ミミズ粉末あるいは抽出物を利用したバイオマス糖化技術
【課題】バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現すること。
【解決手段】アカミミズ（Lumbricus rubellus）の粉末またはその抽出物を含有しているセルロース糖化用組成物を提供する。また、アカミミズ（Lumbricus rubellus）から精製したセルラーゼ酵素、および当該酵素を含有しているセルロース糖化用組成物を提供する。
【解決手段】アカミミズ（Lumbricus rubellus）の粉末またはその抽出物を含有しているセルロース糖化用組成物を提供する。また、アカミミズ（Lumbricus rubellus）から精製したセルラーゼ酵素、および当該酵素を含有しているセルロース糖化用組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、脱石油エネルギーが盛んに提唱されている。特に、世界的な石油資源の高騰によって、新エネルギー技術の開発は急を要する。新エネルギー技術として、セルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産が世界的に注目されている。
【０００３】
バイオマスからのエタノール製造は、主に、バイオマスから単糖を生成する糖化工程、および生成した単糖を用いてエタノール発酵するエタノール生成工程の２つの工程から構成される。セルロースの糖化効率が低いと、エタノール発酵の全体収率は低減する。よって、バイオマスの効率的な糖化技術が望まれている。
【０００４】
糸状菌Tricoderma reesei（T. reesei）はセルラーゼ分泌能力が高く、T. reesei由来のセルラーゼは、他の菌が産生するセルラーゼと比較して良好な活性を示す（非特許文献１参照）。このため、本酵素を用いたセルロース系バイオマスの酵素糖化が盛んに研究されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−７２９８５号公報（平成２０（２００８）年４月３日公開）
【特許文献２】特開２００９−２８０３７号公報（平成２１（２００９）年２月１２日公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ng, T. K. and Zeikus, J. G. 1981. Comparison of Extracellular Cellulase Activities of Clostridium thermocellum LQRI and Trichoderma reesei QM9414. Appl. Environ, Microbiol. 42: 231-240.
【非特許文献２】Aira, M., Monroy, F., and Domienguez, J. 2007. Earthworms strongly modify microbial biomass and activity triggering enzymatic activities during vermicomposting independently of the application rates of pig slurry. Sci. Total Environ. 385: 252-61.
【非特許文献３】Nakajima, N., Mihara, H., and Sumi, H. 1993. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1726-1730.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記生産プロセスにおけるセルロースの糖化に費やす酵素のコストが問題となっている。酵素活性が優れている観点からT. reeseiの産生するセルラーゼの研究が盛んに行われているが、実用化という点ではまだまだ課題が多い。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ミミズは、地龍ともいわれ、古くから解熱、鎮痛に効く漢方として親しまれている。また、ゴミの量を低減させるために、シマミミズと混合することによって生ゴミをコンポスト化することは、以前から行われている（非特許文献２等参照）。このように、ミミズは我々の生活に深く関わっている。
【００１０】
上述したように、シマミミズには生ゴミの加水分解能力があることが示唆されているが、糖化能力を検討した研究は知られていない。
【００１１】
近年、血栓分解酵素であるルンブルキナーゼがアカミミズLumbricus rubellus（L. rubellus）から見出され（非特許文献３参照）、その機能が注目されている。本発明者らは、アカミミズの機能をより詳細に検討した結果、アカミミズ粉末の粗抽出液にセルラーゼ活性が存在することを初めて見出し、そのセルラーゼ活性画分を精製することに成功した。そして、このアカミミズ由来のセルラーゼ活性画分を用いれば、バイオマスを直接糖化し得ることを確認し、新たなバイオマス糖化技術としての本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を含有していることを特徴としている。抽出に用いられる溶媒は、種々の操作における利便性の観点から水性溶媒であることが好ましいが、有機溶媒であってもよい。
【００１３】
特許文献１には、シマミミズによるコンポスト化に重要なアミラーゼを精製したことが記載されている。しかし、アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素であり、セルロースを基質とすることができない。また、本発明に係るセルロース分解は、特許文献１に記載のデンプン分解と作用面および機能面で何ら関連せず、全く別の技術といえる。
【００１４】
上述したように、アカミミズについては、血栓分解酵素の研究が進んでおり、当業者は、このようなアカミミズからセルラーゼ活性画分を取得し得ることを全く予期していなかった。特許文献２には、シマミミズに含まれるセルラーゼを検討し、その性状を確認しているが糖化能力を検討したものではない。また、従来よりアカミミズを用いている技術は血栓分解であり、従来よりシマミミズを用いている技術は生ゴミのコンポスト化である。当業者は、特定の技術分野で得られた知見を、全く関連しない技術分野に利用するということを容易になし得ない。
【００１５】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、セルロース系バイオマスを直接糖化するために用いられることがより好ましい。
【００１６】
本発明に係るセルロース糖化用キットは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を備えていることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係るセルロース糖化方法において、上記セルロース含有物質はセルロース系バイオマスであることが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明者らは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物に含まれる、バイオマス糖化に関与すると考えられる酵素を精製し、その諸性質を同定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明に係るセルロース糖化酵素は、アカミミズに由来し、推定分子量が５３．３ｋＤａであり、至適ｐＨが６．０であり、かつ至適温度が４５℃であることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化酵素は、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるセルロース含有物質（好ましくはセルロース系バイオマス）に対して用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るセルロース糖化酵素は、アカミミズに由来し、推定分子量が５７．５ｋＤａであり、至適ｐＨが５．５であり、かつ至適温度が４０℃であることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化酵素は、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるセルロース含有物質（好ましくはセルロース系バイオマス）に対して用いられることが好ましい。
【００２１】
特許文献２には、シマミミズに含まれるセルラーゼを検討し、その性状を確認しているが糖化能力を検討したものではない。しかも、カラムクロマトグラフィーによって分画された酵素の性状は、本発明の酵素と特許文献２記載の酵素との間において明らかに異なる。
【００２２】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、上記酵素を含有していることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、上記酵素を備えていることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、上記酵素とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係る方法において、上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明を用いれば、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現することができる。さらに、各種バイオマスを直接糖化し得る本発明を用いれば、通常複数の工程を必要とするバイオマス糖化を簡便に遂行することができる。なおさらに、本発明を用いれば、比較的穏やかな条件下でバイオマス分解を実現することができる。特に、バイオマスとして赤フスマを用いた場合には、有用な酵素として公知であるT. reeseiセルラーゼ溶液よりも優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液に含まれるセルラーゼの性状を示す図である。
【図２】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いたＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色の結果を示す図である。
【図３】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いたアゾ色素系プレートアッセイの結果を示す図である。
【図４】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いて各種バイオマスの糖化試験を行った結果を示す図である。
【図５】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６】Lumbricus rubellusから精製した酵素（ＣＭＣ ＩおよびＩＩ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図７】Lumbricus rubellusから精製した酵素（ＣＭＣ Ｉ）についての性状を示す図である。（ａ）は各酵素の至適温度を示し、（ｂ）は各酵素の至適ｐＨを示す。
【図８】Lumbricus rubellusから調製した粗酵素溶液を赤フスマに作用された際の、生成還元糖量の経時変化を測定した結果を示す図である。
【図９】T. reeseiから調製した分泌酵素溶液を赤フスマに作用された際の、生成還元糖量の経時変化を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔１．アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物〕
本発明は、セルロース糖化用組成物およびキットを提供する。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を含有していることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を備えていることを特徴としている。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「組成物」は複数の含有成分を単一組成物中に含有する態様が意図される。また、本明細書中で使用される場合、用語「キット」は、単一物質（キット）中に複数の含有成分を別々の容器内に備えている態様であってもよい。すなわち、本発明に係る組成物は、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などをさらに含んでいる形態であり、本発明に係るキットは、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などを別々に備えている形態である。
【００２８】
本発明に利用されるアカミミズは、養殖ミミズであっても天然ミミズであってもよい。なお、血栓溶解活性を有するセリンプロテアーゼを含有していることがよく知られているアカミミズからの抽出物が優れたセルラーゼ活性を有していることは全く知られていない。アカミミズの乾燥粉末は当該分野において周知の種々の方法を用いて得られればよく、例えば、アカミミズの乾燥粉末を得るために、アカミミズを水中に浸けることによって消化管内の糞土を吐出させ、続いて、ホモジナイザー、ミキサー、ブレンダーなどを用いて破砕した後に凍結乾燥する手順が採用され得る。
【００２９】
アカミミズの乾燥粉末から抽出物を得るための溶媒（抽出溶剤）は、種々の操作における利便性の観点から水性溶媒であることが好ましいが、有機溶媒であってもよい。本明細書中において使用される場合、「水性溶媒」は、弱酸性〜弱アルカリ性のｐＨ（好ましくはｐＨ５．０〜７．５、より好ましくはｐＨ５．０〜７．０）にて緩衝作用を示す緩衝液（例えば、例えば、リン酸緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）が最も好ましいが、水であっても、水溶性物質（例えば、有機酸類、無機酸類など）を含んでいる水溶液であってもよい。
【００３０】
抽出工程は、破砕したアカミミズ（アカミミズ乾燥粉末）に含まれている活性成分が水性溶媒中に抽出されれば特に限定されない。得られた抽出物はさらなる精製工程に供されてもよく、一般的な酵素精製に用いられる硫安沈殿、種々のクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過など）、電気泳動などの精製手段が単独または組み合わせて適宜用いられ得る。
【００３１】
なお、実施例にて後述するように、本発明に係るセルロース糖化用組成物中に含まれる活性成分の一部は、推定分子量４１．７ｋＤａ、至適温度５０℃かつ至適ｐＨ７．０を有するエンドグルカナーゼである。従来技術では希硫酸を用いたセルロース糖化が行われているが、中性付近下にて安定に作用する本発明を用いれば、製造プラントを酸によって腐食させることなく単糖を生成させることができる。また、一般に高温環境下で酵素は失活するため、反応液の温度を下げた後に酵素反応を行う必要がある。７０℃にて酵素活性を保持している本発明を用いれば、高温状態であっても酵素反応を開始することができるので、総作業時間を大いに短縮し得る。
【００３２】
アカミミズの乾燥粉末の抽出物を例に挙げて本発明を説明したが、本発明は抽出物に限定されず、アカミミズの乾燥粉末もまた好適に利用され得る。特に、活性成分の抽出工程をセルロース糖化の工程と近似する環境にて行う場合には、セルロースをアカミミズの乾燥粉末とともにインキュベートすればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、アカミミズの乾燥粉末を含有している組成物、またはアカミミズの乾燥粉末を備えているキットもまた、セルロース糖化用に好適に用いられるので、本発明の範囲内に含まれる。もちろん、良好なセルラーゼ活性を示すT. reesei由来のセルラーゼとともに用いられてもよい。
【００３３】
本発明はまた、セルロース糖化方法を提供する。本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。セルロース含有物質としては特に限定されないが、セルロースを主成分とするセルロース系バイオマスであることが好ましく、古紙、段ボールなどのセルロース系材料や、食品製造の際に大量に発生する副産物（例えば、ビートパルプ、小麦ふすま、廃菌床、脱脂大豆、脱脂糠など）、農林業廃棄物（例えば、稲わら、スギ、おがくず）、非農耕地に生育する雑草などが挙げられる。なお、リグニンおよびセルロースを主成分とする木質系バイオマスを用いる場合は、必要に応じて、予め脱リグニン処理を行ってもよい。
【００３４】
本発明に係るセルロース糖化方法を実行するには、上述した組成物またはキットを用いればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。上述したように、本発明におけるセルロース糖化の活性成分は、推定分子量４１．７ｋＤａ、至適温度５０℃かつ至適ｐＨ７．０を有するエンドグルカナーゼであるので、インキュベート工程は３０〜５０℃の温度範囲および５．０〜７．５のｐＨ範囲にて行われることが好ましいが、インキュベートに用いられる温度およびｐＨは、上記範囲内に限定されない。
【００３５】
〔２．精製セルラーゼタンパク質〕
本発明は、アカミミズから精製したセルラーゼタンパク質を提供する。第１の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、アカミミズに由来する、推定分子量が５３．３ｋＤａのタンパク質である。また、本実施形態に係るタンパク質の至適ｐＨは６．０であり、至適温度が４５℃である。本実施形態に係るタンパク質を用いれば、セルロース含有物質を糖化することができる。本実施形態に係るタンパク質の基質として好ましいセルロース含有物質としては、セルロース系バイオマスが挙げられ、より好ましくは、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるバイオマスであり得る。
【００３６】
第２の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、アカミミズに由来する、推定分子量が５７．５ｋＤａのタンパク質である。また、本実施形態に係るタンパク質の至適ｐＨは５．５であり、至適温度が４０℃である。本実施形態に係るタンパク質を用いれば、セルロース含有物質を糖化することができる。好ましいセルロース含有物質としては、セルロース系バイオマスが挙げられ、より好ましくは、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるバイオマスであり得る。後述する実施例にしめすように、本実施形態に係るタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、「（Ａ／Ｓ）ＥＬＷＩＳＴＧＤＥＬＸＱＬＶ」（配列番号１または２）と同定されている。
【００３７】
本発明はさらに、セルロース糖化用組成物およびキットを提供する。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、上記タンパク質を含有していることを特徴としている。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、T. reesei由来のセルラーゼをさらに含有してもよい。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、上記タンパク質を備えていることを特徴としており、T. reesei由来のセルラーゼをさらに備えていてもよい。上述したように、本発明に係る組成物は、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などをさらに含んでいる形態であり、本発明に係るキットは、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などを別々に備えている形態である。
【００３８】
本発明はまた、セルロース糖化方法を提供する。本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、上記タンパク質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明が適用されるべきセルロース含有物質は、上記「アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物」の項にて挙げたものであり得、好ましくは、上記タンパク質の基質として好ましいものであり得る。
【００３９】
本発明に係るセルロース糖化方法を実行するには、上述した組成物またはキットを用いればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、アカミミズから精製したセルラーゼタンパク質をT. reesei由来のセルラーゼとともに用いる態様もまた本発明の範囲内である。なお、インキュベート工程において採用されるべき温度範囲およびｐＨ範囲は、上記タンパク質の至適温度および至適ｐＨを参照して行われることが好ましい。
【００４０】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
〔実施例１：粗酵素溶液〕
〔粗酵素溶液の抽出〕
粗酵素溶液の抽出に用いたLumbricus rubellus（L. rubellus）凍結乾燥粉末を、ワキ製薬株式会社より供与頂いた。L. rubellus凍結乾燥粉末７５ｇを、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）７５０ｍＬに添加して、混合物を４℃で２０時間攪拌した。その混合液を４℃で、１２，０００×ｇにて６０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿画分に上記緩衝液３５０ｍＬをさらに加え、混合物を４℃で２４時間攪拌した。その混合液を上記の条件にて遠心分離し、上清を回収した。回収した各上清を混合し、上記の条件にて遠心分離をさらに３回行い、その上清を粗酵素溶液とした。
【００４２】
〔硫酸アンモニウム分画〕
得られた粗酵素溶液に最終濃度２５％の硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を４℃で１２，０００×ｇにて６０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた溶液に最終濃度６０％の硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を同じ条件で遠心分離し、沈殿を回収した。回収した沈殿を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解した。
【００４３】
〔カラムクロマトグラフィー〕
カラムクロマトグラフィーを全て、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いて４℃で行った。上記で得られた粗酵素溶液の硫酸アンモニウム画分を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）（Ａ緩衝液）を用いて透析した。この溶液を、Ａ緩衝液によってあらかじめ平衡化した弱陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）にアプライした。同じ緩衝液によってカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＡ緩衝液を用いて直線濃度勾配法で溶出し、後述の方法により確認したセルラーゼ活性を有する画分を分取した。
【００４４】
〔ゲルろ過カラムクロマトグラフィー〕
上記で得られた活性画分をフィルターで濃縮し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したゲルろ過カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｓに供した。吸着したタンパク質を同じ緩衝液で溶出した。
【００４５】
〔酵素活性測定〕
１．２５％ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ）を基質として用いて、セルラーゼ活性の測定を行った。測定すべき画分を適当に希釈し、１００μＬを、１．２５％ ＣＭＣを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）４００μＬに加え、４０℃で１５分間インキュベートした。遊離した還元糖量を、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって測定した。酵素反応後、反応液にＳｏｍｏｇｙｉ銅試薬５００μＬを加え１５分間煮沸した後、５分間水浴中に放置した。これにネルソン呈色試薬５００μＬを加えた後、蒸留水１ｍＬを加え、１，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、回収した上清の吸光度を波長５２０ｎｍにて測定した。１分間あたり１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖量を遊離する酵素量を１Ｕと規定した。
【００４６】
〔Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄプレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（ＣＭＣ、リケナン、ラミナラン、キシログルカン、オートスペルトキシラン、PSC）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でプレートを洗浄し、ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色液を添加し、３０分間放置した。次いで、１Ｍ ＮａＣｌでプレートを洗浄し、５％酢酸溶液を添加し、ハロの大きさを測定した。
【００４７】
〔アゾ色素系プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（アミロース、バーリーβ―グルカン、プロテイン、マンナン、１，３β−グルカン、ガラクタン、アラビナン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２４時間反応させた（呈色反応）。
【００４８】
〔バイオマス糖化試験〕
５０ｃｃの広口瓶に、バイオマス（赤フスマ、スギ、廃菌床）各０．１ｇを、１ｍＭアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１１．７ｍＬとともに加えたものを、バイオマス試料として予め調整した。フィルター滅菌した３．３ｍＬの粗酵素溶液を、バイオマス試料に添加し、４０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を適量回収し、遠心分離した後の上清に含まれる生成還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって定量した。
【００４９】
〔タンパク質量測定〕
タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。具体的には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＢｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬を用い、Ｍｏｄｅｌ ６８０ＸＲマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用し、波長５９５ｎｍで定量した。検量線の作成には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
【００５０】
〔結果〕
〔１．粗酵素を用いた諸性質の検討〕
〔１．１．至適温度の検討〕
ＣＭＣを基質として用いて、粗酵素溶液中に含まれるセルラーゼの至適温度について検討した。その結果、酵素の至適温度は５０℃付近であることが示された（図１（ａ））。粗酵素溶液を種々の温度で反応させたときの活性を測定した。温度が高くなるにつれて酵素の安定性は徐々に低下することが示されたが、７０℃付近においても２０％程度の活性を保っていた（図１（ｂ））。種々のｐＨに調整した粗酵素溶液を４０℃で反応させたときの活性を測定した。その結果、至適ｐＨはｐＨ７．０付近であることが示された（図１（ｃ））。種々のｐＨに調整した粗酵素溶液を、ｐＨ７．０、４０℃にて反応させたときの活性と比較した。その結果、酸性領域での安定性はよくなかったが、アルカリ領域では比較的安定であることが示された（図１（ｄ））。
【００５１】
〔２．Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色法によるプレートアッセイ結果〕
Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色の結果を図２に示した。ハロの有無により各基質に対する酵素活性を検討した。その結果、ＣＭＣ、リケナン、ラミナラン、キシログルカン、オートスペルトキシランを含む培地でハロを確認することができた。このことにより、粗酵素溶液中にβ−１，４エンドグルカナーゼ、β−１，４エンドキシラナーゼの存在が示唆された。
【００５２】
〔３．アゾ色素系プレートアッセイ結果〕
アゾ色素系プレートアッセイの結果を図３に示した。酵素が培地中の基質を分解するとアゾ色素が可溶化し青く呈色するため、この呈色を確認することにより各基質に対する酵素活性の有無を検討した。アミロース、バーリーβ−グルカン、プロテイン、マンナン、１，３−β−グルカンで呈色を確認することができた。このことにより、粗酵素溶液中にアミラーゼ、β−１，４エンドグルカナーゼ、プロテアーゼ、β−１，４エンドマンナナーゼの存在が示唆された。
【００５３】
〔４．バイオマス糖化試験〕
粗酵素溶液を用いて各種バイオマス（赤フスマ、スギ、廃菌床）の糖化試験を行った。Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法を用いて生成還元糖量の経時変化を測定した（図４）。ａは赤フスマの生成還元糖量、ｂはスギの生成還元糖量、ｃは廃菌床の生成還元糖量を示す。その結果、赤フスマに対して効率よく酵素が作用していることが明らかとなった。
【００５４】
〔５．酵素精製〕
各種クロマトグラフィーを用いて、ＣＭＣ分解活性を指標に酵素精製を試みた。その結果、ゲルろ過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、目的酵素は推定分子量４１．７ｋＤａのモノマーであることが示唆された。
【００５５】
以上のように、L. rubellusには推定分子量が約４５ｋＤａのエンドグルカナーゼが存在することが示された。また、それ以外にβ−１，４エンドグルカナーゼ、β−１，４エンドキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、β−１，４エンドマンナナーゼなどの存在も示唆された。さらに、粗酵素溶液は各種バイオマスを直接糖化した。このことにより、粗酵素溶液を用いた新規バイオマス糖化技術が提案可能であり、産業への応用が大いに期待される。
【００５６】
〔実施例２：酵素の精製〕
〔粗酵素溶液の抽出〕
粗酵素溶液の抽出に用いたLumbricus rubellus（L. rubellus）凍結乾燥粉末を、ワキ製薬株式会社より供与頂いた。L. rubellus凍結乾燥粉末７５ｇを、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）７５０ｍＬに添加して、混合物を４℃で２４時間攪拌した。その混合液を、１２，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離し、上清を回収した。核酸を除去するために、上清に最終濃度２％のストレプトマイシン硫酸塩を添加し、４℃で３０分間攪拌した後に１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離し、回収した上清を粗酵素溶液とした。
【００５７】
〔硫酸アンモニウム分画〕
得られた粗酵素溶液に最終濃度２０％となるように硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を４℃で１９，０００×ｇにて３０分間遠心分離した後、回収した上清に最終濃度６０％となるように硫酸アンモニウムを添加した。この溶液を同一条件にて再度遠心分離した後に、沈殿を回収した。回収した沈殿を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬに溶解した。
【００５８】
〔陰イオンカラムクロマトグラフィー〕
上述した手順に従って、弱陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、セルラーゼ活性を有する画分を分取した。
【００５９】
〔マルチモーダル弱陽イオン交換カラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で透析した後、同じ緩衝液で予め平衡化したＣａｐｔｏ ＭＭＣカラムにアプライした。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を、１ｍＭ ＤＴＴ及び１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で直線濃度勾配法にて溶出した。
【００６０】
〔ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、１ｍＭ ＤＴＴを含む１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析した後、同じ緩衝液で予め平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ Ｉにアプライした。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で直線濃度勾配法で溶出した。なお、本操作はＣＭＣ Ｉについてのみ行った。ＣＭＣ ＩＩについては本工程を省き、ゲルろ過カラムによる精製を引き続いて行った。
【００６１】
〔ゲルろ過カラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したゲルろ過カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｓに供した。吸着したタンパク質を同じ緩衝液で溶出した。
【００６２】
〔酵素活性測定〕
ＣＭＣａｓｅの活性を，上述したＣＭＣを基質として用いたセルラーゼ活性の測定の手順に従って測定した。また、β―グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性あるいはセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）活性を、以下の手順に従って測定した。酵素溶液１μＬに２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４μＬを添加し、４５μＬの基質溶液（ＢＧＬ活性：４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４ＭＵ−Ｇ）を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたもの（最終濃度が０．５ｍＭ）、ＣＢＨ活性：４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ（４ＭＵ−Ｇ２）を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたもの（最終濃度が０．５ｍＭ））をさらに添加した。この混合溶液を４０℃で３０分間インキュベートした後に、１５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）を添加した溶液を３６０ｎｍで励起し、４６０ｎｍで測定した。１分間あたり１μｍｏｌの４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを生成する酵素量を１Ｕと規定した。また検量線の作製には４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを用いた。
【００６３】
〔Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄプレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（ＣＭＣ、ラミナラン、リケナン、オートスペルトキシラン、バーチウッドキシラン、キシログルカン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でプレートを洗浄し、ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色液を添加し、３０分間放置した。次いで、１Ｍ ＮａＣｌでプレートを洗浄し、５％酢酸溶液を添加し、ハロの大きさを測定した。
【００６４】
〔アゾ色素系プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（β―グルカン、アミロース、マンナン、１，３β−グルカン、ガラクタン、アラビナン、キシラン、プロテイン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２４時間反応させた（呈色反応）。
【００６５】
〔合成基質プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．５ｍＭの４ＭＵ−Ｇまたは４ＭＵ−Ｇ２、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させ、３６５ｎｍの紫外線を照射しハロの大きさを測定した。
【００６６】
〔Ｎ末端アミノ酸配列解析〕
精製したＣＭＣ ＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦメンブレンに転写し、目的のタンパク質バンドについて、アミノ酸配列決定機を用いてＮ末端アミノ酸配列を解析した。
【００６７】
〔タンパク質量測定〕
タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。具体的には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、Ｍｏｄｅｌ ６８０ＸＲマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用し、波長５９５ｎｍで定量した。検量線の作成には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
【００６８】
〔結果〕
〔１．陰イオンカラムクロマトグラフィー〕
陰イオンカラムクロマトグラフィーの溶出結果を図５に示す。ＣＭＣａｓｅの活性画分として、ＣＭＣ ＩとＣＭＣ ＩＩの２つの画分が得られた。またＢＧＬの活性画分も２つ得られた（図５）。ＣＭＣａｓｅはエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性を有していることから、本結果より、本粗酵素中には少なくとも２種のＥＧ、１種のＢＧＬが存在することが示唆された。
【００６９】
〔２．精製ＣＭＣ ＩおよびＩＩの性状〕
ＣＭＣ ＩおよびＩＩを各種クロマトグラフィーにて精製し、その性状を検討した。ＣＭＣ ＩおよびＩＩの精製結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
ＣＭＣ Ｉは、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より分子量４８．７ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より分子量５３．３ｋＤａ（図６）を示したことから、モノマーであることが示唆された。また、酵素の至適温度は４５℃付近（図７（ａ））であり、至適ｐＨは６．０付近（図７（ｂ））であることが示された。
【００７２】
また、ＣＭＣ ＩＩは、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より分子量５８．９ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より分子量５７．５ｋＤａ（図６）を示したことから、モノマーであることが示唆された。また、酵素の至適温度は４０℃付近（図７（ａ））であり、至適ｐＨは５．５付近（図７（ｂ））であることが示された。
【００７３】
〔３．プレートアッセイ結果〕
プレートアッセイの結果，ＣＭＣ Ｉは、４ＭＵ−Ｇ、ＣＭＣ、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカンに対して活性を示した。ＣＭＣ ＩＩは、ＣＭＣ、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカンに対して活性を示した。
【００７４】
〔４．Ｎ末端アミノ酸配列解析結果〕
ＣＭＣ ＩＩのＮ末端アミノ酸配列解析を行った結果、（Ａ／Ｓ）ＥＬＷＩＳＴＧＤＥＬＸＱＬＶ（配列番号１または２）であることがわかった。この配列をＢＬＡＳＴにて検索したが、関連すると思われる配列は全くヒットしなかった。
【００７５】
L. rubellusに存在するセルラーゼの精製タンパク質の分子量は、５０〜６０ｋＤａであった。これは、粗精製段階での推定分子量よりも若干高かったが、これは実験誤差の範囲内であるといえる。また、得られた精製タンパク質は至適ｐＨが弱酸性〜中性付近であり、かつ至適温度が３０〜５０℃であり、穏やかな条件下で各種バイオマスを直接糖化した。このことにより、精製タンパク質を用いた新規バイオマス糖化技術が提案可能であり、産業への応用が大いに期待される。
【００７６】
〔実施例３：バイオマス糖化試験〕
５０ｃｃの広口瓶に、バイオマス（赤フスマ）１．０ｇを、３ｍＭアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とともに加えたものを、バイオマス試料として予め調整した。フィルター滅菌した３０Ｕ当量のＣＭＣａｓｅ活性を有する粗酵素溶液を、バイオマス試料に添加し、３０〜５０℃で４８時間振とうしながら反応させた。反応後、反応液を適量回収し、１０分間煮沸し，酵素を失活させた後，遠心分離した後の上清に含まれる生成還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって定量した。
【００７７】
Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法を用いて生成還元糖量の経時変化を測定した結果を図８に示す。図に示すように、上記粗酵素溶液は、５０℃で最も効率よく還元糖を生成させることが明らかとなった。また、上記粗酵素溶液による生成還元糖量は、T. reeseiに由来する分泌酵素を用いて同様の試験を行った場合の５０℃での生成還元糖量を上回っていた（図９）。
【００７８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
粗酵素溶液が各種バイオマスを直接糖化し、バイオマスとして赤フスマを用いた場合には特に、有用な酵素として公知であるT. reeseiセルラーゼ溶液による効果を上回る結果を示したこと、および精製された酵素が比較的穏やかな条件下で作用することから、より簡便なバイオマス糖化が実現し得、新規バイオマス糖化技術により産業への応用が期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、脱石油エネルギーが盛んに提唱されている。特に、世界的な石油資源の高騰によって、新エネルギー技術の開発は急を要する。新エネルギー技術として、セルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産が世界的に注目されている。
【０００３】
バイオマスからのエタノール製造は、主に、バイオマスから単糖を生成する糖化工程、および生成した単糖を用いてエタノール発酵するエタノール生成工程の２つの工程から構成される。セルロースの糖化効率が低いと、エタノール発酵の全体収率は低減する。よって、バイオマスの効率的な糖化技術が望まれている。
【０００４】
糸状菌Tricoderma reesei（T. reesei）はセルラーゼ分泌能力が高く、T. reesei由来のセルラーゼは、他の菌が産生するセルラーゼと比較して良好な活性を示す（非特許文献１参照）。このため、本酵素を用いたセルロース系バイオマスの酵素糖化が盛んに研究されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−７２９８５号公報（平成２０（２００８）年４月３日公開）
【特許文献２】特開２００９−２８０３７号公報（平成２１（２００９）年２月１２日公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ng, T. K. and Zeikus, J. G. 1981. Comparison of Extracellular Cellulase Activities of Clostridium thermocellum LQRI and Trichoderma reesei QM9414. Appl. Environ, Microbiol. 42: 231-240.
【非特許文献２】Aira, M., Monroy, F., and Domienguez, J. 2007. Earthworms strongly modify microbial biomass and activity triggering enzymatic activities during vermicomposting independently of the application rates of pig slurry. Sci. Total Environ. 385: 252-61.
【非特許文献３】Nakajima, N., Mihara, H., and Sumi, H. 1993. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57: 1726-1730.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記生産プロセスにおけるセルロースの糖化に費やす酵素のコストが問題となっている。酵素活性が優れている観点からT. reeseiの産生するセルラーゼの研究が盛んに行われているが、実用化という点ではまだまだ課題が多い。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ミミズは、地龍ともいわれ、古くから解熱、鎮痛に効く漢方として親しまれている。また、ゴミの量を低減させるために、シマミミズと混合することによって生ゴミをコンポスト化することは、以前から行われている（非特許文献２等参照）。このように、ミミズは我々の生活に深く関わっている。
【００１０】
上述したように、シマミミズには生ゴミの加水分解能力があることが示唆されているが、糖化能力を検討した研究は知られていない。
【００１１】
近年、血栓分解酵素であるルンブルキナーゼがアカミミズLumbricus rubellus（L. rubellus）から見出され（非特許文献３参照）、その機能が注目されている。本発明者らは、アカミミズの機能をより詳細に検討した結果、アカミミズ粉末の粗抽出液にセルラーゼ活性が存在することを初めて見出し、そのセルラーゼ活性画分を精製することに成功した。そして、このアカミミズ由来のセルラーゼ活性画分を用いれば、バイオマスを直接糖化し得ることを確認し、新たなバイオマス糖化技術としての本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を含有していることを特徴としている。抽出に用いられる溶媒は、種々の操作における利便性の観点から水性溶媒であることが好ましいが、有機溶媒であってもよい。
【００１３】
特許文献１には、シマミミズによるコンポスト化に重要なアミラーゼを精製したことが記載されている。しかし、アミラーゼはデンプンを加水分解する酵素であり、セルロースを基質とすることができない。また、本発明に係るセルロース分解は、特許文献１に記載のデンプン分解と作用面および機能面で何ら関連せず、全く別の技術といえる。
【００１４】
上述したように、アカミミズについては、血栓分解酵素の研究が進んでおり、当業者は、このようなアカミミズからセルラーゼ活性画分を取得し得ることを全く予期していなかった。特許文献２には、シマミミズに含まれるセルラーゼを検討し、その性状を確認しているが糖化能力を検討したものではない。また、従来よりアカミミズを用いている技術は血栓分解であり、従来よりシマミミズを用いている技術は生ゴミのコンポスト化である。当業者は、特定の技術分野で得られた知見を、全く関連しない技術分野に利用するということを容易になし得ない。
【００１５】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、セルロース系バイオマスを直接糖化するために用いられることがより好ましい。
【００１６】
本発明に係るセルロース糖化用キットは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を備えていることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係るセルロース糖化方法において、上記セルロース含有物質はセルロース系バイオマスであることが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明者らは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物に含まれる、バイオマス糖化に関与すると考えられる酵素を精製し、その諸性質を同定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明に係るセルロース糖化酵素は、アカミミズに由来し、推定分子量が５３．３ｋＤａであり、至適ｐＨが６．０であり、かつ至適温度が４５℃であることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化酵素は、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるセルロース含有物質（好ましくはセルロース系バイオマス）に対して用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明に係るセルロース糖化酵素は、アカミミズに由来し、推定分子量が５７．５ｋＤａであり、至適ｐＨが５．５であり、かつ至適温度が４０℃であることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化酵素は、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるセルロース含有物質（好ましくはセルロース系バイオマス）に対して用いられることが好ましい。
【００２１】
特許文献２には、シマミミズに含まれるセルラーゼを検討し、その性状を確認しているが糖化能力を検討したものではない。しかも、カラムクロマトグラフィーによって分画された酵素の性状は、本発明の酵素と特許文献２記載の酵素との間において明らかに異なる。
【００２２】
本発明に係るセルロース糖化用組成物は、上記酵素を含有していることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、上記酵素を備えていることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、上記酵素とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係る方法において、上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明を用いれば、バイオマス糖化を簡便かつ低コストにて実現することができる。さらに、各種バイオマスを直接糖化し得る本発明を用いれば、通常複数の工程を必要とするバイオマス糖化を簡便に遂行することができる。なおさらに、本発明を用いれば、比較的穏やかな条件下でバイオマス分解を実現することができる。特に、バイオマスとして赤フスマを用いた場合には、有用な酵素として公知であるT. reeseiセルラーゼ溶液よりも優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液に含まれるセルラーゼの性状を示す図である。
【図２】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いたＣｏｎｇｏ ｒｅｄ染色の結果を示す図である。
【図３】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いたアゾ色素系プレートアッセイの結果を示す図である。
【図４】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液を用いて各種バイオマスの糖化試験を行った結果を示す図である。
【図５】Lumbricus rubellusから抽出した粗酵素溶液の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６】Lumbricus rubellusから精製した酵素（ＣＭＣ ＩおよびＩＩ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図７】Lumbricus rubellusから精製した酵素（ＣＭＣ Ｉ）についての性状を示す図である。（ａ）は各酵素の至適温度を示し、（ｂ）は各酵素の至適ｐＨを示す。
【図８】Lumbricus rubellusから調製した粗酵素溶液を赤フスマに作用された際の、生成還元糖量の経時変化を測定した結果を示す図である。
【図９】T. reeseiから調製した分泌酵素溶液を赤フスマに作用された際の、生成還元糖量の経時変化を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔１．アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物〕
本発明は、セルロース糖化用組成物およびキットを提供する。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を含有していることを特徴としている。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物を備えていることを特徴としている。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「組成物」は複数の含有成分を単一組成物中に含有する態様が意図される。また、本明細書中で使用される場合、用語「キット」は、単一物質（キット）中に複数の含有成分を別々の容器内に備えている態様であってもよい。すなわち、本発明に係る組成物は、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などをさらに含んでいる形態であり、本発明に係るキットは、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などを別々に備えている形態である。
【００２８】
本発明に利用されるアカミミズは、養殖ミミズであっても天然ミミズであってもよい。なお、血栓溶解活性を有するセリンプロテアーゼを含有していることがよく知られているアカミミズからの抽出物が優れたセルラーゼ活性を有していることは全く知られていない。アカミミズの乾燥粉末は当該分野において周知の種々の方法を用いて得られればよく、例えば、アカミミズの乾燥粉末を得るために、アカミミズを水中に浸けることによって消化管内の糞土を吐出させ、続いて、ホモジナイザー、ミキサー、ブレンダーなどを用いて破砕した後に凍結乾燥する手順が採用され得る。
【００２９】
アカミミズの乾燥粉末から抽出物を得るための溶媒（抽出溶剤）は、種々の操作における利便性の観点から水性溶媒であることが好ましいが、有機溶媒であってもよい。本明細書中において使用される場合、「水性溶媒」は、弱酸性〜弱アルカリ性のｐＨ（好ましくはｐＨ５．０〜７．５、より好ましくはｐＨ５．０〜７．０）にて緩衝作用を示す緩衝液（例えば、例えば、リン酸緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）が最も好ましいが、水であっても、水溶性物質（例えば、有機酸類、無機酸類など）を含んでいる水溶液であってもよい。
【００３０】
抽出工程は、破砕したアカミミズ（アカミミズ乾燥粉末）に含まれている活性成分が水性溶媒中に抽出されれば特に限定されない。得られた抽出物はさらなる精製工程に供されてもよく、一般的な酵素精製に用いられる硫安沈殿、種々のクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過など）、電気泳動などの精製手段が単独または組み合わせて適宜用いられ得る。
【００３１】
なお、実施例にて後述するように、本発明に係るセルロース糖化用組成物中に含まれる活性成分の一部は、推定分子量４１．７ｋＤａ、至適温度５０℃かつ至適ｐＨ７．０を有するエンドグルカナーゼである。従来技術では希硫酸を用いたセルロース糖化が行われているが、中性付近下にて安定に作用する本発明を用いれば、製造プラントを酸によって腐食させることなく単糖を生成させることができる。また、一般に高温環境下で酵素は失活するため、反応液の温度を下げた後に酵素反応を行う必要がある。７０℃にて酵素活性を保持している本発明を用いれば、高温状態であっても酵素反応を開始することができるので、総作業時間を大いに短縮し得る。
【００３２】
アカミミズの乾燥粉末の抽出物を例に挙げて本発明を説明したが、本発明は抽出物に限定されず、アカミミズの乾燥粉末もまた好適に利用され得る。特に、活性成分の抽出工程をセルロース糖化の工程と近似する環境にて行う場合には、セルロースをアカミミズの乾燥粉末とともにインキュベートすればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、アカミミズの乾燥粉末を含有している組成物、またはアカミミズの乾燥粉末を備えているキットもまた、セルロース糖化用に好適に用いられるので、本発明の範囲内に含まれる。もちろん、良好なセルラーゼ活性を示すT. reesei由来のセルラーゼとともに用いられてもよい。
【００３３】
本発明はまた、セルロース糖化方法を提供する。本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。セルロース含有物質としては特に限定されないが、セルロースを主成分とするセルロース系バイオマスであることが好ましく、古紙、段ボールなどのセルロース系材料や、食品製造の際に大量に発生する副産物（例えば、ビートパルプ、小麦ふすま、廃菌床、脱脂大豆、脱脂糠など）、農林業廃棄物（例えば、稲わら、スギ、おがくず）、非農耕地に生育する雑草などが挙げられる。なお、リグニンおよびセルロースを主成分とする木質系バイオマスを用いる場合は、必要に応じて、予め脱リグニン処理を行ってもよい。
【００３４】
本発明に係るセルロース糖化方法を実行するには、上述した組成物またはキットを用いればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。上述したように、本発明におけるセルロース糖化の活性成分は、推定分子量４１．７ｋＤａ、至適温度５０℃かつ至適ｐＨ７．０を有するエンドグルカナーゼであるので、インキュベート工程は３０〜５０℃の温度範囲および５．０〜７．５のｐＨ範囲にて行われることが好ましいが、インキュベートに用いられる温度およびｐＨは、上記範囲内に限定されない。
【００３５】
〔２．精製セルラーゼタンパク質〕
本発明は、アカミミズから精製したセルラーゼタンパク質を提供する。第１の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、アカミミズに由来する、推定分子量が５３．３ｋＤａのタンパク質である。また、本実施形態に係るタンパク質の至適ｐＨは６．０であり、至適温度が４５℃である。本実施形態に係るタンパク質を用いれば、セルロース含有物質を糖化することができる。本実施形態に係るタンパク質の基質として好ましいセルロース含有物質としては、セルロース系バイオマスが挙げられ、より好ましくは、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるバイオマスであり得る。
【００３６】
第２の実施形態において、本発明に係るタンパク質は、アカミミズに由来する、推定分子量が５７．５ｋＤａのタンパク質である。また、本実施形態に係るタンパク質の至適ｐＨは５．５であり、至適温度が４０℃である。本実施形態に係るタンパク質を用いれば、セルロース含有物質を糖化することができる。好ましいセルロース含有物質としては、セルロース系バイオマスが挙げられ、より好ましくは、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカン、またはこれらの任意の混合物を含んでいるバイオマスであり得る。後述する実施例にしめすように、本実施形態に係るタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、「（Ａ／Ｓ）ＥＬＷＩＳＴＧＤＥＬＸＱＬＶ」（配列番号１または２）と同定されている。
【００３７】
本発明はさらに、セルロース糖化用組成物およびキットを提供する。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、上記タンパク質を含有していることを特徴としている。本発明に係るセルロース糖化用組成物は、T. reesei由来のセルラーゼをさらに含有してもよい。また、本発明に係るセルロース糖化用キットは、上記タンパク質を備えていることを特徴としており、T. reesei由来のセルラーゼをさらに備えていてもよい。上述したように、本発明に係る組成物は、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などをさらに含んでいる形態であり、本発明に係るキットは、セルロース糖化反応に用いられる反応液や他の成分などを別々に備えている形態である。
【００３８】
本発明はまた、セルロース糖化方法を提供する。本発明に係るセルロース糖化方法は、セルロース含有物質を、上記タンパク質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明が適用されるべきセルロース含有物質は、上記「アカミミズの乾燥粉末またはその抽出物」の項にて挙げたものであり得、好ましくは、上記タンパク質の基質として好ましいものであり得る。
【００３９】
本発明に係るセルロース糖化方法を実行するには、上述した組成物またはキットを用いればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、アカミミズから精製したセルラーゼタンパク質をT. reesei由来のセルラーゼとともに用いる態様もまた本発明の範囲内である。なお、インキュベート工程において採用されるべき温度範囲およびｐＨ範囲は、上記タンパク質の至適温度および至適ｐＨを参照して行われることが好ましい。
【００４０】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４１】
〔実施例１：粗酵素溶液〕
〔粗酵素溶液の抽出〕
粗酵素溶液の抽出に用いたLumbricus rubellus（L. rubellus）凍結乾燥粉末を、ワキ製薬株式会社より供与頂いた。L. rubellus凍結乾燥粉末７５ｇを、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）７５０ｍＬに添加して、混合物を４℃で２０時間攪拌した。その混合液を４℃で、１２，０００×ｇにて６０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿画分に上記緩衝液３５０ｍＬをさらに加え、混合物を４℃で２４時間攪拌した。その混合液を上記の条件にて遠心分離し、上清を回収した。回収した各上清を混合し、上記の条件にて遠心分離をさらに３回行い、その上清を粗酵素溶液とした。
【００４２】
〔硫酸アンモニウム分画〕
得られた粗酵素溶液に最終濃度２５％の硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を４℃で１２，０００×ｇにて６０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた溶液に最終濃度６０％の硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を同じ条件で遠心分離し、沈殿を回収した。回収した沈殿を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解した。
【００４３】
〔カラムクロマトグラフィー〕
カラムクロマトグラフィーを全て、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）を用いて４℃で行った。上記で得られた粗酵素溶液の硫酸アンモニウム画分を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）（Ａ緩衝液）を用いて透析した。この溶液を、Ａ緩衝液によってあらかじめ平衡化した弱陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）にアプライした。同じ緩衝液によってカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＡ緩衝液を用いて直線濃度勾配法で溶出し、後述の方法により確認したセルラーゼ活性を有する画分を分取した。
【００４４】
〔ゲルろ過カラムクロマトグラフィー〕
上記で得られた活性画分をフィルターで濃縮し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したゲルろ過カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｓに供した。吸着したタンパク質を同じ緩衝液で溶出した。
【００４５】
〔酵素活性測定〕
１．２５％ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ）を基質として用いて、セルラーゼ活性の測定を行った。測定すべき画分を適当に希釈し、１００μＬを、１．２５％ ＣＭＣを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）４００μＬに加え、４０℃で１５分間インキュベートした。遊離した還元糖量を、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって測定した。酵素反応後、反応液にＳｏｍｏｇｙｉ銅試薬５００μＬを加え１５分間煮沸した後、５分間水浴中に放置した。これにネルソン呈色試薬５００μＬを加えた後、蒸留水１ｍＬを加え、１，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、回収した上清の吸光度を波長５２０ｎｍにて測定した。１分間あたり１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖量を遊離する酵素量を１Ｕと規定した。
【００４６】
〔Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄプレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（ＣＭＣ、リケナン、ラミナラン、キシログルカン、オートスペルトキシラン、PSC）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でプレートを洗浄し、ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色液を添加し、３０分間放置した。次いで、１Ｍ ＮａＣｌでプレートを洗浄し、５％酢酸溶液を添加し、ハロの大きさを測定した。
【００４７】
〔アゾ色素系プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（アミロース、バーリーβ―グルカン、プロテイン、マンナン、１，３β−グルカン、ガラクタン、アラビナン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２４時間反応させた（呈色反応）。
【００４８】
〔バイオマス糖化試験〕
５０ｃｃの広口瓶に、バイオマス（赤フスマ、スギ、廃菌床）各０．１ｇを、１ｍＭアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１１．７ｍＬとともに加えたものを、バイオマス試料として予め調整した。フィルター滅菌した３．３ｍＬの粗酵素溶液を、バイオマス試料に添加し、４０℃で２４時間反応させた。反応後、反応液を適量回収し、遠心分離した後の上清に含まれる生成還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって定量した。
【００４９】
〔タンパク質量測定〕
タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。具体的には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＢｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬を用い、Ｍｏｄｅｌ ６８０ＸＲマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用し、波長５９５ｎｍで定量した。検量線の作成には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
【００５０】
〔結果〕
〔１．粗酵素を用いた諸性質の検討〕
〔１．１．至適温度の検討〕
ＣＭＣを基質として用いて、粗酵素溶液中に含まれるセルラーゼの至適温度について検討した。その結果、酵素の至適温度は５０℃付近であることが示された（図１（ａ））。粗酵素溶液を種々の温度で反応させたときの活性を測定した。温度が高くなるにつれて酵素の安定性は徐々に低下することが示されたが、７０℃付近においても２０％程度の活性を保っていた（図１（ｂ））。種々のｐＨに調整した粗酵素溶液を４０℃で反応させたときの活性を測定した。その結果、至適ｐＨはｐＨ７．０付近であることが示された（図１（ｃ））。種々のｐＨに調整した粗酵素溶液を、ｐＨ７．０、４０℃にて反応させたときの活性と比較した。その結果、酸性領域での安定性はよくなかったが、アルカリ領域では比較的安定であることが示された（図１（ｄ））。
【００５１】
〔２．Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色法によるプレートアッセイ結果〕
Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色の結果を図２に示した。ハロの有無により各基質に対する酵素活性を検討した。その結果、ＣＭＣ、リケナン、ラミナラン、キシログルカン、オートスペルトキシランを含む培地でハロを確認することができた。このことにより、粗酵素溶液中にβ−１，４エンドグルカナーゼ、β−１，４エンドキシラナーゼの存在が示唆された。
【００５２】
〔３．アゾ色素系プレートアッセイ結果〕
アゾ色素系プレートアッセイの結果を図３に示した。酵素が培地中の基質を分解するとアゾ色素が可溶化し青く呈色するため、この呈色を確認することにより各基質に対する酵素活性の有無を検討した。アミロース、バーリーβ−グルカン、プロテイン、マンナン、１，３−β−グルカンで呈色を確認することができた。このことにより、粗酵素溶液中にアミラーゼ、β−１，４エンドグルカナーゼ、プロテアーゼ、β−１，４エンドマンナナーゼの存在が示唆された。
【００５３】
〔４．バイオマス糖化試験〕
粗酵素溶液を用いて各種バイオマス（赤フスマ、スギ、廃菌床）の糖化試験を行った。Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法を用いて生成還元糖量の経時変化を測定した（図４）。ａは赤フスマの生成還元糖量、ｂはスギの生成還元糖量、ｃは廃菌床の生成還元糖量を示す。その結果、赤フスマに対して効率よく酵素が作用していることが明らかとなった。
【００５４】
〔５．酵素精製〕
各種クロマトグラフィーを用いて、ＣＭＣ分解活性を指標に酵素精製を試みた。その結果、ゲルろ過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果により、目的酵素は推定分子量４１．７ｋＤａのモノマーであることが示唆された。
【００５５】
以上のように、L. rubellusには推定分子量が約４５ｋＤａのエンドグルカナーゼが存在することが示された。また、それ以外にβ−１，４エンドグルカナーゼ、β−１，４エンドキシラナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、β−１，４エンドマンナナーゼなどの存在も示唆された。さらに、粗酵素溶液は各種バイオマスを直接糖化した。このことにより、粗酵素溶液を用いた新規バイオマス糖化技術が提案可能であり、産業への応用が大いに期待される。
【００５６】
〔実施例２：酵素の精製〕
〔粗酵素溶液の抽出〕
粗酵素溶液の抽出に用いたLumbricus rubellus（L. rubellus）凍結乾燥粉末を、ワキ製薬株式会社より供与頂いた。L. rubellus凍結乾燥粉末７５ｇを、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）７５０ｍＬに添加して、混合物を４℃で２４時間攪拌した。その混合液を、１２，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離し、上清を回収した。核酸を除去するために、上清に最終濃度２％のストレプトマイシン硫酸塩を添加し、４℃で３０分間攪拌した後に１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離し、回収した上清を粗酵素溶液とした。
【００５７】
〔硫酸アンモニウム分画〕
得られた粗酵素溶液に最終濃度２０％となるように硫酸アンモニウムを添加した。その溶液を４℃で１９，０００×ｇにて３０分間遠心分離した後、回収した上清に最終濃度６０％となるように硫酸アンモニウムを添加した。この溶液を同一条件にて再度遠心分離した後に、沈殿を回収した。回収した沈殿を、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１００ｍＬに溶解した。
【００５８】
〔陰イオンカラムクロマトグラフィー〕
上述した手順に従って、弱陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、セルラーゼ活性を有する画分を分取した。
【００５９】
〔マルチモーダル弱陽イオン交換カラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、１ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で透析した後、同じ緩衝液で予め平衡化したＣａｐｔｏ ＭＭＣカラムにアプライした。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を、１ｍＭ ＤＴＴ及び１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で直線濃度勾配法にて溶出した。
【００６０】
〔ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、１ｍＭ ＤＴＴを含む１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析した後、同じ緩衝液で予め平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ Ｉにアプライした。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、吸着したタンパク質を１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で直線濃度勾配法で溶出した。なお、本操作はＣＭＣ Ｉについてのみ行った。ＣＭＣ ＩＩについては本工程を省き、ゲルろ過カラムによる精製を引き続いて行った。
【００６１】
〔ゲルろ過カラムクロマトグラフィー〕
得られた画分をフィルターで濃縮し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したゲルろ過カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−５５Ｓに供した。吸着したタンパク質を同じ緩衝液で溶出した。
【００６２】
〔酵素活性測定〕
ＣＭＣａｓｅの活性を，上述したＣＭＣを基質として用いたセルラーゼ活性の測定の手順に従って測定した。また、β―グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性あるいはセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）活性を、以下の手順に従って測定した。酵素溶液１μＬに２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４μＬを添加し、４５μＬの基質溶液（ＢＧＬ活性：４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４ＭＵ−Ｇ）を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたもの（最終濃度が０．５ｍＭ）、ＣＢＨ活性：４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ（４ＭＵ−Ｇ２）を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させたもの（最終濃度が０．５ｍＭ））をさらに添加した。この混合溶液を４０℃で３０分間インキュベートした後に、１５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）を添加した溶液を３６０ｎｍで励起し、４６０ｎｍで測定した。１分間あたり１μｍｏｌの４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを生成する酵素量を１Ｕと規定した。また検量線の作製には４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを用いた。
【００６３】
〔Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄプレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（ＣＭＣ、ラミナラン、リケナン、オートスペルトキシラン、バーチウッドキシラン、キシログルカン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でプレートを洗浄し、ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ染色液を添加し、３０分間放置した。次いで、１Ｍ ＮａＣｌでプレートを洗浄し、５％酢酸溶液を添加し、ハロの大きさを測定した。
【００６４】
〔アゾ色素系プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．１％基質（β―グルカン、アミロース、マンナン、１，３β−グルカン、ガラクタン、アラビナン、キシラン、プロテイン）、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２４時間反応させた（呈色反応）。
【００６５】
〔合成基質プレートアッセイ〕
最終濃度が各々０．５ｍＭの４ＭＵ−Ｇまたは４ＭＵ−Ｇ２、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％Ａｇａｒとなるようにプレートを作製した。このプレートに各酵素溶液を滴下し、４０℃で２時間反応させ、３６５ｎｍの紫外線を照射しハロの大きさを測定した。
【００６６】
〔Ｎ末端アミノ酸配列解析〕
精製したＣＭＣ ＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦメンブレンに転写し、目的のタンパク質バンドについて、アミノ酸配列決定機を用いてＮ末端アミノ酸配列を解析した。
【００６７】
〔タンパク質量測定〕
タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。具体的には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、Ｍｏｄｅｌ ６８０ＸＲマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用し、波長５９５ｎｍで定量した。検量線の作成には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
【００６８】
〔結果〕
〔１．陰イオンカラムクロマトグラフィー〕
陰イオンカラムクロマトグラフィーの溶出結果を図５に示す。ＣＭＣａｓｅの活性画分として、ＣＭＣ ＩとＣＭＣ ＩＩの２つの画分が得られた。またＢＧＬの活性画分も２つ得られた（図５）。ＣＭＣａｓｅはエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性を有していることから、本結果より、本粗酵素中には少なくとも２種のＥＧ、１種のＢＧＬが存在することが示唆された。
【００６９】
〔２．精製ＣＭＣ ＩおよびＩＩの性状〕
ＣＭＣ ＩおよびＩＩを各種クロマトグラフィーにて精製し、その性状を検討した。ＣＭＣ ＩおよびＩＩの精製結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
【００７１】
ＣＭＣ Ｉは、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より分子量４８．７ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より分子量５３．３ｋＤａ（図６）を示したことから、モノマーであることが示唆された。また、酵素の至適温度は４５℃付近（図７（ａ））であり、至適ｐＨは６．０付近（図７（ｂ））であることが示された。
【００７２】
また、ＣＭＣ ＩＩは、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より分子量５８．９ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より分子量５７．５ｋＤａ（図６）を示したことから、モノマーであることが示唆された。また、酵素の至適温度は４０℃付近（図７（ａ））であり、至適ｐＨは５．５付近（図７（ｂ））であることが示された。
【００７３】
〔３．プレートアッセイ結果〕
プレートアッセイの結果，ＣＭＣ Ｉは、４ＭＵ−Ｇ、ＣＭＣ、リケナン、オートスペルトキシラン、β−グルカンに対して活性を示した。ＣＭＣ ＩＩは、ＣＭＣ、ラミナラン、リケナン、β−グルカン、β−１，３−グルカンに対して活性を示した。
【００７４】
〔４．Ｎ末端アミノ酸配列解析結果〕
ＣＭＣ ＩＩのＮ末端アミノ酸配列解析を行った結果、（Ａ／Ｓ）ＥＬＷＩＳＴＧＤＥＬＸＱＬＶ（配列番号１または２）であることがわかった。この配列をＢＬＡＳＴにて検索したが、関連すると思われる配列は全くヒットしなかった。
【００７５】
L. rubellusに存在するセルラーゼの精製タンパク質の分子量は、５０〜６０ｋＤａであった。これは、粗精製段階での推定分子量よりも若干高かったが、これは実験誤差の範囲内であるといえる。また、得られた精製タンパク質は至適ｐＨが弱酸性〜中性付近であり、かつ至適温度が３０〜５０℃であり、穏やかな条件下で各種バイオマスを直接糖化した。このことにより、精製タンパク質を用いた新規バイオマス糖化技術が提案可能であり、産業への応用が大いに期待される。
【００７６】
〔実施例３：バイオマス糖化試験〕
５０ｃｃの広口瓶に、バイオマス（赤フスマ）１．０ｇを、３ｍＭアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とともに加えたものを、バイオマス試料として予め調整した。フィルター滅菌した３０Ｕ当量のＣＭＣａｓｅ活性を有する粗酵素溶液を、バイオマス試料に添加し、３０〜５０℃で４８時間振とうしながら反応させた。反応後、反応液を適量回収し、１０分間煮沸し，酵素を失活させた後，遠心分離した後の上清に含まれる生成還元糖量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法によって定量した。
【００７７】
Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法を用いて生成還元糖量の経時変化を測定した結果を図８に示す。図に示すように、上記粗酵素溶液は、５０℃で最も効率よく還元糖を生成させることが明らかとなった。また、上記粗酵素溶液による生成還元糖量は、T. reeseiに由来する分泌酵素を用いて同様の試験を行った場合の５０℃での生成還元糖量を上回っていた（図９）。
【００７８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
粗酵素溶液が各種バイオマスを直接糖化し、バイオマスとして赤フスマを用いた場合には特に、有用な酵素として公知であるT. reeseiセルラーゼ溶液による効果を上回る結果を示したこと、および精製された酵素が比較的穏やかな条件下で作用することから、より簡便なバイオマス糖化が実現し得、新規バイオマス糖化技術により産業への応用が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物を含有している、セルロース糖化用組成物。
【請求項２】
アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物を備えている、セルロース糖化用キット。
【請求項３】
セルロース含有物質を、アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含する、セルロース糖化方法。
【請求項４】
上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
推定分子量が５３．３ｋＤａであり、至適ｐＨが６．０であり、かつ至適温度が４５℃である、アカミミズ（Lumbricus rubellus）由来のセルロース糖化酵素。
【請求項６】
推定分子量が５７．５ｋＤａであり、至適ｐＨが５．５であり、かつ至適温度が４０℃である、アカミミズ（Lumbricus rubellus）由来のセルロース糖化酵素。
【請求項７】
請求項５または６の酵素を含有している、セルロース糖化用組成物。
【請求項８】
請求項５または６の酵素を備えている、セルロース糖化用キット。
【請求項９】
セルロース含有物質を、請求項５または６の酵素とともにインキュベートする工程を包含する、セルロース糖化方法。
【請求項１０】
上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物を含有している、セルロース糖化用組成物。
【請求項２】
アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物を備えている、セルロース糖化用キット。
【請求項３】
セルロース含有物質を、アカミミズ（Lumbricus rubellus）の乾燥粉末またはその抽出物とともにインキュベートする工程を包含する、セルロース糖化方法。
【請求項４】
上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
推定分子量が５３．３ｋＤａであり、至適ｐＨが６．０であり、かつ至適温度が４５℃である、アカミミズ（Lumbricus rubellus）由来のセルロース糖化酵素。
【請求項６】
推定分子量が５７．５ｋＤａであり、至適ｐＨが５．５であり、かつ至適温度が４０℃である、アカミミズ（Lumbricus rubellus）由来のセルロース糖化酵素。
【請求項７】
請求項５または６の酵素を含有している、セルロース糖化用組成物。
【請求項８】
請求項５または６の酵素を備えている、セルロース糖化用キット。
【請求項９】
セルロース含有物質を、請求項５または６の酵素とともにインキュベートする工程を包含する、セルロース糖化方法。
【請求項１０】
上記セルロース含有物質がセルロース系バイオマスである、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図６】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−８３２７４（Ｐ２０１１−８３２７４Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６０７０３（Ｐ２０１０−６０７０３）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第６１回日本生物工学会大会講演要旨集」 発行日 平成２１年８月２５日 発行所 社団法人日本生物工学会
【出願人】（５０１０２００２８）ワキ製薬株式会社 (1)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第６１回日本生物工学会大会講演要旨集」 発行日 平成２１年８月２５日 発行所 社団法人日本生物工学会
【出願人】（５０１０２００２８）ワキ製薬株式会社 (1)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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