ラット肝細胞におけるリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法
【課題】 ラット肝細胞において誘導が認められないことが知られているリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法の提供。
【解決手段】 リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法。
【解決手段】 リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット肝細胞におけるリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法及びラット肝細胞を用いたリファンピシンと被験薬物の相互作用の検定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リファンピシンは抗結核薬として使われている肝排泄型の薬剤であるが、ヒト肝臓中に存在するシトクロム系薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４を誘導するために、併用すると効果が得られない薬剤や肝臓に重大な障害を及ぼす薬剤が多数あると考えられ、リファンピシン投与状態での薬物代謝系の研究が必要である。しかし動物実験で頻繁に使われるラット等のげっ歯類では、ヒトＣＹＰ３Ａ４に相当するＣＹＰ３Ａ１及びＣＹＰ３Ａ２のリファンピシンによる誘導が認められないことがわかっているため、これらの動物を使った従来の研究法では正確な評価は困難である。また、ヒト肝細胞を用いた実験は細胞の入手が難しく、研究を行うのは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ラット肝細胞において誘導が認められないことが知られているリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法を提供するとともに、ラット肝細胞を用いた被験薬物とリファンピシンとの相互作用検定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、種々の動物の細胞を用いて薬物代謝酵素誘導能の検討をしてきたところ、全く意外にもラット小型肝細胞をリファンピシン存在下に培養すれば、従来ラット肝細胞では誘導されないと考えられていたＣＹＰ３Ａ誘導が生じることを見出した。さらに、この培養系を用いれば、生体内における被験薬物とリファンピシンとの相互作用が検定できることも見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法を提供するものである。
さらに本発明は、被験薬物及びリファンピシンの存在下にラット小型肝細胞を培養し、薬物代謝酵素誘導能を測定することを特徴とする、被験薬物とリファンピシンの相互作用の検定法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、従来、ラット肝細胞ではリファンピシンによって誘導されないと考えられていたＣＹＰ３Ａを、培養が容易で、凍結保存も可能なラット小型肝細胞で誘導させることが可能となった。この培養系を用いることにより、種々の被験薬物とリファンピシンとを併用した場合の生体内における相互作用、すなわち、薬効、肝障害の可能性等が予測可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、ラット小型肝細胞を用いる。ラット小型肝細胞は肝組織中に存在する肝幹細胞の一種で肝細胞としての機能を持ちながら、非常に高い増殖活性を持っている。また長期間凍結保存した後、再培養を行ってもその能力を失わない。また、ラット小型肝細胞は培養経過とともに薬物代謝酵素の活性が低下することはなく、成熟化を誘導するとその活性も成熟肝細胞に近くまで上がる。従って、ラット小型肝細胞は、薬物代謝酵素誘導能の高い状態を長期間に渡って維持することができる特性を有している。
【０００８】
ラット小型肝細胞は、例えばラットの肝臓よりコラゲナーゼ灌流法によって採取された細胞懸濁物から、遠心操作を繰り返すことによって単離することができる。また、同細胞懸濁物から小型肝細胞特異的抗原に対する特異抗体（CD44、BRI3、D6.1A等）やヒアルロン酸を付着した担体などにより分離することができる。
【０００９】
得られたラット小型肝細胞は、凍結保存することができるので、長期保存可能である。
【００１０】
ＣＹＰ３Ａ誘導法にあたっては、リファンピシンの存在下にラット小型肝細胞を培養する。培養液中のリファンピシンの濃度は、１０〜１００μＭ、さらに３０〜１００μＭが好ましい。また、ラット小型肝細胞は、３０〜５０個の細胞よりなるコロニーを形成する培養７〜２０日目（より好ましくは、８〜１４日目、特に好ましくは１０〜１２日目）に一旦培養皿より剥がして新しい培養皿に再播種するか、凍結保存した小型肝細胞コロニーを５００〜１００００コロニー/６０mm培養皿（より好ましくは、１０００〜５０００コロニー/６０mm培養皿、特に好ましくは２０００〜４０００コロニー/６０mm培養皿）の濃度で播種し、培養するのが好ましい。
【００１１】
また、被験薬物とリファンピシンの相互作用検定法においては、上記培養条件に被験薬物を添加した系でラット小型肝細胞を培養する。リファンピシン及び小型肝細胞濃度は前記と同様である。
【００１２】
培養は、コラーゲンをコートしたディシュ上で行うのが好ましい。また、培地としては、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。さらに培地中にはＦＢＳ、アスコルビン酸、甲状腺ホルモン、ＤＭＳＯ等を添加することができる。培地中に加えるのが好ましいものとしては、ニコチンアミド、増殖因子、デキサメサゾン、インスリンが挙げられる。増殖因子としては、肝細胞増殖因子[HGF, hepatocyte growth factor]、腫瘍増殖因子[TGF-alpha, Transforming growth factor-alpha]、線維芽細胞増殖因子[FGF, fibroblast growth factor]などが挙げられる。培養は、通常３５±５℃、３〜７％ＣＯ2インキュベーター内の条件で行うのが好ましい。また試験を行うまでの培養時間は、２日以上であるのが好ましい。
【００１３】
ラット小型肝細胞のＣＹＰ３Ａ活性は、リファンピシンの濃度に依存して高くなる。従ってこの培養系を用いれば、リファンピシンと被験薬物との相互作用が検定できる。リファンピシンと被験薬物との相互作用を検定するには、被験薬物非添加時のＣＹＰ３Ａを含む薬物代謝酵素誘導能と被験薬物添加時の薬物代謝酵素誘導能とを対比すればよい。ここで、ＣＹＰ３Ａを含む薬物代謝酵素誘導能は常法、例えば酵素反応の基質を含む緩衝液をラット小型肝細胞に加えて酵素反応を行い、代謝産物をＨＰＬＣにより測定すればよい。ここで、ＣＹＰ３Ａとしては、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２３が挙げられ、このうち、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２３が好ましい。ＣＹＰ３Ａ以外の薬物代謝酵素としては、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｅ等が挙げられる。
【実施例】
【００１４】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
Ａ：試験方法
１）凍結小型肝細胞の調製
オスのラット肝臓を灌流し、得られた細胞をハンクス緩衝液（表１）に懸濁して５０×ｇ、１min、４℃で遠心し、上清を回収する。この操作を３回繰り返す。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。この操作を３回繰り返す。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳ（表２）に懸濁する。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳに懸濁する。
細胞数を数え、６×１０4細胞／mlになるようＤＭＥＭ／ＦＢＳで調製する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
調製した細胞懸濁液を１００mm 培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に９mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養する。培養２日目に培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳで交換し、その後２日に１回、培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ＤＭＳＯ（表３）で交換する。１０日間培養後、培養皿から培地を除き６mlのＰＢＳで洗浄し、２mlの０．０２％ＥＤＴＡを加えて攪拌、液を除く。３７℃に温めたＣｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ）を２ml加え、ＣＯ2インキュベーター内で５min静置する。ＤＭＥＭを１ml加えて細胞を回収、５００rpm、５minで遠心し、沈殿を１ml（４培養皿分）のセルバンカー（三菱化学ヤトロン）に懸濁する。−３０℃で３０min凍結したのち、−８０℃で保存する。
【００１９】
【表３】
【００２０】
２）コラーゲンコート培養皿の調製
ラットの尾から調製したコラーゲン液（５mg／ml）を０．１％ 酢酸で１００倍に希釈し、６０mm 培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に３mlずつ分注する。室温で１hr静置してからコラーゲン液を除き、クリーンベンチ内で一晩乾燥させたのち、紫外線を１hr照射して滅菌、３mlのＰＢＳを加えて３７℃で３０minインキュベートする。その後ＰＢＳを除き、解凍した小型肝細胞を３，０００〜５，０００コロニー／培養皿で播種する。
【００２１】
３）小型肝細胞の培養
凍結小型肝細胞を３７℃インキュベーター内で解凍し、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地１０mlに加えて５０×ｇ、１min遠心する。上清を除き、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地３mlに沈殿した細胞を懸濁してコラーゲンコート培養皿に播種する。ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養し、２４時間後培地を無血清培地（ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ、表４）に交換し、以後２日に１回、培地をＤＭＥＭ／ＤＭＳＯで交換する。
【００２２】
【表４】
【００２３】
４）小型肝細胞の成熟化
凍結小型肝細胞を１４日間培養したのち、成熟化を行う。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンデキンソン）を４℃に冷却したＤＭＥＭ培地で１mg／mlになるよう希釈し、氷上で静置する。培養皿から培地を除きＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を１mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター内で１時間培養したのち、ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ培地を２ml加えて培養を続ける。
【００２４】
５）誘導剤の添加
リファンピシン（ＳＩＧＭＡ）を１０ｍＭになるようＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）に溶解し、さらにＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈して孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存する。それをさらにＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ培地で希釈し、０、１、３、１０、３０μＭのリファンピシンを含む培地を調製する。
成熟化後７日間、および成熟化せず播種後２１日間培養した小型肝細胞をリファンピシン添加培地で培養する。リファンピシン添加後３日間培養を行ったのちに酵素反応を行う。
【００２５】
６）酵素反応
リファンピシン添加および非添加で３日間培養した小型肝細胞を３７℃のＫＨ緩衝液（表５）３mlで２回洗浄したのち、１０μＭのミダゾラム（ＵＬＴＲＡＦＩＮＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＫＨ緩衝液を１．５ml加えてＣＯ2インキュベーターで１時間反応させる。反応液を回収し、−８０℃で保存する。
【００２６】
【表５】
【００２７】
７）サンプル処理
サンプル４００μｌをフィルター（ウルトラフリー、Ｃ３ＬＨ、日本ミリポア）を用いて、遠心分離（２４００×ｇ、４℃、５分）する。
得られたろ液２５０μｌに内部標準溶液（Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎのメタノール溶液、１０μｇ／ｍｌ）１０μｌを加え、そのうちの５０μｌをＨＰＬＣに注入する。
【００２８】
８） 検量線溶液
１'−ヒドロキシミダゾラム溶液（１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１μＭ）２５０μｌに内部標準溶液１０μｌを添加し、そのうちの５０μｌをＨＰＬＣに注入する。
【００２９】
９）ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Xterra RP１８、５μｍ、４．６×１５０mm（Ｗａｔｅｒｓ）
移動相：Ａ液；１０mmol／Ｌリン酸緩衝液（pH７．４）
Ｂ液；メタノール／アセトニトリル（５／７、ｖ／ｖ）
溶出条件：グラジェント
Time(min) ０→５→１７→２５→２６→３５
B conc.（％） ３０→３０→６０→６０→３０→３０
流速：１ml／min
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出波長：２６３nm
分析時間：３５min
【００３０】
１０）タンパク濃度測定
酵素反応を行った培養皿に１mlのリシス緩衝液（表６）を加えて４℃で１ｈｒ静置したのち、緩衝液に細胞を懸濁させて回収し、氷上で超音波処理（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、５０％ ｄｕｔｙ、ｏｕｔｐｕｔ１、３０ｓｅｃ）を行う。
１，２００×ｇ、５min、４℃で遠心し上清を回収、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）でタンパク濃度を測定する。濃度標準はＢＳＡを用いる。
【００３１】
【表６】
【００３２】
１１）データ処理
ＨＰＬＣで得られた代謝産物量を培養皿あたりのタンパク量で割り、酵素活性（pmol／min／mg protein）とする。各項目３培養皿ずつの実験と４培養皿ずつの実験を行い、リファンピシン非添加条件での酵素活性を１として相対値を算出する。
【００３３】
Ｂ．結果
リファンピシンを０〜３０μＭになるように添加して培養したラット小型肝細胞を図１に示す。また、そのときのＣＹＰ３Ａ活性を測定した結果を図２に示す。
【００３４】
図１から明らかなように、１〜３０μＭの濃度範囲においてリファンピシンはラット小型肝細胞の培養に影響を及ぼさなかった。
【００３５】
図２から明らかなように、リファンピシンを０、１、３、１０、３０μＭになるよう加えてラット小型肝細胞を培養し、ＣＹＰ３Ａ活性を測定した結果、リファンピシン１μＭの条件下では活性は無添加の条件と比べると若干低下するが、リファンピシン濃度を高くすると活性は濃度依存的に上昇し、３０μＭ条件下では無添加に比べて活性は高くなることが判明した。従って、この系に被験薬物を添加し、ＣＹＰ３Ａ活性その他の薬物代謝酵素活性を測定すれば、被験薬物とリファンピシンとの相互作用が検定できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】リファンピシン存在下に培養したラット小型肝細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図２】リファンピシン存在下に培養したラット小型肝細胞のＣＹＰ３Ａ活性を示す。リファンピシン濃度０の時の値を１として、各濃度における活性を相対値で表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット肝細胞におけるリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法及びラット肝細胞を用いたリファンピシンと被験薬物の相互作用の検定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リファンピシンは抗結核薬として使われている肝排泄型の薬剤であるが、ヒト肝臓中に存在するシトクロム系薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４を誘導するために、併用すると効果が得られない薬剤や肝臓に重大な障害を及ぼす薬剤が多数あると考えられ、リファンピシン投与状態での薬物代謝系の研究が必要である。しかし動物実験で頻繁に使われるラット等のげっ歯類では、ヒトＣＹＰ３Ａ４に相当するＣＹＰ３Ａ１及びＣＹＰ３Ａ２のリファンピシンによる誘導が認められないことがわかっているため、これらの動物を使った従来の研究法では正確な評価は困難である。また、ヒト肝細胞を用いた実験は細胞の入手が難しく、研究を行うのは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ラット肝細胞において誘導が認められないことが知られているリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導法を提供するとともに、ラット肝細胞を用いた被験薬物とリファンピシンとの相互作用検定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、種々の動物の細胞を用いて薬物代謝酵素誘導能の検討をしてきたところ、全く意外にもラット小型肝細胞をリファンピシン存在下に培養すれば、従来ラット肝細胞では誘導されないと考えられていたＣＹＰ３Ａ誘導が生じることを見出した。さらに、この培養系を用いれば、生体内における被験薬物とリファンピシンとの相互作用が検定できることも見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法を提供するものである。
さらに本発明は、被験薬物及びリファンピシンの存在下にラット小型肝細胞を培養し、薬物代謝酵素誘導能を測定することを特徴とする、被験薬物とリファンピシンの相互作用の検定法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、従来、ラット肝細胞ではリファンピシンによって誘導されないと考えられていたＣＹＰ３Ａを、培養が容易で、凍結保存も可能なラット小型肝細胞で誘導させることが可能となった。この培養系を用いることにより、種々の被験薬物とリファンピシンとを併用した場合の生体内における相互作用、すなわち、薬効、肝障害の可能性等が予測可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、ラット小型肝細胞を用いる。ラット小型肝細胞は肝組織中に存在する肝幹細胞の一種で肝細胞としての機能を持ちながら、非常に高い増殖活性を持っている。また長期間凍結保存した後、再培養を行ってもその能力を失わない。また、ラット小型肝細胞は培養経過とともに薬物代謝酵素の活性が低下することはなく、成熟化を誘導するとその活性も成熟肝細胞に近くまで上がる。従って、ラット小型肝細胞は、薬物代謝酵素誘導能の高い状態を長期間に渡って維持することができる特性を有している。
【０００８】
ラット小型肝細胞は、例えばラットの肝臓よりコラゲナーゼ灌流法によって採取された細胞懸濁物から、遠心操作を繰り返すことによって単離することができる。また、同細胞懸濁物から小型肝細胞特異的抗原に対する特異抗体（CD44、BRI3、D6.1A等）やヒアルロン酸を付着した担体などにより分離することができる。
【０００９】
得られたラット小型肝細胞は、凍結保存することができるので、長期保存可能である。
【００１０】
ＣＹＰ３Ａ誘導法にあたっては、リファンピシンの存在下にラット小型肝細胞を培養する。培養液中のリファンピシンの濃度は、１０〜１００μＭ、さらに３０〜１００μＭが好ましい。また、ラット小型肝細胞は、３０〜５０個の細胞よりなるコロニーを形成する培養７〜２０日目（より好ましくは、８〜１４日目、特に好ましくは１０〜１２日目）に一旦培養皿より剥がして新しい培養皿に再播種するか、凍結保存した小型肝細胞コロニーを５００〜１００００コロニー/６０mm培養皿（より好ましくは、１０００〜５０００コロニー/６０mm培養皿、特に好ましくは２０００〜４０００コロニー/６０mm培養皿）の濃度で播種し、培養するのが好ましい。
【００１１】
また、被験薬物とリファンピシンの相互作用検定法においては、上記培養条件に被験薬物を添加した系でラット小型肝細胞を培養する。リファンピシン及び小型肝細胞濃度は前記と同様である。
【００１２】
培養は、コラーゲンをコートしたディシュ上で行うのが好ましい。また、培地としては、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。さらに培地中にはＦＢＳ、アスコルビン酸、甲状腺ホルモン、ＤＭＳＯ等を添加することができる。培地中に加えるのが好ましいものとしては、ニコチンアミド、増殖因子、デキサメサゾン、インスリンが挙げられる。増殖因子としては、肝細胞増殖因子[HGF, hepatocyte growth factor]、腫瘍増殖因子[TGF-alpha, Transforming growth factor-alpha]、線維芽細胞増殖因子[FGF, fibroblast growth factor]などが挙げられる。培養は、通常３５±５℃、３〜７％ＣＯ2インキュベーター内の条件で行うのが好ましい。また試験を行うまでの培養時間は、２日以上であるのが好ましい。
【００１３】
ラット小型肝細胞のＣＹＰ３Ａ活性は、リファンピシンの濃度に依存して高くなる。従ってこの培養系を用いれば、リファンピシンと被験薬物との相互作用が検定できる。リファンピシンと被験薬物との相互作用を検定するには、被験薬物非添加時のＣＹＰ３Ａを含む薬物代謝酵素誘導能と被験薬物添加時の薬物代謝酵素誘導能とを対比すればよい。ここで、ＣＹＰ３Ａを含む薬物代謝酵素誘導能は常法、例えば酵素反応の基質を含む緩衝液をラット小型肝細胞に加えて酵素反応を行い、代謝産物をＨＰＬＣにより測定すればよい。ここで、ＣＹＰ３Ａとしては、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２３が挙げられ、このうち、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２３が好ましい。ＣＹＰ３Ａ以外の薬物代謝酵素としては、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｂ、ＣＹＰ２Ｅ等が挙げられる。
【実施例】
【００１４】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
Ａ：試験方法
１）凍結小型肝細胞の調製
オスのラット肝臓を灌流し、得られた細胞をハンクス緩衝液（表１）に懸濁して５０×ｇ、１min、４℃で遠心し、上清を回収する。この操作を３回繰り返す。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。この操作を３回繰り返す。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をハンクス緩衝液に懸濁する。
１５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳ（表２）に懸濁する。
５０×ｇ、５min、４℃で遠心し、沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳに懸濁する。
細胞数を数え、６×１０4細胞／mlになるようＤＭＥＭ／ＦＢＳで調製する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
調製した細胞懸濁液を１００mm 培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に９mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養する。培養２日目に培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳで交換し、その後２日に１回、培地をＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ＤＭＳＯ（表３）で交換する。１０日間培養後、培養皿から培地を除き６mlのＰＢＳで洗浄し、２mlの０．０２％ＥＤＴＡを加えて攪拌、液を除く。３７℃に温めたＣｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ）を２ml加え、ＣＯ2インキュベーター内で５min静置する。ＤＭＥＭを１ml加えて細胞を回収、５００rpm、５minで遠心し、沈殿を１ml（４培養皿分）のセルバンカー（三菱化学ヤトロン）に懸濁する。−３０℃で３０min凍結したのち、−８０℃で保存する。
【００１９】
【表３】
【００２０】
２）コラーゲンコート培養皿の調製
ラットの尾から調製したコラーゲン液（５mg／ml）を０．１％ 酢酸で１００倍に希釈し、６０mm 培養皿（ＣＯＲＮＩＮＧ）に３mlずつ分注する。室温で１hr静置してからコラーゲン液を除き、クリーンベンチ内で一晩乾燥させたのち、紫外線を１hr照射して滅菌、３mlのＰＢＳを加えて３７℃で３０minインキュベートする。その後ＰＢＳを除き、解凍した小型肝細胞を３，０００〜５，０００コロニー／培養皿で播種する。
【００２１】
３）小型肝細胞の培養
凍結小型肝細胞を３７℃インキュベーター内で解凍し、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地１０mlに加えて５０×ｇ、１min遠心する。上清を除き、３７℃に温めたＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地３mlに沈殿した細胞を懸濁してコラーゲンコート培養皿に播種する。ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2，湿度９５％）で培養し、２４時間後培地を無血清培地（ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ、表４）に交換し、以後２日に１回、培地をＤＭＥＭ／ＤＭＳＯで交換する。
【００２２】
【表４】
【００２３】
４）小型肝細胞の成熟化
凍結小型肝細胞を１４日間培養したのち、成熟化を行う。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンデキンソン）を４℃に冷却したＤＭＥＭ培地で１mg／mlになるよう希釈し、氷上で静置する。培養皿から培地を除きＭａｔｒｉｇｅｌ溶液を１mlずつ分注し、ＣＯ2インキュベーター内で１時間培養したのち、ＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ培地を２ml加えて培養を続ける。
【００２４】
５）誘導剤の添加
リファンピシン（ＳＩＧＭＡ）を１０ｍＭになるようＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）に溶解し、さらにＤＭＥＭ培地で１００倍に希釈して孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存する。それをさらにＤＭＥＭ／ＤＭＳＯ培地で希釈し、０、１、３、１０、３０μＭのリファンピシンを含む培地を調製する。
成熟化後７日間、および成熟化せず播種後２１日間培養した小型肝細胞をリファンピシン添加培地で培養する。リファンピシン添加後３日間培養を行ったのちに酵素反応を行う。
【００２５】
６）酵素反応
リファンピシン添加および非添加で３日間培養した小型肝細胞を３７℃のＫＨ緩衝液（表５）３mlで２回洗浄したのち、１０μＭのミダゾラム（ＵＬＴＲＡＦＩＮＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＫＨ緩衝液を１．５ml加えてＣＯ2インキュベーターで１時間反応させる。反応液を回収し、−８０℃で保存する。
【００２６】
【表５】
【００２７】
７）サンプル処理
サンプル４００μｌをフィルター（ウルトラフリー、Ｃ３ＬＨ、日本ミリポア）を用いて、遠心分離（２４００×ｇ、４℃、５分）する。
得られたろ液２５０μｌに内部標準溶液（Ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎのメタノール溶液、１０μｇ／ｍｌ）１０μｌを加え、そのうちの５０μｌをＨＰＬＣに注入する。
【００２８】
８） 検量線溶液
１'−ヒドロキシミダゾラム溶液（１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１μＭ）２５０μｌに内部標準溶液１０μｌを添加し、そのうちの５０μｌをＨＰＬＣに注入する。
【００２９】
９）ＨＰＬＣ分析条件
カラム：Xterra RP１８、５μｍ、４．６×１５０mm（Ｗａｔｅｒｓ）
移動相：Ａ液；１０mmol／Ｌリン酸緩衝液（pH７．４）
Ｂ液；メタノール／アセトニトリル（５／７、ｖ／ｖ）
溶出条件：グラジェント
Time(min) ０→５→１７→２５→２６→３５
B conc.（％） ３０→３０→６０→６０→３０→３０
流速：１ml／min
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出波長：２６３nm
分析時間：３５min
【００３０】
１０）タンパク濃度測定
酵素反応を行った培養皿に１mlのリシス緩衝液（表６）を加えて４℃で１ｈｒ静置したのち、緩衝液に細胞を懸濁させて回収し、氷上で超音波処理（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、５０％ ｄｕｔｙ、ｏｕｔｐｕｔ１、３０ｓｅｃ）を行う。
１，２００×ｇ、５min、４℃で遠心し上清を回収、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）でタンパク濃度を測定する。濃度標準はＢＳＡを用いる。
【００３１】
【表６】
【００３２】
１１）データ処理
ＨＰＬＣで得られた代謝産物量を培養皿あたりのタンパク量で割り、酵素活性（pmol／min／mg protein）とする。各項目３培養皿ずつの実験と４培養皿ずつの実験を行い、リファンピシン非添加条件での酵素活性を１として相対値を算出する。
【００３３】
Ｂ．結果
リファンピシンを０〜３０μＭになるように添加して培養したラット小型肝細胞を図１に示す。また、そのときのＣＹＰ３Ａ活性を測定した結果を図２に示す。
【００３４】
図１から明らかなように、１〜３０μＭの濃度範囲においてリファンピシンはラット小型肝細胞の培養に影響を及ぼさなかった。
【００３５】
図２から明らかなように、リファンピシンを０、１、３、１０、３０μＭになるよう加えてラット小型肝細胞を培養し、ＣＹＰ３Ａ活性を測定した結果、リファンピシン１μＭの条件下では活性は無添加の条件と比べると若干低下するが、リファンピシン濃度を高くすると活性は濃度依存的に上昇し、３０μＭ条件下では無添加に比べて活性は高くなることが判明した。従って、この系に被験薬物を添加し、ＣＹＰ３Ａ活性その他の薬物代謝酵素活性を測定すれば、被験薬物とリファンピシンとの相互作用が検定できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】リファンピシン存在下に培養したラット小型肝細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図２】リファンピシン存在下に培養したラット小型肝細胞のＣＹＰ３Ａ活性を示す。リファンピシン濃度０の時の値を１として、各濃度における活性を相対値で表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法。
【請求項２】
被験薬物及びリファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養し、薬物代謝酵素誘導能を測定することを特徴とする、被験薬物とリファンピシンの相互作用の検定法。
【請求項１】
リファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養することを特徴とする、ＣＹＰ３Ａ誘導法。
【請求項２】
被験薬物及びリファンピシン存在下にラット小型肝細胞を培養し、薬物代謝酵素誘導能を測定することを特徴とする、被験薬物とリファンピシンの相互作用の検定法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−３７４６６（Ｐ２００７−３７４６６Ａ）
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２５７０８（Ｐ２００５−２２５７０８）
【出願日】平成１７年８月３日（２００５．８．３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月３日（２００５．８．３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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