マラリアの検出のためのプローブ及びプライマー
本開示は、オリゴヌクレオチドプローブを利用することによって血液サンプルから単離された核酸を用いる、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出及び定量化に使用される方法について説明する。本明細書中で検出に利用される方法はリアルタイムＰＣＲによるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）又は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）によって引き起こされるマラリア感染を検出及び定量化する方法に関する。該方法は「オリゴヌクレオチド」プローブを利用することによって血液サンプルから単離された核酸を使用する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは依然として世界規模の公衆衛生において緊急課題となっており、年間死亡者数は７０万人〜２７０万人であり、犠牲者の７５％超がアフリカの子供たちである。過去３５年間で、マラリアの発生率は２倍〜３倍に増大している。現在、３億人〜５億人の人々が罹患しており、主にアフリカにおいて約１００万人の死者が出ている。１９５５年に、世界保健機関（ＷＨＯ）はクロロキンを用いた臨床治療によって、またＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタン）を用いて蚊の個体数を抑えることによってマラリアを根絶する大規模な計画を開始した。１９６０年代後半に廃止されたが、この計画は世界中の多くの国々でこの疾患の負担の重要かつ持続的な軽減をもたらしている。しかしながら、多くの国々でマラリアの再流行が起こっている。これは基本的に薬物耐性寄生虫の出現及び蔓延に起因するものである。殺虫剤耐性の蚊の進化、人口密度の増加（世界人口は１９６３年から倍増している）、地球温暖化（これにより以前は範囲外であった地域へと媒介生物が広がっている）、継続する貧困、政情不安定、及び感染性疾患による生産性の低下というこれらの要因全てによって、マラリアの治療及び制御に対する安定な公衆衛生インフラの維持が損なわれている。
【０００３】
ヒトマラリアは、世界中のほとんどの熱帯及び亜熱帯の生態系に特有の寄生虫性疾患である。マラリア寄生虫はプラズモディウム属に属し、非ヒト霊長類の幾つかの種を含む多くの脊椎動物宿主に感染する。熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ． ｏｖａｌｅ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐ． ｖｉｖａｘ）という４つのプラズモディウム種がヒトに寄生性である。これらの中でも、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫が、それぞれ最高のマラリア罹患率及び死亡率と関連している。
【０００４】
マラリア患者の適切な治療には、マラリアの正確かつ迅速な診断が不可欠である。血液塗抹標本の顕微鏡検査は、マラリア診断にとって「究極の判断基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」である。この方法は高感度で特異的であるが、面倒であり時間がかかる。一次医療レベルでマラリアを診断するための光学顕微鏡検査の幾つかの制限のために、ＰＣＲ及び迅速抗原捕捉検査（ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙｓ）等の代替方法が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示の目的は、マラリアの検出のためのプローブ及びプライマーを提供することである。
【０００６】
本開示の別の目的は、マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物を提供することである。
【０００７】
本開示のまた別の目的は、マラリア感染を検出及び定量化する方法を提供することである。
【０００８】
本開示のさらに別の目的は、マラリア感染の検出のためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブ；配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマー；マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物；マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、ｂ）上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの任意の増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程、並びにｃ）任意で検出されたシグナルから標準曲線を作成し、マラリア感染を定量化するためにコピー数を得る、作成する工程を含む、方法；並びにマラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】熱帯熱マラリア原虫の標準曲線を示す図である。
【図２】三日熱マラリア原虫の標準曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブに関する。
【００１２】
本開示の一実施形態では、上記プローブはマラリアの検出のためのものである。
【００１３】
本開示の別の実施形態では、プローブは５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している。
【００１４】
本開示のまた別の実施形態では、蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００１５】
本開示のさらに別の実施形態では、クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００１６】
本開示のさらに別の実施形態では、好ましい蛍光物質は５’末端の６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーは３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）である。
【００１７】
本開示は配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマーに関する。
【００１８】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーはセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーはアンチセンスプライマーである。
【００１９】
本開示の別の実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２０】
本開示は、マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物に関する。
【００２１】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２２】
本開示の別の実施形態では、マラリア感染は血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される。
【００２３】
本開示は、マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、
（ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、
（ｂ）上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程、並びに
（ｃ）任意で検出されたシグナルから標準曲線を作成し、マラリア感染を定量化するためにコピー数を得る、作成する工程を含む、方法に関する。
【００２４】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーはセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーはアンチセンスプライマーである。
【００２５】
本開示の別の実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２６】
本開示のまた別の実施形態では、蛍光シグナルは５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有するプローブによって発生する。
【００２７】
本開示のさらに別の実施形態では、蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００２８】
本開示のさらに別の実施形態では、クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００２９】
本開示のさらに別の実施形態では、マラリア感染は血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される。
【００３０】
本開示は、マラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。
【００３１】
本開示の一実施形態では、増幅試薬は塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む。
【００３２】
プローブ及びプライマーの設計に選択された領域
配列番号１を有するプローブは配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーと共に、熱帯熱マラリア原虫の赤血球結合タンパク質領域に対して設計された。同様に、配列番号２のプローブは配列番号５及び配列番号８のプライマーと共に、熱帯熱マラリア原虫のＶａｒ遺伝子領域に対して設計された。配列番号３のプローブは配列番号６及び配列番号９のプライマーと共に、三日熱マラリア原虫の赤血球結合タンパク質遺伝子に対して設計された。
【００３３】
本開示の目的は、感染した血液サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルから単離されたＤＮＡからの、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出である。検出方法は、蛍光物質及びクエンチャーで標識された「オリゴヌクレオチド」プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって蛍光の増大をモニタリングすることである。
【００３４】
本開示は、リアルタイムＰＣＲ法を利用する、オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらのそれぞれのプライマーを用いたマラリア感染の検出に関する。
【００３５】
上述の「オリゴヌクレオチド」プローブは、５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーと結合している。
【００３６】
本開示のさらに別の実施形態では、上記蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００３７】
本開示のさらに別の実施形態では、上記クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００３８】
本開示の別の実施形態では、上記蛍光物質は６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である。
【００３９】
本開示によると、配列番号１及び配列番号２で指定されるプローブは、熱帯熱マラリア原虫の検出用に設計されている。配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７は配列番号１のプローブに対して、配列番号５及び配列番号８は配列番号２のプローブに対してそれぞれ設計されている。
【００４０】
同様に、配列番号３のプローブは、配列番号６及び配列番号９のプライマーそれぞれと組み合わせて三日熱マラリア原虫の検出用に設計されている。
【００４１】
本開示によると、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６はセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９はアンチセンスプライマーである。
【００４２】
本開示は、マラリア感染を検出する方法であって、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に指定されるオリゴヌクレオチドプローブ、それらの対応するプライマー、並びにマラリアＤＮＡサンプルを含む上記ＰＣＲ混合物に対してリアルタイムＰＣＲを用いた増幅を行い、標的配列のコピーを得る、方法に関する。増幅は蛍光シグナルの増大によって測定し、生じたシグナルの量を非感染ＤＮＡサンプルと比較する。
【００４３】
本開示によると、オリゴヌクレオチドプローブのサイズは２７ヌクレオチド〜２９ヌクレオチドの範囲である。設計したプローブは５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有する。
【００４４】
５’末端の蛍光物質はＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である。
【００４５】
本開示は、血液サンプル、尿サンプル又は唾液サンプルから単離されたＤＮＡを用いる、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出に使用される。検出に利用される方法はリアルタイムＰＣＲを用いるものである。
【００４６】
本開示によると、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短配列を指す。このオリゴヌクレオチドプローブは、非感染ＤＮＡへの非特異的なハイブリダイゼーションを示すことなく、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる。
【００４７】
ここで利用されるプローブは、Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの原理に従う。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄｙｅオリゴヌクレオチド又は二重標識プローブとも呼ばれるＴａｑＭａｎプローブは、最も広く使用されているタイプのプローブである。
【００４８】
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染をリアルタイムＰＣＲによって特異的に増幅し、検出するために使用することのできるそれぞれのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと共にさらに提供される。上記でクレームされるプライマーのサイズは、２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの範囲である。熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫に対する対応するプローブ及びプライマーの配列を表１、表２及び表３に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出に適用することができる。
【００５３】
マラリア感染の検出におけるこれらのプローブ及びプライマーの効率を、以下の実施例で説明する。
【００５４】
本開示を以下の実施例及び図面によってさらに詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
熱帯熱マラリア原虫に対して陽性の１０個の血液サンプル、及び１０個の非感染血液サンプルからなるサンプルパネルからＤＮＡを単離した。同様に、市販のＤＮＡ単離キットを用いて、三日熱マラリア原虫に対して陽性の１０個の血液サンプル、及び１０個の非感染血液サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫の検出のために、配列番号１のプローブを配列番号４若しくは配列番号１０及び配列番号７と共に、又は配列番号２のプローブを配列番号５及び配列番号８と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行った。同様に、配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に、三日熱マラリア原虫の検出に使用した。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。ＰＣＲミックスの組成及びＰＣＲ条件を表４及び表５に挙げる。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号２に指定されるプローブが、感染サンプルのみを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知することで１００％の特異性及び感度を示し、陰性サンプルに対する誤った増幅を全く示さなかったことが示された（表６）。
【００５９】
三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号３も、感染サンプルのみを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知することで１００％の特異性及び感度を示し、陰性サンプルに対する誤った増幅を全く示さなかった（表７）。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
実施例２
別の研究では、２５個の感染血液サンプルからなる二重盲検サンプルパネルからＤＮＡを単離した。次いで、感染血液サンプルからのマラリアの検出における配列番号１、配列番号２及び配列番号３の効率をリアルタイムＰＣＲによって試験した。得られた結果を次に、マラリア検出のための他の市販の技法、すなわち（ｖｉｚ）顕微鏡検査及び迅速診断検査（ＲＤＴ）と比較した。
【００６３】
得られた結果から、配列番号１、配列番号２及び配列番号３が、他の２つの技法によって単独感染であると示された混合感染の症例であっても検知することが示された。混合感染の場合のＣｔ値を検討すると、三日熱マラリア原虫感染について得られたＣｔは遅く、そのＣｔでの寄生虫量はおよそ３寄生虫／μｌ〜５寄生虫／μｌであり、これは非常に低い数値である。顕微鏡検査及びＲＤＴによっては、そのように低いレベルの寄生虫血症を検出することができず、したがってこれら２つの試験によると感染は単独感染であると報告される。他の２つの試験によっては検出されず、結果が非検出と示されたサンプルが幾つかあった（表８）。この比較によって、設計された配列番号１、配列番号２及び配列番号３がそれらのそれぞれのプライマーと共に、マラリア感染の検出において１００％の特異性及び感度を示すと結論づけることができる。
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例３
標準曲線から得られるＣｔ値を比較することによっても、感染サンプルの寄生虫量を定量することができる（図１、図２）及び（表９、表１０）。
【００６６】
コピー数の算出プロトコル
およそ２５μｌのマラリアＤＮＡ（熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫）に対し、熱帯熱マラリア原虫については配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７のプライマー、三日熱マラリア原虫については配列番号６及び配列番号９のプライマーと共に、従来のＰＣＲ装置を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの後、増幅したサンプルをアガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、アンプリコンのバンドをゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。吸光度（２μｌのＤＮＡ）を、２６０ｎｍでｎａｎｏｄｒｏｐを用いて推定した。ＤＮＡの吸光係数は、個々の塩基の吸光係数を合計することによって算出した。
【００６７】
アンプリコンのナノモル濃度（Ｎａｎｏｍｏｌｅｓ）は以下の方程式を用いて算出した：
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝１０００×ＯＤ２６０（１ｃｍ）×１ｍｌ（体積）／アンプリコンの吸光係数
コピー数は以下の式を用いて算出した：
コピー数／ｍｌ＝（ｍｏｌ／ｍｌ）×アボガドロ数
熱帯熱マラリア原虫についての算出値：
ＯＤ２６０＝０．４６
吸光係数＝３２８２．１２
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝０．１４
コピー数／ｍｌ＝８．４４×１０１３
三日熱マラリア原虫についての算出値：
ＯＤ２６０＝０．１８２
吸光係数＝２６９９．４
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝０．０６７４
コピー数／ｍｌ＝４．０６×１０１３
リアルタイムＰＣＲを用いて１０９倍希釈〜１０４倍希釈のアンプリコンをランすることによって、純粋なアンプリコンのコピー数から標準曲線を作成した。標準曲線から得られるＣｔから、未知のサンプルについてコピー数を算出することができる。
【００６８】
注記：上述のプロトコルは、ｖａｒ遺伝子領域についてのコピー数の算出のための、配列番号５及び配列番号８のプライマーを用いた標準曲線の作成に適用可能である。
【００６９】
【表９】
【００７０】
【表１０】
【００７１】
実施例４：尿サンプルからのマラリア検出
市販のＤＮＡ単離キットを用いて、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれに対して陽性の１０人のマラリア患者の尿サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫の検出については配列番号１を配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行い、又は三日熱マラリア原虫の検出については配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に用いた。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。
【００７２】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号３に指定されるプローブが、１０個全ての陽性尿サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知したことが示された（表１１）。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
実施例５：唾液サンプルからのマラリア検出
市販のＤＮＡ単離キットを用いて、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれに対して陽性の５人のマラリア患者の唾液サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれの検出のために、配列番号１を配列番号４若しくは配列番号１０及び配列番号７と共に、又は配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行った。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。
【００７５】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号３に指定されるプローブが、５個全ての陽性唾液サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知したことが示された（表１２）。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
結論
１）配列番号１、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプローブは全ての陽性サンプルを検知し、非感染サンプルに対していかなる反応性も示さなかったため、それらが１００％特異的であり、１００％の感度を有することが示される。
【００７８】
２）これらのプローブは、顕微鏡検査又はＲＤＴによっては検出されなかった混合感染の症例を検知するうえで効率的である。
【００７９】
３）これらのプローブは、感染サンプルにおける寄生虫量の定量に使用することもできる。
【００８０】
４）最後に、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のプローブは、それらのそれぞれのプライマーと共に、血液サンプル、尿サンプル及び唾液サンプルにおいてマラリア感染の症例を効果的に検出することができる。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）又は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）によって引き起こされるマラリア感染を検出及び定量化する方法に関する。該方法は「オリゴヌクレオチド」プローブを利用することによって血液サンプルから単離された核酸を使用する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは依然として世界規模の公衆衛生において緊急課題となっており、年間死亡者数は７０万人〜２７０万人であり、犠牲者の７５％超がアフリカの子供たちである。過去３５年間で、マラリアの発生率は２倍〜３倍に増大している。現在、３億人〜５億人の人々が罹患しており、主にアフリカにおいて約１００万人の死者が出ている。１９５５年に、世界保健機関（ＷＨＯ）はクロロキンを用いた臨床治療によって、またＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタン）を用いて蚊の個体数を抑えることによってマラリアを根絶する大規模な計画を開始した。１９６０年代後半に廃止されたが、この計画は世界中の多くの国々でこの疾患の負担の重要かつ持続的な軽減をもたらしている。しかしながら、多くの国々でマラリアの再流行が起こっている。これは基本的に薬物耐性寄生虫の出現及び蔓延に起因するものである。殺虫剤耐性の蚊の進化、人口密度の増加（世界人口は１９６３年から倍増している）、地球温暖化（これにより以前は範囲外であった地域へと媒介生物が広がっている）、継続する貧困、政情不安定、及び感染性疾患による生産性の低下というこれらの要因全てによって、マラリアの治療及び制御に対する安定な公衆衛生インフラの維持が損なわれている。
【０００３】
ヒトマラリアは、世界中のほとんどの熱帯及び亜熱帯の生態系に特有の寄生虫性疾患である。マラリア寄生虫はプラズモディウム属に属し、非ヒト霊長類の幾つかの種を含む多くの脊椎動物宿主に感染する。熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ． ｏｖａｌｅ）及び三日熱マラリア原虫（Ｐ． ｖｉｖａｘ）という４つのプラズモディウム種がヒトに寄生性である。これらの中でも、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び三日熱マラリア原虫が、それぞれ最高のマラリア罹患率及び死亡率と関連している。
【０００４】
マラリア患者の適切な治療には、マラリアの正確かつ迅速な診断が不可欠である。血液塗抹標本の顕微鏡検査は、マラリア診断にとって「究極の判断基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」である。この方法は高感度で特異的であるが、面倒であり時間がかかる。一次医療レベルでマラリアを診断するための光学顕微鏡検査の幾つかの制限のために、ＰＣＲ及び迅速抗原捕捉検査（ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙｓ）等の代替方法が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示の目的は、マラリアの検出のためのプローブ及びプライマーを提供することである。
【０００６】
本開示の別の目的は、マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物を提供することである。
【０００７】
本開示のまた別の目的は、マラリア感染を検出及び定量化する方法を提供することである。
【０００８】
本開示のさらに別の目的は、マラリア感染の検出のためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブ；配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマー；マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物；マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、ｂ）上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの任意の増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程、並びにｃ）任意で検出されたシグナルから標準曲線を作成し、マラリア感染を定量化するためにコピー数を得る、作成する工程を含む、方法；並びにマラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】熱帯熱マラリア原虫の標準曲線を示す図である。
【図２】三日熱マラリア原虫の標準曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブに関する。
【００１２】
本開示の一実施形態では、上記プローブはマラリアの検出のためのものである。
【００１３】
本開示の別の実施形態では、プローブは５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している。
【００１４】
本開示のまた別の実施形態では、蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００１５】
本開示のさらに別の実施形態では、クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００１６】
本開示のさらに別の実施形態では、好ましい蛍光物質は５’末端の６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーは３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）である。
【００１７】
本開示は配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマーに関する。
【００１８】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーはセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーはアンチセンスプライマーである。
【００１９】
本開示の別の実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２０】
本開示は、マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物に関する。
【００２１】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２２】
本開示の別の実施形態では、マラリア感染は血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される。
【００２３】
本開示は、マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、
（ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、
（ｂ）上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程、並びに
（ｃ）任意で検出されたシグナルから標準曲線を作成し、マラリア感染を定量化するためにコピー数を得る、作成する工程を含む、方法に関する。
【００２４】
本開示の一実施形態では、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーはセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーはアンチセンスプライマーである。
【００２５】
本開示の別の実施形態では、配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーは配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーは配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーは配列番号３のプローブに対応する。
【００２６】
本開示のまた別の実施形態では、蛍光シグナルは５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有するプローブによって発生する。
【００２７】
本開示のさらに別の実施形態では、蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００２８】
本開示のさらに別の実施形態では、クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００２９】
本開示のさらに別の実施形態では、マラリア感染は血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される。
【００３０】
本開示は、マラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。
【００３１】
本開示の一実施形態では、増幅試薬は塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む。
【００３２】
プローブ及びプライマーの設計に選択された領域
配列番号１を有するプローブは配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーと共に、熱帯熱マラリア原虫の赤血球結合タンパク質領域に対して設計された。同様に、配列番号２のプローブは配列番号５及び配列番号８のプライマーと共に、熱帯熱マラリア原虫のＶａｒ遺伝子領域に対して設計された。配列番号３のプローブは配列番号６及び配列番号９のプライマーと共に、三日熱マラリア原虫の赤血球結合タンパク質遺伝子に対して設計された。
【００３３】
本開示の目的は、感染した血液サンプル、唾液サンプル又は尿サンプルから単離されたＤＮＡからの、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出である。検出方法は、蛍光物質及びクエンチャーで標識された「オリゴヌクレオチド」プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって蛍光の増大をモニタリングすることである。
【００３４】
本開示は、リアルタイムＰＣＲ法を利用する、オリゴヌクレオチドプローブ及びそれらのそれぞれのプライマーを用いたマラリア感染の検出に関する。
【００３５】
上述の「オリゴヌクレオチド」プローブは、５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーと結合している。
【００３６】
本開示のさらに別の実施形態では、上記蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される。
【００３７】
本開示のさらに別の実施形態では、上記クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。
【００３８】
本開示の別の実施形態では、上記蛍光物質は６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である。
【００３９】
本開示によると、配列番号１及び配列番号２で指定されるプローブは、熱帯熱マラリア原虫の検出用に設計されている。配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７は配列番号１のプローブに対して、配列番号５及び配列番号８は配列番号２のプローブに対してそれぞれ設計されている。
【００４０】
同様に、配列番号３のプローブは、配列番号６及び配列番号９のプライマーそれぞれと組み合わせて三日熱マラリア原虫の検出用に設計されている。
【００４１】
本開示によると、配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６はセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９はアンチセンスプライマーである。
【００４２】
本開示は、マラリア感染を検出する方法であって、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に指定されるオリゴヌクレオチドプローブ、それらの対応するプライマー、並びにマラリアＤＮＡサンプルを含む上記ＰＣＲ混合物に対してリアルタイムＰＣＲを用いた増幅を行い、標的配列のコピーを得る、方法に関する。増幅は蛍光シグナルの増大によって測定し、生じたシグナルの量を非感染ＤＮＡサンプルと比較する。
【００４３】
本開示によると、オリゴヌクレオチドプローブのサイズは２７ヌクレオチド〜２９ヌクレオチドの範囲である。設計したプローブは５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有する。
【００４４】
５’末端の蛍光物質はＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である。
【００４５】
本開示は、血液サンプル、尿サンプル又は唾液サンプルから単離されたＤＮＡを用いる、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出に使用される。検出に利用される方法はリアルタイムＰＣＲを用いるものである。
【００４６】
本開示によると、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短配列を指す。このオリゴヌクレオチドプローブは、非感染ＤＮＡへの非特異的なハイブリダイゼーションを示すことなく、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる。
【００４７】
ここで利用されるプローブは、Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの原理に従う。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄｙｅオリゴヌクレオチド又は二重標識プローブとも呼ばれるＴａｑＭａｎプローブは、最も広く使用されているタイプのプローブである。
【００４８】
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染をリアルタイムＰＣＲによって特異的に増幅し、検出するために使用することのできるそれぞれのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと共にさらに提供される。上記でクレームされるプライマーのサイズは、２０ヌクレオチド〜２８ヌクレオチドの範囲である。熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫に対する対応するプローブ及びプライマーの配列を表１、表２及び表３に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【００５２】
本開示によるオリゴヌクレオチドプローブは、熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫によって引き起こされるマラリア感染の検出に適用することができる。
【００５３】
マラリア感染の検出におけるこれらのプローブ及びプライマーの効率を、以下の実施例で説明する。
【００５４】
本開示を以下の実施例及び図面によってさらに詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
熱帯熱マラリア原虫に対して陽性の１０個の血液サンプル、及び１０個の非感染血液サンプルからなるサンプルパネルからＤＮＡを単離した。同様に、市販のＤＮＡ単離キットを用いて、三日熱マラリア原虫に対して陽性の１０個の血液サンプル、及び１０個の非感染血液サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫の検出のために、配列番号１のプローブを配列番号４若しくは配列番号１０及び配列番号７と共に、又は配列番号２のプローブを配列番号５及び配列番号８と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行った。同様に、配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に、三日熱マラリア原虫の検出に使用した。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。ＰＣＲミックスの組成及びＰＣＲ条件を表４及び表５に挙げる。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号２に指定されるプローブが、感染サンプルのみを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知することで１００％の特異性及び感度を示し、陰性サンプルに対する誤った増幅を全く示さなかったことが示された（表６）。
【００５９】
三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号３も、感染サンプルのみを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知することで１００％の特異性及び感度を示し、陰性サンプルに対する誤った増幅を全く示さなかった（表７）。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
実施例２
別の研究では、２５個の感染血液サンプルからなる二重盲検サンプルパネルからＤＮＡを単離した。次いで、感染血液サンプルからのマラリアの検出における配列番号１、配列番号２及び配列番号３の効率をリアルタイムＰＣＲによって試験した。得られた結果を次に、マラリア検出のための他の市販の技法、すなわち（ｖｉｚ）顕微鏡検査及び迅速診断検査（ＲＤＴ）と比較した。
【００６３】
得られた結果から、配列番号１、配列番号２及び配列番号３が、他の２つの技法によって単独感染であると示された混合感染の症例であっても検知することが示された。混合感染の場合のＣｔ値を検討すると、三日熱マラリア原虫感染について得られたＣｔは遅く、そのＣｔでの寄生虫量はおよそ３寄生虫／μｌ〜５寄生虫／μｌであり、これは非常に低い数値である。顕微鏡検査及びＲＤＴによっては、そのように低いレベルの寄生虫血症を検出することができず、したがってこれら２つの試験によると感染は単独感染であると報告される。他の２つの試験によっては検出されず、結果が非検出と示されたサンプルが幾つかあった（表８）。この比較によって、設計された配列番号１、配列番号２及び配列番号３がそれらのそれぞれのプライマーと共に、マラリア感染の検出において１００％の特異性及び感度を示すと結論づけることができる。
【００６４】
【表８】
【００６５】
実施例３
標準曲線から得られるＣｔ値を比較することによっても、感染サンプルの寄生虫量を定量することができる（図１、図２）及び（表９、表１０）。
【００６６】
コピー数の算出プロトコル
およそ２５μｌのマラリアＤＮＡ（熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫）に対し、熱帯熱マラリア原虫については配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７のプライマー、三日熱マラリア原虫については配列番号６及び配列番号９のプライマーと共に、従来のＰＣＲ装置を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲの後、増幅したサンプルをアガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、アンプリコンのバンドをゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。吸光度（２μｌのＤＮＡ）を、２６０ｎｍでｎａｎｏｄｒｏｐを用いて推定した。ＤＮＡの吸光係数は、個々の塩基の吸光係数を合計することによって算出した。
【００６７】
アンプリコンのナノモル濃度（Ｎａｎｏｍｏｌｅｓ）は以下の方程式を用いて算出した：
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝１０００×ＯＤ２６０（１ｃｍ）×１ｍｌ（体積）／アンプリコンの吸光係数
コピー数は以下の式を用いて算出した：
コピー数／ｍｌ＝（ｍｏｌ／ｍｌ）×アボガドロ数
熱帯熱マラリア原虫についての算出値：
ＯＤ２６０＝０．４６
吸光係数＝３２８２．１２
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝０．１４
コピー数／ｍｌ＝８．４４×１０１３
三日熱マラリア原虫についての算出値：
ＯＤ２６０＝０．１８２
吸光係数＝２６９９．４
ｎｍｏｌ／ｍｌ＝０．０６７４
コピー数／ｍｌ＝４．０６×１０１３
リアルタイムＰＣＲを用いて１０９倍希釈〜１０４倍希釈のアンプリコンをランすることによって、純粋なアンプリコンのコピー数から標準曲線を作成した。標準曲線から得られるＣｔから、未知のサンプルについてコピー数を算出することができる。
【００６８】
注記：上述のプロトコルは、ｖａｒ遺伝子領域についてのコピー数の算出のための、配列番号５及び配列番号８のプライマーを用いた標準曲線の作成に適用可能である。
【００６９】
【表９】
【００７０】
【表１０】
【００７１】
実施例４：尿サンプルからのマラリア検出
市販のＤＮＡ単離キットを用いて、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれに対して陽性の１０人のマラリア患者の尿サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫の検出については配列番号１を配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行い、又は三日熱マラリア原虫の検出については配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に用いた。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。
【００７２】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号３に指定されるプローブが、１０個全ての陽性尿サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知したことが示された（表１１）。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
実施例５：唾液サンプルからのマラリア検出
市販のＤＮＡ単離キットを用いて、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれに対して陽性の５人のマラリア患者の唾液サンプルからＤＮＡを単離した。精製したＤＮＡに対し、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫それぞれの検出のために、配列番号１を配列番号４若しくは配列番号１０及び配列番号７と共に、又は配列番号３を配列番号６及び配列番号９と共に用いたリアルタイムＰＣＲを行った。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。
【００７５】
得られた結果から、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の検出用に設計された配列番号１及び配列番号３に指定されるプローブが、５個全ての陽性唾液サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知したことが示された（表１２）。
【００７６】
【表１２】
【００７７】
結論
１）配列番号１、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドプローブは全ての陽性サンプルを検知し、非感染サンプルに対していかなる反応性も示さなかったため、それらが１００％特異的であり、１００％の感度を有することが示される。
【００７８】
２）これらのプローブは、顕微鏡検査又はＲＤＴによっては検出されなかった混合感染の症例を検知するうえで効率的である。
【００７９】
３）これらのプローブは、感染サンプルにおける寄生虫量の定量に使用することもできる。
【００８０】
４）最後に、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のプローブは、それらのそれぞれのプライマーと共に、血液サンプル、尿サンプル及び唾液サンプルにおいてマラリア感染の症例を効果的に検出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブ。
【請求項２】
マラリアの検出のためのものである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記蛍光物質がフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記クエンチャーが、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
好ましい蛍光物質が５’末端の６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーが３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）である、請求項４及び５に記載のプローブ。
【請求項７】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマー。
【請求項８】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物。
【請求項１１】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１２】
マラリア感染が血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１３】
マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、
（ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、
（ｂ）前記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの任意の増大を測定する工程、並びに
（ｃ）検出されたシグナルから、マラリア感染を定量化するためのコピー数を得るために、標準曲線を任意で作成する工程を含む、方法。
【請求項１４】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光シグナルが、５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有するプローブによって発生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光物質がフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記クエンチャーがテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
マラリア感染が血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
マラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キット。
【請求項２１】
前記増幅試薬が塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３を有するプローブ。
【請求項２】
マラリアの検出のためのものである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記蛍光物質がフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、並びにシアニン色素を含む群から選択される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記クエンチャーが、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される、請求項３に記載のプローブ。
【請求項６】
好ましい蛍光物質が５’末端の６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、好ましいクエンチャーが３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）である、請求項４及び５に記載のプローブ。
【請求項７】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のプライマー。
【請求項８】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
マラリアの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む、反応混合物。
【請求項１１】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１２】
マラリア感染が血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される、請求項１０に記載の反応混合物。
【請求項１３】
マラリア感染を検出し、任意で定量化する方法であって、
（ａ）検出対象のサンプル、核酸増幅試薬、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を含む群から選択されるプローブ、並びに配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を含む群から選択される対応するプライマーを含む反応混合物を調製する工程、
（ｂ）前記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、マラリア感染を検出するために蛍光シグナルの任意の増大を測定する工程、並びに
（ｃ）検出されたシグナルから、マラリア感染を定量化するためのコピー数を得るために、標準曲線を任意で作成する工程を含む、方法。
【請求項１４】
配列番号４又は配列番号１０、配列番号５及び配列番号６を有するプライマーがセンスプライマーであり、配列番号７、配列番号８及び配列番号９を有するプライマーがアンチセンスプライマーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４又は配列番号１０及び配列番号７を有するプライマーが配列番号１のプローブに対応し、配列番号５及び配列番号８を有するプライマーが配列番号２のプローブに対応し、配列番号６及び配列番号９を有するプライマーが配列番号３のプローブに対応する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光シグナルが、５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有するプローブによって発生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光物質がフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記クエンチャーがテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
マラリア感染が血液サンプル、唾液サンプル及び尿サンプルを含む群から選択されるサンプルから検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
マラリア感染の検出のためのキットであって、単独の又は組み合わせた配列番号１、配列番号２及び配列番号３の二重標識プローブ、単独の又は組み合わせた配列番号４又は配列番号１０、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キット。
【請求項２１】
前記増幅試薬が塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５１９４７２（Ｐ２０１２−５１９４７２Ａ）
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０７０４（Ｐ２０１１−５５０７０４）
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／００００４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９７８０３
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５１１１９８０６９）ビッグテック プライベート リミテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＧＴＥＣ ＰＲＩＶＡＴＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】ＩＩ Ｆｌｏｏｒ， ＳＩＤ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｉｎｄｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＩＳｃ Ｃａｍｐｕｓ， Ｍａｌｌｅｓｈｗａｒａｍ，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ５６０ ０１２， Ｋａｒｎａｔａｋａ ＩＮＤＩＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／００００４９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９７８０３
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５１１１９８０６９）ビッグテック プライベート リミテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＧＴＥＣ ＰＲＩＶＡＴＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】ＩＩ Ｆｌｏｏｒ， ＳＩＤ Ｅｎｔｒｅｐｒｅｎｅｕｒｓｈｉｐ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｉｎｄｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＩＳｃ Ｃａｍｐｕｓ， Ｍａｌｌｅｓｈｗａｒａｍ，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ５６０ ０１２， Ｋａｒｎａｔａｋａ ＩＮＤＩＡ
【Ｆターム（参考）】
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