＶｍａｘは、約１９１ｎｍに存在し、これは標準的な光度検出方法の短い方の波長の限界に近い。従って、代替的な検出方法（例えば、電気化学的検出質量分析検出方法が興味深いことが見出されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと）。しかし、これらの代替的な方法は、主に生物学的マトリックス（例えば、血漿または他の生物学的物質）におけるマクロライドの検出のために設計されていて、（例えば、多くが類似する物理的特性を有する関連するマクロライドである少量の不純物からの活性な薬学的成分（ＡＰＩ）として使用される）実質的に純粋なマクロライドの分離には適していない。
【非特許文献１】「Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ」、２０００年１月１日、ｐ６６３−６６５
【非特許文献２】Ｗｈｉｔａｋｅｒら、「Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．」、１９８８年、第１１巻、第１４号、ｐ．３０１１−２０
【非特許文献３】Ｐａｐｐａ−Ｌｏｕｉｓｉら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．」、２００１年、第７５５巻、第１−２号、ｐ．５７−６４
【非特許文献４】Ｋｅｅｓら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ」、１９９８年、第８１２巻、（１＋２）、ｐ．２８７−２９３
【非特許文献５】Ｈｅｄｅｎｍｏら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、１９９５年、第６９２巻、（１＋２）、ｐ．１６１−６
【非特許文献６】Ｄａｓｚｋｏｗｓｋｉら、「Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９９年、第２２巻、第５号、ｐ．６４１−６５７
【非特許文献７】Ｄｕｂｏｉｓら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．」、２００１年、第７５３巻、第２号、ｐ．１８９−２０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
マクロライドサンプル中の不純物の検出、同定および定量は、品質管理に必要であるので、特にマクロライドがＡＰＩである場合、ＨＰＬＣベースのアッセイ方法を用いてマクロライド（例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン）およびその不純物を検出、同定および定量するために適切に設計されているアッセイに現在は必要である。本明細書中に記載される方法およびシステムは、これらの必要性および他の必要性を満たすのを補助する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中のマクロライドを検出する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；ならびに
ｃ）このカラムからの流出液を電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングして、このマクロライドに対応するピーク電流または質量ピークをそれぞれ検出する工程；
を包含する。
【０００８】
本発明は、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプルの純度を決定する方法をさらに提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）このカラムからの流出液を電気化学的検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）このマクロライドに対応するピーク電流；および
ｉｉ）必要に応じて、この試験サンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流；
を検出する工程；ならびに
ｄ）この試験サンプル中の不純物含有量を計算するために、この検出器によって検出された一つ以上のピーク電流の特徴を測定する工程；
を包含する。
【０００９】
本発明はさらに、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物を同定する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）このカラムからの溶出液を質量分析検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）このマクロライドに対応する質量ピーク；および
ｉｉ）この試験サンプル中のこの不純物に対応するさらなる質量ピーク；
を検出する工程；ならびに
ｄ）この不純物に対応するさらなる質量ピークの質量を決定する工程；
を包含する。
【００１０】
本発明はさらに、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物の量を決定する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）ＨＰＬＣ−ＭＳアッセイまたはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイによって不純物を同定する工程；
ｂ）以下：
ｉ）既知の量のこの不純物および既知の量のこのマクロライドを、イオン対試薬を含有する移動相で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流す工程であって、このＲＰ−ＨＰＬＣカラムが約１８０ｎｍと約２２０ｎｍとの間の検出波長を有する紫外光（ＵＶ）検出器を備えている、工程；
ｉｉ）カラム流出液を、このＵＶ検出器を用いてモニタリングしてこの検出波長にて一番目の吸収ピークを検出する工程であって、この一番目の吸収ピークが不純物に対応する、工程；
ｉｉｉ）カラム流出液をこのＵＶ検出器でモニタリングしてこの検出波長にて二番目の吸収ピークを検出する工程であって、この二番目の吸収ピークがマクロライドに対応する、工程
ｉｖ）この不純物の応答因子を、一番目の吸収ピークおよび二番目の吸収ピークのピーク面積を使用して計算する工程；
を包含する方法によってこの不純物に対する応答因子を決定する工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）と同じアッセイ条件下で該試験サンプルを流して不純物に対応する三番目の吸収ピークを検出する工程；および
ｉｉ）この応答因子を使用してこの試験サンプル中の不純物の量を計算する工程；
を包含する方法によって試験サンプル中の不純物の量を決定する工程；
を包含する。
【００１１】
本発明はさらに、エリスロマイシンの試験サンプル中の不純物を検出するためのシステムを提供し、このシステムは、以下：
ａ）以下
ｉ）Ｃ１８カラム；
ｉｉ）溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物を含有する勾配移動相であって、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、勾配移動相；
を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム；
ｂ）ガード電極、スクリーニング電極および作用電極を備える電気化学的検出器、または質量分析検出器
を備える。
【００１２】
本明細書中の方法およびシステムにより検出され得るマクロライドの例としては、例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシン、エリスロマイシンヒドラゾン、エリスロマイシン、９−イミノエリスロマイシン、エリスロマイシンオキシム、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤ、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１３】
本発明はさらに、以下の詳細な説明に提供する実施形態を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本発明は検出方法として電気化学的（ＥＣＤ）方法および質量分析（ＭＳ）方法を用いてマクロライドおよびその不純物を検出、同定および定量化するための、とりわけＨＰＬＣベースの方法およびシステムを提供する。ＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳアッセイは、マクロライドサンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流す工程を包含する。カラムからの流出液は、電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングされ、サンプル中に存在するマクロライドおよび／または任意の潜在的な不純物に対応するピーク電流または質量ピークがそれぞれ検出される。いくつかの実施形態において、質量分析計の使用は、生じたクロマトグラムにおける検出された化合物の同定を容易にする。マクロライドサンプル中で同定された不純物は、光度検出を備えるＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＵＶ）アッセイを使用してさらに定量され得る。
【００１５】
本発明に従ったマクロライドとしては、任意の公知の抗生物質または他のマクロライドおよびそれらの誘導体が挙げられる。代表的なマクロライドは、１２員、１４員または１６員の大環状ラクトンコア構造により特徴付けられる。マクロライドは、当該分野で広く公知であり、例えば、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｍｕｒａ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｌａｎｄｏ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８４に十分に記載され、この文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。いくつかの実施形態において、マクロライドは、比較的低い紫外光−可視光（ＵＶ−ＶＩＳ）吸収プロフィールを有し、例えば、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍまたは約１８０ｎｍ〜約１９５ｎｍの波長で、ＵＶ−ＶＩＳ範囲（約１００ｎｍ〜約９００ｎｍ）の最大吸収を示す。さらなる実施形態において、このマクロライドは、約１８８ｎｍ、約１８９ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９１ｎｍ、約１９２ｎｍ、約１９３ｎｍ、約１９４ｎｍ、約１９５ｎｍ、約１９６ｎｍ、約１９７ｎｍ、約１９８ｎｍ、約１９９ｎｍ、約２００ｎｍ、約２０１ｎｍ、約２０２ｎｍ、約２０３ｎｍ、約２０４ｎｍまたは約２０５ｎｍの波長で、ＵＶ−ＶＩＳ範囲の最大吸収を有する。
【００１６】
本明細書中の方法およびシステムによって検出され得るマクロライドの例としては、例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシン、エリスロマイシンヒドラゾン、エリスロマイシン、９−イミノエリスロマイシン、エリスロマイシンオキシム、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤ、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法およびシステムによる分析に適した試験サンプルは、少なくとも一種のマクロライドを含む。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、試験サンプル中で重量で主要な成分を構成するマクロライドを含む。試験サンプルは、不純物と呼ばれ得る他の少量の成分を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、化学的合成手順によって調製された、多くの場合少量の不純物を含む実質的に純粋なマクロライドのバッチである。本明細書中で使用される場合、用語「不純物」とは、研究の目的であるマクロライド以外の化合物をいう。いくつかの実施形態において、一種以上の不純物は、試験サンプルの約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満または約１重量％未満を構成し得る。
【００１９】
不純物は、多くの場合、別のマクロライド（例えば、試験サンプルの大部分を構成するマクロライドの誘導体）であり得る。不純物は、主要なマクロライド成分の分解産物または主要なマクロライド成分の化学合成由来のキャリーオーバーであり得る。いくつかの実施形態において、不純物としては、図１および図２に示す一種以上の化合物が挙げられ、例えば、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤまたは式Ｉ，ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶもしくはＶを有する化合物：
【００２０】
【化５】
である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、不純物は、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩの化合物：
【００２２】
【化６】
である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、ＨＰＬＣアッセイに関連して句「試験サンプルを流す」などは、１）試験サンプルのＨＰＬＣカラムへの適用後、２）移動相を用いた試験サンプルの溶出をいうことを意味し、生じた溶出液は、試験サンプル中のマクロライドおよび／または不純物を検出し得る検出器によりモニタリングされる。
【００２４】
（ＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳアッセイ）
ＭＳ検出方法に適合するアッセイのための移動相は、代表的に揮発性成分を含有する。例えば、本発明に従ったＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳのための移動相は、揮発性の緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有し得る。
【００２５】
揮発性の適切な緩衝液としては、移動相を所望のｐＨで維持し、質量分析計によるマクロライドの検出を妨害しない任意の緩衝物質が挙げられる。いくつかの実施形態において、揮発性緩衝液は、例えば、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を含む。移動相中の揮発性緩衝塩の濃度は、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約８０ｍＭまたは約６５ｍＭ〜約７５ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、揮発性緩衝塩は、移動相中に約６７ｍＭの濃度で存在する。さらなる実施形態において、移動相は、約６〜約８のｐＨを有する。なおさらなる実施形態において、移動相は、約７のｐＨを有する。
【００２６】
移動相の適切な有機成分としては、ピークの形状および保持時間を制御するための有機溶媒（例えば、アセトニトリル）および有機修飾物質（例えば、アルコール）が挙げられる。適切なアルコールの例としては、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖および分枝鎖のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）が挙げられる。いくつかの実施形態において、このアルコールは、メタノールである。いくつかの実施形態において、移動相中のアセトニトリルのアルコールに対する体積比は、約１：１〜約２：１であり得る。いくつかの実施形態において、アセトニトリルのアルコールに対する体積比は、約３：２である。
【００２７】
移動相は、勾配溶出液としてＨＰＬＣカラムに流され得る。従って、移動相は、二種以上の異なる溶出溶液の混合物からなり得、その比率は、溶出の時間経過によって変動する。いくつかの実施形態において、移動相は、溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物からなり、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動する。いくつかの実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中に約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００２８】
さらなる実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６５ｍＭ〜約７０ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５５体積％〜約６０体積％のアセトニトリルと約４０体積％〜約４５体積％のメタノールとの混合物中に、約６５ｍＭ〜約７０ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００２９】
なおさらなる実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６７ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５８体積％のアセトニトリルと約４２体積％のメタノールとの混合物中に約６７ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、移動相は、溶出の任意の時点で、約４０体積％〜約７５体積％の溶出液Ａと約２５体積％〜約６０体積％の溶出液Ｂとの混合物を含有し得る。いくつかの実施形態において、溶出液Ｂの比率は、溶出の間の時間、徐々に増加する。
【００３１】
固定相は、移動相と組合せて、マクロライドの検出およびマクロライドの不純物からの分離を可能にする任意の逆相固体支持体媒体からなり得る。いくつかの実施形態において、固定相は、Ｃ８〜Ｃ１８のマトリックスを含む。さらなる実施形態において、固定相は、Ｃ１８マトリックスである。
【００３２】
上記試験サンプルは、カラムへの導入の前に、サンプル希釈溶液で希釈されて、希釈サンプルを形成し得る。希釈サンプル中のマクロライドの適切な濃度は、任意の適切な量（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ）であり得る。いくつかの実施形態において、この濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。サンプル希釈溶液は、移動相と同じか類似したものであり得る。いくつかの実施形態において、サンプル希釈溶液は、水、アセトニトリルおよびアルコール（例えば、メタノール）の混合物である。さらなる実施形態において、このサンプル希釈溶液は、約５０％〜約９０％の水、約５０％〜約７０％のアセトニトリルと約３０％〜約５０％のメタノールとの混合物を約１０％〜約５０％含有する。なおさらなる実施形態において、このサンプル希釈溶液は、約７０％の水、および約６０％のアセトニトリルと約４０％のメタノールとの混合物を約３０％含有する。
【００３３】
電気化学的検出器（ＥＣＤ）は、マクロライドの酸化または還元を誘導および検出し得る任意の適切な検出器であり得る。適切なＥＣＤの一つの例としては、３つの電極：ガード電極またはセル、スクリーニング電極および作用電極を用いるＥＣＤが挙げられる。作用電極は、例えば、白金電極またはガラス状の炭素電極であり得る。電極のキャリブレーションは、当業者に公知の任意の標準的な手段によって行なわれ得る。いくつかの実施形態において、ＥＣＤは、マクロライドの検出および付随的な不純物のこの不純物の酸化による検出のために設定される。例えば、作用電極は、サイクリックボルタンメトリーのような種々の公知の方法のいずれかによって決定され得るように、マクロライドを酸化するのに適した電位に設定され得る。作用電極に適した電位としては、約７００ｍＶより高い電位、約７５０ｍＶより高い電位および約８００ｍＶより高い電位が挙げられる。いくつかの実施形態において、作用電極は、約８００ｍＶ〜約９００ｍＶの電位を有する。さらなる実施形態において、作用電極は、約８５０ｍＶの電位を有する。ガード電極および照合電極のための電位は、当業者により容易に決定され得る。例えば、ガード電極は、約１０００ｍＶの電位を有し得、照合電極は、作用電極の電位より低い電位（例えば、約−１００ｍＶ〜約１００ｍＶ）を有し得る。いくつかの実施形態において、照合電極は、約０ｍＶの電位を有する。
【００３４】
質量分析（ＭＳ）検出器としては、マクロライドの質量／電荷の比を検出および決定し得る任意のＭＳ検出器が挙げられ得る。適切なＭＳ検出器は、例えば、多くの市販のＬＣ−ＭＳ機器と組合せて広く利用可能であり、マクロライドのような有機化合物の検出におけるその使用は、当該分野では、日常的である。いくつかの実施形態において、マクロライドおよび付随する任意の不純物の検出は、ＭＳ検出器をポジティブモードで用いて実施され得る。イオン化は、エレクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）または他の手段を含む任意の適切な方法によって行なわれ得る。適切なＭＳパラメーターとしては、約１５０℃〜約２００℃（例えば、約１８０℃）のキャピラリー温度および約３００℃〜約４００℃（例えば、約３５０℃）に設定した蒸発器が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法およびシステムに従ったマクロライドの溶出は、室温および大気圧を含む種々の温度および圧力下で実施され得る。いくつかの実施形態において、溶出は、約１０℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃または約２０℃の一定温度で行われる。温度は、カラムにこのような適用のために設計された冷却装置を備えることによって室温以下に維持され得る。逆に、温度は、カラムにこのような適用のために設計された加熱装置を備えることによって室温より高く維持され得る。溶出は、空気下、または不活性な雰囲気下でも行なわれ得る。
【００３６】
マクロライドの検出は、マクロライドに対応すると考えられるピークを含む、本発明のアッセイに従って得られたクロマトグラムを、マクロライドの既知のサンプルに対する参照ピークを示す、同じ条件下で流したクロマトグラムと比較することにより確認され得る。例えば、参照ピークの約０．２分以内に出現するサンプルピークは、確認されたとみなされ得る。サンプル中のマクロライドの量はまた、マクロライドに対応するピークの面積を既知の量のマクロライドを含む参照サンプル（標準）について得られたクロマトグラムのピークの面積と比較することにより定量され得る。
【００３７】
本発明は、試験サンプルの純度を決定する方法をさらに提供する。この方法は、ａ）サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流して、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程を包含する。流出液は、ｉ）マクロライドに対応するピーク電流；およびｉｉ）必要に応じてサンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流（例えば、マクロライドに起因するピーク面積の約０．０５％以上のピーク面積を有するピーク電流）を検出するために、電気化学的検出器によりモニタリングされる。次いで、ピーク電流の特徴は、不純物の含有量を計算するために評価される（例えば、不純物の含有量（純度）を評価および計算するために、ピーク面積またはピークの高さの比のパーセントが使用され得る）。いくつかの実施形態において、ピーク電流の面積は、マクロライドとともにそれぞれ検出された不純物について決定され、そのぞれぞれの全ピーク面積のパーセントが計算される。
【００３８】
サンプル中の不純物は、例えば、本発明のＨＰＬＣ−ＭＳ法により得られたクロマトグラムの不純物に対応するピークの面積を決定することにより同定され得る。
【００３９】
（ＨＰＬＣ−ＵＶによるマクロライド不純物の定量）
上記のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイおよび／またはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイにより試験サンプル中で同定された不純物は、光度検出を備えるＨＰＬＣアッセイ（ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイ）を用いて定量され得る。
【００４０】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイのための適切な移動相組成物は、所望のマクロライドを効率的に溶出する液体成分の任意の組合せであり得、潜在的な不純物からのマクロライドの分離を可能にし、検出波長でのマクロライドの光度検出を可能にする。いくつかの実施形態において、移動相は、約２０５ｎｍより上でごくわずかな吸光度（例えば、１ｃｍのパス長にわたって分光光度計により測定される）を有する。「ごくわずかな」とは、約０．０２以下の吸光度を意味する。さらなる実施形態において、移動相は、検出波長において、約０．５未満、約０．３未満または約０．１未満の吸光度（例えば、１ｃｍのパス長にわたって分光光度計により測定される）を有する。
【００４１】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相は、水、有機溶媒またはこれらの混合物を含有し得る。水に混和性であり、検出波長では、マクロライドの検出を妨害しない任意の適切な有機溶媒が使用され得る。いくつかの実施形態において、この有機溶媒は、アセトニトリルである。この移動相は、０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の水および０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含有し得る。いくつかの実施形態において、この移動相は、約５％（ｖ／ｖ）〜約７５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含有する。
【００４２】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相は、さらに溶媒を所望のｐＨに安定させるために緩衝液を含有し得る。検出波長では、マクロライドの検出を妨害しない任意の緩衝液が使用され得る。いくつかの実施形態において、この緩衝液は、リン酸緩衝液または硫酸緩衝液である。さらなる実施形態において、緩衝液は、硫酸緩衝液である。緩衝液濃度は、例えば、約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。マクロライドが、本発明の方法およびシステムにより検出され得るように十分に安定である任意のｐＨが適している。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約１〜約４である。さらなる実施形態において、ｐＨは約３である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、移動相は、イオン対試薬（例えば、逆相カラム上でマクロライドの保持を促進する塩）を含有する。移動相溶液中で適度に安定であり、マクロライドの荷電した形態（例えば、プロトン化したか、または脱プロトン化した形態）とイオン対を形成し得、そしてマクロライドの溶出または検出を妨害しない任意のイオン対試薬が、適している。種々の適切なイオン対試薬が市販されており、それを使用するＨＰＬＣ技術は、当該分野で周知である。イオン対試薬のいくつかの例としては、（Ｃ４〜Ｃ１２アルキル）スルホネート塩などのアルキルスルホネート塩（１−オクタンスルホネートナトリウムが挙げられる）が挙げられる。移動相中のイオン対試薬の濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭであり得る。いくつかのさらなる実施形態において、イオン対濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。いくつかの実施形態において、イオン対濃度は、約１２ｍＭ〜約１５ｍＭである。
【００４４】
移動相は、均一濃度溶出液または勾配溶出液としてＨＰＬＣカラムを通って流れ得る。勾配移動相が適用される実施形態において、移動相は、二種以上の異なる溶出溶液の混合物からなり得、その比率は、溶出の時間の経過によって変動する。例えば、移動相は、溶出の間に、種々の量の水、有機溶媒、緩衝液およびイオン対試薬を含有し得る。成分の量における変動は、勾配移動相が溶出の過程の間の検出波長における実質的に一定の吸光度を維持するように調整され得る。成分の量における変動はまた、ピークの形状、溶出時間、不純物からのマクロライドの分離および他のパラメーターを最適化するために、調節され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相組成物は、それぞれ異なる量の水、有機溶媒、緩衝液およびイオン対試薬を含有する二つの溶出溶液の一方または混合物で溶出することにより変動し得る。いくつかの実施形態において、一番目の溶出溶液は、約１０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約７０％（ｖ／ｖ）〜約９０％（ｖ／ｖ）の水、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのイオン対試薬および約１０ｍＭ〜約１５ｍＭの緩衝液を含有し、二番目の溶出溶液は、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の水、約８ｍＭ〜約１５ｍＭのイオン対試薬および約８ｍＭ〜約１２ｍＭの緩衝液を含有する。さらなる実施形態において、一番目の溶出溶液は、約２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約８０％（ｖ／ｖ）の水、約１５ｍＭのイオン対試薬および約１３ｍＭの緩衝液を含有し、二番目の溶出溶液は、約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約５０％（ｖ／ｖ）の水、約１２ｍＭのイオン対試薬および約１０．５ｍＭの緩衝液を含有する。溶出の間の任意の時点で、移動相は、二つの溶出溶液の一方の１００％からなり得るか、またはこの二つの混合物からなり得る。
【００４６】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの固定相は、移動相と組合せて、マクロライドの検出およびマクロライドの潜在的な不純物からの分離を可能にする任意の逆相固体支持体媒体からなり得る。いくつかの実施形態において、固定相は、Ｃ８〜Ｃ１８のマトリックスを含む。さらなる実施形態において、固定相は、Ｃ１８マトリックスである。
【００４７】
サンプルは、カラムへの導入のために希釈されて、希釈サンプルを形成し得る。希釈サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのマクロライド濃度を有し得る。サンプル希釈液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（例えば、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭまたは約５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）により緩衝された水からなり得、約６〜約８、または約７のｐＨを有し得る。
【００４８】
カラムからの流出液をモニタリングするＵＶ検出器は、液体サンプルが吸収するＵＶ波長または液体サンプルを透過するＵＶ波長を検出し得る任意の分光光度計を備え得る。この検出器は、溶出の間に一定であり得る検出波長に調整され得る。いくつかの実施形態において、流出液は、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍの波長、約１９７ｎｍ〜約２０５ｎｍの波長または約２００ｎｍの波長でモニタリングされる。いくつかの実施形態において、検出波長は、約２００ｎｍである。
【００４９】
上記のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイおよび／またはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイにより同定された各不純物に対するＵＶ応答因子（検出波長で標準化された不純物のマクロライドに対するピーク面積比）は、既知の不純物量を含有する参照サンプルおよび高純度の既知の量のマクロライドを含有する参照サンプルに対して上記ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイを行なうことにより決定され得る。例えば、不純物に対する応答因子は、以下の等式Ａ、ＢおよびＣに従って計算され得る。
【００５０】
応答因子＝（標準化した不純物のピーク面積）／（標準化したマクロライドのピーク面積） （Ａ）
ここで、
標準化した不純物のピーク面積＝（不純物のピーク面積）×（純度％）／（不純物の濃度） （Ｂ）
標準化したマクロライドのピーク面積＝（マクロライドのピーク面積）×（純度％）／（マクロライドの濃度） （Ｃ）。
【００５１】
未知の量の不純物を含有する試験サンプル中の不純物の量は、本明細書中に記載のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイまたはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイを使用して不純物を同定し、その後、同定された不純物の参照サンプルおよびマクロライドの参照サンプルに対して上記ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイを行ない、上記のＨＰＬＣ−ＵＶアッセイに従って試験サンプルをアッセイし、試験サンプル中の不純物の量を計算するために計算された応答因子を使用して同定された不純物に対する応答因子を計算することによって決定され得る。
【００５２】
（システム）
上記の構成要素の集合を含むシステムもまた本発明に包含される。例えば、本発明のシステムは、ａ）以下、ｉ）逆相固体支持体マトリックスを含む固定相；およびｉｉ）上記の移動相を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）；ならびにｂ）電気化学的検出器または質量分析検出器を備え得る。
【００５３】
本発明に従ってＨＰＬＣアッセイを適用し、最適化するためのさらなるパラメーターは、例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ Ｍｅｔｈｏｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第２版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７（その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）のような文献に明らかにされるように、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００５４】
本発明は、特定の実施例により、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示目的で提供され、どのような形ででも本発明を制限することを意図しない。当業者は、本質的に同じ結果を生じるように変化または改変され得る種々の重要ではないパラメーターを容易に認識する。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの電気化学的検出および質量分析検出のためのＨＰＬＣパラメーター）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンサンプルのＨＰＬＣ分析を、以下のパラメーターに従って実施した。パーセントは、体積パーセントである。
【００５６】
（機器）
Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ ＨＰＬＣポンプ
ＥＳＡ Ｍｏｄｅｌ ５２００Ａ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ 電気化学的検出器
ＥＳＡ Ｍｏｄｅｌ ５０１０ 分析用セル
ＡＣＥ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ、３μｍ、ＭＡＣ−ＭＯＤ、Ｐ／Ｎ＃ＡＣＥ−１１１−１５４６）
Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＳＳＱ７０００またはＪＥＯＬ ＬＣ−Ｍａｔｅ 質量分析計システム。
【００５７】
（移動相）
溶出液Ａ：０．２２μｍのフィルターを通して減圧ろ過した水中の０．０６７１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０４）
溶出液Ｂ：５７．６体積％のアセトニトリルと４２．４体積％のメタノール中の０．０６７１Ｍ酢酸アンモニウム（０．２２μｍフィルターを通して減圧濾過）
サンプル希釈液：Ｃ１８ディスクで精製したミリＱ水を７１％と、５７．６％のアセトニトリルと４２．２％のメタノールとの混合物を２９％。
【００５８】
（標準およびサンプルの調製）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン標準溶液および０．８〜０．９ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液を、サンプル希釈液を用いて５０．００ｍＬのメスフラスコに調製した。
【００５９】
（カラムパラメーター）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＥＣＤの注入体積：１０μＬ
ＭＳの注入体積：５０μＬ
適用時間：６０分間
【００６０】
【表１】
。
【００６１】
（電気化学的検出パラメーター）
ガードセル：１０００ｍＶ
電極１：０ｍＶ
電極２：８５０ｍＶ
ノイズフィルター：５秒間
範囲：５０μＡ。
【００６２】
（質量分析計検出パラメーター）
ＡＰＣＩポジティブ様式
キャピラリー温度：１８０℃
蒸発器温度：３５０℃。
【００６３】
（実施例２）
（異なるロットの９−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析）
異なる製造供給元の９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのサンプルを、実施例１に記載されるパラメーターに従って質量分析計もしくは電気化学的検出のどちらかまたはその両方を使用してＨＰＬＣにより分析した。仮の構造の指定を質量に基づいて行い、対応する構造を図１および図２に提供する。文字「ＮＤ」は、「検出されなかった」ことを示す。
【００６４】
（表２ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット３６１８８ＣＡ００および６Ｅ０１０１の対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよびＨＰＬＣ−ＥＣＤのデータ）
【００６５】
【表２】
。
【００６６】
（表３ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット（Ｓ）ＡＥ／ｉｉ３２／５６および３５３５に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよび電気化学的検出器（ＥＣＤ）のデータ）
【００６７】
【表３】
。
【００６８】
（表４ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット６Ｅ０２０１およびＰＤＣ３２５／Ｖｄ０７０２０２に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよび電気化学的検出器（ＥＣＤ）のデータ）
【００６９】
【表４】
。
【００７０】
（表５ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロットＰＤ２０１２／ＷＲＳ／３２８／０１６および１０００６６４７に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータ）
【００７１】
【表５】
。
【００７２】
（実施例３）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのサンプル中の不純物の同定および定量）
以下の手順に従って、６個のマクロライド不純物（表６および上記式ＶＩ〜ＸＩを参照のこと）は、夾雑物であると考えられ、ＡＰＩとして使用するための９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのバッチ中の存在または非存在について確認した。検出された不純物の量もまた定量した。
【００７３】
（表６）
【００７４】
【表６】
上記６個の不純物と考えられるそれぞれの参照サンプルおよび９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを、Ａｌｅｍｂｉｃ，Ｉｎｃ（Ｉｎｄｉａ）から購入し、その構造を、ＦＴ−ＩＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳにより確認した。その手順は、実施例１に記載の手順に従って行なった。約２ｍｇの参照サンプルと約１００ｍｇの乾燥ＫＢｒを瑪瑙の乳鉢中で混合し、微細な粉末に粉砕することによりＦＴ−ＩＲサンプルを調製した。この粉末を１１ｍｍのペレットの型に装填し、減圧下で圧縮した。４ｃｍ−１で１６回スキャニングすることによりＩＲスペクトルを得た。ＩＲスペクトルおよびＭＳのデータは、表６の６個の化合物のそれぞれと一致していた。
【００７５】
上記６個の考えられる化合物のそれぞれに対する応答因子を、以下の手順により決定した。６個の考えられる化合物のそれぞれの参照サンプルを、以下に示すＨＰＬＣ−ＵＶパラメーターに従って光度検出を用いてＨＰＬＣによりアッセイした。
【００７６】
（機器）
製造業者の指示書に従って操作した以下の装置を使用してＨＰＬＣクロマトグラムを得た。同等の性能を有する装置を代用し得る。
【００７７】
減圧脱気装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
インジェクター：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
・針の洗浄用としてアセトニトリルと水との５０：５０（体積）混合物
・１００μＬのインジェクションループ
プレカラム：ＯＤＳカートリッジを備えるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ｇｕａｒｄ（Ｐ／Ｎ ＡＪＯ−４２８７）
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム、Ｃ１８（２）、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｐ／Ｎ ００Ｆ−４２５２−Ｅ０）
・カラムを、カラムのラベルに指示されるとおりに溶出液の流れの向きに設置し、２０±１℃に維持されたＪｏｎｅｓクロマトグラフィーカラム冷却装置／加熱装置内に配置した
・使用していないときには、カラムを７０：３０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル：水中に保存した
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ２４８７二重波長検出器
・波長＝２００ｎｍ
カラム冷却装置：Ｊｏｎｅｓクロマトグラフィーモデル ７９５５
・温度を２０±１℃に設定した
データシステム：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍデータシステム、バージョン６．２．１。
【００７８】
（作用溶液）
（サンプル希釈液）
５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ （Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．４。
【００７９】
（溶出液Ａ）
２０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）
１５ｍＭ １−オクタンスルホネートナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１３ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１。
【００８０】
（溶出液Ｂ）
５０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）
１２ｍＭ １−オクタンスルホネートナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１。
【００８１】
（ＨＰＬＣ分析）
サンプル分析を以下のパラメーターの下で行なった：
流速：１．０ｍＬ／分
注入体積：２０μＬ
適用時間：４０分間
波長：２００ｎｍ
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ。
【００８２】
データシステムを、４０分間の取得時間で１ポイント／秒を得るように設定した。
勾配移動相を、以下の表Ａに従って適用した。
【００８３】
（表Ａ）
【００８４】
【化７】
。
【００８５】
各不純物の参照サンプルに対する標準化したピーク面積および９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの参照サンプルに対する標準化したピーク面積を、式（Ｄ）を用いて計算し、応答因子を、式（Ｅ）を用いて計算した。面積１は、一番目の注入のピーク面積であり、面積２は、二番目の注入のピーク面積である。
【００８６】
標準化したピーク面積＝（面積１＋面積２）／２×（純度％）／濃度（ｍｇ／ｍＬ） （Ｄ）
応答因子＝（不純物の標準化したピーク面積）／（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの標準化したピーク面積） （Ｅ）。
【００８７】
６個の不純物と考えられるそれぞれに対する計算した応答因子を、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンに対する応答因子とともに以下の表７に示す。
【００８８】
（表７）
【００８９】
【表７】
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験サンプル中の６個の不純物それぞれの量を、試験サンプルを上記のＨＰＬＣ−ＵＶカラムに流し、表７の応答因子を使用することにより決定した。結果を以下の表８に示す。９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミンは、検出可能な量では、観察されなかった。
【００９０】
（表８）
【００９１】
【表８】
明瞭性のために別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴はまた単一の実施形態中で組合せて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴はまた、別個にまたは任意の適切なより小さな組合せで提供され得る。
【００９２】
本明細書中に記載される改変に加えて本発明の種々の改変は、前述の記載から当業者には明らかである。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本出願に引用した各参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１および図２は、本発明の方法およびシステムに従って検出、同定および定量化され得る９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの可能性のある不純物を示す。
【図２】図１および図２は、本発明の方法およびシステムに従って検出、同定および定量化され得る９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの可能性のある不純物を示す。
【図３】図３は、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの合成の例を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００４年５月６日に出願された米国特許出願第６０／５６８，６３７号の利益を主張し、その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出または質量分析検出を含む、例えば、エリスロマイシルアミンおよび関連化合物などのマクロライドを検出、同定および定量するための分析方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
マクロライドは、種々の細菌感染を処置するために使用される抗体のファミリーを表す。マクロライドは、１４〜１６原子の大環状ラクトン環構造および通常少なくとも一つのペンダント糖部分、アミノ糖部分または関連する部分により化学的に特徴付けられる。マクロライドは、転移ＲＮＡの解離を引き起こす細菌の５０Ｓリボソームおよびペプチド結合の末端の二つの部位での結合の結果として細菌のタンパク質合成を阻害すると考えられている。最初のマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンは、１９５２年に発見され、その後すぐに臨床的に使用された。エリスロマイシンおよびその初期の誘導体（例えば、種々の塩およびエステル）は、代表的にほとんどのグラム陰性細菌（特に連鎖球菌）に対する静菌活性または殺菌活性、ならびに呼吸器系の病原体に対する良好な活性によって特徴付けられる。マクロライドは、安全で、多くの呼吸器系の感染症に対して有効であることが証明されており、ペニシリンアレルギーを有する患者に有用である。
【０００４】
マクロライドは代表的に、光度検出方法の限界に近い非常に低い波長範囲（例えば、＜２２０ｎｍ）に紫外線（ＵＶ）の吸光度を有する。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ−ＮＦ）のエリスロマイシン（以下の構造を参照のこと）のための簡潔なアッセイ方法は、２１５ｎｍでのＵＶ検出を用いるＬ２１固定相（逆相、柔軟性のない、球状のスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、５〜１０μｍの粒径）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣを包含する（例えば、非特許文献１を参照のこと）。実際、多くの還元されたエリスロマイシン誘導体および関連する分子（例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン（エリアミンすなわちＰＡ２７９４；以下の構造：
【０００５】
【化４】
を参照のこと））は、２１５ｎｍよりかなり低いＵＶ最大吸収帯（ＵＶｍａｘ）を有する。例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのＵＶｍａｘは、約１９１ｎｍに存在し、これは標準的な光度検出方法の短い方の波長の限界に近い。従って、代替的な検出方法（例えば、電気化学的検出質量分析検出方法が興味深いことが見出されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７を参照のこと）。しかし、これらの代替的な方法は、主に生物学的マトリックス（例えば、血漿または他の生物学的物質）におけるマクロライドの検出のために設計されていて、（例えば、多くが類似する物理的特性を有する関連するマクロライドである少量の不純物からの活性な薬学的成分（ＡＰＩ）として使用される）実質的に純粋なマクロライドの分離には適していない。
【非特許文献１】「Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ」、２０００年１月１日、ｐ６６３−６６５
【非特許文献２】Ｗｈｉｔａｋｅｒら、「Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．」、１９８８年、第１１巻、第１４号、ｐ．３０１１−２０
【非特許文献３】Ｐａｐｐａ−Ｌｏｕｉｓｉら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．」、２００１年、第７５５巻、第１−２号、ｐ．５７−６４
【非特許文献４】Ｋｅｅｓら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ａ」、１９９８年、第８１２巻、（１＋２）、ｐ．２８７−２９３
【非特許文献５】Ｈｅｄｅｎｍｏら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、１９９５年、第６９２巻、（１＋２）、ｐ．１６１−６
【非特許文献６】Ｄａｓｚｋｏｗｓｋｉら、「Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９９年、第２２巻、第５号、ｐ．６４１−６５７
【非特許文献７】Ｄｕｂｏｉｓら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．」、２００１年、第７５３巻、第２号、ｐ．１８９−２０２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
マクロライドサンプル中の不純物の検出、同定および定量は、品質管理に必要であるので、特にマクロライドがＡＰＩである場合、ＨＰＬＣベースのアッセイ方法を用いてマクロライド（例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン）およびその不純物を検出、同定および定量するために適切に設計されているアッセイに現在は必要である。本明細書中に記載される方法およびシステムは、これらの必要性および他の必要性を満たすのを補助する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中のマクロライドを検出する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；ならびに
ｃ）このカラムからの流出液を電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングして、このマクロライドに対応するピーク電流または質量ピークをそれぞれ検出する工程；
を包含する。
【０００８】
本発明は、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプルの純度を決定する方法をさらに提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）このカラムからの流出液を電気化学的検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）このマクロライドに対応するピーク電流；および
ｉｉ）必要に応じて、この試験サンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流；
を検出する工程；ならびに
ｄ）この試験サンプル中の不純物含有量を計算するために、この検出器によって検出された一つ以上のピーク電流の特徴を測定する工程；
を包含する。
【０００９】
本発明はさらに、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物を同定する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）この試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）この試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）このカラムからの溶出液を質量分析検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）このマクロライドに対応する質量ピーク；および
ｉｉ）この試験サンプル中のこの不純物に対応するさらなる質量ピーク；
を検出する工程；ならびに
ｄ）この不純物に対応するさらなる質量ピークの質量を決定する工程；
を包含する。
【００１０】
本発明はさらに、試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物の量を決定する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）ＨＰＬＣ−ＭＳアッセイまたはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイによって不純物を同定する工程；
ｂ）以下：
ｉ）既知の量のこの不純物および既知の量のこのマクロライドを、イオン対試薬を含有する移動相で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流す工程であって、このＲＰ−ＨＰＬＣカラムが約１８０ｎｍと約２２０ｎｍとの間の検出波長を有する紫外光（ＵＶ）検出器を備えている、工程；
ｉｉ）カラム流出液を、このＵＶ検出器を用いてモニタリングしてこの検出波長にて一番目の吸収ピークを検出する工程であって、この一番目の吸収ピークが不純物に対応する、工程；
ｉｉｉ）カラム流出液をこのＵＶ検出器でモニタリングしてこの検出波長にて二番目の吸収ピークを検出する工程であって、この二番目の吸収ピークがマクロライドに対応する、工程
ｉｖ）この不純物の応答因子を、一番目の吸収ピークおよび二番目の吸収ピークのピーク面積を使用して計算する工程；
を包含する方法によってこの不純物に対する応答因子を決定する工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）と同じアッセイ条件下で該試験サンプルを流して不純物に対応する三番目の吸収ピークを検出する工程；および
ｉｉ）この応答因子を使用してこの試験サンプル中の不純物の量を計算する工程；
を包含する方法によって試験サンプル中の不純物の量を決定する工程；
を包含する。
【００１１】
本発明はさらに、エリスロマイシンの試験サンプル中の不純物を検出するためのシステムを提供し、このシステムは、以下：
ａ）以下
ｉ）Ｃ１８カラム；
ｉｉ）溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物を含有する勾配移動相であって、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、勾配移動相；
を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム；
ｂ）ガード電極、スクリーニング電極および作用電極を備える電気化学的検出器、または質量分析検出器
を備える。
【００１２】
本明細書中の方法およびシステムにより検出され得るマクロライドの例としては、例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシン、エリスロマイシンヒドラゾン、エリスロマイシン、９−イミノエリスロマイシン、エリスロマイシンオキシム、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤ、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１３】
本発明はさらに、以下の詳細な説明に提供する実施形態を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本発明は検出方法として電気化学的（ＥＣＤ）方法および質量分析（ＭＳ）方法を用いてマクロライドおよびその不純物を検出、同定および定量化するための、とりわけＨＰＬＣベースの方法およびシステムを提供する。ＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳアッセイは、マクロライドサンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流す工程を包含する。カラムからの流出液は、電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングされ、サンプル中に存在するマクロライドおよび／または任意の潜在的な不純物に対応するピーク電流または質量ピークがそれぞれ検出される。いくつかの実施形態において、質量分析計の使用は、生じたクロマトグラムにおける検出された化合物の同定を容易にする。マクロライドサンプル中で同定された不純物は、光度検出を備えるＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＵＶ）アッセイを使用してさらに定量され得る。
【００１５】
本発明に従ったマクロライドとしては、任意の公知の抗生物質または他のマクロライドおよびそれらの誘導体が挙げられる。代表的なマクロライドは、１２員、１４員または１６員の大環状ラクトンコア構造により特徴付けられる。マクロライドは、当該分野で広く公知であり、例えば、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｍｕｒａ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｌａｎｄｏ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８４に十分に記載され、この文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。いくつかの実施形態において、マクロライドは、比較的低い紫外光−可視光（ＵＶ−ＶＩＳ）吸収プロフィールを有し、例えば、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍ、約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍまたは約１８０ｎｍ〜約１９５ｎｍの波長で、ＵＶ−ＶＩＳ範囲（約１００ｎｍ〜約９００ｎｍ）の最大吸収を示す。さらなる実施形態において、このマクロライドは、約１８８ｎｍ、約１８９ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９１ｎｍ、約１９２ｎｍ、約１９３ｎｍ、約１９４ｎｍ、約１９５ｎｍ、約１９６ｎｍ、約１９７ｎｍ、約１９８ｎｍ、約１９９ｎｍ、約２００ｎｍ、約２０１ｎｍ、約２０２ｎｍ、約２０３ｎｍ、約２０４ｎｍまたは約２０５ｎｍの波長で、ＵＶ−ＶＩＳ範囲の最大吸収を有する。
【００１６】
本明細書中の方法およびシステムによって検出され得るマクロライドの例としては、例えば、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシン、エリスロマイシンヒドラゾン、エリスロマイシン、９−イミノエリスロマイシン、エリスロマイシンオキシム、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤ、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記マクロライドは、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法およびシステムによる分析に適した試験サンプルは、少なくとも一種のマクロライドを含む。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、試験サンプル中で重量で主要な成分を構成するマクロライドを含む。試験サンプルは、不純物と呼ばれ得る他の少量の成分を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、化学的合成手順によって調製された、多くの場合少量の不純物を含む実質的に純粋なマクロライドのバッチである。本明細書中で使用される場合、用語「不純物」とは、研究の目的であるマクロライド以外の化合物をいう。いくつかの実施形態において、一種以上の不純物は、試験サンプルの約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満または約１重量％未満を構成し得る。
【００１９】
不純物は、多くの場合、別のマクロライド（例えば、試験サンプルの大部分を構成するマクロライドの誘導体）であり得る。不純物は、主要なマクロライド成分の分解産物または主要なマクロライド成分の化学合成由来のキャリーオーバーであり得る。いくつかの実施形態において、不純物としては、図１および図２に示す一種以上の化合物が挙げられ、例えば、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンＢ、９−イミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ、エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン、エリスロマイシルアミン水酸化物、９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ、エリスロマイシルアミンＢ水酸化物、９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン、エリスロマイシルアミンＣ、エリスロマイシルアミンＤまたは式Ｉ，ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶもしくはＶを有する化合物：
【００２０】
【化５】
である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、不純物は、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩの化合物：
【００２２】
【化６】
である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、ＨＰＬＣアッセイに関連して句「試験サンプルを流す」などは、１）試験サンプルのＨＰＬＣカラムへの適用後、２）移動相を用いた試験サンプルの溶出をいうことを意味し、生じた溶出液は、試験サンプル中のマクロライドおよび／または不純物を検出し得る検出器によりモニタリングされる。
【００２４】
（ＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳアッセイ）
ＭＳ検出方法に適合するアッセイのための移動相は、代表的に揮発性成分を含有する。例えば、本発明に従ったＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイおよびＨＰＬＣ−ＭＳのための移動相は、揮発性の緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有し得る。
【００２５】
揮発性の適切な緩衝液としては、移動相を所望のｐＨで維持し、質量分析計によるマクロライドの検出を妨害しない任意の緩衝物質が挙げられる。いくつかの実施形態において、揮発性緩衝液は、例えば、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を含む。移動相中の揮発性緩衝塩の濃度は、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約８０ｍＭまたは約６５ｍＭ〜約７５ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、揮発性緩衝塩は、移動相中に約６７ｍＭの濃度で存在する。さらなる実施形態において、移動相は、約６〜約８のｐＨを有する。なおさらなる実施形態において、移動相は、約７のｐＨを有する。
【００２６】
移動相の適切な有機成分としては、ピークの形状および保持時間を制御するための有機溶媒（例えば、アセトニトリル）および有機修飾物質（例えば、アルコール）が挙げられる。適切なアルコールの例としては、Ｃ１〜Ｃ８の直鎖および分枝鎖のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）が挙げられる。いくつかの実施形態において、このアルコールは、メタノールである。いくつかの実施形態において、移動相中のアセトニトリルのアルコールに対する体積比は、約１：１〜約２：１であり得る。いくつかの実施形態において、アセトニトリルのアルコールに対する体積比は、約３：２である。
【００２７】
移動相は、勾配溶出液としてＨＰＬＣカラムに流され得る。従って、移動相は、二種以上の異なる溶出溶液の混合物からなり得、その比率は、溶出の時間経過によって変動する。いくつかの実施形態において、移動相は、溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物からなり、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動する。いくつかの実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中に約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００２８】
さらなる実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６５ｍＭ〜約７０ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５５体積％〜約６０体積％のアセトニトリルと約４０体積％〜約４５体積％のメタノールとの混合物中に、約６５ｍＭ〜約７０ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００２９】
なおさらなる実施形態において、溶出液Ａは、水中に約６７ｍＭの酢酸アンモニウムを含有し、溶出液Ｂは、約５８体積％のアセトニトリルと約４２体積％のメタノールとの混合物中に約６７ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する。
【００３０】
なおさらなる実施形態において、移動相は、溶出の任意の時点で、約４０体積％〜約７５体積％の溶出液Ａと約２５体積％〜約６０体積％の溶出液Ｂとの混合物を含有し得る。いくつかの実施形態において、溶出液Ｂの比率は、溶出の間の時間、徐々に増加する。
【００３１】
固定相は、移動相と組合せて、マクロライドの検出およびマクロライドの不純物からの分離を可能にする任意の逆相固体支持体媒体からなり得る。いくつかの実施形態において、固定相は、Ｃ８〜Ｃ１８のマトリックスを含む。さらなる実施形態において、固定相は、Ｃ１８マトリックスである。
【００３２】
上記試験サンプルは、カラムへの導入の前に、サンプル希釈溶液で希釈されて、希釈サンプルを形成し得る。希釈サンプル中のマクロライドの適切な濃度は、任意の適切な量（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ）であり得る。いくつかの実施形態において、この濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。サンプル希釈溶液は、移動相と同じか類似したものであり得る。いくつかの実施形態において、サンプル希釈溶液は、水、アセトニトリルおよびアルコール（例えば、メタノール）の混合物である。さらなる実施形態において、このサンプル希釈溶液は、約５０％〜約９０％の水、約５０％〜約７０％のアセトニトリルと約３０％〜約５０％のメタノールとの混合物を約１０％〜約５０％含有する。なおさらなる実施形態において、このサンプル希釈溶液は、約７０％の水、および約６０％のアセトニトリルと約４０％のメタノールとの混合物を約３０％含有する。
【００３３】
電気化学的検出器（ＥＣＤ）は、マクロライドの酸化または還元を誘導および検出し得る任意の適切な検出器であり得る。適切なＥＣＤの一つの例としては、３つの電極：ガード電極またはセル、スクリーニング電極および作用電極を用いるＥＣＤが挙げられる。作用電極は、例えば、白金電極またはガラス状の炭素電極であり得る。電極のキャリブレーションは、当業者に公知の任意の標準的な手段によって行なわれ得る。いくつかの実施形態において、ＥＣＤは、マクロライドの検出および付随的な不純物のこの不純物の酸化による検出のために設定される。例えば、作用電極は、サイクリックボルタンメトリーのような種々の公知の方法のいずれかによって決定され得るように、マクロライドを酸化するのに適した電位に設定され得る。作用電極に適した電位としては、約７００ｍＶより高い電位、約７５０ｍＶより高い電位および約８００ｍＶより高い電位が挙げられる。いくつかの実施形態において、作用電極は、約８００ｍＶ〜約９００ｍＶの電位を有する。さらなる実施形態において、作用電極は、約８５０ｍＶの電位を有する。ガード電極および照合電極のための電位は、当業者により容易に決定され得る。例えば、ガード電極は、約１０００ｍＶの電位を有し得、照合電極は、作用電極の電位より低い電位（例えば、約−１００ｍＶ〜約１００ｍＶ）を有し得る。いくつかの実施形態において、照合電極は、約０ｍＶの電位を有する。
【００３４】
質量分析（ＭＳ）検出器としては、マクロライドの質量／電荷の比を検出および決定し得る任意のＭＳ検出器が挙げられ得る。適切なＭＳ検出器は、例えば、多くの市販のＬＣ−ＭＳ機器と組合せて広く利用可能であり、マクロライドのような有機化合物の検出におけるその使用は、当該分野では、日常的である。いくつかの実施形態において、マクロライドおよび付随する任意の不純物の検出は、ＭＳ検出器をポジティブモードで用いて実施され得る。イオン化は、エレクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）または他の手段を含む任意の適切な方法によって行なわれ得る。適切なＭＳパラメーターとしては、約１５０℃〜約２００℃（例えば、約１８０℃）のキャピラリー温度および約３００℃〜約４００℃（例えば、約３５０℃）に設定した蒸発器が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法およびシステムに従ったマクロライドの溶出は、室温および大気圧を含む種々の温度および圧力下で実施され得る。いくつかの実施形態において、溶出は、約１０℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃または約２０℃の一定温度で行われる。温度は、カラムにこのような適用のために設計された冷却装置を備えることによって室温以下に維持され得る。逆に、温度は、カラムにこのような適用のために設計された加熱装置を備えることによって室温より高く維持され得る。溶出は、空気下、または不活性な雰囲気下でも行なわれ得る。
【００３６】
マクロライドの検出は、マクロライドに対応すると考えられるピークを含む、本発明のアッセイに従って得られたクロマトグラムを、マクロライドの既知のサンプルに対する参照ピークを示す、同じ条件下で流したクロマトグラムと比較することにより確認され得る。例えば、参照ピークの約０．２分以内に出現するサンプルピークは、確認されたとみなされ得る。サンプル中のマクロライドの量はまた、マクロライドに対応するピークの面積を既知の量のマクロライドを含む参照サンプル（標準）について得られたクロマトグラムのピークの面積と比較することにより定量され得る。
【００３７】
本発明は、試験サンプルの純度を決定する方法をさらに提供する。この方法は、ａ）サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに流して、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程を包含する。流出液は、ｉ）マクロライドに対応するピーク電流；およびｉｉ）必要に応じてサンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流（例えば、マクロライドに起因するピーク面積の約０．０５％以上のピーク面積を有するピーク電流）を検出するために、電気化学的検出器によりモニタリングされる。次いで、ピーク電流の特徴は、不純物の含有量を計算するために評価される（例えば、不純物の含有量（純度）を評価および計算するために、ピーク面積またはピークの高さの比のパーセントが使用され得る）。いくつかの実施形態において、ピーク電流の面積は、マクロライドとともにそれぞれ検出された不純物について決定され、そのぞれぞれの全ピーク面積のパーセントが計算される。
【００３８】
サンプル中の不純物は、例えば、本発明のＨＰＬＣ−ＭＳ法により得られたクロマトグラムの不純物に対応するピークの面積を決定することにより同定され得る。
【００３９】
（ＨＰＬＣ−ＵＶによるマクロライド不純物の定量）
上記のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイおよび／またはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイにより試験サンプル中で同定された不純物は、光度検出を備えるＨＰＬＣアッセイ（ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイ）を用いて定量され得る。
【００４０】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイのための適切な移動相組成物は、所望のマクロライドを効率的に溶出する液体成分の任意の組合せであり得、潜在的な不純物からのマクロライドの分離を可能にし、検出波長でのマクロライドの光度検出を可能にする。いくつかの実施形態において、移動相は、約２０５ｎｍより上でごくわずかな吸光度（例えば、１ｃｍのパス長にわたって分光光度計により測定される）を有する。「ごくわずかな」とは、約０．０２以下の吸光度を意味する。さらなる実施形態において、移動相は、検出波長において、約０．５未満、約０．３未満または約０．１未満の吸光度（例えば、１ｃｍのパス長にわたって分光光度計により測定される）を有する。
【００４１】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相は、水、有機溶媒またはこれらの混合物を含有し得る。水に混和性であり、検出波長では、マクロライドの検出を妨害しない任意の適切な有機溶媒が使用され得る。いくつかの実施形態において、この有機溶媒は、アセトニトリルである。この移動相は、０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の水および０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含有し得る。いくつかの実施形態において、この移動相は、約５％（ｖ／ｖ）〜約７５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含有する。
【００４２】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相は、さらに溶媒を所望のｐＨに安定させるために緩衝液を含有し得る。検出波長では、マクロライドの検出を妨害しない任意の緩衝液が使用され得る。いくつかの実施形態において、この緩衝液は、リン酸緩衝液または硫酸緩衝液である。さらなる実施形態において、緩衝液は、硫酸緩衝液である。緩衝液濃度は、例えば、約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。マクロライドが、本発明の方法およびシステムにより検出され得るように十分に安定である任意のｐＨが適している。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約１〜約４である。さらなる実施形態において、ｐＨは約３である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、移動相は、イオン対試薬（例えば、逆相カラム上でマクロライドの保持を促進する塩）を含有する。移動相溶液中で適度に安定であり、マクロライドの荷電した形態（例えば、プロトン化したか、または脱プロトン化した形態）とイオン対を形成し得、そしてマクロライドの溶出または検出を妨害しない任意のイオン対試薬が、適している。種々の適切なイオン対試薬が市販されており、それを使用するＨＰＬＣ技術は、当該分野で周知である。イオン対試薬のいくつかの例としては、（Ｃ４〜Ｃ１２アルキル）スルホネート塩などのアルキルスルホネート塩（１−オクタンスルホネートナトリウムが挙げられる）が挙げられる。移動相中のイオン対試薬の濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭであり得る。いくつかのさらなる実施形態において、イオン対濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約３０ｍＭである。いくつかの実施形態において、イオン対濃度は、約１２ｍＭ〜約１５ｍＭである。
【００４４】
移動相は、均一濃度溶出液または勾配溶出液としてＨＰＬＣカラムを通って流れ得る。勾配移動相が適用される実施形態において、移動相は、二種以上の異なる溶出溶液の混合物からなり得、その比率は、溶出の時間の経過によって変動する。例えば、移動相は、溶出の間に、種々の量の水、有機溶媒、緩衝液およびイオン対試薬を含有し得る。成分の量における変動は、勾配移動相が溶出の過程の間の検出波長における実質的に一定の吸光度を維持するように調整され得る。成分の量における変動はまた、ピークの形状、溶出時間、不純物からのマクロライドの分離および他のパラメーターを最適化するために、調節され得る。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの移動相組成物は、それぞれ異なる量の水、有機溶媒、緩衝液およびイオン対試薬を含有する二つの溶出溶液の一方または混合物で溶出することにより変動し得る。いくつかの実施形態において、一番目の溶出溶液は、約１０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約７０％（ｖ／ｖ）〜約９０％（ｖ／ｖ）の水、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのイオン対試薬および約１０ｍＭ〜約１５ｍＭの緩衝液を含有し、二番目の溶出溶液は、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約４０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の水、約８ｍＭ〜約１５ｍＭのイオン対試薬および約８ｍＭ〜約１２ｍＭの緩衝液を含有する。さらなる実施形態において、一番目の溶出溶液は、約２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約８０％（ｖ／ｖ）の水、約１５ｍＭのイオン対試薬および約１３ｍＭの緩衝液を含有し、二番目の溶出溶液は、約５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒、約５０％（ｖ／ｖ）の水、約１２ｍＭのイオン対試薬および約１０．５ｍＭの緩衝液を含有する。溶出の間の任意の時点で、移動相は、二つの溶出溶液の一方の１００％からなり得るか、またはこの二つの混合物からなり得る。
【００４６】
ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイの固定相は、移動相と組合せて、マクロライドの検出およびマクロライドの潜在的な不純物からの分離を可能にする任意の逆相固体支持体媒体からなり得る。いくつかの実施形態において、固定相は、Ｃ８〜Ｃ１８のマトリックスを含む。さらなる実施形態において、固定相は、Ｃ１８マトリックスである。
【００４７】
サンプルは、カラムへの導入のために希釈されて、希釈サンプルを形成し得る。希釈サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのマクロライド濃度を有し得る。サンプル希釈液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（例えば、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭまたは約５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）により緩衝された水からなり得、約６〜約８、または約７のｐＨを有し得る。
【００４８】
カラムからの流出液をモニタリングするＵＶ検出器は、液体サンプルが吸収するＵＶ波長または液体サンプルを透過するＵＶ波長を検出し得る任意の分光光度計を備え得る。この検出器は、溶出の間に一定であり得る検出波長に調整され得る。いくつかの実施形態において、流出液は、約１９０ｎｍ〜約２１０ｎｍの波長、約１９７ｎｍ〜約２０５ｎｍの波長または約２００ｎｍの波長でモニタリングされる。いくつかの実施形態において、検出波長は、約２００ｎｍである。
【００４９】
上記のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイおよび／またはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイにより同定された各不純物に対するＵＶ応答因子（検出波長で標準化された不純物のマクロライドに対するピーク面積比）は、既知の不純物量を含有する参照サンプルおよび高純度の既知の量のマクロライドを含有する参照サンプルに対して上記ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイを行なうことにより決定され得る。例えば、不純物に対する応答因子は、以下の等式Ａ、ＢおよびＣに従って計算され得る。
【００５０】
応答因子＝（標準化した不純物のピーク面積）／（標準化したマクロライドのピーク面積） （Ａ）
ここで、
標準化した不純物のピーク面積＝（不純物のピーク面積）×（純度％）／（不純物の濃度） （Ｂ）
標準化したマクロライドのピーク面積＝（マクロライドのピーク面積）×（純度％）／（マクロライドの濃度） （Ｃ）。
【００５１】
未知の量の不純物を含有する試験サンプル中の不純物の量は、本明細書中に記載のＨＰＬＣ−ＭＳアッセイまたはＨＰＬＣ−ＥＣＤアッセイを使用して不純物を同定し、その後、同定された不純物の参照サンプルおよびマクロライドの参照サンプルに対して上記ＨＰＬＣ−ＵＶアッセイを行ない、上記のＨＰＬＣ−ＵＶアッセイに従って試験サンプルをアッセイし、試験サンプル中の不純物の量を計算するために計算された応答因子を使用して同定された不純物に対する応答因子を計算することによって決定され得る。
【００５２】
（システム）
上記の構成要素の集合を含むシステムもまた本発明に包含される。例えば、本発明のシステムは、ａ）以下、ｉ）逆相固体支持体マトリックスを含む固定相；およびｉｉ）上記の移動相を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）；ならびにｂ）電気化学的検出器または質量分析検出器を備え得る。
【００５３】
本発明に従ってＨＰＬＣアッセイを適用し、最適化するためのさらなるパラメーターは、例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ Ｍｅｔｈｏｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第２版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７（その開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）のような文献に明らかにされるように、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００５４】
本発明は、特定の実施例により、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示目的で提供され、どのような形ででも本発明を制限することを意図しない。当業者は、本質的に同じ結果を生じるように変化または改変され得る種々の重要ではないパラメーターを容易に認識する。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの電気化学的検出および質量分析検出のためのＨＰＬＣパラメーター）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンサンプルのＨＰＬＣ分析を、以下のパラメーターに従って実施した。パーセントは、体積パーセントである。
【００５６】
（機器）
Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ ＨＰＬＣポンプ
ＥＳＡ Ｍｏｄｅｌ ５２００Ａ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ 電気化学的検出器
ＥＳＡ Ｍｏｄｅｌ ５０１０ 分析用セル
ＡＣＥ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ、３μｍ、ＭＡＣ−ＭＯＤ、Ｐ／Ｎ＃ＡＣＥ−１１１−１５４６）
Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＳＳＱ７０００またはＪＥＯＬ ＬＣ−Ｍａｔｅ 質量分析計システム。
【００５７】
（移動相）
溶出液Ａ：０．２２μｍのフィルターを通して減圧ろ過した水中の０．０６７１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０４）
溶出液Ｂ：５７．６体積％のアセトニトリルと４２．４体積％のメタノール中の０．０６７１Ｍ酢酸アンモニウム（０．２２μｍフィルターを通して減圧濾過）
サンプル希釈液：Ｃ１８ディスクで精製したミリＱ水を７１％と、５７．６％のアセトニトリルと４２．２％のメタノールとの混合物を２９％。
【００５８】
（標準およびサンプルの調製）
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミン標準溶液および０．８〜０．９ｍｇ／ｍＬのサンプル溶液を、サンプル希釈液を用いて５０．００ｍＬのメスフラスコに調製した。
【００５９】
（カラムパラメーター）
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＥＣＤの注入体積：１０μＬ
ＭＳの注入体積：５０μＬ
適用時間：６０分間
【００６０】
【表１】
。
【００６１】
（電気化学的検出パラメーター）
ガードセル：１０００ｍＶ
電極１：０ｍＶ
電極２：８５０ｍＶ
ノイズフィルター：５秒間
範囲：５０μＡ。
【００６２】
（質量分析計検出パラメーター）
ＡＰＣＩポジティブ様式
キャピラリー温度：１８０℃
蒸発器温度：３５０℃。
【００６３】
（実施例２）
（異なるロットの９−エリスロマイシルアミンのＨＰＬＣ分析）
異なる製造供給元の９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのサンプルを、実施例１に記載されるパラメーターに従って質量分析計もしくは電気化学的検出のどちらかまたはその両方を使用してＨＰＬＣにより分析した。仮の構造の指定を質量に基づいて行い、対応する構造を図１および図２に提供する。文字「ＮＤ」は、「検出されなかった」ことを示す。
【００６４】
（表２ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット３６１８８ＣＡ００および６Ｅ０１０１の対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよびＨＰＬＣ−ＥＣＤのデータ）
【００６５】
【表２】
。
【００６６】
（表３ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット（Ｓ）ＡＥ／ｉｉ３２／５６および３５３５に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよび電気化学的検出器（ＥＣＤ）のデータ）
【００６７】
【表３】
。
【００６８】
（表４ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロット６Ｅ０２０１およびＰＤＣ３２５／Ｖｄ０７０２０２に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータおよび電気化学的検出器（ＥＣＤ）のデータ）
【００６９】
【表４】
。
【００７０】
（表５ ９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのロットＰＤ２０１２／ＷＲＳ／３２８／０１６および１０００６６４７に対するＨＰＬＣ−ＭＳのデータ）
【００７１】
【表５】
。
【００７２】
（実施例３）
（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのサンプル中の不純物の同定および定量）
以下の手順に従って、６個のマクロライド不純物（表６および上記式ＶＩ〜ＸＩを参照のこと）は、夾雑物であると考えられ、ＡＰＩとして使用するための９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンのバッチ中の存在または非存在について確認した。検出された不純物の量もまた定量した。
【００７３】
（表６）
【００７４】
【表６】
上記６個の不純物と考えられるそれぞれの参照サンプルおよび９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンを、Ａｌｅｍｂｉｃ，Ｉｎｃ（Ｉｎｄｉａ）から購入し、その構造を、ＦＴ−ＩＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳにより確認した。その手順は、実施例１に記載の手順に従って行なった。約２ｍｇの参照サンプルと約１００ｍｇの乾燥ＫＢｒを瑪瑙の乳鉢中で混合し、微細な粉末に粉砕することによりＦＴ−ＩＲサンプルを調製した。この粉末を１１ｍｍのペレットの型に装填し、減圧下で圧縮した。４ｃｍ−１で１６回スキャニングすることによりＩＲスペクトルを得た。ＩＲスペクトルおよびＭＳのデータは、表６の６個の化合物のそれぞれと一致していた。
【００７５】
上記６個の考えられる化合物のそれぞれに対する応答因子を、以下の手順により決定した。６個の考えられる化合物のそれぞれの参照サンプルを、以下に示すＨＰＬＣ−ＵＶパラメーターに従って光度検出を用いてＨＰＬＣによりアッセイした。
【００７６】
（機器）
製造業者の指示書に従って操作した以下の装置を使用してＨＰＬＣクロマトグラムを得た。同等の性能を有する装置を代用し得る。
【００７７】
減圧脱気装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
インジェクター：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
・針の洗浄用としてアセトニトリルと水との５０：５０（体積）混合物
・１００μＬのインジェクションループ
プレカラム：ＯＤＳカートリッジを備えるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ｇｕａｒｄ（Ｐ／Ｎ ＡＪＯ−４２８７）
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム、Ｃ１８（２）、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（Ｐ／Ｎ ００Ｆ−４２５２−Ｅ０）
・カラムを、カラムのラベルに指示されるとおりに溶出液の流れの向きに設置し、２０±１℃に維持されたＪｏｎｅｓクロマトグラフィーカラム冷却装置／加熱装置内に配置した
・使用していないときには、カラムを７０：３０（ｖ／ｖ）のアセトニトリル：水中に保存した
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ２４８７二重波長検出器
・波長＝２００ｎｍ
カラム冷却装置：Ｊｏｎｅｓクロマトグラフィーモデル ７９５５
・温度を２０±１℃に設定した
データシステム：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍデータシステム、バージョン６．２．１。
【００７８】
（作用溶液）
（サンプル希釈液）
５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ （Ｓｉｇｍａ）ｐＨ ７．４。
【００７９】
（溶出液Ａ）
２０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）
１５ｍＭ １−オクタンスルホネートナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１３ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１。
【００８０】
（溶出液Ｂ）
５０％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード、Ｆｉｓｈｅｒ）
１２ｍＭ １−オクタンスルホネートナトリウム（Ｆｌｕｋａ）
１０．５ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨ３．１。
【００８１】
（ＨＰＬＣ分析）
サンプル分析を以下のパラメーターの下で行なった：
流速：１．０ｍＬ／分
注入体積：２０μＬ
適用時間：４０分間
波長：２００ｎｍ
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ。
【００８２】
データシステムを、４０分間の取得時間で１ポイント／秒を得るように設定した。
勾配移動相を、以下の表Ａに従って適用した。
【００８３】
（表Ａ）
【００８４】
【化７】
。
【００８５】
各不純物の参照サンプルに対する標準化したピーク面積および９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの参照サンプルに対する標準化したピーク面積を、式（Ｄ）を用いて計算し、応答因子を、式（Ｅ）を用いて計算した。面積１は、一番目の注入のピーク面積であり、面積２は、二番目の注入のピーク面積である。
【００８６】
標準化したピーク面積＝（面積１＋面積２）／２×（純度％）／濃度（ｍｇ／ｍＬ） （Ｄ）
応答因子＝（不純物の標準化したピーク面積）／（９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの標準化したピーク面積） （Ｅ）。
【００８７】
６個の不純物と考えられるそれぞれに対する計算した応答因子を、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンに対する応答因子とともに以下の表７に示す。
【００８８】
（表７）
【００８９】
【表７】
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験サンプル中の６個の不純物それぞれの量を、試験サンプルを上記のＨＰＬＣ−ＵＶカラムに流し、表７の応答因子を使用することにより決定した。結果を以下の表８に示す。９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミンは、検出可能な量では、観察されなかった。
【００９０】
（表８）
【００９１】
【表８】
明瞭性のために別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴はまた単一の実施形態中で組合せて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載される本発明の種々の特徴はまた、別個にまたは任意の適切なより小さな組合せで提供され得る。
【００９２】
本明細書中に記載される改変に加えて本発明の種々の改変は、前述の記載から当業者には明らかである。このような改変はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。本出願に引用した各参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１および図２は、本発明の方法およびシステムに従って検出、同定および定量化され得る９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの可能性のある不純物を示す。
【図２】図１および図２は、本発明の方法およびシステムに従って検出、同定および定量化され得る９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの可能性のある不純物を示す。
【図３】図３は、９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの合成の例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中のマクロライドを検出する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；ならびに
ｃ）該カラムからの流出液を電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングして、該マクロライドに対応するピーク電流または質量ピークをそれぞれ検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記マクロライドが９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロライドが、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍの紫外光−可視光の範囲で最大の吸収を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記揮発性緩衝液が酢酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記移動相が約６〜約８のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールがメタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記移動相が、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合物を含み、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで、溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験サンプル中の前記マクロライドの電流のピークの面積または高さを、参照標準と比較することにより該マクロライドの量を定量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプルの純度を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）該カラムからの流出液を電気化学的検出器を用いてモニタリングして、
ｉ）該マクロライドに対応するピーク電流；および
ｉｉ）必要に応じて、該試験サンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流；
を検出する工程；ならびに
ｄ）該試験サンプル中の不純物含有量を計算するために、該検出器によって検出された一つ以上のピーク電流の特徴を測定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記測定する工程が、以下：
ｉ）検出された不純物および前記マクロライドのそれぞれに対する電流のピーク面積を決定する工程；および
ｉｉ）該マクロライドに起因する全電流のピーク面積のパーセントを計算する工程；
によって行なわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）該カラムからの流出液を質量分析検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）該マクロライドに対応する質量ピーク；および
ｉｉ）さらに該試験サンプル中の該不純物に対応するさらなる質量ピーク；
を検出する工程；ならびに
ｄ）該不純物に対応するさらなる質量ピークの質量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記マクロライドが９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記不純物がマクロライドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不純物が、以下：
エリスロマイシンＢ；
エリスロマイシンヒドラゾンＢ；
９−イミノエリスロマイシンＢ；
エリスロマイシルアミンＢ；
エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物；
９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン；
エリスロマイシルアミン水酸化物；
９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ；
エリスロマイシルアミンＢ水酸化物；
９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン；
エリスロマイシルアミンＣ；
エリスロマイシルアミンＤ；または、
以下の式：
【化１】
を有する化合物；
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記不純物が、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩ：
【化２】
の化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物の量を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１１に記載の方法に従って該不純物を同定する工程；
ｂ）以下：
ｉ）既知の量の該不純物および既知の量の該マクロライドを、約１８０ｎｍと約２２０ｎｍとの間の検出波長を有する紫外光（ＵＶ）検出器を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｉｉ）既知の量の該不純物を、イオン対試薬を含有する移動相で溶出する工程；
ｉｉｉ）カラム流出液を該ＵＶ検出器を用いてモニタリングして該検出波長にて一番目の吸収ピークを検出する工程であって、該一番目の吸収ピークが該不純物に対応する、工程；
ｉｖ）該カラム流出液を該ＵＶ検出器を用いてモニタリングして該検出波長にて二番目の吸収ピークを検出する工程であって、該二番目の吸収ピークが該マクロライドに対応する、工程；および
ｖ）該不純物の応答因子を、該一番目の吸収ピークおよび該二番目の吸収ピークのピーク面積を使用して計算する工程；
を包含する方法によって該不純物に対する応答因子を決定する工程；
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）と同じアッセイ条件下で該試験サンプルを流して該不純物に対応する三番目の吸収ピークを検出する工程；および
ｉｉ）該応答因子を使用して該試験サンプル中の該不純物の量を計算する工程；
を包含する方法によって該試験サンプル中の該不純物の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記不純物が、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩ：
【化３】
の化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験サンプル中の不純物を検出するためのシステムであって、以下：
ａ）以下：
ｉ）Ｃ１８カラム；
ｉｉ）溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物を含む勾配移動相であって、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、勾配移動相；
を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム；
ｂ）ガード電極、スクリーニング電極および作用電極を備える電気化学的検出器、または質量分析検出器
を備える、システム。
【請求項１】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中のマクロライドを検出する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；ならびに
ｃ）該カラムからの流出液を電気化学的検出器または質量分析検出器を用いてモニタリングして、該マクロライドに対応するピーク電流または質量ピークをそれぞれ検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記マクロライドが９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロライドが、約１８０ｎｍ〜約２２０ｎｍの紫外光−可視光の範囲で最大の吸収を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記揮発性緩衝液が酢酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記移動相が約６〜約８のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールがメタノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記移動相が、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合物を含み、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで、溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試験サンプル中の前記マクロライドの電流のピークの面積または高さを、参照標準と比較することにより該マクロライドの量を定量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプルの純度を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）該カラムからの流出液を電気化学的検出器を用いてモニタリングして、
ｉ）該マクロライドに対応するピーク電流；および
ｉｉ）必要に応じて、該試験サンプル中の一種以上の不純物に対応する一種以上のさらなるピーク電流；
を検出する工程；ならびに
ｄ）該試験サンプル中の不純物含有量を計算するために、該検出器によって検出された一つ以上のピーク電流の特徴を測定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記測定する工程が、以下：
ｉ）検出された不純物および前記マクロライドのそれぞれに対する電流のピーク面積を決定する工程；および
ｉｉ）該マクロライドに起因する全電流のピーク面積のパーセントを計算する工程；
によって行なわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物を同定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）該試験サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｂ）該試験サンプルを、揮発性緩衝液、水、アセトニトリルおよびアルコールを含有する勾配移動相で溶出する工程；
ｃ）該カラムからの流出液を質量分析検出器を用いてモニタリングして、以下：
ｉ）該マクロライドに対応する質量ピーク；および
ｉｉ）さらに該試験サンプル中の該不純物に対応するさらなる質量ピーク；
を検出する工程；ならびに
ｄ）該不純物に対応するさらなる質量ピークの質量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記マクロライドが９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記不純物がマクロライドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不純物が、以下：
エリスロマイシンＢ；
エリスロマイシンヒドラゾンＢ；
９−イミノエリスロマイシンＢ；
エリスロマイシルアミンＢ；
エリスロマイシンヒドラゾンアセトン付加物；
９−ヒドロキシイミノエリスロマイシン；
エリスロマイシルアミン水酸化物；
９−ヒドロキシイミノエリスロマイシンＢ；
エリスロマイシルアミンＢ水酸化物；
９−（Ｒ）−エリスロマイシルアミン；
エリスロマイシルアミンＣ；
エリスロマイシルアミンＤ；または、
以下の式：
【化１】
を有する化合物；
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記不純物が、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩ：
【化２】
の化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
試験サンプルの重量による主要な成分がマクロライドである試験サンプル中の不純物の量を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１１に記載の方法に従って該不純物を同定する工程；
ｂ）以下：
ｉ）既知の量の該不純物および既知の量の該マクロライドを、約１８０ｎｍと約２２０ｎｍとの間の検出波長を有する紫外光（ＵＶ）検出器を備えた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムに適用する工程；
ｉｉ）既知の量の該不純物を、イオン対試薬を含有する移動相で溶出する工程；
ｉｉｉ）カラム流出液を該ＵＶ検出器を用いてモニタリングして該検出波長にて一番目の吸収ピークを検出する工程であって、該一番目の吸収ピークが該不純物に対応する、工程；
ｉｖ）該カラム流出液を該ＵＶ検出器を用いてモニタリングして該検出波長にて二番目の吸収ピークを検出する工程であって、該二番目の吸収ピークが該マクロライドに対応する、工程；および
ｖ）該不純物の応答因子を、該一番目の吸収ピークおよび該二番目の吸収ピークのピーク面積を使用して計算する工程；
を包含する方法によって該不純物に対する応答因子を決定する工程；
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）と同じアッセイ条件下で該試験サンプルを流して該不純物に対応する三番目の吸収ピークを検出する工程；および
ｉｉ）該応答因子を使用して該試験サンプル中の該不純物の量を計算する工程；
を包含する方法によって該試験サンプル中の該不純物の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記不純物が、式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸまたはＸＩ：
【化３】
の化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
９−（Ｓ）−エリスロマイシルアミンの試験サンプル中の不純物を検出するためのシステムであって、以下：
ａ）以下：
ｉ）Ｃ１８カラム；
ｉｉ）溶出液Ａおよび溶出液Ｂの混合物を含む勾配移動相であって、その相対的な量は、溶出の過程の間に変動し、ここで溶出液Ａは本質的に、水中約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなり、溶出液Ｂは本質的に、約５０体積％〜約７０体積％のアセトニトリルと約３０体積％〜約５０体積％のメタノールとの混合物中の約６０ｍＭ〜約７５ｍＭの酢酸アンモニウムからなる、勾配移動相；
を含む逆相高速液体クロマトグラフィーカラム；
ｂ）ガード電極、スクリーニング電極および作用電極を備える電気化学的検出器、または質量分析検出器
を備える、システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５３６５２６（Ｐ２００７−５３６５２６Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１６９０（Ｐ２００７−５１１６９０）
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１６１０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８９８４
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１６１０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０８９８４
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
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