リウマチ様関節炎（ＲＡ）のためのバイオマーカー
本発明は生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの同時測定に基づくリウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測のための方法および予測に使用するための組成物を提供する。本発明はさらにＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法およびＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質を同定するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は未知の病因の炎症性、自己免疫性、全身性疾患である。白人集団の約１％が女性の男性に対する比率２.５／１でリウマチ様関節炎に罹患する（Lee & Weinblatt； Lancet ３５８（９２８５）： ９０３−９１１（２００１））。疾患はいずれの年齢でも生じ得るが、最も一般的であるのは３０から５５歳の間の年齢の人々であり（Kodadek ； Chem.Biol. ８,（２）：１０５−１１５（２００１）； Stoll, Templin, Schrenk, Traub, Vohringer, & Joos； Front Biosci. ７：c１３−c３２（２００２）； Templin et al. ； Proteomics. ３（１１）：２１５５−２１６６（２００３））、その罹患率は年齢と共に上昇する。
【０００２】
ＲＡの顕著な症状は痛み、こわばり、および末梢関節の腫脹である。障害の臨床症状は非常に多様であり、穏やかな自己限定性関節炎から著しい罹患率および死亡率を伴う急速に進行する多臓器炎症にわたる（Lee & Weinblatt （２００１）； ibid； Sweeney & Firestein（２００４）； ibid）。関節損傷はリウマチ様関節炎の経過中の初期に生じ；患者の３０％は診断時に骨浸食の証拠となるＸ線像を有し、そしてこの比率は２年までに６０％まで上昇する（van der Heijde； Br.J.Rheumatol.３４（Suppl ２）：７４−７８（１９９５））。
【０００３】
ＲＡは多くの関節（６またはそれより多い）に関与し得る多関節炎であるが、疾患の初期の段階では１つまたは少しの関節しか冒されないこともある。実際に全末梢関節が疾患に冒され得る；しかしながら最も一般的には関与する関節は手、足および膝の関節である（Smolen et al.； Arthritis Rheum., ３８（１）：３８−４３（１９９５））。加えてＲＡは脊椎に影響を及ぼし得て、そして長期にわたる疾患では環軸関節の関与が一般的であり、そして致死の直接的な関節関連の原因となる。関節外関与はＲＡのもう一つの特徴であり、そしてこれはリウマトイド結節から生命を脅かす脈管炎にわたり得る（Smolen & Steiner； Nat.Rev.Drug Discov. ２（６）：４７３−４８８（２００３））。
【０００４】
ＲＡは免疫および炎症系が軟骨および骨の破壊に密接に関連する疾患である。２つの系の関連は明らかではなく、そしてＲＡの原因は未知のままであるが、疾患の発生に関与する多くの経路が認識されている。ここ数年にわたる研究により、遺伝性および感染性因子が複雑に相互に関係する方式でＲＡ病因に関与していることが同定された（Smith & Haynes； Ann.Intern.Med. １３６（１２）：９０８−９２２（２００２））。ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−１ｒａ（Gabay et al.； J.Rheumatol. ２４（２）：３０３−３０８（１９９７））、ＩＬ−６（Arvidson et al. ； Ann.Rheum.Dis. ５３（８）：５２１−５２４（１９９４））、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１（De Benedetti et al.； J.Rheumatol. ２６（２）：４２５−４３１（１９９９））、ならびに炎症過程に関係する血清アミロイド（ＳＡＡ）のような、可溶性サイトカインおよびケモカインがリウマチ様関節炎に関連することが示されている（Szekanecz & Koch ； Curr.Rheumatol.Rep. ３（１）：５３−６３（２００１））。
【０００５】
薬物がＲＡの処置の主要な形態を構成する。現在用いられる薬物は４つの主要なカテゴリーに分けられる：ａ）非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ｂ）疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、ｃ）ステロイドおよびｄ）鎮痛薬。
【０００６】
歴史的に、ＲＡの処置は疾患に関連する腫脹および痛みを軽減するためのＮＳＡＩＤ薬（イブプロフェンおよびアスピリンのような）の使用に基づいている。しかしながらこの方法は疾患に関連する痛みの根本的な（複数の）原因に取り組んではいない。この方法はスルファサラジンおよびメトトレキサートのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の開発に取って代わられている。別の型のＤＭＡＲＤには生物剤が含まれる。承認された生物学的ＤＭＡＲＤには例えばインフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブまたはアナキンラが含まれる。
【０００７】
ＲＡの診断はアメリカリウマチ協会（ＡＲＡ）により認識されている７つの診断基準の使用に基づく（Arnett et al.； Arthritis Rheum. ３１（３）：３１５−３２４（１９８８））。診断には臨床因子が必要とされるため、臨床医が尋ねる鋭い質問および、微妙になりがちな初期の身体的所見の認識に依存する。ＡＲＡの基準：
１）最大改善の前に少なくとも１時間持続する関節および関節周囲の朝のこわばり；
２）医師により観察される３つまたはそれより多い関節部分の軟組織腫脹（関節炎）；
３）手の関節の腫脹（関節炎）；
４）対称性腫脹（関節炎）；
５）リウマトイド結節；
６）血清リウマトイド因子（ＲＦ）のレベル上昇；
７）手および／または手首関節のＸ線像変化；
が含まれる。
【０００８】
最初の４つの基準はリウマチ様関節炎の診断がなされ得る前、最低６週間存在しなければならない。ＲＡ試験はリウマトイド因子：ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープと反応するＩｇＭ自己抗体を測定する（Corper et al., Nat.Struct.Biol. ４（５）：３７４−３８１（１９９７））。ＲＦは一次的にＲＡに関連するが、これらの抗体は疾患特異性が低く、正常な高齢者、健常な個体、およびその他の自己免疫障害または慢性感染を伴う患者の血清でも検出され得る。（Williams DG （１９９８））。
したがって、ＲＡを診断する代替の方法、およびＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法に関する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００９】
（発明の要旨）
１つの態様では、本発明は対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有しているか、または発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中の腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦα、ＴＮＦ−ａ）；マクロファージ走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｂ）からなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、対象におけるＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質を同定するための方法に関し、該方法はａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；およびｃ）工程ｂの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；の工程を含み、ここで工程ａ）の少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較した場合の工程ｂ）の生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量における変化により、ＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質が同定される。
【００１１】
本発明の別の態様はＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法を提供し、該方法は該処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで双方の生物学的試料中の量の類似は処置が有効でないことを示し、そして該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量における変化は処置が有効であることを示している。
【００１２】
なおさらなる本発明の態様は、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含むリウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物に関する。
本発明はまた本発明による組成物および使用のための指示書を含む診断または薬物発見キットをも提供する。そして本発明の別の態様は本発明の方法の１つにおけるかかる診断または薬物発見キットの使用に関する。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
図１：コーティング溶液へのグリセロールの添加の結果を示す。
図２：コーティング抗体力価。種々の濃度のコーティングＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８抗体をプリントした（左から右にバックグラウンド、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）。最良のシグナル対ノイズ比は全被分析物に関してコーティング抗体２００μｇ／ｍｌで測定した。
図３：種々の濃度のビオチン化抗体を用いてアッセイを実施した（抗体；左から右に：６２.５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体）。最良のシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してビオチン化抗体５００ｎｇ／ｍｌの濃度で作成された。示したシグナル対ノイズ比はＩＬ−８アッセイに関して作成された。
図４：２工程および同時インキュベーションプロトコールで実施したアッセイに関する代表的なＩＬ−６標準曲線。丸はＩＬ−６ １工程プロトコールを表し、四角はＩＬ−６ ２工程プロトコールを表す。得られた結果により、１工程プロトコールがアッセイ感度を改善できることが示される。
図５：ノンパララックストレイ装置で作成された画像。３つの異なる画像様式を比較する：高（左）、標準（中）および高分解能様式（右）。
図６：抗体アレイおよびＥＬＩＳＡ手順の相関性。７８個の血清および１０個のスパイクされた試料中のサイトカインを抗体マイクロアレイまたはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて並行して定量した。これらの２つの分析からのデータを互いに対してプロットし、そして線形回帰分析により相関係数を決定した。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用した全ての特許出願、特許および参照文献はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
本発明の実施に際して、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術を用いる。これらの技術は周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, １９９７（F. M. Ausubel ed.）； Sambrook et al., １９８９, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.； DNA Cloning： A Practical Approach, Volumes I and II, １９８５（D. N. Glover ed.）； Oligonucleotide Synthesis, １９８４（M. L. Gait ed.）； Nucleic Acid Hybridization, １９８５,（Hames and Higgins）； Transcription and Translation, １９８４（Hames and Higgins eds.）； Animal Cell Culture, １９８６（R. I. Freshney ed.）； Immobilized Cells and Enzymes, １９８６（IRL Press）； Perbal, １９８４, A Practical Guide to Molecular Cloning； the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, １９８７（J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory）；および Methods in Enzymology Vol. １５４およびVol. １５５（各々Wu and Grossman, and Wu, eds.）にて説明されている。
【００１５】
本発明はＲＡを有する対象のバイオマーカープロファイルの発見に少なくとも一部基づいている。好ましくは、本発明は生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータおよびＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することによる、最も好ましくは本発明によるタンパク質マイクロアレイのような組成物に使用によるＲＡバイオマーカープロファイルの決定に関する。
【００１６】
生物学的試料は血液試料または組織試料でよい。適当な試料には全血、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側塗抹標本、皮膚、および筋肉または神経組織のような特定の器官組織の生検、ならびに毛髪が含まれる。最も好ましくは生物学的試料は血清である。
生物学的試料を採取する対象をスルファサラジン、メトトレキサート、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブもしくはアナキンラ、またはシクロスポリンのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）で処置することができる。
【００１７】
本発明の方法によるバイオマーカープロファイルの決定は、対象中または該対象から単離された生物学的試料中の核酸またはタンパク質の測定を含み得る。本発明の１つの好ましい実施態様では、バイオマーカーの決定はバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量の決定を含む。例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. １, pp.４.１.１-４.２.９ and ４.５.１-４.５.３, John Wiley & Sons, Inc.（１９９６）に記載されるような当業者に周知の方法により試料からｍＲＮＡをも含むＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの量を検出するための方法は当分野で周知であり、そして限定するものではないがノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲおよびその他のハイブリダイゼーション方法を含む。好ましくはｍＲＮＡを少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドと接触させることによりｍＲＮＡの量を決定する。好ましい実施態様では、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドで該ｍＲＮＡを決定する。配列特異的オリゴヌクレオチドはバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡにのみに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであるのが好ましい。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は一本鎖核酸を意味する。一般に配列特異的オリゴヌクレオチドは少なくとも１５から２０ヌクレオチド長であるが、少なくとも２０から２５ヌクレオチド長のより長いプローブが望ましい場合もある。配列特異的オリゴヌクレオチドを１つまたはそれより多い標識部分で標識して、ハイブリダイズされたプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出を可能にすることができる。標識部分は分光学的、生化学的、光化学的、生体電子工学的、免疫化学的、および電気光学的または化学的な手段により検出することができる組成物を含み得る。標識部分の実例には、限定するものではないが放射性同位元素、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素のような分光学的マーカー、結合酵素、質量分析タグ、および磁気標識が含まれる。ｍＲＮＡまたは発現モニタリングのためのオリゴヌクレオチドアレイを調製し、そして例えばLockhart et al., Nature Biotechnology, １４：１６７５−１６８０（１９９６）； McGall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９３：１３５５５−１３４６０（１９９６）；および米国特許第６０４０１３８号に記載されるような当業者に周知である技術に従って用いることができる。
【００１８】
本発明の少なくとも２つのバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を決定するための特に有用な方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドの規則的なアレイへの標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを伴う。かかる方法によりＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つもしくは４つ、または少なくとも５つもしくは６つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を同時に決定することが可能になる。このハイブリダイゼーション方法に利用される配列特異的オリゴヌクレオチドは典型的には固体支持体に結合されている。固体支持体の実例には、限定するものではないが膜、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウェファー、繊維、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、管類、ポリマー、塩化ポリビニル皿等が含まれる。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施態様によると、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量の決定をタンパク質の量、すなわちＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１ベータタンパク質の量を測定することにより実施する。本発明の別の好ましい実施態様では、該少なくとも２つのバイオマーカーの量に加えて、ＲＦの量を決定する。
【００２０】
本明細書で用いる「タンパク質」なる用語を「ポリペプチド」なる用語と同義的に用いることができるか、またはそれに加えて、ペプチド結合以外の結合により連結できる２つまたはそれより多いポリペプチドの複合体、例えばジスルフィド結合により連結され得るタンパク質を作るかかるポリペプチドを意味し得る。最も好ましくは本発明による該バイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／もしくはＩＬ−１ベータタンパク質、ならびに／またはＲＦを含む。「タンパク質」なる用語はまた同一のアミノ酸配列を有するが、とりわけかかるタンパク質が真核細胞宿主において発現される場合に加えられ得るような、翻訳後修飾が異なるポリペプチドのファミリーをも含み得る。これらのタンパク質はその元来の形態でよいか、または例えばタンパク質分解から得られたタンパク質の免疫学的に検出可能なフラグメントでよいかのいずれかである。「免疫学的に検出可能」とはタンパク質フラグメントが例えば質量分析または以下で記載するような抗体試薬により特異的に認識されるエピトープを含有することを意味する。
【００２１】
好ましい実施態様では、該少なくとも２つのバイオマーカーまたはバイオマーカータンパク質の量を質量分析を用いて決定する。さらに好ましい本発明の実施態様によれば、少なくとも２つのバイオマーカーの量を少なくとも２つのバイオマーカータンパク質に特異的に結合する試薬により決定し、ここでタンパク質はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される。本発明の実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する試薬は、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）と称されるインビトロ選択法から作成され、そしてタンパク質を含む特異的リガンドに対して高親和性を有するアプタマー、短いＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む（Brody et al., Mol.Diagn. ４（４）：３８１−３８８（１９９９））。さらに好ましくは、バイオマーカーに特異的に結合する試薬は抗体（Ａｂ）、抗体誘導体および抗体フラグメントを含む。最も好ましくは試薬はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。最も好ましくは該抗体はさらに以下の実施例において記載するものである。
【００２２】
本明細書で用いる「抗体」なる用語には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体および生物学的に機能的な抗体フラグメントが含まれ、それらは抗体フラグメントがタンパク質またはタンパク質のフラグメントに結合するのに十分なこれらのフラグメントである。かかる抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンのクラスのものでよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することができる。キメラ抗体はマウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種から誘導された分子である。これに代えて、抗体は一本鎖抗体を含み得る。一本鎖抗体の生成に関して記載された技術（米国特許第４９４６７７８号； Bird, Science, ２４２：４２３−４２６（１９８８）； Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；および Ward et al., Nature ３３４：５４４−５４６（１９８９））を差次的に発現される遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。最も好ましくは。「ヒト化抗体」を生成するのに有用な技術をタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体に対する抗体を生成するために適合させることができる。かかる技術は米国特許第５９３２４４８号；第５６９３７６２号；第５６９３７６１号；第５５８５０８９号；第５５３０１０１号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５６６１０１６号；および第５７７０４２９号に開示されている。本発明のバイオマーカーの特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを公知の技術により作成することができる。例えばかかるフラグメントには、限定するものではないがＦ（ａｂ’）２フラグメント（これは抗体分子のペプシン消化により生成することができる）およびＦａｂフラグメント（これはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作成することができる）が含まれる。これに代えて、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huse et al., Science, Vol. ２４６, pp. １２７５-１２８１（１９８９））望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、そして容易に同定することを可能にすることができる。本発明のバイオマーカー／バイオマーカータンパク質の量を、前記した抗体を利用するイムノアッセイ法により決定することができる。かかるイムノアッセイ法には、限定するものではないが例えば競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、ドットブロッティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のような蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノＰＣＲイムノアッセイ、プロテインＡまたはプロテインＧイムノアッセイ、およびウェスタンブロッティングのような免疫電気泳動アッセイ、ならびに一般的に用いられ、科学および特許文献に広く記載されるその他のもの、ならびに商業的に用いられる多くのものが含まれる。
【００２３】
酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を用いて二次抗体に酵素を結合させる。しかしながら容易に認識されるように、当業者に周知である非常に多様なライゲーション技術が存在する。一般に用いられる酵素にはとりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に用いられる基質は、一般的に対応する酵素による加水分解時に検出可能な色の変化を生成することで選択される。例えばｐ−ニトロフェニルリン酸がアルカリホスファターゼ共役体と共に使用するのに適当であり；ペルオキシダーゼ共役体には１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に用いられる。前記で記した発色性基質よりもむしろ、蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を用いることも可能である。次いで適切な基質を含有する溶液を第３の複合体に加える。基質は二次抗体に連結させた酵素と反応して定性的な可視シグナルを生じ、これをさらに通常分光光度法により定量して分泌されたタンパク質またはそのフラグメントの量を評価することができる。これに代えて、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光化合物をその結合能力を変化させずに化学的に抗体に結合させることができる。特定の波長の光を有する照明により活性化する場合、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収して、分子の励起状態を誘導し、続いて特徴的なより長い波長で光を放出させる。放出は光学顕微鏡により視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において非常によく確立されており、そして本方法にとりわけ好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカータンパク質と特異的に結合する該試薬を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。本発明の好ましい実施態様は、本発明による少なくとも２つのバイオマーカータンパク質の同時結合および定量のためのタンパク質マイクロアレイ（Templin et al., Comb.Chem.High Throughput.Screen. ７（３）：２２３−２２９（２００４））を提供する。タンパク質マイクロアレイは支持材料上の規定のスポット位置に結合した分子（捕捉剤）からなる。次いでアレイを複合体タンパク質試料に暴露する。抗体のような捕捉剤は生物学的試料の目的のタンパク質に結合することができる。次いで特異的被分析物の個々のスポットへの結合を、各スポットにより生じたシグナルを定量することによりモニタリングすることができる（MacBeath, Nat.Genet. ３２（Suppl）：５２６−５３２（２００２）； Zhu & Snyder, Curr.Opin.Chem.Biol. ７（１）：５５−６３（２００３））。タンパク質マイクロアレイをその適用によって２つの主要なカテゴリーに分類することができる。これらをタンパク質発現マイクロアレイおよびタンパク質機能マイクロアレイと定義する（Kodadek, Chem.Biol. ８（２）：１０５−１１５（２００１））。タンパク質発現マイクロアレイは主に分析ツールとして提供され、そして生物学的液体または試料中のタンパク質、抗原または抗体を検出および定量するために使用され得る。一方タンパク質機能マイクロアレイはタンパク質−タンパク質、酵素−基質および小型分子−タンパク質相互作用を研究するために使用され得る（Huang, Front Biosci. ８：d５５９−d５７６（２００３））。タンパク質マイクロアレイにはまた多くの構造形態がある。これには平板な表面上に構築された二次元マイクロアレイ、および「フロースルー」支持体を用いる三次元マイクロアレイが含まれる。
【００２５】
タンパク質マイクロアレイ構成の型：逆相アレイ（ＲＰＡ）および順相アレイ（ＦＰＡ）（Liotta et al. ２００３； Cancer Cell, vol. ３, no. ４, pp. ３１７-３２５）。ＲＰＡでは少量の組織または細胞試料を各アレイスポットに固定して、アレイが異なる患者の試料または細胞ライセートからなるようにする。ＲＰＡ形式では各アレイを１つの検出タンパク質（例えば抗体）と共にインキュベートし、そして単一の被分析物の評価項目を測定し、そして複数の試料にわたって直接比較する。ＦＰＡでは捕捉剤、通常抗体または抗原は表面に固定され、そして捕捉分子として作用する。各スポットは１つの型の固定抗体または捕捉タンパク質を含有する。各アレイを１つの被験試料と共にインキュベートし、そして複数の被分析物を直ぐに測定する。
【００２６】
ＦＰＡの最も一般的な形態の１つは抗体マイクロアレイである。サンドイッチアッセイによるか、または直接標識法によるかのいずれかで、抗体マイクロアレイを２つの形態で生成することができる。サンドイッチアッセイ法は標的タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つの異なる抗体を利用する。１つの抗体が固体支持体に固定され、そして生物学的試料からその標的分子を捕捉する。適切な検出系を用いて標識二次抗体が結合標的を検出する。サンドイッチアッセイの主な利点はその高い特異性および感度である（Templin, Stoll, Bachmann, & Joos, Comb.Chem.High Throughput.Screen. ７（３）：２２３−２２９（２００４））。高いシグナル対ノイズ比を生じるバックグラウンドの劇的な低下により高い感度が達成される。加えて、大量の標識タンパク質が試料中に存在する直接標識法とは対照的に、少量の標識された検出抗体のみが適用される。またサンドイッチイムノアッセイ形式はマイクロアレイテクノロジーの分野で容易に扱いやすく、そしてかかるイムノアッセイをタンパク質マイクロアレイ形式に適合させて、条件培地および／または患者血清中のタンパク質を定量することができる（Huang et al., Clin.Chem.Lab Med. ３９（３）：２０９−２１４（２００１）； Schweitzer et al., Nat.Biotechnol. ２０（４）：３５９−３６５（２００２））。
【００２７】
直接標識法では、試料中の全タンパク質をフルオロフォアで標識する。次いで抗体マイクロアレイのようなタンパク質マイクロアレイに結合する標識タンパク質を蛍光により直接検出する。直接標識法の適応はHaabおよび共同研究者（Haab, Dunham, & Brown, Genome Biol.２（２）： p（２００１））により記載されている。この方法では、２つの異なる生物学的試料をＣｙ３またはＣｙ５のいずれかのフルオロフォアで標識する。次いでこれらの２つの標識試料を一緒に同等に混合し、そして抗体マイクロアレイに適用する。この方法により、例えば罹患および健常、または処置および未処置試料の間で比較することが可能になる。直接標識にはいくつかの利点があり、その１つは、直接標識法がアッセイを実施するのに１つの特異的抗体しか必要としないということである。
【００２８】
また小型および多重イムノアッセイを用いて、抗体のようなタンパク質の存在または不在に関して生物学的試料をスクリーニングすることもできる（Joos et al., Electrophoresis ２１（１３）：２６４１−２６５０（２０００）； Robinson et al., Nat.Med. ８（３）：２９５−３０１（２００２））。
【００２９】
したがって、本発明は、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータおよびＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出または捕捉剤を含む例えばタンパク質マイクロアレイのような組成物を提供する。最も好ましくは、該タンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。なおさらに好ましくは、本発明によるタンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。最も好ましくは、タンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。その他の好ましい実施態様では、かかるタンパク質マイクロアレイはさらにＲＦの量をも決定するために例えば抗体のような手段を含む。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、抗体のような検出または捕捉剤を例えばポリスチレン表面のような固体支持体上に固定する。別の最も好ましい実施態様では、検出または捕捉剤を２検体ずつ、３検体ずつまたは４検体ずつ９６ウェルプレートの１つのウェルの底部にスポットまたは固定する。
【００３１】
本発明の別の態様は、対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータから選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。本発明の方法の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましい実施態様では、対照試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量ならびに／または骨浸食の存在に相対して、対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加は、対象がＲＡを有するかもしくは発症する可能性があることを示すか、またはここで対照試料に相対して対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加の程度、ならびに／もしくは浸食の程度がＲＡの進行と相関する。好ましくは、対照試料は健常個体から得られた試料である。
該増加量は好ましくは統計的に有意な増加量を意味し、すなわちこれらの少なくとも２つのバイオマーカーに関して健常個体において見出された、および／またはＲＦに関して見出された正常レベルを有意に超えるレベルを意味する。「有意に」または「統計的に有意な」なる用語は統計的有意性を意味し、そして一般的に正常、または高濃度のマーカーを超える２標準偏差（ＳＤ）を意味する。好ましい実施態様では少なくとも２つのバイオマーカーの量および場合によってはＲＦの量の少なくとも約５％増加は、対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があることの指標である。好ましくは、増加は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。
【００３２】
別の態様では、本発明は対象におけるＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質を同定する方法に関し、該方法はａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；およびｃ）工程ｂ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を再度決定することの工程を含み；ここで工程ａ）で測定した量に相対した工程ｂ）で測定した少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により、ＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質が同定される。本発明の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。本発明の好ましい実施態様によれば、（工程ａ）で決定される少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量に比較する場合工程ｃ）で決定される）少なくとも２つのバイオマーカー、および場合によってはＲＦの量の低下は、被験物質がＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質であることを示している。
【００３３】
別の態様では、本発明はＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法を提供し、該方法はａ）該処置を開始する前にＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ｂ）該処置を開始した後にＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ならびにｃ）工程ａ）およびｂ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を比較すること；の工程を含み、ここで工程ａ）およびｂ）の試料中の量の類似により、処置が有効でないことが示され、そしてここで工程ｂ）の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により処置が有効であることが示される。別の実施態様では、ＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法は、該処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで該処置を開始する前に試料中で決定された量に比較して、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により、処置が有効であることが示される。好ましくは、工程ｂ）の試料中、すなわち該処置を開始する前に該対象から得られた生物学的試料中で決定された量に相対して、該処置を開始した後に対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下により、処置が有効であることが示される。本発明の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましい実施態様によれば、該処置は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の投与を含む。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法の１つで決定された該低下は統計的に有意な低下であり、すなわち少なくとも２つのバイオマーカーに関して、および場合によってはＲＦに関してＲＡ患者において見出されるレベルより有意に低く、そして健常な個体で見出されるレベルに近いレベルを意味する。例えば少なくとも２つのバイオマーカーの量の約５％の低下により、被験物質がＲＡを予防または軽減する可能性のあることが示されるか、または処置が有効であることが示される。好ましくは低下は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、ＲＡの特定のサブタイプを有するかまたは有する可能性のある対象を同定するための方法を提供し、該方法はａ）ＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ｂ）工程ａ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を特定のＲＡサブタイプの量と比較すること；の工程を含み、ここで工程ａ）およびｂ）の試料中の量の類似により、対象が該特定のサブタイプに属することが示され、そしてここで工程ａ）およびｂ）の少なくとも２つのバイオマーカーの量の差により、対象がＲＡの異なるサブタイプに属することが示される。該方法の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましくは該差は統計的に有意な差であり、すなわちＲＡの特定のサブタイプに関して公知の該バイオマーカーのレベルと有意に異なる、少なくとも２つのバイオマーカーの、ならびに場合によってはＲＦおよび／または浸食のレベルを意味する。
【００３６】
本発明の別の態様はリウマチ性疾患を有するかまたは有する可能性のある対象を同定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。該方法のさらなる実施態様は浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量のさらなる決定を提供する。好ましい実施態様では、健常個体の対照試料に相対して対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加、ならびに／または浸食の存在により、該対象が該リウマチ性疾患を有するかまたは発症する可能性があることが示される。該増加量は好ましくは統計的に有意な量を含む。好ましい実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカー量の少なくとも約５％増加は、対象が該リウマチ性疾患を有するかまたは発症する可能性があることの指標である。好ましくは、増加は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。リウマチ性疾患は例えばリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、若年性リウマチ様関節炎（ＪＲＡ）、結合組織病（ＣＴＤ）および巨細胞性動脈炎でよい。
【００３７】
少なくとも２つのバイオマーカーの量、ならびに場合によってはＲＦの量、および／または浸食の決定を本明細書に記載するように実施するのが好ましい。例えば浸食を例えばＸ線フィルム検査により視覚的および定性的に評価することができるか、またはＭＲＩ分析を用いることにより決定することができる；少なくとも２つのバイオマーカーの量またはＲＦの量を、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することができる。別の好ましい実施態様では、該バイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量を質量分析を用いて、または例えばモノクローナル抗体、抗体誘導体もしくは抗体フラグメントを含む抗体のような少なくとも２つのバイオマーカータンパク質および／もしくはＲＦに特異的に結合する試薬を用いて決定する。好ましくは少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するために用いる該手段を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。最も好ましくは、本発明の少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する抗体はさらに以下の実施例において記載するものである。
【００３８】
種々の方法を用いてＲＦを測定することができ；その全ては血清中のＩｇＭ ＲＦの検出に基づく。用いることができる方法は例えば：ａ）Waaler Rose：ウサギＩｇＧでコーティングしたヒツジ赤血球を用いる古典的半定量的アッセイ（Waaler E. ヒツジ血球の特異的凝集を活性化するヒト血清中の因子の発生に関して、ActaPathol. Microbiol. Scan.１７：１７２−１７８（１９４０）； Rose HM, Ragan C, Pearce E, Lipman MO. リウマチ様関節炎を有する患者の血清による正常および感作ヒツジ赤血球の差次的凝集、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ６８：１−１１（１９４９））；ｂ）ラテックス吸着アッセイ：ヒトＩｇＧでコーティングしたラテックスビーズを用いる、これもまた古典的半定量的アッセイ（Singer JM, Plotz CM.ラテックス試験Ｉ．リウマチ様関節炎の血清学的診断への適用、Am J Med ２１：８８８（１９５６））および／またはｃ）非濁法：ヒトＩｇＧでコーティングしたラテックスビーズを用いる自動検出、「ＮラテックスＲＦ」試薬を用いて比濁計「ＢＮＩＩ」で測定（Dade Behringによる装置およびアッセイ、ＯＵＵＡ Ｇ１３ Ｅ０５４０ １３５ Ｈ； Weinblatt, ME, Schur PH. 非濁法によるリウマトイド因子検出、 Arthitis and Rheumatism ２３：７７７−７７９（１９８０））。
【００３９】
好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファの量ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。別の好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４０】
別の好ましい実施態様では、ＭＣＰ−１の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは、該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。別の好ましい実施態様によれば、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、さらにＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４１】
なおさらなる実施態様では、ＩＬ−１ｒａの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定し、ここで最も好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。最も好ましい実施態様では、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。本発明の別の最も好ましい実施態様では、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量、またはＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４２】
別の好ましい実施態様では、ＩＬ−８の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。
【００４３】
なおさらなる実施態様では、ＩＬ−６の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−１ベータである。最も好ましい実施態様では、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量またはＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、さらにＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４４】
別の好ましい実施態様ではＩＬ−１ベータの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−６である。さらなる好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４５】
なおさらに好ましい実施態様によれば、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。最も好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の量、またはＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する。なおさらなる実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーの量を決定することを提供する。本発明の最も好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。本発明の別の最も好ましい実施態様では、場合によっては骨浸食の決定と一緒に、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＲＦの量を決定する。
【００４６】
本発明の別の実施態様ではＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーの量を決定する方法に関する。好ましくはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６の量を決定する。さらに好ましい実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５または６つのバイオマーカーの量を決定する。好ましい実施態様ではＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータの量を決定する。本発明のその他の好ましい方法によれば、前記で概要を示したように、生物学的試料中の少なくとも２、３、４、５または最大４、５または６つのバイオマーカーの量をＲＦの量と一緒に、および／または骨浸食の決定と一緒に測定する。
【００４７】
好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を場合によってはＲＦの量と一緒に、別個に逐次的にまたは同時に決定する。最も好ましくは、少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する。したがって、抗体のような該バイオマーカーに特異的に結合することができる手段の混合物を試料と接触させることにより、生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカー、ならびに場合によってはＲＦを同時に決定する。本発明の別の好ましい実施態様では、本明細書に記載したような組成物またはキットを用いることによりバイオマーカーの量の同時決定を実施する。
【００４８】
本発明はさらにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含む、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物の発見に基づく。該組成物の別の実施態様はさらにＲＦの量を決定するための少なくとも１つの検出剤を含む。また該組成物をＲＡの診断または進行もしくは処置をモニタリングするために用いることもできる。検出剤は好ましくはＴＮＦ−アルファに特異的に結合する手段ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは該手段はＴＮＦ−アルファに特異的に結合し、そして該その他の手段はＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータに特異的に結合する。本発明にさらに好ましい実施態様では、検出剤はＭＣＰ−１に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。本発明の別の実施態様では、組成物はＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する１つのさらなる手段を含む。別の実施態様では該組成物はさらにＲＦに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００４９】
なおさらに好ましい実施態様では、検出剤はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは、組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＩＬ−６に結合する少なくとも１つのさらなる手段、またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくともさらなる手段、またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。その他の実施態様では、該組成物はさらにＲＦに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、検出剤はＩＬ−８に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。なおさらに好ましい実施態様は、検出剤がＩＬ−６に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含むことを提供する。好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−１ベータである。最も好ましくは、組成物はＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＭＣＰ−１に結合する少なくとも１つのさらなる手段および場合によってはＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに結合する少なくとも１つのさらなる手段および場合によってはＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、検出剤がＩＬ−１ベータに特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む組成物に関する。最も好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−６である。そして本発明のなおさらなる実施態様は検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む組成物に関する。最も好ましくは該組成物はＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。本発明のその他の最も好ましい実施態様では、少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む該組成物はさらにＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５２】
本発明のなお別の実施態様は、検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む組成物を提供する。最も好ましくは少なくとも４つのバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６を含む。別の最も好ましい実施態様では、少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む組成物はさらにＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。本発明のもっとさらに好ましい実施態様は、検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも５つの異なる手段を含み、ここで最も好ましくは少なくとも５つのバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６を含むことを提供する。本発明の別の実施態様は検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５もしくは６つのバイオマーカーに特異的に結合する最大４、５もしくは６つの異なる手段を含むか、または最大６つのバイオマーカーがＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータを含む組成物を提供する。本発明の別の実施態様によれば、バイオマーカーに特異的に結合する手段は該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡに結合することができる少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドを含むか、または、さらに前記で詳記し、そしてまた実施例でも概要を示すように、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカー／バイオマーカータンパク質に結合することができる抗体、モノクローナル抗体、抗体誘導体もしくは抗体フラグメントを含む。特に好ましい実施態様では、バイオマーカーに特異的に結合する手段を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。最も好ましい実施態様はさらに以下の実施例で記載するようにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６もしくはＩＬ−１ベータ、またはＲＦに特異的に結合する少なくとも２、３、４つの、または少なくとも５もしくは６つの抗体を提供し、ここで該抗体を９６ウェルプレートの１つのウェル内のようなポリスチレン表面にスポットまたは固定する。別の好ましい実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６の群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも２つの抗体、ならびに場合によってはＲＦを２検体ずつ、３検体ずつまたは４検体ずつで９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットまたは固定する。
【００５３】
本発明のその他の態様はまた本発明による組成物のいずれか１つおよび使用のための指示書を含む診断または薬物発見キットを提供する。好ましい実施態様では、該診断または薬物発見キットはさらにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦから選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合することができる例えばビオチン化抗体のような標識抗体の混合物を含む。
そして本発明のなおさらなる態様は本発明による方法の１つにおけるかかる診断または薬物発見キットの使用に関する。
本発明を以下の実施例でさらに記載する。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ガラスチップ形式のタンパク質マイクロアレイの開発
タンパク質マイクロアレイを多重タンパク質分析に有用なツールとして開発を続ける。タンパク質マイクロアレイの開発はタンパク質沈着、アッセイ手順、シグナル検出およびデータ解析のために多くの技術を組み合わせる。異なる支持体、液体処理方法および検出系を伴う多くの試みが、タンパク質マイクロアレイ開発に関して為されている（Kodadek ； Chem.Biol. ８,（２）：１０５−１１５（２００１）； Stoll, Templin, Schrenk, Traub, Vohringer, & Joos； Front Biosci. ７：c１３−c３２（２００２）； Templin et al. ； Proteomics. ３（１１）：２１５５−２１６６（２００３））。開発は以下の工程を網羅する：
２つの界面化学物質を用いたガラスチップの処理の比較：ポリ−Ｌ−リジン対オクタデシルリン酸エステルの自己組織化単分子膜；
抗体沈着に関する接触および非接触圧電型アレイの比較；
コーティング抗体の種々濃度の比較；
種々検出系の比較：ＣＣＤカメラ対蛍光スキャナ。
ガラスチップ上のサンドイッチタンパク質マイクロアレイの開発は例えばUrbanowska et al., Cell Biology and Toxicology １９：１８９−２０２（２００３）に記載されている。
【００５５】
最適化アッセイ
プリンティングバッファーへのグリセロール添加の影響をＭＣＰ−１アッセイで調べる。ＭＣＰ−１に対する抗体をＰＢＳ単独ならびに１０、２０、３０、４０および５０％グリセロールを添加したＰＢＳで希釈する。５ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＣＰ−１に関してサンドウィッチアッセイの間に生じたシグナルをコーティング溶液に加えたグリセロールの種々の量に対してプロットする（図１）。結果により、１０％グリセロールをコーティング溶液に加えた場合、シグナル強度が低下することが示される。しかしながら２０−５０％グリセロールの添加の場合、生じたシグナルは同程度であるが、スポット（ｎ＝１６）間の変動性はかなり増加する。
【００５６】
実施例２
９６ウェルプレート形式のタンパク質マイクロアレイの開発
界面化学を用いてチップをコーティングする方法（実施例１をも参照）は、アッセイ処理のロボット自動化がなされておらず、そしてチップ間変動性が高く、かなり時間がかかり、そして複雑であるので、タンパク質マイクロアレイ製造に関してあまり複雑でなく、そしてより確固とした代替を求める探求が促された。結果的に類似するが、ガラススライドを用いる代わりに固体支持体として９６ウェルプレートのポリスチレン表面を使用するマイクロアレイを開発する試みが為された。
【００５７】
ポリスチレンプレートは９６ウェル形式でイムノアッセイに用いられる明確に確立された固体支持体であり、そして古典的ＥＬＩＳＡ技術において広く利用されている。界面化学は抗体結合に関して標準化および最適化されており、そしてアッセイ処理工程は完全に自動化される。したがって、このテクノロジーをマイクロアレイ形式に適合させる可能性はその他の固体支持体に勝る多くの利点を提供できるであろう。
【００５８】
バイオチップアレイヤー（ＢＣＡ）プリンティング装置に適合するロングネックチップ（PerkinElmer）の利用可能性により固体支持体としての９６ウェルプレートの使用の選択肢が提供された。重要なことに、これらのロングネックチップにより、抗体を９６ウェルプレートの底部に正確にスポットすることが可能になる（Moody, Van Arsdell, Murphy, Orencole, & Burns, Biotechniques ３１（１）：１８６−４（２００１））。開発過程は試薬選択、プリンティングプロトコール最適化、マトリックス検査、アッセイプロトコール確立および検出系評価を伴った。
【００５９】
得られた結果に基づいて、マイクロアレイ調製のために以下の条件を選択した：ガラス処理のためのＯＤＰのＳＡＭ；非接触圧電型プリンターを用いる２００μｇ／ｍｌの濃度でのコーティング抗体の沈着、および蛍光によるシグナル検出。
【００６０】
実施した実験の結果として、９６ウェルプレートの各ウェルで４×４マイクロアレイを開発した。圧電型装置を用いて抗体を各ウェルに２００μｇ／ｍｌの濃度で、スポットあたり３ｎｌ固定した。抗原およびビオチン化抗体の混合物の試料インキュベーションに続いて、各ウェル内の各スポットで生じた化学発光シグナルを、ノンパララックストレイを有するＣＣＤカメラを用いて撮像した。次いで画像をArrayVision（商標）ソフトウェアを用いて分析した。各スポットで生じたシグナルの量は元来の標準または試料中の標的タンパク質の量に比例した。
【００６１】
材料および方法
一般試薬
ＰＢＳバッファー １０×ＰＢＳバッファー、Roche Diagnostic, Indianapolis, IN,USA）
Tween（登録商標）２０ Fluka Chemie Sarl, Buchs, Switzerland
SuperBlock（商標） Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA
ウシ血清アルブミン（Ｖ分画） Fluka Chemie Sarl, Buchs, Switzerland
洗浄バッファー ＰＢＳ１×０.０５％Tween含有
アッセイバッファー ＰＢＳ１×０.０５％Tween、３％ＢＳＡ含有
【００６２】
ソフトウェア
Quantity One バージョン４.２.１（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）
Aida バージョン５.０（Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany）
ImaGene（商標）バージョン５.０（BioDiscovery, Inc. , El Segundo, CA, USA）
Array Vision（商標）バージョン８.０（Imaging Research Inc. , Ontario, Canada）
SOFTmax（登録商標） PRO バージョン３.１.１（Molecular Devices Corp. , Sunnyvale, CA, USA）
【００６３】
研究室装置
ブラックプレート：Maxisorp（商標）９６ウェルプレート（Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）
透明プレート：Maxisorp（商標）９６ウェルプレート（Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）
プレートシェーカー：Wesbart（ＩＳ８９）（Fischer scientific, Wohlen, Switzerland）
洗浄器： Embla, Molecular Devices（Bucher Biotec AG, Basel, Switzerland）
【００６４】
装置
プリンティング装置 バイオチップアレイヤー（ＢＣＡ）（PerkinElmer, Boston, MA, USA）
カメラ ＬＡＳ１０００− Fuji, Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany.
ＬＡＳ３０００− Fuji, Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany
【００６５】
プリンティング系設定
マイクロアレイ製造のためにＢＣＡを使用した。圧電系のパラメーターをチップあたり１１０−２００ボルトに設定した。チップとウェル底部との間の距離は０.５ｍｍであった。抗体を２検体ずつ、スポット間１ｍｍの距離で分配した。
【００６６】
抗体および組換えタンパク質
抗体試薬
【表１】
【００６７】
組換えタンパク質
【表２】
【００６８】
市販キット
ＥＬＩＳＡキット
【表３】
【００６９】
抗体選択
抗体９６ウェルプレートの開発に用いる試薬は市販の異なるエピトープに対するＥＬＩＳＡ抗体適合対、および対応する抗原であった。マイクロアレイ開発のために選択されるバイオマーカーのパネルはＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦαであった。
【００７０】
多重形式の前記の抗体適合対の適応性を確認するために、交差反応の可能性を調べる実験を行った。全ての捕捉抗体を各ウェルの底部にスポットし、そして単一の組換えサイトカイン（０.６４ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、０.５８ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１ｒａ、０.８ ｎｇ／ｍｌ ＭＣＰ−１および０.０３８ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα）および全抗原に対するビオチン化抗体のカクテルでスパイクしたＰＢＳと共にインキュベートした。試料にスパイクしなかった全ての被分析物のレベルは定量限界以下であった。したがって、選択した抗体適合対はこのマイクロアレイ形式で特異的である。
【００７１】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１に対する抗体のサブセットの交差反応性もまたBIAcore（登録商標）テクノロジーで調べた。結果により、マイクロアレイ製造のために選択された抗体適合対間に交差反応性がないことが実証された。
【００７２】
試薬条件最適化
アッセイの各工程に関して、種々の条件を試験しなければならない。様々の濃度のコーティングおよび検出抗体ならびに種々のスポット容量を比較した。検出抗体に関しては、高いシグナル対ノイズ比を生じるために種々濃度が必要とされる。
【００７３】
コーティング抗体濃度の力価測定
ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に対する抗体を４つの濃度でプリントした：２５、５０、１００および２００μｇ／ｍｌ。アッセイを実施した後、各被分析物に関して生じたシグナルをバックグラウンド値で除した。バックグラウンドは被分析物を加えなかった（ブランク）ウェルから定量した。各被分析物に関して１００００、１０００および１００pｇ／ｍｌの濃度でシグナル対ノイズ比を計算した。図２では被分析物濃度１００pｇ／ｍｌに関するシグナル対ノイズ比を示す。ＩＬ−１βに関しては、コーティング抗体濃度１０、５０、１００および２００μｇ／ｍｌに関してシグナル対ノイズ比１.５、１９.５、９２.９および１２９.２を測定した。ＩＬ−６の場合、同一のコーティング抗体濃度に関してシグナル対ノイズ比は１.０、１０６.９、１１３.９、１１６.５であったが；ＩＬ−８に関しては、２.１、５９.７、１５５.１、１５７.８という結果であった（図２）。全被分析物に関して最も高いシグナル対ノイズ比は、２００μｇ／ｍｌの濃度のコーティング抗体を用いた場合に得られ、結果として、マイクロアレイ製造のためにこの濃度を選択した。
【００７４】
スポットあたりのコーティング溶液の容量
各ウェルの底部に抗体をプリントした。全抗体をウェルあたり４検体ずつでプリントした。各標準曲線濃度を２つのウェルに分配した。結果的に被分析物あたり８つのスポットを生じた。抗体溶液を滴あたり〜０.３３３ｐｌの容量で分配した。４つの異なる場合の全スポット容量を調べた：２０ｎｌ（６０滴）、１０ｎｌ（３０滴）、３ｎｌ（９滴）および０.３３３ｎｌ（１滴）。各分配容量に関して変動係数（ＣＶ％）を計算した。滴あたり２０ｎｌを分配した場合、スポットの大きさは比較的大きく、スポットのお互いの重複を引き起こし、それによりアッセイ結果が不正確になった。３つのその他の場合では、各スポットから生じたシグナル強度のＣＶ％を全標準曲線濃度に関して計算した：１０、２５、５０、１００および１０００pｇ／ｍｌ。最良の感度およびＣＶ％はスポットあたり３ｎｌの容量を分配した場合に得られた。全標準曲線濃度にわたるＣＶ％範囲を示す（表１）。結果的に、３ｎｌ／スポットをマイクロアレイ製造に選択した。
【００７５】
【表４】
各被分析物に関してスポットあたり種々容量のコーティング抗体溶液を分配した。式：（標準偏差／平均*１００）を用いて各スポット（ｎ＝８）から生じたシグナル強度に関してＣＶ％を計算した。ＣＶ％は３ｎｌ／スポット容量を分配した場合に最良であった。
【００７６】
ビオチン化抗体濃度の力価測定
種々濃度のビオチン化抗体を試験した。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−８に対するビオチン化抗体を６２.５、１２５、２５０および５００ｎｇ／ｍｌに希釈した。ビオチン化抗体の各希釈に関して生じたシグナルを対応するバックグラウンドで除した。最も高いシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してコーティング抗体の濃度５００ｎｇ／ｍｌを用いた場合に得られた。種々濃度のビオチン化ＡｂでＩＬ−８アッセイに関して発生したたシグナル対ノイズ比の実例を図３に示す。結果的に、５００ｎｇ／ｍｌの濃度をマイクロアレイ製造に選択した。
【００７７】
ヒト、イヌおよび子ウシ血清評価
無作為にイヌ、ヒトおよび子ウシ血清でＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に関する標準曲線を調製した。プロットする前に各ウェルからのローカルバックグラウンドをシグナル強度から減じた。
【００７８】
バッファー評価
市販のＥＬＩＳＡキットで標準作成に使用するアッセイバッファーでＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に関する標準曲線を調製した。様々な濃度の組換えタンパク質でスパイクしたヒト血清プールから調製した試料を標準に基づいて計算した。
【００７９】
【表５】
ＩＬ−１βでスパイクしたヒト血清試料に関して計算した正確性［（スパイクした被分析物濃度／実測被分析物濃度）＊１００］。バッファー中で調製したＩＬ−１β標準に基づいて正確性を計算した。得られた値はＩＬ−１βのスパイクした量に比較して半分の値になった。
【００８０】
種々のヒト血清スクリーニング
低レベルのＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦαを含有するマトリックスを選択するために、それらに対する抗体を各ウェルの底部にプリントした。ヒト血清の種々のバッチをアレイの各ウェルに適用した。各バッチを２検体ずつで分析した。プリントされた被分析物に関して高いシグナルが得られた血清を拒絶し、そして調べた被分析物に関して低いシグナルを生じた血清を可能性のあるプール構成成分として選択した。これらの血清中の内因性の被分析物の量を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。得られた結果に基づいて、ＥＬＩＳＡデータシートに記載された正常なヒト血清中の値に相当する被分析物の量を含有する血清を、プールを調製するために選択した。スクリーニングした全部で３６個のヒト血清のバッチから１２個を選択し、そして一緒にプールした。続いてヒト血清プール中の被分析物の量もまたＥＬＩＳＡキットで測定した。結果により、プール中の目的の被分析物の全量はまた正常血清中に見出されたレベルに相当することが示された。結果を表３に示す。
【００８１】
【表６】
【００８２】
続いてヒト血清プールで全被分析物に関する標準曲線を生成した。シグナルおよび濃度をプロットする前に各ウェルからのローカルバックグラウンドを減じた。全標準は満足できる直線性を示した。
【００８３】
バッファーマトリックス評価の間に同一の様式で調製された試料を前記した標準に基づいて測定した。全被分析物に関する実測濃度はスパイク濃度に相当し、７０％≦および≦１３０％内のアッセイの正確さが得られた。ＩＬ−１βに関する実例の結果を表４に示す。選択されたヒト血清プールをアッセイバリデーションに用いた。
【００８４】
【表７】
ＩＬ−１βヒト血清スパイク試料をヒト血清で調製した標準曲線で測定した。濃度は満足できる正確性７０％≦および≦１３０％で実測された。
【００８５】
アッセイ条件最適化
コーティング溶液へのグリセロールの添加
グリセロール１０、５および０％を添加したＰＢＳをコーティング溶液として用いた。全ての標準曲線濃度点に関してＣＶ％および正確さを計算した。ＩＬ−１βに関する代表的なデータを表５に示す。ＣＶ％とＡｃｃ％の間で、種々のグリセロール添加で得られた結果の間に主要な差異はなかった。しかしながらグリセロールの添加は技術的観点の理由で問題があった。粘性のグリセロール特性がプリンティングチップに詰まりを引き起こした。この結果に基づいて、グリセロールを添加していないＰＢＳをマイクロアレイ作成のためのコーティングバッファーとして選択した。
【００８６】
【表８】
【００８７】
アッセイ形式
２つの異なるアッセイ形式を比較した：サンドイッチアッセイならびに試料およびビオチン化抗体の同時インキュベーション。サンドイッチ法ではアッセイを２工程で実施する。最初にプリントしたコーティング抗体を試料と共にインキュベートし、次いで洗浄工程の間に未結合試料を除去した後、アレイをビオチン化抗体のカクテルに暴露する。２工程インキュベーションは、アッセイ抗体のいくつかがポリクローナルである場合に有利であろう。
【００８８】
同時インキュベーションの場合、アッセイを１工程で実施する。プリントしたコーティング抗体を試料およびビオチン化抗体のカクテルの混合物と一緒にインキュベートする。同時インキュベーション法は試料適用の間の時間差を最小にし得る。ＩＬ−６標準曲線は双方のアッセイ形式を用いて作成した標準曲線を表す（図４）。１工程形式を実施した場合、作成した標準曲線は最低範囲でさえも直線であり、アッセイ感度を高めた。
【００８９】
ＣＣＤカメラ選択および設定
次いでＨＲＰ−共役ストレプトアビジンおよび化学発光の強化を用いて視覚化したシグナルを、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いて撮像した。９６ウェル形式により化学発光およびＣＣＤ組み合わせの選択が決定づけられた。２つの異なるＣＣＤカメラを用いて画像を作成した。撮像に利用した２つの異なるＣＣＤカメラはFuji ＬＡＳ１０００およびＬＡＳ３０００であった。ノンパララックストレイなしで生成された画像はエッジ効果を生み出し、画像分析を不正確にすることが観察された。第２のカメラの利点は９６ウェルプレートウェルの視差を排除するノンパララックストレイである。また第２のカメラにより、スポットの大きさを小さくすることによりマイク分析を容易にそしてより精密にする高解像度ビニング様式の選択肢が得られた。図５はノンパララックストレイ装置で、そして３つの異なる画像様式で撮影した画像を示す：高（左）、標準（中央）および高解像度様式（右）。もはやエッジ効果は観察されなかった。結果的にマイクロアレイ製造のために第２のカメラを選択した。アッセイの間に生じたバックグラウンドはプレートの全ウェルにわたって安定していた。各ウェルからのバックグラウンドシグナル強度間のＣＶ％は３.３％であった。これらの結果により、生成されたシグナル強度のバックグラウンド補正は必要でないことが示された。
【００９０】
定量ソフトウェア
３つの市販の定量ソフトウェアを評価した：Aida、ImageneおよびArrayVision。３つのツール間の主要な差異はArrayVision（商標）システムに含まれる標準曲線作成特徴である。その他のプログラムは標準曲線作成にさらなるツールを必要とした。例えばその他の２つのソフトウェアでデジタル化シグナル値をExcelプログラムにエクスポートしてプログラム変動性計算を実施しなければならなかった。その後でデータを再度標準曲線作成のためにSoftmaxPro（登録商標）ソフトウェアにエクスポートした。これが、ArrayVision（商標）を抗体マイクロアレイ製造のためのソフトウェアとして選択することになった主要な原因であった。３つのソフトウェアの比較を表６に示す。
【００９１】
【表９】
【００９２】
開発したプロトコール
一般試薬：
プレート： ブラックプレート
コーティングバッファー： ＰＢＳ１Ｘ
ＣＣＤカメラ： ＬＡＳ−３０００高解像度ビニング様式
ソフトウェア： ArrayVision（登録商標）
【００９３】
アッセイプロトコール
コーティング ２００μｇ／ｍｌモノクローナル抗体
３ｎｌ／スポット
バイオチップアレイヤーエンクロージャー中２時間乾燥
４℃で一晩インキュベーション
室温で３０分間乾燥
３７℃で１０分間乾燥
遮断 SuperBlock／ウェル３×２００μｌ
SuperBlock／ウェル１００μｌ、室温で３０分間インキュベーション
試料インキュベーション 試料５０μｌ／ウェル
５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体のカクテル５０μｌ／ウェル
振盪プラットフォーム上で室温で４時間インキュベーション
洗浄バッファー３００μｌ／ウェルで３回洗浄
ストレプトアビジン−ＨＲＰ ０.２μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ウェル
振盪プラットフォーム上で室温で３０分間インキュベーション
洗浄バッファー３００μｌ／ウェルで３回洗浄
化学発光基質 １００μｌ／ウェル、即座に読み出し
撮像 ＣＣＤカメラ露出２０秒
画像デジタル化および１６ビットｔｉｆｆファイルとして保存
シグナル定量 ArrayVision（商標）
【００９４】
要約すれば、９６ウェル形式でＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１ベータのようなリウマチ様関節炎に関連する少なくとも２、３、４、５または６つのバイオマーカーを同時に測定するのに有効な方法の開発における主要な構成成分、工程および条件を評価した。評価は試薬力価測定、スポットあたりに沈着したコーティング抗体の量、マトリックス選択、検出および解析、ならびにソフトウェア評価を網羅する。
【００９５】
最適なシグナル対ノイズ比を生成するのに必要な、ＥＬＩＳＡに比較して高い抗体濃度を検討する場合、プリンティング過程の間に抗体変性の可能性を考慮すべきである。別の可能性は抗体をポリスチレン９６ウェルプレートに固定する物理的吸着である。物理的吸着はアッセイ中のタンパク質脱離に至り得て、これはシグナル損失に至り得る。コーティング溶液の濃度が高い場合、抗体の変性または脱離の可能性は低くなるかもしれない。
【００９６】
薬物動態イムノアッセイのための既存の手引きは、分析する試料と同一起源のマトリックス、これに代えて異種動物マトリックスまたはタンパク質不含バッファーで被分析物測定のための標準曲線を調製することを推奨した。
化学発光反応において生成された光は全方向に同等に放出される。そのためにいわゆる光パイピング現象を回避するために、化学発光測定のために透明のプレートの代わりにブラックプレートを使用することが推奨される。光パイピングは単に各ウェルから生じたシグナルの干渉である。しかしながらブラックプレートは視誤差を取り込む危険性を創成するプレートの上から画像を撮影することを必要とする。したがって抗体アレイのための撮像ツールとして２種のＣＣＤカメラを比較した。ＬＡＳ３０００カメラにより提供されるノンパララックストレイの選択肢により全てのプレートを視差の影響なく撮像することが可能になった。
【００９７】
実施例３
９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイのバリデーション
開発した９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイは古典的なイムノアッセイで利用されるサンドイッチＥＬＩＳＡ手順に基づく（Wild ２００１； The Imunoassay Handbook）。イムノアッセイはしばしば疾病の経過および処置に応答して誘発された抗体を示すバイオマーカー定量化に適用される。（Findlay, Smith, Lee, Nordblom, Das, DeSilva, Khan, & Bowsher； J.Pharm.Biomed.Anal. ２１（６）：１２４９−１２７３（２０００））。したがって、イムノアッセイが正確であり、そして精密であることが非常に重要である。正確性は、方法により得られた濃度の値が被分析物の公知の真の濃度の値に近似することと定義され、一方精度は、方法を同一の生物学的試料の複数のアリコートに繰り返し適用した場合に被分析物の個々の測定値が近似することである。
正確性＝（算出濃度／名目濃度）＊１００
精度＝（標準偏差／算出平均濃度）＊１００
【００９８】
任意の生物分析方法のこれらの重要な特徴をバリデーションの過程で調べる。分析方法のバリデーションにより供給源を同定し、そして方法における潜在誤差を定量化する（Findlay, Smith, Lee, Nordblom, Das, DeSilva, Khan, & Bowsher, J.Pharm.Biomed.Anal. ２１（６）：１２４９−１２７３（２０００）；Shah, Midha, Findlay, Hill, Hulse, McGilveray, McKay, Miller, Patnaik, Powell, Tonelli, Viswanathan, & Yacobi, Pharm.Res. １７（１２）：１５５１−１５５７（２０００））。アッセイバリデーションは数学的および定量可能な用語でアッセイの動作特性について説明する。古典的なイムノアッセイはＦＤＡの指令（２００４）に沿ってバリデートされなければならない。
【００９９】
バリデーションプロトコール
抗体マイクロアレイのバリデーションに採用されたプロトコールは薬物動態イムノアッセイに関するＦＤＡの指令（２００４）の重要な要素を用いた許容基準文書に基づいた。９６ウェル形式のＡｂマイクロアレイに採用された修飾されたプロトコールがバリデーション方法で実践された。
【０１００】
９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイのバリデーションプロトコール
マトリックス
そこから（複数の）被分析物を定量する血漿、血清、全血、尿、糞便、組織のような生物学的培地を記載するためにマトリックスを用いる。測定された低レベルの被分析物を含有する選択されたヒト血清のプールで全てのバリデーション実験を実施した。
【０１０１】
標準曲線は装置応答性と被分析物の公知の濃度との間の関係である。
標準曲線の直線部分は疾病状態の被分析物濃度レベル内にあるべきである。８つの異なる濃度レベルを用いて標準曲線を構築した。（複数の）被分析物も内部標準も加えられていない試料をブランクとした。
【０１０２】
【表１０】
マトリックス中に標準を新たに調製し、そして各バリデーション日に実行した。
標準を１回調製し、そして３検体ずつで分析した。
作動範囲内の標準に関する逆算値は予測濃度から≦３０％偏差になるべきである（７０％≦正確性≦１３０％）。
個々の標準の最大１／４は排除され得る。
各標準濃度で少なくとも５０％の値（スポット）が正確性および精度範囲内に入らなければならない。
【０１０３】
品質管理試料
品質管理試料（ＱＣ）は生物分析方法の性能をモニタリングするため、および個々のバッチで分析される未知試料の結果の完全性および妥当性を評価するために用いられるスパイクされた試料である。ＱＣを標準曲線と同一のマトリックスで調製する。
ＱＣ試料を各被分析物に関して６濃度で調製した。
【０１０４】
【表１１】
各ＱＣ濃度に関して同一のマトリックスから別個に２つのＱＣセットを調製し、３検体ずつで分析した。
ＱＣ試料は予想される動的濃度範囲を網羅すべきであり、１つのＱＣは予想される定量下限（ＬＬＯＱ）で；１つはＬＬＯＱの３倍内で、１つは高および低ＱＣ濃度のほぼ間で、そして１つは予想される定量上限（ＵＬＯＱ）である。ＬＬＯＱは適当な精度および正確性を伴って定量的に決定され得る試料中の被分析物の最低濃度である。ＵＬＯＱは適当な精度および正確性を伴って定量的に決定され得る試料中の被分析物の最高量である。
７０％≦正確さ≦１３０％は各濃度レベルでの平均値に基づいた。
各濃度レベルで精度≦３０％
個々のＱＣ濃度値の少なくとも２／３は正確性および精度の範囲内でなければならない。
各ＱＣ濃度で少なくとも５０％の値（スポット）は正確性および精度の範囲内でなければならない。
標準およびＱＣを同一ストック溶液から調製した。
日間変動性：異なる日で３回バリデーションを実行した。バリデーション実行は分析に問題がある場合にのみ拒絶されるべきである（例えば試薬調製のエラー、装置不備、ピペッティングエラーまたは実行からのデータがあまりに異常であるので、その値が説明できない分析エラーの結果でしかあり得ない場合）。
【０１０５】
安定性
安定性は規定の時間間隔で特定の保存条件下での、規定の溶液またはマトリックス中の被分析物の物理化学的安定性である。
スパイクされた試料の短時間安定性。室温で少なくとも６時間評価される、非分析物のヒト血清プールをスパイクするストックの安定性。望ましい保存時間の完了後、保存した試料対新たに調製した試料を測定することにより安定性を試験すべきである。安定性はＱＣ３およびＱＣ４で試験する。
長期間安定性：日間変動性バリデーションのために調製したＱＣ３およびＱＣ４を最初のバリデーション実行時、１週間間隔および１か月間隔で分析する。
【０１０６】
標準曲線およびＱＣ試料調製
各被分析物に関して同一ストック溶液を用いて標準およびＱＣ試料を調製した。標準およびＱＣ試料を各分析日に同一ヒト血清プールから新たに調製した。バリデーションプロトコールで示すように濃度範囲は標準およびＱＣを網羅した。
【０１０７】
標準曲線調製
ヒト血清プールで２０μｇ／ｍｌ被分析物ストック溶液を用いてプレ試料溶液を調製した。ストック溶液をヒト血清プールで１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで２倍希釈（１：１０）した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の目標濃度を調製するために、１００ｎｇ／ｍｌ濃度を用いた。ＴＮＦαに関しては、１０ｎｇ／ｍｌの濃度を用いた。ヒト血清中の組換えタンパク質のカクテルをヒト血清で、バリデーションプロトコールで定義した目標濃度まで連続希釈で１：２に希釈した。各被分析物に関してArrayVision（商標）でロジスティック（ＥＬＩＳＡ）設定を用いて、シグナル対濃度をプロットすることにより標準曲線が得られた。個々の較正線の品質を較正標準の逆算濃度の正確性および精度から評価した。これらの正確さをSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアを用いて計算した。
【０１０８】
計算
正確性％および精度％
平均 各標準濃度に関して全スポット（ｎ＝６）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
【０１０９】
ＱＣ試料調製
各被分析物に関して２０μｇ／ｍｌストック溶液からヒト血清プールでプレ試料溶液を調製した。ストック溶液をヒト血清プールで１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで２倍希釈（１：１０）した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の目標濃度を調製するために、１００ｎｇ／ｍｌ濃度を用いた。ＴＮＦαに関しては、１０ｎｇ／ｍｌの濃度を用いた。ヒト血清中の組換えタンパク質のカクテルをバリデーションプロトコールで定義した目標濃度まで連続希釈で１：２.５に希釈した。各日に較正試料（ｎ＝３）と一緒に分析したＱＣ試料の日間正確性および精度ならびに日内正確さおよび精度を計算することにより、方法の正確性および精度を評価した。別個のＱＣセットに関してＱＣを３検体ずつ、ウェルあたり２スポット（ｎ＝１２）で調製した。ＱＣ試料に関する正確性および精度を以下の式を用いてArrayVision（商標）ソフトウェアで計算した。
【０１１０】
計算
日内正確性％および精度％
平均 各ＱＣ濃度に関して全スポット（ｎ＝１２）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各ＱＣ濃度に関して全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
日間正確性％および精度％
平均 各ＱＣ濃度に関して３日間のバリデーション日の全スポット（ｎ＝３６）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各ＱＣ濃度に関して３日間のバリデーション日の全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
【０１１１】
安定性試料調製
ヒト血清プールを各被分析物に関してＱＣ３およびＱＣ４に相当する濃度の組換えタンパク質でスパイクした。別個に調製した２セットに関して３検体ずつで試料を分析した。各バリデーション日に室温で８時間保存した後にスパイクしたヒト血清の安定性を測定した。毎日新たな試料を調製し、そして室温で８時間保存した。−８０℃で１週間および１か月保存の場合、最初のバリデーション日に試料を調製した。特定の保存時間の後、１回の実験で安定性を調べ、新たに調製した標準曲線で保存した試料のデータを計算した。
【０１１２】
アッセイ手順
さらに前記で記載したプロトコールに従って各バリデーション日に実験を行った。
【０１１３】
較正曲線
バリデーションプロトコールに記載したようにキャリブラントの濃度を用いて各バリデーション日にヒト血清プールで標準／較正曲線を調製した。シグナル密度を統合データ値（ＩＤＶ）として定義する。ロジスティックＥＬＩＳＡフィットを用いてシグナルを被分析物濃度に対してプロットした。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαに関して、全キャリブラントに関する精度および正確性は許容基準内であった。ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１標準に関しては、最も低い較正試料を除いて全試料に関する正確性および精度は許容基準を満たした。ＩＬ−１ｒａの最も低い較正試料、０.０９０ｎｇ／ｍｌにより４０.２％の精度が得られたが、正確性は許容基準を満たした。ＭＣＰ−１の最も低い較正試料、０.１１７ｎｇ／ｍｌにより各々１９８.３％および３８.５％の正確性および精度が得られた（表９および１０）。
【０１１４】
【表１２】
各標準曲線濃度に関する逆算値をSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアで評価した。各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％（ｎ＝６）で平均正確性を計算した。
【０１１５】
【表１３】
各標準曲線濃度に関する逆算値をSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアで評価した。各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％（ｎ＝６）で平均精度を計算した。
【０１１６】
品質管理試料
日内正確性および精度、ならびに日間正確さおよび精度に関する結果を各々表１１および１２に示す。全ＱＣ試料は日内および日間アッセイ正確性および精度に関する許容基準を満たした。
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
【表１６】
【０１２０】
アッセイ作動範囲
ＬＬＯＱとＵＬＯＱの間でアッセイ作動範囲を決定した。アッセイ作動範囲は測定した被分析物に関する疾患濃度を満たしていた。
【０１２１】
【表１７】
【０１２２】
安定性
ＭＣＰ−１を除く全ての被分析物は室温で８時間後、および−８０℃保存で１週間後に安定であった。−８０℃で１か月保存の後、スパイクされた試料の濃度はスパイクされた名目値と比較した場合に３倍少なかった。これらの結果を室温保存測定に関しては表１５、ならびに−８０℃で１週間および１か月保存に関しては表１６に示す。
【０１２３】
【表１８】
【０１２４】
【表１９】
バイオマーカー定量に用いるテクノロジーとしてのイムノアッセイは正確性、精度およびに室間再現精度に関してバリデートする必要がある。９６ウェル形式の抗体マイクロアレイを薬物動態アッセイに関する食品医薬品規制ガイドラインに基づいてバリデートした。バリデーション過程で以下のパラメーターを調べた：逆算値に基づくキャリブラント正確性および精度；品質管理試料に基づく日内および日間正確性および精度；室温で８時間後、ならびに−８０℃で１週間および１か月保存の後の抗原スパイクされたヒト血清試料の安定性；ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱに基づくアッセイＷＲ。
【０１２５】
得られたデータにより、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα被分析物に関する全較正試料に関する正確さおよび精度が許容基準に合致したことが示される。ＭＣＰ−１の場合正確さおよび精度が、ならびにＩＬ−１ｒａに関しては標準曲線の最低濃度の精度のみが許容基準を網羅しなかった。しかしながらこれらの試料はアッセイ作動範囲決定の間に排除される。アッセイ作動範囲はＲＡ血清中の試験される被分析物を網羅するので、結果は全体にわたって満足できるものである。
バリデーション結果により、９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイが決定されたアッセイ作動範囲内で正確であり、精密であり、そして再現性があることが実証される。
【０１２６】
実施例４
抗体マイクロアレイおよびＥＬＩＳＡテクノロジーの比較
ＥＬＩＳＡは血清試料中のタンパク質を分析するための標準的な方法である。実施するのが容易であり、そして特異的な方法であるので、ＥＬＩＳＡは過去１０年間にわたり臨床および微生物学研究における血清サイトカインの検出のために広く用いられている（Klimiuk et al. （２００２）；Lloyd et al., Ann.Rheum.Dis. ６１（９）：８０４−８０９（１９９１）； Mangge et al., Arthritis Rheum. ３８（２）：２１１−２２０（１９９５））。このセクションでは、前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイをＥＬＩＳＡテクノロジーと比較する。双方のテクノロジーを用いて３５個のＲＡ試料、１４個のリウマチ性疾患試料および２６個の対照ヒト血清でＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαレベルを測定した。続いて双方の方法で得られた結果を線形回帰分析を用いて比較した。
【０１２７】
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関する多重アッセイ
前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイでＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度を測定した。
【０１２８】
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関するＥＬＩＳＡアッセイ
マイクロアレイ製造ならびに抗体適合対および組換えタンパク質の各々で用いた同一の試薬でサンドウィッチＥＬＩＳＡを調製した。血清プールを用いて標準曲線および抗体マイクロアレイを生成するために用いたのと同一の濃度点を有するＱＣ試料を調製した（表７および表８）。製造者の指示書に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【０１２９】
スパイクされた試料の調製
組換えＩｌ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαを３、１.５００、０.７５０、０.３７５、０.１８８、０.０９４、０.０４７、０.０２３、０.０１２および０.００６ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト血清プールをスパイクした。サイトカインレベル決定に用いたマイクロアレイおよびＥＬＩＳＡの標準曲線範囲を網羅する様式で濃度を選択した。試料を−８０℃で凍結させた。
【０１３０】
多重アッセイ動作をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイと比較した。５２個のリウマチ患者血清試料および２６個の無作為ヒト血清を多重アッセイおよびサンドイッチＥＬＩＳＡの双方で検定した。２つの分析群の結果を一緒にプールして７８個の血清の群を作った。ＩＬ−１βアッセイの場合、双方のテクノロジーにより検出できる値の数が小さすぎて回帰分析を実施できなかった。相関性分析を実施するために、ヒト血清プールを１０の異なる濃度の目的の被分析物でスパイクした。スパイクされた試料中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαのレベルをもまた測定した。スパイクされた試料の結果を以前に分析した７８個の血清の結果と共にプールした。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαに関する７８個の全被分析物および１０個のスパイクされた試料の被分析物濃度を線形回帰分析に供した。結果を図６に示す。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦαに関する相関係数（Ｒ２）は各々０.９０、０.６０、０.９３、０.９６、０.９４および０.９５であった。
【０１３１】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関する多重アッセイにより、同一の被分析物に関する個々のＥＬＩＳＡとの非常に良好な相関性が示された。相関係数は各々０.９０、０.９３、０.９６、０.９４および０.９５であった。ＩＬ−１ｒａアッセイに関しては、ＥＬＩＳＡとの相関性は低かった（０.６０）。これはサンドイッチイムノアッセイでしばしば直面する問題により説明でき、そして恐らくアッセイ多重化により増幅され得る。例えばリウマトイド因子または天然発生ヒト異好抗体はしばしば自己免疫性および炎症性疾患に関連し、動物およびヒト免疫グロブリンを認識できる。結果的に偽陽性または陰性結果を生じる（Hennig, Rink, Fagin, Jabs, & Kirchner, J.Immunol.Methods ２３５（１−２）：７１−８０（２０００））。別の理由は可溶性受容体ＩＬ−１ Ｉ型の存在であろう（Arend，Cytokine Growth Factor Rev. １３（４−５）：３２３−３４０（２００２））。多分ＩＬ−１ｒａのその可溶性受容体への結合親和性が多重形式により偏る。それは多重および単一ＥＬＩＳＡで異なる偽の高または低サイトカインレベルを引き起こし得る。
タンパク質マイクロアレイおよびＥＬＩＳＡ間の良好な相関性は、試料あたりいくつかの被分析物をモニタリングするタンパク質マイクロアレイの適用性および高速大量処理スクリーニングツールとしてのその可能性を示している。
【０１３２】
実施例５
リウマチ試料中の参考になる被分析物を評価するための抗体マイクロアレイの適用
多重アッセイを用いてリウマチ様関節炎（ＲＡ）およびその他のリウマチ性疾患と診断された患者からの試料中のＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα血清濃度を測定した。
【０１３３】
対象および試料
研究した試料はＲＡと診断された患者からの３５個の試料ならびに、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、若年性リウマチ様関節炎（ＪＲＡ）、結合組織病（ＣＴＤ）および巨細胞性動脈炎のようなリウマチ性疾患と診断された患者からの１３個の試料からなった。患者の集団の特徴を表１７に示す。
【０１３４】
【表２０】
ＳＤ−標準偏差
ＲＦ−リウマトイド因子
ＤＭＡＲＤ−疾患修飾性抗リウマチ薬
ＮＡ−評価不能
【０１３５】
患者の関節外徴候（骨浸食、皮膚変化、胸膜肺徴候、心臓疾患、レイノー現象、シェーグレン症候群、リウマトイド血管炎、骨粗鬆症および主要関節置換）についての情報もまた収集した。
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度をさらに前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイで測定した。
【０１３６】
一方向分散分析を用いてデータの分析を行った（Kempthorne O １９８３）。ｐ値が５％未満である場合（ｐ＜０.０５）、結果は有意であると考えられた。
測定したＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清レベルを２工程で分析した。最初に６つの被分析物の各々に関する平均値をＲＡおよび非ＲＡ試料に関して計算した。これらのデータにより、２群間の５つの被分析物レベル（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα）に関する差異が示された（表１８）。
【０１３７】
【表２１】
ＳＤ−標準偏差
【０１３８】
分析は３つの患者群の比較を含む：ＲＡ対非ＲＡ、リウマトイド因子（ＲＦ）陽性対陰性、骨浸食陽性対陰性。目的の６つの被分析物の血清レベル、患者の年齢、罹病期間および現在投与されているＤＭＡＲＤの数に関して分析を行った。罹病期間は診断の日付から試料収集の日付までと定義する。
【０１３９】
ＲＡおよび非ＲＡリウマチ患者の比較の結果を表１９に示す。血清中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの濃度はＲＡ患者で有意に高かった（各々ｐ＜０.００２２、ｐ＜０.０１０７、ｐ＜０.００２４およびｐ＜０.００５７）。加えて、ＤＭＡＲＤの数もまた調べた患者集団間で有意に異なった（ｐ＜０.００６０）。
【０１４０】
【表２２】
ＲＦ陽性対ＲＦ陰性患者の比較からの結果を表２０に示す。Ｌ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＴＮＦαに関してこの患者の２群間で有意差があった（各々ｐ＜０.０２１０、ｐ＜０.０３２５、ｐ＜０.０１０９）。
【０１４１】
【表２３】
【０１４２】
表２１は浸食を有する患者と浸食を有さない患者間の比較の結果を示す。ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に関してこの２群間で有意差があった（ｐ＜０.０１０５およびｐ＜０.０２２０）。罹病期間（ｐ＜０.０００２）およびＤＭＡＲＤの数（ｐ＜０.００５８）に関して分析した集団間でも差が観察された。
【０１４３】
【表２４】
結果によりＲＡとその他の関節炎患者との間でＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度で有意差が示された。ＤＭＡＲＤの数もまたこれらの２集団間で異なった。
ＲＦ陽性およびＲＦ陰性患者集団を研究すると、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルで差が観察された。
最後に骨浸食を有するおよび有さない患者においてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の測定レベルにおいても差があった。加えて、罹病期間およびＤＭＡＲＤパラメーターの数もまた浸食を有するおよび有さない患者間で区別され得る。浸食は疾患の後期の、さらに進行した段階で、および関節炎のより侵攻性の形態で発現する。
【０１４４】
各々の集団間で測定したレベルで差が観察された被分析物（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα）を、ＲＡに関連すると同定した（Arend, Arthritis Rheum. ４５（１）：１０１−１０６（２００１）； Arend & Gabay, Rheum.Dis.Clin.North Am. ３０（１）：４１−vi （２００４）； Choy & Panayi, N.Engl.J.Med. ３４４（１２）：９０７−９１６（２００１））。さらに、ＩＬ−１ｒａ（Anakira）（Fleischmann et al., Arthritis Rheum. ４８（４）：９２７−９３４（２００３）； Smolen & Steiner, Nat.Rev.Drug Discov. ２（６）：４７３−４８８）およびＴＮＦα阻害剤（エントラセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブ）（Breedveld et al., Ann.Rheum.Dis. ６３（２）：１４９−１５５（２００４）； Lipsky et al., N.Engl.J.Med. ３４３（２２）：１５９４−１６０２（２０００））は生物学的ＤＭＡＲＤ治療に属する。加えて、抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲＡ）を伴う予備研究により、それはＴＮＦαに向けた方法とほぼ同様に有効であることが示唆される（Wendling, Racadot, & Wijdenes, J.Rheumatol. ２０（２）：２５９−２６２（１９９３））。またＭＣＰ−１に対するモノクローナル抗体を用いる可能性のある抗ＭＣＰ−１処置を関節炎モデルで試験した（ラットコラーゲン誘起関節炎（ＣＩＡ））（Ogata et al. , J.Pathol. １８２（１）：１０６−１１４（１９９７））。
【０１４５】
実施例６
統計分析
臨床データおよび多重アッセイのバイオマーカーの濃度（実施例５）を含む生データをさらに統計分析した。リウマトイド対非リウマトイド患者の臨床データの一変量統計比較（バイナリデータに関するカイ二乗検定および連続データに関するスチューデントｔ検定）の結果以下のｐ値が得られた：センター（ｐ＝０.００６）、性別（ｐ＝０.２３）、ＲＦ（ｐ＝０.００２）、ＭＴＸ前処置（ｐ＝０.００６）、ＮＳＡＩＤ（ｐ＝０.３８）、浸食（ｐ＝０.０００６）、関節外（ｐ＝０.５４）、抗ＴＮＦ−アルファ処置（ｐ＝０.６２）、ＤＭＡＲＤ（ｐ＝０.０００１）、年齢（ｐ＝０.５７）、および診断からの期間（ｐ＝０.９３）。
【０１４６】
リウマトイド対非リウマトイド患者の被分析物濃度に適用したスチューデントｔ検定により以下のｐ値が作成された：ＩＬ−１ベータ（ｐ値＝０.４７）；ＩＬ−１ｒａ（ｐ値＝０.０２）；ＩＬ−６（ｐ値＝０.００７）；ＩＬ−８（ｐ値＝０.２３）；ＭＣＰ−１（ｐ値＝０.００５）；およびＴＮＦ−アルファ（ｐ値＝０.０２）。
【０１４７】
クロスバリデーションおよび応答順列のバリデーションを含む部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋Ｖｅｒｓ １０.５）による多変量統計分析を実施した。別個の予測モデルを臨床データのみ（施設、性別、年齢および診断からの期間を含まない）、被分析物データのみ、および双方のパラメーターのセットのいくつかの組み合わせに適用した。異なるモデルの予測力をインプット変数（Ｒ２Ｘ）および応答変数（Ｒ２Ｙ）の被説明分散、ならびにクロスバリデーションによりモデルにより予測され得る応答の全変動の分画（Ｑ２）に対して測定した。加えて、モデルの予測スコアにスチューデントｔ検定を適用した。異なるモデルのランキングはＱ２に基づいた。分析の結果を表２２に表す。
【０１４８】
【表２５】
Ｒ２Ｘ：モデルにより説明される予測パラメーターの分散の比率
Ｒ２Ｙ：モデルにより説明される応答変数の分散の比率
Ｑ２：クロスバリデーションに基づくモデルの予測力
スコアｔ検定：双方の群の予測スコアの統計比較（スチューデントｔ検定、両側、不等分散）
【０１４９】
略語一覧
Ａｂ 抗体
ＢＣＡ バイオチップアレイヤー
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｂ インターロイキン−１ベータ
ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−１ｒａ ＩＬ−１受容体アンタゴニスト
ＩＬ−６ インターロイキン−６
ＩＬ−８ インターロイキン−８
ＭＣＰ−１ マクロファージ走化性タンパク質−１
ＯＤＰ オクタデシルリン酸エステル
ＲＡ リウマチ様関節炎
ＲＦ リウマトイド因子
ＳＡＭ 自己組織化単分子膜
ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦα、ＴＮＦ−ａ 腫瘍壊死因子−アルファ
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】コーティング溶液へのグリセロールの添加の結果を示す。
【図２】コーティング抗体力価。種々の濃度のコーティングＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８抗体をプリントした（左から右にバックグラウンド、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）。最良のシグナル対ノイズ比は全被分析物に関してコーティング抗体２００μｇ／ｍｌで測定した。
【図３】種々の濃度のビオチン化抗体を用いてアッセイを実施した（抗体；左から右に：６２.５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体）。最良のシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してビオチン化抗体５００ｎｇ／ｍｌの濃度で作成された。示したシグナル対ノイズ比はＩＬ−８アッセイに関して作成された。
【図４】２工程および同時インキュベーションプロトコールで実施したアッセイに関する代表的なＩＬ−６標準曲線。丸はＩＬ−６ １工程プロトコールを表し、四角はＩＬ−６ ２工程プロトコールを表す。得られた結果により、１工程プロトコールがアッセイ感度を改善できることが示される。
【図５】ノンパララックストレイ装置で作成された画像。３つの異なる画像様式を比較する：高（左）、標準（中）および高分解能様式（右）。
【図６】抗体アレイおよびＥＬＩＳＡ手順の相関性。７８個の血清および１０個のスパイクされた試料中のサイトカインを抗体マイクロアレイまたはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて並行して定量した。これらの２つの分析からのデータを互いに対してプロットし、そして線形回帰分析により相関係数を決定した。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は未知の病因の炎症性、自己免疫性、全身性疾患である。白人集団の約１％が女性の男性に対する比率２.５／１でリウマチ様関節炎に罹患する（Lee & Weinblatt； Lancet ３５８（９２８５）： ９０３−９１１（２００１））。疾患はいずれの年齢でも生じ得るが、最も一般的であるのは３０から５５歳の間の年齢の人々であり（Kodadek ； Chem.Biol. ８,（２）：１０５−１１５（２００１）； Stoll, Templin, Schrenk, Traub, Vohringer, & Joos； Front Biosci. ７：c１３−c３２（２００２）； Templin et al. ； Proteomics. ３（１１）：２１５５−２１６６（２００３））、その罹患率は年齢と共に上昇する。
【０００２】
ＲＡの顕著な症状は痛み、こわばり、および末梢関節の腫脹である。障害の臨床症状は非常に多様であり、穏やかな自己限定性関節炎から著しい罹患率および死亡率を伴う急速に進行する多臓器炎症にわたる（Lee & Weinblatt （２００１）； ibid； Sweeney & Firestein（２００４）； ibid）。関節損傷はリウマチ様関節炎の経過中の初期に生じ；患者の３０％は診断時に骨浸食の証拠となるＸ線像を有し、そしてこの比率は２年までに６０％まで上昇する（van der Heijde； Br.J.Rheumatol.３４（Suppl ２）：７４−７８（１９９５））。
【０００３】
ＲＡは多くの関節（６またはそれより多い）に関与し得る多関節炎であるが、疾患の初期の段階では１つまたは少しの関節しか冒されないこともある。実際に全末梢関節が疾患に冒され得る；しかしながら最も一般的には関与する関節は手、足および膝の関節である（Smolen et al.； Arthritis Rheum., ３８（１）：３８−４３（１９９５））。加えてＲＡは脊椎に影響を及ぼし得て、そして長期にわたる疾患では環軸関節の関与が一般的であり、そして致死の直接的な関節関連の原因となる。関節外関与はＲＡのもう一つの特徴であり、そしてこれはリウマトイド結節から生命を脅かす脈管炎にわたり得る（Smolen & Steiner； Nat.Rev.Drug Discov. ２（６）：４７３−４８８（２００３））。
【０００４】
ＲＡは免疫および炎症系が軟骨および骨の破壊に密接に関連する疾患である。２つの系の関連は明らかではなく、そしてＲＡの原因は未知のままであるが、疾患の発生に関与する多くの経路が認識されている。ここ数年にわたる研究により、遺伝性および感染性因子が複雑に相互に関係する方式でＲＡ病因に関与していることが同定された（Smith & Haynes； Ann.Intern.Med. １３６（１２）：９０８−９２２（２００２））。ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−１ｒａ（Gabay et al.； J.Rheumatol. ２４（２）：３０３−３０８（１９９７））、ＩＬ−６（Arvidson et al. ； Ann.Rheum.Dis. ５３（８）：５２１−５２４（１９９４））、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１（De Benedetti et al.； J.Rheumatol. ２６（２）：４２５−４３１（１９９９））、ならびに炎症過程に関係する血清アミロイド（ＳＡＡ）のような、可溶性サイトカインおよびケモカインがリウマチ様関節炎に関連することが示されている（Szekanecz & Koch ； Curr.Rheumatol.Rep. ３（１）：５３−６３（２００１））。
【０００５】
薬物がＲＡの処置の主要な形態を構成する。現在用いられる薬物は４つの主要なカテゴリーに分けられる：ａ）非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ｂ）疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、ｃ）ステロイドおよびｄ）鎮痛薬。
【０００６】
歴史的に、ＲＡの処置は疾患に関連する腫脹および痛みを軽減するためのＮＳＡＩＤ薬（イブプロフェンおよびアスピリンのような）の使用に基づいている。しかしながらこの方法は疾患に関連する痛みの根本的な（複数の）原因に取り組んではいない。この方法はスルファサラジンおよびメトトレキサートのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の開発に取って代わられている。別の型のＤＭＡＲＤには生物剤が含まれる。承認された生物学的ＤＭＡＲＤには例えばインフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブまたはアナキンラが含まれる。
【０００７】
ＲＡの診断はアメリカリウマチ協会（ＡＲＡ）により認識されている７つの診断基準の使用に基づく（Arnett et al.； Arthritis Rheum. ３１（３）：３１５−３２４（１９８８））。診断には臨床因子が必要とされるため、臨床医が尋ねる鋭い質問および、微妙になりがちな初期の身体的所見の認識に依存する。ＡＲＡの基準：
１）最大改善の前に少なくとも１時間持続する関節および関節周囲の朝のこわばり；
２）医師により観察される３つまたはそれより多い関節部分の軟組織腫脹（関節炎）；
３）手の関節の腫脹（関節炎）；
４）対称性腫脹（関節炎）；
５）リウマトイド結節；
６）血清リウマトイド因子（ＲＦ）のレベル上昇；
７）手および／または手首関節のＸ線像変化；
が含まれる。
【０００８】
最初の４つの基準はリウマチ様関節炎の診断がなされ得る前、最低６週間存在しなければならない。ＲＡ試験はリウマトイド因子：ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープと反応するＩｇＭ自己抗体を測定する（Corper et al., Nat.Struct.Biol. ４（５）：３７４−３８１（１９９７））。ＲＦは一次的にＲＡに関連するが、これらの抗体は疾患特異性が低く、正常な高齢者、健常な個体、およびその他の自己免疫障害または慢性感染を伴う患者の血清でも検出され得る。（Williams DG （１９９８））。
したがって、ＲＡを診断する代替の方法、およびＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法に関する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００９】
（発明の要旨）
１つの態様では、本発明は対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有しているか、または発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中の腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦα、ＴＮＦ−ａ）；マクロファージ走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｂ）からなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、対象におけるＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質を同定するための方法に関し、該方法はａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；およびｃ）工程ｂの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；の工程を含み、ここで工程ａ）の少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較した場合の工程ｂ）の生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量における変化により、ＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質が同定される。
【００１１】
本発明の別の態様はＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法を提供し、該方法は該処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで双方の生物学的試料中の量の類似は処置が有効でないことを示し、そして該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量における変化は処置が有効であることを示している。
【００１２】
なおさらなる本発明の態様は、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含むリウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物に関する。
本発明はまた本発明による組成物および使用のための指示書を含む診断または薬物発見キットをも提供する。そして本発明の別の態様は本発明の方法の１つにおけるかかる診断または薬物発見キットの使用に関する。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
図１：コーティング溶液へのグリセロールの添加の結果を示す。
図２：コーティング抗体力価。種々の濃度のコーティングＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８抗体をプリントした（左から右にバックグラウンド、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）。最良のシグナル対ノイズ比は全被分析物に関してコーティング抗体２００μｇ／ｍｌで測定した。
図３：種々の濃度のビオチン化抗体を用いてアッセイを実施した（抗体；左から右に：６２.５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体）。最良のシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してビオチン化抗体５００ｎｇ／ｍｌの濃度で作成された。示したシグナル対ノイズ比はＩＬ−８アッセイに関して作成された。
図４：２工程および同時インキュベーションプロトコールで実施したアッセイに関する代表的なＩＬ−６標準曲線。丸はＩＬ−６ １工程プロトコールを表し、四角はＩＬ−６ ２工程プロトコールを表す。得られた結果により、１工程プロトコールがアッセイ感度を改善できることが示される。
図５：ノンパララックストレイ装置で作成された画像。３つの異なる画像様式を比較する：高（左）、標準（中）および高分解能様式（右）。
図６：抗体アレイおよびＥＬＩＳＡ手順の相関性。７８個の血清および１０個のスパイクされた試料中のサイトカインを抗体マイクロアレイまたはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて並行して定量した。これらの２つの分析からのデータを互いに対してプロットし、そして線形回帰分析により相関係数を決定した。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用した全ての特許出願、特許および参照文献はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
本発明の実施に際して、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術を用いる。これらの技術は周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, １９９７（F. M. Ausubel ed.）； Sambrook et al., １９８９, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.； DNA Cloning： A Practical Approach, Volumes I and II, １９８５（D. N. Glover ed.）； Oligonucleotide Synthesis, １９８４（M. L. Gait ed.）； Nucleic Acid Hybridization, １９８５,（Hames and Higgins）； Transcription and Translation, １９８４（Hames and Higgins eds.）； Animal Cell Culture, １９８６（R. I. Freshney ed.）； Immobilized Cells and Enzymes, １９８６（IRL Press）； Perbal, １９８４, A Practical Guide to Molecular Cloning； the series, Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, １９８７（J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory）；および Methods in Enzymology Vol. １５４およびVol. １５５（各々Wu and Grossman, and Wu, eds.）にて説明されている。
【００１５】
本発明はＲＡを有する対象のバイオマーカープロファイルの発見に少なくとも一部基づいている。好ましくは、本発明は生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータおよびＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することによる、最も好ましくは本発明によるタンパク質マイクロアレイのような組成物に使用によるＲＡバイオマーカープロファイルの決定に関する。
【００１６】
生物学的試料は血液試料または組織試料でよい。適当な試料には全血、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側塗抹標本、皮膚、および筋肉または神経組織のような特定の器官組織の生検、ならびに毛髪が含まれる。最も好ましくは生物学的試料は血清である。
生物学的試料を採取する対象をスルファサラジン、メトトレキサート、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブもしくはアナキンラ、またはシクロスポリンのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）で処置することができる。
【００１７】
本発明の方法によるバイオマーカープロファイルの決定は、対象中または該対象から単離された生物学的試料中の核酸またはタンパク質の測定を含み得る。本発明の１つの好ましい実施態様では、バイオマーカーの決定はバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量の決定を含む。例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. １, pp.４.１.１-４.２.９ and ４.５.１-４.５.３, John Wiley & Sons, Inc.（１９９６）に記載されるような当業者に周知の方法により試料からｍＲＮＡをも含むＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの量を検出するための方法は当分野で周知であり、そして限定するものではないがノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲおよびその他のハイブリダイゼーション方法を含む。好ましくはｍＲＮＡを少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドと接触させることによりｍＲＮＡの量を決定する。好ましい実施態様では、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドで該ｍＲＮＡを決定する。配列特異的オリゴヌクレオチドはバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたは該ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡにのみに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであるのが好ましい。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は一本鎖核酸を意味する。一般に配列特異的オリゴヌクレオチドは少なくとも１５から２０ヌクレオチド長であるが、少なくとも２０から２５ヌクレオチド長のより長いプローブが望ましい場合もある。配列特異的オリゴヌクレオチドを１つまたはそれより多い標識部分で標識して、ハイブリダイズされたプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出を可能にすることができる。標識部分は分光学的、生化学的、光化学的、生体電子工学的、免疫化学的、および電気光学的または化学的な手段により検出することができる組成物を含み得る。標識部分の実例には、限定するものではないが放射性同位元素、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素のような分光学的マーカー、結合酵素、質量分析タグ、および磁気標識が含まれる。ｍＲＮＡまたは発現モニタリングのためのオリゴヌクレオチドアレイを調製し、そして例えばLockhart et al., Nature Biotechnology, １４：１６７５−１６８０（１９９６）； McGall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９３：１３５５５−１３４６０（１９９６）；および米国特許第６０４０１３８号に記載されるような当業者に周知である技術に従って用いることができる。
【００１８】
本発明の少なくとも２つのバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を決定するための特に有用な方法は、配列特異的オリゴヌクレオチドの規則的なアレイへの標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを伴う。かかる方法によりＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つもしくは４つ、または少なくとも５つもしくは６つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を同時に決定することが可能になる。このハイブリダイゼーション方法に利用される配列特異的オリゴヌクレオチドは典型的には固体支持体に結合されている。固体支持体の実例には、限定するものではないが膜、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウェファー、繊維、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、管類、ポリマー、塩化ポリビニル皿等が含まれる。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施態様によると、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量の決定をタンパク質の量、すなわちＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１ベータタンパク質の量を測定することにより実施する。本発明の別の好ましい実施態様では、該少なくとも２つのバイオマーカーの量に加えて、ＲＦの量を決定する。
【００２０】
本明細書で用いる「タンパク質」なる用語を「ポリペプチド」なる用語と同義的に用いることができるか、またはそれに加えて、ペプチド結合以外の結合により連結できる２つまたはそれより多いポリペプチドの複合体、例えばジスルフィド結合により連結され得るタンパク質を作るかかるポリペプチドを意味し得る。最も好ましくは本発明による該バイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／もしくはＩＬ−１ベータタンパク質、ならびに／またはＲＦを含む。「タンパク質」なる用語はまた同一のアミノ酸配列を有するが、とりわけかかるタンパク質が真核細胞宿主において発現される場合に加えられ得るような、翻訳後修飾が異なるポリペプチドのファミリーをも含み得る。これらのタンパク質はその元来の形態でよいか、または例えばタンパク質分解から得られたタンパク質の免疫学的に検出可能なフラグメントでよいかのいずれかである。「免疫学的に検出可能」とはタンパク質フラグメントが例えば質量分析または以下で記載するような抗体試薬により特異的に認識されるエピトープを含有することを意味する。
【００２１】
好ましい実施態様では、該少なくとも２つのバイオマーカーまたはバイオマーカータンパク質の量を質量分析を用いて決定する。さらに好ましい本発明の実施態様によれば、少なくとも２つのバイオマーカーの量を少なくとも２つのバイオマーカータンパク質に特異的に結合する試薬により決定し、ここでタンパク質はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される。本発明の実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する試薬は、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）と称されるインビトロ選択法から作成され、そしてタンパク質を含む特異的リガンドに対して高親和性を有するアプタマー、短いＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む（Brody et al., Mol.Diagn. ４（４）：３８１−３８８（１９９９））。さらに好ましくは、バイオマーカーに特異的に結合する試薬は抗体（Ａｂ）、抗体誘導体および抗体フラグメントを含む。最も好ましくは試薬はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。最も好ましくは該抗体はさらに以下の実施例において記載するものである。
【００２２】
本明細書で用いる「抗体」なる用語には、限定するものではないがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体および生物学的に機能的な抗体フラグメントが含まれ、それらは抗体フラグメントがタンパク質またはタンパク質のフラグメントに結合するのに十分なこれらのフラグメントである。かかる抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンのクラスのものでよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することができる。キメラ抗体はマウスｍＡｂ由来の可変または超可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種から誘導された分子である。これに代えて、抗体は一本鎖抗体を含み得る。一本鎖抗体の生成に関して記載された技術（米国特許第４９４６７７８号； Bird, Science, ２４２：４２３−４２６（１９８８）； Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；および Ward et al., Nature ３３４：５４４−５４６（１９８９））を差次的に発現される遺伝子一本鎖抗体を生成するために適合させることができる。最も好ましくは。「ヒト化抗体」を生成するのに有用な技術をタンパク質、そのフラグメントまたは誘導体に対する抗体を生成するために適合させることができる。かかる技術は米国特許第５９３２４４８号；第５６９３７６２号；第５６９３７６１号；第５５８５０８９号；第５５３０１０１号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５７８９６５０号；第５６６１０１６号；および第５７７０４２９号に開示されている。本発明のバイオマーカーの特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを公知の技術により作成することができる。例えばかかるフラグメントには、限定するものではないがＦ（ａｂ’）２フラグメント（これは抗体分子のペプシン消化により生成することができる）およびＦａｂフラグメント（これはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作成することができる）が含まれる。これに代えて、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huse et al., Science, Vol. ２４６, pp. １２７５-１２８１（１９８９））望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、そして容易に同定することを可能にすることができる。本発明のバイオマーカー／バイオマーカータンパク質の量を、前記した抗体を利用するイムノアッセイ法により決定することができる。かかるイムノアッセイ法には、限定するものではないが例えば競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、ドットブロッティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のような蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノＰＣＲイムノアッセイ、プロテインＡまたはプロテインＧイムノアッセイ、およびウェスタンブロッティングのような免疫電気泳動アッセイ、ならびに一般的に用いられ、科学および特許文献に広く記載されるその他のもの、ならびに商業的に用いられる多くのものが含まれる。
【００２３】
酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩を用いて二次抗体に酵素を結合させる。しかしながら容易に認識されるように、当業者に周知である非常に多様なライゲーション技術が存在する。一般に用いられる酵素にはとりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれる。特異的酵素と共に用いられる基質は、一般的に対応する酵素による加水分解時に検出可能な色の変化を生成することで選択される。例えばｐ−ニトロフェニルリン酸がアルカリホスファターゼ共役体と共に使用するのに適当であり；ペルオキシダーゼ共役体には１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に用いられる。前記で記した発色性基質よりもむしろ、蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を用いることも可能である。次いで適切な基質を含有する溶液を第３の複合体に加える。基質は二次抗体に連結させた酵素と反応して定性的な可視シグナルを生じ、これをさらに通常分光光度法により定量して分泌されたタンパク質またはそのフラグメントの量を評価することができる。これに代えて、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光化合物をその結合能力を変化させずに化学的に抗体に結合させることができる。特定の波長の光を有する照明により活性化する場合、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収して、分子の励起状態を誘導し、続いて特徴的なより長い波長で光を放出させる。放出は光学顕微鏡により視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は双方共に当分野において非常によく確立されており、そして本方法にとりわけ好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子のようなその他のレポーター分子を用いることもできる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカータンパク質と特異的に結合する該試薬を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。本発明の好ましい実施態様は、本発明による少なくとも２つのバイオマーカータンパク質の同時結合および定量のためのタンパク質マイクロアレイ（Templin et al., Comb.Chem.High Throughput.Screen. ７（３）：２２３−２２９（２００４））を提供する。タンパク質マイクロアレイは支持材料上の規定のスポット位置に結合した分子（捕捉剤）からなる。次いでアレイを複合体タンパク質試料に暴露する。抗体のような捕捉剤は生物学的試料の目的のタンパク質に結合することができる。次いで特異的被分析物の個々のスポットへの結合を、各スポットにより生じたシグナルを定量することによりモニタリングすることができる（MacBeath, Nat.Genet. ３２（Suppl）：５２６−５３２（２００２）； Zhu & Snyder, Curr.Opin.Chem.Biol. ７（１）：５５−６３（２００３））。タンパク質マイクロアレイをその適用によって２つの主要なカテゴリーに分類することができる。これらをタンパク質発現マイクロアレイおよびタンパク質機能マイクロアレイと定義する（Kodadek, Chem.Biol. ８（２）：１０５−１１５（２００１））。タンパク質発現マイクロアレイは主に分析ツールとして提供され、そして生物学的液体または試料中のタンパク質、抗原または抗体を検出および定量するために使用され得る。一方タンパク質機能マイクロアレイはタンパク質−タンパク質、酵素−基質および小型分子−タンパク質相互作用を研究するために使用され得る（Huang, Front Biosci. ８：d５５９−d５７６（２００３））。タンパク質マイクロアレイにはまた多くの構造形態がある。これには平板な表面上に構築された二次元マイクロアレイ、および「フロースルー」支持体を用いる三次元マイクロアレイが含まれる。
【００２５】
タンパク質マイクロアレイ構成の型：逆相アレイ（ＲＰＡ）および順相アレイ（ＦＰＡ）（Liotta et al. ２００３； Cancer Cell, vol. ３, no. ４, pp. ３１７-３２５）。ＲＰＡでは少量の組織または細胞試料を各アレイスポットに固定して、アレイが異なる患者の試料または細胞ライセートからなるようにする。ＲＰＡ形式では各アレイを１つの検出タンパク質（例えば抗体）と共にインキュベートし、そして単一の被分析物の評価項目を測定し、そして複数の試料にわたって直接比較する。ＦＰＡでは捕捉剤、通常抗体または抗原は表面に固定され、そして捕捉分子として作用する。各スポットは１つの型の固定抗体または捕捉タンパク質を含有する。各アレイを１つの被験試料と共にインキュベートし、そして複数の被分析物を直ぐに測定する。
【００２６】
ＦＰＡの最も一般的な形態の１つは抗体マイクロアレイである。サンドイッチアッセイによるか、または直接標識法によるかのいずれかで、抗体マイクロアレイを２つの形態で生成することができる。サンドイッチアッセイ法は標的タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つの異なる抗体を利用する。１つの抗体が固体支持体に固定され、そして生物学的試料からその標的分子を捕捉する。適切な検出系を用いて標識二次抗体が結合標的を検出する。サンドイッチアッセイの主な利点はその高い特異性および感度である（Templin, Stoll, Bachmann, & Joos, Comb.Chem.High Throughput.Screen. ７（３）：２２３−２２９（２００４））。高いシグナル対ノイズ比を生じるバックグラウンドの劇的な低下により高い感度が達成される。加えて、大量の標識タンパク質が試料中に存在する直接標識法とは対照的に、少量の標識された検出抗体のみが適用される。またサンドイッチイムノアッセイ形式はマイクロアレイテクノロジーの分野で容易に扱いやすく、そしてかかるイムノアッセイをタンパク質マイクロアレイ形式に適合させて、条件培地および／または患者血清中のタンパク質を定量することができる（Huang et al., Clin.Chem.Lab Med. ３９（３）：２０９−２１４（２００１）； Schweitzer et al., Nat.Biotechnol. ２０（４）：３５９−３６５（２００２））。
【００２７】
直接標識法では、試料中の全タンパク質をフルオロフォアで標識する。次いで抗体マイクロアレイのようなタンパク質マイクロアレイに結合する標識タンパク質を蛍光により直接検出する。直接標識法の適応はHaabおよび共同研究者（Haab, Dunham, & Brown, Genome Biol.２（２）： p（２００１））により記載されている。この方法では、２つの異なる生物学的試料をＣｙ３またはＣｙ５のいずれかのフルオロフォアで標識する。次いでこれらの２つの標識試料を一緒に同等に混合し、そして抗体マイクロアレイに適用する。この方法により、例えば罹患および健常、または処置および未処置試料の間で比較することが可能になる。直接標識にはいくつかの利点があり、その１つは、直接標識法がアッセイを実施するのに１つの特異的抗体しか必要としないということである。
【００２８】
また小型および多重イムノアッセイを用いて、抗体のようなタンパク質の存在または不在に関して生物学的試料をスクリーニングすることもできる（Joos et al., Electrophoresis ２１（１３）：２６４１−２６５０（２０００）； Robinson et al., Nat.Med. ８（３）：２９５−３０１（２００２））。
【００２９】
したがって、本発明は、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータおよびＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出または捕捉剤を含む例えばタンパク質マイクロアレイのような組成物を提供する。最も好ましくは、該タンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、ならびに／またはＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの抗体およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。なおさらに好ましくは、本発明によるタンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体；ならびに／またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。最も好ましくは、タンパク質マイクロアレイはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの抗体、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる抗体を含む。その他の好ましい実施態様では、かかるタンパク質マイクロアレイはさらにＲＦの量をも決定するために例えば抗体のような手段を含む。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、抗体のような検出または捕捉剤を例えばポリスチレン表面のような固体支持体上に固定する。別の最も好ましい実施態様では、検出または捕捉剤を２検体ずつ、３検体ずつまたは４検体ずつ９６ウェルプレートの１つのウェルの底部にスポットまたは固定する。
【００３１】
本発明の別の態様は、対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があるかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータから選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。本発明の方法の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましい実施態様では、対照試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量ならびに／または骨浸食の存在に相対して、対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加は、対象がＲＡを有するかもしくは発症する可能性があることを示すか、またはここで対照試料に相対して対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加の程度、ならびに／もしくは浸食の程度がＲＡの進行と相関する。好ましくは、対照試料は健常個体から得られた試料である。
該増加量は好ましくは統計的に有意な増加量を意味し、すなわちこれらの少なくとも２つのバイオマーカーに関して健常個体において見出された、および／またはＲＦに関して見出された正常レベルを有意に超えるレベルを意味する。「有意に」または「統計的に有意な」なる用語は統計的有意性を意味し、そして一般的に正常、または高濃度のマーカーを超える２標準偏差（ＳＤ）を意味する。好ましい実施態様では少なくとも２つのバイオマーカーの量および場合によってはＲＦの量の少なくとも約５％増加は、対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があることの指標である。好ましくは、増加は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。
【００３２】
別の態様では、本発明は対象におけるＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質を同定する方法に関し、該方法はａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；およびｃ）工程ｂ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を再度決定することの工程を含み；ここで工程ａ）で測定した量に相対した工程ｂ）で測定した少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により、ＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質が同定される。本発明の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。本発明の好ましい実施態様によれば、（工程ａ）で決定される少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量に比較する場合工程ｃ）で決定される）少なくとも２つのバイオマーカー、および場合によってはＲＦの量の低下は、被験物質がＲＡを予防または軽減する可能性のある被験物質であることを示している。
【００３３】
別の態様では、本発明はＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法を提供し、該方法はａ）該処置を開始する前にＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ｂ）該処置を開始した後にＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ならびにｃ）工程ａ）およびｂ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を比較すること；の工程を含み、ここで工程ａ）およびｂ）の試料中の量の類似により、処置が有効でないことが示され、そしてここで工程ｂ）の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により処置が有効であることが示される。別の実施態様では、ＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法は、該処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで該処置を開始する前に試料中で決定された量に比較して、該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化により、処置が有効であることが示される。好ましくは、工程ｂ）の試料中、すなわち該処置を開始する前に該対象から得られた生物学的試料中で決定された量に相対して、該処置を開始した後に対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下により、処置が有効であることが示される。本発明の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましい実施態様によれば、該処置は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の投与を含む。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法の１つで決定された該低下は統計的に有意な低下であり、すなわち少なくとも２つのバイオマーカーに関して、および場合によってはＲＦに関してＲＡ患者において見出されるレベルより有意に低く、そして健常な個体で見出されるレベルに近いレベルを意味する。例えば少なくとも２つのバイオマーカーの量の約５％の低下により、被験物質がＲＡを予防または軽減する可能性のあることが示されるか、または処置が有効であることが示される。好ましくは低下は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。
【００３５】
本発明のさらに別の態様は、ＲＡの特定のサブタイプを有するかまたは有する可能性のある対象を同定するための方法を提供し、該方法はａ）ＲＡを患う対象から生物学的試料を入手すること、ｂ）工程ａ）の生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を特定のＲＡサブタイプの量と比較すること；の工程を含み、ここで工程ａ）およびｂ）の試料中の量の類似により、対象が該特定のサブタイプに属することが示され、そしてここで工程ａ）およびｂ）の少なくとも２つのバイオマーカーの量の差により、対象がＲＡの異なるサブタイプに属することが示される。該方法の別の実施態様はさらに浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量の決定を含む。好ましくは該差は統計的に有意な差であり、すなわちＲＡの特定のサブタイプに関して公知の該バイオマーカーのレベルと有意に異なる、少なくとも２つのバイオマーカーの、ならびに場合によってはＲＦおよび／または浸食のレベルを意味する。
【００３６】
本発明の別の態様はリウマチ性疾患を有するかまたは有する可能性のある対象を同定するための方法を提供し、該方法は該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む。該方法のさらなる実施態様は浸食の存在および／または生物学的試料中のＲＦの量のさらなる決定を提供する。好ましい実施態様では、健常個体の対照試料に相対して対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量の増加、ならびに／または浸食の存在により、該対象が該リウマチ性疾患を有するかまたは発症する可能性があることが示される。該増加量は好ましくは統計的に有意な量を含む。好ましい実施態様では、少なくとも２つのバイオマーカー量の少なくとも約５％増加は、対象が該リウマチ性疾患を有するかまたは発症する可能性があることの指標である。好ましくは、増加は少なくとも約６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％である。リウマチ性疾患は例えばリウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、若年性リウマチ様関節炎（ＪＲＡ）、結合組織病（ＣＴＤ）および巨細胞性動脈炎でよい。
【００３７】
少なくとも２つのバイオマーカーの量、ならびに場合によってはＲＦの量、および／または浸食の決定を本明細書に記載するように実施するのが好ましい。例えば浸食を例えばＸ線フィルム検査により視覚的および定性的に評価することができるか、またはＭＲＩ分析を用いることにより決定することができる；少なくとも２つのバイオマーカーの量またはＲＦの量を、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することができる。別の好ましい実施態様では、該バイオマーカーおよび場合によってはＲＦの量を質量分析を用いて、または例えばモノクローナル抗体、抗体誘導体もしくは抗体フラグメントを含む抗体のような少なくとも２つのバイオマーカータンパク質および／もしくはＲＦに特異的に結合する試薬を用いて決定する。好ましくは少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するために用いる該手段を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。最も好ましくは、本発明の少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する抗体はさらに以下の実施例において記載するものである。
【００３８】
種々の方法を用いてＲＦを測定することができ；その全ては血清中のＩｇＭ ＲＦの検出に基づく。用いることができる方法は例えば：ａ）Waaler Rose：ウサギＩｇＧでコーティングしたヒツジ赤血球を用いる古典的半定量的アッセイ（Waaler E. ヒツジ血球の特異的凝集を活性化するヒト血清中の因子の発生に関して、ActaPathol. Microbiol. Scan.１７：１７２−１７８（１９４０）； Rose HM, Ragan C, Pearce E, Lipman MO. リウマチ様関節炎を有する患者の血清による正常および感作ヒツジ赤血球の差次的凝集、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ６８：１−１１（１９４９））；ｂ）ラテックス吸着アッセイ：ヒトＩｇＧでコーティングしたラテックスビーズを用いる、これもまた古典的半定量的アッセイ（Singer JM, Plotz CM.ラテックス試験Ｉ．リウマチ様関節炎の血清学的診断への適用、Am J Med ２１：８８８（１９５６））および／またはｃ）非濁法：ヒトＩｇＧでコーティングしたラテックスビーズを用いる自動検出、「ＮラテックスＲＦ」試薬を用いて比濁計「ＢＮＩＩ」で測定（Dade Behringによる装置およびアッセイ、ＯＵＵＡ Ｇ１３ Ｅ０５４０ １３５ Ｈ； Weinblatt, ME, Schur PH. 非濁法によるリウマトイド因子検出、 Arthitis and Rheumatism ２３：７７７−７７９（１９８０））。
【００３９】
好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファの量ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。別の好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４０】
別の好ましい実施態様では、ＭＣＰ−１の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは、該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。別の好ましい実施態様によれば、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、さらにＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４１】
なおさらなる実施態様では、ＩＬ−１ｒａの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定し、ここで最も好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。最も好ましい実施態様では、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。本発明の別の最も好ましい実施態様では、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量、またはＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４２】
別の好ましい実施態様では、ＩＬ−８の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくは少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。
【００４３】
なおさらなる実施態様では、ＩＬ−６の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−１ベータである。最も好ましい実施態様では、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量またはＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの量を決定する。その他の好ましい実施態様では、さらにＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４４】
別の好ましい実施態様ではＩＬ−１ベータの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する。好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−６である。さらなる好ましい実施態様では、加えてＲＦの量および／または浸食の存在を決定する。
【００４５】
なおさらに好ましい実施態様によれば、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの量を決定する。最も好ましくはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。最も好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の量、またはＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する。なおさらなる実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーの量を決定することを提供する。本発明の最も好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する。本発明の別の最も好ましい実施態様では、場合によっては骨浸食の決定と一緒に、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＲＦの量を決定する。
【００４６】
本発明の別の実施態様ではＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーの量を決定する方法に関する。好ましくはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６の量を決定する。さらに好ましい実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５または６つのバイオマーカーの量を決定する。好ましい実施態様ではＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータの量を決定する。本発明のその他の好ましい方法によれば、前記で概要を示したように、生物学的試料中の少なくとも２、３、４、５または最大４、５または６つのバイオマーカーの量をＲＦの量と一緒に、および／または骨浸食の決定と一緒に測定する。
【００４７】
好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を場合によってはＲＦの量と一緒に、別個に逐次的にまたは同時に決定する。最も好ましくは、少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する。したがって、抗体のような該バイオマーカーに特異的に結合することができる手段の混合物を試料と接触させることにより、生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカー、ならびに場合によってはＲＦを同時に決定する。本発明の別の好ましい実施態様では、本明細書に記載したような組成物またはキットを用いることによりバイオマーカーの量の同時決定を実施する。
【００４８】
本発明はさらにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含む、リウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物の発見に基づく。該組成物の別の実施態様はさらにＲＦの量を決定するための少なくとも１つの検出剤を含む。また該組成物をＲＡの診断または進行もしくは処置をモニタリングするために用いることもできる。検出剤は好ましくはＴＮＦ−アルファに特異的に結合する手段ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは該手段はＴＮＦ−アルファに特異的に結合し、そして該その他の手段はＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータに特異的に結合する。本発明にさらに好ましい実施態様では、検出剤はＭＣＰ−１に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。本発明の別の実施態様では、組成物はＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する１つのさらなる手段を含む。別の実施態様では該組成物はさらにＲＦに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００４９】
なおさらに好ましい実施態様では、検出剤はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは、組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＩＬ−６に結合する少なくとも１つのさらなる手段、またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくともさらなる手段、またはＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。その他の実施態様では、該組成物はさらにＲＦに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、検出剤はＩＬ−８に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む。最も好ましくは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６またはＩＬ−１ベータである。なおさらに好ましい実施態様は、検出剤がＩＬ−６に特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含むことを提供する。好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−１ベータである。最も好ましくは、組成物はＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＭＣＰ−１に結合する少なくとも１つのさらなる手段および場合によってはＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段およびＴＮＦ−アルファに結合する少なくとも１つのさらなる手段および場合によってはＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、検出剤がＩＬ−１ベータに特異的に結合する手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む組成物に関する。最も好ましくは該少なくとも１つのさらなるバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８またはＩＬ−６である。そして本発明のなおさらなる実施態様は検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む組成物に関する。最も好ましくは該組成物はＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段を含むか；または組成物はＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段、ＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段、およびＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段を含む。本発明のその他の最も好ましい実施態様では、少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む該組成物はさらにＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。
【００５２】
本発明のなお別の実施態様は、検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む組成物を提供する。最も好ましくは少なくとも４つのバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６を含む。別の最も好ましい実施態様では、少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む組成物はさらにＲＦに結合する少なくとも１つの手段を含む。本発明のもっとさらに好ましい実施態様は、検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも５つの異なる手段を含み、ここで最も好ましくは少なくとも５つのバイオマーカーはＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６を含むことを提供する。本発明の別の実施態様は検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５もしくは６つのバイオマーカーに特異的に結合する最大４、５もしくは６つの異なる手段を含むか、または最大６つのバイオマーカーがＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータを含む組成物を提供する。本発明の別の実施態様によれば、バイオマーカーに特異的に結合する手段は該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡに結合することができる少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドを含むか、または、さらに前記で詳記し、そしてまた実施例でも概要を示すように、ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカー／バイオマーカータンパク質に結合することができる抗体、モノクローナル抗体、抗体誘導体もしくは抗体フラグメントを含む。特に好ましい実施態様では、バイオマーカーに特異的に結合する手段を例えばポリスチレン表面のような固体支持体に固定する。最も好ましい実施態様はさらに以下の実施例で記載するようにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６もしくはＩＬ−１ベータ、またはＲＦに特異的に結合する少なくとも２、３、４つの、または少なくとも５もしくは６つの抗体を提供し、ここで該抗体を９６ウェルプレートの１つのウェル内のようなポリスチレン表面にスポットまたは固定する。別の好ましい実施態様はＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６の群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも２つの抗体、ならびに場合によってはＲＦを２検体ずつ、３検体ずつまたは４検体ずつで９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットまたは固定する。
【００５３】
本発明のその他の態様はまた本発明による組成物のいずれか１つおよび使用のための指示書を含む診断または薬物発見キットを提供する。好ましい実施態様では、該診断または薬物発見キットはさらにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータ、ならびにＲＦから選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合することができる例えばビオチン化抗体のような標識抗体の混合物を含む。
そして本発明のなおさらなる態様は本発明による方法の１つにおけるかかる診断または薬物発見キットの使用に関する。
本発明を以下の実施例でさらに記載する。
【実施例】
【００５４】
実施例１
ガラスチップ形式のタンパク質マイクロアレイの開発
タンパク質マイクロアレイを多重タンパク質分析に有用なツールとして開発を続ける。タンパク質マイクロアレイの開発はタンパク質沈着、アッセイ手順、シグナル検出およびデータ解析のために多くの技術を組み合わせる。異なる支持体、液体処理方法および検出系を伴う多くの試みが、タンパク質マイクロアレイ開発に関して為されている（Kodadek ； Chem.Biol. ８,（２）：１０５−１１５（２００１）； Stoll, Templin, Schrenk, Traub, Vohringer, & Joos； Front Biosci. ７：c１３−c３２（２００２）； Templin et al. ； Proteomics. ３（１１）：２１５５−２１６６（２００３））。開発は以下の工程を網羅する：
２つの界面化学物質を用いたガラスチップの処理の比較：ポリ−Ｌ−リジン対オクタデシルリン酸エステルの自己組織化単分子膜；
抗体沈着に関する接触および非接触圧電型アレイの比較；
コーティング抗体の種々濃度の比較；
種々検出系の比較：ＣＣＤカメラ対蛍光スキャナ。
ガラスチップ上のサンドイッチタンパク質マイクロアレイの開発は例えばUrbanowska et al., Cell Biology and Toxicology １９：１８９−２０２（２００３）に記載されている。
【００５５】
最適化アッセイ
プリンティングバッファーへのグリセロール添加の影響をＭＣＰ−１アッセイで調べる。ＭＣＰ−１に対する抗体をＰＢＳ単独ならびに１０、２０、３０、４０および５０％グリセロールを添加したＰＢＳで希釈する。５ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＣＰ−１に関してサンドウィッチアッセイの間に生じたシグナルをコーティング溶液に加えたグリセロールの種々の量に対してプロットする（図１）。結果により、１０％グリセロールをコーティング溶液に加えた場合、シグナル強度が低下することが示される。しかしながら２０−５０％グリセロールの添加の場合、生じたシグナルは同程度であるが、スポット（ｎ＝１６）間の変動性はかなり増加する。
【００５６】
実施例２
９６ウェルプレート形式のタンパク質マイクロアレイの開発
界面化学を用いてチップをコーティングする方法（実施例１をも参照）は、アッセイ処理のロボット自動化がなされておらず、そしてチップ間変動性が高く、かなり時間がかかり、そして複雑であるので、タンパク質マイクロアレイ製造に関してあまり複雑でなく、そしてより確固とした代替を求める探求が促された。結果的に類似するが、ガラススライドを用いる代わりに固体支持体として９６ウェルプレートのポリスチレン表面を使用するマイクロアレイを開発する試みが為された。
【００５７】
ポリスチレンプレートは９６ウェル形式でイムノアッセイに用いられる明確に確立された固体支持体であり、そして古典的ＥＬＩＳＡ技術において広く利用されている。界面化学は抗体結合に関して標準化および最適化されており、そしてアッセイ処理工程は完全に自動化される。したがって、このテクノロジーをマイクロアレイ形式に適合させる可能性はその他の固体支持体に勝る多くの利点を提供できるであろう。
【００５８】
バイオチップアレイヤー（ＢＣＡ）プリンティング装置に適合するロングネックチップ（PerkinElmer）の利用可能性により固体支持体としての９６ウェルプレートの使用の選択肢が提供された。重要なことに、これらのロングネックチップにより、抗体を９６ウェルプレートの底部に正確にスポットすることが可能になる（Moody, Van Arsdell, Murphy, Orencole, & Burns, Biotechniques ３１（１）：１８６−４（２００１））。開発過程は試薬選択、プリンティングプロトコール最適化、マトリックス検査、アッセイプロトコール確立および検出系評価を伴った。
【００５９】
得られた結果に基づいて、マイクロアレイ調製のために以下の条件を選択した：ガラス処理のためのＯＤＰのＳＡＭ；非接触圧電型プリンターを用いる２００μｇ／ｍｌの濃度でのコーティング抗体の沈着、および蛍光によるシグナル検出。
【００６０】
実施した実験の結果として、９６ウェルプレートの各ウェルで４×４マイクロアレイを開発した。圧電型装置を用いて抗体を各ウェルに２００μｇ／ｍｌの濃度で、スポットあたり３ｎｌ固定した。抗原およびビオチン化抗体の混合物の試料インキュベーションに続いて、各ウェル内の各スポットで生じた化学発光シグナルを、ノンパララックストレイを有するＣＣＤカメラを用いて撮像した。次いで画像をArrayVision（商標）ソフトウェアを用いて分析した。各スポットで生じたシグナルの量は元来の標準または試料中の標的タンパク質の量に比例した。
【００６１】
材料および方法
一般試薬
ＰＢＳバッファー １０×ＰＢＳバッファー、Roche Diagnostic, Indianapolis, IN,USA）
Tween（登録商標）２０ Fluka Chemie Sarl, Buchs, Switzerland
SuperBlock（商標） Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA
ウシ血清アルブミン（Ｖ分画） Fluka Chemie Sarl, Buchs, Switzerland
洗浄バッファー ＰＢＳ１×０.０５％Tween含有
アッセイバッファー ＰＢＳ１×０.０５％Tween、３％ＢＳＡ含有
【００６２】
ソフトウェア
Quantity One バージョン４.２.１（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）
Aida バージョン５.０（Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany）
ImaGene（商標）バージョン５.０（BioDiscovery, Inc. , El Segundo, CA, USA）
Array Vision（商標）バージョン８.０（Imaging Research Inc. , Ontario, Canada）
SOFTmax（登録商標） PRO バージョン３.１.１（Molecular Devices Corp. , Sunnyvale, CA, USA）
【００６３】
研究室装置
ブラックプレート：Maxisorp（商標）９６ウェルプレート（Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）
透明プレート：Maxisorp（商標）９６ウェルプレート（Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA）
プレートシェーカー：Wesbart（ＩＳ８９）（Fischer scientific, Wohlen, Switzerland）
洗浄器： Embla, Molecular Devices（Bucher Biotec AG, Basel, Switzerland）
【００６４】
装置
プリンティング装置 バイオチップアレイヤー（ＢＣＡ）（PerkinElmer, Boston, MA, USA）
カメラ ＬＡＳ１０００− Fuji, Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany.
ＬＡＳ３０００− Fuji, Raytest GmbH, D 75339 Straubenhardt, Germany
【００６５】
プリンティング系設定
マイクロアレイ製造のためにＢＣＡを使用した。圧電系のパラメーターをチップあたり１１０−２００ボルトに設定した。チップとウェル底部との間の距離は０.５ｍｍであった。抗体を２検体ずつ、スポット間１ｍｍの距離で分配した。
【００６６】
抗体および組換えタンパク質
抗体試薬
【表１】
【００６７】
組換えタンパク質
【表２】
【００６８】
市販キット
ＥＬＩＳＡキット
【表３】
【００６９】
抗体選択
抗体９６ウェルプレートの開発に用いる試薬は市販の異なるエピトープに対するＥＬＩＳＡ抗体適合対、および対応する抗原であった。マイクロアレイ開発のために選択されるバイオマーカーのパネルはＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦαであった。
【００７０】
多重形式の前記の抗体適合対の適応性を確認するために、交差反応の可能性を調べる実験を行った。全ての捕捉抗体を各ウェルの底部にスポットし、そして単一の組換えサイトカイン（０.６４ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、０.５８ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１ｒａ、０.８ ｎｇ／ｍｌ ＭＣＰ−１および０.０３８ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα）および全抗原に対するビオチン化抗体のカクテルでスパイクしたＰＢＳと共にインキュベートした。試料にスパイクしなかった全ての被分析物のレベルは定量限界以下であった。したがって、選択した抗体適合対はこのマイクロアレイ形式で特異的である。
【００７１】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１に対する抗体のサブセットの交差反応性もまたBIAcore（登録商標）テクノロジーで調べた。結果により、マイクロアレイ製造のために選択された抗体適合対間に交差反応性がないことが実証された。
【００７２】
試薬条件最適化
アッセイの各工程に関して、種々の条件を試験しなければならない。様々の濃度のコーティングおよび検出抗体ならびに種々のスポット容量を比較した。検出抗体に関しては、高いシグナル対ノイズ比を生じるために種々濃度が必要とされる。
【００７３】
コーティング抗体濃度の力価測定
ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に対する抗体を４つの濃度でプリントした：２５、５０、１００および２００μｇ／ｍｌ。アッセイを実施した後、各被分析物に関して生じたシグナルをバックグラウンド値で除した。バックグラウンドは被分析物を加えなかった（ブランク）ウェルから定量した。各被分析物に関して１００００、１０００および１００pｇ／ｍｌの濃度でシグナル対ノイズ比を計算した。図２では被分析物濃度１００pｇ／ｍｌに関するシグナル対ノイズ比を示す。ＩＬ−１βに関しては、コーティング抗体濃度１０、５０、１００および２００μｇ／ｍｌに関してシグナル対ノイズ比１.５、１９.５、９２.９および１２９.２を測定した。ＩＬ−６の場合、同一のコーティング抗体濃度に関してシグナル対ノイズ比は１.０、１０６.９、１１３.９、１１６.５であったが；ＩＬ−８に関しては、２.１、５９.７、１５５.１、１５７.８という結果であった（図２）。全被分析物に関して最も高いシグナル対ノイズ比は、２００μｇ／ｍｌの濃度のコーティング抗体を用いた場合に得られ、結果として、マイクロアレイ製造のためにこの濃度を選択した。
【００７４】
スポットあたりのコーティング溶液の容量
各ウェルの底部に抗体をプリントした。全抗体をウェルあたり４検体ずつでプリントした。各標準曲線濃度を２つのウェルに分配した。結果的に被分析物あたり８つのスポットを生じた。抗体溶液を滴あたり〜０.３３３ｐｌの容量で分配した。４つの異なる場合の全スポット容量を調べた：２０ｎｌ（６０滴）、１０ｎｌ（３０滴）、３ｎｌ（９滴）および０.３３３ｎｌ（１滴）。各分配容量に関して変動係数（ＣＶ％）を計算した。滴あたり２０ｎｌを分配した場合、スポットの大きさは比較的大きく、スポットのお互いの重複を引き起こし、それによりアッセイ結果が不正確になった。３つのその他の場合では、各スポットから生じたシグナル強度のＣＶ％を全標準曲線濃度に関して計算した：１０、２５、５０、１００および１０００pｇ／ｍｌ。最良の感度およびＣＶ％はスポットあたり３ｎｌの容量を分配した場合に得られた。全標準曲線濃度にわたるＣＶ％範囲を示す（表１）。結果的に、３ｎｌ／スポットをマイクロアレイ製造に選択した。
【００７５】
【表４】
各被分析物に関してスポットあたり種々容量のコーティング抗体溶液を分配した。式：（標準偏差／平均*１００）を用いて各スポット（ｎ＝８）から生じたシグナル強度に関してＣＶ％を計算した。ＣＶ％は３ｎｌ／スポット容量を分配した場合に最良であった。
【００７６】
ビオチン化抗体濃度の力価測定
種々濃度のビオチン化抗体を試験した。ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−８に対するビオチン化抗体を６２.５、１２５、２５０および５００ｎｇ／ｍｌに希釈した。ビオチン化抗体の各希釈に関して生じたシグナルを対応するバックグラウンドで除した。最も高いシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してコーティング抗体の濃度５００ｎｇ／ｍｌを用いた場合に得られた。種々濃度のビオチン化ＡｂでＩＬ−８アッセイに関して発生したたシグナル対ノイズ比の実例を図３に示す。結果的に、５００ｎｇ／ｍｌの濃度をマイクロアレイ製造に選択した。
【００７７】
ヒト、イヌおよび子ウシ血清評価
無作為にイヌ、ヒトおよび子ウシ血清でＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に関する標準曲線を調製した。プロットする前に各ウェルからのローカルバックグラウンドをシグナル強度から減じた。
【００７８】
バッファー評価
市販のＥＬＩＳＡキットで標準作成に使用するアッセイバッファーでＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８に関する標準曲線を調製した。様々な濃度の組換えタンパク質でスパイクしたヒト血清プールから調製した試料を標準に基づいて計算した。
【００７９】
【表５】
ＩＬ−１βでスパイクしたヒト血清試料に関して計算した正確性［（スパイクした被分析物濃度／実測被分析物濃度）＊１００］。バッファー中で調製したＩＬ−１β標準に基づいて正確性を計算した。得られた値はＩＬ−１βのスパイクした量に比較して半分の値になった。
【００８０】
種々のヒト血清スクリーニング
低レベルのＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＴＮＦαを含有するマトリックスを選択するために、それらに対する抗体を各ウェルの底部にプリントした。ヒト血清の種々のバッチをアレイの各ウェルに適用した。各バッチを２検体ずつで分析した。プリントされた被分析物に関して高いシグナルが得られた血清を拒絶し、そして調べた被分析物に関して低いシグナルを生じた血清を可能性のあるプール構成成分として選択した。これらの血清中の内因性の被分析物の量を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。得られた結果に基づいて、ＥＬＩＳＡデータシートに記載された正常なヒト血清中の値に相当する被分析物の量を含有する血清を、プールを調製するために選択した。スクリーニングした全部で３６個のヒト血清のバッチから１２個を選択し、そして一緒にプールした。続いてヒト血清プール中の被分析物の量もまたＥＬＩＳＡキットで測定した。結果により、プール中の目的の被分析物の全量はまた正常血清中に見出されたレベルに相当することが示された。結果を表３に示す。
【００８１】
【表６】
【００８２】
続いてヒト血清プールで全被分析物に関する標準曲線を生成した。シグナルおよび濃度をプロットする前に各ウェルからのローカルバックグラウンドを減じた。全標準は満足できる直線性を示した。
【００８３】
バッファーマトリックス評価の間に同一の様式で調製された試料を前記した標準に基づいて測定した。全被分析物に関する実測濃度はスパイク濃度に相当し、７０％≦および≦１３０％内のアッセイの正確さが得られた。ＩＬ−１βに関する実例の結果を表４に示す。選択されたヒト血清プールをアッセイバリデーションに用いた。
【００８４】
【表７】
ＩＬ−１βヒト血清スパイク試料をヒト血清で調製した標準曲線で測定した。濃度は満足できる正確性７０％≦および≦１３０％で実測された。
【００８５】
アッセイ条件最適化
コーティング溶液へのグリセロールの添加
グリセロール１０、５および０％を添加したＰＢＳをコーティング溶液として用いた。全ての標準曲線濃度点に関してＣＶ％および正確さを計算した。ＩＬ−１βに関する代表的なデータを表５に示す。ＣＶ％とＡｃｃ％の間で、種々のグリセロール添加で得られた結果の間に主要な差異はなかった。しかしながらグリセロールの添加は技術的観点の理由で問題があった。粘性のグリセロール特性がプリンティングチップに詰まりを引き起こした。この結果に基づいて、グリセロールを添加していないＰＢＳをマイクロアレイ作成のためのコーティングバッファーとして選択した。
【００８６】
【表８】
【００８７】
アッセイ形式
２つの異なるアッセイ形式を比較した：サンドイッチアッセイならびに試料およびビオチン化抗体の同時インキュベーション。サンドイッチ法ではアッセイを２工程で実施する。最初にプリントしたコーティング抗体を試料と共にインキュベートし、次いで洗浄工程の間に未結合試料を除去した後、アレイをビオチン化抗体のカクテルに暴露する。２工程インキュベーションは、アッセイ抗体のいくつかがポリクローナルである場合に有利であろう。
【００８８】
同時インキュベーションの場合、アッセイを１工程で実施する。プリントしたコーティング抗体を試料およびビオチン化抗体のカクテルの混合物と一緒にインキュベートする。同時インキュベーション法は試料適用の間の時間差を最小にし得る。ＩＬ−６標準曲線は双方のアッセイ形式を用いて作成した標準曲線を表す（図４）。１工程形式を実施した場合、作成した標準曲線は最低範囲でさえも直線であり、アッセイ感度を高めた。
【００８９】
ＣＣＤカメラ選択および設定
次いでＨＲＰ−共役ストレプトアビジンおよび化学発光の強化を用いて視覚化したシグナルを、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いて撮像した。９６ウェル形式により化学発光およびＣＣＤ組み合わせの選択が決定づけられた。２つの異なるＣＣＤカメラを用いて画像を作成した。撮像に利用した２つの異なるＣＣＤカメラはFuji ＬＡＳ１０００およびＬＡＳ３０００であった。ノンパララックストレイなしで生成された画像はエッジ効果を生み出し、画像分析を不正確にすることが観察された。第２のカメラの利点は９６ウェルプレートウェルの視差を排除するノンパララックストレイである。また第２のカメラにより、スポットの大きさを小さくすることによりマイク分析を容易にそしてより精密にする高解像度ビニング様式の選択肢が得られた。図５はノンパララックストレイ装置で、そして３つの異なる画像様式で撮影した画像を示す：高（左）、標準（中央）および高解像度様式（右）。もはやエッジ効果は観察されなかった。結果的にマイクロアレイ製造のために第２のカメラを選択した。アッセイの間に生じたバックグラウンドはプレートの全ウェルにわたって安定していた。各ウェルからのバックグラウンドシグナル強度間のＣＶ％は３.３％であった。これらの結果により、生成されたシグナル強度のバックグラウンド補正は必要でないことが示された。
【００９０】
定量ソフトウェア
３つの市販の定量ソフトウェアを評価した：Aida、ImageneおよびArrayVision。３つのツール間の主要な差異はArrayVision（商標）システムに含まれる標準曲線作成特徴である。その他のプログラムは標準曲線作成にさらなるツールを必要とした。例えばその他の２つのソフトウェアでデジタル化シグナル値をExcelプログラムにエクスポートしてプログラム変動性計算を実施しなければならなかった。その後でデータを再度標準曲線作成のためにSoftmaxPro（登録商標）ソフトウェアにエクスポートした。これが、ArrayVision（商標）を抗体マイクロアレイ製造のためのソフトウェアとして選択することになった主要な原因であった。３つのソフトウェアの比較を表６に示す。
【００９１】
【表９】
【００９２】
開発したプロトコール
一般試薬：
プレート： ブラックプレート
コーティングバッファー： ＰＢＳ１Ｘ
ＣＣＤカメラ： ＬＡＳ−３０００高解像度ビニング様式
ソフトウェア： ArrayVision（登録商標）
【００９３】
アッセイプロトコール
コーティング ２００μｇ／ｍｌモノクローナル抗体
３ｎｌ／スポット
バイオチップアレイヤーエンクロージャー中２時間乾燥
４℃で一晩インキュベーション
室温で３０分間乾燥
３７℃で１０分間乾燥
遮断 SuperBlock／ウェル３×２００μｌ
SuperBlock／ウェル１００μｌ、室温で３０分間インキュベーション
試料インキュベーション 試料５０μｌ／ウェル
５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体のカクテル５０μｌ／ウェル
振盪プラットフォーム上で室温で４時間インキュベーション
洗浄バッファー３００μｌ／ウェルで３回洗浄
ストレプトアビジン−ＨＲＰ ０.２μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ウェル
振盪プラットフォーム上で室温で３０分間インキュベーション
洗浄バッファー３００μｌ／ウェルで３回洗浄
化学発光基質 １００μｌ／ウェル、即座に読み出し
撮像 ＣＣＤカメラ露出２０秒
画像デジタル化および１６ビットｔｉｆｆファイルとして保存
シグナル定量 ArrayVision（商標）
【００９４】
要約すれば、９６ウェル形式でＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１ベータのようなリウマチ様関節炎に関連する少なくとも２、３、４、５または６つのバイオマーカーを同時に測定するのに有効な方法の開発における主要な構成成分、工程および条件を評価した。評価は試薬力価測定、スポットあたりに沈着したコーティング抗体の量、マトリックス選択、検出および解析、ならびにソフトウェア評価を網羅する。
【００９５】
最適なシグナル対ノイズ比を生成するのに必要な、ＥＬＩＳＡに比較して高い抗体濃度を検討する場合、プリンティング過程の間に抗体変性の可能性を考慮すべきである。別の可能性は抗体をポリスチレン９６ウェルプレートに固定する物理的吸着である。物理的吸着はアッセイ中のタンパク質脱離に至り得て、これはシグナル損失に至り得る。コーティング溶液の濃度が高い場合、抗体の変性または脱離の可能性は低くなるかもしれない。
【００９６】
薬物動態イムノアッセイのための既存の手引きは、分析する試料と同一起源のマトリックス、これに代えて異種動物マトリックスまたはタンパク質不含バッファーで被分析物測定のための標準曲線を調製することを推奨した。
化学発光反応において生成された光は全方向に同等に放出される。そのためにいわゆる光パイピング現象を回避するために、化学発光測定のために透明のプレートの代わりにブラックプレートを使用することが推奨される。光パイピングは単に各ウェルから生じたシグナルの干渉である。しかしながらブラックプレートは視誤差を取り込む危険性を創成するプレートの上から画像を撮影することを必要とする。したがって抗体アレイのための撮像ツールとして２種のＣＣＤカメラを比較した。ＬＡＳ３０００カメラにより提供されるノンパララックストレイの選択肢により全てのプレートを視差の影響なく撮像することが可能になった。
【００９７】
実施例３
９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイのバリデーション
開発した９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイは古典的なイムノアッセイで利用されるサンドイッチＥＬＩＳＡ手順に基づく（Wild ２００１； The Imunoassay Handbook）。イムノアッセイはしばしば疾病の経過および処置に応答して誘発された抗体を示すバイオマーカー定量化に適用される。（Findlay, Smith, Lee, Nordblom, Das, DeSilva, Khan, & Bowsher； J.Pharm.Biomed.Anal. ２１（６）：１２４９−１２７３（２０００））。したがって、イムノアッセイが正確であり、そして精密であることが非常に重要である。正確性は、方法により得られた濃度の値が被分析物の公知の真の濃度の値に近似することと定義され、一方精度は、方法を同一の生物学的試料の複数のアリコートに繰り返し適用した場合に被分析物の個々の測定値が近似することである。
正確性＝（算出濃度／名目濃度）＊１００
精度＝（標準偏差／算出平均濃度）＊１００
【００９８】
任意の生物分析方法のこれらの重要な特徴をバリデーションの過程で調べる。分析方法のバリデーションにより供給源を同定し、そして方法における潜在誤差を定量化する（Findlay, Smith, Lee, Nordblom, Das, DeSilva, Khan, & Bowsher, J.Pharm.Biomed.Anal. ２１（６）：１２４９−１２７３（２０００）；Shah, Midha, Findlay, Hill, Hulse, McGilveray, McKay, Miller, Patnaik, Powell, Tonelli, Viswanathan, & Yacobi, Pharm.Res. １７（１２）：１５５１−１５５７（２０００））。アッセイバリデーションは数学的および定量可能な用語でアッセイの動作特性について説明する。古典的なイムノアッセイはＦＤＡの指令（２００４）に沿ってバリデートされなければならない。
【００９９】
バリデーションプロトコール
抗体マイクロアレイのバリデーションに採用されたプロトコールは薬物動態イムノアッセイに関するＦＤＡの指令（２００４）の重要な要素を用いた許容基準文書に基づいた。９６ウェル形式のＡｂマイクロアレイに採用された修飾されたプロトコールがバリデーション方法で実践された。
【０１００】
９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイのバリデーションプロトコール
マトリックス
そこから（複数の）被分析物を定量する血漿、血清、全血、尿、糞便、組織のような生物学的培地を記載するためにマトリックスを用いる。測定された低レベルの被分析物を含有する選択されたヒト血清のプールで全てのバリデーション実験を実施した。
【０１０１】
標準曲線は装置応答性と被分析物の公知の濃度との間の関係である。
標準曲線の直線部分は疾病状態の被分析物濃度レベル内にあるべきである。８つの異なる濃度レベルを用いて標準曲線を構築した。（複数の）被分析物も内部標準も加えられていない試料をブランクとした。
【０１０２】
【表１０】
マトリックス中に標準を新たに調製し、そして各バリデーション日に実行した。
標準を１回調製し、そして３検体ずつで分析した。
作動範囲内の標準に関する逆算値は予測濃度から≦３０％偏差になるべきである（７０％≦正確性≦１３０％）。
個々の標準の最大１／４は排除され得る。
各標準濃度で少なくとも５０％の値（スポット）が正確性および精度範囲内に入らなければならない。
【０１０３】
品質管理試料
品質管理試料（ＱＣ）は生物分析方法の性能をモニタリングするため、および個々のバッチで分析される未知試料の結果の完全性および妥当性を評価するために用いられるスパイクされた試料である。ＱＣを標準曲線と同一のマトリックスで調製する。
ＱＣ試料を各被分析物に関して６濃度で調製した。
【０１０４】
【表１１】
各ＱＣ濃度に関して同一のマトリックスから別個に２つのＱＣセットを調製し、３検体ずつで分析した。
ＱＣ試料は予想される動的濃度範囲を網羅すべきであり、１つのＱＣは予想される定量下限（ＬＬＯＱ）で；１つはＬＬＯＱの３倍内で、１つは高および低ＱＣ濃度のほぼ間で、そして１つは予想される定量上限（ＵＬＯＱ）である。ＬＬＯＱは適当な精度および正確性を伴って定量的に決定され得る試料中の被分析物の最低濃度である。ＵＬＯＱは適当な精度および正確性を伴って定量的に決定され得る試料中の被分析物の最高量である。
７０％≦正確さ≦１３０％は各濃度レベルでの平均値に基づいた。
各濃度レベルで精度≦３０％
個々のＱＣ濃度値の少なくとも２／３は正確性および精度の範囲内でなければならない。
各ＱＣ濃度で少なくとも５０％の値（スポット）は正確性および精度の範囲内でなければならない。
標準およびＱＣを同一ストック溶液から調製した。
日間変動性：異なる日で３回バリデーションを実行した。バリデーション実行は分析に問題がある場合にのみ拒絶されるべきである（例えば試薬調製のエラー、装置不備、ピペッティングエラーまたは実行からのデータがあまりに異常であるので、その値が説明できない分析エラーの結果でしかあり得ない場合）。
【０１０５】
安定性
安定性は規定の時間間隔で特定の保存条件下での、規定の溶液またはマトリックス中の被分析物の物理化学的安定性である。
スパイクされた試料の短時間安定性。室温で少なくとも６時間評価される、非分析物のヒト血清プールをスパイクするストックの安定性。望ましい保存時間の完了後、保存した試料対新たに調製した試料を測定することにより安定性を試験すべきである。安定性はＱＣ３およびＱＣ４で試験する。
長期間安定性：日間変動性バリデーションのために調製したＱＣ３およびＱＣ４を最初のバリデーション実行時、１週間間隔および１か月間隔で分析する。
【０１０６】
標準曲線およびＱＣ試料調製
各被分析物に関して同一ストック溶液を用いて標準およびＱＣ試料を調製した。標準およびＱＣ試料を各分析日に同一ヒト血清プールから新たに調製した。バリデーションプロトコールで示すように濃度範囲は標準およびＱＣを網羅した。
【０１０７】
標準曲線調製
ヒト血清プールで２０μｇ／ｍｌ被分析物ストック溶液を用いてプレ試料溶液を調製した。ストック溶液をヒト血清プールで１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで２倍希釈（１：１０）した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の目標濃度を調製するために、１００ｎｇ／ｍｌ濃度を用いた。ＴＮＦαに関しては、１０ｎｇ／ｍｌの濃度を用いた。ヒト血清中の組換えタンパク質のカクテルをヒト血清で、バリデーションプロトコールで定義した目標濃度まで連続希釈で１：２に希釈した。各被分析物に関してArrayVision（商標）でロジスティック（ＥＬＩＳＡ）設定を用いて、シグナル対濃度をプロットすることにより標準曲線が得られた。個々の較正線の品質を較正標準の逆算濃度の正確性および精度から評価した。これらの正確さをSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアを用いて計算した。
【０１０８】
計算
正確性％および精度％
平均 各標準濃度に関して全スポット（ｎ＝６）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
【０１０９】
ＱＣ試料調製
各被分析物に関して２０μｇ／ｍｌストック溶液からヒト血清プールでプレ試料溶液を調製した。ストック溶液をヒト血清プールで１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで２倍希釈（１：１０）した。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の目標濃度を調製するために、１００ｎｇ／ｍｌ濃度を用いた。ＴＮＦαに関しては、１０ｎｇ／ｍｌの濃度を用いた。ヒト血清中の組換えタンパク質のカクテルをバリデーションプロトコールで定義した目標濃度まで連続希釈で１：２.５に希釈した。各日に較正試料（ｎ＝３）と一緒に分析したＱＣ試料の日間正確性および精度ならびに日内正確さおよび精度を計算することにより、方法の正確性および精度を評価した。別個のＱＣセットに関してＱＣを３検体ずつ、ウェルあたり２スポット（ｎ＝１２）で調製した。ＱＣ試料に関する正確性および精度を以下の式を用いてArrayVision（商標）ソフトウェアで計算した。
【０１１０】
計算
日内正確性％および精度％
平均 各ＱＣ濃度に関して全スポット（ｎ＝１２）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各ＱＣ濃度に関して全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
日間正確性％および精度％
平均 各ＱＣ濃度に関して３日間のバリデーション日の全スポット（ｎ＝３６）の少なくとも５０％の平均
ＣＶ％ （各ＱＣ濃度に関して３日間のバリデーション日の全スポットの少なくとも５０％のＳＤ／平均）＊１００％
Ａｃｃ％ （観察濃度／予測濃度）＊１００％＝各濃度レベルでの平均値に基づく
【０１１１】
安定性試料調製
ヒト血清プールを各被分析物に関してＱＣ３およびＱＣ４に相当する濃度の組換えタンパク質でスパイクした。別個に調製した２セットに関して３検体ずつで試料を分析した。各バリデーション日に室温で８時間保存した後にスパイクしたヒト血清の安定性を測定した。毎日新たな試料を調製し、そして室温で８時間保存した。−８０℃で１週間および１か月保存の場合、最初のバリデーション日に試料を調製した。特定の保存時間の後、１回の実験で安定性を調べ、新たに調製した標準曲線で保存した試料のデータを計算した。
【０１１２】
アッセイ手順
さらに前記で記載したプロトコールに従って各バリデーション日に実験を行った。
【０１１３】
較正曲線
バリデーションプロトコールに記載したようにキャリブラントの濃度を用いて各バリデーション日にヒト血清プールで標準／較正曲線を調製した。シグナル密度を統合データ値（ＩＤＶ）として定義する。ロジスティックＥＬＩＳＡフィットを用いてシグナルを被分析物濃度に対してプロットした。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαに関して、全キャリブラントに関する精度および正確性は許容基準内であった。ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１標準に関しては、最も低い較正試料を除いて全試料に関する正確性および精度は許容基準を満たした。ＩＬ−１ｒａの最も低い較正試料、０.０９０ｎｇ／ｍｌにより４０.２％の精度が得られたが、正確性は許容基準を満たした。ＭＣＰ−１の最も低い較正試料、０.１１７ｎｇ／ｍｌにより各々１９８.３％および３８.５％の正確性および精度が得られた（表９および１０）。
【０１１４】
【表１２】
各標準曲線濃度に関する逆算値をSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアで評価した。各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％（ｎ＝６）で平均正確性を計算した。
【０１１５】
【表１３】
各標準曲線濃度に関する逆算値をSOFTmax（登録商標） PROソフトウェアで評価した。各標準濃度に関して全スポットの少なくとも５０％（ｎ＝６）で平均精度を計算した。
【０１１６】
品質管理試料
日内正確性および精度、ならびに日間正確さおよび精度に関する結果を各々表１１および１２に示す。全ＱＣ試料は日内および日間アッセイ正確性および精度に関する許容基準を満たした。
【０１１７】
【表１４】
【０１１８】
【表１５】
【０１１９】
【表１６】
【０１２０】
アッセイ作動範囲
ＬＬＯＱとＵＬＯＱの間でアッセイ作動範囲を決定した。アッセイ作動範囲は測定した被分析物に関する疾患濃度を満たしていた。
【０１２１】
【表１７】
【０１２２】
安定性
ＭＣＰ−１を除く全ての被分析物は室温で８時間後、および−８０℃保存で１週間後に安定であった。−８０℃で１か月保存の後、スパイクされた試料の濃度はスパイクされた名目値と比較した場合に３倍少なかった。これらの結果を室温保存測定に関しては表１５、ならびに−８０℃で１週間および１か月保存に関しては表１６に示す。
【０１２３】
【表１８】
【０１２４】
【表１９】
バイオマーカー定量に用いるテクノロジーとしてのイムノアッセイは正確性、精度およびに室間再現精度に関してバリデートする必要がある。９６ウェル形式の抗体マイクロアレイを薬物動態アッセイに関する食品医薬品規制ガイドラインに基づいてバリデートした。バリデーション過程で以下のパラメーターを調べた：逆算値に基づくキャリブラント正確性および精度；品質管理試料に基づく日内および日間正確性および精度；室温で８時間後、ならびに−８０℃で１週間および１か月保存の後の抗原スパイクされたヒト血清試料の安定性；ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱに基づくアッセイＷＲ。
【０１２５】
得られたデータにより、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα被分析物に関する全較正試料に関する正確さおよび精度が許容基準に合致したことが示される。ＭＣＰ−１の場合正確さおよび精度が、ならびにＩＬ−１ｒａに関しては標準曲線の最低濃度の精度のみが許容基準を網羅しなかった。しかしながらこれらの試料はアッセイ作動範囲決定の間に排除される。アッセイ作動範囲はＲＡ血清中の試験される被分析物を網羅するので、結果は全体にわたって満足できるものである。
バリデーション結果により、９６ウェルプレートの抗体マイクロアレイが決定されたアッセイ作動範囲内で正確であり、精密であり、そして再現性があることが実証される。
【０１２６】
実施例４
抗体マイクロアレイおよびＥＬＩＳＡテクノロジーの比較
ＥＬＩＳＡは血清試料中のタンパク質を分析するための標準的な方法である。実施するのが容易であり、そして特異的な方法であるので、ＥＬＩＳＡは過去１０年間にわたり臨床および微生物学研究における血清サイトカインの検出のために広く用いられている（Klimiuk et al. （２００２）；Lloyd et al., Ann.Rheum.Dis. ６１（９）：８０４−８０９（１９９１）； Mangge et al., Arthritis Rheum. ３８（２）：２１１−２２０（１９９５））。このセクションでは、前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイをＥＬＩＳＡテクノロジーと比較する。双方のテクノロジーを用いて３５個のＲＡ試料、１４個のリウマチ性疾患試料および２６個の対照ヒト血清でＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαレベルを測定した。続いて双方の方法で得られた結果を線形回帰分析を用いて比較した。
【０１２７】
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関する多重アッセイ
前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイでＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度を測定した。
【０１２８】
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関するＥＬＩＳＡアッセイ
マイクロアレイ製造ならびに抗体適合対および組換えタンパク質の各々で用いた同一の試薬でサンドウィッチＥＬＩＳＡを調製した。血清プールを用いて標準曲線および抗体マイクロアレイを生成するために用いたのと同一の濃度点を有するＱＣ試料を調製した（表７および表８）。製造者の指示書に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【０１２９】
スパイクされた試料の調製
組換えＩｌ−１ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαを３、１.５００、０.７５０、０.３７５、０.１８８、０.０９４、０.０４７、０.０２３、０.０１２および０.００６ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト血清プールをスパイクした。サイトカインレベル決定に用いたマイクロアレイおよびＥＬＩＳＡの標準曲線範囲を網羅する様式で濃度を選択した。試料を−８０℃で凍結させた。
【０１３０】
多重アッセイ動作をサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイと比較した。５２個のリウマチ患者血清試料および２６個の無作為ヒト血清を多重アッセイおよびサンドイッチＥＬＩＳＡの双方で検定した。２つの分析群の結果を一緒にプールして７８個の血清の群を作った。ＩＬ−１βアッセイの場合、双方のテクノロジーにより検出できる値の数が小さすぎて回帰分析を実施できなかった。相関性分析を実施するために、ヒト血清プールを１０の異なる濃度の目的の被分析物でスパイクした。スパイクされた試料中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαのレベルをもまた測定した。スパイクされた試料の結果を以前に分析した７８個の血清の結果と共にプールした。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαに関する７８個の全被分析物および１０個のスパイクされた試料の被分析物濃度を線形回帰分析に供した。結果を図６に示す。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦαに関する相関係数（Ｒ２）は各々０.９０、０.６０、０.９３、０.９６、０.９４および０.９５であった。
【０１３１】
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαに関する多重アッセイにより、同一の被分析物に関する個々のＥＬＩＳＡとの非常に良好な相関性が示された。相関係数は各々０.９０、０.９３、０.９６、０.９４および０.９５であった。ＩＬ−１ｒａアッセイに関しては、ＥＬＩＳＡとの相関性は低かった（０.６０）。これはサンドイッチイムノアッセイでしばしば直面する問題により説明でき、そして恐らくアッセイ多重化により増幅され得る。例えばリウマトイド因子または天然発生ヒト異好抗体はしばしば自己免疫性および炎症性疾患に関連し、動物およびヒト免疫グロブリンを認識できる。結果的に偽陽性または陰性結果を生じる（Hennig, Rink, Fagin, Jabs, & Kirchner, J.Immunol.Methods ２３５（１−２）：７１−８０（２０００））。別の理由は可溶性受容体ＩＬ−１ Ｉ型の存在であろう（Arend，Cytokine Growth Factor Rev. １３（４−５）：３２３−３４０（２００２））。多分ＩＬ−１ｒａのその可溶性受容体への結合親和性が多重形式により偏る。それは多重および単一ＥＬＩＳＡで異なる偽の高または低サイトカインレベルを引き起こし得る。
タンパク質マイクロアレイおよびＥＬＩＳＡ間の良好な相関性は、試料あたりいくつかの被分析物をモニタリングするタンパク質マイクロアレイの適用性および高速大量処理スクリーニングツールとしてのその可能性を示している。
【０１３２】
実施例５
リウマチ試料中の参考になる被分析物を評価するための抗体マイクロアレイの適用
多重アッセイを用いてリウマチ様関節炎（ＲＡ）およびその他のリウマチ性疾患と診断された患者からの試料中のＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα血清濃度を測定した。
【０１３３】
対象および試料
研究した試料はＲＡと診断された患者からの３５個の試料ならびに、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、若年性リウマチ様関節炎（ＪＲＡ）、結合組織病（ＣＴＤ）および巨細胞性動脈炎のようなリウマチ性疾患と診断された患者からの１３個の試料からなった。患者の集団の特徴を表１７に示す。
【０１３４】
【表２０】
ＳＤ−標準偏差
ＲＦ−リウマトイド因子
ＤＭＡＲＤ−疾患修飾性抗リウマチ薬
ＮＡ−評価不能
【０１３５】
患者の関節外徴候（骨浸食、皮膚変化、胸膜肺徴候、心臓疾患、レイノー現象、シェーグレン症候群、リウマトイド血管炎、骨粗鬆症および主要関節置換）についての情報もまた収集した。
ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度をさらに前記したようにバリデートされたタンパク質マイクロアレイで測定した。
【０１３６】
一方向分散分析を用いてデータの分析を行った（Kempthorne O １９８３）。ｐ値が５％未満である場合（ｐ＜０.０５）、結果は有意であると考えられた。
測定したＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清レベルを２工程で分析した。最初に６つの被分析物の各々に関する平均値をＲＡおよび非ＲＡ試料に関して計算した。これらのデータにより、２群間の５つの被分析物レベル（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα）に関する差異が示された（表１８）。
【０１３７】
【表２１】
ＳＤ−標準偏差
【０１３８】
分析は３つの患者群の比較を含む：ＲＡ対非ＲＡ、リウマトイド因子（ＲＦ）陽性対陰性、骨浸食陽性対陰性。目的の６つの被分析物の血清レベル、患者の年齢、罹病期間および現在投与されているＤＭＡＲＤの数に関して分析を行った。罹病期間は診断の日付から試料収集の日付までと定義する。
【０１３９】
ＲＡおよび非ＲＡリウマチ患者の比較の結果を表１９に示す。血清中のＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの濃度はＲＡ患者で有意に高かった（各々ｐ＜０.００２２、ｐ＜０.０１０７、ｐ＜０.００２４およびｐ＜０.００５７）。加えて、ＤＭＡＲＤの数もまた調べた患者集団間で有意に異なった（ｐ＜０.００６０）。
【０１４０】
【表２２】
ＲＦ陽性対ＲＦ陰性患者の比較からの結果を表２０に示す。Ｌ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＴＮＦαに関してこの患者の２群間で有意差があった（各々ｐ＜０.０２１０、ｐ＜０.０３２５、ｐ＜０.０１０９）。
【０１４１】
【表２３】
【０１４２】
表２１は浸食を有する患者と浸食を有さない患者間の比較の結果を示す。ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に関してこの２群間で有意差があった（ｐ＜０.０１０５およびｐ＜０.０２２０）。罹病期間（ｐ＜０.０００２）およびＤＭＡＲＤの数（ｐ＜０.００５８）に関して分析した集団間でも差が観察された。
【０１４３】
【表２４】
結果によりＲＡとその他の関節炎患者との間でＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦαの血清濃度で有意差が示された。ＤＭＡＲＤの数もまたこれらの２集団間で異なった。
ＲＦ陽性およびＲＦ陰性患者集団を研究すると、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＴＮＦαのレベルで差が観察された。
最後に骨浸食を有するおよび有さない患者においてＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の測定レベルにおいても差があった。加えて、罹病期間およびＤＭＡＲＤパラメーターの数もまた浸食を有するおよび有さない患者間で区別され得る。浸食は疾患の後期の、さらに進行した段階で、および関節炎のより侵攻性の形態で発現する。
【０１４４】
各々の集団間で測定したレベルで差が観察された被分析物（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα）を、ＲＡに関連すると同定した（Arend, Arthritis Rheum. ４５（１）：１０１−１０６（２００１）； Arend & Gabay, Rheum.Dis.Clin.North Am. ３０（１）：４１−vi （２００４）； Choy & Panayi, N.Engl.J.Med. ３４４（１２）：９０７−９１６（２００１））。さらに、ＩＬ−１ｒａ（Anakira）（Fleischmann et al., Arthritis Rheum. ４８（４）：９２７−９３４（２００３）； Smolen & Steiner, Nat.Rev.Drug Discov. ２（６）：４７３−４８８）およびＴＮＦα阻害剤（エントラセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブ）（Breedveld et al., Ann.Rheum.Dis. ６３（２）：１４９−１５５（２００４）； Lipsky et al., N.Engl.J.Med. ３４３（２２）：１５９４−１６０２（２０００））は生物学的ＤＭＡＲＤ治療に属する。加えて、抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲＡ）を伴う予備研究により、それはＴＮＦαに向けた方法とほぼ同様に有効であることが示唆される（Wendling, Racadot, & Wijdenes, J.Rheumatol. ２０（２）：２５９−２６２（１９９３））。またＭＣＰ−１に対するモノクローナル抗体を用いる可能性のある抗ＭＣＰ−１処置を関節炎モデルで試験した（ラットコラーゲン誘起関節炎（ＣＩＡ））（Ogata et al. , J.Pathol. １８２（１）：１０６−１１４（１９９７））。
【０１４５】
実施例６
統計分析
臨床データおよび多重アッセイのバイオマーカーの濃度（実施例５）を含む生データをさらに統計分析した。リウマトイド対非リウマトイド患者の臨床データの一変量統計比較（バイナリデータに関するカイ二乗検定および連続データに関するスチューデントｔ検定）の結果以下のｐ値が得られた：センター（ｐ＝０.００６）、性別（ｐ＝０.２３）、ＲＦ（ｐ＝０.００２）、ＭＴＸ前処置（ｐ＝０.００６）、ＮＳＡＩＤ（ｐ＝０.３８）、浸食（ｐ＝０.０００６）、関節外（ｐ＝０.５４）、抗ＴＮＦ−アルファ処置（ｐ＝０.６２）、ＤＭＡＲＤ（ｐ＝０.０００１）、年齢（ｐ＝０.５７）、および診断からの期間（ｐ＝０.９３）。
【０１４６】
リウマトイド対非リウマトイド患者の被分析物濃度に適用したスチューデントｔ検定により以下のｐ値が作成された：ＩＬ−１ベータ（ｐ値＝０.４７）；ＩＬ−１ｒａ（ｐ値＝０.０２）；ＩＬ−６（ｐ値＝０.００７）；ＩＬ−８（ｐ値＝０.２３）；ＭＣＰ−１（ｐ値＝０.００５）；およびＴＮＦ−アルファ（ｐ値＝０.０２）。
【０１４７】
クロスバリデーションおよび応答順列のバリデーションを含む部分最小二乗法−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋Ｖｅｒｓ １０.５）による多変量統計分析を実施した。別個の予測モデルを臨床データのみ（施設、性別、年齢および診断からの期間を含まない）、被分析物データのみ、および双方のパラメーターのセットのいくつかの組み合わせに適用した。異なるモデルの予測力をインプット変数（Ｒ２Ｘ）および応答変数（Ｒ２Ｙ）の被説明分散、ならびにクロスバリデーションによりモデルにより予測され得る応答の全変動の分画（Ｑ２）に対して測定した。加えて、モデルの予測スコアにスチューデントｔ検定を適用した。異なるモデルのランキングはＱ２に基づいた。分析の結果を表２２に表す。
【０１４８】
【表２５】
Ｒ２Ｘ：モデルにより説明される予測パラメーターの分散の比率
Ｒ２Ｙ：モデルにより説明される応答変数の分散の比率
Ｑ２：クロスバリデーションに基づくモデルの予測力
スコアｔ検定：双方の群の予測スコアの統計比較（スチューデントｔ検定、両側、不等分散）
【０１４９】
略語一覧
Ａｂ 抗体
ＢＣＡ バイオチップアレイヤー
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｂ インターロイキン−１ベータ
ＩＬ−１Ｒａ；ＩＬ−１ｒａ ＩＬ−１受容体アンタゴニスト
ＩＬ−６ インターロイキン−６
ＩＬ−８ インターロイキン−８
ＭＣＰ−１ マクロファージ走化性タンパク質−１
ＯＤＰ オクタデシルリン酸エステル
ＲＡ リウマチ様関節炎
ＲＦ リウマトイド因子
ＳＡＭ 自己組織化単分子膜
ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦα、ＴＮＦ−ａ 腫瘍壊死因子−アルファ
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】コーティング溶液へのグリセロールの添加の結果を示す。
【図２】コーティング抗体力価。種々の濃度のコーティングＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８抗体をプリントした（左から右にバックグラウンド、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）。最良のシグナル対ノイズ比は全被分析物に関してコーティング抗体２００μｇ／ｍｌで測定した。
【図３】種々の濃度のビオチン化抗体を用いてアッセイを実施した（抗体；左から右に：６２.５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌビオチン化抗体）。最良のシグナル対ノイズ比は各被分析物に関してビオチン化抗体５００ｎｇ／ｍｌの濃度で作成された。示したシグナル対ノイズ比はＩＬ−８アッセイに関して作成された。
【図４】２工程および同時インキュベーションプロトコールで実施したアッセイに関する代表的なＩＬ−６標準曲線。丸はＩＬ−６ １工程プロトコールを表し、四角はＩＬ−６ ２工程プロトコールを表す。得られた結果により、１工程プロトコールがアッセイ感度を改善できることが示される。
【図５】ノンパララックストレイ装置で作成された画像。３つの異なる画像様式を比較する：高（左）、標準（中）および高分解能様式（右）。
【図６】抗体アレイおよびＥＬＩＳＡ手順の相関性。７８個の血清および１０個のスパイクされた試料中のサイトカインを抗体マイクロアレイまたはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて並行して定量した。これらの２つの分析からのデータを互いに対してプロットし、そして線形回帰分析により相関係数を決定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む該対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があるかどうかを決定するための方法。
【請求項２】
対照試料に相対して対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の増加が、対象がＲＡを有するかまたは発症する可能性があることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；
ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；
ｃ）工程ｂの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ここで工程ａ）で測定される量に相対して工程ｂ）で測定される少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化によりＲＡを予防するかまたは低減させる可能性を有する被験物質が同定される；
を含む対象におけるＲＡを予防するかまたは低減させる可能性がある被験物質を同定する方法。
【請求項４】
工程ａ）で決定された少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較する場合、工程ｃ）で少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下が、被験物質がＲＡを予防するかまたは低減させる可能性があることを示す請求項３に記載の方法。
【請求項５】
処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで生物学的試料中の類似の量は処置が有効でないことを示し、そして処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化は処置が有効であることを示すＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法。
【請求項６】
該処置を開始する前に対象から得られた生物学的試料中において決定された量に相対して該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下は処置が有効であることを示している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
処置が疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の投与を含む請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
生物学的試料が全血、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側塗抹標本、皮膚、および特定の器官組織の生検からなる群から選択される請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２つのバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡの各々を少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドと接触させることによりｍＲＮＡの量を決定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
質量分析を用いることにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つのバイオマーカータンパク質に特異的に結合する試薬を用いることにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試薬が抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試薬がモノクローナル抗体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つのバイオマーカーの量の決定が競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、ドットブロッティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のような蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノＰＣＲイムノアッセイ、プロテインＡまたはプロテインＧイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイからなる群から選択される少なくとも１つの直接的または間接的イムノアッセイを含む請求項８または１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
配列特異的オリゴヌクレオチドまたは少なくとも２つの試薬が固体支持体に固定されている請求項１０または１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
固体支持体がポリスチレン表面を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＮＦ−アルファの量ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＣＰ−１の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１ｒａの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬ−８の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−６の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１ベータの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６、２９または３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６、２９、３０または３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６の量を決定する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
１つの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含むリウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物。
【請求項４２】
検出剤がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
検出剤がＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
検出剤がＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
検出剤がＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
該少なくとも１つのさらなる手段がＩＬ−６に特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
該少なくとも１つのさらなる手段がＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
該少なくとも１つのさらなる手段がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
検出剤がＩＬ−８に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５０】
検出剤がＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５１】
該少なくとも１つのさらなる手段がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
該少なくとも１つのさらなる手段がＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
検出剤がＩＬ−１ベータに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５４】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０または５３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも３つの異なる手段がＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０、５３または５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
少なくとも４つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する請求項５６に記載の組成物。
【請求項６１】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも５つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０、５３、５４または５９のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも５つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６に特異的に結合する請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５または６つのバイオマーカーに特異的に結合する最大４、５または６つの異なる手段を含む請求項４１から６２のいずれかに記載の組成物。
【請求項６４】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドを含む請求項４１から６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項４１から６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６６】
手段がモノクローナル抗体を含む請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が固体支持体に固定されている請求項４１から６６のいずれかに記載の組成物。
【請求項６８】
固体支持体がポリスチレン表面を含む請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
少なくとも２つの異なる抗体のような少なくとも２つの検出剤を９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットするかまたは固定する請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する抗体を２検体ずつ、３検体ずつ、または４検体ずつで９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットするかまたは固定する請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
請求項４１から７０のいずれかに記載の組成物および使用のための指示書を含む診断または薬物発見キット。
【請求項７２】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合することができる標識抗体の混合物をさらに含む請求項７１に記載の診断または薬物発見キット。
【請求項７３】
請求項１から４０に記載の方法のいずれかにおける診断または薬物発見キットの使用。
【請求項１】
対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定することを含む該対象がリウマチ様関節炎（ＲＡ）を有するかまたは発症する可能性があるかどうかを決定するための方法。
【請求項２】
対照試料に相対して対象から得られた試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の増加が、対象がＲＡを有するかまたは発症する可能性があることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）該対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；
ｂ）生物学的試料を被験物質と接触させること；
ｃ）工程ｂの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定すること；ここで工程ａ）で測定される量に相対して工程ｂ）で測定される少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化によりＲＡを予防するかまたは低減させる可能性を有する被験物質が同定される；
を含む対象におけるＲＡを予防するかまたは低減させる可能性がある被験物質を同定する方法。
【請求項４】
工程ａ）で決定された少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較する場合、工程ｃ）で少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下が、被験物質がＲＡを予防するかまたは低減させる可能性があることを示す請求項３に記載の方法。
【請求項５】
処置を開始する前にＲＡを患う対象から得られた生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を、処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の該少なくとも２つのバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで生物学的試料中の類似の量は処置が有効でないことを示し、そして処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の変化は処置が有効であることを示すＲＡに対する処置の有効性を追跡調査するための方法。
【請求項６】
該処置を開始する前に対象から得られた生物学的試料中において決定された量に相対して該処置を開始した後に該対象から得られた生物学的試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの量の低下は処置が有効であることを示している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
処置が疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の投与を含む請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
生物学的試料が全血、血清、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、頬側塗抹標本、皮膚、および特定の器官組織の生検からなる群から選択される請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２つのバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡの各々を少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドと接触させることによりｍＲＮＡの量を決定する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
質量分析を用いることにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つのバイオマーカータンパク質に特異的に結合する試薬を用いることにより少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試薬が抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試薬がモノクローナル抗体である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つのバイオマーカーの量の決定が競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、ゲル拡散免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、ドットブロッティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のような蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノＰＣＲイムノアッセイ、プロテインＡまたはプロテインＧイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイからなる群から選択される少なくとも１つの直接的または間接的イムノアッセイを含む請求項８または１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
配列特異的オリゴヌクレオチドまたは少なくとも２つの試薬が固体支持体に固定されている請求項１０または１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
固体支持体がポリスチレン表面を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＮＦ−アルファの量ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＭＣＰ−１の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１ｒａの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１ｒａおよびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬ−８の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−６の量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファの量を決定する請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１ベータの量ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６または２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１の量を決定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６、２９または３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６の量を決定する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーの量を決定する請求項１から１７、１８、１９、２１，２５、２６、２９、３０または３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６の量を決定する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
１つの生物学的試料中のＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を同時に決定する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの量を決定するための少なくとも２つの検出剤を含むリウマチ様関節炎（ＲＡ）の予測、診断または予後診断のための組成物。
【請求項４２】
検出剤がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
検出剤がＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
検出剤がＭＣＰ−１に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
検出剤がＩＬ−１ｒａに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
該少なくとも１つのさらなる手段がＩＬ−６に特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
該少なくとも１つのさらなる手段がＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
該少なくとも１つのさらなる手段がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
検出剤がＩＬ−８に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５０】
検出剤がＩＬ−６に特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５１】
該少なくとも１つのさらなる手段がＴＮＦ−アルファに特異的に結合する請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
該少なくとも１つのさらなる手段がＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
検出剤がＩＬ−１ベータに特異的に結合する少なくとも１つの手段ならびにＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つのさらなる手段を含む請求項４１に記載の組成物。
【請求項５４】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも３つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０または５３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ｒａおよびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも３つの異なる手段がＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
少なくとも３つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６およびＭＣＰ−１に特異的に結合する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも４つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０、５３または５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
少なくとも４つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する請求項５６に記載の組成物。
【請求項６１】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される少なくとも５つのバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも５つの異なる手段を含む請求項４１から４３、４５、４９、５０、５３、５４または５９のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも５つの異なる手段がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８およびＩＬ−６に特異的に結合する請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
検出剤がＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータからなる群から選択される最大４、５または６つのバイオマーカーに特異的に結合する最大４、５または６つの異なる手段を含む請求項４１から６２のいずれかに記載の組成物。
【請求項６４】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡに特異的に結合することができる少なくとも１つの配列特異的オリゴヌクレオチドを含む請求項４１から６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項４１から６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６６】
手段がモノクローナル抗体を含む請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
バイオマーカーに特異的に結合する手段が固体支持体に固定されている請求項４１から６６のいずれかに記載の組成物。
【請求項６８】
固体支持体がポリスチレン表面を含む請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
少なくとも２つの異なる抗体のような少なくとも２つの検出剤を９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットするかまたは固定する請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−６に特異的に結合する抗体を２検体ずつ、３検体ずつ、または４検体ずつで９６ウェルプレートの１つのウェル内にスポットするかまたは固定する請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
請求項４１から７０のいずれかに記載の組成物および使用のための指示書を含む診断または薬物発見キット。
【請求項７２】
ＴＮＦ−アルファ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびＩＬ−１ベータならびにＲＦからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに特異的に結合することができる標識抗体の混合物をさらに含む請求項７１に記載の診断または薬物発見キット。
【請求項７３】
請求項１から４０に記載の方法のいずれかにおける診断または薬物発見キットの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０７６８６（Ｐ２００８−５０７６８６Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２１９１４（Ｐ２００７−５２１９１４）
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８０４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８１８３
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８０４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８１８３
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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