モノクローナル抗体
【課題】ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する新規のモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体。前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである構成、エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる構成、エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる構成が推奨される。
【解決手段】ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体。前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである構成、エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる構成、エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる構成が推奨される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノクローナル抗体に関し、さらに詳細には、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する新規のモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となる。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。同様に、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。
【０００４】
エンドセリン（endothelin；ＥＴ）は２１個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、強力な血管収縮作用を有することが知られている。エンドセリンにはＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３の３種類のアイソフォームが見出されている。一方、エンドセリンに特異的に結合する受容体がエンドセリン受容体（endothelin receptor）である。エンドセリン受容体にはエンドセリン受容体タイプＡ（ＥＴＡＲ）とエンドセリン受容体タイプＢ（ＥＴＢＲ）の２種類が見出されており、ＥＴＡＲはＥＴ−１とＥＴ−２に対する強い結合性を示し、ＥＴＢＲは３種類のＥＴに対して同程度の結合性を示す。
【０００５】
エンドセリン受容体はＧＰＣＲの一種であり、細胞膜を７回貫通する構造を有している。ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（以下、「ｈＥＴＡＲ」と略記することがある。）の１次構造はすでに解明されており、そのＮ末端ドメイン、各細胞外ドメイン、各細胞内ドメイン、およびＣ末端ドメインに相当する部位も特定されている。
【０００６】
エンドセリン受容体のアンタゴニストは、エンドセリンが関与する種々の疾病の治療薬となる可能性があり、新規アンタゴニストの探索が盛んに行われている（例えば、特許文献１，２）。例えば、当該アンタゴニストは血管収縮を抑える作用を有することが予想され、心筋症の治療薬となる可能性がある。一方で、受容体に対する抗体をアンタゴニストとして応用することも一般に試みられており（アンタゴニスト抗体）、エンドセリン受容体に対する抗体が心筋症等の治療薬となる可能性もある。現在、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する抗体としては、ポリクローナル抗体がすでに取得され、一部は市販もされている。一方、モノクローナル抗体に関しては、ｈＥＴＡＲの１次構造のみを特異的に認識するものが取得されている（非特許文献１）。しかし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれにおいても、ｈＥＴＡＲの細胞外ループを特異的に認識するものは取得されていない。したがって、ｈＥＴＡＲとナチュラルリガンド（ＥＴ−１、ＥＴ−２）との結合やシグナル伝達を阻害することができる抗体も取得されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１-６４２６２号公報
【特許文献２】特開２００４-４３４９５号公報
【非特許文献１】バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），１９９２年，第１８７巻，第３号，ｐ．１２４１−１２４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新たな医薬品開発等に有用なヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する新規のモノクローナル抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、分子シャペロンの一種であるシャペロニンをコードする遺伝子とヒト由来エンドセリン受容体タイプＡをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いて、マウスに遺伝子免疫を施し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する免疫応答を誘導した。そして、当該マウスの脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマの集団を作製し、ｈＥＴＡＲの細胞外ループを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを検索した。その結果、１種のクローンを選抜することに成功した。そして、当該ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１０】
請求項１に記載の発明は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明のヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体（以下、「抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体」と略記することがある。）は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに特異的に反応するものであり、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しない。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の診断や、エンドセリン受容体タイプＡの免疫測定法の構築にも有用である。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、前記細胞外ループの立体構造を認識するものである請求項１に記載のモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、細胞外ループの立体構造を認識するものである。換言すれば、細胞外ループの１次構造のみを認識するものではない。かかる構成により、ｈＥＴＡＲのアンタゴニスト抗体として特に好適なモノクローナル抗体が提供される。なお、立体構造を保持した細胞外ループは、天然（native）のｈＥＴＡＲ（活性型ｈＥＴＡＲ）の細胞外ループが該当し、例えば、生きた細胞の表面上に存在する。
【００１４】
前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである構成が推奨される（請求項３）。
【００１５】
マウス由来のものである構成（請求項４）、および以下の性質を有する構成（請求項５）が推奨される。
（ａ）サブクラス：ＩｇＧ２ａ
（ｂ）軽鎖：κ鎖
（ｃ）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに反応し、マウス由来エンドセリン受容体タイプＡとラット由来エンドセリン受容体タイプＡのいずれにも実質的に反応しない。
【００１６】
請求項６に記載の発明は、エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体である。
【００１７】
また請求項７に記載の発明は、エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体である。
【００１８】
かかる構成により、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するアンタゴニストとして使用可能なモノクローナル抗体が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の診断や、エンドセリン受容体タイプＡの免疫測定法の構築にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００２１】
まず、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）の構造について説明する。
前述したように、ｈＥＴＡＲはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ｈＥＴＡＲをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ｈＥＴＡＲのアミノ酸配列も知られている。配列番号３にｈＥＴＡＲ遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。
【００２２】
ｈＥＴＡＲの疎水性モデルにより一般的に考えられている構造によれば、ｈＥＴＡＲの各ドメインは、配列番号４に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当する。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお、異種動物間で細胞外ドメイン（Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、細胞外第３ループ）のアミノ酸配列を比較すると、Ｎ末端ドメインの相同性は低く、各ループの相同性は高いことがわかっている。
【００２３】
１〜 ２４：膜移行シグナルペプチド配列（発現後に切断・除去される）
２５〜 ８０：Ｎ末端ドメイン
１０１〜１１９：細胞内第１ループ
１４１〜１６１：細胞外第１ループ
１８０〜２０５：細胞内第２ループ
２２５〜２５６：細胞外第２ループ
２７５〜３１０：細胞内第３ループ
３３２〜３４８：細胞外第３ループ
３７２〜４２７：Ｃ末端ドメイン
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないものである。本発明のモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答が誘導されたマウス等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００２５】
ｈＥＴＡＲに対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にｈＥＴＡＲ（タンパク質）を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいが、動物にｈＥＴＡＲ遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法が好ましく用いられる。
【００２６】
すなわち、ｈＥＴＡＲは膜タンパク質であるので、全長のｈＥＴＡＲを免疫原として使用することは一般に難しい。そこで、タンパク免疫をもってｈＥＴＡＲの細胞外ループに対する免疫応答を誘導したい場合には、細胞外ループのペプチドを免疫原として用いることとなる。しかし、細胞外ループは異種生物間で相同性が高いので、当該ペプチドを免疫原に用いても十分な免疫応答を誘導することができないことがある。結局、タンパク免疫によって細胞外ループに対する免疫応答を十分に誘導することは難しい。
【００２７】
一方、遺伝子免疫によれば、ｈＥＴＡＲの全長をコードする遺伝子を用いることにより、全長のｈＥＴＡＲを免疫原に用いたのと同様の状況を作り出すことができる。さらに、発現したｈＥＴＡＲが動物体内で天然（native）の状態（活性型の状態）で存在できるので、ｈＥＴＡＲの立体構造に特異的な免疫応答を誘導することが可能となる。また遺伝子免疫の手法によれば、ｈＥＴＡＲ遺伝子さえ入手できれば行うことができ、精製されたｈＥＴＡＲを準備する必要がない。
【００２８】
ただしこの場合でも、ｈＥＴＡＲにおいては異種動物間でＮ末端ドメインの相同性が低いため、Ｎ末端ドメインに対する免疫応答が主として誘導されてしまうおそれがある。従来、ｈＥＴＡＲに対する抗体に関してＮ末端ドメインを認識するものしか取得されていないのは、これが原因の１つと考えられる。そこで、より好ましくは、動物に接種する遺伝子として、シャペロニンをコードする遺伝子とｈＥＴＡＲをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いる。当該融合遺伝子を免疫原として用いることにより、ｈＥＴＡＲ遺伝子を単独で用いる場合よりも細胞外ループに対する免疫応答をより選択的に誘導することができる。当該融合遺伝子を用いた遺伝子免疫の方法については、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットにその詳細が記載されている。
【００２９】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在している。特に、バクテリアの細胞質、真核細胞のミトコンドリア、葉緑体に多量に存在している。シャペロニンは、タンパク質の折り畳みを促進する活性やタンパク質の変性を阻止する活性を有する。シャペロニンは、分子量約６万のシャペロニンサブユニット（ＨＳＰ６０ともいう）７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはそのリング状構造体の内部に空洞を有しており、その空洞内に折り畳み途中のタンパク質や変性したタンパク質を一時的に収納して複合体を形成する。そして、空洞内で収納したタンパク質を正しく折り畳み、続いて空洞から正しく折り畳まれたタンパク質を放出することが知られている。
【００３０】
シャペロニンは、バクテリアや真核生物のオルガネラにみられるグループＩ型と、真核生物や古細菌にみられるグループＩＩ型に分類される。本発明のモノクローナル抗体を製造する際に行う遺伝子免疫において、前記した融合遺伝子を用いる場合には、グループＩ型とグループＩＩ型のいずれのシャペロニン遺伝子を採用してもよい。グループＩ型シャペロニンの代表例としては、大腸菌由来のＧｒｏＥＬが挙げられる。グループＩＩ型シャペロニンの代表例としては、古細菌由来のＴＣＰが挙げられる。ＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【００３１】
ここで「シャペロニンをコードする遺伝子（シャペロニン遺伝子）」には、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子（シャペロニンサブユニット遺伝子）に加え、複数のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された「シャペロニンサブユニット連結体」をコードする遺伝子を含む。シャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子は、複数のシャペロニンサブユニット遺伝子がタンデムに連結された遺伝子と同じである。なお、シャペロニンサブユニット連結体は、天然のシャペロニンと同様のリング状構造体を形成することができる。
【００３２】
前記融合遺伝子の作製方法としては、例えば、ｈＥＴＡＲ遺伝子とシャペロニン遺伝子とをライゲーション反応によって連結すればよい。なお、融合遺伝子を動物に投与する際には、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、プロモーターの制御下にある状態で投与することが好ましい。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。またさらに、発現ベクターには、ＣｐＧモチーフを含めてもよい。
【００３３】
融合遺伝子を動物に投与する方法としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投与も適用可能である。また投与量としては、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはマウスの場合は２５〜１００μｇ／回になる。また投与の回数は、１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い免疫応答を誘導することができる。
【００３４】
なお、タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したｈＥＴＡＲを用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウス等に皮下注射し、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。
【００３５】
免疫される動物としては特に限定はないが、好ましくは、マウスが用いられる。これにより、マウス由来のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３６】
ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順で遺伝子免疫あるいはタンパク免疫され、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、ＨＡＴ選択培地を用いて行うことができる。また、ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。このようにして、ｈＥＴＡＲの細胞外ループに反応し、ｈＥＴＡＲのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しない抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜ならびにクローニングすればよい。
【００３７】
そして、選抜ならびにクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００３８】
モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、ｈＥＴＡＲに対するアンタゴニストとして、医薬品開発に応用することができる。すなわち、ｈＥＴＡＲが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することにより、血管収縮を抑え、心筋症治療や高血圧症治療に応用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を特定し、キメラ化あるいはヒト化すれば、より安全性が高い医薬品とすることができる。また本発明のモノクローナル抗体は、低分子医薬のスクリーニング用試薬、心筋症・高血圧症検査試薬、組織切片・細胞等を用いたＥＴＡＲ局在検証用研究試薬、組換えＥＴＡＲ発現細胞調製用検査試薬、ＥＴＡＲの結晶構造解析用研究試薬、等の用途にも使用できる。
【００４０】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（１）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ遺伝子の単離
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端にＳａｌＩサイトが導入された。また、同様にして配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するｈＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。
【００４２】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５’末端にＳａｌＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。
【００４３】
（３）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡとＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬは、ｈＥＴＡＲをコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vectorを制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲはｈＥＴＡＲ遺伝子のみを有している。
【００４４】
（４）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ安定発現細胞及びヒト由来エンドセリン受容体タイプＢ安定発現細胞の作製
（３）で構築したｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを鋳型とし、配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを構築した。一方、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＢ（ｈＥＴＢＲ）遺伝子（配列番号１１）を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏのＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲを構築した。
【００４５】
Lipofectamin溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを含むＯＰＴＩ―ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。同様の手順で、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏ１のみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。クローニングした各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、さらに、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のＥＴ―１（ペプチド研究所）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ｈＥＴＡＲと活性型ｈＥＴＢＲのいずれもが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。
【００４６】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＥＴＡＲを単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲを用いてマウスを免疫した。
【００４７】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ｈＥＴＡＲに対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」と称する。）、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞」と称する。）、及び、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後３５日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体との相互作用を解析した。
【００４８】
その結果、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体がｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体がｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。なお、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ｈＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【００４９】
（７）抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス６匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、約９９０種のハイブリドーマが得られた。
【００５０】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（Ｓｉｇｍａ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
【００５１】
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、４穴において抗体との結合性が確認された。
【００５２】
抗体との結合性が確認された４種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、４種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を産生する４種のハイブリドーマがクローニングされた。
【００５３】
各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された４種の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を各々約２ｍｇ得た。
【００５４】
各々の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体について、以下に示す試験を行った。それらの結果から、所望の性質を有する抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を１種選抜した（クローン番号ｈＡ２１）。以下、クローン番号ｈＡ２１の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体（以下、単に「ｈＡ２１」と略記することがある。）を代表として、試験の手順と結果を順次示す。
【００５５】
（８）フローサイトメトリーによるｈＥＴＡＲに対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度のｈＡ２１のＰＢＳ溶液（以下、「ｈＡ２１溶液」と称する。）を調製した。一方、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞、および対照の細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した後、ｈＡ２１溶液を各細胞と共にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞とｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図１〜３に示す。図１はｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図２はｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図３は対照の細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１〜３において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｍ１、Ｍ２）のうち、Ｍ２（右領域）に属する細胞がｈＡ２１と結合した細胞を表す。
【００５６】
その結果、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｍ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１）。これは、ｈＡ２１がｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図２）と対照の細胞を用いた場合（図３）は、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、ｈＡ２１がｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞と対照の細胞のいずれにも結合しないことを示していた。以上のことから、ｈＡ２１が活性型ｈＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。
【００５７】
（９）免疫学的細胞染色よるｈＥＴＡＲに対する結合性評価
ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞ならびにｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を、カバーガラスを入れた６穴プレートに播種し、培養した。細胞が接着増殖したことを確認した後、カバーガラスを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液に浸漬して細胞を固定化し、サポニンにより細胞膜透過処理を行った。その後、カバーガラスをｈＡ２１溶液と共にインキュベートした。さらに、カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、蛍光顕微鏡（オリンパス社）を用いて観察し、各細胞とｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図４（ａ）（ｂ）及び図５（ａ）（ｂ）に示す。図４はｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。図５はｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。図４，５において、蛍光が検出された箇所が、細胞上でｈＡ２１が結合した箇所である。図４，５中に示したスケールバーは１００μｍを示す。
【００５８】
図４（ｂ）に示すように、細胞膜上に発現しているｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合には蛍光が検出され、細胞膜上にｈＡ２１が結合していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合には、蛍光は検出されず、細胞膜上にｈＡ２１が結合していなかった。以上より、免疫学的細胞染色によっても、ｈＡ２１が細胞上に発現したｈＥＴＡＲ（細胞外ドメイン）に特異的に結合することが示された。
【００５９】
（１０）エピトープ解析
配列番号４に示すアミノ酸配列の以下の４つの枠内で３アミノ酸残基ずつずらし、１５アミノ酸残基からなるペプチドを計６０種作製した。
・配列番号４のアミノ酸番号２５〜９６（Ｎ末端ドメインを包含する枠）：ペプチド番号１〜２０
・配列番号４のアミノ酸番号１２８〜１７５（細胞外第１ループを包含する枠）：ペプチド番号２５〜３６
・配列番号４のアミノ酸番号２１０〜２７２（細胞外第２ループを包含する枠）：ペプチド番号３７〜５３
・配列番号４のアミノ酸番号３１２〜３５６（細胞外第３ループを包含する枠）：ペプチド番号６１〜７１
【００６０】
作製した各ペプチドをガラスアレイ上に固相化した。このガラスアレイを、ラット血清でブロッキングした後、ｈＡ２１溶液と共にインキュベートした。さらに、２次抗体としてＣｙ５標識抗マウスＩｇＧラット抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ社）を添加した後、蛍光スライドスキャナーＧｅｎｅｐｉｘ４２００Ａ（ＡｘｓｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、各ペプチドとｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図６に示す。図６において、縦軸は蛍光強度、横軸は各ペプチドの番号を表す。図６に示すように、ｈＡ２１は細胞外第２ループの一部に相当する４２番と４３番のペプチドにのみ強く結合した（図６の丸囲み部分）。４２番のペプチドは配列番号４のアミノ酸番号２２５（Ｖａｌ）〜２３９（Ｃｙｓ）、４３番のペプチドはアミノ酸番号２２８（Ｐｒｏ）〜２４２（Ａｓｎ）の部分に相当し、いずれも細胞外第２ループ（アミノ酸番号２２５〜２５６）の一部を構成するものであった。以上より、ｈＡ２１がｈＥＴＡＲの細胞外第２ループを特異的に認識することがわかった。
【００６１】
（１１）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達阻害活性評価
ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のｈＡ２１を添加した。また対照として、マウスＩｇＧ（ピアス社、陰性対照）又はペプチド性アンタゴニストＢＱ１２３（ＴＯＣＲＩＳ社、陽性対照）を同様に１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-8ＭのエンドセリンＥＴ−１（ペプチド研究所）によって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的減少度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。結果を図７に示す。図７は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図７に示すように、ｈＡ２１を添加した場合には、ＢＱ１２３と添加した場合と同様に細胞内Ｃａ2+濃度の低下がみられた。これは、ｈＡ２１がエンドセリンＥＴ−１とｈＥＴＡＲとの結合を競合的に阻害した結果、細胞内へのシグナル伝達が阻害されたことを示していた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出すると、ｈＡ２１では１．７０８×１０-7Ｍ、ＢＱ１２３では２．８０７×１０-8Ｍであった。
以上より、ｈＡ２１が、ｈＥＴＡＲが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害できることが示された。
【００６２】
（１２）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ｈＡ２１のアイソタイプを決定した。検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによった。結果を図８に示す。図８（ａ）は対照の結果を表す写真、図８（ｂ）はｈＡ２１の結果を表す写真である。図８（ｂ）に示すように、ｈＡ２１のサブクラスはＩｇＧ２ａ、軽鎖はκ鎖であった（矢印参照）。
【００６３】
（１３）異種ＥＴＡＲに対する結合性評価
上記（１）〜（６）と同様にして「ｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」と「ｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」を作製した。これらの細胞を用い、上記（８）と同様のフローサイトメトリーにて、ｈＡ２１のｍＥＴＡＲとｒＥＴＡＲに対する結合性を評価した。結果を図９に示す。図９（ａ）はｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラム、図９（ｂ）はｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。すなわち、いずれの細胞を用いた場合でも、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、ｈＡ２１がｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞のいずれにも結合しないことを示していた。なおｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図９（ｂ））は、ｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図９（ａ））よりもＭ２のエリアに検出された細胞数が多かったが、実質的には結合していないと呼べるレベルであった。以上より、ｈＡ２１はｈＥＴＡＲに対して特異的に反応するが、ｍＥＴＡＲとｒＥＴＡＲのいずれにも実質的に反応しないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図２】ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図３】対照の細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図４】ｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。
【図５】ｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。
【図６】エピトープ解析の結果を表すグラフである。
【図７】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図８】アイソタイプ解析の結果を表す写真であり、（ａ）は対照の結果、（ｂ）はｈＡ２１の結果を表す。
【図９】（ａ）はｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラム、（ｂ）はｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノクローナル抗体に関し、さらに詳細には、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する新規のモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となる。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。同様に、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。
【０００４】
エンドセリン（endothelin；ＥＴ）は２１個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、強力な血管収縮作用を有することが知られている。エンドセリンにはＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３の３種類のアイソフォームが見出されている。一方、エンドセリンに特異的に結合する受容体がエンドセリン受容体（endothelin receptor）である。エンドセリン受容体にはエンドセリン受容体タイプＡ（ＥＴＡＲ）とエンドセリン受容体タイプＢ（ＥＴＢＲ）の２種類が見出されており、ＥＴＡＲはＥＴ−１とＥＴ−２に対する強い結合性を示し、ＥＴＢＲは３種類のＥＴに対して同程度の結合性を示す。
【０００５】
エンドセリン受容体はＧＰＣＲの一種であり、細胞膜を７回貫通する構造を有している。ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（以下、「ｈＥＴＡＲ」と略記することがある。）の１次構造はすでに解明されており、そのＮ末端ドメイン、各細胞外ドメイン、各細胞内ドメイン、およびＣ末端ドメインに相当する部位も特定されている。
【０００６】
エンドセリン受容体のアンタゴニストは、エンドセリンが関与する種々の疾病の治療薬となる可能性があり、新規アンタゴニストの探索が盛んに行われている（例えば、特許文献１，２）。例えば、当該アンタゴニストは血管収縮を抑える作用を有することが予想され、心筋症の治療薬となる可能性がある。一方で、受容体に対する抗体をアンタゴニストとして応用することも一般に試みられており（アンタゴニスト抗体）、エンドセリン受容体に対する抗体が心筋症等の治療薬となる可能性もある。現在、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する抗体としては、ポリクローナル抗体がすでに取得され、一部は市販もされている。一方、モノクローナル抗体に関しては、ｈＥＴＡＲの１次構造のみを特異的に認識するものが取得されている（非特許文献１）。しかし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のいずれにおいても、ｈＥＴＡＲの細胞外ループを特異的に認識するものは取得されていない。したがって、ｈＥＴＡＲとナチュラルリガンド（ＥＴ−１、ＥＴ−２）との結合やシグナル伝達を阻害することができる抗体も取得されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１-６４２６２号公報
【特許文献２】特開２００４-４３４９５号公報
【非特許文献１】バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications），１９９２年，第１８７巻，第３号，ｐ．１２４１−１２４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新たな医薬品開発等に有用なヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する新規のモノクローナル抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、分子シャペロンの一種であるシャペロニンをコードする遺伝子とヒト由来エンドセリン受容体タイプＡをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いて、マウスに遺伝子免疫を施し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対する免疫応答を誘導した。そして、当該マウスの脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマの集団を作製し、ｈＥＴＡＲの細胞外ループを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを検索した。その結果、１種のクローンを選抜することに成功した。そして、当該ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１０】
請求項１に記載の発明は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体である。
【００１１】
本発明のヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体（以下、「抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体」と略記することがある。）は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに特異的に反応するものであり、Ｎ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しない。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の診断や、エンドセリン受容体タイプＡの免疫測定法の構築にも有用である。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、前記細胞外ループの立体構造を認識するものである請求項１に記載のモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、細胞外ループの立体構造を認識するものである。換言すれば、細胞外ループの１次構造のみを認識するものではない。かかる構成により、ｈＥＴＡＲのアンタゴニスト抗体として特に好適なモノクローナル抗体が提供される。なお、立体構造を保持した細胞外ループは、天然（native）のｈＥＴＡＲ（活性型ｈＥＴＡＲ）の細胞外ループが該当し、例えば、生きた細胞の表面上に存在する。
【００１４】
前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである構成が推奨される（請求項３）。
【００１５】
マウス由来のものである構成（請求項４）、および以下の性質を有する構成（請求項５）が推奨される。
（ａ）サブクラス：ＩｇＧ２ａ
（ｂ）軽鎖：κ鎖
（ｃ）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに反応し、マウス由来エンドセリン受容体タイプＡとラット由来エンドセリン受容体タイプＡのいずれにも実質的に反応しない。
【００１６】
請求項６に記載の発明は、エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体である。
【００１７】
また請求項７に記載の発明は、エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体である。
【００１８】
かかる構成により、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するアンタゴニストとして使用可能なモノクローナル抗体が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに関係する疾病の診断や、エンドセリン受容体タイプＡの免疫測定法の構築にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００２１】
まず、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）の構造について説明する。
前述したように、ｈＥＴＡＲはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ｈＥＴＡＲをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ｈＥＴＡＲのアミノ酸配列も知られている。配列番号３にｈＥＴＡＲ遺伝子の塩基配列と該塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。
【００２２】
ｈＥＴＡＲの疎水性モデルにより一般的に考えられている構造によれば、ｈＥＴＡＲの各ドメインは、配列番号４に示すアミノ酸配列における以下の部分に相当する。左側がアミノ酸番号、右側が各ドメインである。なお、異種動物間で細胞外ドメイン（Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、細胞外第３ループ）のアミノ酸配列を比較すると、Ｎ末端ドメインの相同性は低く、各ループの相同性は高いことがわかっている。
【００２３】
１〜 ２４：膜移行シグナルペプチド配列（発現後に切断・除去される）
２５〜 ８０：Ｎ末端ドメイン
１０１〜１１９：細胞内第１ループ
１４１〜１６１：細胞外第１ループ
１８０〜２０５：細胞内第２ループ
２２５〜２５６：細胞外第２ループ
２７５〜３１０：細胞内第３ループ
３３２〜３４８：細胞外第３ループ
３７２〜４２７：Ｃ末端ドメイン
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないものである。本発明のモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答が誘導されたマウス等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００２５】
ｈＥＴＡＲに対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にｈＥＴＡＲ（タンパク質）を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいが、動物にｈＥＴＡＲ遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法が好ましく用いられる。
【００２６】
すなわち、ｈＥＴＡＲは膜タンパク質であるので、全長のｈＥＴＡＲを免疫原として使用することは一般に難しい。そこで、タンパク免疫をもってｈＥＴＡＲの細胞外ループに対する免疫応答を誘導したい場合には、細胞外ループのペプチドを免疫原として用いることとなる。しかし、細胞外ループは異種生物間で相同性が高いので、当該ペプチドを免疫原に用いても十分な免疫応答を誘導することができないことがある。結局、タンパク免疫によって細胞外ループに対する免疫応答を十分に誘導することは難しい。
【００２７】
一方、遺伝子免疫によれば、ｈＥＴＡＲの全長をコードする遺伝子を用いることにより、全長のｈＥＴＡＲを免疫原に用いたのと同様の状況を作り出すことができる。さらに、発現したｈＥＴＡＲが動物体内で天然（native）の状態（活性型の状態）で存在できるので、ｈＥＴＡＲの立体構造に特異的な免疫応答を誘導することが可能となる。また遺伝子免疫の手法によれば、ｈＥＴＡＲ遺伝子さえ入手できれば行うことができ、精製されたｈＥＴＡＲを準備する必要がない。
【００２８】
ただしこの場合でも、ｈＥＴＡＲにおいては異種動物間でＮ末端ドメインの相同性が低いため、Ｎ末端ドメインに対する免疫応答が主として誘導されてしまうおそれがある。従来、ｈＥＴＡＲに対する抗体に関してＮ末端ドメインを認識するものしか取得されていないのは、これが原因の１つと考えられる。そこで、より好ましくは、動物に接種する遺伝子として、シャペロニンをコードする遺伝子とｈＥＴＡＲをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いる。当該融合遺伝子を免疫原として用いることにより、ｈＥＴＡＲ遺伝子を単独で用いる場合よりも細胞外ループに対する免疫応答をより選択的に誘導することができる。当該融合遺伝子を用いた遺伝子免疫の方法については、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットにその詳細が記載されている。
【００２９】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在している。特に、バクテリアの細胞質、真核細胞のミトコンドリア、葉緑体に多量に存在している。シャペロニンは、タンパク質の折り畳みを促進する活性やタンパク質の変性を阻止する活性を有する。シャペロニンは、分子量約６万のシャペロニンサブユニット（ＨＳＰ６０ともいう）７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはそのリング状構造体の内部に空洞を有しており、その空洞内に折り畳み途中のタンパク質や変性したタンパク質を一時的に収納して複合体を形成する。そして、空洞内で収納したタンパク質を正しく折り畳み、続いて空洞から正しく折り畳まれたタンパク質を放出することが知られている。
【００３０】
シャペロニンは、バクテリアや真核生物のオルガネラにみられるグループＩ型と、真核生物や古細菌にみられるグループＩＩ型に分類される。本発明のモノクローナル抗体を製造する際に行う遺伝子免疫において、前記した融合遺伝子を用いる場合には、グループＩ型とグループＩＩ型のいずれのシャペロニン遺伝子を採用してもよい。グループＩ型シャペロニンの代表例としては、大腸菌由来のＧｒｏＥＬが挙げられる。グループＩＩ型シャペロニンの代表例としては、古細菌由来のＴＣＰが挙げられる。ＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
【００３１】
ここで「シャペロニンをコードする遺伝子（シャペロニン遺伝子）」には、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子（シャペロニンサブユニット遺伝子）に加え、複数のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された「シャペロニンサブユニット連結体」をコードする遺伝子を含む。シャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子は、複数のシャペロニンサブユニット遺伝子がタンデムに連結された遺伝子と同じである。なお、シャペロニンサブユニット連結体は、天然のシャペロニンと同様のリング状構造体を形成することができる。
【００３２】
前記融合遺伝子の作製方法としては、例えば、ｈＥＴＡＲ遺伝子とシャペロニン遺伝子とをライゲーション反応によって連結すればよい。なお、融合遺伝子を動物に投与する際には、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、プロモーターの制御下にある状態で投与することが好ましい。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。またさらに、発現ベクターには、ＣｐＧモチーフを含めてもよい。
【００３３】
融合遺伝子を動物に投与する方法としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投与も適用可能である。また投与量としては、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはマウスの場合は２５〜１００μｇ／回になる。また投与の回数は、１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い免疫応答を誘導することができる。
【００３４】
なお、タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したｈＥＴＡＲを用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウス等に皮下注射し、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。
【００３５】
免疫される動物としては特に限定はないが、好ましくは、マウスが用いられる。これにより、マウス由来のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３６】
ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順で遺伝子免疫あるいはタンパク免疫され、ｈＥＴＡＲに対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、ＨＡＴ選択培地を用いて行うことができる。また、ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。このようにして、ｈＥＴＡＲの細胞外ループに反応し、ｈＥＴＡＲのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しない抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜ならびにクローニングすればよい。
【００３７】
そして、選抜ならびにクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。
【００３８】
モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、ｈＥＴＡＲに対するアンタゴニストとして、医薬品開発に応用することができる。すなわち、ｈＥＴＡＲが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することにより、血管収縮を抑え、心筋症治療や高血圧症治療に応用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を特定し、キメラ化あるいはヒト化すれば、より安全性が高い医薬品とすることができる。また本発明のモノクローナル抗体は、低分子医薬のスクリーニング用試薬、心筋症・高血圧症検査試薬、組織切片・細胞等を用いたＥＴＡＲ局在検証用研究試薬、組換えＥＴＡＲ発現細胞調製用検査試薬、ＥＴＡＲの結晶構造解析用研究試薬、等の用途にも使用できる。
【００４０】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（１）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ遺伝子の単離
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端にＳａｌＩサイトが導入された。また、同様にして配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するｈＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。
【００４２】
（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号８に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５’末端にＳａｌＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。
【００４３】
（３）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡとＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬは、ｈＥＴＡＲをコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vectorを制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲはｈＥＴＡＲ遺伝子のみを有している。
【００４４】
（４）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡ安定発現細胞及びヒト由来エンドセリン受容体タイプＢ安定発現細胞の作製
（３）で構築したｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを鋳型とし、配列番号１及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを構築した。一方、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＢ（ｈＥＴＢＲ）遺伝子（配列番号１１）を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏのＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲを構築した。
【００４５】
Lipofectamin溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを含むＯＰＴＩ―ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲを２×１０5個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬社）に導入した。同様の手順で、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏ１のみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０5個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。クローニングした各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、さらに、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のＥＴ―１（ペプチド研究所）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ2+濃度が一過的に上昇した。Ｃａ2+濃度は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ2+染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ｈＥＴＡＲと活性型ｈＥＴＢＲのいずれもが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることがわかった。
【００４６】
（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のマウスＢＡＬＢ／ｃ（雌）の両足大腿筋に各０．１２ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬを両足に各３０μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり６０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様して繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、ｈＥＴＡＲを単独で発現するベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲを用いてマウスを免疫した。
【００４７】
（６）フローサイトメトリーによる活性型ｈＥＴＡＲに対する血清中抗体結合性評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＡＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」と称する。）、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＥＴＢＲが導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞」と称する。）、及び、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後３５日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体との相互作用を解析した。
【００４８】
その結果、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリンがほとんど検出されなかったが、遺伝子免疫後の血清では検出された。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体がｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体がｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。なお、対照の細胞を用いた場合も、遺伝子免疫後の血清でもフィコエリスリンが検出されなかった。これは、免疫後の血清中の抗ｈＥＴＡＲ抗体が対照の細胞に結合しないことを示していた。
以上のことから、ベクターｐＣＩ−ｈＥＴＡＲ・ＧｒｏＥＬによる遺伝子免疫によって、マウス血清中に活性型ｈＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。
【００４９】
（７）抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体の作製
上記（５）と同様の手順で遺伝子免疫したマウス６匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０8個の脾細胞と、１×１０7個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、約９９０種のハイブリドーマが得られた。
【００５０】
細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（Ｓｉｇｍａ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。
【００５１】
上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、４穴において抗体との結合性が確認された。
【００５２】
抗体との結合性が確認された４種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、４種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様のフローサイトメトリーを行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を産生する４種のハイブリドーマがクローニングされた。
【００５３】
各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された４種の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を各々約２ｍｇ得た。
【００５４】
各々の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体について、以下に示す試験を行った。それらの結果から、所望の性質を有する抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体を１種選抜した（クローン番号ｈＡ２１）。以下、クローン番号ｈＡ２１の抗ｈＥＴＡＲモノクローナル抗体（以下、単に「ｈＡ２１」と略記することがある。）を代表として、試験の手順と結果を順次示す。
【００５５】
（８）フローサイトメトリーによるｈＥＴＡＲに対する結合性評価
１０μｇ／ｍＬ濃度のｈＡ２１のＰＢＳ溶液（以下、「ｈＡ２１溶液」と称する。）を調製した。一方、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞、および対照の細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した後、ｈＡ２１溶液を各細胞と共にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞とｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図１〜３に示す。図１はｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図２はｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図３は対照の細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１〜３において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｍ１、Ｍ２）のうち、Ｍ２（右領域）に属する細胞がｈＡ２１と結合した細胞を表す。
【００５６】
その結果、ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｍ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１）。これは、ｈＡ２１がｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図２）と対照の細胞を用いた場合（図３）は、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、ｈＡ２１がｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞と対照の細胞のいずれにも結合しないことを示していた。以上のことから、ｈＡ２１が活性型ｈＥＴＡＲの細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。
【００５７】
（９）免疫学的細胞染色よるｈＥＴＡＲに対する結合性評価
ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞ならびにｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を、カバーガラスを入れた６穴プレートに播種し、培養した。細胞が接着増殖したことを確認した後、カバーガラスを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液に浸漬して細胞を固定化し、サポニンにより細胞膜透過処理を行った。その後、カバーガラスをｈＡ２１溶液と共にインキュベートした。さらに、カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、蛍光顕微鏡（オリンパス社）を用いて観察し、各細胞とｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図４（ａ）（ｂ）及び図５（ａ）（ｂ）に示す。図４はｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。図５はｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。図４，５において、蛍光が検出された箇所が、細胞上でｈＡ２１が結合した箇所である。図４，５中に示したスケールバーは１００μｍを示す。
【００５８】
図４（ｂ）に示すように、細胞膜上に発現しているｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合には蛍光が検出され、細胞膜上にｈＡ２１が結合していた。一方、ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を用いた場合には、蛍光は検出されず、細胞膜上にｈＡ２１が結合していなかった。以上より、免疫学的細胞染色によっても、ｈＡ２１が細胞上に発現したｈＥＴＡＲ（細胞外ドメイン）に特異的に結合することが示された。
【００５９】
（１０）エピトープ解析
配列番号４に示すアミノ酸配列の以下の４つの枠内で３アミノ酸残基ずつずらし、１５アミノ酸残基からなるペプチドを計６０種作製した。
・配列番号４のアミノ酸番号２５〜９６（Ｎ末端ドメインを包含する枠）：ペプチド番号１〜２０
・配列番号４のアミノ酸番号１２８〜１７５（細胞外第１ループを包含する枠）：ペプチド番号２５〜３６
・配列番号４のアミノ酸番号２１０〜２７２（細胞外第２ループを包含する枠）：ペプチド番号３７〜５３
・配列番号４のアミノ酸番号３１２〜３５６（細胞外第３ループを包含する枠）：ペプチド番号６１〜７１
【００６０】
作製した各ペプチドをガラスアレイ上に固相化した。このガラスアレイを、ラット血清でブロッキングした後、ｈＡ２１溶液と共にインキュベートした。さらに、２次抗体としてＣｙ５標識抗マウスＩｇＧラット抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ社）を添加した後、蛍光スライドスキャナーＧｅｎｅｐｉｘ４２００Ａ（ＡｘｓｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、各ペプチドとｈＡ２１との相互作用を解析した。結果を図６に示す。図６において、縦軸は蛍光強度、横軸は各ペプチドの番号を表す。図６に示すように、ｈＡ２１は細胞外第２ループの一部に相当する４２番と４３番のペプチドにのみ強く結合した（図６の丸囲み部分）。４２番のペプチドは配列番号４のアミノ酸番号２２５（Ｖａｌ）〜２３９（Ｃｙｓ）、４３番のペプチドはアミノ酸番号２２８（Ｐｒｏ）〜２４２（Ａｓｎ）の部分に相当し、いずれも細胞外第２ループ（アミノ酸番号２２５〜２５６）の一部を構成するものであった。以上より、ｈＡ２１がｈＥＴＡＲの細胞外第２ループを特異的に認識することがわかった。
【００６１】
（１１）細胞内Ｃａ2+シグナル伝達阻害活性評価
ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を、２×１０4個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、各穴に１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内のｈＡ２１を添加した。また対照として、マウスＩｇＧ（ピアス社、陰性対照）又はペプチド性アンタゴニストＢＱ１２３（ＴＯＣＲＩＳ社、陽性対照）を同様に１０-6〜１０-12Ｍの濃度範囲内で添加したものも調製した。１時間後、１×１０-8ＭのエンドセリンＥＴ−１（ペプチド研究所）によって各細胞を刺激した際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇の抗体濃度依存的減少度を測定した。Ｃａ2+濃度の測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。結果を図７に示す。図７は細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。図７に示すように、ｈＡ２１を添加した場合には、ＢＱ１２３と添加した場合と同様に細胞内Ｃａ2+濃度の低下がみられた。これは、ｈＡ２１がエンドセリンＥＴ−１とｈＥＴＡＲとの結合を競合的に阻害した結果、細胞内へのシグナル伝達が阻害されたことを示していた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出すると、ｈＡ２１では１．７０８×１０-7Ｍ、ＢＱ１２３では２．８０７×１０-8Ｍであった。
以上より、ｈＡ２１が、ｈＥＴＡＲが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害できることが示された。
【００６２】
（１２）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ｈＡ２１のアイソタイプを決定した。検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによった。結果を図８に示す。図８（ａ）は対照の結果を表す写真、図８（ｂ）はｈＡ２１の結果を表す写真である。図８（ｂ）に示すように、ｈＡ２１のサブクラスはＩｇＧ２ａ、軽鎖はκ鎖であった（矢印参照）。
【００６３】
（１３）異種ＥＴＡＲに対する結合性評価
上記（１）〜（６）と同様にして「ｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」と「ｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞」を作製した。これらの細胞を用い、上記（８）と同様のフローサイトメトリーにて、ｈＡ２１のｍＥＴＡＲとｒＥＴＡＲに対する結合性を評価した。結果を図９に示す。図９（ａ）はｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラム、図９（ｂ）はｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。すなわち、いずれの細胞を用いた場合でも、Ｍ２のエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、ｈＡ２１がｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞のいずれにも結合しないことを示していた。なおｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図９（ｂ））は、ｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を用いた場合（図９（ａ））よりもＭ２のエリアに検出された細胞数が多かったが、実質的には結合していないと呼べるレベルであった。以上より、ｈＡ２１はｈＥＴＡＲに対して特異的に反応するが、ｍＥＴＡＲとｒＥＴＡＲのいずれにも実質的に反応しないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図２】ｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図３】対照の細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【図４】ｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＡＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。
【図５】ｈＡ２１溶液と共にインキュベートしたｈＥＴＢＲ遺伝子導入細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を表す写真であり、（ａ）は微分干渉画像、（ｂ）は蛍光顕微鏡画像である。
【図６】エピトープ解析の結果を表すグラフである。
【図７】細胞内Ｃａ2+濃度と各添加物の濃度との関係を表すグラフである。
【図８】アイソタイプ解析の結果を表す写真であり、（ａ）は対照の結果、（ｂ）はｈＡ２１の結果を表す。
【図９】（ａ）はｍＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラム、（ｂ）はｒＥＴＡＲ遺伝子導入細胞とｈＡ２１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記細胞外ループの立体構造を認識するものである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
マウス由来のものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
以下の性質を有する請求項４に記載のモノクローナル抗体。
（ａ）サブクラス：ＩｇＧ２ａ
（ｂ）軽鎖：κ鎖
（ｃ）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに反応し、マウス由来エンドセリン受容体タイプＡとラット由来エンドセリン受容体タイプＡのいずれにも実質的に反応しない。
【請求項６】
エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１】
ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡの細胞外ループに反応し、ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡのＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び細胞内ループのいずれにも反応しないモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記細胞外ループの立体構造を認識するものである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記細胞外ループドメインは、細胞外第２ループである請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
マウス由来のものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
以下の性質を有する請求項４に記載のモノクローナル抗体。
（ａ）サブクラス：ＩｇＧ２ａ
（ｂ）軽鎖：κ鎖
（ｃ）ヒト由来エンドセリン受容体タイプＡに反応し、マウス由来エンドセリン受容体タイプＡとラット由来エンドセリン受容体タイプＡのいずれにも実質的に反応しない。
【請求項６】
エンドセリン受容体とナチュラルリガンドとの結合を阻害することができる請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
エンドセリン受容体が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を阻害することができる請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図９】
【図４】
【図５】
【図８】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図９】
【図４】
【図５】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２８０２６６（Ｐ２００８−２８０２６６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２４２８３（Ｐ２００７−１２４２８３）
【出願日】平成１９年５月９日（２００７．５．９）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月９日（２００７．５．９）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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