ヤブレツボカビ科原生生物における多価不飽和脂肪酸の含量を高める方法
本発明は、細胞を低温条件下に保存することによって、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、０．５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に接種するステップ、前記培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップ、遠心分離によって前記細胞を収穫してバイオマスを得るステップ、前記バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ、および前記保存されたバイオマスから、増大したＰＵＦＡを得るステップ、を含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ；培養物を、室温にて２〜５日間増殖させるステップ；遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ；バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ；および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の構成成分であり、脂質はあらゆる生物の成長、生存、繁殖に必要とされる。脂肪酸のうち飽和脂肪酸は、炭素原子が互いに一重結合によって結合しており、炭素二重結合を含まない化学構造を有する。不飽和脂肪酸は、１つ以上の、互いの炭素原子が二重結合によって結合している化学構造を有する。多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと称する）は、そのような二重結合が２つ以上存在する脂肪酸である。
【０００３】
ＰＵＦＡのうちの２種類は、動物および人間の健康において極めて重要であると考えられる。この２種類とはドコサヘキサエン酸とエイコサペンタエン酸であり、以下においてそれぞれを、ＤＨＡとＥＰＡと称する。ＤＨＡとＥＰＡの分子構造はいずれも、脂肪酸構造のメチル末端から３番目の炭素原子が最初の二重結合を形成している。したがって、これらのＰＵＦＡは、オメガ−３ＰＵＦＡとも称される。ＤＨＡには２２個の炭素原子が含まれており、これらのなかに６個の炭素二重結合が存在する。ＥＰＡには２０個の炭素原子が含まれており、これらのなかに５個の炭素二重結合が存在する。
【０００４】
ＤＨＡとＥＰＡのいずれも、人間の健康と動物の栄養にとって重要であることが明らかになっている。人間の健康に関してＤＨＡとＥＰＡは、子供の脳の発達、アテローム性動脈硬化の防止、夜盲症の防止、神経疾患の防止に重要なことが明らかになっているほか、癌の防止の可能性も示されている（Bajpai, P. and P. K. Bajpai. 1993. Journal of Biotechnology 30: 161-183 ; Barclay, W. R. et al. 1994. Journal of Applied Phycology 6: 123-129; Singh, A. and O. P. Ward. 1997. Advances in applied microbiology, 45: 271-312）。
【０００５】
これら２種類のオメガ−３ＰＵＦＡは、甲殻類生物（エビなど）の成長と繁殖を促進させることが明らかにされており、甲殻類生物は、人間により消費される養殖生物として非常に重要である（Harrison, K. E. 1990. Journal of Shellfish Research 9: 1-28）。
【０００６】
したがってＤＨＡとＥＰＡを、人間および動物の食料に取り込むことは意義深いと考えられる。ヤブレツボカビ科の原生生物におけるＤＨＡおよびＥＰＡの含量は、本発明に詳しく説明されるように、高い粘性の培地中で細胞を増殖させることによって、その天然状態の含量よりも高められるので、ヤブレツボカビ科の細胞は、人間の栄養補給剤および動物飼料として、現在知られている方法と比較して、より好ましく使用されうる。ヤブレツボカビ科の細胞は、よく知られている発酵手法を用いて大規模に培養されうる。このようにして得られた細胞は、適切な工程（例えば噴霧乾燥や冷凍など）を経た後に貯蔵されることによって、動物飼料として使用されうる。また、オメガ−３脂肪酸の含量が増大した細胞バイオマスを収穫し、それからＤＨＡとＥＰＡを純粋な形で抽出することもできる。これらは、不可欠なオメガ−３ＰＵＦＡを十分に含まない人間の食品を補うために使用されうる。
【０００７】
人間が消費するＥＰＡおよびＤＨＡの主たる供給源の一つは魚油である。しかしながら魚油は、多くの消費者が不快に感じる匂いがあるという欠点を有する。また、ＤＨＡおよびＥＰＡが含まれる魚は、季節によって非常に限定され、そのオメガ−３ＰＵＦＡ含量も変動する。さらに魚油のほとんどは水素化されるので、オメガ−３ＰＵＦＡも分解される。
【０００８】
これらの理由から、ＥＰＡおよびＤＨＡを含み、かつ大規模に培養されうる微生物は、人間の栄養分および動物飼料に好適に用いられると考えられる（Bajpai, P. and P. K. Bajpai. 1993. Journal of Biotechnology 30: 161-183）。いくつかの単細胞植物、すなわち藻類には、多量のＥＰＡおよびＤＨＡが含まれており、上記の目的に適していると考えられてきた。A. Singh and O. P. Ward（Singh, A. and O. P. Ward, 1997. Advances in Applied Microbiology 45: 272-312）を参照。微生物は、安価な栄養物を用いて容易かつ大規模に培養することができる。いくつかの種類の微生物には、多量のＥＰＡおよびＤＨＡが含まれている。このような微生物は、そのまま食料として用いられたり、さらなる用途を目的として上記のＰＵＦＡを抽出されうる。多量のＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物を調べた結果、ヤブレツボカビ科の原生生物に、最も多量のＤＨＡおよびＥＰＡが含まれていることが明らかにされた。ヤブレツボカビは、商業的な重要性がすでに検討されている。ヤブレツボカビ科の細胞は、動物飼料中で使用されたり、ＰＵＦＡを抽出されたりして、商業的に利用されている（Lewis, T. E. et al., 1999, The Biotechnological potential of thraustochytrids. Marine Biotechnology 1: 580-587; US Patent No. 6,451, 567 of 17 September 2002）。
【０００９】
日本国特許第９６３３２６３号（１９９６年）には、ヤブレツボカビ株の食品産業における用途として、食品添加物、栄養補給剤、幼児用調乳の添加物、飼料添加物および医薬品添加物などが記載されている。その株には、少なくとも２重量％のＤＨＡ（乾燥重量）が含まれている。一方、日本国特許第９８０３６７１号（１９９８年）には、ヤブレツボカビ科の原生生物のリピドからの、発酵によるＤＨＡ、および別のＰＵＦＡであるドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の製造について記載されている。原生生物ヤブレツボカビの細胞は、養殖における飼料としてそのまま使用することができる（米国特許第５,９０８,６２２号、１９９９年６月１日）。あるいは、ヤブレツボカビの細胞から、適切な技術を用いてＤＨＡおよびＥＰＡを抽出することができる（特開平１０−３１０５５５５（１９９８年１１月２４日）、特開平１０−３１０５５６（１９９７年５月１２日））。米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、高濃度のオメガ−３ＰＵＦＡを含む原生生物ヤブレツボカビを用いて、微生物産物そのもの、またはその抽出物を生産する方法が記載されている。またヤブレツボカビ科の原生生物を、人間の栄養補給剤として利用できる可能性もある（Application A428 of Australia New Zealand Food Authority (ANZFA), 12 Dec. 2001）。
【００１０】
ヤブレツボカビ科原生生物からＤＨＡおよびＥＰＡを生産するためには、それを発酵槽において適切な条件下で成長させて、商業的に有用な量の前記２種類のＰＵＦＡを得る必要がある。いくつかの研究報告および特許では、ヤブレツボカビにおけるＤＨＡおよびＥＰＡの増大と生産に適した条件を提供するという課題に取り組んでいる。米国特許第５,３４０,７４２号明細書には、原生生物ヤブレツボカビの成長に適しているとされる培地中で、原生生物ヤブレツボカビを成長させる方法が開示されている。米国特許第６,４６１,８３９号明細書（２００２年１０月８日）には、炭素源としてオイルまたは脂肪酸が含まれている培地を用いて、ラビリンチュラ属（Labyrinthula sp.）においてＰＵＦＡを生産する方法が示されている。Yokochi等（1999; Applied Microbiology and Biotechnology, 49, 72-76）は、ヤブレツボカビ属スキゾキトリウムリマシウム（thraustochytrid Schizochytrium limacinum）において多量のＤＧＡを生産するための、塩分、温度、炭素源、油／窒素源について説明している。スラウストキトリウム・アウレム（Thraustochytrium aureum）にとって好適なｐＨと培地成分も知られている（Iida T. et al., Journal of Fermentation and Biogengineering, 81: 76-78）。
【００１１】
本発明は、培地の成分に依存することなく、原生生物ヤブレツボカビにおけるＤＨＡおよびＥＰＡの含量を高めて、ＰＵＦＡを商業的に高い収率で得ることを目的とする。さらに、上述した先行技術特許では、ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度が中程度である種々の株が考慮されていないが、本発明においては、ＤＨＡおよびＥＰＡの含量が中程度である株さえも、低温条件下にさらすことによって、多量のＰＵＦＡを生産するために用いることができる。
【００１２】
米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、ヤブレツボカビが、成長時にわたって低温によるストレスを受けると、培地中に多量の溶存酸素を維持すると記載されている。しかしながら、数百リットルにもおよぶ多量のヤブレツボカビの培養物を低温条件下に維持することは、高コストな方法である。さらに米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、酸素含有量の高い液体培地から細胞バイオマスを取り出して低温条件下に保存した場合に、そのＰＵＦＡ含量が高められることを示唆する記載はない。さらに、ＰＵＦＡ含量の変動に注目させる示唆はない。一方、本出願人は数百の実験を行って本願方法を開発した。さらに、いかなる当業者も、上記の米国特許に記載された方法からＰＵＦＡ含量を推測することはない。本願発明では、室温において細胞を増殖させ、細胞を収穫し、収穫された細胞を低温にて保存することによって、上記の問題を克服する。この保存ステップによって、ＤＨＡおよびＥＰＡ含量を増加させる。
【００１３】
上記した特許のすべては、多数のヤブレツボカビの培養物をスクリーニングして、ＤＨＡおよびＥＰＡ含量が最も高い株を選択し、それらの突然変異株を作製し、その突然変異株を商業生産に最適な培養条件下で培養する技術に関する。米国特許第６,４１０,２８２号明細書には、多価不飽和脂肪酸を増大させる方法が示されているが、この方法では、培地の成分を変えずに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することによって培地の粘性を増大させている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主たる目的は、原生生物ヤブレツボカビにおけるＰＵＦＡ含量を増大させることにより、上述した欠点を解消することである。
本発明の別の目的は、最適な栄養条件下でヤブレツボカビ株を作製して、通常に生産されるよりも多量のＤＨＡおよびＥＰＡを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、標準培地で原生生物ヤブレツボカビの培養物を室温にて増殖させ、細胞を収穫し、収穫された細胞を低温条件下で保存することによって、原生生物ヤブレツボカビの脂肪酸の含量を高めることである。
本発明のさらに別の目的は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ、培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップ、遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ、バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ、および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップ、を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
したがって本発明は、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって、０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ、培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップ、遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ、バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ、および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップ、を含む方法に関する。
【００１７】
本発明の別の実施形態においては、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、
・ 原生生物を培地に植えつけるステップと、
・ 培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップと、
・ 遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップと、
・ バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップと、
・ 保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップと、
を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態においては、ＰＵＦＡはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＨＡ）である。
本発明のさらに別の実施形態においては、増大したＰＵＦＡは、動物飼料、人間の栄養分、および栄養補給剤として用いられる。
本発明のさらに別の実施形態においては、室温は２５〜３０℃の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態においては、原生生物ヤブレツボカビは、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）、およびウルケニア（Ulkenia）である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態においては、培地は０.３重量％〜３.０重量％濃度のペプトンと、０.００５重量％〜０.５重量％濃度の酵母エキスと、０.００５重量％〜５.０重量％濃度のグルコースと、海水とを含む。
本発明の別の実施形態においては、ペプトンの濃度は約１.５重量％である。
本発明のさらに別の実施形態においては、酵母エキスの濃度は約０.１重量％である。
本発明のさらに別の実施形態においては、グルコースの濃度は約１.０重量％である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態においては、通常条件下でＰＵＦＡの含量が中程度である細胞さえからも、ＰＵＦＡが多量に生産される。
【００２１】
本発明は、標準培地中で原生生物ヤブレツボカビの培養物を室温にて増殖させ、細胞を収穫し、それらを低温条件下で保存することによって提供される。
【００２２】
したがって本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める冷蔵方法であって、（ａ）スラウストキトリウム（Thraustochytrim）、スキゾキトリウム（Schizoclaytrium）、ウルケニア（Ulkenia）などの属に属するヤブレツボカビの培養物を用意するステップ、（ｂ）上記原生生物の培養物を、培地中で２５〜３０℃の範囲の温度にて２〜５日培養するステップ、（ｃ）遠心分離によって上記培養物から細胞を収穫するステップ、（ｇ）細胞バイオマスを低温条件下で最大４８時間保存するステップ、ならびに（ｈ）増大した量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を抽出するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態においては、原生生物ヤブレツボカビの細胞におけるＰＵＦＡの含量を高める方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態においては、標準培地中で培養物を増殖させ、細胞を収穫し、それらを低温条件下で保存することによって、原生生物ヤブレツボカビの細胞中のＤＨＡおよびＥＰＡ含量を増大させる。
本発明のさらに別の実施形態においては、使用される培地は、０.５重量％〜１.５重量％（好ましくは１.５重量％）のペプトン、０.０１重量％〜０.１重量％（好ましくは０.１重量％）の酵母エキス、０.０１重量％〜１.０重量％（好ましくは１.０重量％）のグルコース、および１００ｍｌの海水を含有する。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態においては、低温での保存時間は１２〜４８時間である。
本発明のさらに別の実施形態においては、増大するＰＵＦＡは、ＤＨＡおよびＥＰＡである。
【００２５】
本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める方法に関する。詳細には、本発明は、ヤブレツボカビと称される原生生物のグループに属する微生物の細胞中の多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸を、前記細胞を低温条件下にて保存することによって増大させる方法に関する。このような多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量が増大された細胞は、動物飼料、人間の栄養分、栄養補給剤用としてのＰＵＦＡの抽出など、多価不飽和脂肪酸を必要とするさまざまな有用な用途において、ＰＵＦＡの含量が増大されていない細胞よりも好ましく利用されうる。
【００２６】
したがって本発明は、標準培地、またはＤＨＡおよびＥＰＡの生産のために最適化された培地を用いて、かつ収穫された細胞バイオマスを低温にて保存して、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める方法を提供する。
ステップａ：ＤＨＡおよびＥＰＡを含むヤブレツボカビの培養物を用意する。
ステップｂ：前記株を培地に植え付ける。
ステップｃ：培養物を２日間増殖させる。
ステップｄ：前記培地を使用する接種物として使用するための培養物を取得し、それをヤブレツボカビを培養するための標準培地、またはその特定の株におけるＥＰＡおよびＤＨＡの生産用に最適化されている培地に植えつける。
ステップｅ：前記培養物を２５〜３０℃にて、個別に２〜５日間増殖させる。
ステップｆ：遠心分離またはその他の適切な方法によって、上記培養物から細胞を収穫する。
ステップｇ：細胞を１０℃の温度にて１２〜４８時間保存し、増大した量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を抽出する、または細胞バイオマスをさまざまな目的に使用する。
【００２７】
まず本発明では、オメガ−３ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＥＰＡを含む、ヤブレツボカビの候補種の培養物を、液体培地に植えつける。それ以外の原生生物ヤブレツボカビに属する原生生物の株、例えば米国バクテリア登録機関ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）株として、ヤブレツボカビ属（Thraustochytrium sp.）に属するＡＴＣＣ番号１８９０６、１８９０７、２０８９０、２０８９１、２０８９２、２６１８５；スラウストキトリウム・ロセウム・ガルトナー（Thraustochytrium roseum Gaertner）に属するＡＴＣＣ番号２８２１０；スラウストキトリウム・アウレム・ゴールドスタイン（Thraustochytrium aureum Goldstein）に属するＡＴＣＣ番号３４３０４を使用することができる。ヤブレツボカビ以外に、ヤブレツボカビに関連する原生生物ラビリンチュラ（labyrinthulid protists）のメンバー、例えばラビリンチュラ種またはアプラノキトリウム種（Aplanochytrium）などを使用してもよい。
【００２８】
適切な培地とは、例えば、ペプトン、酵母エキス、グルコースおよび海水を含む培地である。培養物が良好に増殖することができるのであれば、他の培地を用いてもよい。培養物を、２５〜３０℃の範囲の室温にて２日間増殖させる。この培養物を接種物として使用して、上記のような標準培地、または特定のヤブレツボカビ株におけるＤＨＡおよびＥＰＡの生産に最適化された培地に植えつける。培養物は、実験室の回転式振盪培養機の上のフラスコの中で増殖させるか、大規模な培養が必要なときには、発酵槽の中で増殖させればよい。培養物は、２５〜３０℃の室温か、または前記特定の株の増殖にとって好ましい任意の温度にて増殖されればよい。
【００２９】
培養物を適切な期間（例えば２〜７日間）増殖させた後、培養物から細胞を収穫する。細胞の収穫は、遠心分離、定常流遠心分離（continuous flow centrifugation）、濾過などの任意の適切な方法によって行えばよい。次いで、細胞バイオマスを約１０℃にて１２〜４８時間保存する。その後、保存された細胞は、ヤブレツボカビの細胞を必要とするあらゆる用途に使用されうる。前記用途の例には、動物飼料、人間の栄養補給剤、あるいは純粋なＤＨＡおよびＥＰＡの抽出用としての細胞バイオマスが含まれる。
【００３０】
前述のように本発明は、オメガ−３ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＥＰＡの含量を高める方法に関する。本方法によって、ヤブレツボカビの培養株から、他の方法によるよりも多量のＰＵＦＡを生産することができる。さらに、通常の条件下ではこれらのＰＵＦＡを中程度の量しか含まない株を使用しても、その細胞において多量のＰＵＦＡを生産することができる。
【００３１】
以下の実施例は、本発明を説明する目的で示してあり、したがって、本発明の範囲を制限するように解釈されないものとする。
【００３２】
［実施例１］
形態およびライフサイクルが、スキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に対応する、＃ＮＩＯＳ−１株に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物として用いた。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫に１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスのほぼ０.５倍増のＤＨＡが含まれていた（図１）。
【００３３】
［実施例２］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、＃ＮＩＯＳ−１株に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスは、ただちに使用し、脂肪酸の抽出とガスクロマトグラフィーによる分析を行った。収穫した細胞バイオマスの別のセットは、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ３倍のＥＰＡが含まれていた（図２）。
【００３４】
［実施例３］
形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・ガルトナー（Thraustochytrium Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−２に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％、および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスは、ただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットは、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ２倍のＤＨＡが含まれていた（図３）。
【００３５】
［実施例４］
形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・ガルトナー（Thraustochytrium Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−２に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％、および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。対照の培養物にはＥＰＡが含まれていなかったが、冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、多量のＰＵＦＡが含まれていた（図４）。
【００３６】
［実施例５］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−３に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＤＨＡが含まれていた（図５）。
【００３７】
［実施例６］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−３に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜４倍のＥＰＡが含まれていた（図６）。
【００３８】
［実施例７］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−４に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＤＨＡが含まれていた（図７）。
【００３９】
［実施例８］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−４に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＥＰＡが含まれていた（図８）。
【００４０】
［実施例９］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−１に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。６セットの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別の５セットを、冷蔵庫に１０℃にて、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に６時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量の増加を示さず、１２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量のわずかな増加を示し、２４時間保存した細胞バイオマスはほぼ１００％の増加を示し、４８時間保存した細胞バイオマスはほぼ５０％の増加を示し、７２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡの増加を示さなかった（図９）。
【００４１】
［実施例１０］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−１に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。６セットの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別の５セットを、冷蔵庫に１０℃にて、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に６時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量の増加を示さず、１２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量のわずかな増加を示し、２４時間保存した細胞バイオマスはほぼ１００％の増加を示し、４８時間保存した細胞バイオマスはほぼ３００％の増加を示し、７２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡの増加を示さなかった（図１０）。
【００４２】
本発明の主な利点は次のとおりである。
１． 培養物の中に存在するヤブレツボカビのＤＨＡおよびＥＰＡの量を、単純な手法により、さらに高めることができる。
２． 中程度の量のＤＨＡおよびＥＰＡしか含まない株についても、これらの脂肪酸を増大させることができる。
３． ＤＨＡおよびＥＰＡ含量の増加は、細胞バイオマスを１２〜４８時間、低温において保存することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図２】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー属に対応するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図３】形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・スパロー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−２を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図４】形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・スパロー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−２を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含有量を示している。
【図５】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−３を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図６】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−３を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図７】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−４を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図８】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図９】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム種属に相当するヤブレツボカビＮＩＯＳ−１における、細胞バイオマスを低温条件下で種々の時間にわたり保存したときの、ＤＨＡ含量を示している。
【図１０】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム種（Schizochytrium sp.）属に相当するヤブレツボカビＮＩＯＳ−１における、細胞バイオマスを低温条件下で種々の時間にわたり保存したときの、ＥＰＡ含量を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ；培養物を、室温にて２〜５日間増殖させるステップ；遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ；バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ；および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の構成成分であり、脂質はあらゆる生物の成長、生存、繁殖に必要とされる。脂肪酸のうち飽和脂肪酸は、炭素原子が互いに一重結合によって結合しており、炭素二重結合を含まない化学構造を有する。不飽和脂肪酸は、１つ以上の、互いの炭素原子が二重結合によって結合している化学構造を有する。多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと称する）は、そのような二重結合が２つ以上存在する脂肪酸である。
【０００３】
ＰＵＦＡのうちの２種類は、動物および人間の健康において極めて重要であると考えられる。この２種類とはドコサヘキサエン酸とエイコサペンタエン酸であり、以下においてそれぞれを、ＤＨＡとＥＰＡと称する。ＤＨＡとＥＰＡの分子構造はいずれも、脂肪酸構造のメチル末端から３番目の炭素原子が最初の二重結合を形成している。したがって、これらのＰＵＦＡは、オメガ−３ＰＵＦＡとも称される。ＤＨＡには２２個の炭素原子が含まれており、これらのなかに６個の炭素二重結合が存在する。ＥＰＡには２０個の炭素原子が含まれており、これらのなかに５個の炭素二重結合が存在する。
【０００４】
ＤＨＡとＥＰＡのいずれも、人間の健康と動物の栄養にとって重要であることが明らかになっている。人間の健康に関してＤＨＡとＥＰＡは、子供の脳の発達、アテローム性動脈硬化の防止、夜盲症の防止、神経疾患の防止に重要なことが明らかになっているほか、癌の防止の可能性も示されている（Bajpai, P. and P. K. Bajpai. 1993. Journal of Biotechnology 30: 161-183 ; Barclay, W. R. et al. 1994. Journal of Applied Phycology 6: 123-129; Singh, A. and O. P. Ward. 1997. Advances in applied microbiology, 45: 271-312）。
【０００５】
これら２種類のオメガ−３ＰＵＦＡは、甲殻類生物（エビなど）の成長と繁殖を促進させることが明らかにされており、甲殻類生物は、人間により消費される養殖生物として非常に重要である（Harrison, K. E. 1990. Journal of Shellfish Research 9: 1-28）。
【０００６】
したがってＤＨＡとＥＰＡを、人間および動物の食料に取り込むことは意義深いと考えられる。ヤブレツボカビ科の原生生物におけるＤＨＡおよびＥＰＡの含量は、本発明に詳しく説明されるように、高い粘性の培地中で細胞を増殖させることによって、その天然状態の含量よりも高められるので、ヤブレツボカビ科の細胞は、人間の栄養補給剤および動物飼料として、現在知られている方法と比較して、より好ましく使用されうる。ヤブレツボカビ科の細胞は、よく知られている発酵手法を用いて大規模に培養されうる。このようにして得られた細胞は、適切な工程（例えば噴霧乾燥や冷凍など）を経た後に貯蔵されることによって、動物飼料として使用されうる。また、オメガ−３脂肪酸の含量が増大した細胞バイオマスを収穫し、それからＤＨＡとＥＰＡを純粋な形で抽出することもできる。これらは、不可欠なオメガ−３ＰＵＦＡを十分に含まない人間の食品を補うために使用されうる。
【０００７】
人間が消費するＥＰＡおよびＤＨＡの主たる供給源の一つは魚油である。しかしながら魚油は、多くの消費者が不快に感じる匂いがあるという欠点を有する。また、ＤＨＡおよびＥＰＡが含まれる魚は、季節によって非常に限定され、そのオメガ−３ＰＵＦＡ含量も変動する。さらに魚油のほとんどは水素化されるので、オメガ−３ＰＵＦＡも分解される。
【０００８】
これらの理由から、ＥＰＡおよびＤＨＡを含み、かつ大規模に培養されうる微生物は、人間の栄養分および動物飼料に好適に用いられると考えられる（Bajpai, P. and P. K. Bajpai. 1993. Journal of Biotechnology 30: 161-183）。いくつかの単細胞植物、すなわち藻類には、多量のＥＰＡおよびＤＨＡが含まれており、上記の目的に適していると考えられてきた。A. Singh and O. P. Ward（Singh, A. and O. P. Ward, 1997. Advances in Applied Microbiology 45: 272-312）を参照。微生物は、安価な栄養物を用いて容易かつ大規模に培養することができる。いくつかの種類の微生物には、多量のＥＰＡおよびＤＨＡが含まれている。このような微生物は、そのまま食料として用いられたり、さらなる用途を目的として上記のＰＵＦＡを抽出されうる。多量のＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物を調べた結果、ヤブレツボカビ科の原生生物に、最も多量のＤＨＡおよびＥＰＡが含まれていることが明らかにされた。ヤブレツボカビは、商業的な重要性がすでに検討されている。ヤブレツボカビ科の細胞は、動物飼料中で使用されたり、ＰＵＦＡを抽出されたりして、商業的に利用されている（Lewis, T. E. et al., 1999, The Biotechnological potential of thraustochytrids. Marine Biotechnology 1: 580-587; US Patent No. 6,451, 567 of 17 September 2002）。
【０００９】
日本国特許第９６３３２６３号（１９９６年）には、ヤブレツボカビ株の食品産業における用途として、食品添加物、栄養補給剤、幼児用調乳の添加物、飼料添加物および医薬品添加物などが記載されている。その株には、少なくとも２重量％のＤＨＡ（乾燥重量）が含まれている。一方、日本国特許第９８０３６７１号（１９９８年）には、ヤブレツボカビ科の原生生物のリピドからの、発酵によるＤＨＡ、および別のＰＵＦＡであるドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の製造について記載されている。原生生物ヤブレツボカビの細胞は、養殖における飼料としてそのまま使用することができる（米国特許第５,９０８,６２２号、１９９９年６月１日）。あるいは、ヤブレツボカビの細胞から、適切な技術を用いてＤＨＡおよびＥＰＡを抽出することができる（特開平１０−３１０５５５５（１９９８年１１月２４日）、特開平１０−３１０５５６（１９９７年５月１２日））。米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、高濃度のオメガ−３ＰＵＦＡを含む原生生物ヤブレツボカビを用いて、微生物産物そのもの、またはその抽出物を生産する方法が記載されている。またヤブレツボカビ科の原生生物を、人間の栄養補給剤として利用できる可能性もある（Application A428 of Australia New Zealand Food Authority (ANZFA), 12 Dec. 2001）。
【００１０】
ヤブレツボカビ科原生生物からＤＨＡおよびＥＰＡを生産するためには、それを発酵槽において適切な条件下で成長させて、商業的に有用な量の前記２種類のＰＵＦＡを得る必要がある。いくつかの研究報告および特許では、ヤブレツボカビにおけるＤＨＡおよびＥＰＡの増大と生産に適した条件を提供するという課題に取り組んでいる。米国特許第５,３４０,７４２号明細書には、原生生物ヤブレツボカビの成長に適しているとされる培地中で、原生生物ヤブレツボカビを成長させる方法が開示されている。米国特許第６,４６１,８３９号明細書（２００２年１０月８日）には、炭素源としてオイルまたは脂肪酸が含まれている培地を用いて、ラビリンチュラ属（Labyrinthula sp.）においてＰＵＦＡを生産する方法が示されている。Yokochi等（1999; Applied Microbiology and Biotechnology, 49, 72-76）は、ヤブレツボカビ属スキゾキトリウムリマシウム（thraustochytrid Schizochytrium limacinum）において多量のＤＧＡを生産するための、塩分、温度、炭素源、油／窒素源について説明している。スラウストキトリウム・アウレム（Thraustochytrium aureum）にとって好適なｐＨと培地成分も知られている（Iida T. et al., Journal of Fermentation and Biogengineering, 81: 76-78）。
【００１１】
本発明は、培地の成分に依存することなく、原生生物ヤブレツボカビにおけるＤＨＡおよびＥＰＡの含量を高めて、ＰＵＦＡを商業的に高い収率で得ることを目的とする。さらに、上述した先行技術特許では、ＤＨＡおよびＥＰＡの濃度が中程度である種々の株が考慮されていないが、本発明においては、ＤＨＡおよびＥＰＡの含量が中程度である株さえも、低温条件下にさらすことによって、多量のＰＵＦＡを生産するために用いることができる。
【００１２】
米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、ヤブレツボカビが、成長時にわたって低温によるストレスを受けると、培地中に多量の溶存酸素を維持すると記載されている。しかしながら、数百リットルにもおよぶ多量のヤブレツボカビの培養物を低温条件下に維持することは、高コストな方法である。さらに米国特許第５,３４０,５９４号明細書には、酸素含有量の高い液体培地から細胞バイオマスを取り出して低温条件下に保存した場合に、そのＰＵＦＡ含量が高められることを示唆する記載はない。さらに、ＰＵＦＡ含量の変動に注目させる示唆はない。一方、本出願人は数百の実験を行って本願方法を開発した。さらに、いかなる当業者も、上記の米国特許に記載された方法からＰＵＦＡ含量を推測することはない。本願発明では、室温において細胞を増殖させ、細胞を収穫し、収穫された細胞を低温にて保存することによって、上記の問題を克服する。この保存ステップによって、ＤＨＡおよびＥＰＡ含量を増加させる。
【００１３】
上記した特許のすべては、多数のヤブレツボカビの培養物をスクリーニングして、ＤＨＡおよびＥＰＡ含量が最も高い株を選択し、それらの突然変異株を作製し、その突然変異株を商業生産に最適な培養条件下で培養する技術に関する。米国特許第６,４１０,２８２号明細書には、多価不飽和脂肪酸を増大させる方法が示されているが、この方法では、培地の成分を変えずに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することによって培地の粘性を増大させている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主たる目的は、原生生物ヤブレツボカビにおけるＰＵＦＡ含量を増大させることにより、上述した欠点を解消することである。
本発明の別の目的は、最適な栄養条件下でヤブレツボカビ株を作製して、通常に生産されるよりも多量のＤＨＡおよびＥＰＡを生産することである。
本発明のさらに別の目的は、標準培地で原生生物ヤブレツボカビの培養物を室温にて増殖させ、細胞を収穫し、収穫された細胞を低温条件下で保存することによって、原生生物ヤブレツボカビの脂肪酸の含量を高めることである。
本発明のさらに別の目的は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ、培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップ、遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ、バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ、および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップ、を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
したがって本発明は、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって、０.５〜５倍に高める方法であって、原生生物を培地に植えつけるステップ、培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップ、遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップ、バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップ、および保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップ、を含む方法に関する。
【００１７】
本発明の別の実施形態においては、ヤブレツボカビ科の原生生物における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量を、細胞を低温条件下に保存することによって０.５〜５倍に高める方法であって、
・ 原生生物を培地に植えつけるステップと、
・ 培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップと、
・ 遠心分離によって細胞を収穫してバイオマスを得るステップと、
・ バイオマスを１２〜４８時間、約１０℃にて保存するステップと、
・ 保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップと、
を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態においては、ＰＵＦＡはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＨＡ）である。
本発明のさらに別の実施形態においては、増大したＰＵＦＡは、動物飼料、人間の栄養分、および栄養補給剤として用いられる。
本発明のさらに別の実施形態においては、室温は２５〜３０℃の範囲である。
本発明のさらに別の実施形態においては、原生生物ヤブレツボカビは、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）、およびウルケニア（Ulkenia）である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態においては、培地は０.３重量％〜３.０重量％濃度のペプトンと、０.００５重量％〜０.５重量％濃度の酵母エキスと、０.００５重量％〜５.０重量％濃度のグルコースと、海水とを含む。
本発明の別の実施形態においては、ペプトンの濃度は約１.５重量％である。
本発明のさらに別の実施形態においては、酵母エキスの濃度は約０.１重量％である。
本発明のさらに別の実施形態においては、グルコースの濃度は約１.０重量％である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態においては、通常条件下でＰＵＦＡの含量が中程度である細胞さえからも、ＰＵＦＡが多量に生産される。
【００２１】
本発明は、標準培地中で原生生物ヤブレツボカビの培養物を室温にて増殖させ、細胞を収穫し、それらを低温条件下で保存することによって提供される。
【００２２】
したがって本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める冷蔵方法であって、（ａ）スラウストキトリウム（Thraustochytrim）、スキゾキトリウム（Schizoclaytrium）、ウルケニア（Ulkenia）などの属に属するヤブレツボカビの培養物を用意するステップ、（ｂ）上記原生生物の培養物を、培地中で２５〜３０℃の範囲の温度にて２〜５日培養するステップ、（ｃ）遠心分離によって上記培養物から細胞を収穫するステップ、（ｇ）細胞バイオマスを低温条件下で最大４８時間保存するステップ、ならびに（ｈ）増大した量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を抽出するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の実施形態においては、原生生物ヤブレツボカビの細胞におけるＰＵＦＡの含量を高める方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態においては、標準培地中で培養物を増殖させ、細胞を収穫し、それらを低温条件下で保存することによって、原生生物ヤブレツボカビの細胞中のＤＨＡおよびＥＰＡ含量を増大させる。
本発明のさらに別の実施形態においては、使用される培地は、０.５重量％〜１.５重量％（好ましくは１.５重量％）のペプトン、０.０１重量％〜０.１重量％（好ましくは０.１重量％）の酵母エキス、０.０１重量％〜１.０重量％（好ましくは１.０重量％）のグルコース、および１００ｍｌの海水を含有する。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態においては、低温での保存時間は１２〜４８時間である。
本発明のさらに別の実施形態においては、増大するＰＵＦＡは、ＤＨＡおよびＥＰＡである。
【００２５】
本発明は、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める方法に関する。詳細には、本発明は、ヤブレツボカビと称される原生生物のグループに属する微生物の細胞中の多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸を、前記細胞を低温条件下にて保存することによって増大させる方法に関する。このような多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量が増大された細胞は、動物飼料、人間の栄養分、栄養補給剤用としてのＰＵＦＡの抽出など、多価不飽和脂肪酸を必要とするさまざまな有用な用途において、ＰＵＦＡの含量が増大されていない細胞よりも好ましく利用されうる。
【００２６】
したがって本発明は、標準培地、またはＤＨＡおよびＥＰＡの生産のために最適化された培地を用いて、かつ収穫された細胞バイオマスを低温にて保存して、原生生物ヤブレツボカビにおける多価不飽和脂肪酸の含量を高める方法を提供する。
ステップａ：ＤＨＡおよびＥＰＡを含むヤブレツボカビの培養物を用意する。
ステップｂ：前記株を培地に植え付ける。
ステップｃ：培養物を２日間増殖させる。
ステップｄ：前記培地を使用する接種物として使用するための培養物を取得し、それをヤブレツボカビを培養するための標準培地、またはその特定の株におけるＥＰＡおよびＤＨＡの生産用に最適化されている培地に植えつける。
ステップｅ：前記培養物を２５〜３０℃にて、個別に２〜５日間増殖させる。
ステップｆ：遠心分離またはその他の適切な方法によって、上記培養物から細胞を収穫する。
ステップｇ：細胞を１０℃の温度にて１２〜４８時間保存し、増大した量のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を抽出する、または細胞バイオマスをさまざまな目的に使用する。
【００２７】
まず本発明では、オメガ−３ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＥＰＡを含む、ヤブレツボカビの候補種の培養物を、液体培地に植えつける。それ以外の原生生物ヤブレツボカビに属する原生生物の株、例えば米国バクテリア登録機関ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）株として、ヤブレツボカビ属（Thraustochytrium sp.）に属するＡＴＣＣ番号１８９０６、１８９０７、２０８９０、２０８９１、２０８９２、２６１８５；スラウストキトリウム・ロセウム・ガルトナー（Thraustochytrium roseum Gaertner）に属するＡＴＣＣ番号２８２１０；スラウストキトリウム・アウレム・ゴールドスタイン（Thraustochytrium aureum Goldstein）に属するＡＴＣＣ番号３４３０４を使用することができる。ヤブレツボカビ以外に、ヤブレツボカビに関連する原生生物ラビリンチュラ（labyrinthulid protists）のメンバー、例えばラビリンチュラ種またはアプラノキトリウム種（Aplanochytrium）などを使用してもよい。
【００２８】
適切な培地とは、例えば、ペプトン、酵母エキス、グルコースおよび海水を含む培地である。培養物が良好に増殖することができるのであれば、他の培地を用いてもよい。培養物を、２５〜３０℃の範囲の室温にて２日間増殖させる。この培養物を接種物として使用して、上記のような標準培地、または特定のヤブレツボカビ株におけるＤＨＡおよびＥＰＡの生産に最適化された培地に植えつける。培養物は、実験室の回転式振盪培養機の上のフラスコの中で増殖させるか、大規模な培養が必要なときには、発酵槽の中で増殖させればよい。培養物は、２５〜３０℃の室温か、または前記特定の株の増殖にとって好ましい任意の温度にて増殖されればよい。
【００２９】
培養物を適切な期間（例えば２〜７日間）増殖させた後、培養物から細胞を収穫する。細胞の収穫は、遠心分離、定常流遠心分離（continuous flow centrifugation）、濾過などの任意の適切な方法によって行えばよい。次いで、細胞バイオマスを約１０℃にて１２〜４８時間保存する。その後、保存された細胞は、ヤブレツボカビの細胞を必要とするあらゆる用途に使用されうる。前記用途の例には、動物飼料、人間の栄養補給剤、あるいは純粋なＤＨＡおよびＥＰＡの抽出用としての細胞バイオマスが含まれる。
【００３０】
前述のように本発明は、オメガ−３ＰＵＦＡであるＤＨＡおよびＥＰＡの含量を高める方法に関する。本方法によって、ヤブレツボカビの培養株から、他の方法によるよりも多量のＰＵＦＡを生産することができる。さらに、通常の条件下ではこれらのＰＵＦＡを中程度の量しか含まない株を使用しても、その細胞において多量のＰＵＦＡを生産することができる。
【００３１】
以下の実施例は、本発明を説明する目的で示してあり、したがって、本発明の範囲を制限するように解釈されないものとする。
【００３２】
［実施例１］
形態およびライフサイクルが、スキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に対応する、＃ＮＩＯＳ−１株に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物として用いた。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫に１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスのほぼ０.５倍増のＤＨＡが含まれていた（図１）。
【００３３】
［実施例２］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、＃ＮＩＯＳ−１株に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスは、ただちに使用し、脂肪酸の抽出とガスクロマトグラフィーによる分析を行った。収穫した細胞バイオマスの別のセットは、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ３倍のＥＰＡが含まれていた（図２）。
【００３４】
［実施例３］
形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・ガルトナー（Thraustochytrium Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−２に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％、および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスは、ただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットは、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ２倍のＤＨＡが含まれていた（図３）。
【００３５】
［実施例４］
形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・ガルトナー（Thraustochytrium Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−２に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％、および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。対照の培養物にはＥＰＡが含まれていなかったが、冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、多量のＰＵＦＡが含まれていた（図４）。
【００３６】
［実施例５］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−３に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＤＨＡが含まれていた（図５）。
【００３７】
［実施例６］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−３に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜４倍のＥＰＡが含まれていた（図６）。
【００３８】
［実施例７］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−４に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＤＨＡが含まれていた（図７）。
【００３９】
［実施例８］
形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー（Ulkenia Gaertner）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−４に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。これらの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別のセットを、冷蔵庫において１０℃にて２４時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に保存した細胞バイオマスには、冷蔵庫に保存しなかった細胞バイオマスと比較して、ほぼ０.５〜２倍のＥＰＡが含まれていた（図８）。
【００４０】
［実施例９］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−１に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。６セットの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別の５セットを、冷蔵庫に１０℃にて、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に６時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量の増加を示さず、１２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量のわずかな増加を示し、２４時間保存した細胞バイオマスはほぼ１００％の増加を示し、４８時間保存した細胞バイオマスはほぼ５０％の増加を示し、７２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡの増加を示さなかった（図９）。
【００４１】
［実施例１０］
形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー（Schizochytrium Goldstein and Belsky）属に相当する、株＃ＮＩＯＳ−１に属するヤブレツボカビの培養物を、ゼラチンペプトン１.５重量％、酵母エキス０.１重量％、グルコース１.０重量％および海水１００ｍｌを含む１００ｍｌの培地に植えつけた。培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて２日間増殖させた。これらの培養物を、実験用の接種物とした。上記と同じ組成の培地を使用して、培養物を準備した。６セットの培養物を、振盪機において２５〜３０℃の室温にて５日間増殖させた。この期間後に、遠心分離によって細胞を収穫した。１セットの細胞バイオマスをただちに使用し、脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。収穫した細胞バイオマスの別の５セットを、冷蔵庫に１０℃にて、それぞれ６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間保存し、保存後に脂肪酸を抽出してガスクロマトグラフィーにより分析した。冷蔵庫に６時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量の増加を示さず、１２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡ含量のわずかな増加を示し、２４時間保存した細胞バイオマスはほぼ１００％の増加を示し、４８時間保存した細胞バイオマスはほぼ３００％の増加を示し、７２時間保存した細胞バイオマスはＤＨＡの増加を示さなかった（図１０）。
【００４２】
本発明の主な利点は次のとおりである。
１． 培養物の中に存在するヤブレツボカビのＤＨＡおよびＥＰＡの量を、単純な手法により、さらに高めることができる。
２． 中程度の量のＤＨＡおよびＥＰＡしか含まない株についても、これらの脂肪酸を増大させることができる。
３． ＤＨＡおよびＥＰＡ含量の増加は、細胞バイオマスを１２〜４８時間、低温において保存することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図２】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム・ゴールドスタイン・アンド・ベルスキー属に対応するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図３】形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・スパロー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−２を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図４】形態およびライフサイクルがスラウストキトリウム・スパロー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−２を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含有量を示している。
【図５】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−３を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図６】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー種に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−３を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図７】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−４を、液体培地中で増殖させたときのＤＨＡ含量を示している。
【図８】形態およびライフサイクルがウルケニア・ガルトナー属に相当するヤブレツボカビ株ＮＩＯＳ−１を、液体培地中で増殖させたときのＥＰＡ含量を示している。
【図９】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム種属に相当するヤブレツボカビＮＩＯＳ−１における、細胞バイオマスを低温条件下で種々の時間にわたり保存したときの、ＤＨＡ含量を示している。
【図１０】形態およびライフサイクルがスキゾキトリウム種（Schizochytrium sp.）属に相当するヤブレツボカビＮＩＯＳ−１における、細胞バイオマスを低温条件下で種々の時間にわたり保存したときの、ＥＰＡ含量を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤブレツボカビ科原生生物における多価不飽和脂肪酸の含量を、細胞を低温条件下に保管することによって、０.５〜５倍に高める方法であって、
ａ．前記原生生物を培地に接種するステップと、
ｂ．前記培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップと、
ｃ．遠心分離によって前記細胞を収穫してバイオマスを得るステップと、
ｄ．前記バイオマスを１２〜４８時間にわたって約１０℃にて保存するステップと、
ｅ．前記保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増大したＰＵＦＡを、動物飼料、人間の栄養分、栄養補給剤において使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
室温は２５〜３０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヤブレツボカビ科原生生物は、スラウストキトリウム、スキゾキトリウム、およびウルケニアである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培地は、０.３重量％〜３.０重量％濃度のペプトンと、０.００５重量％〜０.５重量％濃度の酵母エキスと、０.００５重量％〜５.０重量％濃度のグルコースと、海水とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプトンの濃度は約１.５重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母エキスの濃度は約０.１重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グルコースの濃度は約１.０重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
通常条件下で中程度の量のＰＵＦＡを含んでいる細胞からも多量に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ヤブレツボカビ科原生生物における多価不飽和脂肪酸の含量を、細胞を低温条件下に保管することによって、０.５〜５倍に高める方法であって、
ａ．前記原生生物を培地に接種するステップと、
ｂ．前記培養物を室温にて２〜５日間増殖させるステップと、
ｃ．遠心分離によって前記細胞を収穫してバイオマスを得るステップと、
ｄ．前記バイオマスを１２〜４８時間にわたって約１０℃にて保存するステップと、
ｅ．前記保存されたバイオマスから増大したＰＵＦＡを得るステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増大したＰＵＦＡを、動物飼料、人間の栄養分、栄養補給剤において使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
室温は２５〜３０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヤブレツボカビ科原生生物は、スラウストキトリウム、スキゾキトリウム、およびウルケニアである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培地は、０.３重量％〜３.０重量％濃度のペプトンと、０.００５重量％〜０.５重量％濃度の酵母エキスと、０.００５重量％〜５.０重量％濃度のグルコースと、海水とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプトンの濃度は約１.５重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母エキスの濃度は約０.１重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記グルコースの濃度は約１.０重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
通常条件下で中程度の量のＰＵＦＡを含んでいる細胞からも多量に生産される、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００６−５１３７１３（Ｐ２００６−５１３７１３Ａ）
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６９５３３（Ｐ２００４−５６９５３３）
【出願日】平成１５年３月２８日（２００３．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／００００９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３４４２
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９５０２３８７３）カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ (69)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月２８日（２００３．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００３／００００９４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３４４２
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９５０２３８７３）カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ (69)
【Ｆターム（参考）】
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