マンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストックメセンテロイデス及びそれを利用したキムチの製造方法
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストック メセンテロイデス及びその用途に関する。本発明の乳酸菌は食品添加用組成物及びキムチのスターターとして有用に用いられる。本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチは従来のキムチに比べて適正熟成度が長期間維持され、淡泊な味が優れ、酸臭が薄く、酸味の質が極めてまろやかで官能特性が優れた効果を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性乳酸菌及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キムチは主原料である塩漬白菜に唐辛子粉、ニンニク、生姜、葱及び大根等を混合した後、製品の保存性と熟成度を確保する為、低温で発酵させた食品にして、韓国固有の代表的な伝統発酵食品である。1990年代まではキムチは主に家庭で自己的に生産されてきた食品であったが、急速な経済成長と国民所得の増加、産業構造及び生活環境の変化により1990年代以降本格的に商品化され始めた。商品化されているキムチの場合、キムチの発酵を主導し、かつキムチ特有の味を出す自然発生的な菌株等が原材料の産地、季節、発酵条件によって異なり、商品キムチの品質や味を望む状態で一定して維持することが極めて難しかった。従って、品質と味が一定していながら優れた商品キムチに対する開発が要望された。
【０００３】
キムチの淡泊でサッパリした味を出す主要因はキムチ乳酸菌の内、異常乳酸発酵菌(heterofermentative lactic acid bacteria)であるロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides) がキムチ熟成の際増加するからである(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci.Technol., 27(4):495-505,1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci.Technol., 27(4):506-515, 1995)。このロイコノストック メセンテロイデスはキムチ製造の際、初期から生育を始めて二酸化炭素、乳酸、酢酸、エタノール及びマンニトール等の代謝産物を生産することにより、キムチを複合的で独特な風味を有した状態に発酵させる。さらに、生産された二酸化炭素をしてキムチの内部を嫌気的条件に維持させ、好気性細菌の繁殖を強く抑制することにより、正常的なキムチ発酵となるようにする。しかしながら、キムチの発酵中期になると、ロイコノストック メセンテロイデスの数が急激に減少し、正常乳酸発酵菌(homofermentative lactic acid bacteria)であるラクトバチルス プランタリウム(Lactobacillus plantarium)が旺盛に増殖するようになる。ラクトバチルス プランタリウムはキムチの酸味を呈する主な菌にして、酸敗に関与するとも知られている。このラクトバチルス プランタリウムは乳酸を多量に生成し、pH3.0の酸性環境でも生育が可能である。従って、キムチの発酵末期からは相対的に酸に弱い乳酸菌であるロイコノストック メセンテロイデスの生育は減少されながら酸味の原因菌であるラクトバチルス プランタリウムの生育が増加され、これによりキムチの淡泊でこくのある味が失われるようになる。従って、キムチ内のロイコノストック メセンテロイデスの生育を貯蔵期間の間維持させ、キムチの淡泊でサッパリした味を再現することが品質と味の良いキムチが生産できる主要関鍵と言える。
【０００４】
さらに、キムチ発酵により生成されるマンニトールは、キムチ原料に由来する果糖がマンニトール ジヒドロゲナーゼ(Mannitol dehydrogenase)により、キムチ熟成適期以後に生成されるものにして、キムチにさわやかでまろやかな甘みを与える反面、キムチが過度に酸っぱくなる現象を抑制し、キムチの酸臭と酸味を減少させる効果があるものと知られている(Hawer W.D., Ahn H.S. Report of Korea Food Research Institute, S9-3, Kang S.C., Yun J.W., Ro T.W., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 11(2), 1996)。
従って、最近ではキムチから由来する乳酸菌を分離し、キムチ製造の際スターター(starter)として添加することにより、キムチの味と発酵の調節を試みる研究等が多く進められている。特に、ロイコノストック メセンテロイデスを利用してキムチの品質を向上させようとする研究が継続して進められている。大韓民国登録特許第1989-4894号に次亜塩素酸ナトリウムとロイコノストック メセンテロイデスを添加して酸敗が抑制され、保存性が延長されたキムチを製造する方法が開示された。さらに、大韓民国登録特許第0181009号にロイコノストック パラメセンテロイデスとロイコノストック メセンテロイデスを混合添加することにより、味が良くなるばかりでなくラクトバチルス属菌株の生育を抑制して酸敗が遅延されるようにしたキムチの製造方法が開示された。しかしながら、ロイコノストック メセンテロイデスは耐酸性が弱いことからキムチの発酵が漸次進行されながらその数が減少され、キムチの新鮮な味を持続的に維持することができないという問題点がある。
【０００５】
このような問題点を克服する為に、大韓民国特許第1996-1940号ではロイコノストック属菌株の耐酸性を向上させる為、ロイコノストック属菌株を紫外線処理して耐酸性変異菌株を製造し、これをキムチ製造の際スターターとして添加した結果、キムチの官能性を向上させ、キムチの酸敗を遅延させた。しかしながら、このような耐酸性変異菌株を添加して製造したキムチは味が良く酸敗は遅延されたものの、キムチの酸味を出す主原因菌でありながら強力な耐酸性菌株であるラクトバチルス プランタリウムの生育が抑制されるのは見当たらなかった。
これにより、キムチの淡泊でサッパリした味を長く維持させ得る乳酸菌スターターに対する開発が切実に要望されている実情である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的はマンニトール生成能が優れた耐酸性キムチ乳酸菌スターター及びその用途を提供することである。
【０００７】
前記のような目的を達成する為、本発明はpH3.5-5.0において耐酸性を有し、マンニトール生成能が優れたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(寄託番号:KCTC 10882BP)を提供する。
さらに、本発明は前記菌株又はその培養液を含む食品添加用組成物を提供する。
さらには、本発明は前記菌株又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を提供する点に特徴がある。
本発明ではキムチの味が最も良い時、生育される耐酸性が優れた乳酸菌を分離し、前記分離された乳酸菌を果糖が添加された培地で自然改良し、耐酸性と共にマンニトール生成能が優れた新菌株を得た。前記菌株を同定した結果、ロイコノストック メセンテロイデスに属することを確認することができた。前記菌株をロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と命名し、前記菌株をブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行(Korean Collection for Type Culture)（大韓民国大田市儒城区魚恩洞52番地韓国生命工学研究院）に2005年12月14日付で寄託番号KCTC 10882BPで寄託した。前記寄託物は登録特許(issued patent)の全期間中韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行で生きている状態で維持され、寄託物管理法の規定により無制限で非商業的用途の為全ての人(any person or entity)が入手できる。
【０００９】
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512はpH3.5-5で耐酸性を示す。一般的なロイコノストック メセンテロイデスが酸性条件、特に、pH4.0以下で増殖が急激に低下するものの、本発明の乳酸菌はpH3.5の酸性条件においても、活発に生育して耐酸性の強いものとして表れた（表３参照）。
さらに、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は優れたマンニトール生成能を有する（表１参照）。特に本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、従来マンニトール生成能が優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(N.V. Weymarn, M. Hujanen, M. Leisola,Process Biochemistry, 37, 1207-1213, 2002)に比べて、糖含有培地で30%程度高めのマンニトール生成能を示す（図１参照）。
【００１０】
このような特性を有する本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液はキムチ、飲料、離乳食等の食品に対する食品添加用組成物（食品添加剤）として用いられ得る。本発明に伴う食品添加用組成物は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液以外に必要に応じて担体、賦形剤、保存剤、香料等の一般的な食品添加用組成物に用いられる成分等が追加して含まれ得る。さらに、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、発酵製品製造の為のスターター(starter)として用いられる。前記発酵製品は発酵生食製品、チーズ、キムチ等を含む。本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512、又はその培養液を利用した発酵製品は当業界に公知された通常の方法により製造できる。例えば、発酵生食製品の場合には、玄米と鳩麦等の穀類粉末に本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、それを含む2-3種の混合乳酸菌を処理して適正温度で発酵させ、大豆、糯米、黍等の多様な農産物を、栄養的な均衡と嗜好性が優れるように適切に配合して製造できる。特に、本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液を添加してキムチが製造できる。好ましくは塩漬けした白菜に唐辛子粉、ニンニク、生姜、葱、千切大根、砂糖のような一般的なキムチ薬味等を混合した後、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液を添加してキムチが製造できる。
【００１１】
本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチは、酸度増加速度が緩慢であるばかりでなく（図２参照）、キムチ内のマンニトール含量が高いことからキムチが熟成された以後、酸臭と酸味が薄く、全般的な官能評価が優れたものとして示された（図３及び表５参照）。特に、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512はキムチに添加された場合、キムチより優占種（dominant species）として発酵を主導する。従って、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造されたキムチは酸度増加速度が緩慢な為、キムチの適正熟成度（酸度0.4-0.8%）を長い間維持できる。さらに、マンニトールの生成量が高く、淡泊でサッパリした味を出すばかりでなく、酸味が抑制され、その味を長期間保存できる特徴がある。
【００１２】
本発明において、前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、これを破砕した細胞壁分画(cell wall fraction)、生菌、死菌、乾燥菌の形態で用いられる。さらに、本発明で前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液は、液体培地で培養した培養液自体、これを濾過又は遠心分離して菌株を除去した濾液（遠心分離した上澄液）を含む。さらに、前記培養液はこれを乾燥（例：凍結乾燥）後、粉末化したものも含まれる。
【００１３】
本発明の乳酸菌を利用してキムチを製造する場合、菌自体を直接キムチに添加することもできるものの、好ましくは、前記菌の培養液を添加することもできる。本発明のキムチ製造の際、用いられるロイコノストック メセンテロイデス DRCO512の培養液は、前記菌株をMRSブロス(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)に１次前培養する段階；１次前培養された前記菌株を滅菌された白菜汁に0.5-1.0%(v/v)接種後、25-30℃で18-24時間２次前培養する段階；及び前記２次前培養液を滅菌された白菜汁に0.5-1.0%(v/v)接種後、25-30℃で18-24時間の間本培養する段階を経て、製造されるのが好ましい。さらに、前記白菜汁は次のような方法により製造されるのが好ましい：塩漬け白菜を粉砕搾汁後、効果的な菌株の生育の為に、塩濃度を2.0-3.0%、好ましくは2.5%に調整する。以後、ブドウ糖を1.0-3.0%(w/v)、好ましくは1.0%(w/v)添加後滅菌する。このように製造されたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液は、キムチ全体の重量に対して0.5-3重量%で添加することが好ましい。前記においてロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液が、キムチ全体の重量に対して0.5重量%未満で添加されると、菌株による効果は微々たるものであり、3重量%を超過して添加すると、キムチの風味が低下してキムチが過熟成する問題点が発生することもあって、前記の範囲で添加することが好ましい。最も好ましくは１重量%添加することもできる。
【００１４】
本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は通常的なロイコノストック属微生物の培養方法により大量に培養することができる。培養培地としては炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地を用いることができ、例えば、MRS(Man-Rogosa-Sharp)培地、又はキムチ培地を用いることができる。前記キムチ培地は熟成されたキムチ、好ましくはキムチ製造後24時間の間4℃で熟成されたキムチを粉砕搾汁後、滅菌して使用することができる。微生物の培養は通常のロイコノストック属微生物の培養条件の元で可能であり、例えば、20℃乃至40℃で10時間乃至40時間程度培養できる。より好ましくは37℃で18時間程度培養するのが好ましい。培養液中の培養培地を除去し濃縮された菌体のみを回収する為に、遠心分離又は濾過過程を経ることもあり、このような段階は当業者が必要に応じて行える。濃縮された菌体は通常的な方法により冷凍(frozen)するか又は冷凍乾燥(lyophilized)してその活性を失わないように保存できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
〈実施例１〉
耐酸性及びマンニトール生成が優れた乳酸菌の製造
〈1-1〉乳酸菌分離キムチ試料の製造及びそれより乳酸菌の分離
通常的なキムチの製造方法により製造された多種類のキムチ等を対象に、官能評価を実施して最も味の良いものとして評価されるキムチを選択した。前記キムチを-1℃の低温で熟成させながら官能評価を実施し、最も風味の優れた時点のキムチを乳酸菌分離キムチ試料として用いた。前記キムチ試料を0.85%食塩水で10倍希釈し、0.1mlずつPESアガ培地(Phenylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, Phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)のプレートに接種後ガラス棒で塗抹した。以後、プレートを25℃の恒温培養器で１日間培養した。生成されたそれぞれのコロニーをPESアガプレートに画線接種(streakinoculated)し、25℃で１日間培養して乳酸菌コロニー等を分離した。
【００１７】
〈1-2〉耐酸性乳酸菌の選別
前記実施例〈1-1〉で分離された乳酸菌コロニー等を、乳酸(lactic acid)でpH3.0、3.5、4.0、5.0にそれぞれ調整したMRSブロス(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)5mlにそれぞれ接種した。25℃で72時間培養しながら生育有無を観察して前記pH範囲でも最も生育が活発な耐酸性菌株を選別した。選別された耐酸性乳酸菌はpH3.5-5.0で生育が活発で耐酸性が強いものとして示された。
【００１８】
〈1-3〉マンニトール生成量が優れた菌株への改良
前記実施例〈1-2〉で選別された耐酸性乳酸菌をマンニトール生成量の優れた菌株に改良する為、前記乳酸菌をMRSブロス5mlに２回に亙り継代培養した。以後、前記乳酸菌を果糖が1-9%(w/v)までそれぞれ添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. 1L)5mlに1.0%(v/v)で接種して25℃で24時間培養した。以後、生成されたマンニトールの量を測定してマンニトールが多く生成された順に1-5位までの菌株を選別した。選別された５種の菌株をさらに1-9%(w/v)の果糖が添加された培地にそれぞれ再接種して再度マンニトールの生成量を測定した。マンニトール生成量の測定は次のような方法で行った：各培養液を13,000rpm, 3分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その内でマンニトール生成量が多い1〜3位までの菌株を再選別し、これらを再度1-9%(w/v)の果糖が添加された培地に２次再接種してマンニトールの生成量を測定した。その内6%(w/v)の果糖が添加された培地で、マンニトール生成量が最も高く維持されるものとして示された。従って、6%(w/v)の果糖が添加された培地で、前記菌株等を10回にわたり継代培養し、この内マンニトール生成量が最も優れた１種の菌株を最終選抜した（表１参照）。
【００１９】
【表１】
【００２０】
〈実施例 2〉
前記実施例１で分離及び改良した乳酸菌の同定
〈2-1〉バージスの分類細菌学マニュアルによる分析
前記実施例１で最終選抜された乳酸菌（改良菌株２）を単一コロニーに分離し、バージスの分類細菌学マニュアル(Bergy’s manual of systematic bacteriology)に準じて形態学的及び生化学的特性を調査してグラム染色を行った。その結果、前記分離された菌株はグラム陽性菌株であり、桿菌の形態を有していることが確認できた。
【００２１】
〈2-2〉APIシステムを利用した分析
前記菌株をAPIシステム(API system; La Balme-les-Grottes, France)で同定した。先ず、滅菌白金で菌コロニーを採り、滅菌蒸留水2mlに浮遊させた。さらに、前記菌液を滅菌蒸留水5mlにAPI 50CHキット(BioMerieux, France)より提供されるマックファランド標準溶液No.2(MccFaland Standard Solution No.2)の濃度で菌液を浮遊させた。前記浮遊液をAPI 50CHキットの液体培地に添加して均質化させ、API 50CHキットの50個各チューブに200μlずつ接種した。ミネラルオイルでチューブの上を覆った後、30℃で48時間培養させた。前記培養液をAPIシステムで分析して49種の炭水化物発酵パターンを確認し、その結果をATB同定コンピュータシステムに入力して同定した。その結果、前記実施例１で分離及び改良した乳酸菌は、下記表２の炭水化物発酵パターンを有しているロイコノストック メセンテロイデスに属する菌株であることが判明された。
【００２２】
【表２】
【００２３】
〈2-3〉16S rDNA塩基配列分析
当業界に公知された通常的な方法により、前記選別された乳酸菌の16S rDNAの塩基配列を分析した。その結果、前記乳酸菌の16S rDNA塩基配列はロイコノストック メセンテロイデスの16S rDNA塩基配列と99%同一であることが確認できた（結果未図示）。
従って、本発明者等は前記乳酸菌を“ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512”と命名し、これを韓国生命工学研究院生物資源センター遺伝子銀行に2005年12月14日付で寄託した（寄託番号：KCTC 10882BP）。
【００２４】
〈実施例３〉
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌との耐酸性程度比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌との耐酸性程度を比較した。従来乳酸菌（対照群）には、ロイコノストック メセンテロイデス(KCCM-11325)とロイコノストック属菌株(KFCC-10774)を用いた。
各乳酸菌を乳酸でpH3.2、3.5、4.0、5.0に調整したMRSブロス10mlにそれぞれ接種し、25℃で72時間培養しながら生育有無を観察した。その結果を下記表３に示した。
【００２５】
【表３】
【００２６】
前記表３に示した通り、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は従来ロイコノストック属菌株に比べて耐酸性が著しく強く、pH3.5-5.0で生育が活発に維持されることが確認された。
【００２７】
〈実施例４〉
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌とのマンニトール生成量比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌とのマンニトール生成量を比較した。従来乳酸菌（対照群）ではマンニトール生成能が優れていると知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291と、キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3及びOH-20を用いた。前記乳酸菌等を2%(w/v)果糖が添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. IL)5mlに1.0%(v/v)で接種して10℃で5〜10日間培養した。以後前記実施例〈1-3〉に記載された方法と同一な方法で培養液内マンニトール生成量を測定した。
その結果、図１に示された通り、本発明の乳酸菌は従来のキムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス菌株等(CH-3及びOH-20)に比べて著しく高い水準でマンニトールを生成した。さらに、本発明の乳酸菌は従来のマンニトール生成能が優れていると知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291に比べてもさらに高い水準でマンニトールを生成した。
【００２８】
〈実施例５〉
ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用したキムチの製造及び製造されたキムチの特性分析
【００２９】
〈5-1〉ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512のキムチ添加培養液製造
先ず、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512をMRSブロス5mlに接種し、25℃で24時間１次前培養を行った。以降、前記１次前培養を白菜汁に1.0%(v/v)接種し、25℃で24時間２次前培養を行った。この際前記白菜汁は下記のような方法で製造した：塩漬け白菜をブレンダーで粉砕、搾汁後再製塩を用いて塩度が2.5%になるように調整した。ここにブドウ糖を1.0%(w/v)添加後、滅菌して白菜汁を製造した。以後、前記２次前培養液を再度滅菌された白菜汁に1.0%接種し、25℃で18時間本培養をした。
【００３０】
〈5-2〉キムチの製造
先ず、白菜を塩漬けして白菜の塩度が2.3%となるようにした。塩漬け白菜（82.5重量%）に唐辛子粉（2.5重量%）、ニンニク（2重量%）、生姜（0.5重量%）、太葱（2重量%）、千切り大根(9重量%）、砂糖(0.5重量%）のキムチ薬味を混合した。以後、スターターとして前記実施例〈5-1〉で製造した本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ全体の重量に対して1.0%(w/w)で添加した。この際、陽性対照群としてはマンニトール生成能が、優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(陽性対照群１）、さらに、従来キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3(陽性対照群２）とロイコノストック メセンテロイデス OH-3(陽性対照群３）をそれぞれ用いた。さらに、陰性対照群には乳酸菌スターターを添加せずに同一な方法で製造したキムチを用いた。以後、製造された各キムチをキムチの一般的な熟成温度である10℃で貯蔵しながら酸度、乳酸菌数及びマンニトール生成量を測定して官能評価を実施した。
【００３１】
〈5-3〉キムチの酸度測定
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象に酸度を測定して比較した。各キムチ100gを磨砕し、ガーゼで濾過してキムチ液を製造した。キムチ液20mlを0.1N NaOHを用いてpH8.1となるように中和滴定後、消費されたNaOHの量を下記の式により乳酸含量(%)で換算して酸度を求めた。
酸度(%)=｛0.00908×F(0.1N NaOH factor)×0.1N NaOH 添加量｝/試料の重さ
その結果、図２に示した通り、熟成初期には各キムチの酸度の差がさほど大きくはなかったものの、熟成期間が長引く程酸度の差が開いた。本発明に伴う乳酸菌を利用して製造されたキムチの場合、酸度増加速度が異なるキムチに比べて緩慢であることが見られた。さらに、本発明の乳酸菌が添加された熟成20日以降にもキムチの適正熟成度（酸度0.4-0.8%）を維持した。反面、他の乳酸菌が添加されたキムチ等は全て熟成20日目に酸度0.8%を超過し、25日目には酸度がさらに増加するものとして示された。マンニトール生成能が優れたものとして知られた、従来のロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチの場合（陽性対照群１）には初期酸度は最も低かったものの、5日目以降には急上昇して20日目には適正熟成度を外れた。
【００３２】
〈5-4〉乳酸菌数測定
前記実施例〈5-2〉で製造された各キムチの乳酸菌数を測定した。10℃で10日間熟成させた各キムチを0.85%食塩水で10倍に希釈してキムチ希釈液を製造した。以降、総乳酸菌数の測定の為には、前記キムチ希釈液0.1mlずつをMRSアガ培地プレートに接種後ガラス棒で塗抹した。さらに、ロイコノストック菌数の測定の為には前記キムチ希釈液0.1mlずつPESアガ培地(tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)プレートに接種した後、ガラス棒で塗抹した。キムチ希釈液が塗抹された各アガプレートを25℃の恒温培養器で２日間培養した。生成された集落の数をそれぞれの菌数で計数した。さらに、優占率(%)は総乳酸菌菌数の内乳酸菌スターター（PESアガプレートに表れるロイコノストック属菌株の内、乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致する菌）の菌数の比率で計算した
(下記式参照）。その結果を下記表４に示した。
優占率(%)=(乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致するロイコノストック属菌株の数／総乳酸菌数）×100
【００３３】
【表４】
【００３４】
その結果、前記表４に示された通り、本発明の乳酸菌をスターターとして添加して製造されたキムチの場合、従来乳酸菌等を添加して製造されたキムチ等（陽性対照群１乃至３）に比べてロイコノストック属菌株の数が著しく多かった。さらに、優占率を調査した結果、本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチから本発明に伴うスターター乳酸菌の優占率が72.5%と最も高く表れた。このように本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は耐酸性が強い為、生育が優れているばかりでなく、キムチ内における優占種として発酵を主導してキムチの新鮮な味を持続的に維持させることができる。
【００３５】
〈5-5〉マンニトール含量測定
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象にマンニトール含量を測定して比較した。前記実施例〈5-2〉に記載された方法と同一な方法で各キムチからキムチ液を製造し、これを13,000rpmで３分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その結果、図３に示した通り、本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用して製造されたキムチのマンニトール含量が最も高く、これは熟成時間の経過に伴い増加するものとして表れた。本発明の菌株を利用して製造されたキムチは従来マンニトール生成能が優れているとして知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチ（陽性対照群１）よりもさらに高いマンニトール含量を示した。
【００３６】
〈5-6〉官能検査
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチ（酸度0.6-0.7%）に対して訓練された検査要員50名により官能検査を行った。5点を満点に嗜好度尺度法により実施し、有意性検証はt-testにより実施した。その結果を下記表５に示した。
【００３７】
【表５】
【００３８】
前記表５に示した通り、本発明の乳酸菌が添加されたキムチが対照群キムチ等に比べて、全般的に最も優れたものとして評価された。特に本発明により製造されたキムチは淡泊な味が優れ、酸臭がより薄く酸味の質が極めてまろやかなものとして評価された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
前記にて記述した通り、本発明で提供する乳酸菌は耐酸性とマンニトール生成能が優れている。従って、本発明の乳酸菌は食品添加用組成物及びキムチのスターターとして有用に用いられる。本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチは、従来のキムチに比べて適正熟成度が長期間維持され、淡泊な味が優れ、かつ、酸臭が薄く、酸味の質が極めてまろやかで官能特性が優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は糖含有培地で本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌のマンニトール生成量を比較した結果を示した図である。 DRC0512：本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512 ATCC12291：ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291 CH-3：ロイコノストック メセンテロイデス CH-3 OH-20：ロイコノストック メセンテロイデス OH-20
【図２】図２は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ、従来公知された乳酸菌を添加して製造したキムチ及び乳酸菌を添加せずに製造されたキムチの熟成期間の経過に伴う酸度変化を比較して示したグラフである。 −◆−：本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ −■−：ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を添加して製造したキムチ −―−：ロイコノストック メセンテロイデス CH-3を添加して製造したキムチ −●−：ロイコノストック メセンテロイデス OH-20を添加して製造したキムチ −▲−：乳酸菌を添加せずに製造したキムチ
【図３】図３は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ、従来公知された乳酸菌を添加して製造したキムチ及び乳酸菌を添加せずに製造したキムチのマンニトール含量変化を比較して示したグラフである。 −◆−:本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ −■−:ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を添加して製造したキムチ −―−:ロイコノストック メセンテロイデス CH-3を添加して製造したキムチ −●−:ロイコノストック メセンテロイデス OH-20を添加して製造したキムチ −▲−:乳酸菌を添加せずに製造したキムチ
【技術分野】
【０００１】
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性乳酸菌及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キムチは主原料である塩漬白菜に唐辛子粉、ニンニク、生姜、葱及び大根等を混合した後、製品の保存性と熟成度を確保する為、低温で発酵させた食品にして、韓国固有の代表的な伝統発酵食品である。1990年代まではキムチは主に家庭で自己的に生産されてきた食品であったが、急速な経済成長と国民所得の増加、産業構造及び生活環境の変化により1990年代以降本格的に商品化され始めた。商品化されているキムチの場合、キムチの発酵を主導し、かつキムチ特有の味を出す自然発生的な菌株等が原材料の産地、季節、発酵条件によって異なり、商品キムチの品質や味を望む状態で一定して維持することが極めて難しかった。従って、品質と味が一定していながら優れた商品キムチに対する開発が要望された。
【０００３】
キムチの淡泊でサッパリした味を出す主要因はキムチ乳酸菌の内、異常乳酸発酵菌(heterofermentative lactic acid bacteria)であるロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides) がキムチ熟成の際増加するからである(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci.Technol., 27(4):495-505,1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci.Technol., 27(4):506-515, 1995)。このロイコノストック メセンテロイデスはキムチ製造の際、初期から生育を始めて二酸化炭素、乳酸、酢酸、エタノール及びマンニトール等の代謝産物を生産することにより、キムチを複合的で独特な風味を有した状態に発酵させる。さらに、生産された二酸化炭素をしてキムチの内部を嫌気的条件に維持させ、好気性細菌の繁殖を強く抑制することにより、正常的なキムチ発酵となるようにする。しかしながら、キムチの発酵中期になると、ロイコノストック メセンテロイデスの数が急激に減少し、正常乳酸発酵菌(homofermentative lactic acid bacteria)であるラクトバチルス プランタリウム(Lactobacillus plantarium)が旺盛に増殖するようになる。ラクトバチルス プランタリウムはキムチの酸味を呈する主な菌にして、酸敗に関与するとも知られている。このラクトバチルス プランタリウムは乳酸を多量に生成し、pH3.0の酸性環境でも生育が可能である。従って、キムチの発酵末期からは相対的に酸に弱い乳酸菌であるロイコノストック メセンテロイデスの生育は減少されながら酸味の原因菌であるラクトバチルス プランタリウムの生育が増加され、これによりキムチの淡泊でこくのある味が失われるようになる。従って、キムチ内のロイコノストック メセンテロイデスの生育を貯蔵期間の間維持させ、キムチの淡泊でサッパリした味を再現することが品質と味の良いキムチが生産できる主要関鍵と言える。
【０００４】
さらに、キムチ発酵により生成されるマンニトールは、キムチ原料に由来する果糖がマンニトール ジヒドロゲナーゼ(Mannitol dehydrogenase)により、キムチ熟成適期以後に生成されるものにして、キムチにさわやかでまろやかな甘みを与える反面、キムチが過度に酸っぱくなる現象を抑制し、キムチの酸臭と酸味を減少させる効果があるものと知られている(Hawer W.D., Ahn H.S. Report of Korea Food Research Institute, S9-3, Kang S.C., Yun J.W., Ro T.W., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 11(2), 1996)。
従って、最近ではキムチから由来する乳酸菌を分離し、キムチ製造の際スターター(starter)として添加することにより、キムチの味と発酵の調節を試みる研究等が多く進められている。特に、ロイコノストック メセンテロイデスを利用してキムチの品質を向上させようとする研究が継続して進められている。大韓民国登録特許第1989-4894号に次亜塩素酸ナトリウムとロイコノストック メセンテロイデスを添加して酸敗が抑制され、保存性が延長されたキムチを製造する方法が開示された。さらに、大韓民国登録特許第0181009号にロイコノストック パラメセンテロイデスとロイコノストック メセンテロイデスを混合添加することにより、味が良くなるばかりでなくラクトバチルス属菌株の生育を抑制して酸敗が遅延されるようにしたキムチの製造方法が開示された。しかしながら、ロイコノストック メセンテロイデスは耐酸性が弱いことからキムチの発酵が漸次進行されながらその数が減少され、キムチの新鮮な味を持続的に維持することができないという問題点がある。
【０００５】
このような問題点を克服する為に、大韓民国特許第1996-1940号ではロイコノストック属菌株の耐酸性を向上させる為、ロイコノストック属菌株を紫外線処理して耐酸性変異菌株を製造し、これをキムチ製造の際スターターとして添加した結果、キムチの官能性を向上させ、キムチの酸敗を遅延させた。しかしながら、このような耐酸性変異菌株を添加して製造したキムチは味が良く酸敗は遅延されたものの、キムチの酸味を出す主原因菌でありながら強力な耐酸性菌株であるラクトバチルス プランタリウムの生育が抑制されるのは見当たらなかった。
これにより、キムチの淡泊でサッパリした味を長く維持させ得る乳酸菌スターターに対する開発が切実に要望されている実情である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的はマンニトール生成能が優れた耐酸性キムチ乳酸菌スターター及びその用途を提供することである。
【０００７】
前記のような目的を達成する為、本発明はpH3.5-5.0において耐酸性を有し、マンニトール生成能が優れたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(寄託番号:KCTC 10882BP)を提供する。
さらに、本発明は前記菌株又はその培養液を含む食品添加用組成物を提供する。
さらには、本発明は前記菌株又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法を提供する。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はマンニトール生成能が優れた耐酸性ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を提供する点に特徴がある。
本発明ではキムチの味が最も良い時、生育される耐酸性が優れた乳酸菌を分離し、前記分離された乳酸菌を果糖が添加された培地で自然改良し、耐酸性と共にマンニトール生成能が優れた新菌株を得た。前記菌株を同定した結果、ロイコノストック メセンテロイデスに属することを確認することができた。前記菌株をロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と命名し、前記菌株をブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行(Korean Collection for Type Culture)（大韓民国大田市儒城区魚恩洞52番地韓国生命工学研究院）に2005年12月14日付で寄託番号KCTC 10882BPで寄託した。前記寄託物は登録特許(issued patent)の全期間中韓国生命工学院生物資源センター遺伝子銀行で生きている状態で維持され、寄託物管理法の規定により無制限で非商業的用途の為全ての人(any person or entity)が入手できる。
【０００９】
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512はpH3.5-5で耐酸性を示す。一般的なロイコノストック メセンテロイデスが酸性条件、特に、pH4.0以下で増殖が急激に低下するものの、本発明の乳酸菌はpH3.5の酸性条件においても、活発に生育して耐酸性の強いものとして表れた（表３参照）。
さらに、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は優れたマンニトール生成能を有する（表１参照）。特に本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、従来マンニトール生成能が優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(N.V. Weymarn, M. Hujanen, M. Leisola,Process Biochemistry, 37, 1207-1213, 2002)に比べて、糖含有培地で30%程度高めのマンニトール生成能を示す（図１参照）。
【００１０】
このような特性を有する本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液はキムチ、飲料、離乳食等の食品に対する食品添加用組成物（食品添加剤）として用いられ得る。本発明に伴う食品添加用組成物は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液以外に必要に応じて担体、賦形剤、保存剤、香料等の一般的な食品添加用組成物に用いられる成分等が追加して含まれ得る。さらに、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、発酵製品製造の為のスターター(starter)として用いられる。前記発酵製品は発酵生食製品、チーズ、キムチ等を含む。本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512、又はその培養液を利用した発酵製品は当業界に公知された通常の方法により製造できる。例えば、発酵生食製品の場合には、玄米と鳩麦等の穀類粉末に本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、それを含む2-3種の混合乳酸菌を処理して適正温度で発酵させ、大豆、糯米、黍等の多様な農産物を、栄養的な均衡と嗜好性が優れるように適切に配合して製造できる。特に、本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液を添加してキムチが製造できる。好ましくは塩漬けした白菜に唐辛子粉、ニンニク、生姜、葱、千切大根、砂糖のような一般的なキムチ薬味等を混合した後、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又は、その培養液を添加してキムチが製造できる。
【００１１】
本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチは、酸度増加速度が緩慢であるばかりでなく（図２参照）、キムチ内のマンニトール含量が高いことからキムチが熟成された以後、酸臭と酸味が薄く、全般的な官能評価が優れたものとして示された（図３及び表５参照）。特に、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512はキムチに添加された場合、キムチより優占種（dominant species）として発酵を主導する。従って、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造されたキムチは酸度増加速度が緩慢な為、キムチの適正熟成度（酸度0.4-0.8%）を長い間維持できる。さらに、マンニトールの生成量が高く、淡泊でサッパリした味を出すばかりでなく、酸味が抑制され、その味を長期間保存できる特徴がある。
【００１２】
本発明において、前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は、これを破砕した細胞壁分画(cell wall fraction)、生菌、死菌、乾燥菌の形態で用いられる。さらに、本発明で前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液は、液体培地で培養した培養液自体、これを濾過又は遠心分離して菌株を除去した濾液（遠心分離した上澄液）を含む。さらに、前記培養液はこれを乾燥（例：凍結乾燥）後、粉末化したものも含まれる。
【００１３】
本発明の乳酸菌を利用してキムチを製造する場合、菌自体を直接キムチに添加することもできるものの、好ましくは、前記菌の培養液を添加することもできる。本発明のキムチ製造の際、用いられるロイコノストック メセンテロイデス DRCO512の培養液は、前記菌株をMRSブロス(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)に１次前培養する段階；１次前培養された前記菌株を滅菌された白菜汁に0.5-1.0%(v/v)接種後、25-30℃で18-24時間２次前培養する段階；及び前記２次前培養液を滅菌された白菜汁に0.5-1.0%(v/v)接種後、25-30℃で18-24時間の間本培養する段階を経て、製造されるのが好ましい。さらに、前記白菜汁は次のような方法により製造されるのが好ましい：塩漬け白菜を粉砕搾汁後、効果的な菌株の生育の為に、塩濃度を2.0-3.0%、好ましくは2.5%に調整する。以後、ブドウ糖を1.0-3.0%(w/v)、好ましくは1.0%(w/v)添加後滅菌する。このように製造されたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液は、キムチ全体の重量に対して0.5-3重量%で添加することが好ましい。前記においてロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液が、キムチ全体の重量に対して0.5重量%未満で添加されると、菌株による効果は微々たるものであり、3重量%を超過して添加すると、キムチの風味が低下してキムチが過熟成する問題点が発生することもあって、前記の範囲で添加することが好ましい。最も好ましくは１重量%添加することもできる。
【００１４】
本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は通常的なロイコノストック属微生物の培養方法により大量に培養することができる。培養培地としては炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地を用いることができ、例えば、MRS(Man-Rogosa-Sharp)培地、又はキムチ培地を用いることができる。前記キムチ培地は熟成されたキムチ、好ましくはキムチ製造後24時間の間4℃で熟成されたキムチを粉砕搾汁後、滅菌して使用することができる。微生物の培養は通常のロイコノストック属微生物の培養条件の元で可能であり、例えば、20℃乃至40℃で10時間乃至40時間程度培養できる。より好ましくは37℃で18時間程度培養するのが好ましい。培養液中の培養培地を除去し濃縮された菌体のみを回収する為に、遠心分離又は濾過過程を経ることもあり、このような段階は当業者が必要に応じて行える。濃縮された菌体は通常的な方法により冷凍(frozen)するか又は冷凍乾燥(lyophilized)してその活性を失わないように保存できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
〈実施例１〉
耐酸性及びマンニトール生成が優れた乳酸菌の製造
〈1-1〉乳酸菌分離キムチ試料の製造及びそれより乳酸菌の分離
通常的なキムチの製造方法により製造された多種類のキムチ等を対象に、官能評価を実施して最も味の良いものとして評価されるキムチを選択した。前記キムチを-1℃の低温で熟成させながら官能評価を実施し、最も風味の優れた時点のキムチを乳酸菌分離キムチ試料として用いた。前記キムチ試料を0.85%食塩水で10倍希釈し、0.1mlずつPESアガ培地(Phenylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, Phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)のプレートに接種後ガラス棒で塗抹した。以後、プレートを25℃の恒温培養器で１日間培養した。生成されたそれぞれのコロニーをPESアガプレートに画線接種(streakinoculated)し、25℃で１日間培養して乳酸菌コロニー等を分離した。
【００１７】
〈1-2〉耐酸性乳酸菌の選別
前記実施例〈1-1〉で分離された乳酸菌コロニー等を、乳酸(lactic acid)でpH3.0、3.5、4.0、5.0にそれぞれ調整したMRSブロス(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 20g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)5mlにそれぞれ接種した。25℃で72時間培養しながら生育有無を観察して前記pH範囲でも最も生育が活発な耐酸性菌株を選別した。選別された耐酸性乳酸菌はpH3.5-5.0で生育が活発で耐酸性が強いものとして示された。
【００１８】
〈1-3〉マンニトール生成量が優れた菌株への改良
前記実施例〈1-2〉で選別された耐酸性乳酸菌をマンニトール生成量の優れた菌株に改良する為、前記乳酸菌をMRSブロス5mlに２回に亙り継代培養した。以後、前記乳酸菌を果糖が1-9%(w/v)までそれぞれ添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. 1L)5mlに1.0%(v/v)で接種して25℃で24時間培養した。以後、生成されたマンニトールの量を測定してマンニトールが多く生成された順に1-5位までの菌株を選別した。選別された５種の菌株をさらに1-9%(w/v)の果糖が添加された培地にそれぞれ再接種して再度マンニトールの生成量を測定した。マンニトール生成量の測定は次のような方法で行った：各培養液を13,000rpm, 3分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その内でマンニトール生成量が多い1〜3位までの菌株を再選別し、これらを再度1-9%(w/v)の果糖が添加された培地に２次再接種してマンニトールの生成量を測定した。その内6%(w/v)の果糖が添加された培地で、マンニトール生成量が最も高く維持されるものとして示された。従って、6%(w/v)の果糖が添加された培地で、前記菌株等を10回にわたり継代培養し、この内マンニトール生成量が最も優れた１種の菌株を最終選抜した（表１参照）。
【００１９】
【表１】
【００２０】
〈実施例 2〉
前記実施例１で分離及び改良した乳酸菌の同定
〈2-1〉バージスの分類細菌学マニュアルによる分析
前記実施例１で最終選抜された乳酸菌（改良菌株２）を単一コロニーに分離し、バージスの分類細菌学マニュアル(Bergy’s manual of systematic bacteriology)に準じて形態学的及び生化学的特性を調査してグラム染色を行った。その結果、前記分離された菌株はグラム陽性菌株であり、桿菌の形態を有していることが確認できた。
【００２１】
〈2-2〉APIシステムを利用した分析
前記菌株をAPIシステム(API system; La Balme-les-Grottes, France)で同定した。先ず、滅菌白金で菌コロニーを採り、滅菌蒸留水2mlに浮遊させた。さらに、前記菌液を滅菌蒸留水5mlにAPI 50CHキット(BioMerieux, France)より提供されるマックファランド標準溶液No.2(MccFaland Standard Solution No.2)の濃度で菌液を浮遊させた。前記浮遊液をAPI 50CHキットの液体培地に添加して均質化させ、API 50CHキットの50個各チューブに200μlずつ接種した。ミネラルオイルでチューブの上を覆った後、30℃で48時間培養させた。前記培養液をAPIシステムで分析して49種の炭水化物発酵パターンを確認し、その結果をATB同定コンピュータシステムに入力して同定した。その結果、前記実施例１で分離及び改良した乳酸菌は、下記表２の炭水化物発酵パターンを有しているロイコノストック メセンテロイデスに属する菌株であることが判明された。
【００２２】
【表２】
【００２３】
〈2-3〉16S rDNA塩基配列分析
当業界に公知された通常的な方法により、前記選別された乳酸菌の16S rDNAの塩基配列を分析した。その結果、前記乳酸菌の16S rDNA塩基配列はロイコノストック メセンテロイデスの16S rDNA塩基配列と99%同一であることが確認できた（結果未図示）。
従って、本発明者等は前記乳酸菌を“ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512”と命名し、これを韓国生命工学研究院生物資源センター遺伝子銀行に2005年12月14日付で寄託した（寄託番号：KCTC 10882BP）。
【００２４】
〈実施例３〉
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌との耐酸性程度比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌との耐酸性程度を比較した。従来乳酸菌（対照群）には、ロイコノストック メセンテロイデス(KCCM-11325)とロイコノストック属菌株(KFCC-10774)を用いた。
各乳酸菌を乳酸でpH3.2、3.5、4.0、5.0に調整したMRSブロス10mlにそれぞれ接種し、25℃で72時間培養しながら生育有無を観察した。その結果を下記表３に示した。
【００２５】
【表３】
【００２６】
前記表３に示した通り、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は従来ロイコノストック属菌株に比べて耐酸性が著しく強く、pH3.5-5.0で生育が活発に維持されることが確認された。
【００２７】
〈実施例４〉
本発明の乳酸菌と従来乳酸菌とのマンニトール生成量比較
本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌とのマンニトール生成量を比較した。従来乳酸菌（対照群）ではマンニトール生成能が優れていると知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291と、キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3及びOH-20を用いた。前記乳酸菌等を2%(w/v)果糖が添加された栄養培地(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g〜90g/D.W. IL)5mlに1.0%(v/v)で接種して10℃で5〜10日間培養した。以後前記実施例〈1-3〉に記載された方法と同一な方法で培養液内マンニトール生成量を測定した。
その結果、図１に示された通り、本発明の乳酸菌は従来のキムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス菌株等(CH-3及びOH-20)に比べて著しく高い水準でマンニトールを生成した。さらに、本発明の乳酸菌は従来のマンニトール生成能が優れていると知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291に比べてもさらに高い水準でマンニトールを生成した。
【００２８】
〈実施例５〉
ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用したキムチの製造及び製造されたキムチの特性分析
【００２９】
〈5-1〉ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512のキムチ添加培養液製造
先ず、本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512をMRSブロス5mlに接種し、25℃で24時間１次前培養を行った。以降、前記１次前培養を白菜汁に1.0%(v/v)接種し、25℃で24時間２次前培養を行った。この際前記白菜汁は下記のような方法で製造した：塩漬け白菜をブレンダーで粉砕、搾汁後再製塩を用いて塩度が2.5%になるように調整した。ここにブドウ糖を1.0%(w/v)添加後、滅菌して白菜汁を製造した。以後、前記２次前培養液を再度滅菌された白菜汁に1.0%接種し、25℃で18時間本培養をした。
【００３０】
〈5-2〉キムチの製造
先ず、白菜を塩漬けして白菜の塩度が2.3%となるようにした。塩漬け白菜（82.5重量%）に唐辛子粉（2.5重量%）、ニンニク（2重量%）、生姜（0.5重量%）、太葱（2重量%）、千切り大根(9重量%）、砂糖(0.5重量%）のキムチ薬味を混合した。以後、スターターとして前記実施例〈5-1〉で製造した本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ全体の重量に対して1.0%(w/w)で添加した。この際、陽性対照群としてはマンニトール生成能が、優れているとして知られたロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291(陽性対照群１）、さらに、従来キムチより分離されたロイコノストック メセンテロイデス CH-3(陽性対照群２）とロイコノストック メセンテロイデス OH-3(陽性対照群３）をそれぞれ用いた。さらに、陰性対照群には乳酸菌スターターを添加せずに同一な方法で製造したキムチを用いた。以後、製造された各キムチをキムチの一般的な熟成温度である10℃で貯蔵しながら酸度、乳酸菌数及びマンニトール生成量を測定して官能評価を実施した。
【００３１】
〈5-3〉キムチの酸度測定
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象に酸度を測定して比較した。各キムチ100gを磨砕し、ガーゼで濾過してキムチ液を製造した。キムチ液20mlを0.1N NaOHを用いてpH8.1となるように中和滴定後、消費されたNaOHの量を下記の式により乳酸含量(%)で換算して酸度を求めた。
酸度(%)=｛0.00908×F(0.1N NaOH factor)×0.1N NaOH 添加量｝/試料の重さ
その結果、図２に示した通り、熟成初期には各キムチの酸度の差がさほど大きくはなかったものの、熟成期間が長引く程酸度の差が開いた。本発明に伴う乳酸菌を利用して製造されたキムチの場合、酸度増加速度が異なるキムチに比べて緩慢であることが見られた。さらに、本発明の乳酸菌が添加された熟成20日以降にもキムチの適正熟成度（酸度0.4-0.8%）を維持した。反面、他の乳酸菌が添加されたキムチ等は全て熟成20日目に酸度0.8%を超過し、25日目には酸度がさらに増加するものとして示された。マンニトール生成能が優れたものとして知られた、従来のロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチの場合（陽性対照群１）には初期酸度は最も低かったものの、5日目以降には急上昇して20日目には適正熟成度を外れた。
【００３２】
〈5-4〉乳酸菌数測定
前記実施例〈5-2〉で製造された各キムチの乳酸菌数を測定した。10℃で10日間熟成させた各キムチを0.85%食塩水で10倍に希釈してキムチ希釈液を製造した。以降、総乳酸菌数の測定の為には、前記キムチ希釈液0.1mlずつをMRSアガ培地プレートに接種後ガラス棒で塗抹した。さらに、ロイコノストック菌数の測定の為には前記キムチ希釈液0.1mlずつPESアガ培地(tryptone 5g, yeast extract 0.5g, sucrose 20g, ammonium sulfate 2g, dipotassium phosphate 1g, magnesium sulfate 0.244g, phenylethyl alcohol 2.5ml, agar 15g/D.W. 1L)プレートに接種した後、ガラス棒で塗抹した。キムチ希釈液が塗抹された各アガプレートを25℃の恒温培養器で２日間培養した。生成された集落の数をそれぞれの菌数で計数した。さらに、優占率(%)は総乳酸菌菌数の内乳酸菌スターター（PESアガプレートに表れるロイコノストック属菌株の内、乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致する菌）の菌数の比率で計算した
(下記式参照）。その結果を下記表４に示した。
優占率(%)=(乳酸菌スターターと形態学的タイプが一致するロイコノストック属菌株の数／総乳酸菌数）×100
【００３３】
【表４】
【００３４】
その結果、前記表４に示された通り、本発明の乳酸菌をスターターとして添加して製造されたキムチの場合、従来乳酸菌等を添加して製造されたキムチ等（陽性対照群１乃至３）に比べてロイコノストック属菌株の数が著しく多かった。さらに、優占率を調査した結果、本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチから本発明に伴うスターター乳酸菌の優占率が72.5%と最も高く表れた。このように本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512は耐酸性が強い為、生育が優れているばかりでなく、キムチ内における優占種として発酵を主導してキムチの新鮮な味を持続的に維持させることができる。
【００３５】
〈5-5〉マンニトール含量測定
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチを対象にマンニトール含量を測定して比較した。前記実施例〈5-2〉に記載された方法と同一な方法で各キムチからキムチ液を製造し、これを13,000rpmで３分間遠心分離し、0.22μmシリンジフィルター(syringe filter)で濾過した。80℃で超純粋 H2O(0.5ml/min)溶媒を用いて濾過された試料20μlをHPLC(High performance liquid chromatography)で分析した。
その結果、図３に示した通り、本発明に伴うロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を利用して製造されたキムチのマンニトール含量が最も高く、これは熟成時間の経過に伴い増加するものとして表れた。本発明の菌株を利用して製造されたキムチは従来マンニトール生成能が優れているとして知られた、ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を利用して製造されたキムチ（陽性対照群１）よりもさらに高いマンニトール含量を示した。
【００３６】
〈5-6〉官能検査
前記実施例〈5-2〉で製造した各キムチ（酸度0.6-0.7%）に対して訓練された検査要員50名により官能検査を行った。5点を満点に嗜好度尺度法により実施し、有意性検証はt-testにより実施した。その結果を下記表５に示した。
【００３７】
【表５】
【００３８】
前記表５に示した通り、本発明の乳酸菌が添加されたキムチが対照群キムチ等に比べて、全般的に最も優れたものとして評価された。特に本発明により製造されたキムチは淡泊な味が優れ、酸臭がより薄く酸味の質が極めてまろやかなものとして評価された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
前記にて記述した通り、本発明で提供する乳酸菌は耐酸性とマンニトール生成能が優れている。従って、本発明の乳酸菌は食品添加用組成物及びキムチのスターターとして有用に用いられる。本発明の乳酸菌を添加して製造されたキムチは、従来のキムチに比べて適正熟成度が長期間維持され、淡泊な味が優れ、かつ、酸臭が薄く、酸味の質が極めてまろやかで官能特性が優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は糖含有培地で本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512と従来乳酸菌のマンニトール生成量を比較した結果を示した図である。 DRC0512：本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512 ATCC12291：ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291 CH-3：ロイコノストック メセンテロイデス CH-3 OH-20：ロイコノストック メセンテロイデス OH-20
【図２】図２は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ、従来公知された乳酸菌を添加して製造したキムチ及び乳酸菌を添加せずに製造されたキムチの熟成期間の経過に伴う酸度変化を比較して示したグラフである。 −◆−：本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ −■−：ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を添加して製造したキムチ −―−：ロイコノストック メセンテロイデス CH-3を添加して製造したキムチ −●−：ロイコノストック メセンテロイデス OH-20を添加して製造したキムチ −▲−：乳酸菌を添加せずに製造したキムチ
【図３】図３は本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ、従来公知された乳酸菌を添加して製造したキムチ及び乳酸菌を添加せずに製造したキムチのマンニトール含量変化を比較して示したグラフである。 −◆−:本発明のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512を添加して製造したキムチ −■−:ロイコノストック シュードメセンテロイデス ATCC12291を添加して製造したキムチ −―−:ロイコノストック メセンテロイデス CH-3を添加して製造したキムチ −●−:ロイコノストック メセンテロイデス OH-20を添加して製造したキムチ −▲−:乳酸菌を添加せずに製造したキムチ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キムチより分離されたpH3.5-5.0で耐酸性を有し、マンニトール生成能が優れたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(寄託番号：KCTC 10882BP)。
【請求項２】
請求項１に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を含有することを特徴とする食品添加用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法。
【請求項４】
前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ製造の際、キムチ全体の重量に対して0.5-3重量%で添加することを特徴とする請求項３に記載のキムチの製造方法。
【請求項１】
キムチより分離されたpH3.5-5.0で耐酸性を有し、マンニトール生成能が優れたロイコノストック メセンテロイデス DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(寄託番号：KCTC 10882BP)。
【請求項２】
請求項１に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を含有することを特徴とする食品添加用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のロイコノストック メセンテロイデス DRC0512又はその培養液を添加することを特徴とするキムチの製造方法。
【請求項４】
前記ロイコノストック メセンテロイデス DRC0512の培養液をキムチ製造の際、キムチ全体の重量に対して0.5-3重量%で添加することを特徴とする請求項３に記載のキムチの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５１８０３１（Ｐ２００９−５１８０３１Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４４２２８（Ｐ２００８−５４４２２８）
【出願日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７４９５１
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０７３３６５５８）デサン エフエヌエフ コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４６３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７４９５１
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５０７３３６５５８）デサン エフエヌエフ コーポレーション (2)
【Ｆターム（参考）】
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