リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合タンパク質
【課題】 新規リガンド(配位子)結合分子および受容体、並びに、リガンド結合分子の循環血漿半減期を改善する組成物および方法を提供する。
【解決手段】 免疫グロブリン軽鎖を有さない免疫グロブリン重鎖二量体を含むポリペプチドであって、受容体、担体タンパク質、ホルモン、成長因子、酵素または栄養物質であって、リンパ球誘導受容体、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素、それに相同なタンパク質、または分離した遺伝子によってコードされている複数サブユニットポリペプチドではないリガンド結合パートナーのアミノ酸配列が少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖の可変領域を置換しており、その結合パートナーがＣ末端で免疫グロブリン定常領域のアミノ酸配列に融合し、結合特性を保持している、ポリペプチド。
【解決手段】 免疫グロブリン軽鎖を有さない免疫グロブリン重鎖二量体を含むポリペプチドであって、受容体、担体タンパク質、ホルモン、成長因子、酵素または栄養物質であって、リンパ球誘導受容体、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素、それに相同なタンパク質、または分離した遺伝子によってコードされている複数サブユニットポリペプチドではないリガンド結合パートナーのアミノ酸配列が少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖の可変領域を置換しており、その結合パートナーがＣ末端で免疫グロブリン定常領域のアミノ酸配列に融合し、結合特性を保持している、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規リガンド(配位子)結合分子および受容体、並びに、リガンド結合分子の循環血漿半減期を改善する組成物および方法に関する。具体的には、本発明はハイブリッド(雑種)免疫グロブリン分子、これらの免疫グロブリン類の製造法および使用法、並びに、これらをコードする核酸に関する。
【０００２】
免疫グロブリンはジスルフィド結合で互いに結合し合ったポリペプチド鎖を含有する分子であり、典型的には２つの軽鎖と２つの重鎖を有する。各鎖の１ドメイン(領域)(Ｖ)は、その分子の抗体特異性に依存する可変アミノ酸配列を有する。もう１つのドメイン(Ｃ)は、同じクラスの分子に共通のかなり定常的な配列を有する。これらのドメインはそのアミノ末端から順番に番号が付与される。
【０００３】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー(上科)は免疫グロブリン様ドメインを伴う分子から構成されている。このファミリーの構成要素には、クラスＩおよびクラスII主要組織適合性抗原、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、γおよびδ鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよびε鎖、ＯＸ-２、Ｔｈｙ-１、細胞間または神経細胞接着性分子(Ｉ-ＣＡＭまたはＮ-ＣＡＭ)、リンパ球機能付随抗原-３(ＬＦＡ-３)、神経細胞質タンパク質(ＮＣＰ-３)、ポリ-Ｉｇ受容体、ミエリン結合糖タンパク質(ＭＡＧ)、高親和性ＩｇＥ受容体、抹消ミエリンの主要糖タンパク質(Ｐｏ)、血小板由来成長因子受容体、コロニー刺激因子-１受容体、マクロファージＦｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体およびガン胎児性抗原が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
ある免疫グロブリンの可変ドメイン(超可変領域を含む)で別の免疫グロブリンを置換できること、またある種の免疫グロブリンの可変ドメインを異なる種に置換できることが知られている。例えばＥＰ０ １７３ ４９４；ＥＰ０ １２５ ０２３；Munro,Nature 312:(1984年12月13日)；Neuberger等,Nature 312(1984年12月13日)；Sharon等,Nature 309:(1984年5月24日)；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)；Boulianne等,Nature 312:643-646(1984年12月13日)などを参照のこと。
【０００５】
Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)は、ある種から得た免疫グロブリン定常領域に融合した別の種由来の可変領域を有する免疫グロブリン・キメラの調製を教示している。この文献は非免疫グロブリン配列(例えば酵素配列)と融合した免疫グロブリン配列を有する分子を示唆しているが、この文献は非免疫グロブリン配列に結合した免疫グロブリン可変ドメインのみを教示している。Morrison等のＥＰ０ １７３ ４９４は同様のキメラを教示している。この著者等は“受容体”という用語を使用し、その“背景”の項で、“免疫グロブリン、酵素および膜タンパク質などの受容体”に言及しているが、彼らの述べた“興味ある受容体”には“Ｂ細胞およびＴ細胞受容体、より具体的には免疫グロブリン(例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、並びに、個々の群の種々のサブタイプ)”が含まれる(３頁１０〜１３行）。この文献の開示は免疫グロブリンキメラに限定されている(例えば３頁２１〜３０行を参照のこと)。
【０００６】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの２構成要素(ＣＤ４およびそのＴ細胞受容体)由来の免疫グロブリン可変様ドメインで、ある免疫グロブリンの可変ドメインを置換し得ることも知られている(例えばCapon等,Nature 337:525-531(1989)；Traunecker等,Nature 339:68-70(1989)；Gascoigne等,Proc.Nat.Acad.Sci.84:2936-2940(1987)；公開された欧州出願ＥＰＯ 0 325 224 A2などを参照のこと)。
【０００７】
多数のタンパク質性物質が、標的分子に特異的に結合することによって機能することがわかっている。これらの標的分子は一般的にはタンパク質であるが、タンパク質であるとは限らない。標的分子またはリガンドに結合する物質を、本明細書ではリガンド結合パートナー(配位子結合相手)と呼び、これには受容体および担体タンパク質、並びに、ホルモン、細胞接着性タンパク質、組織特異的接着因子、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。
【０００８】
リンパ球は特定の組織に標的を定められた細胞の例である。リンパ球は正常組織炎症、並びに、リウマチ様関節炎および他の自己免疫疾患で起こるような病的組織損傷のメディエーター(媒介体)である。脊椎動物は、その生物の空間的に異なる領域に対して異なった抗原特異性を有するリンパ球を分配する機構を進化させてきた(Butcher,E.C.,Curr.Top.Micro.Immunol.128:85(1986)；Gallatin,W.M.等,Cell 44:673(1986)；Woodruff,J.J.等,Ann.Rev.Immunol.5:201(1987)；Duijvestijn,A.等,Immunol.Today 10:23(1989);Yednock,T.A.等,Adv.Immunol.印刷中(1989)。
【０００９】
この機構には、血液とリンパ様器官との間のリンパ球の連続的再循環が含まれている。リンパ球が最も高い移動度を持つ血液と、隔離され加工された抗原にリンパ球が出会うリンパ様器官との間のリンパ球の移動は、リンパ球表面上の受容体と特殊化した毛細管後の細静脈(例えば高内皮細静脈(ＨＥＶ)および慢性的炎症滑膜中に誘発されるＨＥＶ様血管)の内皮細胞上のリガンドとの接着性相互作用によって始まる。
【００１０】
リンパ球接着分子は、これらの細胞を特定の２次的リンパ様器官に局在化させる、もしくは“誘導（home）”することができるので、特に誘導(ホーミング)受容体と呼ばれている。
【００１１】
リンパ球誘導受容体の候補は、マウス、ラットおよびヒトで既に同定されている(Gallatin,W.M.等,Nature 303:30(1983)；Rasmussen,R.A.等,J.Immunol.135:19(1985)；Chin,Y.H.等,J.Immunol.136:2556(1986)；Jalkanen,S.等,Eur.J.Immunol.10:1195(1986))。次に記載する文献は、ネズミ型とされるリンパ球表面タンパク質に対するMel１４と呼ばれるモノクローナル抗体を用いてこの分野で行われた研究について記述している：Gallatin,W.M.等,前掲；Mountz,J.D.等,J.Immunol.140:2943(1988)；Lewinsohn,D.M.等,J.Immunol.138:4313(1987)；Siegelman,M.等,Science 231:823(1986)；St.John,T.等,Science 231:845(1986)。
【００１２】
免疫沈降実験によって、この抗体がリンパ球上の拡散した〜９００００ダルトンの細胞表面タンパク質(Gallatin,W.M.等,前掲)および好中球上の〜１０００００ダルトンのタンパク質(Lewinsohn,D.M.等,前掲)を認識することが示されている。
【００１３】
Mel１４抗体によって限定される糖タンパク質の放射活性標識アミノ酸配列決定によって同定された、リンパ球誘導受容体とされる受容体の部分的配列(１３残基)がSiegelman等によって開示されている(Siegelman,M.等,Science 231:823(1986))。
【００１４】
レクチンは炭水化物結合ドメインを有するタンパク質であり、ヒト、フジツボおよびニクバエを含む種々の動物中に認められる。細胞接着におけるレクチン作用の概念は、ある種のウイルスおよび細菌と真核宿主細胞との相互作用によって例示される(Paulson,J.C.,The Receptors,第2巻,P.M.Conn等共編(Academic Press,NY,1985),131頁；Sharon,N.,FEBS Lett.217:145(1987))。真核細胞-細胞相互作用において、種々の系中の内因性レクチンに関して接着性機能が推測されており(Grabel,L.等,Cell 17:477(1979)；Fenderson,B.等,J.Exp.Med.160:1591(1984)；Kunemund,V.,J.Cell Biol.106:213(1988)；Bischoff,R.,J.Cell Biol.102:2273(1986)；Crocker,P.R.等,J.Exp.Med.164:1862(1986))、これには無脊椎動物(Glabe,C.G.等,J.Cell.Biol.94:123(1982)；DeAngelis,P.等,J.Biol.Chem.262:13946(1987))および脊椎動物受精(Bleil,J.D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.85:6778(1988)；Lopez,L.C.等,J.Cell.Biol.101:1501(1985))が含まれる。特異的細胞認識を達成する手段としてタンパク質-糖相互作用を使用することはよく知られているようである。
【００１５】
リンパ球とそのリガンドとの接着性相互作用にレクチンが関与していることを文献は示唆している(Rosen,S.D.等,Science 228:1005(1985)；Rosen,S.D.等,J.Immunol.印刷中(1989)；Stoolman,L.M.等,J.Cell Biol.96:722(1983)；Stoolman,L.M.等,J.Cell Biol.99:1535(1984)；Yednock,T.A.等,J.Cell Bio.104:725(1987)；Stoolman,L.M.等,Blood 70:1842(1987)；Brandley,B.K.等,J.Cell Biol.105:991(1987)による関連する方法；Yednock,T.A.等,準備中；Yednock,T.A.等,J.Cell Biol.104:725(1987))。
【００１６】
ヒトのリンパ球誘導に関与するであろう表面糖タンパク質の特徴が、一般にヘルメス(Hermes)と呼ばれる一連のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて研究された。免疫細胞型および非免疫細胞型の多数に認められ、抗体プレクリーニング実験によってMel１４抗原に関係すると思われる〜９００００ダルトンの表面糖タンパク質を、これらの抗体が認識した(Jalkanen,S.等,Ann.Rev.Med.38:467-476(1987)；Jalkanen,S.等,Blood,66(3):577-582(1985)；Jalkanen,S.等,J.Cell Biol.105:983-990(1987)；Jalkanen,S.等,Eur.J.Immunol.18:1195-1202(1986))。
【００１７】
表皮成長因子様ドメインは、成長因子、細胞表面受容体、発生遺伝子産物、細胞外マトリックス・タンパク質、血液凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子および補体を含む広範囲にわたるタンパク質に認められている(Doolittle,R.F.等,CSH Symp.51:447(1986))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
リンパ球細胞表面糖タンパク質(以下、“ＬＨＲ”と記述する)がリンパ様組織の内皮に対するリンパ球の結合を媒介することが特徴づけられてる。ヒトおよびネズミのＬＨＲ(それぞれＨｕＬＨＲおよびＭＬＨＲ)をコードする全長ｃＤＮＡクローンおよびＤＮＡは同定され、単離されており、さらにこのＤＮＡは組換え宿主細胞によって容易に発現する。ヒトＬＨＲ(ＨｕＬＨＲ)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１〜３に示す。ネズミＬＨＲ(ＭＬＨＲ)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図４〜６に示す。変異アミノ酸配列もしくは天然には認められないグリコシル化を有するＬＨＲ、並びに、増大した特異的活性や改善された血漿半減期を含む改善された特性を有するＬＨＲの他の誘導体、並びに、このような変異体の調製を可能にする方法をも提供する。
【００１９】
本明細書に、ＬＨＲが次のタンパク質ドメイン：シグナル配列、炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子様(ｅｇｆ)ドメイン、少なくとも１つ、好ましくは２つの補体結合ドメイン反復、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)、および荷電細胞内または細胞質ドメイン、を含有する糖タンパク質であることを示す。本発明のＬＨＲは、これらのドメインの少なくとも１つを含有するが、すべてを含有する必要はない。
【００２０】
リガンド-結合パートナー相互作用に関する多くの先天性異常の治療用薬剤の開発において成功した方法は、リガンドと結合パートナーとの相互作用または結合を遮断するアンタゴニスト(拮抗薬)の同定であった。１つの方法は、外来性結合パートナーを天然の結合パートナーの競争的アンタゴニストとして使用することである。しかし多くのリガンド結合パートナーは、細胞の脂質二重膜に固定された細胞膜タンパク質である。膜成分の存在は典型的には製造および精製の観点から望ましくない。さらに、これらの分子は通常は細胞表面上のみに存在するので、循環中でより安定な形態でこれらを生産することが望ましいであろう。また、先端の欠失したリガンド結合パートナーや可溶性リガンド結合パートナーでも、生体内血漿半減期が比較的短く、胎盤または他の生物学的障壁を通過しないであろうし、またエフェクター機能を送達せず単にそのリガンド認識部位を隔離するだけでは治療的目的には不適切であろうから、治療薬として最適な効果を示さないであろう。
【００２１】
したがって本発明の目的は、免疫グロブリン・ドメインや血漿タンパク質など、リガンド結合パートナーの生体内血漿半減期を長時間持続させ、またプロテインＡによる精製を容易にするよう機能する部分に融合したリガンド結合パートナーを生産することにある。さらなる目的は、リガンド結合パートナーの接着性および標的選択特性と、補体結合や細胞受容体結合などの免疫グロブリン・エフェクター機能とを合わせ持つハイブリッド免疫グロブリン分子を提供することにある。さらに別の目的は、治療的に使用するため、あるいはリガンド結合パートナーまたはその標的のインビトロ(試験管内)検定のための診断用試薬として使用するために、上述のような新規機能性を伴う分子を提供することにある。もう１つの目的は、多数のリガンド結合パートナー(そのそれぞれは同じであっても、異なっていてもよい)を会合させることによって、複数のリガンドを結合および／または活性化し得るようになる多機能性分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
具体的には、１つの目的は、毒素、細胞表面パートナー、酵素、栄養物質、成長因子、ホルモン、もしくは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー構成要素の定常ドメイン様部分などのエフェクター分子などのリガンド結合パートナーを、そのリガンド結合パートナーのためのリガンドを保持する細胞に向かわせるための分子、およびリガンド結合パートナーの精製を容易にする際に使用するための分子を製造することにある。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、治療的部分を特定の組織およびリガンドに対して誘導する際に使用するリガンド結合パートナー-免疫グロブリン・ハイブリッド・ヘテロ多量体、特にヘテロ二量体およびヘテロ四量体を提供することにある。例えば、ＣＤ４-ＩｇＧをヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などのウイルスに感染した組織に誘導するために、ＬＨＲ-ＩｇＧ鎖１本およびＣＤ４-ＩｇＧ鎖１本から構成されるハイブリッド免疫グロブリンを使用することができる。同様に、毒素を目的の組織に送達するために、毒素-血漿タンパク質部分と組み合わされたリガンド結合パートナー-血漿タンパク質部分を有する分子を使用する。
【００２４】
もう１つの目的は、これらの分子を組換え細胞培養中で発現させる方法を提供することである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規なポリペプチド、それらの作製方法、およびそれらをコードする核酸が提供される。これらのポリペプチドは、細胞表面接着分子およびリガンドとして有用であり、治療または診断用組成物および方法において有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の目的は、リガンド結合パートナーとの融合物として存在するときにリガンド結合パートナーの生体内血漿半減期を延ばすことができる安定な血漿タンパク質、特に免疫グロブリン定常ドメイン、に融合したリガンド結合パートナーからなる新規ポリペプチドを提供することによって達成される。また、このポリペプチドをコードするＤＮＡ、このポリペプチドを製造するための培養物および方法をも提供する。
【００２７】
安定血漿タンパク質が、同じポリペプチド鎖あるいは異なるポリペプチド鎖が通常はジスルフィド結合および／または非共有結合で結合することによって集合した複数鎖ポリペプチドを形成しており、通常は多量体型で存在する多くの場合(例えば、免疫グロブリンまたはリポタンパク質)には、リガンド結合パートナーを含有する本発明の融合物もまた、安定血漿タンパク質前駆体と本質的に同じ構造を有する多量体として生産され使用されるであろう。これらの多量体は、それが含有するリガンド結合パートナーに関して均一であり得るし、あるいは複数のリガンド結合パートナーを含有することも有り得る。さらにこれらの多量体は１または複数のリガンド結合パートナー部分を含有し得る。
【００２８】
安定血漿タンパク質が免疫グロブリン鎖である好ましい態様として、リガンド結合パートナーを少なくとも１本の鎖中に置換し、また普通はリガンド結合パートナーで免疫グロブリンの可変領域またはその適切な断片を置換する。しかし、本発明が免疫グロブリンの複数の鎖中に同じ、もしくは異なるリガンド結合パートナーが置換された融合物をも包含することは理解されるであろう。複数のリガンド結合パートナーが互いに異なる場合、集合した最終的な複数鎖ポリペプチドは、天然の可変領域を有する多機能抗体では不可能な様式でリガンドを架橋することができる。
【００２９】
この種類に属する特定の複数鎖融合物は、１本の免疫グロブリン鎖の可変領域がＣＤ４などの一次受容体のリガンド結合領域によって置換されており、一方、もう１つの免疫グロブリン鎖の可変領域がＬＨＲの結合機能性によって置換されており、その両免疫グロブリン鎖が本質的に通常の様式で互いに結合し合っているものである。
【００３０】
ペプチド結合もしくは試験管内で生成する結合を通して追加の治療的部分、例えばポリペプチド毒素、診断用標識、あるいは他の機能性など、に結合させることにより、本発明の融合物をさらに修飾することができる。
【００３１】
本発明の融合物の製造は、その融合物をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、その宿主細胞を培養し、その培養から融合物を回収することによって行う。本発明の融合物をコードするベクターおよび核酸、並びに、それらを含有する治療用および診断用組成物をも提供する。
【００３２】
本発明は、そのある側面として、ＬＨＲ自体に関する。本発明のＬＨＲは、図１〜３および図４〜６に記載のアミノ酸配列を有する全長成熟ＬＨＲ、および天然に存在する対立遺伝子、試験管内で誘導体化することによって製造した共有結合的誘導体、あるいはそれらの予め決定されたアミノ酸配列変種もしくはグリコシル化変種である。
【００３３】
本発明が提供する新規組成物は精製され、抗ウイルス療法、神経変調療法、あるいは免疫変調療法を必要とする患者に投与するための薬学的に許容される担体中に製剤化され、細胞接着の変調に使用される。本発明は、受容体媒介性の異常を有する患者の治療に特に有用である。さらに本発明が提供する組成物は、その安定血漿タンパク質成分に結合し得る抗体または他の物質を使用することによってその融合物を吸収する、リガンド結合パートナーの組換え細胞培養からの精製の中間体としても有用であり、あるいは、安定血漿タンパク質が間接的標識として働く、リガンド結合パートナーの診断的検定にも有用である。
【００３４】
詳細な説明
本明細書で定義されるリガンド結合パートナーは、標的リガンド分子に特異的に結合するよう機能することが知られているタンパク質であり、その天然状態では一般に分泌ポリペプチドもしくは膜結合ポリペプチドとして存在する。典型的な膜結合型リガンド結合パートナーには疎水性貫膜領域またはリン脂質アンカーが含まれる。リガンド結合パートナーには、受容体、担体タンパク質、ホルモン、細胞接着性タンパク質(ある細胞に対する他の細胞の接着を指示または誘発するタンパク質)、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素でないか、もしくは上記の説明で除外したＣＤ抗原類も適切なリガンド結合パートナーである(Knapp等,Immunology Today 10(8):253-258(1989))。血小板成長因子受容体およびインスリン受容体もリガンド結合パートナーとして選択できる。リガンド結合パートナーには全長天然型のみならず、正常なリガンドに結合する能力の残っている先端が欠失したアミノ酸配列変種またはその他のアミノ酸配列変種も含まれる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語“リガンド結合パートナー”は免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの多形性構成要素および非多形性構成要素、並びに、それに相同のタンパク質(例えばクラスＩおよびクラスII主要組織適合性抗原、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、γおよびδ鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよびε鎖、ＯＸ-２、Ｔｈｙ-１、細胞間または神経細胞接着分子(Ｉ-ＣＡＭまたはＮ-ＣＡＭ)、リンパ球機能付随抗原-３(ＬＦＡ-３)、神経細胞質タンパク質(ＮＣＰ-３)、ポリ-Ｉｇ受容体、ミエリン結合糖タンパク質(ＭＡＧ)、高親和性ＩｇＥ受容体、抹消ミエリンの主要糖タンパク質(Ｐｏ)、血小板由来成長因子受容体、コロニー刺激因子-１受容体、マクロファージＦｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体、ガン胎児性抗原など)を特に除外する。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素に相同という用語は、この除外のみを目的として、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素の配列を有すること、もしくは、このスーパーファミリーの既知の構成要素に対して、上に挙げた特定の例が免疫グロブリン可変または定常ドメインの配列に対して有するアミノ酸配列相同性と同等(もしくはより高度)のアミノ酸配列相同性を有する配列を、その中に含有することを意味する。ただしこの記述は、リガンド結合パートナー融合物がさらに免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素またはその融合物と集合して多量体を形成する態様を排除しないことに注意すること。
【００３６】
また、用語“リガンド結合パートナー”からは、分離した遺伝子(複数サブユニットポリペプチドを導く単一鎖前駆体ポリペプチドをコードしない遺伝子)によってコードされ、そのポリペプチドの少なくとも１サブユニットが通常は細胞膜中に挿入されている複数サブユニット(鎖)ポリペプチド(ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０６９５３(１９９０年６月２８日公開)に例示されている、細胞外マトリックス分子のための細胞受容体(例：インテグリン)を含む)も特に除外される。ただしこの記述は、リガンド結合パートナー融合物がさらに本段落で定義した複数サブユニットポリペプチドまたは複数サブユニット・ポリペプチドの融合物と集合して多量体を形成する態様を排除しないことに注意すること。
【００３７】
安定血漿タンパク質は典型的には約３０〜２０００残基を有し、その天然の環境において循環中の半減期の延長(例えば約２０時間以上)を示すタンパク質である。適切な安定血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンである。典型的には、リガンド結合パートナーを、そのリガンド結合パートナーに増大した半減期を付与し得る血漿タンパク質またはその断片のＮ-末端で、血漿タンパク質に融合する。リガンド結合パートナーは一般にその天然のＣ-末端で血漿タンパク質に融合する。しかし場合により、リガンド結合パートナーの(貫膜領域および細胞質領域が削除された)先端欠失型を、実質的に疎水性ハイドロパシー特性を示す安定タンパク質の一部、典型的には約２０残基以上を有する疎水領域が認められる成熟安定タンパク質の第１部位、に融合する。このような部位はトランスフェリンに存在し、アルブミンおよびアポリポタンパク質にも極めて普遍的であり、その同定に困難は伴わないはずである。次に、リガンド結合パートナーに増大した血漿半減期を付与するのに必要な程度の安定タンパク質の残部を融合物中に組み込む。リガンド結合パートナーの血漿半減期の増大が約１００％以上なら満足のゆく結果である。
【００３８】
いくつかの好ましい態様として、結合パートナーをＬＨＲとする。ＬＨＲは、図１〜３または図４〜６のＬＨＲと同様の定性的生物活性を有するポリペプチドと定義され、好ましくは図１〜３または図４〜６のＬＨＲの炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子ドメイン、もしくは炭水化物結合ドメインと約７０％以上相同なドメインを含有する。
【００３９】
本明細書では、ＬＨＲに関する相同性を、配列を並べ、必要ならば最大相同性率を達成するために間隙を導入した後に、図１〜３または図４〜６中の炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子ドメイン、または補体結合ドメイン中の残基と同一である候補配列中の残基の百分率と定義する。
【００４０】
本明細書で使用する用語としてのＬＨＲの範囲には、図１〜３または図４〜６に記載したＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲのアミノ酸配列を有するＬＨＲ、図１〜３または図４〜６のＬＨＲと同様の生物活性を示し得る脱グリコシル化ＬＨＲ誘導体または非グリコシル化ＬＨＲ誘導体、図１〜３または図４〜６の配列の相同アミノ酸配列変種、および試験管内で生成したＬＨＲの相同変種および誘導体が含まれる。
【００４１】
ＬＨＲまたはＬＨＲ断片の生物活性を、１）ＬＨＲの少なくとも１つのエピトープと免疫学的に交差反応するか、もしくは２）ＬＨＲと質的に同等の少なくとも１つの接着性機能、調節機能またはエフェクター機能を有することと定義する。
【００４２】
ＬＨＲの定性的生物活性の一例は、リンパ様組織の特殊化した高内皮細胞上のリガンドに対する結合である。また、リガンド結合にはしばしばカルシウムなどの二価カチオンが必要である。
【００４３】
免疫学的に交差反応性という用語は、本明細書では、候補ポリペプチドが、既知の活性類縁体に対して生じたポリクローナル抗血清とのこの活性を有するＬＨＲの定性的生物活性を競争的に阻害し得ることを意味する。このような抗血清は、完全フロインドアジュバント中の既知の活性類縁体をヤギまたはウサギに例えば皮下注射した後、追加免疫を不完全フロインドで腹腔内注射または皮下注射することによる常法で調製される。
【００４４】
構造的には、図７〜８に示したようにＬＨＲには数個のドメインが含まれ、これらは次のように同定される(±１０残基以内)：シグナル配列(残基２０〜３２)、これに続く炭水化物結合ドメイン(図７〜８では“レクチン”ドメインと同定されている)(残基３９〜１５５)、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメイン(残基１６０〜１９３)、補体因子結合ドメイン(残基１９７〜３１７)、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)(残基３３３〜３５５)および細胞質ドメイン(残基３５６〜３７２)。ＬＨＲ細胞外ドメインの境界は一般に貫膜ドメインのＮ-末端もしくはその約３０残基以内にあり、ＬＨＲ配列を精査することによって容易に同定できる。これらのドメインはいずれも、あるいはすべて本発明の実施に使用できる。
【００４５】
図１１〜１３は、これらのドメインの３つに対していくらかの相同性を有する種々のタンパク質を示している。図１１は、炭水化物結合ドメインを示し、図１２は表皮成長因子ドメインを示し、図１３はいくらか相同な補体結合ドメインを示している。
【００４６】
図７〜８に掲載したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列の比較は、全体の配列相同性が高度(〜８３％)であることを示している。しかし、ＨｕＬＨＲとＭＬＨＲに認められる種々のドメイン間の相同性の程度は様々である。例えばＭＬＨＲとＨｕＬＨＲの間の配列保存度は、炭水化物結合ドメインおよびｅｇｆドメインの両者では約８３％であるのに対して、第１補体結合反復中の保存度は７９％に減少し、第２反復では６３％しかなく、補体結合ドメイン全体の相同性は約７１％である。さらに、ＭＬＨＲの２つの補体結合ドメイン反復は同一であるのに対し、ＨｕＬＨＲでは相違が認められ、ネズミの反復とも異なっている。興味深いことに、貫膜配列および周辺領域におけるこれらの２つの受容体間の保存度はほぼ同一であり、おそらく貫膜アンカー領域内に保存的疎水性置換が１つあるだけである。
【００４７】
一般にヘルメスと呼ばれる一連のモノクローナルおよびポリクローナル抗体によって認識される上述の表面糖タンパク質は、本発明の範囲から除外される。
【００４８】
免疫グロブリンおよびそのある種の変異体は既知であり、多くが組換え細胞培養中で製造されている。例えば米国特許第４７４５０５５号；ＥＰ第２５６６５４号；Faulkner等,Nature 298:286(1982)；ＥＰ１２０６９４；ＥＰ１２５０２３；Morrison,J.Immun.123:793(1979)；Kohler等,P.N.A.S.USA 77:2197(1980)；Raso等,Cancer Res.41:2073(1981)；Morrison等,Ann.Rev.Immunol.2:239(1984)；Morrison,Science 229:1202(1985)；Morrison等,P.N.A.S.USA 81:6851(1984)；ＥＰ２５５６９４；ＥＰ２６６６６３；ＷＯ８８／０３５５９を参照のこと。再分類された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば米国特許第４４４４８７８号；ＷＯ８８／０３５６５；ＥＰ６８７６３およびこれらに引用された文献を参照のこと。
【００４９】
普通はリガンド結合パートナーをＣ-末端で、免疫グロブリンの定常領域のＮ-末端に融合して、その可変領域を置換するが、結合パートナーのＮ-末端融合も望ましい。貫膜領域または脂質もしくはリン脂質アンカー認識配列を含有するリガンド結合パートナーのこれらの領域または配列は融合に先立って不活化するか削除することが好ましい。
【００５０】
典型的な場合、このような融合物は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを残している。定常ドメインのＦｃ部分のＣ-末端か、重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のすぐＮ-末端側で融合を行うこともある。通常これは、適切なＤＮＡ配列を構築し、それを組換え細胞培養中で発現させることにより達成される。しかし別法として、本発明のポリペプチドを既知の方法に従って合成することもできる。融合を行う正確な部位は重要ではない。特定の部位はよく知られており、結合パートナーの生物活性、分泌または結合特性を最適化するよう選択することができる。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。
【００５１】
いくつかの態様では、ハイブリッド免疫グロブリンが単量体、あるいはヘテロ多量体またはホモ多量体(特に二量体または四量体)として会合する。一般的にこれらの会合した免疫グロブリンは、次の模式図で表される既知の単位構造を有するであろう。基本４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがとる形態である。高分子量免疫グロブリン中では４鎖単位が反復される。ＩｇＭは一般に、互いにジスルフィド結合で結合し合った基本４鎖単位の５量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、および場合によってＩｇＧグロブリンも多量体型で血清中に存在し得る。多量体の場合、それぞれの４鎖単位は同一であり得るし、異なることもあり得る。
【００５２】
本明細書の模式図において、“Ａ”は、そのリガンドに結合し得るリガンド結合部位を含有するリガンド結合パートナーの少なくとも一部を意味する。Ｘは追加の薬剤を表し、これはもう１つの機能性リガンド結合パートナー(Ａと同一または異なる)であってもよいし、上に定義した複数サブユニット(鎖)ポリペプチド(例えばインテグリン)、あるいは可変領域または可変領域様ドメインなど免疫グロブリン・スーパーファミリーの構成要素の一部(天然またはキメラ免疫グロブリン可変領域を含む)、あるいはシュードモナス外毒素やリシンなどの毒素、あるいは普通は定常ドメインに結合していないポリペプチド治療薬であってもよい。ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨは免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変または定常ドメインを表す。これらの模式図が単に一般的な会合免疫グロブリン構造の例であって、すべての可能性を包含するものではないことは理解されるであろう。例えば数個の異なる“Ａ”または“Ｘ”がこれらの構築物いずれかに存在することが望ましいかも知れないことは理解されるであろう。
【００５３】
【化１】
【００５４】
これらの模式図が単に例示であること、また多量体の鎖が天然の免疫グロブリンと同じ様式でジスルフィド結合していると考えられることは理解されるであろう。本発明によれば、適切な核酸で形質転換された哺乳類細胞からハリブリッド免疫グロブリンが容易に分泌される。この分泌型には、結合パートナーのエピトープが重鎖二量体、軽鎖単量体または二量体中に存在するもの、並びに、結合パートナーのエピトープが１または複数の軽鎖または重鎖に融合して存在する重鎖および軽鎖ヘテロ四量体(４つまで、あるいは４つすべての可変領域類縁体が置換されているヘテロ四量体を含む)が含まれる。軽-重鎖非結合パートナー可変様ドメインが存在する場合、ヘテロ機能性抗体が提供される。
【００５５】
様々な構造の鎖また基本単位を使用することによって、本発明の単量体、ヘテロ多量体およびホモ多量体および免疫グロブリンを組み立てることができる。これらの基本単位の特定の例を次の模式図に表し、以下の式を省略するための等価表示を示す。
【００５６】
【化２】
【００５７】
本発明によって製造される会合した新規免疫グロブリンの種々の例を以下に模式的に表す。上に定義した記号に加えて、ｎは整数を表し、Ｙは共有結合的架橋部分を表す。
【００５８】
（ａ）ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｃ）ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｄ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ,ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｅ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ, ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｆ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ, ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ,ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｇ）[Ａ−Ｙ]ｎ−[ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ]２；
（ｈ）ＸＣＨまたはＸＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ］；
（ｉ）ＸＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｊ）ＸＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｋ）ＸＣＨ−ＶＬＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｌ）ＸＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ,ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｍ）ＡＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ,ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
Ａ、Ｘ、ＶまたはＣを共有結合的架橋部分(Ｙ)で、(Ａ−Ｙ)ｎ、(Ｘ−Ｙ)ｎなどになるように改変してもよい。
【００５９】
リガンド結合パートナーＡは、例えば任意にＡαおよびＡβと表される鎖を有する複数鎖分子であってもよい。これらの鎖を一単位として、上で単一鎖“Ａ”と記載した部位に置く。この複数鎖の１本を(残りの鎖が正常な様式で、共有結合的または非共有結合的に融合鎖と結合している状態で)、免疫グロブリン鎖の一本に融合するか、あるいは、リガンド結合パートナーが２つの鎖を含有する場合には、１本の鎖を独立して免疫グロブリン軽鎖に融合し、もう１つの鎖を免疫グロブリン重鎖に融合する。
【００６０】
ここではリガンド結合パートナーの１本の鎖だけを安定血漿タンパク質に融合することが好ましい。この場合、結合パートナー鎖の１本と安定血漿タンパク質との間にペプチド結合による融合を行い、リガンド結合パートナーの他方の鎖は、自然に結合している時の様式、例えばジスルフィド結合や疎水相互作用で、融合鎖に結合させる。ペプチド融合のために選択するリガンド結合パートナー鎖は、貫膜ドメインを含有する鎖であるべきであり、その融合を本質的にその貫膜ドメインのＮ-末端側から行うか、貫膜および細胞質ドメインを置換するように行うであろう。複数の貫膜ドメインが存在する場合には、通常、融合(または削除後の融合)のためにその１つを選択し、他方を非融合のまま残すか、もしくは削除する。
【００６１】
以下に模式化する構造を有する基本単位は、複数鎖リガンド結合パートナーを伴う単量体、ヘテロ多量体およびホモ多量体(特に二量体および三量体)を作成するために使用するものの例である。
【００６２】
【化３】
【００６３】
上記の単位構造に使用される２鎖リガンド結合パートナー(“ＡαおよびＡβ”)を有する新規会合抗体の種々の例を以下に模式的に表す。
【００６４】
（ｎ）ＡαＡβＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｏ）ＡαＡβＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｐ）ＡαＣＬ−ＡβＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｑ）ＡβＣＬ−ＡαＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｒ）ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｓ）ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｔ）ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｕ）ＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
上の表に示した構造は単に重要な特徴を示すだけであり、例えば上記の構造は免疫グロブリンの結合(Ｊ)ドメインや他のドメインを示しておらず、またジスルフィド結合も示していない。これらを簡潔のために省略する。しかし、そのようなドメインが結合活性にとって必要な場合には、その場合に応じて結合パートナーまたは免疫グロブリン分子中でそれらが占める通常の位置にそのようなドメインが存在すると見なされるべきである。
【００６５】
免疫グロブリンＶＬＶＨ抗体結合部位が上に示されている場合、あるいはＸＣＬまたはＸＣＨが示されておりＸが免疫グロブリン可変領域を表す場合は、それが予め決定した抗原に結合し得ることが好ましい。適切な免疫グロブリン結合部位および融合パートナーはＩｇＧ-１、-２、-３、または-４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得られるが、ＩｇＧ-１が好ましい。上記の模式的例は二価抗体の代表例である。より複雑な構造は、他のクラス(例えばＩｇＭ)由来の免疫グロブリン重鎖配列を使用することによって齎されるであろう。
【００６６】
特に好ましい態様は、リンパ様組織内皮のための結合部位を含有するＬＨＲのＮ-末端部分の、免疫グロブリンＧ１のエフェクター機能を含有する抗体のＣ-末端Ｆｃ部分への融合物である。この種類には２つの好ましい態様がある。その１つは、全重鎖定常領域がＬＨＲの一部に融合している態様であり、もう１つはＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(重鎖定常領域の第１残基を１１４として残基２１６(Kabat等,"Sequences of Proteins of Immunological Interest",第4版,1987)、もしくは他の免疫グロブリンの類似の部位)がＬＨＲの一部に融合している態様である。後者の態様を実施例４に記述する。
【００６７】
本発明のこれらの組成物、特にリガンド結合パートナーの生物活性部分で免疫グロブリン鎖の可変領域が置換されているものは、生体内血漿半減期の改善を示すと考えられる。これらのハイブリッド免疫グロブリンは、免疫グロブリン様ドメインで免疫グロブリンの可変領域が置換されている構築物と同様の方法で構築される。例えばCapon等,Nature 337:525-531(1989)；Traunecker等,Nature 339:68-70(1989)；Gascoigne等,Proc.Nat.Acad.Sci.84:2936-2940(1987)；公開欧州出願ＥＰＯ 0 325 224 A2を参照のこと。本発明のハイブリッド免疫グロブリンは、ある種の抗体由来の可変ドメインで別の種の可変ドメインが置換されているキメラ抗体と同様の方法でも構築される。例えばＥＰ 0 125 023；Munro,Nature 312:(1984年12月13日)；Neuberger等,Nature 312:(1984年12月13日)；Sharon等,Nature 309:(1984年5月24日)；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)；Boulianne等,Nature 312:643-646(1984年12月13日)を参照のこと。結合パートナーをコードするＤＮＡを、目的の結合パートナードメインをコードするＤＮＡの３'末端かその近位、およびその成熟ポリペプチドのＮ-末端をコードするＤＮＡかその近傍(異なるリーダーの使用を計画する場合)、もしくは結合パートナーのＮ-末端コード領域かその近位(天然のシグナルを使用する場合)で、制限酵素によって切断する。次にこのＤＮＡ断片は、免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡに容易に挿入でき、必要ならば欠失変異法によって加工する。ヒトのインビボ(生体内)療法にこの変種を利用したい場合は、これがヒト免疫グロブリンであることが好ましい。
【００６８】
ＬＨＲ細胞外ドメインは一般にそのＣ-末端で免疫グロブリン定常領域に融合する。融合を行う正確な部位は重要でない。可溶性ＬＨＲ-Ｉｇ融合物の分泌や結合特性を最適化するために、細胞外領域近傍または細胞外領域内の他の部位を選択してもよい。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。融合は典型的には貫膜ドメインおよび細胞質ドメインの両方またはそのどちらかを置換する。
【００６９】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは既知であるか、もしくはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能であるか、あるいは合成できる。例えばAdams等,Biochemistry 19:2711-2719(1980)；Gough等,Biochemistry 19:2702-2710(1980)；Dolby等,P.N.A.S.USA,77:6027-6031(1980)；Rice等,P.N.A.S.USA 79:7862-7865(1982)；Falkner等,Nature 298:286-288(1982)；Morrison等,Ann.Rev.Immunol.2:239-256(1984)を参照のこと。
【００７０】
ＬＨＲをコードするＤＮＡ配列を本明細書に記載する。既知の、あるいはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能な他の望ましい結合パートナーをコードするＤＮＡ配列も本発明の実施に適している。
【００７１】
本発明の融合物をコードするＤＮＡを、発現用の宿主細胞に導入する。多量体を望む場合には宿主細胞を、その多量体を構成する各鎖をコードするＤＮＡで形質転換するが、この際、その多量体の鎖を目的の様式で組み立て得るように宿主細胞を最適に選択する。宿主細胞がトランスフェクション前に免疫グロブリンを産出している場合には、軽鎖または重鎖に融合した結合パートナーでトランスフェクションするだけでヘテロ抗体を生産することができる。結合パートナードメインを保持する１または複数のアームと、付随の可変領域を保持する１または複数のアームを有する前記の免疫グロブリンは、結合パートナーリガンドと抗原または治療的部分について２重の特異性を齎す。多重に同時形質転換した細胞を上述の組換え法と共に用いることによって、例えば上述のヘテロ四量体免疫グロブリンなど、多重特異性を有するポリペプチドが生産される。
【００７２】
一般的に、融合物は細胞内で発現し、よく分泌されるが、種々の融合物の組換え宿主からの分泌程度にはいつもかなりの多様性が認められることがわかった。
【００７３】
また、異なる特異性を有する免疫グロブリンから完全なヘテロ抗体を生産する方法は既知である。これらの方法をインビトロ合成に採用するか、もしくは免疫グロブリンまたは免疫グロブリンハイブリッドを過去に使用した場合にはその結合パートナー-免疫グロブリン鎖を単に置換することによるヘテロキメラ抗体の生産に採用する。
【００７４】
ヘテロ機能性抗体生産の別法として、結合パートナー-免疫グロブリン融合物を産出する宿主細胞(例えばトランスフェクションした骨髄腫)を、ある抗原に対して望ましい付随特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマまたはＢ細胞と融合する。ヘテロ二機能性抗体をこのようなハイブリドーマの培養培地から回収することによって、従来のインビトロ再分類法(ＥＰ 68763)より多少便利にヘテロ二機能性抗体を生産することができる。
【００７５】
本発明はＬＨＲまたは他の結合パートナーのアミノ酸配列変種をも包含する。結合パートナーのアミノ酸配列変種は種々の意図で調製され、これらの意図にはリガンドに対する結合パートナーの親和性の増大、結合パートナーの安定性、精製および調製の助成、血漿半減期の修正、治療的効用の改善、およびその結合パートナーを治療的に使用する際の副作用の発生またはその重篤度の減少が含まれる。以下の議論に、他のリガンド結合パートナーとして選択し得る変種の典型例であるＬＨＲのアミノ酸配列変種について記述する。
【００７６】
リガンド結合パートナーのアミノ酸配列変種は次の３種類のうちの１または複数に分類できる：挿入変種、置換変種、または欠失変種。これらの変種は通常、リガンド結合パートナーをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドへの部位特異的変異導入によって変種をコードするＤＮＡを得た後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させることによって生産される。しかし、約１００〜１５０アミノ酸残基までの断片ならばインビトロ合成によって便利に製造できる。以下の議論は部分的にＬＨＲに関するものであるが、リガンド結合パートナーの構造または機能に適用できる範囲で、あらゆるリガンド結合パートナーに対して適合し、等しい効果を与える。
【００７７】
ＬＨＲのアミノ酸配列変種は、天然には認められないか、もしくは天然の対立遺伝子に認められない予め決定された変種である。ＬＨＲ変種は典型的には天然に存在するＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲ類縁体と同じ性質の生物活性(例えばリガンド結合活性)を示す。しかし、そのリガンドを結合できないＬＨＲ変種および誘導体であっても、少なくとも１つのＬＨＲエピトープが活性なまま残っている限り、(ａ)ＬＨＲまたはＬＨＲに対する抗体の診断的検定で用いる試薬として、(ｂ)既知の方法で不溶化した場合には、抗血清またはハイブリドーマ培養上清から抗ＬＨＲ抗体を精製するための試薬として、および(ｃ)ＬＨＲに対する抗体を引き出すための免疫原として、あるいは免疫検定キットの構成要素(天然ＬＨＲに対する競争的試薬として標識したもの、またはＬＨＲ検定の標準として非標識のもの)として有用である。
【００７８】
アミノ酸配列変異の導入部位は予め決定するが、変異自体を予め決定する必要はない。例えば、ある部位における変異の効果を最適化するために、ランダム(無作為)または飽和変異法(考え得る２０残基のすべてを挿入する)を標的コドンで実施し、発現したＬＨＲ変種を、望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。このようなスクリーニングは当該分野では常法に属する。
【００７９】
アミノ酸挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基程度であろう。置換は典型的には１残基に対して導入する。欠失(削除)は約１〜３０残基の範囲であろう。削除または挿入を隣接した対で行うこと、即ち２残基の削除または２残基の挿入が好ましい。置換、削除、挿入およびそれらのあらゆる組み合わせを導入または組み合わせることにより最終構築物に到達することは以下の議論からよくわかるであろう。
【００８０】
ＬＨＲの挿入アミノ酸配列変種は、ＬＨＲにとって異種のアミノ酸残基の１または複数が標的ＬＨＲ中の予め決定した部位に導入され、先に存在していた残基を移動させたものである。
【００８１】
通常、挿入変種はＬＨＲのアミノまたはカルボキシル末端に対する異種タンパク質またはポリペプチドの融合物である。このような変種を、ＬＨＲ中の挿入を行った位置に通常に認められるもの以外の配列を含有するポリペプチドとＬＨＲとの融合物と言う。融合物のいくつかの群はこれに包含される。
【００８２】
本発明の新規ポリペプチドは、免疫アフィニテイー技術(これ自体は既知である)によるリガンド結合パートナーの診断または精製に有用である。あるいは、結合パートナーの精製に際し、この新規ポリペプチドを使用することによって、不純な混合物から融合物を吸着させた後、その融合物を溶出させ、所望により、結合パートナーを融合物から例えば酵素的切断によって回収する。
【００８３】
結合パートナーの望ましい融合物(免疫学的に活性であっても活性でなくてもよい)には、成熟結合パートナー配列とその結合パートナーにとって異種のシグナル配列との融合物が含まれる。
【００８４】
ＬＨＲの場合および他の選択された結合タンパク質に関して望ましい場合、ＬＨＲの分泌をより迅速に指示するためにシグナル配列融合物を使用する。異種シグナルで天然のＬＨＲシグナルを置換し、得られた融合物が認識される場合、即ち宿主細胞によるプロセシングを受けて切断される場合に、ＬＨＲが分泌される。意図する宿主細胞に基づいてシグナルを選択し、これらのシグナルには細菌、酵母、哺乳類およびウイルスの配列が含まれ得る。天然のＬＨＲシグナルまたはヘルペスｇＤ糖タンパク質シグナルが哺乳類発現系での使用に適している。
【００８５】
置換変種は、図１〜３または図４〜６の配列の少なくとも１残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。ＬＨＲの特徴を微細に調節したい場合には、このような置換は一般に次の表１に従って行われる。
【００８６】
【表１】
【００８７】
新規アミノ酸配列は活性中心類縁体(アミノ酸ないし他の方法)と共に本発明の範囲に含まれる。
【００８８】
機能または免疫学的同一性の本質的な変化は、表１の置換より保存性の少ない置換を選択することによって、即ち、(ａ)置換領域内のポリペプチド骨格の構造(例えばシートまたはラセン立体配座)、(ｂ)標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは(ｃ)側鎖の嵩高さ、の維持に対する効果がより有意に異なる残基を選択することによって起こる。一般的にＬＨＲの性質に最も大きな変化を齎すと考えられる置換は次の置換であろう：(ａ)親水性側鎖(例：セリンまたはスレオニン残基)で(を)疎水性残基(例：ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニン残基)を(で)置換する；(ｂ)システインまたはプロリンで(を)他の残基を(で)置換する；(ｃ)正荷電側鎖を有する残基(例：リジン、アルギニンまたはヒスチジン残基)で(を)負荷電残基(例：グルタミン酸またはアスパラギン酸残基)を(で)置換する；もしくは、(ｄ)嵩高い側鎖を有する残基(例；フェニルアラニン)で(を)側鎖をもたない残基(例：グリシン)を(で)置換する。
【００８９】
削除、挿入、および置換のいくつかは、ＬＨＲ分子の性質に極端な変化を齎さないであろう。しかし置換、削除または挿入を行う前にその正確な効果を予測することが困難な場合、例えばＬＨＲ炭水化物結合ドメインまたは免疫エピトープを改変する場合、その効果を日常的なスクリーニング法で評価することを当業者は望むであろう。例えば典型的な場合、変種は、ＬＨＲコード核酸への部位特異的変異導入、組換え細胞培養中でのその変種核酸の発現、および任意に、例えば(少なくとも１つの残存免疫エピトープによってその変種を吸着するための)ポリクローナル抗ＬＨＲカラムでの免疫アフィニティー吸着による、その細胞培養からの精製によって作成される。次に、その細胞溶解液または精製ＬＨＲ変種の活性を、目的の特徴に適したスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、Mel-１４などのある抗体に対する親和性など、ＬＨＲの免疫学的特徴の変化を、競争型免疫検定法で測定する。ＬＨＲの生体内での機能についてより多くのことがわかるようになれば、他の検定法もこのようなスクリーニングに有用になるであろう。酸化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク分解性の分解に対する感受性、担体との会合傾向、あるいは多量体への会合傾向などのタンパク質の性質の変化は、当業者によく知られた方法で検定する。
【００９０】
ＬＨＲの置換変種には、上に定義したＬＨＲドメインの１または複数が、常法によって他のタンパク質の機能的に相同なドメインに置換されている変種も含まれる。変種がＬＨＲの特定のドメインの断片である場合、本明細書に定義した対応するＬＨＲドメインに対して少なくとも〜７０％相同であることが好ましい(ただし必須ではない)。このような置換可能なドメインの供給源として、当業者は図１１〜１３を使用することができる。例えば、図１１に配列を示したニクバエレクチンを改変してＬＨＲの炭水化物結合ドメインと少なくとも〜７０％相同な程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様に、図１２に配列を示した凝固因子Ｘを改変してＬＨＲのｅｇｆ-ドメインと少なくとも〜７０％相同な程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様の置換をシグナル配列、補体結合ドメイン、貫膜ドメインおよび細胞質ドメインに対して行うことも望ましいであろう。
【００９１】
ＬＨＲ変種のもう１つの種類は欠失変種である。欠失(削除)はＬＨＲ配列から１または複数のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、ＬＨＲの貫膜および細胞質ドメイン、もしくは細胞質ドメインのみを削除する。しかし、ＬＨＲの生物活性または免疫交差反応性が保存されるような、ＬＨＲ Ｃ-末端から貫膜領域のＮ-末端側の他の適切な部位までの欠失が適切である。ＬＨＲのアミノ酸配列解明の過程で今までに得られているタンパク質消化断片と、上に同定したＬＨＲドメインのいずれかに対して〜７０％より小さい相同性を有するタンパク質断片は欠失変種の範囲から除外される。
【００９２】
免疫グロブリン融合物は、補体結合ドメイン、炭水化物ドメイン、および表皮成長因子ドメインなどのＬＨＲ断片を用いて製造できる。補体結合ドメイン融合物は補体媒介性疾患の診断および治療、並びに、この融合物とＬＨＲまたはリンパ球表面上の他の成分とのオリゴマー化に有用である。
【００９３】
システインまたは他の不安定残基の削除も、例えばＬＨＲの酸化安定性を増大させる際に望ましいであろう。潜在的タンパク加水分解部位(例：ArgArg)の削除または置換は、その塩基性残基の１つを削除するか、もしくはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することによって達成される。
【００９４】
ある態様では、ＬＨＲが補体結合ドメインおよび／またはｅｇｆドメインを伴わない炭水化物結合ドメインで構成される。この態様は貫膜および細胞質領域の一方または両方を含有してもよいし、含有しなくてもよい。
【００９５】
置換または欠失変異の好ましい種類は、ＬＨＲの貫膜領域が関与するものである。ＬＨＲサブユニットの貫膜領域は、細胞膜の脂質二重層をまたぐのに適切な大きさを有する高度に疎水的または親油的なドメインである。これらはＬＨＲを細胞膜中に固定すると考えられ、ＬＨＲとのホモまたはヘテロ多量体錯体形成を可能にする。
【００９６】
典型的には貫膜ドメイン・ヒドロキシル化残基の削除または置換によって齎されるＬＨＲおよび貫膜ドメインが存在する他の結合パートナーの貫膜ドメインの不活化は、その細胞または膜脂質親和性の減少および水溶性の改善によって回収および製剤化を容易にするであろう。貫膜および細胞質ドメインを削除すれば、その身体によって外来と認識されるかも知れない本来ならば細胞内にあるポリペプチドの露出か、もしくは潜在的に免疫原性の異種ポリペプチドの挿入による潜在的免疫原性エピトープの導入が回避される。膜結合機能の不活化は、この部位に本質的な親水性ハイドロパシー特性を齎すのに充分な数の残基を削除するか、もしくはこれと同じ結果を達成する異種残基で置換することによって達成される。
【００９７】
貫膜失活ＬＨＲの基本的な利点は、それが組換え宿主の培養培地中に分泌される得ることである。この変種は、血液などの体液に可溶であり、容易に感知できるような対細胞膜脂質親和性を有さないので、組換え細胞培養からの回収がかなり簡単になる。
【００９８】
一般的提案として、すべての変種は機能的な貫膜ドメインを有さず、また、機能的な細胞質配列を有さないことも好ましいであろう。
【００９９】
例えば貫膜ドメインを、完全に親水性ハイドロパシー特性を示すアミノ酸配列(例：約５〜５０のセリン、スレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸などの親水性残基からなる無作為または予め決定された配列)で置換することができる。欠失(先端削除型)ＬＨＲと同様に、これらの変種は組換え宿主の培養培地中に分泌される。
【０１００】
ＨｕＬＨＲアミノ酸配列変種の例を次の表に記載する。残基番号に続く残基は、置換アミノ酸または挿入されたアミノ酸を示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
これらの変種は保存的置換体であることが好ましい。いくつかの変種が生物活性の減少または欠失を示すであろうことは理解されるであろう。これらの変種であっても、ＬＨＲの免疫エピトープを少なくとも１つ保持している限り、ＬＨＲの免疫検定の標準として有用である。
【０１０３】
グリコシル化変種はＨｕＬＨＲの範囲に含まれる。これらにはグリコシル化が完全に欠如している(非グリコシル化)変種、天然型より少なくとも１つグリコシル化部位が少ない(脱グリコシル化)変種およびグリコシル化が変化している変種が含まれる。脱グリコシル化および非グリコシル化アミノ酸配列変種、天然の非改変ＬＨＲアミノ酸配列を有する脱グリコシル化および非グリコシル化ＬＨＲ、および他のグリコシル化変種が含まれる。例えば、置換または欠失変異法を使用することによりＬＨＲのＮ-またはＯ-結合型グリコシル化部位を除去する(例えばアスパラギン残基を削除するか、もしくはリジンまたはヒスチジンなど別の塩基性残基で置換する)。あるいは、グリコシル化認識部位を除去することによってグリコシル化を阻害するために、アスパラギン残基には手を加えないが、グリコシル化部位を形成する隣接残基を置換または削除する。
【０１０４】
別法として、原核生物はポリペプチドにグリコシル化を導入できないので、天然ＬＨＲのアミノ酸配列を有する非グリコシル化ＬＨＲを組換え原核細胞中で生産する。
【０１０５】
グリコシル化変種を、適切な宿主を選択することによって、もしくはインビトロ法で製造する。例えば酵母は哺乳類系とはかなり異なるグリコシル化を導入する。同様に、そのＬＨＲとは異なる種(例：ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ)あるいは異なる組織起源(例：肺、肝臓、リンパ様、間葉、表皮)の哺乳類細胞も、例えばマンノースレベルの増大、またはマンノース、フコース、シアル酸、および哺乳類糖タンパク質に典型的に認められる他の糖類の比の変化によって特徴づけられる変種グリコシル化を導入する能力について常法でスクリーニングする。ＬＨＲのインビトロ・プロセシングは典型的には酵素的加水分解(例：ノイラミニダーゼ消化)によって達成される。
【０１０６】
ＬＨＲ分子の共有結合による修飾はその範囲に含まれる。このような修飾は、回収したタンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させるか、もしくは選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物活性、ＬＨＲの免疫検定、あるいは組換えＬＨＲの免疫アフィニティ−精製用の抗ＬＨＲ抗体の調製にとって重要な残基を同定するための研究に有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後にそのタンパク質の生物活性が
完全に失活したら、少なくとも１つのアルギニンまたはリジン残基がその活性に必須であることが示唆され、その後、修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチド断片を単離することによって、選択した条件下で修飾された個々の残基を同定する。このような修飾は当該技術分野では常法に属し、不都合な実験を伴わずに実行される。
【０１０７】
二官能性試薬による誘導体化は、ハイブリッド免疫グロブリンとポリペプチドとの分子間会合体を製造するため、およびハイブリッド免疫グロブリンをそのリガンドの検定またはアフィニティー精製で使用するための非水溶性支持マトリックスまたは表面に架橋するために有用である。さらに、鎖内架橋の研究も立体配座構造に関する直接的情報を提供するであろう。一般に使用される架橋試薬には、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル類(例：４-アジドサリチル酸とのエステル)、ジスクシンイミジルエステル類(例：３,３'-ジチオビス(スクシンイミジル-プロピオネート))を含むホモ二官能性イミドエステル類、およびビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンなどの二官能性マレイミド類が含まれる。メチル-３-[(ｐ-アジド-フェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化試薬によって、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化が可能な中間体を得ることができる。別法として、米国特許第３９５９０８０号、同第３９６９２８７号、同第３６９１０１６号、同第４１９５１２８号、同第４２４７６４２号、同第４２２９５３７号、同第４０５５６３５号、同第４３３０４４０号に記述された系反応性基質および臭化シアン活性化炭水化物などの活性な非水溶性マトリックスをタンパク質の固定化および架橋に使用する。
【０１０８】
ある種の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基になる。あるいは、これらの残基を温和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【０１０９】
他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,79〜86頁(1983))、Ｎ-末端アミンのアセチル化、および(いくつかの例では)Ｃ-末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【０１１０】
他の誘導体は、非タンパク質性重合体(ポリマー)に共有結合した本発明の新規ポリペプチドからなる。通常、非タンパク質性重合体は親水性合成ポリマー、即ち天然には認められないポリマーである。しかし天然に存在し、組換え法またはインビトロ法で製造したポリマーも、天然から単離したポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー(例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン)は本発明の範囲に含まれる。特に有用なものは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル類、メトキシポリエチレングリコールなどのポリアルキレンエーテル類；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体(プルロニクス(Pluronics))などのポリオキシアルキレン類；ポリメタクリレート類；カルボマー(carbomer)類；糖単量体Ｄ-マンノース、Ｄ-およびＬ-ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン酸、シアル酸、Ｄ-ガラクトウロン酸、Ｄ-マヌロン酸(例えばポリマヌロン酸またはアルギン酸)、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ-グルコースおよびノイラミン酸からなる分枝状または非分枝状多糖類(乳糖、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンなどのホモ多糖類およびヘテロ多糖類、または酸ムコ多糖類の多糖サブユニット(例：ヒアルロン酸)を含む)；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコール・ポリマー；ヘパリンまたはヘパロンである。
【０１１１】
多糖が天然のグリコシル化または組換え発現に付随して生じるグリコシル化である場合、その置換部位は、追加または置換Ｎ-またはＯ-結合部位がその分子中に導入された、天然のＮ-またはＯ-結合型グリコシル化部位とは異なる位置であってもよい。このようなポリマーの混合物を使用してもよく、またポリマーが均一であってもよい。架橋前のポリマーは水溶性であることが(必要ではないが)好ましく、最終的複合体は水溶性でなければならない。さらに、ポリマーはその複合体型において高度に免疫原性であってはならず、静脈内注入または注射による投与を意図する場合には、そのような方法に適合しない粘度であってはならない。
【０１１２】
ポリマーが反応性の基を１つだけ含有することが好ましい。このことはタンパク質分子の架橋を避けるために役立つ。しかし、架橋を減少させるために反応条件を最適化すること、あるいは、本質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過またはクロマトグラフィー的ふるいを通して反応生成物を精製することは本発明の範囲に含まれる。
【０１１３】
ポリマーの分子量は約１００〜５０００００の範囲であることが望ましく、好ましくは約１０００〜２００００である。選択する分子量はそのポリマーの性質と置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が大きく、置換の程度が大きいほど、使用できる分子量は低くなる。至適分子量は日常的な実験で決定されるであろう。
【０１１４】
一般に、ハイブリッドの１または複数のアミノ酸もしくは糖残基およびポリマーと反応する多官能性架橋試薬を通して、ポリマーを本発明のハイブリッド免疫グロブリンに共有結合させる。しかし、誘導体化したポリマーをハイブリッドと反応させることによってポリマーを直接架橋すること、またはその逆も本発明の範囲に含まれる。
【０１１５】
ハイブリッド免疫グロブリン上の共有結合架橋部位には、Ｎ-末端アミノ基、リジン残基に存在するε-アミノ基、および他のアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基あるいは他の親水性基が含まれる。多官能性(通常は二官能性)架橋試薬を使用せず、ポリマーを直接ハイブリッドに共有結合させてもよい。アミノ基に対する共有結合は、シアヌル酸クロリド、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基(ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび酢酸無水物；あるいはＰＥＧクロリド＋４-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルトリクロロホルメートまたはｐ-ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ)に基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ-アミンをカップリングさせることによって誘導体化する。
【０１１６】
ビオチンまたはアビジンによるオリゴ糖類の標識に関してBayer等,Methods in Enzymology,62:310(1979)またはHeitzmann等,P.N.A.S.,71:3537-341(1984)に記述されている方法と同様の方法で、化学品(例：メソ過ヨウ素酸塩)または酵素(例：グルコースまたはガラクトース・オキシダーゼ)(いずれも各炭水化物のアルデヒド誘導体を生成させる)を用いて酸化した後、ヒドラジドまたはアミノ誘導体化ポリマーと反応させることにより、ポリマーをオリゴ糖基に結合させる。さらに、オリゴ糖類とポリマーを結合させるためにこれまでに使用されてきた他の化学法または酵素法も適している。置換オリゴ糖類は、一般に、アミノ酸部位より誘導体化のための置換が少なく、それゆえにオリゴ糖生成物がより均一になるであろうから、特に有利である。任意に、オリゴ糖置換基に、糖を除去するための酵素消化(例：ノイラミニダーゼ消化)によって、ポリマー誘導体化の前に改変を加えてもよい。
【０１１７】
ポリマーは、本発明のポリペプチドのアミノ酸側鎖あるいはＮ-またはＣ-末端と直接反応する基、もしくは多官能性架橋試薬と反応する基を保持するであろう。一般に、このような反応性基を有するポリマーは固定化タンパク質製造のために知られている。このような化学を本発明で使用するためには、これまでにタンパク質固定化に使用されてきた不溶性ポリマーと同じ様式で誘導体化された水溶性ポリマーを使用すべきである。臭化シアン活性化は多糖類を架橋する際に特に有用な方法である。
【０１１８】
出発ポリマーに関する“水溶性”という用語は、複合体のために使用するポリマーまたはその反応性中間体が誘導体化反応に関与し得るほど充分に水溶性であることを意味する。
【０１１９】
ポリマー複合体に関する“水溶性”という用語は、その複合体が血液などの生理的液体に可溶であることを意味する。
【０１２０】
このようなポリマーによる置換の程度は、タンパク質全体を使用するか、その断片を使用するか、タンパク質が異種タンパク質との融合物であるか否か、タンパク質上の反応性部位の数、ポリマーの分子量、親水性およびその他の性質、選択した特定のタンパク質誘導体化部位に依存して変化するであろう。異種配列はいずれも、その望ましい活性が有意に不利な影響を受けない限り、本質的に無制限の数のポリマー分子で置換できるが、一般に、この複合体は１〜１０ポリマー分子を含有する。最適な架橋度は、時間、温度およびその他の反応条件を変化させることによって置換度を変えた後、その複合体が目的の様式で機能する能力を決定する一連の実験により容易に決定できる。
【０１２１】
ＰＥＧなどのポリマーを、ＰＥＧなどの非タンパク質性ポリマーでタンパク質を共有結合的に修飾するための多様な(それ自体は)既知の方法で架橋する。しかしこれらの方法のいくつかは本発明の目的には好ましくない。シアヌル酸クロリドの化学はタンパク質架橋を含む多くの副反応を起こす。さらに、スルフヒドリル基を含有するタンパク質の失活を特に齎しやすい。カルボニルジイミダゾールの化学(Beauchamp等,Anal.Biochem.131:25-33(1983))は高いｐＨ(＞８.５)を必要とし、この条件はタンパク質を不活化し得る。さらに、“活性化ＰＥＧ”中間体は水と反応し得るので、タンパク質に対して大過剰モル量の“活性化ＰＥＧ”が必要である。カルボニルジイミダゾール化学に必要な高濃度のＰＥＧは、ゲル濾過クロマトグラフィーと疎水相互作用クロマトグラフィーの両方に悪影響を与えるので、精製にも問題を起こす。さらに、高濃度の“活性化ＰＥＧ”はタンパク質を沈殿させる可能性があり、この問題自体は過去に触れられている(Davis,米国特許第4179337号)。一方、アルデヒド化学(Royer,米国特許第4002531号)は４０倍過剰モル量のＰＥＧと１〜２時間のインキュベーションしか必要としないので、より効果的である。しかし、ＰＥＧアルデヒドの調製のためにRoyerが提案した二酸化マンガンは、“ＰＥＧは金属性酸化剤と錯体を形成する傾向が極めて高いので”(Harris等,J.Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed.22:341-352(1984))問題が多い。ＤＭＳＯと酢酸無水物を使用するモファット酸化(moffatt oxidation)を使用することによって、この問題を回避できる。さらに、Royerが提案した水素化ホウ素ナトリウムは高ｐＨで使用しなければならず、ジスルフィド結合を還元する傾向がかなりある。これに対し、中性ｐＨで作用し、ジスルフィド結合を還元する傾向が殆ど無い水素化シアノホウ素ナトリウムが好ましい。
【０１２２】
本発明の複合体を未反応の出発物質からゲル濾過によって分離する。複合体の不均一種を同じ方法で互いに精製する。
【０１２３】
ポリマーは親水性ゲルとして、あるいはカテーテルまたはドレナージ導管の形態の外科用チューブとして、非水溶性であってもよい。
【０１２４】
ＬＨＲおよび他のリガンド結合パートナーをコードするＤＮＡをインビトロ法で合成するか、もしくはリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。ＬＨＲをコードするＤＮＡを自動化された装置で、もしくはそのような装置を使用せずに合成する方法は、特に本明細書の教示を考慮すれば、当業者一般に知られている。ポリヌクレオチド合成に関する技術分野の現状の例として、Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1984)およびHorvath等,An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynu cleoside 3'-Phosphoramidites,Methods in Enzymology 154:313-326(1987)を参考にすることができる。
【０１２５】
別法として、好ましい態様のための全ＤＮＡ配列、即ちＨｕＬＨＲ(図１〜３)およびＭＬＨＲ(図４〜６)が既知であるから、ＬＨＲをコードするＤＮＡをネズミまたはヒト以外の供給源から得るためには、ＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲもしくはそれらの断片(普通、約２０bpより大きく、通常は約５０bp)をコードする標識したＤＮＡを用いて、特定の動物から得たｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を含有するクローンを検出するために、ハイブリッド形成スクリーニングを実施し、次いで制限酵素分析および核酸配列決定によってそのクローンを分析することによって全長クローンを同定するだけでよい。全長クローンがライブラリー中に存在しない場合は、適切な断片を種々のクローンから回収し、それらの断片に共
通の制限部位で連結することにより、全長クローンを組み立てる。他の動物種のＬＨＲをコードするＤＮＡは、その種から得たライブラリーをヒトまたはネズミの配列でプローブすることによって、あるいはその遺伝子をインビトロで合成することによって得られる。配列がわかっている他の結合パートナーのＤＮＡはこれに類する定型のハイブリッド形成法を用いて得ることができる。
【０１２６】
本発明は、約１０bpより大きく、好ましくは２０〜５０bpであり、１００bpより大きいことさえある、図１〜３または図４〜６の断片と厳密条件下でハイブリッド形成する核酸配列を提供する。また、厳密条件下で、シグナルまたは貫膜ドメインまたは細胞質ドメイン以外のＬＨＲ断片とハイブリッド形成する核酸配列も本発明の範囲に含まれる。
【０１２７】
さらに、ＬＨＲのｃＤＮＡか、あるいはＬＨＲのゲノム遺伝子(イントロン、並びに、隣接する遺伝子もしくは約５０００bp(どちらがより長くても)に及ぶ５'または３'隣接領域を含む)と、厳密条件下でハイブリッド形成し得る核酸プローブも本発明の範囲に含まれる。
【０１２８】
ＬＨＲまたは他の結合パートナーのゲノムＤＮＡの同定は、特定のゲノムライブラリーを検出可能な基(例：放射性リン酸基)で標識したｃＤＮＡまたはその断片でプローブし、その遺伝子を含むクローンを回収することに外ならない。必要ならば、完全な遺伝子を"ウォーキング(染色体歩行)"によってつなぎ合わせる。典型的な場合、このようなプローブはＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲに対して７０％以上相同な配列をコードし、約１０〜１００bpの長さである。他の結合パートナーに関する相同性と大きさは、不都合な実験を行わなくても決定できる。
【０１２９】
本発明に有用なベクターを構築する際には、一般に原核生物をＤＮＡ配列のクローニングに使用する。例えば大腸菌Ｋ１２-２９４株(ＡＴＣＣ番号３１４４６)は特に有用である。使用し得る他の微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ番号３１５３７)が含まれる。これらの例は単なる例示であって、限定を意図するものではない。別法として、インビトロ・クローニング法(例：ポリメラーゼ連鎖反応)も適している。
【０１３０】
本発明のポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニル類縁体として、もしくはハイブリッド／部分にとって異種のポリペプチド、好ましくはそのハイブリッド／部分のＮ-末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合物として、組換え細胞培養中で直接発現する。例えば、ＬＨＲの原核分泌発現ベクターを構築する際には、天然のＬＨＲシグナルを、そのシグナルを認識する宿主と共に使用する。分泌リーダーが宿主によって“認識される”場合、その宿主シグナル・ペプチダーゼは、目的の成熟ＬＨＲにＣ-末端で融合しているリーダー・ポリペプチドの融合物を切断し得る。ＬＨＲシグナルをプロセシングしない宿主原核生物については、そのシグナルを、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定エンテロトキシンIIリーダーなどから選択した原核シグナルで置換する。酵母分泌のためには、ヒトＬＨＲシグナルを酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼ・リーダーで置換することができる。哺乳類細胞発現の場合は、ウイルス分泌リーダー(例：ヘルペス・シンプレックス・ｇＤシグナル)などの他の哺乳類分泌タンパク質シグナルも適当であるが、哺乳類ＬＨＲに関しては天然のシグナルで十分である。
【０１３１】
本発明の新規ポリペプチドはどの宿主細胞中でも発現し得るが、哺乳類宿主中で合成することが好ましい。しかし原核生物、カビ、酵母、昆虫など由来の宿主細胞も発現に使用される。代表的原核生物は、クローニングに適する株および大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ−,λ−,原栄養株,ＡＴＣＣ番号２７３２５)、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans)などの腸内細菌科、バチルスおよび種々のシュードモナス科である。好ましくは、宿主細胞が分泌する原核性酵素量は最小限であるべきである。
【０１３２】
典型的な場合、発現ベクター中に連結されているハイブリッドをコードするＤＮＡで発現宿主を形質転換する。このようなベクターは通常、複製部位を保持している(ただしこれは染色体組み込みが起こる場合には必要ない)。発現ベクターは、以下に議論するように形質転換細胞中で表現型選択を提供し得る標識配列をも含有する。例えば大腸菌を典型的には、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２(Bolivar等,Gene 2:95(1977))を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、それゆえに、目的がクローニングであるか発現であるかにかかわらず、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。また発現ベクターが転写および翻訳の制御に有用な配列(例：プロモーターおよびシャイン・ダルガルノ配列(原核生物の場合)またはプロモーターおよびエンハンサー(哺乳類細胞の場合))を含有していれば最適であろう。プロモーターは誘導性であってもよいが必ずしもその必要はない。驚くべきことに、哺乳類宿主にとってのＣＭＶプロモーターのように強力な構成プロモーターであっても、宿主細胞毒性を伴わずにＬＨＲを産出することがわかった。発現ベクターが何らかの発現制御、複製配列もしくは選択遺伝子を含有する必要はないと考えられるが、これらの欠失は、ハイブリッド形質転換体の同定および高レベルのハイブリッド免疫グロブリン発現の達成を妨げるであろう。
【０１３３】
原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、例えばβ-ラクタマーゼおよびラクトース・プロモーター系(Chang等,Nature,275:615(1978)およびGoeddel等,Nature,281:544(1979))、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel,Nucleic Acids Res.8:4057(1980)および欧州特許出願番号第36776号)、およびtacプロモーターなどのハイブリッド・プロモーター(H.de Boer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))が含まれる。しかし他の機能的細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド配列は一般に既知であるから、当業者は、必要な制限部位を供給するためにリンカーやアダプターを使用して、ＬＨＲをコードするＤＮＡにこれらを機能的に連結することできる(Siebenlist等,Cell,20:269(1980))。細菌系で使用するプロモーターは、ＬＨＲをコードするＤＮＡに機能的に連結されたシャイン・ダルガルノ(Ｓ.Ｄ.)配列をも含有するであろう。
【０１３４】
原核生物に加えて、酵母や糸状菌などの真核微生物も良好な結果を与える。サッカロミセス・セレビシェは最も一般的に使用される真核微生物であるが、他の株のいくつかも一般に利用できる。プラスミドＹＲｐ７は酵母における良好な発現ベクターである(Stinchcomb等,Nature 282:39(1979)；Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等,Gene,10:157(1980))。このプラスミドは、トリプトファン中での生育能が欠失した酵母の変異株(例：ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４-１(Jones,Genetics 85:12(1977)))のための選択標識を提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１欠損の存在は、トリプトファン非存在下での生育による形質転換検出に効果的な環境を提供する。
【０１３５】
酵母宿主と共に使用するための適切な促進配列には、３-ホスホグリセレート・キナーゼ(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))または他の解糖酵素(Hess等,J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)およびHolland,Biochemistry,17:4900(1978))(例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼなど)のためのプロモーターが含まれる。
【０１３６】
生育条件によって転写を制御し得るという追加の利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルルデヒド-３-リン酸・デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化に寄与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適したベクターおよびプロモーターは、R.Hizeman等,欧州特許出願第73657Aにさらに記述されている。
【０１３７】
真核生物の発現制御配列は知られている。ほとんど全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ含量の豊富な領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０〜８０塩基上流に認められるもう１つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域(Ｘはいずれのヌクレオチドでもよい)である。ほとんどの真核遺伝子の３'末端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列はコード配列の３'末端にポリＡ尾部を付加するためのシグナルであろう。これらの配列をすべて哺乳類発現ベクター中に挿入する。
【０１３８】
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御するための適切なプロモーターは種々の供給源、例えばウイルス(例：ポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ＭＭＶ(ステロイド誘導性)、レトロウイルス(例：ＨＩＶのＬＴＲ)、Ｂ型肝炎ウイルス、並びに、最も好ましくはサイトメガロウイルス)のゲノムから、あるいは異種哺乳類プロモーター(例；ベータ・アクチン・プロモーター)から容易に得られる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として便利に得られる(Fiers等,Nature,273:113(1978))。ヒト・サイトメガロウイルスの前初期プロモーターはＨindIII Ｅ制限断片として便利に得られる(Greenaway,P.J.等,Gene 18:355-360(1982))。
【０１３９】
ハイブリッド免疫グロブリンおよび／またはハイブリッド部分をコードするＤＮＡのより高等な真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーは、通常約１０〜３００bpからなる、ＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは比較的配向および位置非依存性であり、転写単位の５'（Laimins,L.等,PNAS,78:993(1981)）および３'（Lusky,M.L.等,Mol.Cell Bio.,3:1108(1983)）に発見されており、またイントロン内（Banerji,J.L.等,Cell,33:729(1983)）およびコード配列自体の中（Osborne,T.F.等,Mol.Cell Bio.4:1293(1984)）にも発見されている。現在、哺乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られている。しかし典型的には、真核細胞ウイルスのエンハンサーを利用するであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００〜２７０ｂｐ)、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーが含まれる。
【０１４０】
真核宿主細胞(酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞)で使用する発現ベクターは、転写の終止に必要であって、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る配列をも含有するであろう。これらの領域は、ハイブリッド免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル区分として転写される。この３'非翻訳領域には転写終止部位も含まれる。
【０１４１】
発現ベクターは、選択遺伝子(これは選択可能標識とも呼ばれる)を含有することもできる。哺乳類細胞に適した選択可能標識の例には、ジヒドロフォレート・レダクターゼ(ＤＨＦＲ)、チミジン・キナーゼ(ＴＫ)、あるいはネオマイシンが含まれる。このような選択可能標識がうまく哺乳類宿主細胞内に導入されるならば、その形質転換哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生き残ることができる。選択方式には広く用いられている２つの異なった種類がある。第一の種類は細胞の代謝、および補足培地に依存せずに生育する能力を欠く変異株化細胞の使用に基づいている。ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞はその２例である。これらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンなどの栄養素を添加しない条件下で生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要ないくつかの遺伝子を欠いているので、補足培地中に欠失ヌクレオチドを添加しない限り生存することができない。培地を補足するかわりに、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞中に導入し、それによってその生育要求性を変化させることもできる。ＤＨＦＲやＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できないであろう。
【０１４２】
選択法の第二の種類は優性選択、即ちどの細胞型にも使用できる選択法であり、変異株化細胞の使用を必要としない選択法である。この方法は典型的には宿主細胞の生育を停止するための薬剤を使用する。異種遺伝子でうまく形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、それゆえにこの選択法に耐え得る。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン(Southern等,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、マイコフェノール酸(Mulligan等,Science,209:1422(1980))、あるいはハイグロマイシン（Sugden等,Mol.Cell.Biol.5:410-413(1985)）を使用する。上記の３例では、真核性の制御下にある細菌性遺伝子を使用することによって、適切な薬剤、即ちそれぞれＧ４１８またはネオマイシン(ジェネティシン)、ｘｇｐｔ(マイコフェノール酸)、あるいはハイグロマイシンに対する耐性を獲得する。
【０１４３】
ハイブリッド免疫グロブリンの発現に適した真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換されたサルの腎ＣＶ１株(ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1651)、ヒトの胚腎株(２９３または懸濁培養中での生育のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham,F.L.等,J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼ハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 10)、チャイニーズハムスター卵巣-細胞-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubおよびChasin,PNAS(USA),77:4216(1980))、マウスのセルトーリ細胞(ＴＭ４、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、サルの腎細胞(ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 70）、アフリカン・グリーン・モンキー腎細胞(ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-1587)、ヒトの頸部癌細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 2)、イヌの腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 34）、バッファロー・ラットの肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1442)、ヒトの肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ75)、ヒトの肝細胞(ＨｅｐＧ２、ＨＢ 8065)、マウスの乳房の腫瘍細胞(ＭＭＴ060562、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 51)、およびＴＲＩ細胞(Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))が含まれる。
【０１４４】
目的のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準的な連結技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工し、目的の形態に再連結することによって必要なプラスミドを形成させる。
【０１４５】
構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、その連結混合物を用いて大腸菌Ｋ１２ ２９４株(ＡＴＣＣ31446)を形質転換し、成功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性によって選択する。Messing等,Nucleic Acids Res.9:309(1981)またはMaxam等,Methods in Enzymology,65:499(1980)の方法で、その形質転換体からプラスミドを調製し、制限分析および／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。
本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または目的の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改良した従来の栄養培地中で培養する。温度やｐＨなどの培養条件を、発現用に選択した宿主細胞について過去に使用されたものとし、これらの条件は当業者には明白であろう。
【０１４６】
本明細書で使用する宿主細胞なる用語は、インビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内の細胞をも包含する。
【０１４７】
“形質転換”という用語は、ＤＮＡが染色体外要素として、もしくは染色体組み込みによって複製されるように、生物内にそのＤＮＡを導入することを意味する。特に断らない限り、本発明で使用する宿主細胞の形質転換法は、Graham,F.およびvan der Eb,A.,Virology,52:456-457(1973)の方法である。しかし、核注入あるいはプロトプラスト融合などによる、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も用いることができる。原核細胞または強固な細胞壁構築物を有する細胞を使用する場合に好ましいトランスフェクション法は、Cohen,F.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),69:2110(1972)が記述した、塩化カルシウムを用いるカルシウム
処理である。
【０１４８】
"トランスフェクション"という用語は、なんらかのコード配列が実際に発現するかどうかにかかわらず、宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味する。数多くのトランスフェクション法が当業者一般に知られている(例えば、ＣａＰＯ４および電気穿孔法)。宿主細胞の形質転換はトランスフェクション成功の証拠である。
【０１４９】
本発明の新規ポリペプチドを組換え細胞培養から既知の方法で回収し、精製する。これらの方法には、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーが含まれる。本発明の範囲に含まれる他の既知の精製法では、固定化した炭水化物、表皮成長因子または補体ドメインを使用する。さらに逆相ＨＰＬＣ、並びに、ハイブリッド免疫グロブリンのリガンドを使用するクロマトグラフィーもハイブリッドの精製にとって有用である。精製の間、低濃度(約１〜５mM)のカルシウムイオンを存在させることが望ましい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下でＬＨＲを精製することが好ましい。
【０１５０】
ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッドを治療的に使用すると、リンパ様組織に対するリンパ球の正常な結合と競争する。したがってこのハイブリッドは器官または移植体拒絶にとって特に有用であり、また、例えばリウマチ様関節炎あるいは他の自己免疫疾患などの炎症を伴う患者の治療に特に有用である。ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッドは、リンパ腫転移の制御、およびリンパ球の蓄積が起こる症状の治療にも適用できる。
【０１５１】
ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッド・ヘテロ二量体およびヘテロ四量体を、治療的部分をリンパ様組織に誘導する際に使用する。例えば、１本のＬＨＲ-ＩｇＧ鎖と１本のＣＤ４-ＩｇＧ鎖からなるハイブリッド免疫グロブリンを用いることにより、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などのウイルスに感染した組織にＣＤ４-ＩｇＧを誘導することができる。このハイブリッドは、リンパ節内の内皮組織だけでなく、パイエル斑などの２次リンパ様器官内および脳内の内皮組織にも結合するので、ＨＩＶ関連痴呆症の治療のために、血液脳障壁を通過してＣＤ４-ＩｇＧを送達するために使用し得る。同様に、リシンなどの毒素を目的の組織に送達するために、本明細書に記述するＬＨＲ-リシン-あるいはＣＤ４-リシン-免疫グロブリンを有する免疫グロブリン・ヘテロ四量体を使用する。
【０１５２】
この方法で、特定の組織に対して特異的な親和性を有するリガンド結合パートナーを選択すれば、安定で比較的長い半減期を有する治療薬を送達する能力が明確に増大し、不都合な実験を行わなくても正確な加工ができる。
【０１５３】
本発明の新規ポリペプチドを滅菌等張製剤中に、必要な補因子と共に入れ、任意に当該分野でよく知られた標準的手段で投与する。この製剤は液体であることが好ましく、通常は０.５〜１０mM カルシウム、非リン酸緩衝液(ｐＨ６.８〜７.６)を含有する生理的塩類溶液であり、あるいは凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１５４】
静脈内送達、またはカテーテルあるいは他の外科用チューブを通しての送達が主要な治療的投与経路となるであろうと考えている。別の経路には、錠剤など、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾燥またはエアゾル化した受容体の吸入が含まれる。液体製剤は粉末製剤から再構成した後に使用することができる。
【０１５５】
本発明の新規ポリペプチドを微小球、リポソーム、他の微粒子送達系によって投与してもよく、あるいは血液を含むある種の組織中に入れる徐放性製剤によって投与してもよい。徐放性担体の好適例には、成型物(例：坐剤またはマイクロカプセル)の形態の半透性ポリマー・マトリックスが含まれる。マイクロカプセル徐放性マトリックスまたは埋め込み可能な徐放性マトリックスには、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートの共重合体(U.Sidman等,Biopolymers 22(1):547-556(1985))、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクレリート)またはエチレン・ビニル酢酸(R.Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)およびR.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))が含まれる。ハイブリッド免疫グロブリンを含有するリポソームは、よく知られた方法で調製される(DE 3218121A；Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980)；EP 52322A；EP 36676A；EP 88046A；EP 143949A；日本特許出願83-11808；米国特許第4485045号および同第4544545号；UP 102342A)。通常リポソームは小さい(約２００〜８００オングストローム)単層型であって、その脂質成分は、約３０モル％コレステロール以上であり、これはポリペプチドの漏出速度を最適化するように調節された比率である。
【０１５６】
徐放性ポリペプチド調製物を、炎症部位または治療部位(例：関節炎の関節または末梢リンパ節)の近傍に埋め込むか、もしくは注射する。
【０１５７】
医者には充分自明であるように、本発明の新規ポリペプチドの投与量は使用するハイブリッドの性質(例えば結合活性および生体内血漿半減期)、製剤中のハイブリッド濃度、ハイブリッドの投与経路、投与部位、投与速度、関与する患者の臨床的耐性、患者を苦しめている病的症状などに依存するであろう。
【０１５８】
本発明のポリペプチドを、上記の症状を治療するために使用される他の医薬(例：抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍剤)と共に投与することもできる。また、本発明のポリペプチドを、γ-インターフェロンや他の免疫変調因子など、他の治療的タンパク質と共に投与することも有用であろう。
【０１５９】
以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に使用する方法および／または用語のいくつかについて記述する。
【０１６０】
“プラスミド”は、先行して置かれた小文字ｐ、および／またはそれに続く大文字、および／または数字によって指定される。本発明の出発プラスミドは市販されており、誰にでも無制限に利用可能であり、あるいは公表された方法に従って、利用可能なプラスミドから構築することもできる。さらに、これらに等価なプラスミドも本技術分野において知られており、一般の技術者には明白であろう。
【０１６１】
具体的には、これらのプラスミドは次の特徴のいくつか、もしくはすべてを有することが好ましい：(１)含有する宿主生物配列の数が最小限度であること；(２)目的の宿主中で安定であること；(３)目的の宿主中で高コピー数型で存在し得ること；(４)制御可能なプロモーターを保持すること；(５)そのプラスミドの、新規ＤＮＡ配列を挿入する部分から離れた位置にある部分に、選択可能な特徴をコードする少なくとも１つのＤＮＡを有すること。上記の規準に合致するようにプラスミドを改変することは、利用可能な文献および本明細書の教示を考慮すれば、当業者には容易である。上述の性質を有し、それゆえに本発明で使用するのに適した新たなクローニングベクターが存在し、あるいは今後発見されるであろうこと、またこれらのベクターも本発明の範囲に含まれると見なされることを理解すべきである。
【０１６２】
ＤＮＡの“消化”という用語は、そのＤＮＡ中の一定のヌクレオチド配列にしか作用しない制限酵素による、そのＤＮＡの触媒的切断を意味する。本発明で使用する種々の制限酵素は市販されており、反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に知られているであろうものを用いた。分析が目的の場合、典型的には１μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２単位の酵素と共に、約２０μｌの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的の場合は、典型的にはより大きな体積中で、５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適した緩衝液および基質量は、その製造者によって指定されている。通常３７℃で約１時間のインキュベーションが用いられるが、その供給者の指示に従って変更することもある。消化後、その反応液を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって、目的の断片を単離する。
【０１６３】
切断した断片のサイズ分離は、Goeddel,D.等,Nucleic Acids Res.8:4057(1980)が記述した８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【０１６４】
“脱リン酸化”は、細菌アルカリ性ホスファターゼ(ＢＡＰ)を用いる処理による末端５'リン酸の除去を意味する。この操作は、１つのＤＮＡ断片の２つの制限切断末端が“環化”して、もしくは閉環を形成して、その制限部位への別のＤＮＡ断片の挿入を妨害することを防止する。脱リン酸化の操作法と試薬は常法である(Maniatis,T.等,Molecular Cloning,133-134頁(1982))。ＢＡＰを使用する反応は、この酵素調製物中に存在するエキソヌクレアーゼ活性を抑止するために、５０mM Tris中６８℃で実行する。反応は１時間行う。この反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する。
【０１６５】
“オリゴヌクレオチド”は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖、のいずれかを意味し、これらは化学的に合成できる。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さないので、キナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しない限り、別のヌクレオチドには連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片には連結できる。
【０１６６】
“ライゲーション”は、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成過程を意味する(Maniatis,T.等,同上,146頁)。特に述べない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件を用い、約等モル量の連結すべきＤＮＡ断片０.５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガーゼ”)を使って遂行する。
【０１６７】
“充填”または“平滑化”は、制限酵素で切断した核酸の付着末端中の一本鎖化された末端を二本鎖に変換する操作を意味する。これによって付着末端が除去され、平滑末端が生成する。この工程は、唯一の制限酵素あるいは数少ない他の制限酵素でしか生成しない末端に付着する制限切断末端を、平滑に切断するあらゆる制限エンドヌクレアーゼもしくは充填された他の付着末端に適合する末端に変換するための汎用の手段である。典型的な場合、標的ＤＮＡ２〜１５μｇを１０mM MgCl２、１mM ジチオスレイトール、５０mM NaCl、１０mM Tris緩衝液(ｐＨ７.５)中約３７℃で、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片 ８単位および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸各２５０μMと共にインキュベートすることによって、平滑化を遂行する。このインキュベーションを一般的には３０分後に停止させ、フェノールおよびクロロホルム抽出し、エタノール沈殿する。
【０１６８】
本発明の組成物の３次元構造は本明細書に記述したその機能にとって重要であると現在考えている。したがって、本発明の組成物が形成する活性構造を模倣するすべての関連構造類縁体は、特に本発明の範囲に包含される。
【０１６９】
本発明の教示を特定の問題または状況に適用することが、本明細書に記述された教示の内容を考慮すれば当業者にとって可能な範囲になることは理解される。本発明の産物の例、およびそれを単離し、使用し、製造するための代表的方法を以下に記述するが、これらが本発明を限定すると見なすべきではない。
【実施例】
【０１７０】
これらの実施例における"Ｍel１４"モノクローナル抗体もしくは"Ｍel１４"なる記載はすべて、Gallatin等,前掲,Nature 303:30(1983)が記述した、ネズミ型と考えられるリンパ表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を意味する。しかし、本明細書にＬＨＲの全ＤＮＡ配列および全アミノ酸配列が提供されているので、Ｍel１４の使用は本発明にとってもはや必要ではない。
【０１７１】
実施例１：ＭＬＨＲの精製およびクローニング
ＭＬＨＲをコードするｃＤＮＡクローンの単離
界面活性剤で処理したネズミ脾臓から、Ｍel１４モノクローナル抗体を用いる免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによってＭＬＨＲを単離した。
【０１７２】
典型的調製では、ＩＣＲ雌マウス(１６週齢)から得た３００個の脾臓を細かく切り、次いで、１mM ＰＭＳＦおよび１％アプロチニンを含有するダルベッコＰＢＳ中の２％トリトンＸ-１００中で、ポッター・エルベジェム組織グラインダー(Potter-Elvehjem tissue grinder)を用いて均質化(ホモジナイズ)した。溶解を浸透機上４℃で３０分間続けた。この溶解液を２０００ｘＧで５分間、次いで４００００ｘＧで３０分間遠心分離した。
【０１７３】
上清をニテックス・スクリーン(Nitex screen)を通して濾過した後、臭化シアン活性化セファロース(Sepharose)４Ｂに結合したラット血清(充填ゲル１０ml)に吸着させることによって予備浄化した。製造者の指示に従って複合体とカップリングするために、ラット血清を１:１０に希釈した。通過液を、セファロース４Ｂに対して１mlあたり０.５mgの割合で結合したＭＥＬ-１４抗体の３mlカラムにかけた。すべてのカラム緩衝液に０.０２％濃度でアジ化ナトリウムを添加した。
【０１７４】
このカラムをＰＢＳ中の２％トリトンＸ-１００ ２５mlで洗浄した後、同じ緩衝液中の１０mM ＣＨＡＰＳ ２５mlで洗浄した。１００mM グリシン、２００mM ＮａＣｌ、ｐＨ３中の１０mM ＣＨＡＰＳ １０mlを加えることによって抗原を放出させ、これを１mM ＴＲＩＳ ＨＣl(pＨ７.６)１ml中に集めることによって中和した。カラムを２０mM トリエチルアミン、２００mM ＮａＣｌ、ｐＨ１１で洗浄し、ＰＢＳ中の１０mM ＣＨＡＰＳで前平衡化した後、中和し、カラム緩衝液１００ml中に希釈した抗原を再添加し、洗浄および放出操作を繰り返した。
【０１７５】
精製したタンパク質をセントリコン３０(Centricon 30；アミコン・インコーポレーテッド)で濃縮し、可視化に銀染色を用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥ(７.５％アクリルアミド)で分析した。典型的な精製では、オロソムコイド標準との比較に基づいて、マウス３００匹あたり３０〜４０μｇの抗原を得た。
【０１７６】
ここにはデータを示さないが、精製した物質のポリアクリルアミドゲルは約９００００ダルトンに移動する拡散バンドと、１８００００ダルトン付近のより高分子量のタンパク質を示した。１８００００ダルトン成分に対する９００００ダルトン成分の比は、数多くの調製すべてにおいて１０:１か、もしくはそれ以上であった。この物質を１０％ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって可視化した。
【０１７７】
９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解は、Ｎ-末端アミノ酸そのものを含む単一のＮ-末端配列(図９Ａ)の同定をもたらした。位置１、１９、３３および３４の４つの空白(Ｘ)を伴うＮ-末端の３８アミノ酸を同定した。位置２２のアミノ酸シグナルの欠失を、Ｎ-結合型グリコシル化部位共通配列(ＮＸＴ／Ｓ)を齎す後続のチロシン残基(Ｙ)およびスレオニン残基(Ｔ)と組み合わせることによって、位置２２のアスパラギン(Ｎ)を推論した。
【０１７８】
この３８残基長のＮ-末端の上に示した図９Ａの１３配列残基は、過去にSiegelman等(前掲)が放射活性標識アミノ酸配列決定法を用いて推定したものであり、本研究で決定したＬＨＲの配列と高度な相同性(１３残基中１１残基)を示している。
【０１７９】
２つの別個のＭＬＨＲ調製物を用いて行った３回の配列決定実験のいずれでもユビキチン配列は得られなかった。おそらくこの修飾がマウスの脾細胞には欠失しているか、もしくはユビキチンのＮ-末端がこの供給源から得たＬＨＲではエドマン分解に対して遮蔽されているのであろう。
【０１８０】
図４〜６のアミノ酸配列を、Lipman,D.等,Science 227:1435-1441(1981)のアルゴリズムを用いて、デイホッフ(Dayhoff)タンパク質データベース中の既知配列と比較した。
【０１８１】
図９Ａで下線を付したアミノ酸７から１５までの残基を、図９Ｂに示すオリゴヌクレオチド・プローブを作成するために選択した。これらの残基から３２倍に縮重した２６マー・オリゴヌクレオチド・プローブを設計し、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)オリゴヌクレオチド合成機で合成した。このプローブには、哺乳類コドン使用則に基づいてコドンＣＣＣを選択した位置９のプロリンを除いて、考え得るすべてのコドン縮重性が含まれている。
【０１８２】
細断したマウスの脾臓から得たネズミ脾臓ｃＤＮＡライブラリーをこのプローブを用いてスクリーニングすることによって、単一のハイブリッド形成ｃＤＮＡクローンが単離された。操作としては、５μｇ／ml コンカナバリンＡで６時間処理したネズミ脾細胞から単離したｍＲＮＡから作成したオリゴｄＴ-プライム化ｇｔ１０ネズミ脾臓ｃＤＮＡライブラリー由来の６０００００プラークを１プレートあたり５００００ファージの割合で１２プレートに接種し、２０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０mM ＮａＣｌ、１５mM クエン酸三ナトリウム)、５０mM リン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５ｘデンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、２０μｇ／ml 変性剪断サケ精子ＤＮＡ中４２℃で終夜、図９Ｂに示したＰ３２で標識した３２倍縮重２６マー・オリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリッド形成を行った。これらのパラメーターを本明細書では"厳密条件"と呼ぶ。フィルターを１ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間２回洗浄し、−７０℃で終夜オートラジオグラフィーを行った。一複製陽性クローンを再スクリーニングし、ＥcoＲ１挿入物を単離し、これをＭ１３またはＰＵＣ １１８／１１９ベクター中に挿入し、配列特異的プライマーを用いて一本鎖鋳型からそのヌクレオチド配列を決定した。
【０１８３】
このバクテリオファージに含まれていた２.２キロ塩基のＥcoＲ１挿入物の全ＤＮＡ配列を図４〜６に示す。最長の読み取り枠は位置１０６〜１０８のメチオニンコドンで始まっている。コザック(Kozak)ボックス相同性がこのメチオニンコドンの周辺に認められ、このことはこのコドンがおそらくタンパク質の翻訳開始に際して機能することを示唆している。分子量約４２２００ダルトンの３７３アミノ酸を含有するタンパク質配列がこの読み取り枠内にコードされている。翻訳されるタンパク質には、単離したＭＬＨＲから決定したＮ-末端アミノ酸配列と正確に対応する残基４０から７６までの配列が認められる。
【０１８４】
この結果は、ＭＬＨＲの成熟Ｎ-末端が位置３９のトリプトファン残基から始まることを示唆している。しかし、ＬＨＲの実際のＮ-末端のいくつかのタンパク加水分解プロセシングが、このタンパク質の単離中に起こったであろうと考え
られる。
【０１８５】
このタンパク質の疎水性特性図は、Ｎ-末端に位置する、小胞体のルーメンへの挿入のためのシグナル配列として機能し得る疎水性ドメインを明らかにしている。位置３９〜３３３の推定配列は主として親水性であり、その後にストップ・トランスファーまたは膜固定ドメインに特有の２２残基疎水性ドメインが続いている。
【０１８６】
このタンパク質のまさにＣ-末端にある細胞内領域と思われる領域は極めて短く、１７残基長しかない。貫膜ドメインと予想されるドメインのすぐＣ-末端側には数個の塩基性アミノ酸があり、これは細胞表面受容体の膜アンカーと細胞質ドメインとの結合部に典型的な性質である(Yarden等,Nature)。潜在的リン酸化部位である一セリン残基が推定上の細胞質ドメイン内に存在する。
【０１８７】
このタンパク質は１０カ所の潜在的Ｎ-結合型グリコシル化部位を含有しており、そのすべてが細胞外ドメインと考えられるドメイン内に存在する。ペプチド配列決定分析において位置６０(成熟タンパク質の残基２２)のアスパラギンが欠失することは、この部位でのグリコシル化を裏付けており、この領域の細胞外配向を明らかにしている。解読領域には計２５個のシステイン残基が含まれているが、このシステイン残基のうち４個はリーダー配列と考えられる配列内に位置している。
【０１８８】
ＭＬＨＲ内のタンパク質モチーフ
図１１〜１３に示すように、推定ＭＬＨＲアミノ酸配列を、デイホッフ・タンパク質配列データバンク中の他のタンパク質と、fastpプログラム（Lipman,D.およびPearson,W.,Science 227:1435-1441(1985)）を用いて比較した結果、いくつかの興味深い配列相同性が認められた。
【０１８９】
最も高い配列相同性値を有するタンパク質を、最大の配列相同性を示す領域を実線で囲んで示す。配列の最初に記載した数字は、そのタンパク質内におけるこれらの相同配列の位置を示している。
【０１９０】
図１１は、ＬＨＲのＮ-末端モチーフ(残基３９〜１５５)が、次に列挙するいくつかの炭水化物結合タンパク質相同性を有することを示している(これらの配列のＭＬＨＲに対する相同率(％)をカッコ内に示し、記載した文献は実施例の欄の後に列挙する)：Drikamer;Drickamer等(1)が発見したアミノ酸残基、ＭｕＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、Ｈｕ.ＨｅｐＬｅｃ(２７.８％);ヒト肝炎レクチン(2)、Ｂａｒｎ.Ｌｅｃ(２５％);フジツボ・レクチン(3)、Ｒａ.ＨｅｐＬｅｃ(２３.５％);ラット肝炎レクチン(4)、Ｃｈ.ＨｅｐＬｅｃ(２７.５％);ニワトリ肝炎レクチン(5)、Ｈｕ.ＩｇＥＲｅｃ(２８.６％);ヒトＩｇＥ受容体(6)、ＲａＨｅｐＬｅｃ２(２２.６％);ラット肝炎レクチン２(7)、Ｒａ.ＡＳＧＲｅｃ(２２.６％);ラット・アシアロ糖タンパク質(asialoglycoprotein)受容体(8)、Ｒａ.ＩＲＰ(２５.６％);ラット島再生タンパク質(9)、Ｒａ.ＭＢＰ(２６.１％);ラット・マンノース結合タンパク質(10)、Ｒａ.ＭＢＤＡ(２６.１％);ラット・マンノース結合タンパク質前駆体Ａ(11)、Ｒａ.ＫＣＢＰ(２７％);ラット・クッペル細胞結合タンパク質(12)、ＦｌｙＬｅｃ(２３.１％);ニクバエ(ニクバエ属)レクチン(13)、およびＲａｂ.Ｓｕｒｆ(２０.９％);ウサギ肺界面活性剤(14)。
【０１９１】
図１１からわかるように、ほとんどＮ-末端に局在化しているＬＨＲのモチーフは、カルシウム依存性動物レクチン即ちＣ-型レクチン(1)のいくつかと高度な相同性を示す。これらには、ニワトリ、ラットおよびヒト由来の種々の肝炎糖結合タンパク質、可溶性マンノース結合性レクチン、クッペル細胞由来のレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカン核タンパク質、心肺界面活性剤アポタンパク質およびニクバエおよびフジツボ由来の２種の無脊椎動物レクチンが含まれるが、これらに限定されない。Drickamerとその共同研究者(前掲)によって初めてＣ-型動物レクチンに共通であることが認識された"非変異"アミノ酸のすべてがＭＬＨＲの炭水化物結合ドメイン中に完全に保存されているわけではないが、これらの残基およびその他の位置の相同性の程度は明白である。Ｃ-型族に属する既知のレクチン類は、末端ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミンおよびマンノースを伴うオリゴ糖類(１)を含む糖結合特異性の範囲を示す。
【０１９２】
これらの炭水化物結合タンパク質すべてに不変であることがわかった多くの残基が存在するという事実は、この領域がＭＬＨＲにおいて炭水化物結合ドメインとして機能することを強く示唆しており、リンパ球がリンパ様組織の特殊化した内皮に糖およびカルシウム依存的に結合し得るという観測事実を明確に説明している。いくつかの態様では、隣接ＬＨＲ領域を伴わないＬＨＲの炭水化物結合ドメインを単独で用いて本発明を実施する。
【０１９３】
炭水化物結合ドメイン完結のほとんど直後に認められる次のモチーフ(残基１６０〜１９３)は、表皮成長因子(ｅｇｆ)族に対して高度な相同性を示す。図１２は表皮成長因子(ｅｇｆ)相同性示している：ＭＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、Ｎｏｔｃｈ(３８.５％);キイロショウジョウバエnotch遺伝子座(15)、Ｓ.ｐｕｒｐ(３１.７％);ストロンギロセントロター・プルプラタス(Strongylocentrotur purpuratus)ｅｇｆ様タンパク質(16)、Ｐｒｏ.Ｚ(３４.１％);ウシ・プロテインＺ(17)、Ｆａｃｔ.Ｘ(３４.２％);凝固因子Ｘ(18)、Ｆａｃｔ.VII(２７.３％);凝固因子VII(19)、Ｆａｃｔ.IX(３３.３％);凝固因子IX(20)、Ｌｉｎ-１２(３２.１％);カエノルハドジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)Ｌｉｎ-１２遺伝子座(21)、Ｆａｃｔ.XII(２６％);凝固因子XII(22)、およびＭｕ.ｅｇｆ(３０％);ネズミｅｇｆ(23)。
【０１９４】
図１２からわかるように、ＭＬＨＲのこの領域における相同性の最大値はショウジョウバエ属の神経原性遺伝子座notchに認められるが、この大きな族の他の構成要素のいくつかにもかなりの相同性が認められる。この族の構成要素間でこのドメインの位置が多様であることは、この領域が、異なる機能のための異なるタンパク質間で入れ換えられ得るゲノム断片内に存在し得ることを示唆している。
【０１９５】
６個のシステイン残基に加えて、この族のほとんどすべての構成要素が３個のグリシン残基を共有している。このシステイン残基とグリシン残基の保存はＬＨＲにおけるこの領域の構造上の役割の可能性と一致している。このドメインが、Ｎ-末端に位置する炭水化物結合領域をリガンド相互作用に適した配向に位置させると考えられる。またこのドメインは、内皮表面のｅｇｆ-受容体同族体に結合することによるリンパ球と内皮との相互作用を強化するように働くとも考えられる。
【０１９６】
ＭＬＨＲの細胞外領域中の最後のタンパク質モチーフはアミノ酸１９７から３２８までをコードしている。この糖タンパク質のこの領域は、いくつかの補体因子結合タンパク質と高度な相同性を有するアミノ酸モチーフ(図１３)を含有する６２残基配列の２つの直列反復を含んでいる。
【０１９７】
図１３は補体結合タンパク質相同性を示している：ＭＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、ＨｕＣｏｍＨ(３１.９％);ヒト補体プロテインＨ前駆体(24)、ＭｕＣｏｍＨ(２８.９％);ネズミ補体プロテインＨ前駆体(25)、ＨｕＢｅｔａ(２５.６％);ヒトβ-２-グリコプロテインＩ(26)、ＨｕＣＲ１(２９.９％);ヒトＣＲ１(27)、ＥＢＶ／３ｄ(２５％)６;ヒト・エプスタイン-バー・ウイルス／Ｃ３ｄ受容体(28)、ＨｕＣ２(２７.１％);ヒト補体Ｃ２前駆体(29)、ＨｕＢ(２３.１％);ヒト補体因子Ｂ(30)、ＭｕＣ４ｂ(２２％);ネズミＣ４ｂ結合前駆体(31)、ＨｕＣ１ｓ(２９.２％);ヒトＣ１ｓチモーゲン(32)、ＨｕＣ４ｂ(２６.１％)；ヒトＣ４ｂ結合タンパク質(33)、ＨｕＤＡＦ(２７.１％);ヒト崩壊促進因子(34)、ＶａｃＳｅｃＰ(２６.２％)；ワクシニア・ウイルス分泌ペプチド(35)。
【０１９８】
この反復ドメインの複数の広い範囲をコードするこれらのタンパク質には、数あるなかでも、ヒトおよびネズミ補体Ｈ前駆体、ヒト・ベータ２糖タンパク質、エプスタイン-バー・ウイルス／Ｃ３ｄ受容体、ヒトＣ４ｂ結合タンパク質、崩壊促進因子およびワクシニアウイルス分泌ポリペプチドが含まれる。
【０１９９】
図７ＣはＭＬＨＲ中の２つの直列反復と補体結合族に属するタンパク質に認められる直列反復との相同性を示している。補体結合タンパク質のこの群に保存されているアミノ酸の多くが、保存されているシステイン残基の数を含めて、ＭＬＨＲのこの領域中の２つの反復にも認められる。
【０２００】
興味深いことに、ＭＬＨＲに含まれる２つの反復は、アミノ酸レベルで厳密に互いの複製であるばかりでなく、ヌクレオチド配列レベル(ヌクレオチド残基６８５〜８６５および８６６〜１０５６)でも厳密な相同性を示している。この結果がクローニング・アーチファクト(人工産物)によるものであることも考えられるが、ＭＬＨＲ発現細胞株３８Ｃ１３(スタンフォード大学(Palo Alto,California,U.S.A.)から入手可能)から作成した別個のｃＤＮＡライブラリーから単離した他のクローンのいくつか、およびヒトのＭＬＨＲ同族体(後述)にもこの複製領域が認められている。さらに、いくつかの他の遺伝子(最も注目すべきはＬｐ(ａ)遺伝子である)は、さらに高度なこのドメインの遺伝子内反復配列保存を示す。これらの結果は、ＭＬＨＲが補体結合族の他の構成要素と同様に、この結合ドメインの複数反復を含有することを示唆している。
【０２０１】
結論として、ＭＬＨＲの細胞外領域は互いに結合することによって新しい１または複数の機能を果している３つの別個のタンパク質モチーフを含有していると思われる。この糖タンパク質に含まれるタンパク質モチーフの要約を図１４に示す。
【０２０２】
実施例２：ＨｕＬＨＲのクローニング
上記の例に記述したように一般に、上述のネズミＭel１４抗原ｃＤＮＡクローンの２.２kbＥcoＲ１挿入物を単離し、Ｐ３２三リン酸塩を用いるランダム・プライム化ＤＮＡポリメラーゼ合成によって高比活性に標識し、これを用いて、一次細胞から得たヒト末梢血液リンパ球ｍＲＮＡ由来のオリゴｄＴプライム化ラムダｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから６０００００クローンをスクリーニングした。フィルターを４０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１ｘＳＳＣは３０mM ＮａＣｌ、３mM クエン酸三ナトリウムである)、５０mM リン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、１０％ 硫酸デキストラン、５ｘデンハルト溶液および２０μｇ／ml 剪断煮沸サケ精子ＤＮＡ中４２℃で終夜ハイブリッド形成を行った。これらを０.２ｘＳＳＣ、０.１％ 硫酸ドデシルナトリウム中５５℃で４０分間２回洗浄した。１２クローン(５００００ファージのプレートあたり約１陽性)を選択し、最大のＥcｏＲ１挿入物(〜２.２キロ塩基)を単離し、そのＤＮＡ配列を、配列特異的プライマーを用いるバクテリオファージｍ１３内でのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定した。
【０２０３】
この〜２.２kbクローンは、コザック・ボックス相同領域に続くメチオニンで始まる約４２２００ダルトンの分子量を有する３７２アミノ酸の読み取り枠をコードしていた。このコード化されたタンパク質には２６個のシステイン残基と８カ所の潜在的Ｎ-結合型グリコシル化部位が含まれていた。このタンパク質のＮ-末端の高度に疎水的な領域(残基２０〜３３)はシグナル配列と考えられ、Ｃ-末端に位置する２２アミノ酸長のもう１つの高度に疎水的な領域(残基３３５〜３５７)はストップ・トランスファーまたは膜固定ドメインと考えられた。このＣ-末端疎水領域には、荷電した、おそらく細胞質領域と考えられる領域が続いていた。
【０２０４】
このヒト・クローンのヌクレオチド配列を既に分かっているＭＬＨＲの配列と比較したところ、高度な総ＤＮＡ配列相同性(〜８３％)が認められた。各ＬＨＲドメインにおけるＭＬＨＲとＨｕＬＨＲの相対的アミノ酸配列保存度は次の通りである：炭水化物結合ドメイン--８３％；ｅｇｆ様ドメイン--８２％；補体結合反復１--７９％；補体結合反復２--６３％；総補体結合ドメイン--７１％；貫膜ドメイン--９６％。
【０２０５】
公開されたヘルメス配列(Jalkanen,前掲)を、図１〜３のＨｕＬＨＲ配列と比較すると、配列相同性が無いことがわかる。
【０２０６】
実施例３：ＭＬＨＲの発現
本発明において単離したネズミｃＤＮＡクローンがＭＬＨＲをコードしていることを決定的に立証するために、このクローンを発現ベクター中に挿入し、一時的細胞トランスフェクション検定法で分析した。ＨｕＬＨＲの発現も同様の方法で実行した。
【０２０７】
上述の読み取り枠を含むＥcoＲ１断片(図４〜６に配列を示した〜２.２キロ塩基ＥcoＲ１断片)を単離し、サイトメガロウイルス・プロモーターを含有すｐＲＫ５ベクター(Eaton,D.等,Biochemistry 25:8343-8347(1986)；欧州公開第307247号(1989年3月15日公開))中に連結した。この挿入ｃＤＮＡをプロモーターに対して正しい配向で含有しているプラスミドを選択し、ＣａＰＯ４沈殿法を用いて２９３ヒト胚腎細胞に導入した。
【０２０８】
２日後、細胞を各５００μＣｉのＳ３５システインおよびメチオニンと共にインキュベートした。溶解液と上清を過去に記述されたように調製し(Lasky,L.等,Cell 50:975-985(1987))、Ｍel１４モノクローナル抗体とプロテインＡ・セファロースとの間に挟まれた抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体を使用することによって、Ｍel１４モノクローナル抗体(免疫アフィニティー・クロマトグラフィーで精製したもの)で免疫沈降した。
【０２０９】
同時に、ＭＬＨＲを発現することがわかっている細胞、Ｂ-細胞リンパ腫３８Ｃ１３を、上清ＭＬＨＲを分析するためにメチオニンあるいはシステインで代謝的に標識するか、もしくは細胞に結合したＬＨＲを分析するためにこの細胞表面糖タンパク質をＩ１２５およびラクトペルオキシダーゼで標識し、Ｍel１４抗体免疫沈降によって分析した。
【０２１０】
得られた免疫沈降物を７.５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルで分析し、−７０℃で終夜オートラジオグラフィーにかけた。
【０２１１】
これらの検定結果を図１０に示す。この図におけるレーンＡ〜Ｆの意味を次に説明する：
Ａ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液；
Ｂ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清；
Ｃ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液；
Ｄ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶ外被発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清；
Ｅ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した３８Ｃ１３細胞上清；
Ｆ．Ｉ１２５で表面標識し、Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した３８Ｃ１３細胞溶解液。
【０２１２】
図１０からわかるように、この構築物でトランスフェクションした細胞は、Ｍel１４抗体と特異的に反応する２種類の細胞結合性タンパク質を生産する。これ
らの細胞結合性タンパク質は約〜７００００ダルトンおよび〜８５０００ダルトンに移動し、このことは〜４２２００ダルトンの核タンパク質がトランスフェクション細胞中でグリコシル化されるようになることを示唆している。シアリダーゼ処理を行うと、より大きなバンドの分子量が変化する(データは示していない)ことは、このタンパク質が相対的に成熟型の糖タンパク質であることを示唆し、一方、より低分子量のバンドがこの酵素に対して耐性であることは、このタンパク質が前駆体型であり得ることを示している。
【０２１３】
一時的トランスフェクション細胞株のＭel１４抗体によるＦＡＣ分析は、これらの細胞中で発現したＬＨＲの一部が細胞表面上で検出可能であることを明らかにした(データは示していない)。
【０２１４】
このトランスフェクション細胞株中で生産される、より高分子量の糖タンパク質は、他のトランスフェクション細胞株で得た結果、即ち末梢リンパ節誘導性Ｂ-細胞リンパ腫３８Ｃ１３が産出するもの(図１０レーンＦ)より僅かに小さいことがわかった。これはグリコシル化の細胞特異的相違によるものであろう。
【０２１５】
興味深いことに、３８Ｃ１３細胞とトランスフェクションしたヒト細胞はどちらも、より低分子量型のＭＬＨＲを培地中に放出するようである(図１０レーンＢおよびＥ)。この放出分子の性質は明らかではないが、その分子量が小さいことは、これが膜アンカー付近のタンパク加水分解によって生じた細胞表面型の切断産物であることを示唆している。
【０２１６】
結論として、これらの結果は、本発明者等が単離したｃＤＮＡクローンがＭＬＨＲをコードしていることを明確に立証している。
【０２１７】
実施例４：先端が欠失したＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの構築、精製および分析 図１５は、レクチン、レクチン-ｅｇｆおよびレクチン-ｅｇｆ-補体調節モチーフを含有するＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の構築を示している。この図の最上段は、貫膜アンカードメイン(ＴＭＤ)および短い細胞質配列と共にＮ-末端シグナル配列(ＳＳ)、レクチン・ドメイン、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメインおよび重複した補体調節ドメイン(ＣＤＢ)を含有するネズミリンパ球誘導受容体(ＭＬＨＲ)のタンパク質ドメインを示している。レクチン(ＭＬＨＲ-Ｌ＋ＩｇＧ)、レクチンおよびｅｇｆ(ＭＬＨＲ-ＬＥ＋ＩｇＧ)、およびレクチン、ｅｇｆおよび２つの補体調節モチーフ(ＭＬＨＲ-ＬＥＣ＋ＩｇＧ)を含有する３種類の先端欠失型ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類も図１５に示されている。これらの先端欠失型タンパク質はすべて、これらのキメラがＣＨ２およびＣＨ３定常領域と共に、免疫グロブリン二量化に寄与するヒンジの２個のシステイン残基(Ｃ)を含有するように、ヒンジ・ドメイン(Ｈ)の直ぐ上流のヒト重鎖ガンマ１領域に結合している。過去に特徴づけられたヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域カセット(Caponet等,前掲(1989))を使用した。ＬＨＲ配列とヒトＩｇＧ配列との接合部位は、ヒンジ領域近傍におけるこれらの分子の結合によって、軽鎖が産出されない条件下でキメラ分子が効率的に合成され、二量化されるように選択した。さらに、ヒトＩｇＧ１定常領域を使用することにより、以下に記述する免疫組織化学的実験において、内因性のネズミＩｇＧ類との交差反応性に起因する問題を避けることができる。
【０２１８】
図１６からわかるように、これらのキメラはこれらの一時的トランスフェクション検定中で効率良く合成され、分泌された。抗体を添加しない条件下でのこれらのキメラとプロテインＡセファロースとの反応性は、これらの定常領域ドメインが正常に畳み込まれていることを立証している。図１６は、これらの分子が非還元的条件下で二量化することを示しており、これらのキメラにおいてヒンジ領域が完全に機能的であることを立証している。最後に、プロテインＡ反応性は、プロテインＡセファロース・カラムによるこれらのキメラのほぼ均一な精製をも可能にする。この実施例の結果は、定常ドメインがヒトＩｇＧガンマ１重鎖由来であり、一方、"可変"ドメインがＭＬＨＲ由来であると言える抗体様物質の生産を立証している。
【０２１９】
キメラの構築
過去に記述されたＭＬＨＲ-ＰＲＫ５発現プラスミド(Eaton等(1986)；Lasky等,Cell 50:975-985(1987))およびヒト重鎖ＩｇＧのｃＤＮＡコピー(Capon等,Nature 337:525-531(1989))から出発して、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１-ＣＨ３領域をコードする１１００bpのＨindIII断片を、ＭＬＨＲｃＤＮＡのポリＡ部位の３'に挿入した。ｍ１３複製起点およびＫＯ７ヘルパー・ファージを用いてこのプラスミドを一本鎖鋳型に変換した後、貫膜固定領域と推定される領域のＮ-末端側のレクチン、ｅｇｆおよび第２補体結合反復とヒンジとの間の領域を、インビトロ変異法(ZollerおよびSmith(1982))により、４８マー・オリゴヌクレオチドでループ・アウトした。得られた変異体を、欠失接合部をまたぐ３２Ｐで標識した２１マー・オリゴヌクレオチドでスクリーニングし、単離した変異体をスーパーコイル配列決定法を用いて配列決定した。
【０２２０】
過去に記述された方法を用いてヒト腎２９３細胞をトランスフェクションすることによる発現について、正しい変異体を試験した。３５Ｓメチオニンおよびシステインで標識した上清を、抗体を添加しない条件下でプロテインＡセファロース・ビーズによる免疫沈降によって分析した。沈降したタンパク質を、β-メルカプトエタノールによる還元下または非還元下、７.５％ポリアクリルアミド-ＳＤＳゲルで分析した。正しく発現したキメラを齎すプラスミドを、Ｇ４１８に対する耐性をコードしている選択プラスミドおよびジヒドロ葉酸レダクターゼの存在下でトランスフェクションすることにより、２９３細胞中に導入した。クローンをＧ４１８中で選択し、挿入されたプラスミドをメソトレキセートの存在下で増幅した。各構築物を高レベルで発現する永久細胞株をＴ-フラスコ中で大量に生育させ、その細胞上清を遠心分離および濾過によって透明化した。得られた上清をアミコン濾過によって濃縮し、標準的プロテインＡセファロースカラムに通し、ＰＢＳで洗浄し、０.１M 酢酸、０.１５M ＮａＣｌ(ｐＨ３.５)で溶出させた。溶出した物質を直ちに３M Ｔｒｉｓ(ｐＨ９)で中和し、ＳＤＳゲル電気泳動およびＥＬＩＳＡ検定法で定量した。
【０２２１】
前段落に記述したゲル電気泳動の結果を図１６に示す。還元されたタンパク質をレーンＡ〜Ｆに、非還元タンパク質をレーンＧ〜Ｉに、また精製したタンパク質をレーンＪ〜Ｌに示す。マーカーの分子量をキロダルトンで示す。各レーンの同定を次に説明する：Ａ．分泌されたＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｂ．細胞内ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｃ．分泌されたＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｄ．細胞内ＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｅ．分泌されたＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｆ．細胞内ＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｇ．分泌されたＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｈ．分泌されたＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｉ．分泌されたＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｊ．精製したＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｋ．精製したＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｌ．精製したＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ。
【０２２２】
抗ヒトＩｇＧ１-特異的マウス・モノクローナル抗体で被覆したウェルからなる形式のＥＬＩＳＡを用いて、単離したＬＨＲ-ＩｇＧキメラを定量した。未知試料と高度に精製したヒトＣＤ４-ＩｇＧ１免疫アドヘシン(immunoadhesin)標準を、抗体で被覆したプレートと共にインキュベートした後、そのプレートを洗浄し、結合した物質を西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ１と反応させ、次いでさらに洗浄し、基質を添加した。この定量的検定法によって、サブナノグラム量の単離ＬＨＲ-ＩｇＧキメラが測定できた。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡによるＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラＰＰＭＥ反応性の分析
種々のＩｇＧキメラが酵母細胞壁炭水化物、ポリホスホマンナンエステルまたはＰＰＭＥを認識する能力を、過去に記述された形式のＥＬＩＳＡで分析した(Imai等(1989))。簡単に記述すると、約等量の精製キメラを４℃で終夜微量滴定ウェルに被覆する。非特異的部位をＢＳＡで遮断した後、結合した抗原を５μｇ／mlのＰＰＭＥ溶液と反応させた。結合した炭水化物を、これに対するポリクローナル抗体および標準的(ベクター(Vector))免疫組織化学的染色試薬を用いて検出した。Ｍel１４による阻害を、ＰＰＭＥ添加前にＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ含有ウェルをこのモノクローナル抗体と共に予備インキュベートすることにより実行し、一方、結合反応中に１０mM ＥＧＴＡを添加することにより、この誘導受容体-炭水化物相互作用のカルシウム依存性を立証した。阻害を調べる検定として、ＰＰＭＥインキュベーションの前に他の種々の添加物を加えた。２２℃で１時間後、プレートを洗浄し、ＰＰＭＥに対するウサギ・ポリクローナル抗体と共に２２℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ベクターＡＢＣ-ＡＰと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、発色させた。得られた検定をプレート読み取り機で測定した。阻害検定に使用した炭水化物はシグマ・ケミカル・コーポレイテッド(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO.)から入手した。
【０２２４】
ＰＰＭＥ結合分析の結果を図１７に示す。各レーンは次のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを含有する：Ａ．ＭＬＨＲＬ-、ＭＬＨＲＬＥ-およびＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラに対するＰＰＭＥの結合、Ｂ．Ｍel１４モノクローナル抗体およびＥＧＴＡによるＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ-ＰＰＭＥ結合の阻害、Ｃ．他の炭水化物によるＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ-ＰＰＭＥ結合の阻害。
【０２２５】
過去に行われた研究によって、ＬＨＲが酵母細胞壁マンナン、ホスホマンナンエステルまたはＰＰＭＥに結合し得ること(Yednock等,J.Cell Biol.104:725-731(1987))、並びに、この結合がリンパ球の末梢リンパ節高内皮小嚢に対する吸着能を阻害することが立証されており、これは末梢リンパ節ＬＨＲレクチン・ドメインが末梢リンパ節内皮上の炭水化物を認識するであろうという仮説に合致している。さらにＭel１４抗体がリンパ球表面に対するＰＰＭＥの結合を阻害することも発見され(Yednock等,前掲(1987))、これは、この炭水化物が末梢リンパ節ＬＨＲのレクチン・ドメイン内に結合するという理解と合致している。
【０２２６】
レクチン、ｅｇｆおよび重複した補体結合反復構造を含有するキメラがＰＰＭＥを結合することがわかった。この結合はＭel１４抗体によって阻害可能であり、このことは、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラがこの抗体によって認識されることを立証するデータ(データは示していない)と合致している。またこの結合は、脾細胞から単離されたＭＬＨＲ(Imai等,印刷中(1989))を用いて過去に認められたものと定量的に同等であり、このことは、これがリンパ球表面上のＬＨＲで認められているタンパク質-炭水化物相互作用(Yednock等,前掲(1987))と同じであることを示唆している。さらに、この結合はカルシウム依存性であることもわかり(StoolmanおよびRosen,J.Cell Biol.96:722-729(1983))、このことは、リンパ球結合受容体について既に示されているように、Ｃ型またはカルシウム依存性レクチン・ドメイン(Drickamer,J.Biol.Chem.263:9557-9560(1988))が少なくとも部分的にこの相互作用に寄与することを暗示している(図１６ｂ)。
【０２２７】
過去に行われた研究によって、ＰＰＭＥ以外の種々の炭水化物が脾臓由来のＭＬＨＲによって認識され得ることが立証されている(Yednock等,前掲(1987)；Imai等,前掲(1989))。これらには、フコイジン、硫酸デキストランおよび脳由来のスルファチド類が含まれる。これらの炭水化物がＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラとＰＰＭＥとの相互作用を阻害する能力を、この分子の特異性を過去に記述された脾臓由来の糖タンパク質(Imai等,前掲(1989))と比較するために試験した。図１６からわかるように、フコイジン、硫酸デキストランおよびスルファチドはすべてＰＰＭＥとＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧとの相互作用を阻害することができ、このことは、組換え法で誘導したこのタンパク質の炭水化物特異性が、天然に存在するタンパク質に関して過去に記述されたものとよく似ていることを示している。他の２種類の荷電炭水化物、硫酸コンドロイチンおよびヘパリンによって阻害されないことは、この阻害が特異的炭水化物認識に起因するものであり、これらの化合物の高度に荷電した性質による非特異的相互作用に起因するものではないことを示唆している。
【０２２８】
ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラによる細胞遮断検定
過去に記述された(GeoffreyおよびRosen,J.Cell Biol.,印刷中(1989))パイエル斑およびマウスの末梢リンパ節のクリオスタット切断切片を用いて、スタンプファー・ウッドルフ(Stampfer-Woodruff)細胞遮断検定法(StamperおよびWoodruff,J.Exp.Med.144:828-833(1976))を実行した。簡単に説明すると、ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ、単離した脾臓由来ＭＬＨＲもしくは緩衝液単独の存在下で、凍結組織切片を腸間膜リンパ球と共にインキュベートした。ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを１０μｇ／切片程度の濃度で添加し、１ｘ１０７細胞／mlの添加前に凍結切片上で予備インキュベートした。このスライドを洗浄し、デジタル生物形態計測によって、リンパ球付着を、単位面積あたりのこれらのリンパ様器官中のＨＥＶに結合したリンパ細胞数として測定した。
【０２２９】
データは示さないが、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラは末梢リンパ節ＨＥＶに対するリンパ球の結合を約７５％阻害のレベルで阻害し、一方この検定において、脾臓由来のＭＬＨＲは約５０％のレベルで遮断することがわかった。この阻害はカルシウム依存性であり、ＭＥＬ１４モノクローナル抗体の添加によって遮断された(データは示していない)。
【０２３０】
ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの免疫組織化学的分析
単離したＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを、モノクローナル抗体のために用いる方法と同一の方法を用いる免疫組織化学的実験に使用した。８〜１０ミクロンの組織切片をクリオスタット中で切断し、０.１M カコジレート、１％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間固定した。この切片をダルベッコＰＢＳ中で洗浄し、５％正常マウス血清中の種々の量のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを用いて４℃で３０分間染色した。次にこれらの切片を洗浄し、ビオチニル化したヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体(ベクター)を含む第２段階と共にインキュベートした。第２段階の試薬の添加後およびベクターＡＢＣ錯体の添加前に切片を過酸化水素-メタノールで処理することにより、内因性のペルオキシダーゼを除去した。切片を洗浄し、基質(ＡＥＣ)と共に５〜１０分間インキュベートした。最後に切片を水性ヘマトキシリン(バイオメディア(Biomedia))で対比染色し、ツァイス・アキシオプロット(Zeiss Axioplot)で検査した。
【０２３１】
３種類のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラのこれらの免疫組織化学的分析では末梢リンパ節を組織源として用いた。組織学的供給源として末梢リンパ節を選択したのは、リンパ球がこのリンパ様組織のＨＥＶに対して、Ｍel１４によって遮断され得る様式で結合することが多くの過去の文献によって立証されており、これによりＭＬＨＲによって認識される最大レベルのリガンドがこの組織中に存在するはずであることが示唆されている(Gallatin等,Nature 304:30-34(1983))ことに基づく。ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラは末梢リンパ節ＨＥＶを染色することができた。この染色は専ら高壁(high walled)内皮細胞上に認められ、内腔外または内腔近傍領域は染色されなかった。さらに、この染色はＭＥＬ１４抗体によって遮断可能であり、カルシウムの存在に依存した。このことはＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧの末梢リンパ節ＨＥＶに対する結合が、リンパ球とＨＥＶとの接着に似ていることを示唆している。ＰＰＭＥ結合データと合致して、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧによる末梢リンパ節ＨＥＶの染色はフコイジンおよび硫酸デキストランによって阻害可能であり(図１０)、一方、硫酸コンドロイチンおよび単純なマンナン類はこの染色反応を阻害できなかった(データは示していない)。このこともまた、この染色反応が、この末梢リンパ節ＨＥＶ上に発現した炭水化物リガンドの認識によるものであることを示唆している。これらのデータは、末梢リンパ節ＬＨＲと相互作用し得る内皮分子の組織分布を調べるために、この型の免疫組織化学的試薬を使用し得ることを明らかにしている。
【０２３２】
ＭＬＨＲリガンドがパイエル斑中に存在する
ここには示さないが、免疫組織化学的検定の結果、本発明者等は、予想外にもＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラがパイエル斑の内皮を特異的に認識し得ることを発見した。このキメラは、リンパ細胞を含有するパイエル斑管の高壁内皮を染色するようである。この染色はＭＥＬ１４抗体によって阻害可能であり、カルシウム依存性でもあった。興味深いことに、パイエル斑ＨＥＶの染色は、末梢リンパ節ＨＥＶの染色と比較するといくらか弱いように見え、このことは、このリンパ様器官において発現するＭＬＨＲリガンドがより低レベルであることを示唆している。これらの結果は、他の接着系もこの器官に含まれ得るが(Holzman等,Cell 56:37-46(1989))、末梢リンパ節ＬＨＲに対するリガンドが発現し、それゆえに、このリガンドがこのリンパ様器官の内皮に対するリンパ球の結合に関与することを立証している。
【０２３３】
実施例５：ＣＤ４-ＩｇＧ-ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの構築
過去に構築された２種類のＰＲＫプラスミドをＭＬＨＲ-ＩｇＧおよびヒトＣＤ４-ＩｇＧの直接発現に使用した。ＭＬＨＲプラスミドは上の実施例に記述したものである。ＣＤ４-Ｉｇプラスミドは、ＣＨ１ドメインおよび最初のシステイン残基までのヒンジ領域部分をコードする領域を削除することによって改変した、Capon等の文献(前掲)に記述されているものである。これらのプラスミドを上述の標準的リン酸カルシウム法を用いて、２つの遺伝子が高レベルで一時的に発現する細胞を作成するためにＰＳＶＴ ａｎｔｉｇｅｎと共に、もしくは２つの遺伝子が安定に発現する細胞クローンを選択するためのネオマイシン耐性を付与するためにＰＳＶｎｅｏと共に、ヒト２９３細胞中に同時トランスフェクションした。放射免疫沈降によって発現を分析した；ＣＤ４-ＩｇＧ、ＬＨＲ-ＩｇＧおよびＣＤ４-ＩｇＧ-ＬＨＲ-ＩｇＧはすべてＩｇＧ Ｆｃ部分を含有しているので、これらはすべて標準的方法でプロテインＡによって直接沈降させ得る。３種類の分子、ＣＤ４-ＩｇＧホモ二量体、ＬＨＲ-ＩｇＧホモ二量体およびＣＤ４-ＩｇＧ-ＬＨＲ-ＩｇＧヘテロ二量体を検出した。これらの分子は還元によってそれぞれの単量体成分に分離し、このことは各二量体の構成成分が、ヘテロ二量体を含めて、ジスルフィド結合によって互いに共有結合していることを示している。
【０２３４】
実施例の参考文献
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35.Kotwal,G.等,Nature 335:176(1988)。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、ヒトＬＨＲ(ＨｕＬＨＲ)のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。
【図２】図２は、図１の続きである。
【図３】図３は、図２の続きである。
【図４】図４は、ネズミＬＨＲ(ＭＬＨＲ)のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。
【図５】図５は、図４の続きである。
【図６】図６は、図５の続きである。
【図７】図７は、成熟したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列間の比較を示す。
【図８】図８は、図７の続きである。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＭＬＨＲの単離およびＮ末端配列決定の結果を示す。図９Ａは、ネズミ脾臓の界面活性剤抽出物からMel１４モノクローナル抗体アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製した物質のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルから得た９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解を表す。下線を付したアミノ酸７〜１５の残基を、図９Ｂに示すオリゴヌクレオチド・プローブを作成するために選択した。図９Ｂに３２倍に縮重した２６マー(２６量体)・ヌクレオチド・プローブとして示す。
【図１０】図１０は、ＭＬＨＲｃＤＮＡクローンの一時的発現を表す。レーンＡ〜Ｆを次に説明する。Ａ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液。Ｂ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清。Ｃ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫した、ＨＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液。Ｄ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶ外被発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清。Ｅ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、３８Ｃ１３細胞の上清。Ｆ：Ｉ１２５で表面標識し、Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、３８Ｃ１３細胞の溶解液。
【図１１】図１１は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１１は炭水化物結合ドメインを比較している。
【図１２】図１２は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１２は表皮成長因子ドメインを比較している。
【図１３】図１３は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１３は補体結合因子ドメインを比較している。
【図１４】図１４は、ＬＨＲ中に認められるタンパク質ドメインの模式図であり、これにはシグナル配列、炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメイン、２つの補体結合ドメイン反復(矢印)、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)、および荷電細胞内ドメインが含まれる。
【図１５】図１５は、レクチン、レクチン-ｅｇｆおよびレクチン-ｅｇｆ-補体調節モチーフを含有するＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の構築を表す。
【図１６】図１６は、ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の発現産物および精製物のゲル電気泳動を示す。
【図１７】図１７は、種々のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類のポリホスホマンナンエステル(ＰＰＭＥ)結合分析を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規リガンド(配位子)結合分子および受容体、並びに、リガンド結合分子の循環血漿半減期を改善する組成物および方法に関する。具体的には、本発明はハイブリッド(雑種)免疫グロブリン分子、これらの免疫グロブリン類の製造法および使用法、並びに、これらをコードする核酸に関する。
【０００２】
免疫グロブリンはジスルフィド結合で互いに結合し合ったポリペプチド鎖を含有する分子であり、典型的には２つの軽鎖と２つの重鎖を有する。各鎖の１ドメイン(領域)(Ｖ)は、その分子の抗体特異性に依存する可変アミノ酸配列を有する。もう１つのドメイン(Ｃ)は、同じクラスの分子に共通のかなり定常的な配列を有する。これらのドメインはそのアミノ末端から順番に番号が付与される。
【０００３】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー(上科)は免疫グロブリン様ドメインを伴う分子から構成されている。このファミリーの構成要素には、クラスＩおよびクラスII主要組織適合性抗原、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、γおよびδ鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよびε鎖、ＯＸ-２、Ｔｈｙ-１、細胞間または神経細胞接着性分子(Ｉ-ＣＡＭまたはＮ-ＣＡＭ)、リンパ球機能付随抗原-３(ＬＦＡ-３)、神経細胞質タンパク質(ＮＣＰ-３)、ポリ-Ｉｇ受容体、ミエリン結合糖タンパク質(ＭＡＧ)、高親和性ＩｇＥ受容体、抹消ミエリンの主要糖タンパク質(Ｐｏ)、血小板由来成長因子受容体、コロニー刺激因子-１受容体、マクロファージＦｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体およびガン胎児性抗原が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
ある免疫グロブリンの可変ドメイン(超可変領域を含む)で別の免疫グロブリンを置換できること、またある種の免疫グロブリンの可変ドメインを異なる種に置換できることが知られている。例えばＥＰ０ １７３ ４９４；ＥＰ０ １２５ ０２３；Munro,Nature 312:(1984年12月13日)；Neuberger等,Nature 312(1984年12月13日)；Sharon等,Nature 309:(1984年5月24日)；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)；Boulianne等,Nature 312:643-646(1984年12月13日)などを参照のこと。
【０００５】
Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)は、ある種から得た免疫グロブリン定常領域に融合した別の種由来の可変領域を有する免疫グロブリン・キメラの調製を教示している。この文献は非免疫グロブリン配列(例えば酵素配列)と融合した免疫グロブリン配列を有する分子を示唆しているが、この文献は非免疫グロブリン配列に結合した免疫グロブリン可変ドメインのみを教示している。Morrison等のＥＰ０ １７３ ４９４は同様のキメラを教示している。この著者等は“受容体”という用語を使用し、その“背景”の項で、“免疫グロブリン、酵素および膜タンパク質などの受容体”に言及しているが、彼らの述べた“興味ある受容体”には“Ｂ細胞およびＴ細胞受容体、より具体的には免疫グロブリン(例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、並びに、個々の群の種々のサブタイプ)”が含まれる(３頁１０〜１３行）。この文献の開示は免疫グロブリンキメラに限定されている(例えば３頁２１〜３０行を参照のこと)。
【０００６】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの２構成要素(ＣＤ４およびそのＴ細胞受容体)由来の免疫グロブリン可変様ドメインで、ある免疫グロブリンの可変ドメインを置換し得ることも知られている(例えばCapon等,Nature 337:525-531(1989)；Traunecker等,Nature 339:68-70(1989)；Gascoigne等,Proc.Nat.Acad.Sci.84:2936-2940(1987)；公開された欧州出願ＥＰＯ 0 325 224 A2などを参照のこと)。
【０００７】
多数のタンパク質性物質が、標的分子に特異的に結合することによって機能することがわかっている。これらの標的分子は一般的にはタンパク質であるが、タンパク質であるとは限らない。標的分子またはリガンドに結合する物質を、本明細書ではリガンド結合パートナー(配位子結合相手)と呼び、これには受容体および担体タンパク質、並びに、ホルモン、細胞接着性タンパク質、組織特異的接着因子、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。
【０００８】
リンパ球は特定の組織に標的を定められた細胞の例である。リンパ球は正常組織炎症、並びに、リウマチ様関節炎および他の自己免疫疾患で起こるような病的組織損傷のメディエーター(媒介体)である。脊椎動物は、その生物の空間的に異なる領域に対して異なった抗原特異性を有するリンパ球を分配する機構を進化させてきた(Butcher,E.C.,Curr.Top.Micro.Immunol.128:85(1986)；Gallatin,W.M.等,Cell 44:673(1986)；Woodruff,J.J.等,Ann.Rev.Immunol.5:201(1987)；Duijvestijn,A.等,Immunol.Today 10:23(1989);Yednock,T.A.等,Adv.Immunol.印刷中(1989)。
【０００９】
この機構には、血液とリンパ様器官との間のリンパ球の連続的再循環が含まれている。リンパ球が最も高い移動度を持つ血液と、隔離され加工された抗原にリンパ球が出会うリンパ様器官との間のリンパ球の移動は、リンパ球表面上の受容体と特殊化した毛細管後の細静脈(例えば高内皮細静脈(ＨＥＶ)および慢性的炎症滑膜中に誘発されるＨＥＶ様血管)の内皮細胞上のリガンドとの接着性相互作用によって始まる。
【００１０】
リンパ球接着分子は、これらの細胞を特定の２次的リンパ様器官に局在化させる、もしくは“誘導（home）”することができるので、特に誘導(ホーミング)受容体と呼ばれている。
【００１１】
リンパ球誘導受容体の候補は、マウス、ラットおよびヒトで既に同定されている(Gallatin,W.M.等,Nature 303:30(1983)；Rasmussen,R.A.等,J.Immunol.135:19(1985)；Chin,Y.H.等,J.Immunol.136:2556(1986)；Jalkanen,S.等,Eur.J.Immunol.10:1195(1986))。次に記載する文献は、ネズミ型とされるリンパ球表面タンパク質に対するMel１４と呼ばれるモノクローナル抗体を用いてこの分野で行われた研究について記述している：Gallatin,W.M.等,前掲；Mountz,J.D.等,J.Immunol.140:2943(1988)；Lewinsohn,D.M.等,J.Immunol.138:4313(1987)；Siegelman,M.等,Science 231:823(1986)；St.John,T.等,Science 231:845(1986)。
【００１２】
免疫沈降実験によって、この抗体がリンパ球上の拡散した〜９００００ダルトンの細胞表面タンパク質(Gallatin,W.M.等,前掲)および好中球上の〜１０００００ダルトンのタンパク質(Lewinsohn,D.M.等,前掲)を認識することが示されている。
【００１３】
Mel１４抗体によって限定される糖タンパク質の放射活性標識アミノ酸配列決定によって同定された、リンパ球誘導受容体とされる受容体の部分的配列(１３残基)がSiegelman等によって開示されている(Siegelman,M.等,Science 231:823(1986))。
【００１４】
レクチンは炭水化物結合ドメインを有するタンパク質であり、ヒト、フジツボおよびニクバエを含む種々の動物中に認められる。細胞接着におけるレクチン作用の概念は、ある種のウイルスおよび細菌と真核宿主細胞との相互作用によって例示される(Paulson,J.C.,The Receptors,第2巻,P.M.Conn等共編(Academic Press,NY,1985),131頁；Sharon,N.,FEBS Lett.217:145(1987))。真核細胞-細胞相互作用において、種々の系中の内因性レクチンに関して接着性機能が推測されており(Grabel,L.等,Cell 17:477(1979)；Fenderson,B.等,J.Exp.Med.160:1591(1984)；Kunemund,V.,J.Cell Biol.106:213(1988)；Bischoff,R.,J.Cell Biol.102:2273(1986)；Crocker,P.R.等,J.Exp.Med.164:1862(1986))、これには無脊椎動物(Glabe,C.G.等,J.Cell.Biol.94:123(1982)；DeAngelis,P.等,J.Biol.Chem.262:13946(1987))および脊椎動物受精(Bleil,J.D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.85:6778(1988)；Lopez,L.C.等,J.Cell.Biol.101:1501(1985))が含まれる。特異的細胞認識を達成する手段としてタンパク質-糖相互作用を使用することはよく知られているようである。
【００１５】
リンパ球とそのリガンドとの接着性相互作用にレクチンが関与していることを文献は示唆している(Rosen,S.D.等,Science 228:1005(1985)；Rosen,S.D.等,J.Immunol.印刷中(1989)；Stoolman,L.M.等,J.Cell Biol.96:722(1983)；Stoolman,L.M.等,J.Cell Biol.99:1535(1984)；Yednock,T.A.等,J.Cell Bio.104:725(1987)；Stoolman,L.M.等,Blood 70:1842(1987)；Brandley,B.K.等,J.Cell Biol.105:991(1987)による関連する方法；Yednock,T.A.等,準備中；Yednock,T.A.等,J.Cell Biol.104:725(1987))。
【００１６】
ヒトのリンパ球誘導に関与するであろう表面糖タンパク質の特徴が、一般にヘルメス(Hermes)と呼ばれる一連のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて研究された。免疫細胞型および非免疫細胞型の多数に認められ、抗体プレクリーニング実験によってMel１４抗原に関係すると思われる〜９００００ダルトンの表面糖タンパク質を、これらの抗体が認識した(Jalkanen,S.等,Ann.Rev.Med.38:467-476(1987)；Jalkanen,S.等,Blood,66(3):577-582(1985)；Jalkanen,S.等,J.Cell Biol.105:983-990(1987)；Jalkanen,S.等,Eur.J.Immunol.18:1195-1202(1986))。
【００１７】
表皮成長因子様ドメインは、成長因子、細胞表面受容体、発生遺伝子産物、細胞外マトリックス・タンパク質、血液凝固因子、プラスミノーゲン活性化因子および補体を含む広範囲にわたるタンパク質に認められている(Doolittle,R.F.等,CSH Symp.51:447(1986))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
リンパ球細胞表面糖タンパク質(以下、“ＬＨＲ”と記述する)がリンパ様組織の内皮に対するリンパ球の結合を媒介することが特徴づけられてる。ヒトおよびネズミのＬＨＲ(それぞれＨｕＬＨＲおよびＭＬＨＲ)をコードする全長ｃＤＮＡクローンおよびＤＮＡは同定され、単離されており、さらにこのＤＮＡは組換え宿主細胞によって容易に発現する。ヒトＬＨＲ(ＨｕＬＨＲ)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１〜３に示す。ネズミＬＨＲ(ＭＬＨＲ)のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図４〜６に示す。変異アミノ酸配列もしくは天然には認められないグリコシル化を有するＬＨＲ、並びに、増大した特異的活性や改善された血漿半減期を含む改善された特性を有するＬＨＲの他の誘導体、並びに、このような変異体の調製を可能にする方法をも提供する。
【００１９】
本明細書に、ＬＨＲが次のタンパク質ドメイン：シグナル配列、炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子様(ｅｇｆ)ドメイン、少なくとも１つ、好ましくは２つの補体結合ドメイン反復、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)、および荷電細胞内または細胞質ドメイン、を含有する糖タンパク質であることを示す。本発明のＬＨＲは、これらのドメインの少なくとも１つを含有するが、すべてを含有する必要はない。
【００２０】
リガンド-結合パートナー相互作用に関する多くの先天性異常の治療用薬剤の開発において成功した方法は、リガンドと結合パートナーとの相互作用または結合を遮断するアンタゴニスト(拮抗薬)の同定であった。１つの方法は、外来性結合パートナーを天然の結合パートナーの競争的アンタゴニストとして使用することである。しかし多くのリガンド結合パートナーは、細胞の脂質二重膜に固定された細胞膜タンパク質である。膜成分の存在は典型的には製造および精製の観点から望ましくない。さらに、これらの分子は通常は細胞表面上のみに存在するので、循環中でより安定な形態でこれらを生産することが望ましいであろう。また、先端の欠失したリガンド結合パートナーや可溶性リガンド結合パートナーでも、生体内血漿半減期が比較的短く、胎盤または他の生物学的障壁を通過しないであろうし、またエフェクター機能を送達せず単にそのリガンド認識部位を隔離するだけでは治療的目的には不適切であろうから、治療薬として最適な効果を示さないであろう。
【００２１】
したがって本発明の目的は、免疫グロブリン・ドメインや血漿タンパク質など、リガンド結合パートナーの生体内血漿半減期を長時間持続させ、またプロテインＡによる精製を容易にするよう機能する部分に融合したリガンド結合パートナーを生産することにある。さらなる目的は、リガンド結合パートナーの接着性および標的選択特性と、補体結合や細胞受容体結合などの免疫グロブリン・エフェクター機能とを合わせ持つハイブリッド免疫グロブリン分子を提供することにある。さらに別の目的は、治療的に使用するため、あるいはリガンド結合パートナーまたはその標的のインビトロ(試験管内)検定のための診断用試薬として使用するために、上述のような新規機能性を伴う分子を提供することにある。もう１つの目的は、多数のリガンド結合パートナー(そのそれぞれは同じであっても、異なっていてもよい)を会合させることによって、複数のリガンドを結合および／または活性化し得るようになる多機能性分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
具体的には、１つの目的は、毒素、細胞表面パートナー、酵素、栄養物質、成長因子、ホルモン、もしくは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー構成要素の定常ドメイン様部分などのエフェクター分子などのリガンド結合パートナーを、そのリガンド結合パートナーのためのリガンドを保持する細胞に向かわせるための分子、およびリガンド結合パートナーの精製を容易にする際に使用するための分子を製造することにある。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、治療的部分を特定の組織およびリガンドに対して誘導する際に使用するリガンド結合パートナー-免疫グロブリン・ハイブリッド・ヘテロ多量体、特にヘテロ二量体およびヘテロ四量体を提供することにある。例えば、ＣＤ４-ＩｇＧをヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などのウイルスに感染した組織に誘導するために、ＬＨＲ-ＩｇＧ鎖１本およびＣＤ４-ＩｇＧ鎖１本から構成されるハイブリッド免疫グロブリンを使用することができる。同様に、毒素を目的の組織に送達するために、毒素-血漿タンパク質部分と組み合わされたリガンド結合パートナー-血漿タンパク質部分を有する分子を使用する。
【００２４】
もう１つの目的は、これらの分子を組換え細胞培養中で発現させる方法を提供することである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規なポリペプチド、それらの作製方法、およびそれらをコードする核酸が提供される。これらのポリペプチドは、細胞表面接着分子およびリガンドとして有用であり、治療または診断用組成物および方法において有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の目的は、リガンド結合パートナーとの融合物として存在するときにリガンド結合パートナーの生体内血漿半減期を延ばすことができる安定な血漿タンパク質、特に免疫グロブリン定常ドメイン、に融合したリガンド結合パートナーからなる新規ポリペプチドを提供することによって達成される。また、このポリペプチドをコードするＤＮＡ、このポリペプチドを製造するための培養物および方法をも提供する。
【００２７】
安定血漿タンパク質が、同じポリペプチド鎖あるいは異なるポリペプチド鎖が通常はジスルフィド結合および／または非共有結合で結合することによって集合した複数鎖ポリペプチドを形成しており、通常は多量体型で存在する多くの場合(例えば、免疫グロブリンまたはリポタンパク質)には、リガンド結合パートナーを含有する本発明の融合物もまた、安定血漿タンパク質前駆体と本質的に同じ構造を有する多量体として生産され使用されるであろう。これらの多量体は、それが含有するリガンド結合パートナーに関して均一であり得るし、あるいは複数のリガンド結合パートナーを含有することも有り得る。さらにこれらの多量体は１または複数のリガンド結合パートナー部分を含有し得る。
【００２８】
安定血漿タンパク質が免疫グロブリン鎖である好ましい態様として、リガンド結合パートナーを少なくとも１本の鎖中に置換し、また普通はリガンド結合パートナーで免疫グロブリンの可変領域またはその適切な断片を置換する。しかし、本発明が免疫グロブリンの複数の鎖中に同じ、もしくは異なるリガンド結合パートナーが置換された融合物をも包含することは理解されるであろう。複数のリガンド結合パートナーが互いに異なる場合、集合した最終的な複数鎖ポリペプチドは、天然の可変領域を有する多機能抗体では不可能な様式でリガンドを架橋することができる。
【００２９】
この種類に属する特定の複数鎖融合物は、１本の免疫グロブリン鎖の可変領域がＣＤ４などの一次受容体のリガンド結合領域によって置換されており、一方、もう１つの免疫グロブリン鎖の可変領域がＬＨＲの結合機能性によって置換されており、その両免疫グロブリン鎖が本質的に通常の様式で互いに結合し合っているものである。
【００３０】
ペプチド結合もしくは試験管内で生成する結合を通して追加の治療的部分、例えばポリペプチド毒素、診断用標識、あるいは他の機能性など、に結合させることにより、本発明の融合物をさらに修飾することができる。
【００３１】
本発明の融合物の製造は、その融合物をコードする核酸で宿主細胞を形質転換し、その宿主細胞を培養し、その培養から融合物を回収することによって行う。本発明の融合物をコードするベクターおよび核酸、並びに、それらを含有する治療用および診断用組成物をも提供する。
【００３２】
本発明は、そのある側面として、ＬＨＲ自体に関する。本発明のＬＨＲは、図１〜３および図４〜６に記載のアミノ酸配列を有する全長成熟ＬＨＲ、および天然に存在する対立遺伝子、試験管内で誘導体化することによって製造した共有結合的誘導体、あるいはそれらの予め決定されたアミノ酸配列変種もしくはグリコシル化変種である。
【００３３】
本発明が提供する新規組成物は精製され、抗ウイルス療法、神経変調療法、あるいは免疫変調療法を必要とする患者に投与するための薬学的に許容される担体中に製剤化され、細胞接着の変調に使用される。本発明は、受容体媒介性の異常を有する患者の治療に特に有用である。さらに本発明が提供する組成物は、その安定血漿タンパク質成分に結合し得る抗体または他の物質を使用することによってその融合物を吸収する、リガンド結合パートナーの組換え細胞培養からの精製の中間体としても有用であり、あるいは、安定血漿タンパク質が間接的標識として働く、リガンド結合パートナーの診断的検定にも有用である。
【００３４】
詳細な説明
本明細書で定義されるリガンド結合パートナーは、標的リガンド分子に特異的に結合するよう機能することが知られているタンパク質であり、その天然状態では一般に分泌ポリペプチドもしくは膜結合ポリペプチドとして存在する。典型的な膜結合型リガンド結合パートナーには疎水性貫膜領域またはリン脂質アンカーが含まれる。リガンド結合パートナーには、受容体、担体タンパク質、ホルモン、細胞接着性タンパク質(ある細胞に対する他の細胞の接着を指示または誘発するタンパク質)、レクチン結合分子、成長因子、酵素、栄養物質などが含まれる。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素でないか、もしくは上記の説明で除外したＣＤ抗原類も適切なリガンド結合パートナーである(Knapp等,Immunology Today 10(8):253-258(1989))。血小板成長因子受容体およびインスリン受容体もリガンド結合パートナーとして選択できる。リガンド結合パートナーには全長天然型のみならず、正常なリガンドに結合する能力の残っている先端が欠失したアミノ酸配列変種またはその他のアミノ酸配列変種も含まれる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語“リガンド結合パートナー”は免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの多形性構成要素および非多形性構成要素、並びに、それに相同のタンパク質(例えばクラスＩおよびクラスII主要組織適合性抗原、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体α、β、γおよびδ鎖、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３のγ、δおよびε鎖、ＯＸ-２、Ｔｈｙ-１、細胞間または神経細胞接着分子(Ｉ-ＣＡＭまたはＮ-ＣＡＭ)、リンパ球機能付随抗原-３(ＬＦＡ-３)、神経細胞質タンパク質(ＮＣＰ-３)、ポリ-Ｉｇ受容体、ミエリン結合糖タンパク質(ＭＡＧ)、高親和性ＩｇＥ受容体、抹消ミエリンの主要糖タンパク質(Ｐｏ)、血小板由来成長因子受容体、コロニー刺激因子-１受容体、マクロファージＦｃ受容体、Ｆｃガンマ受容体、ガン胎児性抗原など)を特に除外する。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素に相同という用語は、この除外のみを目的として、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素の配列を有すること、もしくは、このスーパーファミリーの既知の構成要素に対して、上に挙げた特定の例が免疫グロブリン可変または定常ドメインの配列に対して有するアミノ酸配列相同性と同等(もしくはより高度)のアミノ酸配列相同性を有する配列を、その中に含有することを意味する。ただしこの記述は、リガンド結合パートナー融合物がさらに免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素またはその融合物と集合して多量体を形成する態様を排除しないことに注意すること。
【００３６】
また、用語“リガンド結合パートナー”からは、分離した遺伝子(複数サブユニットポリペプチドを導く単一鎖前駆体ポリペプチドをコードしない遺伝子)によってコードされ、そのポリペプチドの少なくとも１サブユニットが通常は細胞膜中に挿入されている複数サブユニット(鎖)ポリペプチド(ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０６９５３(１９９０年６月２８日公開)に例示されている、細胞外マトリックス分子のための細胞受容体(例：インテグリン)を含む)も特に除外される。ただしこの記述は、リガンド結合パートナー融合物がさらに本段落で定義した複数サブユニットポリペプチドまたは複数サブユニット・ポリペプチドの融合物と集合して多量体を形成する態様を排除しないことに注意すること。
【００３７】
安定血漿タンパク質は典型的には約３０〜２０００残基を有し、その天然の環境において循環中の半減期の延長(例えば約２０時間以上)を示すタンパク質である。適切な安定血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンである。典型的には、リガンド結合パートナーを、そのリガンド結合パートナーに増大した半減期を付与し得る血漿タンパク質またはその断片のＮ-末端で、血漿タンパク質に融合する。リガンド結合パートナーは一般にその天然のＣ-末端で血漿タンパク質に融合する。しかし場合により、リガンド結合パートナーの(貫膜領域および細胞質領域が削除された)先端欠失型を、実質的に疎水性ハイドロパシー特性を示す安定タンパク質の一部、典型的には約２０残基以上を有する疎水領域が認められる成熟安定タンパク質の第１部位、に融合する。このような部位はトランスフェリンに存在し、アルブミンおよびアポリポタンパク質にも極めて普遍的であり、その同定に困難は伴わないはずである。次に、リガンド結合パートナーに増大した血漿半減期を付与するのに必要な程度の安定タンパク質の残部を融合物中に組み込む。リガンド結合パートナーの血漿半減期の増大が約１００％以上なら満足のゆく結果である。
【００３８】
いくつかの好ましい態様として、結合パートナーをＬＨＲとする。ＬＨＲは、図１〜３または図４〜６のＬＨＲと同様の定性的生物活性を有するポリペプチドと定義され、好ましくは図１〜３または図４〜６のＬＨＲの炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子ドメイン、もしくは炭水化物結合ドメインと約７０％以上相同なドメインを含有する。
【００３９】
本明細書では、ＬＨＲに関する相同性を、配列を並べ、必要ならば最大相同性率を達成するために間隙を導入した後に、図１〜３または図４〜６中の炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子ドメイン、または補体結合ドメイン中の残基と同一である候補配列中の残基の百分率と定義する。
【００４０】
本明細書で使用する用語としてのＬＨＲの範囲には、図１〜３または図４〜６に記載したＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲのアミノ酸配列を有するＬＨＲ、図１〜３または図４〜６のＬＨＲと同様の生物活性を示し得る脱グリコシル化ＬＨＲ誘導体または非グリコシル化ＬＨＲ誘導体、図１〜３または図４〜６の配列の相同アミノ酸配列変種、および試験管内で生成したＬＨＲの相同変種および誘導体が含まれる。
【００４１】
ＬＨＲまたはＬＨＲ断片の生物活性を、１）ＬＨＲの少なくとも１つのエピトープと免疫学的に交差反応するか、もしくは２）ＬＨＲと質的に同等の少なくとも１つの接着性機能、調節機能またはエフェクター機能を有することと定義する。
【００４２】
ＬＨＲの定性的生物活性の一例は、リンパ様組織の特殊化した高内皮細胞上のリガンドに対する結合である。また、リガンド結合にはしばしばカルシウムなどの二価カチオンが必要である。
【００４３】
免疫学的に交差反応性という用語は、本明細書では、候補ポリペプチドが、既知の活性類縁体に対して生じたポリクローナル抗血清とのこの活性を有するＬＨＲの定性的生物活性を競争的に阻害し得ることを意味する。このような抗血清は、完全フロインドアジュバント中の既知の活性類縁体をヤギまたはウサギに例えば皮下注射した後、追加免疫を不完全フロインドで腹腔内注射または皮下注射することによる常法で調製される。
【００４４】
構造的には、図７〜８に示したようにＬＨＲには数個のドメインが含まれ、これらは次のように同定される(±１０残基以内)：シグナル配列(残基２０〜３２)、これに続く炭水化物結合ドメイン(図７〜８では“レクチン”ドメインと同定されている)(残基３９〜１５５)、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメイン(残基１６０〜１９３)、補体因子結合ドメイン(残基１９７〜３１７)、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)(残基３３３〜３５５)および細胞質ドメイン(残基３５６〜３７２)。ＬＨＲ細胞外ドメインの境界は一般に貫膜ドメインのＮ-末端もしくはその約３０残基以内にあり、ＬＨＲ配列を精査することによって容易に同定できる。これらのドメインはいずれも、あるいはすべて本発明の実施に使用できる。
【００４５】
図１１〜１３は、これらのドメインの３つに対していくらかの相同性を有する種々のタンパク質を示している。図１１は、炭水化物結合ドメインを示し、図１２は表皮成長因子ドメインを示し、図１３はいくらか相同な補体結合ドメインを示している。
【００４６】
図７〜８に掲載したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列の比較は、全体の配列相同性が高度(〜８３％)であることを示している。しかし、ＨｕＬＨＲとＭＬＨＲに認められる種々のドメイン間の相同性の程度は様々である。例えばＭＬＨＲとＨｕＬＨＲの間の配列保存度は、炭水化物結合ドメインおよびｅｇｆドメインの両者では約８３％であるのに対して、第１補体結合反復中の保存度は７９％に減少し、第２反復では６３％しかなく、補体結合ドメイン全体の相同性は約７１％である。さらに、ＭＬＨＲの２つの補体結合ドメイン反復は同一であるのに対し、ＨｕＬＨＲでは相違が認められ、ネズミの反復とも異なっている。興味深いことに、貫膜配列および周辺領域におけるこれらの２つの受容体間の保存度はほぼ同一であり、おそらく貫膜アンカー領域内に保存的疎水性置換が１つあるだけである。
【００４７】
一般にヘルメスと呼ばれる一連のモノクローナルおよびポリクローナル抗体によって認識される上述の表面糖タンパク質は、本発明の範囲から除外される。
【００４８】
免疫グロブリンおよびそのある種の変異体は既知であり、多くが組換え細胞培養中で製造されている。例えば米国特許第４７４５０５５号；ＥＰ第２５６６５４号；Faulkner等,Nature 298:286(1982)；ＥＰ１２０６９４；ＥＰ１２５０２３；Morrison,J.Immun.123:793(1979)；Kohler等,P.N.A.S.USA 77:2197(1980)；Raso等,Cancer Res.41:2073(1981)；Morrison等,Ann.Rev.Immunol.2:239(1984)；Morrison,Science 229:1202(1985)；Morrison等,P.N.A.S.USA 81:6851(1984)；ＥＰ２５５６９４；ＥＰ２６６６６３；ＷＯ８８／０３５５９を参照のこと。再分類された免疫グロブリン鎖も知られている。例えば米国特許第４４４４８７８号；ＷＯ８８／０３５６５；ＥＰ６８７６３およびこれらに引用された文献を参照のこと。
【００４９】
普通はリガンド結合パートナーをＣ-末端で、免疫グロブリンの定常領域のＮ-末端に融合して、その可変領域を置換するが、結合パートナーのＮ-末端融合も望ましい。貫膜領域または脂質もしくはリン脂質アンカー認識配列を含有するリガンド結合パートナーのこれらの領域または配列は融合に先立って不活化するか削除することが好ましい。
【００５０】
典型的な場合、このような融合物は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを残している。定常ドメインのＦｃ部分のＣ-末端か、重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のすぐＮ-末端側で融合を行うこともある。通常これは、適切なＤＮＡ配列を構築し、それを組換え細胞培養中で発現させることにより達成される。しかし別法として、本発明のポリペプチドを既知の方法に従って合成することもできる。融合を行う正確な部位は重要ではない。特定の部位はよく知られており、結合パートナーの生物活性、分泌または結合特性を最適化するよう選択することができる。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。
【００５１】
いくつかの態様では、ハイブリッド免疫グロブリンが単量体、あるいはヘテロ多量体またはホモ多量体(特に二量体または四量体)として会合する。一般的にこれらの会合した免疫グロブリンは、次の模式図で表される既知の単位構造を有するであろう。基本４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがとる形態である。高分子量免疫グロブリン中では４鎖単位が反復される。ＩｇＭは一般に、互いにジスルフィド結合で結合し合った基本４鎖単位の５量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、および場合によってＩｇＧグロブリンも多量体型で血清中に存在し得る。多量体の場合、それぞれの４鎖単位は同一であり得るし、異なることもあり得る。
【００５２】
本明細書の模式図において、“Ａ”は、そのリガンドに結合し得るリガンド結合部位を含有するリガンド結合パートナーの少なくとも一部を意味する。Ｘは追加の薬剤を表し、これはもう１つの機能性リガンド結合パートナー(Ａと同一または異なる)であってもよいし、上に定義した複数サブユニット(鎖)ポリペプチド(例えばインテグリン)、あるいは可変領域または可変領域様ドメインなど免疫グロブリン・スーパーファミリーの構成要素の一部(天然またはキメラ免疫グロブリン可変領域を含む)、あるいはシュードモナス外毒素やリシンなどの毒素、あるいは普通は定常ドメインに結合していないポリペプチド治療薬であってもよい。ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨは免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変または定常ドメインを表す。これらの模式図が単に一般的な会合免疫グロブリン構造の例であって、すべての可能性を包含するものではないことは理解されるであろう。例えば数個の異なる“Ａ”または“Ｘ”がこれらの構築物いずれかに存在することが望ましいかも知れないことは理解されるであろう。
【００５３】
【化１】
【００５４】
これらの模式図が単に例示であること、また多量体の鎖が天然の免疫グロブリンと同じ様式でジスルフィド結合していると考えられることは理解されるであろう。本発明によれば、適切な核酸で形質転換された哺乳類細胞からハリブリッド免疫グロブリンが容易に分泌される。この分泌型には、結合パートナーのエピトープが重鎖二量体、軽鎖単量体または二量体中に存在するもの、並びに、結合パートナーのエピトープが１または複数の軽鎖または重鎖に融合して存在する重鎖および軽鎖ヘテロ四量体(４つまで、あるいは４つすべての可変領域類縁体が置換されているヘテロ四量体を含む)が含まれる。軽-重鎖非結合パートナー可変様ドメインが存在する場合、ヘテロ機能性抗体が提供される。
【００５５】
様々な構造の鎖また基本単位を使用することによって、本発明の単量体、ヘテロ多量体およびホモ多量体および免疫グロブリンを組み立てることができる。これらの基本単位の特定の例を次の模式図に表し、以下の式を省略するための等価表示を示す。
【００５６】
【化２】
【００５７】
本発明によって製造される会合した新規免疫グロブリンの種々の例を以下に模式的に表す。上に定義した記号に加えて、ｎは整数を表し、Ｙは共有結合的架橋部分を表す。
【００５８】
（ａ）ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｃ）ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｄ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ,ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｅ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ, ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｆ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ, ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ,ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｇ）[Ａ−Ｙ]ｎ−[ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ]２；
（ｈ）ＸＣＨまたはＸＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ］；
（ｉ）ＸＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｊ）ＸＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｋ）ＸＣＨ−ＶＬＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ]；
（ｌ）ＸＣＬ−ＡＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ,ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
（ｍ）ＡＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ,ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，またはＡＣＬ−ＸＣＨ];
Ａ、Ｘ、ＶまたはＣを共有結合的架橋部分(Ｙ)で、(Ａ−Ｙ)ｎ、(Ｘ−Ｙ)ｎなどになるように改変してもよい。
【００５９】
リガンド結合パートナーＡは、例えば任意にＡαおよびＡβと表される鎖を有する複数鎖分子であってもよい。これらの鎖を一単位として、上で単一鎖“Ａ”と記載した部位に置く。この複数鎖の１本を(残りの鎖が正常な様式で、共有結合的または非共有結合的に融合鎖と結合している状態で)、免疫グロブリン鎖の一本に融合するか、あるいは、リガンド結合パートナーが２つの鎖を含有する場合には、１本の鎖を独立して免疫グロブリン軽鎖に融合し、もう１つの鎖を免疫グロブリン重鎖に融合する。
【００６０】
ここではリガンド結合パートナーの１本の鎖だけを安定血漿タンパク質に融合することが好ましい。この場合、結合パートナー鎖の１本と安定血漿タンパク質との間にペプチド結合による融合を行い、リガンド結合パートナーの他方の鎖は、自然に結合している時の様式、例えばジスルフィド結合や疎水相互作用で、融合鎖に結合させる。ペプチド融合のために選択するリガンド結合パートナー鎖は、貫膜ドメインを含有する鎖であるべきであり、その融合を本質的にその貫膜ドメインのＮ-末端側から行うか、貫膜および細胞質ドメインを置換するように行うであろう。複数の貫膜ドメインが存在する場合には、通常、融合(または削除後の融合)のためにその１つを選択し、他方を非融合のまま残すか、もしくは削除する。
【００６１】
以下に模式化する構造を有する基本単位は、複数鎖リガンド結合パートナーを伴う単量体、ヘテロ多量体およびホモ多量体(特に二量体および三量体)を作成するために使用するものの例である。
【００６２】
【化３】
【００６３】
上記の単位構造に使用される２鎖リガンド結合パートナー(“ＡαおよびＡβ”)を有する新規会合抗体の種々の例を以下に模式的に表す。
【００６４】
（ｎ）ＡαＡβＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｏ）ＡαＡβＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｐ）ＡαＣＬ−ＡβＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｑ）ＡβＣＬ−ＡαＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｒ）ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｓ）ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｔ）ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
（ｕ）ＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ−[ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＶＨＣＨ，ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ,ＸＣＨ，ＸＣＬ，ＸＣＬ−ＸＣＨ，ＸＣＬ−ＶＨＣＨ，ＸＣＨ−ＶＬＣＬ，ＸＣＬ−ＡＣＨ，ＡＣＬ−ＸＣＨ，ＡαＡβＣＨ，ＡαＡβＣＬ，ＡαＣＬ−ＡβＣＨ，ＡβＣＬ−ＡαＣＨ，ＡαＡβＣＬ−ＶＨＣＨ，ＡαＡβＣＨ−ＶＬＣＬ,ＡαＡβＣＬ−ＸＣＨ,またはＡαＡβＣＨ−ＸＣＬ];
上の表に示した構造は単に重要な特徴を示すだけであり、例えば上記の構造は免疫グロブリンの結合(Ｊ)ドメインや他のドメインを示しておらず、またジスルフィド結合も示していない。これらを簡潔のために省略する。しかし、そのようなドメインが結合活性にとって必要な場合には、その場合に応じて結合パートナーまたは免疫グロブリン分子中でそれらが占める通常の位置にそのようなドメインが存在すると見なされるべきである。
【００６５】
免疫グロブリンＶＬＶＨ抗体結合部位が上に示されている場合、あるいはＸＣＬまたはＸＣＨが示されておりＸが免疫グロブリン可変領域を表す場合は、それが予め決定した抗原に結合し得ることが好ましい。適切な免疫グロブリン結合部位および融合パートナーはＩｇＧ-１、-２、-３、または-４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得られるが、ＩｇＧ-１が好ましい。上記の模式的例は二価抗体の代表例である。より複雑な構造は、他のクラス(例えばＩｇＭ)由来の免疫グロブリン重鎖配列を使用することによって齎されるであろう。
【００６６】
特に好ましい態様は、リンパ様組織内皮のための結合部位を含有するＬＨＲのＮ-末端部分の、免疫グロブリンＧ１のエフェクター機能を含有する抗体のＣ-末端Ｆｃ部分への融合物である。この種類には２つの好ましい態様がある。その１つは、全重鎖定常領域がＬＨＲの一部に融合している態様であり、もう１つはＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(重鎖定常領域の第１残基を１１４として残基２１６(Kabat等,"Sequences of Proteins of Immunological Interest",第4版,1987)、もしくは他の免疫グロブリンの類似の部位)がＬＨＲの一部に融合している態様である。後者の態様を実施例４に記述する。
【００６７】
本発明のこれらの組成物、特にリガンド結合パートナーの生物活性部分で免疫グロブリン鎖の可変領域が置換されているものは、生体内血漿半減期の改善を示すと考えられる。これらのハイブリッド免疫グロブリンは、免疫グロブリン様ドメインで免疫グロブリンの可変領域が置換されている構築物と同様の方法で構築される。例えばCapon等,Nature 337:525-531(1989)；Traunecker等,Nature 339:68-70(1989)；Gascoigne等,Proc.Nat.Acad.Sci.84:2936-2940(1987)；公開欧州出願ＥＰＯ 0 325 224 A2を参照のこと。本発明のハイブリッド免疫グロブリンは、ある種の抗体由来の可変ドメインで別の種の可変ドメインが置換されているキメラ抗体と同様の方法でも構築される。例えばＥＰ 0 125 023；Munro,Nature 312:(1984年12月13日)；Neuberger等,Nature 312:(1984年12月13日)；Sharon等,Nature 309:(1984年5月24日)；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Morrison等,Science 229:1202-1207(1985)；Boulianne等,Nature 312:643-646(1984年12月13日)を参照のこと。結合パートナーをコードするＤＮＡを、目的の結合パートナードメインをコードするＤＮＡの３'末端かその近位、およびその成熟ポリペプチドのＮ-末端をコードするＤＮＡかその近傍(異なるリーダーの使用を計画する場合)、もしくは結合パートナーのＮ-末端コード領域かその近位(天然のシグナルを使用する場合)で、制限酵素によって切断する。次にこのＤＮＡ断片は、免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡに容易に挿入でき、必要ならば欠失変異法によって加工する。ヒトのインビボ(生体内)療法にこの変種を利用したい場合は、これがヒト免疫グロブリンであることが好ましい。
【００６８】
ＬＨＲ細胞外ドメインは一般にそのＣ-末端で免疫グロブリン定常領域に融合する。融合を行う正確な部位は重要でない。可溶性ＬＨＲ-Ｉｇ融合物の分泌や結合特性を最適化するために、細胞外領域近傍または細胞外領域内の他の部位を選択してもよい。至適部位は定型の実験によって決定されるであろう。融合は典型的には貫膜ドメインおよび細胞質ドメインの両方またはそのどちらかを置換する。
【００６９】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは既知であるか、もしくはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能であるか、あるいは合成できる。例えばAdams等,Biochemistry 19:2711-2719(1980)；Gough等,Biochemistry 19:2702-2710(1980)；Dolby等,P.N.A.S.USA,77:6027-6031(1980)；Rice等,P.N.A.S.USA 79:7862-7865(1982)；Falkner等,Nature 298:286-288(1982)；Morrison等,Ann.Rev.Immunol.2:239-256(1984)を参照のこと。
【００７０】
ＬＨＲをコードするＤＮＡ配列を本明細書に記載する。既知の、あるいはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能な他の望ましい結合パートナーをコードするＤＮＡ配列も本発明の実施に適している。
【００７１】
本発明の融合物をコードするＤＮＡを、発現用の宿主細胞に導入する。多量体を望む場合には宿主細胞を、その多量体を構成する各鎖をコードするＤＮＡで形質転換するが、この際、その多量体の鎖を目的の様式で組み立て得るように宿主細胞を最適に選択する。宿主細胞がトランスフェクション前に免疫グロブリンを産出している場合には、軽鎖または重鎖に融合した結合パートナーでトランスフェクションするだけでヘテロ抗体を生産することができる。結合パートナードメインを保持する１または複数のアームと、付随の可変領域を保持する１または複数のアームを有する前記の免疫グロブリンは、結合パートナーリガンドと抗原または治療的部分について２重の特異性を齎す。多重に同時形質転換した細胞を上述の組換え法と共に用いることによって、例えば上述のヘテロ四量体免疫グロブリンなど、多重特異性を有するポリペプチドが生産される。
【００７２】
一般的に、融合物は細胞内で発現し、よく分泌されるが、種々の融合物の組換え宿主からの分泌程度にはいつもかなりの多様性が認められることがわかった。
【００７３】
また、異なる特異性を有する免疫グロブリンから完全なヘテロ抗体を生産する方法は既知である。これらの方法をインビトロ合成に採用するか、もしくは免疫グロブリンまたは免疫グロブリンハイブリッドを過去に使用した場合にはその結合パートナー-免疫グロブリン鎖を単に置換することによるヘテロキメラ抗体の生産に採用する。
【００７４】
ヘテロ機能性抗体生産の別法として、結合パートナー-免疫グロブリン融合物を産出する宿主細胞(例えばトランスフェクションした骨髄腫)を、ある抗原に対して望ましい付随特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマまたはＢ細胞と融合する。ヘテロ二機能性抗体をこのようなハイブリドーマの培養培地から回収することによって、従来のインビトロ再分類法(ＥＰ 68763)より多少便利にヘテロ二機能性抗体を生産することができる。
【００７５】
本発明はＬＨＲまたは他の結合パートナーのアミノ酸配列変種をも包含する。結合パートナーのアミノ酸配列変種は種々の意図で調製され、これらの意図にはリガンドに対する結合パートナーの親和性の増大、結合パートナーの安定性、精製および調製の助成、血漿半減期の修正、治療的効用の改善、およびその結合パートナーを治療的に使用する際の副作用の発生またはその重篤度の減少が含まれる。以下の議論に、他のリガンド結合パートナーとして選択し得る変種の典型例であるＬＨＲのアミノ酸配列変種について記述する。
【００７６】
リガンド結合パートナーのアミノ酸配列変種は次の３種類のうちの１または複数に分類できる：挿入変種、置換変種、または欠失変種。これらの変種は通常、リガンド結合パートナーをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドへの部位特異的変異導入によって変種をコードするＤＮＡを得た後、そのＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させることによって生産される。しかし、約１００〜１５０アミノ酸残基までの断片ならばインビトロ合成によって便利に製造できる。以下の議論は部分的にＬＨＲに関するものであるが、リガンド結合パートナーの構造または機能に適用できる範囲で、あらゆるリガンド結合パートナーに対して適合し、等しい効果を与える。
【００７７】
ＬＨＲのアミノ酸配列変種は、天然には認められないか、もしくは天然の対立遺伝子に認められない予め決定された変種である。ＬＨＲ変種は典型的には天然に存在するＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲ類縁体と同じ性質の生物活性(例えばリガンド結合活性)を示す。しかし、そのリガンドを結合できないＬＨＲ変種および誘導体であっても、少なくとも１つのＬＨＲエピトープが活性なまま残っている限り、(ａ)ＬＨＲまたはＬＨＲに対する抗体の診断的検定で用いる試薬として、(ｂ)既知の方法で不溶化した場合には、抗血清またはハイブリドーマ培養上清から抗ＬＨＲ抗体を精製するための試薬として、および(ｃ)ＬＨＲに対する抗体を引き出すための免疫原として、あるいは免疫検定キットの構成要素(天然ＬＨＲに対する競争的試薬として標識したもの、またはＬＨＲ検定の標準として非標識のもの)として有用である。
【００７８】
アミノ酸配列変異の導入部位は予め決定するが、変異自体を予め決定する必要はない。例えば、ある部位における変異の効果を最適化するために、ランダム(無作為)または飽和変異法(考え得る２０残基のすべてを挿入する)を標的コドンで実施し、発現したＬＨＲ変種を、望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングする。このようなスクリーニングは当該分野では常法に属する。
【００７９】
アミノ酸挿入は通常約１〜１０アミノ酸残基程度であろう。置換は典型的には１残基に対して導入する。欠失(削除)は約１〜３０残基の範囲であろう。削除または挿入を隣接した対で行うこと、即ち２残基の削除または２残基の挿入が好ましい。置換、削除、挿入およびそれらのあらゆる組み合わせを導入または組み合わせることにより最終構築物に到達することは以下の議論からよくわかるであろう。
【００８０】
ＬＨＲの挿入アミノ酸配列変種は、ＬＨＲにとって異種のアミノ酸残基の１または複数が標的ＬＨＲ中の予め決定した部位に導入され、先に存在していた残基を移動させたものである。
【００８１】
通常、挿入変種はＬＨＲのアミノまたはカルボキシル末端に対する異種タンパク質またはポリペプチドの融合物である。このような変種を、ＬＨＲ中の挿入を行った位置に通常に認められるもの以外の配列を含有するポリペプチドとＬＨＲとの融合物と言う。融合物のいくつかの群はこれに包含される。
【００８２】
本発明の新規ポリペプチドは、免疫アフィニテイー技術(これ自体は既知である)によるリガンド結合パートナーの診断または精製に有用である。あるいは、結合パートナーの精製に際し、この新規ポリペプチドを使用することによって、不純な混合物から融合物を吸着させた後、その融合物を溶出させ、所望により、結合パートナーを融合物から例えば酵素的切断によって回収する。
【００８３】
結合パートナーの望ましい融合物(免疫学的に活性であっても活性でなくてもよい)には、成熟結合パートナー配列とその結合パートナーにとって異種のシグナル配列との融合物が含まれる。
【００８４】
ＬＨＲの場合および他の選択された結合タンパク質に関して望ましい場合、ＬＨＲの分泌をより迅速に指示するためにシグナル配列融合物を使用する。異種シグナルで天然のＬＨＲシグナルを置換し、得られた融合物が認識される場合、即ち宿主細胞によるプロセシングを受けて切断される場合に、ＬＨＲが分泌される。意図する宿主細胞に基づいてシグナルを選択し、これらのシグナルには細菌、酵母、哺乳類およびウイルスの配列が含まれ得る。天然のＬＨＲシグナルまたはヘルペスｇＤ糖タンパク質シグナルが哺乳類発現系での使用に適している。
【００８５】
置換変種は、図１〜３または図４〜６の配列の少なくとも１残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。ＬＨＲの特徴を微細に調節したい場合には、このような置換は一般に次の表１に従って行われる。
【００８６】
【表１】
【００８７】
新規アミノ酸配列は活性中心類縁体(アミノ酸ないし他の方法)と共に本発明の範囲に含まれる。
【００８８】
機能または免疫学的同一性の本質的な変化は、表１の置換より保存性の少ない置換を選択することによって、即ち、(ａ)置換領域内のポリペプチド骨格の構造(例えばシートまたはラセン立体配座)、(ｂ)標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは(ｃ)側鎖の嵩高さ、の維持に対する効果がより有意に異なる残基を選択することによって起こる。一般的にＬＨＲの性質に最も大きな変化を齎すと考えられる置換は次の置換であろう：(ａ)親水性側鎖(例：セリンまたはスレオニン残基)で(を)疎水性残基(例：ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニン残基)を(で)置換する；(ｂ)システインまたはプロリンで(を)他の残基を(で)置換する；(ｃ)正荷電側鎖を有する残基(例：リジン、アルギニンまたはヒスチジン残基)で(を)負荷電残基(例：グルタミン酸またはアスパラギン酸残基)を(で)置換する；もしくは、(ｄ)嵩高い側鎖を有する残基(例；フェニルアラニン)で(を)側鎖をもたない残基(例：グリシン)を(で)置換する。
【００８９】
削除、挿入、および置換のいくつかは、ＬＨＲ分子の性質に極端な変化を齎さないであろう。しかし置換、削除または挿入を行う前にその正確な効果を予測することが困難な場合、例えばＬＨＲ炭水化物結合ドメインまたは免疫エピトープを改変する場合、その効果を日常的なスクリーニング法で評価することを当業者は望むであろう。例えば典型的な場合、変種は、ＬＨＲコード核酸への部位特異的変異導入、組換え細胞培養中でのその変種核酸の発現、および任意に、例えば(少なくとも１つの残存免疫エピトープによってその変種を吸着するための)ポリクローナル抗ＬＨＲカラムでの免疫アフィニティー吸着による、その細胞培養からの精製によって作成される。次に、その細胞溶解液または精製ＬＨＲ変種の活性を、目的の特徴に適したスクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、Mel-１４などのある抗体に対する親和性など、ＬＨＲの免疫学的特徴の変化を、競争型免疫検定法で測定する。ＬＨＲの生体内での機能についてより多くのことがわかるようになれば、他の検定法もこのようなスクリーニングに有用になるであろう。酸化還元安定性、熱安定性、疎水性、タンパク分解性の分解に対する感受性、担体との会合傾向、あるいは多量体への会合傾向などのタンパク質の性質の変化は、当業者によく知られた方法で検定する。
【００９０】
ＬＨＲの置換変種には、上に定義したＬＨＲドメインの１または複数が、常法によって他のタンパク質の機能的に相同なドメインに置換されている変種も含まれる。変種がＬＨＲの特定のドメインの断片である場合、本明細書に定義した対応するＬＨＲドメインに対して少なくとも〜７０％相同であることが好ましい(ただし必須ではない)。このような置換可能なドメインの供給源として、当業者は図１１〜１３を使用することができる。例えば、図１１に配列を示したニクバエレクチンを改変してＬＨＲの炭水化物結合ドメインと少なくとも〜７０％相同な程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様に、図１２に配列を示した凝固因子Ｘを改変してＬＨＲのｅｇｆ-ドメインと少なくとも〜７０％相同な程度にし、これでそのドメインを置換することができる。同様の置換をシグナル配列、補体結合ドメイン、貫膜ドメインおよび細胞質ドメインに対して行うことも望ましいであろう。
【００９１】
ＬＨＲ変種のもう１つの種類は欠失変種である。欠失(削除)はＬＨＲ配列から１または複数のアミノ酸残基を除去することを特徴とする。典型的には、ＬＨＲの貫膜および細胞質ドメイン、もしくは細胞質ドメインのみを削除する。しかし、ＬＨＲの生物活性または免疫交差反応性が保存されるような、ＬＨＲ Ｃ-末端から貫膜領域のＮ-末端側の他の適切な部位までの欠失が適切である。ＬＨＲのアミノ酸配列解明の過程で今までに得られているタンパク質消化断片と、上に同定したＬＨＲドメインのいずれかに対して〜７０％より小さい相同性を有するタンパク質断片は欠失変種の範囲から除外される。
【００９２】
免疫グロブリン融合物は、補体結合ドメイン、炭水化物ドメイン、および表皮成長因子ドメインなどのＬＨＲ断片を用いて製造できる。補体結合ドメイン融合物は補体媒介性疾患の診断および治療、並びに、この融合物とＬＨＲまたはリンパ球表面上の他の成分とのオリゴマー化に有用である。
【００９３】
システインまたは他の不安定残基の削除も、例えばＬＨＲの酸化安定性を増大させる際に望ましいであろう。潜在的タンパク加水分解部位(例：ArgArg)の削除または置換は、その塩基性残基の１つを削除するか、もしくはグルタミン残基またはヒスチジン残基で置換することによって達成される。
【００９４】
ある態様では、ＬＨＲが補体結合ドメインおよび／またはｅｇｆドメインを伴わない炭水化物結合ドメインで構成される。この態様は貫膜および細胞質領域の一方または両方を含有してもよいし、含有しなくてもよい。
【００９５】
置換または欠失変異の好ましい種類は、ＬＨＲの貫膜領域が関与するものである。ＬＨＲサブユニットの貫膜領域は、細胞膜の脂質二重層をまたぐのに適切な大きさを有する高度に疎水的または親油的なドメインである。これらはＬＨＲを細胞膜中に固定すると考えられ、ＬＨＲとのホモまたはヘテロ多量体錯体形成を可能にする。
【００９６】
典型的には貫膜ドメイン・ヒドロキシル化残基の削除または置換によって齎されるＬＨＲおよび貫膜ドメインが存在する他の結合パートナーの貫膜ドメインの不活化は、その細胞または膜脂質親和性の減少および水溶性の改善によって回収および製剤化を容易にするであろう。貫膜および細胞質ドメインを削除すれば、その身体によって外来と認識されるかも知れない本来ならば細胞内にあるポリペプチドの露出か、もしくは潜在的に免疫原性の異種ポリペプチドの挿入による潜在的免疫原性エピトープの導入が回避される。膜結合機能の不活化は、この部位に本質的な親水性ハイドロパシー特性を齎すのに充分な数の残基を削除するか、もしくはこれと同じ結果を達成する異種残基で置換することによって達成される。
【００９７】
貫膜失活ＬＨＲの基本的な利点は、それが組換え宿主の培養培地中に分泌される得ることである。この変種は、血液などの体液に可溶であり、容易に感知できるような対細胞膜脂質親和性を有さないので、組換え細胞培養からの回収がかなり簡単になる。
【００９８】
一般的提案として、すべての変種は機能的な貫膜ドメインを有さず、また、機能的な細胞質配列を有さないことも好ましいであろう。
【００９９】
例えば貫膜ドメインを、完全に親水性ハイドロパシー特性を示すアミノ酸配列(例：約５〜５０のセリン、スレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸などの親水性残基からなる無作為または予め決定された配列)で置換することができる。欠失(先端削除型)ＬＨＲと同様に、これらの変種は組換え宿主の培養培地中に分泌される。
【０１００】
ＨｕＬＨＲアミノ酸配列変種の例を次の表に記載する。残基番号に続く残基は、置換アミノ酸または挿入されたアミノ酸を示す。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
これらの変種は保存的置換体であることが好ましい。いくつかの変種が生物活性の減少または欠失を示すであろうことは理解されるであろう。これらの変種であっても、ＬＨＲの免疫エピトープを少なくとも１つ保持している限り、ＬＨＲの免疫検定の標準として有用である。
【０１０３】
グリコシル化変種はＨｕＬＨＲの範囲に含まれる。これらにはグリコシル化が完全に欠如している(非グリコシル化)変種、天然型より少なくとも１つグリコシル化部位が少ない(脱グリコシル化)変種およびグリコシル化が変化している変種が含まれる。脱グリコシル化および非グリコシル化アミノ酸配列変種、天然の非改変ＬＨＲアミノ酸配列を有する脱グリコシル化および非グリコシル化ＬＨＲ、および他のグリコシル化変種が含まれる。例えば、置換または欠失変異法を使用することによりＬＨＲのＮ-またはＯ-結合型グリコシル化部位を除去する(例えばアスパラギン残基を削除するか、もしくはリジンまたはヒスチジンなど別の塩基性残基で置換する)。あるいは、グリコシル化認識部位を除去することによってグリコシル化を阻害するために、アスパラギン残基には手を加えないが、グリコシル化部位を形成する隣接残基を置換または削除する。
【０１０４】
別法として、原核生物はポリペプチドにグリコシル化を導入できないので、天然ＬＨＲのアミノ酸配列を有する非グリコシル化ＬＨＲを組換え原核細胞中で生産する。
【０１０５】
グリコシル化変種を、適切な宿主を選択することによって、もしくはインビトロ法で製造する。例えば酵母は哺乳類系とはかなり異なるグリコシル化を導入する。同様に、そのＬＨＲとは異なる種(例：ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ)あるいは異なる組織起源(例：肺、肝臓、リンパ様、間葉、表皮)の哺乳類細胞も、例えばマンノースレベルの増大、またはマンノース、フコース、シアル酸、および哺乳類糖タンパク質に典型的に認められる他の糖類の比の変化によって特徴づけられる変種グリコシル化を導入する能力について常法でスクリーニングする。ＬＨＲのインビトロ・プロセシングは典型的には酵素的加水分解(例：ノイラミニダーゼ消化)によって達成される。
【０１０６】
ＬＨＲ分子の共有結合による修飾はその範囲に含まれる。このような修飾は、回収したタンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させるか、もしくは選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物活性、ＬＨＲの免疫検定、あるいは組換えＬＨＲの免疫アフィニティ−精製用の抗ＬＨＲ抗体の調製にとって重要な残基を同定するための研究に有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後にそのタンパク質の生物活性が
完全に失活したら、少なくとも１つのアルギニンまたはリジン残基がその活性に必須であることが示唆され、その後、修飾されたアミノ酸残基を含有するペプチド断片を単離することによって、選択した条件下で修飾された個々の残基を同定する。このような修飾は当該技術分野では常法に属し、不都合な実験を伴わずに実行される。
【０１０７】
二官能性試薬による誘導体化は、ハイブリッド免疫グロブリンとポリペプチドとの分子間会合体を製造するため、およびハイブリッド免疫グロブリンをそのリガンドの検定またはアフィニティー精製で使用するための非水溶性支持マトリックスまたは表面に架橋するために有用である。さらに、鎖内架橋の研究も立体配座構造に関する直接的情報を提供するであろう。一般に使用される架橋試薬には、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル類(例：４-アジドサリチル酸とのエステル)、ジスクシンイミジルエステル類(例：３,３'-ジチオビス(スクシンイミジル-プロピオネート))を含むホモ二官能性イミドエステル類、およびビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンなどの二官能性マレイミド類が含まれる。メチル-３-[(ｐ-アジド-フェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化試薬によって、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化が可能な中間体を得ることができる。別法として、米国特許第３９５９０８０号、同第３９６９２８７号、同第３６９１０１６号、同第４１９５１２８号、同第４２４７６４２号、同第４２２９５３７号、同第４０５５６３５号、同第４３３０４４０号に記述された系反応性基質および臭化シアン活性化炭水化物などの活性な非水溶性マトリックスをタンパク質の固定化および架橋に使用する。
【０１０８】
ある種の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基になる。あるいは、これらの残基を温和な酸性条件下で脱アミド化する。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【０１０９】
他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,79〜86頁(1983))、Ｎ-末端アミンのアセチル化、および(いくつかの例では)Ｃ-末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【０１１０】
他の誘導体は、非タンパク質性重合体(ポリマー)に共有結合した本発明の新規ポリペプチドからなる。通常、非タンパク質性重合体は親水性合成ポリマー、即ち天然には認められないポリマーである。しかし天然に存在し、組換え法またはインビトロ法で製造したポリマーも、天然から単離したポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー(例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン)は本発明の範囲に含まれる。特に有用なものは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル類、メトキシポリエチレングリコールなどのポリアルキレンエーテル類；ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体(プルロニクス(Pluronics))などのポリオキシアルキレン類；ポリメタクリレート類；カルボマー(carbomer)類；糖単量体Ｄ-マンノース、Ｄ-およびＬ-ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン酸、シアル酸、Ｄ-ガラクトウロン酸、Ｄ-マヌロン酸(例えばポリマヌロン酸またはアルギン酸)、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ-グルコースおよびノイラミン酸からなる分枝状または非分枝状多糖類(乳糖、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンなどのホモ多糖類およびヘテロ多糖類、または酸ムコ多糖類の多糖サブユニット(例：ヒアルロン酸)を含む)；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコール・ポリマー；ヘパリンまたはヘパロンである。
【０１１１】
多糖が天然のグリコシル化または組換え発現に付随して生じるグリコシル化である場合、その置換部位は、追加または置換Ｎ-またはＯ-結合部位がその分子中に導入された、天然のＮ-またはＯ-結合型グリコシル化部位とは異なる位置であってもよい。このようなポリマーの混合物を使用してもよく、またポリマーが均一であってもよい。架橋前のポリマーは水溶性であることが(必要ではないが)好ましく、最終的複合体は水溶性でなければならない。さらに、ポリマーはその複合体型において高度に免疫原性であってはならず、静脈内注入または注射による投与を意図する場合には、そのような方法に適合しない粘度であってはならない。
【０１１２】
ポリマーが反応性の基を１つだけ含有することが好ましい。このことはタンパク質分子の架橋を避けるために役立つ。しかし、架橋を減少させるために反応条件を最適化すること、あるいは、本質的に均一な誘導体を回収するためにゲル濾過またはクロマトグラフィー的ふるいを通して反応生成物を精製することは本発明の範囲に含まれる。
【０１１３】
ポリマーの分子量は約１００〜５０００００の範囲であることが望ましく、好ましくは約１０００〜２００００である。選択する分子量はそのポリマーの性質と置換の程度に依存するであろう。一般に、ポリマーの親水性が大きく、置換の程度が大きいほど、使用できる分子量は低くなる。至適分子量は日常的な実験で決定されるであろう。
【０１１４】
一般に、ハイブリッドの１または複数のアミノ酸もしくは糖残基およびポリマーと反応する多官能性架橋試薬を通して、ポリマーを本発明のハイブリッド免疫グロブリンに共有結合させる。しかし、誘導体化したポリマーをハイブリッドと反応させることによってポリマーを直接架橋すること、またはその逆も本発明の範囲に含まれる。
【０１１５】
ハイブリッド免疫グロブリン上の共有結合架橋部位には、Ｎ-末端アミノ基、リジン残基に存在するε-アミノ基、および他のアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基あるいは他の親水性基が含まれる。多官能性(通常は二官能性)架橋試薬を使用せず、ポリマーを直接ハイブリッドに共有結合させてもよい。アミノ基に対する共有結合は、シアヌル酸クロリド、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基(ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび酢酸無水物；あるいはＰＥＧクロリド＋４-ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、スクシンイミジル活性エステル類、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２,４,５-トリクロロフェニルトリクロロホルメートまたはｐ-ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ)に基づく既知の化学によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ-アミンをカップリングさせることによって誘導体化する。
【０１１６】
ビオチンまたはアビジンによるオリゴ糖類の標識に関してBayer等,Methods in Enzymology,62:310(1979)またはHeitzmann等,P.N.A.S.,71:3537-341(1984)に記述されている方法と同様の方法で、化学品(例：メソ過ヨウ素酸塩)または酵素(例：グルコースまたはガラクトース・オキシダーゼ)(いずれも各炭水化物のアルデヒド誘導体を生成させる)を用いて酸化した後、ヒドラジドまたはアミノ誘導体化ポリマーと反応させることにより、ポリマーをオリゴ糖基に結合させる。さらに、オリゴ糖類とポリマーを結合させるためにこれまでに使用されてきた他の化学法または酵素法も適している。置換オリゴ糖類は、一般に、アミノ酸部位より誘導体化のための置換が少なく、それゆえにオリゴ糖生成物がより均一になるであろうから、特に有利である。任意に、オリゴ糖置換基に、糖を除去するための酵素消化(例：ノイラミニダーゼ消化)によって、ポリマー誘導体化の前に改変を加えてもよい。
【０１１７】
ポリマーは、本発明のポリペプチドのアミノ酸側鎖あるいはＮ-またはＣ-末端と直接反応する基、もしくは多官能性架橋試薬と反応する基を保持するであろう。一般に、このような反応性基を有するポリマーは固定化タンパク質製造のために知られている。このような化学を本発明で使用するためには、これまでにタンパク質固定化に使用されてきた不溶性ポリマーと同じ様式で誘導体化された水溶性ポリマーを使用すべきである。臭化シアン活性化は多糖類を架橋する際に特に有用な方法である。
【０１１８】
出発ポリマーに関する“水溶性”という用語は、複合体のために使用するポリマーまたはその反応性中間体が誘導体化反応に関与し得るほど充分に水溶性であることを意味する。
【０１１９】
ポリマー複合体に関する“水溶性”という用語は、その複合体が血液などの生理的液体に可溶であることを意味する。
【０１２０】
このようなポリマーによる置換の程度は、タンパク質全体を使用するか、その断片を使用するか、タンパク質が異種タンパク質との融合物であるか否か、タンパク質上の反応性部位の数、ポリマーの分子量、親水性およびその他の性質、選択した特定のタンパク質誘導体化部位に依存して変化するであろう。異種配列はいずれも、その望ましい活性が有意に不利な影響を受けない限り、本質的に無制限の数のポリマー分子で置換できるが、一般に、この複合体は１〜１０ポリマー分子を含有する。最適な架橋度は、時間、温度およびその他の反応条件を変化させることによって置換度を変えた後、その複合体が目的の様式で機能する能力を決定する一連の実験により容易に決定できる。
【０１２１】
ＰＥＧなどのポリマーを、ＰＥＧなどの非タンパク質性ポリマーでタンパク質を共有結合的に修飾するための多様な(それ自体は)既知の方法で架橋する。しかしこれらの方法のいくつかは本発明の目的には好ましくない。シアヌル酸クロリドの化学はタンパク質架橋を含む多くの副反応を起こす。さらに、スルフヒドリル基を含有するタンパク質の失活を特に齎しやすい。カルボニルジイミダゾールの化学(Beauchamp等,Anal.Biochem.131:25-33(1983))は高いｐＨ(＞８.５)を必要とし、この条件はタンパク質を不活化し得る。さらに、“活性化ＰＥＧ”中間体は水と反応し得るので、タンパク質に対して大過剰モル量の“活性化ＰＥＧ”が必要である。カルボニルジイミダゾール化学に必要な高濃度のＰＥＧは、ゲル濾過クロマトグラフィーと疎水相互作用クロマトグラフィーの両方に悪影響を与えるので、精製にも問題を起こす。さらに、高濃度の“活性化ＰＥＧ”はタンパク質を沈殿させる可能性があり、この問題自体は過去に触れられている(Davis,米国特許第4179337号)。一方、アルデヒド化学(Royer,米国特許第4002531号)は４０倍過剰モル量のＰＥＧと１〜２時間のインキュベーションしか必要としないので、より効果的である。しかし、ＰＥＧアルデヒドの調製のためにRoyerが提案した二酸化マンガンは、“ＰＥＧは金属性酸化剤と錯体を形成する傾向が極めて高いので”(Harris等,J.Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed.22:341-352(1984))問題が多い。ＤＭＳＯと酢酸無水物を使用するモファット酸化(moffatt oxidation)を使用することによって、この問題を回避できる。さらに、Royerが提案した水素化ホウ素ナトリウムは高ｐＨで使用しなければならず、ジスルフィド結合を還元する傾向がかなりある。これに対し、中性ｐＨで作用し、ジスルフィド結合を還元する傾向が殆ど無い水素化シアノホウ素ナトリウムが好ましい。
【０１２２】
本発明の複合体を未反応の出発物質からゲル濾過によって分離する。複合体の不均一種を同じ方法で互いに精製する。
【０１２３】
ポリマーは親水性ゲルとして、あるいはカテーテルまたはドレナージ導管の形態の外科用チューブとして、非水溶性であってもよい。
【０１２４】
ＬＨＲおよび他のリガンド結合パートナーをコードするＤＮＡをインビトロ法で合成するか、もしくはリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから容易に得ることができる。ＬＨＲをコードするＤＮＡを自動化された装置で、もしくはそのような装置を使用せずに合成する方法は、特に本明細書の教示を考慮すれば、当業者一般に知られている。ポリヌクレオチド合成に関する技術分野の現状の例として、Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1984)およびHorvath等,An Automated DNA Synthesizer Employing Deoxynu cleoside 3'-Phosphoramidites,Methods in Enzymology 154:313-326(1987)を参考にすることができる。
【０１２５】
別法として、好ましい態様のための全ＤＮＡ配列、即ちＨｕＬＨＲ(図１〜３)およびＭＬＨＲ(図４〜６)が既知であるから、ＬＨＲをコードするＤＮＡをネズミまたはヒト以外の供給源から得るためには、ＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲもしくはそれらの断片(普通、約２０bpより大きく、通常は約５０bp)をコードする標識したＤＮＡを用いて、特定の動物から得たｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を含有するクローンを検出するために、ハイブリッド形成スクリーニングを実施し、次いで制限酵素分析および核酸配列決定によってそのクローンを分析することによって全長クローンを同定するだけでよい。全長クローンがライブラリー中に存在しない場合は、適切な断片を種々のクローンから回収し、それらの断片に共
通の制限部位で連結することにより、全長クローンを組み立てる。他の動物種のＬＨＲをコードするＤＮＡは、その種から得たライブラリーをヒトまたはネズミの配列でプローブすることによって、あるいはその遺伝子をインビトロで合成することによって得られる。配列がわかっている他の結合パートナーのＤＮＡはこれに類する定型のハイブリッド形成法を用いて得ることができる。
【０１２６】
本発明は、約１０bpより大きく、好ましくは２０〜５０bpであり、１００bpより大きいことさえある、図１〜３または図４〜６の断片と厳密条件下でハイブリッド形成する核酸配列を提供する。また、厳密条件下で、シグナルまたは貫膜ドメインまたは細胞質ドメイン以外のＬＨＲ断片とハイブリッド形成する核酸配列も本発明の範囲に含まれる。
【０１２７】
さらに、ＬＨＲのｃＤＮＡか、あるいはＬＨＲのゲノム遺伝子(イントロン、並びに、隣接する遺伝子もしくは約５０００bp(どちらがより長くても)に及ぶ５'または３'隣接領域を含む)と、厳密条件下でハイブリッド形成し得る核酸プローブも本発明の範囲に含まれる。
【０１２８】
ＬＨＲまたは他の結合パートナーのゲノムＤＮＡの同定は、特定のゲノムライブラリーを検出可能な基(例：放射性リン酸基)で標識したｃＤＮＡまたはその断片でプローブし、その遺伝子を含むクローンを回収することに外ならない。必要ならば、完全な遺伝子を"ウォーキング(染色体歩行)"によってつなぎ合わせる。典型的な場合、このようなプローブはＨｕＬＨＲまたはＭＬＨＲに対して７０％以上相同な配列をコードし、約１０〜１００bpの長さである。他の結合パートナーに関する相同性と大きさは、不都合な実験を行わなくても決定できる。
【０１２９】
本発明に有用なベクターを構築する際には、一般に原核生物をＤＮＡ配列のクローニングに使用する。例えば大腸菌Ｋ１２-２９４株(ＡＴＣＣ番号３１４４６)は特に有用である。使用し得る他の微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ番号３１５３７)が含まれる。これらの例は単なる例示であって、限定を意図するものではない。別法として、インビトロ・クローニング法(例：ポリメラーゼ連鎖反応)も適している。
【０１３０】
本発明のポリペプチドは、Ｎ-末端メチオニル類縁体として、もしくはハイブリッド／部分にとって異種のポリペプチド、好ましくはそのハイブリッド／部分のＮ-末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合物として、組換え細胞培養中で直接発現する。例えば、ＬＨＲの原核分泌発現ベクターを構築する際には、天然のＬＨＲシグナルを、そのシグナルを認識する宿主と共に使用する。分泌リーダーが宿主によって“認識される”場合、その宿主シグナル・ペプチダーゼは、目的の成熟ＬＨＲにＣ-末端で融合しているリーダー・ポリペプチドの融合物を切断し得る。ＬＨＲシグナルをプロセシングしない宿主原核生物については、そのシグナルを、例えばアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定エンテロトキシンIIリーダーなどから選択した原核シグナルで置換する。酵母分泌のためには、ヒトＬＨＲシグナルを酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼ・リーダーで置換することができる。哺乳類細胞発現の場合は、ウイルス分泌リーダー(例：ヘルペス・シンプレックス・ｇＤシグナル)などの他の哺乳類分泌タンパク質シグナルも適当であるが、哺乳類ＬＨＲに関しては天然のシグナルで十分である。
【０１３１】
本発明の新規ポリペプチドはどの宿主細胞中でも発現し得るが、哺乳類宿主中で合成することが好ましい。しかし原核生物、カビ、酵母、昆虫など由来の宿主細胞も発現に使用される。代表的原核生物は、クローニングに適する株および大腸菌Ｗ３１１０(Ｆ−,λ−,原栄養株,ＡＴＣＣ番号２７３２５)、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans)などの腸内細菌科、バチルスおよび種々のシュードモナス科である。好ましくは、宿主細胞が分泌する原核性酵素量は最小限であるべきである。
【０１３２】
典型的な場合、発現ベクター中に連結されているハイブリッドをコードするＤＮＡで発現宿主を形質転換する。このようなベクターは通常、複製部位を保持している(ただしこれは染色体組み込みが起こる場合には必要ない)。発現ベクターは、以下に議論するように形質転換細胞中で表現型選択を提供し得る標識配列をも含有する。例えば大腸菌を典型的には、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２(Bolivar等,Gene 2:95(1977))を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、それゆえに、目的がクローニングであるか発現であるかにかかわらず、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。また発現ベクターが転写および翻訳の制御に有用な配列(例：プロモーターおよびシャイン・ダルガルノ配列(原核生物の場合)またはプロモーターおよびエンハンサー(哺乳類細胞の場合))を含有していれば最適であろう。プロモーターは誘導性であってもよいが必ずしもその必要はない。驚くべきことに、哺乳類宿主にとってのＣＭＶプロモーターのように強力な構成プロモーターであっても、宿主細胞毒性を伴わずにＬＨＲを産出することがわかった。発現ベクターが何らかの発現制御、複製配列もしくは選択遺伝子を含有する必要はないと考えられるが、これらの欠失は、ハイブリッド形質転換体の同定および高レベルのハイブリッド免疫グロブリン発現の達成を妨げるであろう。
【０１３３】
原核宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、例えばβ-ラクタマーゼおよびラクトース・プロモーター系(Chang等,Nature,275:615(1978)およびGoeddel等,Nature,281:544(1979))、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel,Nucleic Acids Res.8:4057(1980)および欧州特許出願番号第36776号)、およびtacプロモーターなどのハイブリッド・プロモーター(H.de Boer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))が含まれる。しかし他の機能的細菌性プロモーターも適している。これらのヌクレオチド配列は一般に既知であるから、当業者は、必要な制限部位を供給するためにリンカーやアダプターを使用して、ＬＨＲをコードするＤＮＡにこれらを機能的に連結することできる(Siebenlist等,Cell,20:269(1980))。細菌系で使用するプロモーターは、ＬＨＲをコードするＤＮＡに機能的に連結されたシャイン・ダルガルノ(Ｓ.Ｄ.)配列をも含有するであろう。
【０１３４】
原核生物に加えて、酵母や糸状菌などの真核微生物も良好な結果を与える。サッカロミセス・セレビシェは最も一般的に使用される真核微生物であるが、他の株のいくつかも一般に利用できる。プラスミドＹＲｐ７は酵母における良好な発現ベクターである(Stinchcomb等,Nature 282:39(1979)；Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等,Gene,10:157(1980))。このプラスミドは、トリプトファン中での生育能が欠失した酵母の変異株(例：ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４-１(Jones,Genetics 85:12(1977)))のための選択標識を提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１欠損の存在は、トリプトファン非存在下での生育による形質転換検出に効果的な環境を提供する。
【０１３５】
酵母宿主と共に使用するための適切な促進配列には、３-ホスホグリセレート・キナーゼ(Hitzeman等,J.Biol.Chem.255:2073(1980))または他の解糖酵素(Hess等,J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)およびHolland,Biochemistry,17:4900(1978))(例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼなど)のためのプロモーターが含まれる。
【０１３６】
生育条件によって転写を制御し得るという追加の利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルルデヒド-３-リン酸・デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース資化に寄与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適したベクターおよびプロモーターは、R.Hizeman等,欧州特許出願第73657Aにさらに記述されている。
【０１３７】
真核生物の発現制御配列は知られている。ほとんど全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ含量の豊富な領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０〜８０塩基上流に認められるもう１つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域(Ｘはいずれのヌクレオチドでもよい)である。ほとんどの真核遺伝子の３'末端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列はコード配列の３'末端にポリＡ尾部を付加するためのシグナルであろう。これらの配列をすべて哺乳類発現ベクター中に挿入する。
【０１３８】
哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御するための適切なプロモーターは種々の供給源、例えばウイルス(例：ポリオーマウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ＭＭＶ(ステロイド誘導性)、レトロウイルス(例：ＨＩＶのＬＴＲ)、Ｂ型肝炎ウイルス、並びに、最も好ましくはサイトメガロウイルス)のゲノムから、あるいは異種哺乳類プロモーター(例；ベータ・アクチン・プロモーター)から容易に得られる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として便利に得られる(Fiers等,Nature,273:113(1978))。ヒト・サイトメガロウイルスの前初期プロモーターはＨindIII Ｅ制限断片として便利に得られる(Greenaway,P.J.等,Gene 18:355-360(1982))。
【０１３９】
ハイブリッド免疫グロブリンおよび／またはハイブリッド部分をコードするＤＮＡのより高等な真核生物による転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーは、通常約１０〜３００bpからなる、ＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは比較的配向および位置非依存性であり、転写単位の５'（Laimins,L.等,PNAS,78:993(1981)）および３'（Lusky,M.L.等,Mol.Cell Bio.,3:1108(1983)）に発見されており、またイントロン内（Banerji,J.L.等,Cell,33:729(1983)）およびコード配列自体の中（Osborne,T.F.等,Mol.Cell Bio.4:1293(1984)）にも発見されている。現在、哺乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られている。しかし典型的には、真核細胞ウイルスのエンハンサーを利用するであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００〜２７０ｂｐ)、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーが含まれる。
【０１４０】
真核宿主細胞(酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞)で使用する発現ベクターは、転写の終止に必要であって、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る配列をも含有するであろう。これらの領域は、ハイブリッド免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル区分として転写される。この３'非翻訳領域には転写終止部位も含まれる。
【０１４１】
発現ベクターは、選択遺伝子(これは選択可能標識とも呼ばれる)を含有することもできる。哺乳類細胞に適した選択可能標識の例には、ジヒドロフォレート・レダクターゼ(ＤＨＦＲ)、チミジン・キナーゼ(ＴＫ)、あるいはネオマイシンが含まれる。このような選択可能標識がうまく哺乳類宿主細胞内に導入されるならば、その形質転換哺乳類宿主細胞は選択圧下におかれた場合に生き残ることができる。選択方式には広く用いられている２つの異なった種類がある。第一の種類は細胞の代謝、および補足培地に依存せずに生育する能力を欠く変異株化細胞の使用に基づいている。ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞はその２例である。これらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンなどの栄養素を添加しない条件下で生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要ないくつかの遺伝子を欠いているので、補足培地中に欠失ヌクレオチドを添加しない限り生存することができない。培地を補足するかわりに、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞中に導入し、それによってその生育要求性を変化させることもできる。ＤＨＦＲやＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できないであろう。
【０１４２】
選択法の第二の種類は優性選択、即ちどの細胞型にも使用できる選択法であり、変異株化細胞の使用を必要としない選択法である。この方法は典型的には宿主細胞の生育を停止するための薬剤を使用する。異種遺伝子でうまく形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、それゆえにこの選択法に耐え得る。このような優性選択の例では、薬剤ネオマイシン(Southern等,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、マイコフェノール酸(Mulligan等,Science,209:1422(1980))、あるいはハイグロマイシン（Sugden等,Mol.Cell.Biol.5:410-413(1985)）を使用する。上記の３例では、真核性の制御下にある細菌性遺伝子を使用することによって、適切な薬剤、即ちそれぞれＧ４１８またはネオマイシン(ジェネティシン)、ｘｇｐｔ(マイコフェノール酸)、あるいはハイグロマイシンに対する耐性を獲得する。
【０１４３】
ハイブリッド免疫グロブリンの発現に適した真核宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換されたサルの腎ＣＶ１株(ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1651)、ヒトの胚腎株(２９３または懸濁培養中での生育のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham,F.L.等,J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼ハムスター腎細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 10)、チャイニーズハムスター卵巣-細胞-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、UrlaubおよびChasin,PNAS(USA),77:4216(1980))、マウスのセルトーリ細胞(ＴＭ４、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、サルの腎細胞(ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 70）、アフリカン・グリーン・モンキー腎細胞(ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-1587)、ヒトの頸部癌細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 2)、イヌの腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 34）、バッファロー・ラットの肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ 1442)、ヒトの肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ75)、ヒトの肝細胞(ＨｅｐＧ２、ＨＢ 8065)、マウスの乳房の腫瘍細胞(ＭＭＴ060562、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 51)、およびＴＲＩ細胞(Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))が含まれる。
【０１４４】
目的のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、標準的な連結技術を用いる。単離したプラスミドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工し、目的の形態に再連結することによって必要なプラスミドを形成させる。
【０１４５】
構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、その連結混合物を用いて大腸菌Ｋ１２ ２９４株(ＡＴＣＣ31446)を形質転換し、成功した形質転換体を、それが適当な場合には、アンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性によって選択する。Messing等,Nucleic Acids Res.9:309(1981)またはMaxam等,Methods in Enzymology,65:499(1980)の方法で、その形質転換体からプラスミドを調製し、制限分析および／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。
本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または目的の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改良した従来の栄養培地中で培養する。温度やｐＨなどの培養条件を、発現用に選択した宿主細胞について過去に使用されたものとし、これらの条件は当業者には明白であろう。
【０１４６】
本明細書で使用する宿主細胞なる用語は、インビトロ培養中の細胞と共に宿主動物内の細胞をも包含する。
【０１４７】
“形質転換”という用語は、ＤＮＡが染色体外要素として、もしくは染色体組み込みによって複製されるように、生物内にそのＤＮＡを導入することを意味する。特に断らない限り、本発明で使用する宿主細胞の形質転換法は、Graham,F.およびvan der Eb,A.,Virology,52:456-457(1973)の方法である。しかし、核注入あるいはプロトプラスト融合などによる、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法も用いることができる。原核細胞または強固な細胞壁構築物を有する細胞を使用する場合に好ましいトランスフェクション法は、Cohen,F.N.等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),69:2110(1972)が記述した、塩化カルシウムを用いるカルシウム
処理である。
【０１４８】
"トランスフェクション"という用語は、なんらかのコード配列が実際に発現するかどうかにかかわらず、宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味する。数多くのトランスフェクション法が当業者一般に知られている(例えば、ＣａＰＯ４および電気穿孔法)。宿主細胞の形質転換はトランスフェクション成功の証拠である。
【０１４９】
本発明の新規ポリペプチドを組換え細胞培養から既知の方法で回収し、精製する。これらの方法には、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーが含まれる。本発明の範囲に含まれる他の既知の精製法では、固定化した炭水化物、表皮成長因子または補体ドメインを使用する。さらに逆相ＨＰＬＣ、並びに、ハイブリッド免疫グロブリンのリガンドを使用するクロマトグラフィーもハイブリッドの精製にとって有用である。精製の間、低濃度(約１〜５mM)のカルシウムイオンを存在させることが望ましい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤の存在下でＬＨＲを精製することが好ましい。
【０１５０】
ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッドを治療的に使用すると、リンパ様組織に対するリンパ球の正常な結合と競争する。したがってこのハイブリッドは器官または移植体拒絶にとって特に有用であり、また、例えばリウマチ様関節炎あるいは他の自己免疫疾患などの炎症を伴う患者の治療に特に有用である。ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッドは、リンパ腫転移の制御、およびリンパ球の蓄積が起こる症状の治療にも適用できる。
【０１５１】
ＬＨＲ-免疫グロブリン・ハイブリッド・ヘテロ二量体およびヘテロ四量体を、治療的部分をリンパ様組織に誘導する際に使用する。例えば、１本のＬＨＲ-ＩｇＧ鎖と１本のＣＤ４-ＩｇＧ鎖からなるハイブリッド免疫グロブリンを用いることにより、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)などのウイルスに感染した組織にＣＤ４-ＩｇＧを誘導することができる。このハイブリッドは、リンパ節内の内皮組織だけでなく、パイエル斑などの２次リンパ様器官内および脳内の内皮組織にも結合するので、ＨＩＶ関連痴呆症の治療のために、血液脳障壁を通過してＣＤ４-ＩｇＧを送達するために使用し得る。同様に、リシンなどの毒素を目的の組織に送達するために、本明細書に記述するＬＨＲ-リシン-あるいはＣＤ４-リシン-免疫グロブリンを有する免疫グロブリン・ヘテロ四量体を使用する。
【０１５２】
この方法で、特定の組織に対して特異的な親和性を有するリガンド結合パートナーを選択すれば、安定で比較的長い半減期を有する治療薬を送達する能力が明確に増大し、不都合な実験を行わなくても正確な加工ができる。
【０１５３】
本発明の新規ポリペプチドを滅菌等張製剤中に、必要な補因子と共に入れ、任意に当該分野でよく知られた標準的手段で投与する。この製剤は液体であることが好ましく、通常は０.５〜１０mM カルシウム、非リン酸緩衝液(ｐＨ６.８〜７.６)を含有する生理的塩類溶液であり、あるいは凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１５４】
静脈内送達、またはカテーテルあるいは他の外科用チューブを通しての送達が主要な治療的投与経路となるであろうと考えている。別の経路には、錠剤など、液体製剤用の市販の噴霧器、および凍結乾燥またはエアゾル化した受容体の吸入が含まれる。液体製剤は粉末製剤から再構成した後に使用することができる。
【０１５５】
本発明の新規ポリペプチドを微小球、リポソーム、他の微粒子送達系によって投与してもよく、あるいは血液を含むある種の組織中に入れる徐放性製剤によって投与してもよい。徐放性担体の好適例には、成型物(例：坐剤またはマイクロカプセル)の形態の半透性ポリマー・マトリックスが含まれる。マイクロカプセル徐放性マトリックスまたは埋め込み可能な徐放性マトリックスには、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートの共重合体(U.Sidman等,Biopolymers 22(1):547-556(1985))、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクレリート)またはエチレン・ビニル酢酸(R.Langer等,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277(1981)およびR.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))が含まれる。ハイブリッド免疫グロブリンを含有するリポソームは、よく知られた方法で調製される(DE 3218121A；Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980)；EP 52322A；EP 36676A；EP 88046A；EP 143949A；日本特許出願83-11808；米国特許第4485045号および同第4544545号；UP 102342A)。通常リポソームは小さい(約２００〜８００オングストローム)単層型であって、その脂質成分は、約３０モル％コレステロール以上であり、これはポリペプチドの漏出速度を最適化するように調節された比率である。
【０１５６】
徐放性ポリペプチド調製物を、炎症部位または治療部位(例：関節炎の関節または末梢リンパ節)の近傍に埋め込むか、もしくは注射する。
【０１５７】
医者には充分自明であるように、本発明の新規ポリペプチドの投与量は使用するハイブリッドの性質(例えば結合活性および生体内血漿半減期)、製剤中のハイブリッド濃度、ハイブリッドの投与経路、投与部位、投与速度、関与する患者の臨床的耐性、患者を苦しめている病的症状などに依存するであろう。
【０１５８】
本発明のポリペプチドを、上記の症状を治療するために使用される他の医薬(例：抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍剤)と共に投与することもできる。また、本発明のポリペプチドを、γ-インターフェロンや他の免疫変調因子など、他の治療的タンパク質と共に投与することも有用であろう。
【０１５９】
以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に使用する方法および／または用語のいくつかについて記述する。
【０１６０】
“プラスミド”は、先行して置かれた小文字ｐ、および／またはそれに続く大文字、および／または数字によって指定される。本発明の出発プラスミドは市販されており、誰にでも無制限に利用可能であり、あるいは公表された方法に従って、利用可能なプラスミドから構築することもできる。さらに、これらに等価なプラスミドも本技術分野において知られており、一般の技術者には明白であろう。
【０１６１】
具体的には、これらのプラスミドは次の特徴のいくつか、もしくはすべてを有することが好ましい：(１)含有する宿主生物配列の数が最小限度であること；(２)目的の宿主中で安定であること；(３)目的の宿主中で高コピー数型で存在し得ること；(４)制御可能なプロモーターを保持すること；(５)そのプラスミドの、新規ＤＮＡ配列を挿入する部分から離れた位置にある部分に、選択可能な特徴をコードする少なくとも１つのＤＮＡを有すること。上記の規準に合致するようにプラスミドを改変することは、利用可能な文献および本明細書の教示を考慮すれば、当業者には容易である。上述の性質を有し、それゆえに本発明で使用するのに適した新たなクローニングベクターが存在し、あるいは今後発見されるであろうこと、またこれらのベクターも本発明の範囲に含まれると見なされることを理解すべきである。
【０１６２】
ＤＮＡの“消化”という用語は、そのＤＮＡ中の一定のヌクレオチド配列にしか作用しない制限酵素による、そのＤＮＡの触媒的切断を意味する。本発明で使用する種々の制限酵素は市販されており、反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に知られているであろうものを用いた。分析が目的の場合、典型的には１μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２単位の酵素と共に、約２０μｌの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的の場合は、典型的にはより大きな体積中で、５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適した緩衝液および基質量は、その製造者によって指定されている。通常３７℃で約１時間のインキュベーションが用いられるが、その供給者の指示に従って変更することもある。消化後、その反応液を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって、目的の断片を単離する。
【０１６３】
切断した断片のサイズ分離は、Goeddel,D.等,Nucleic Acids Res.8:4057(1980)が記述した８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【０１６４】
“脱リン酸化”は、細菌アルカリ性ホスファターゼ(ＢＡＰ)を用いる処理による末端５'リン酸の除去を意味する。この操作は、１つのＤＮＡ断片の２つの制限切断末端が“環化”して、もしくは閉環を形成して、その制限部位への別のＤＮＡ断片の挿入を妨害することを防止する。脱リン酸化の操作法と試薬は常法である(Maniatis,T.等,Molecular Cloning,133-134頁(1982))。ＢＡＰを使用する反応は、この酵素調製物中に存在するエキソヌクレアーゼ活性を抑止するために、５０mM Tris中６８℃で実行する。反応は１時間行う。この反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する。
【０１６５】
“オリゴヌクレオチド”は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖、のいずれかを意味し、これらは化学的に合成できる。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さないので、キナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しない限り、別のヌクレオチドには連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片には連結できる。
【０１６６】
“ライゲーション”は、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結合の形成過程を意味する(Maniatis,T.等,同上,146頁)。特に述べない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液および条件を用い、約等モル量の連結すべきＤＮＡ断片０.５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガーゼ”)を使って遂行する。
【０１６７】
“充填”または“平滑化”は、制限酵素で切断した核酸の付着末端中の一本鎖化された末端を二本鎖に変換する操作を意味する。これによって付着末端が除去され、平滑末端が生成する。この工程は、唯一の制限酵素あるいは数少ない他の制限酵素でしか生成しない末端に付着する制限切断末端を、平滑に切断するあらゆる制限エンドヌクレアーゼもしくは充填された他の付着末端に適合する末端に変換するための汎用の手段である。典型的な場合、標的ＤＮＡ２〜１５μｇを１０mM MgCl２、１mM ジチオスレイトール、５０mM NaCl、１０mM Tris緩衝液(ｐＨ７.５)中約３７℃で、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片 ８単位および４種のデオキシヌクレオシド三リン酸各２５０μMと共にインキュベートすることによって、平滑化を遂行する。このインキュベーションを一般的には３０分後に停止させ、フェノールおよびクロロホルム抽出し、エタノール沈殿する。
【０１６８】
本発明の組成物の３次元構造は本明細書に記述したその機能にとって重要であると現在考えている。したがって、本発明の組成物が形成する活性構造を模倣するすべての関連構造類縁体は、特に本発明の範囲に包含される。
【０１６９】
本発明の教示を特定の問題または状況に適用することが、本明細書に記述された教示の内容を考慮すれば当業者にとって可能な範囲になることは理解される。本発明の産物の例、およびそれを単離し、使用し、製造するための代表的方法を以下に記述するが、これらが本発明を限定すると見なすべきではない。
【実施例】
【０１７０】
これらの実施例における"Ｍel１４"モノクローナル抗体もしくは"Ｍel１４"なる記載はすべて、Gallatin等,前掲,Nature 303:30(1983)が記述した、ネズミ型と考えられるリンパ表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を意味する。しかし、本明細書にＬＨＲの全ＤＮＡ配列および全アミノ酸配列が提供されているので、Ｍel１４の使用は本発明にとってもはや必要ではない。
【０１７１】
実施例１：ＭＬＨＲの精製およびクローニング
ＭＬＨＲをコードするｃＤＮＡクローンの単離
界面活性剤で処理したネズミ脾臓から、Ｍel１４モノクローナル抗体を用いる免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによってＭＬＨＲを単離した。
【０１７２】
典型的調製では、ＩＣＲ雌マウス(１６週齢)から得た３００個の脾臓を細かく切り、次いで、１mM ＰＭＳＦおよび１％アプロチニンを含有するダルベッコＰＢＳ中の２％トリトンＸ-１００中で、ポッター・エルベジェム組織グラインダー(Potter-Elvehjem tissue grinder)を用いて均質化(ホモジナイズ)した。溶解を浸透機上４℃で３０分間続けた。この溶解液を２０００ｘＧで５分間、次いで４００００ｘＧで３０分間遠心分離した。
【０１７３】
上清をニテックス・スクリーン(Nitex screen)を通して濾過した後、臭化シアン活性化セファロース(Sepharose)４Ｂに結合したラット血清(充填ゲル１０ml)に吸着させることによって予備浄化した。製造者の指示に従って複合体とカップリングするために、ラット血清を１:１０に希釈した。通過液を、セファロース４Ｂに対して１mlあたり０.５mgの割合で結合したＭＥＬ-１４抗体の３mlカラムにかけた。すべてのカラム緩衝液に０.０２％濃度でアジ化ナトリウムを添加した。
【０１７４】
このカラムをＰＢＳ中の２％トリトンＸ-１００ ２５mlで洗浄した後、同じ緩衝液中の１０mM ＣＨＡＰＳ ２５mlで洗浄した。１００mM グリシン、２００mM ＮａＣｌ、ｐＨ３中の１０mM ＣＨＡＰＳ １０mlを加えることによって抗原を放出させ、これを１mM ＴＲＩＳ ＨＣl(pＨ７.６)１ml中に集めることによって中和した。カラムを２０mM トリエチルアミン、２００mM ＮａＣｌ、ｐＨ１１で洗浄し、ＰＢＳ中の１０mM ＣＨＡＰＳで前平衡化した後、中和し、カラム緩衝液１００ml中に希釈した抗原を再添加し、洗浄および放出操作を繰り返した。
【０１７５】
精製したタンパク質をセントリコン３０(Centricon 30；アミコン・インコーポレーテッド)で濃縮し、可視化に銀染色を用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥ(７.５％アクリルアミド)で分析した。典型的な精製では、オロソムコイド標準との比較に基づいて、マウス３００匹あたり３０〜４０μｇの抗原を得た。
【０１７６】
ここにはデータを示さないが、精製した物質のポリアクリルアミドゲルは約９００００ダルトンに移動する拡散バンドと、１８００００ダルトン付近のより高分子量のタンパク質を示した。１８００００ダルトン成分に対する９００００ダルトン成分の比は、数多くの調製すべてにおいて１０:１か、もしくはそれ以上であった。この物質を１０％ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって可視化した。
【０１７７】
９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解は、Ｎ-末端アミノ酸そのものを含む単一のＮ-末端配列(図９Ａ)の同定をもたらした。位置１、１９、３３および３４の４つの空白(Ｘ)を伴うＮ-末端の３８アミノ酸を同定した。位置２２のアミノ酸シグナルの欠失を、Ｎ-結合型グリコシル化部位共通配列(ＮＸＴ／Ｓ)を齎す後続のチロシン残基(Ｙ)およびスレオニン残基(Ｔ)と組み合わせることによって、位置２２のアスパラギン(Ｎ)を推論した。
【０１７８】
この３８残基長のＮ-末端の上に示した図９Ａの１３配列残基は、過去にSiegelman等(前掲)が放射活性標識アミノ酸配列決定法を用いて推定したものであり、本研究で決定したＬＨＲの配列と高度な相同性(１３残基中１１残基)を示している。
【０１７９】
２つの別個のＭＬＨＲ調製物を用いて行った３回の配列決定実験のいずれでもユビキチン配列は得られなかった。おそらくこの修飾がマウスの脾細胞には欠失しているか、もしくはユビキチンのＮ-末端がこの供給源から得たＬＨＲではエドマン分解に対して遮蔽されているのであろう。
【０１８０】
図４〜６のアミノ酸配列を、Lipman,D.等,Science 227:1435-1441(1981)のアルゴリズムを用いて、デイホッフ(Dayhoff)タンパク質データベース中の既知配列と比較した。
【０１８１】
図９Ａで下線を付したアミノ酸７から１５までの残基を、図９Ｂに示すオリゴヌクレオチド・プローブを作成するために選択した。これらの残基から３２倍に縮重した２６マー・オリゴヌクレオチド・プローブを設計し、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)オリゴヌクレオチド合成機で合成した。このプローブには、哺乳類コドン使用則に基づいてコドンＣＣＣを選択した位置９のプロリンを除いて、考え得るすべてのコドン縮重性が含まれている。
【０１８２】
細断したマウスの脾臓から得たネズミ脾臓ｃＤＮＡライブラリーをこのプローブを用いてスクリーニングすることによって、単一のハイブリッド形成ｃＤＮＡクローンが単離された。操作としては、５μｇ／ml コンカナバリンＡで６時間処理したネズミ脾細胞から単離したｍＲＮＡから作成したオリゴｄＴ-プライム化ｇｔ１０ネズミ脾臓ｃＤＮＡライブラリー由来の６０００００プラークを１プレートあたり５００００ファージの割合で１２プレートに接種し、２０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１５０mM ＮａＣｌ、１５mM クエン酸三ナトリウム)、５０mM リン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５ｘデンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、２０μｇ／ml 変性剪断サケ精子ＤＮＡ中４２℃で終夜、図９Ｂに示したＰ３２で標識した３２倍縮重２６マー・オリゴヌクレオチド・プローブを用いてハイブリッド形成を行った。これらのパラメーターを本明細書では"厳密条件"と呼ぶ。フィルターを１ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間２回洗浄し、−７０℃で終夜オートラジオグラフィーを行った。一複製陽性クローンを再スクリーニングし、ＥcoＲ１挿入物を単離し、これをＭ１３またはＰＵＣ １１８／１１９ベクター中に挿入し、配列特異的プライマーを用いて一本鎖鋳型からそのヌクレオチド配列を決定した。
【０１８３】
このバクテリオファージに含まれていた２.２キロ塩基のＥcoＲ１挿入物の全ＤＮＡ配列を図４〜６に示す。最長の読み取り枠は位置１０６〜１０８のメチオニンコドンで始まっている。コザック(Kozak)ボックス相同性がこのメチオニンコドンの周辺に認められ、このことはこのコドンがおそらくタンパク質の翻訳開始に際して機能することを示唆している。分子量約４２２００ダルトンの３７３アミノ酸を含有するタンパク質配列がこの読み取り枠内にコードされている。翻訳されるタンパク質には、単離したＭＬＨＲから決定したＮ-末端アミノ酸配列と正確に対応する残基４０から７６までの配列が認められる。
【０１８４】
この結果は、ＭＬＨＲの成熟Ｎ-末端が位置３９のトリプトファン残基から始まることを示唆している。しかし、ＬＨＲの実際のＮ-末端のいくつかのタンパク加水分解プロセシングが、このタンパク質の単離中に起こったであろうと考え
られる。
【０１８５】
このタンパク質の疎水性特性図は、Ｎ-末端に位置する、小胞体のルーメンへの挿入のためのシグナル配列として機能し得る疎水性ドメインを明らかにしている。位置３９〜３３３の推定配列は主として親水性であり、その後にストップ・トランスファーまたは膜固定ドメインに特有の２２残基疎水性ドメインが続いている。
【０１８６】
このタンパク質のまさにＣ-末端にある細胞内領域と思われる領域は極めて短く、１７残基長しかない。貫膜ドメインと予想されるドメインのすぐＣ-末端側には数個の塩基性アミノ酸があり、これは細胞表面受容体の膜アンカーと細胞質ドメインとの結合部に典型的な性質である(Yarden等,Nature)。潜在的リン酸化部位である一セリン残基が推定上の細胞質ドメイン内に存在する。
【０１８７】
このタンパク質は１０カ所の潜在的Ｎ-結合型グリコシル化部位を含有しており、そのすべてが細胞外ドメインと考えられるドメイン内に存在する。ペプチド配列決定分析において位置６０(成熟タンパク質の残基２２)のアスパラギンが欠失することは、この部位でのグリコシル化を裏付けており、この領域の細胞外配向を明らかにしている。解読領域には計２５個のシステイン残基が含まれているが、このシステイン残基のうち４個はリーダー配列と考えられる配列内に位置している。
【０１８８】
ＭＬＨＲ内のタンパク質モチーフ
図１１〜１３に示すように、推定ＭＬＨＲアミノ酸配列を、デイホッフ・タンパク質配列データバンク中の他のタンパク質と、fastpプログラム（Lipman,D.およびPearson,W.,Science 227:1435-1441(1985)）を用いて比較した結果、いくつかの興味深い配列相同性が認められた。
【０１８９】
最も高い配列相同性値を有するタンパク質を、最大の配列相同性を示す領域を実線で囲んで示す。配列の最初に記載した数字は、そのタンパク質内におけるこれらの相同配列の位置を示している。
【０１９０】
図１１は、ＬＨＲのＮ-末端モチーフ(残基３９〜１５５)が、次に列挙するいくつかの炭水化物結合タンパク質相同性を有することを示している(これらの配列のＭＬＨＲに対する相同率(％)をカッコ内に示し、記載した文献は実施例の欄の後に列挙する)：Drikamer;Drickamer等(1)が発見したアミノ酸残基、ＭｕＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、Ｈｕ.ＨｅｐＬｅｃ(２７.８％);ヒト肝炎レクチン(2)、Ｂａｒｎ.Ｌｅｃ(２５％);フジツボ・レクチン(3)、Ｒａ.ＨｅｐＬｅｃ(２３.５％);ラット肝炎レクチン(4)、Ｃｈ.ＨｅｐＬｅｃ(２７.５％);ニワトリ肝炎レクチン(5)、Ｈｕ.ＩｇＥＲｅｃ(２８.６％);ヒトＩｇＥ受容体(6)、ＲａＨｅｐＬｅｃ２(２２.６％);ラット肝炎レクチン２(7)、Ｒａ.ＡＳＧＲｅｃ(２２.６％);ラット・アシアロ糖タンパク質(asialoglycoprotein)受容体(8)、Ｒａ.ＩＲＰ(２５.６％);ラット島再生タンパク質(9)、Ｒａ.ＭＢＰ(２６.１％);ラット・マンノース結合タンパク質(10)、Ｒａ.ＭＢＤＡ(２６.１％);ラット・マンノース結合タンパク質前駆体Ａ(11)、Ｒａ.ＫＣＢＰ(２７％);ラット・クッペル細胞結合タンパク質(12)、ＦｌｙＬｅｃ(２３.１％);ニクバエ(ニクバエ属)レクチン(13)、およびＲａｂ.Ｓｕｒｆ(２０.９％);ウサギ肺界面活性剤(14)。
【０１９１】
図１１からわかるように、ほとんどＮ-末端に局在化しているＬＨＲのモチーフは、カルシウム依存性動物レクチン即ちＣ-型レクチン(1)のいくつかと高度な相同性を示す。これらには、ニワトリ、ラットおよびヒト由来の種々の肝炎糖結合タンパク質、可溶性マンノース結合性レクチン、クッペル細胞由来のレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカン核タンパク質、心肺界面活性剤アポタンパク質およびニクバエおよびフジツボ由来の２種の無脊椎動物レクチンが含まれるが、これらに限定されない。Drickamerとその共同研究者(前掲)によって初めてＣ-型動物レクチンに共通であることが認識された"非変異"アミノ酸のすべてがＭＬＨＲの炭水化物結合ドメイン中に完全に保存されているわけではないが、これらの残基およびその他の位置の相同性の程度は明白である。Ｃ-型族に属する既知のレクチン類は、末端ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミンおよびマンノースを伴うオリゴ糖類(１)を含む糖結合特異性の範囲を示す。
【０１９２】
これらの炭水化物結合タンパク質すべてに不変であることがわかった多くの残基が存在するという事実は、この領域がＭＬＨＲにおいて炭水化物結合ドメインとして機能することを強く示唆しており、リンパ球がリンパ様組織の特殊化した内皮に糖およびカルシウム依存的に結合し得るという観測事実を明確に説明している。いくつかの態様では、隣接ＬＨＲ領域を伴わないＬＨＲの炭水化物結合ドメインを単独で用いて本発明を実施する。
【０１９３】
炭水化物結合ドメイン完結のほとんど直後に認められる次のモチーフ(残基１６０〜１９３)は、表皮成長因子(ｅｇｆ)族に対して高度な相同性を示す。図１２は表皮成長因子(ｅｇｆ)相同性示している：ＭＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、Ｎｏｔｃｈ(３８.５％);キイロショウジョウバエnotch遺伝子座(15)、Ｓ.ｐｕｒｐ(３１.７％);ストロンギロセントロター・プルプラタス(Strongylocentrotur purpuratus)ｅｇｆ様タンパク質(16)、Ｐｒｏ.Ｚ(３４.１％);ウシ・プロテインＺ(17)、Ｆａｃｔ.Ｘ(３４.２％);凝固因子Ｘ(18)、Ｆａｃｔ.VII(２７.３％);凝固因子VII(19)、Ｆａｃｔ.IX(３３.３％);凝固因子IX(20)、Ｌｉｎ-１２(３２.１％);カエノルハドジチス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)Ｌｉｎ-１２遺伝子座(21)、Ｆａｃｔ.XII(２６％);凝固因子XII(22)、およびＭｕ.ｅｇｆ(３０％);ネズミｅｇｆ(23)。
【０１９４】
図１２からわかるように、ＭＬＨＲのこの領域における相同性の最大値はショウジョウバエ属の神経原性遺伝子座notchに認められるが、この大きな族の他の構成要素のいくつかにもかなりの相同性が認められる。この族の構成要素間でこのドメインの位置が多様であることは、この領域が、異なる機能のための異なるタンパク質間で入れ換えられ得るゲノム断片内に存在し得ることを示唆している。
【０１９５】
６個のシステイン残基に加えて、この族のほとんどすべての構成要素が３個のグリシン残基を共有している。このシステイン残基とグリシン残基の保存はＬＨＲにおけるこの領域の構造上の役割の可能性と一致している。このドメインが、Ｎ-末端に位置する炭水化物結合領域をリガンド相互作用に適した配向に位置させると考えられる。またこのドメインは、内皮表面のｅｇｆ-受容体同族体に結合することによるリンパ球と内皮との相互作用を強化するように働くとも考えられる。
【０１９６】
ＭＬＨＲの細胞外領域中の最後のタンパク質モチーフはアミノ酸１９７から３２８までをコードしている。この糖タンパク質のこの領域は、いくつかの補体因子結合タンパク質と高度な相同性を有するアミノ酸モチーフ(図１３)を含有する６２残基配列の２つの直列反復を含んでいる。
【０１９７】
図１３は補体結合タンパク質相同性を示している：ＭＬＨＲ;ＭＬＨＲ配列、ＨｕＣｏｍＨ(３１.９％);ヒト補体プロテインＨ前駆体(24)、ＭｕＣｏｍＨ(２８.９％);ネズミ補体プロテインＨ前駆体(25)、ＨｕＢｅｔａ(２５.６％);ヒトβ-２-グリコプロテインＩ(26)、ＨｕＣＲ１(２９.９％);ヒトＣＲ１(27)、ＥＢＶ／３ｄ(２５％)６;ヒト・エプスタイン-バー・ウイルス／Ｃ３ｄ受容体(28)、ＨｕＣ２(２７.１％);ヒト補体Ｃ２前駆体(29)、ＨｕＢ(２３.１％);ヒト補体因子Ｂ(30)、ＭｕＣ４ｂ(２２％);ネズミＣ４ｂ結合前駆体(31)、ＨｕＣ１ｓ(２９.２％);ヒトＣ１ｓチモーゲン(32)、ＨｕＣ４ｂ(２６.１％)；ヒトＣ４ｂ結合タンパク質(33)、ＨｕＤＡＦ(２７.１％);ヒト崩壊促進因子(34)、ＶａｃＳｅｃＰ(２６.２％)；ワクシニア・ウイルス分泌ペプチド(35)。
【０１９８】
この反復ドメインの複数の広い範囲をコードするこれらのタンパク質には、数あるなかでも、ヒトおよびネズミ補体Ｈ前駆体、ヒト・ベータ２糖タンパク質、エプスタイン-バー・ウイルス／Ｃ３ｄ受容体、ヒトＣ４ｂ結合タンパク質、崩壊促進因子およびワクシニアウイルス分泌ポリペプチドが含まれる。
【０１９９】
図７ＣはＭＬＨＲ中の２つの直列反復と補体結合族に属するタンパク質に認められる直列反復との相同性を示している。補体結合タンパク質のこの群に保存されているアミノ酸の多くが、保存されているシステイン残基の数を含めて、ＭＬＨＲのこの領域中の２つの反復にも認められる。
【０２００】
興味深いことに、ＭＬＨＲに含まれる２つの反復は、アミノ酸レベルで厳密に互いの複製であるばかりでなく、ヌクレオチド配列レベル(ヌクレオチド残基６８５〜８６５および８６６〜１０５６)でも厳密な相同性を示している。この結果がクローニング・アーチファクト(人工産物)によるものであることも考えられるが、ＭＬＨＲ発現細胞株３８Ｃ１３(スタンフォード大学(Palo Alto,California,U.S.A.)から入手可能)から作成した別個のｃＤＮＡライブラリーから単離した他のクローンのいくつか、およびヒトのＭＬＨＲ同族体(後述)にもこの複製領域が認められている。さらに、いくつかの他の遺伝子(最も注目すべきはＬｐ(ａ)遺伝子である)は、さらに高度なこのドメインの遺伝子内反復配列保存を示す。これらの結果は、ＭＬＨＲが補体結合族の他の構成要素と同様に、この結合ドメインの複数反復を含有することを示唆している。
【０２０１】
結論として、ＭＬＨＲの細胞外領域は互いに結合することによって新しい１または複数の機能を果している３つの別個のタンパク質モチーフを含有していると思われる。この糖タンパク質に含まれるタンパク質モチーフの要約を図１４に示す。
【０２０２】
実施例２：ＨｕＬＨＲのクローニング
上記の例に記述したように一般に、上述のネズミＭel１４抗原ｃＤＮＡクローンの２.２kbＥcoＲ１挿入物を単離し、Ｐ３２三リン酸塩を用いるランダム・プライム化ＤＮＡポリメラーゼ合成によって高比活性に標識し、これを用いて、一次細胞から得たヒト末梢血液リンパ球ｍＲＮＡ由来のオリゴｄＴプライム化ラムダｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから６０００００クローンをスクリーニングした。フィルターを４０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ(１ｘＳＳＣは３０mM ＮａＣｌ、３mM クエン酸三ナトリウムである)、５０mM リン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、１０％ 硫酸デキストラン、５ｘデンハルト溶液および２０μｇ／ml 剪断煮沸サケ精子ＤＮＡ中４２℃で終夜ハイブリッド形成を行った。これらを０.２ｘＳＳＣ、０.１％ 硫酸ドデシルナトリウム中５５℃で４０分間２回洗浄した。１２クローン(５００００ファージのプレートあたり約１陽性)を選択し、最大のＥcｏＲ１挿入物(〜２.２キロ塩基)を単離し、そのＤＮＡ配列を、配列特異的プライマーを用いるバクテリオファージｍ１３内でのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定した。
【０２０３】
この〜２.２kbクローンは、コザック・ボックス相同領域に続くメチオニンで始まる約４２２００ダルトンの分子量を有する３７２アミノ酸の読み取り枠をコードしていた。このコード化されたタンパク質には２６個のシステイン残基と８カ所の潜在的Ｎ-結合型グリコシル化部位が含まれていた。このタンパク質のＮ-末端の高度に疎水的な領域(残基２０〜３３)はシグナル配列と考えられ、Ｃ-末端に位置する２２アミノ酸長のもう１つの高度に疎水的な領域(残基３３５〜３５７)はストップ・トランスファーまたは膜固定ドメインと考えられた。このＣ-末端疎水領域には、荷電した、おそらく細胞質領域と考えられる領域が続いていた。
【０２０４】
このヒト・クローンのヌクレオチド配列を既に分かっているＭＬＨＲの配列と比較したところ、高度な総ＤＮＡ配列相同性(〜８３％)が認められた。各ＬＨＲドメインにおけるＭＬＨＲとＨｕＬＨＲの相対的アミノ酸配列保存度は次の通りである：炭水化物結合ドメイン--８３％；ｅｇｆ様ドメイン--８２％；補体結合反復１--７９％；補体結合反復２--６３％；総補体結合ドメイン--７１％；貫膜ドメイン--９６％。
【０２０５】
公開されたヘルメス配列(Jalkanen,前掲)を、図１〜３のＨｕＬＨＲ配列と比較すると、配列相同性が無いことがわかる。
【０２０６】
実施例３：ＭＬＨＲの発現
本発明において単離したネズミｃＤＮＡクローンがＭＬＨＲをコードしていることを決定的に立証するために、このクローンを発現ベクター中に挿入し、一時的細胞トランスフェクション検定法で分析した。ＨｕＬＨＲの発現も同様の方法で実行した。
【０２０７】
上述の読み取り枠を含むＥcoＲ１断片(図４〜６に配列を示した〜２.２キロ塩基ＥcoＲ１断片)を単離し、サイトメガロウイルス・プロモーターを含有すｐＲＫ５ベクター(Eaton,D.等,Biochemistry 25:8343-8347(1986)；欧州公開第307247号(1989年3月15日公開))中に連結した。この挿入ｃＤＮＡをプロモーターに対して正しい配向で含有しているプラスミドを選択し、ＣａＰＯ４沈殿法を用いて２９３ヒト胚腎細胞に導入した。
【０２０８】
２日後、細胞を各５００μＣｉのＳ３５システインおよびメチオニンと共にインキュベートした。溶解液と上清を過去に記述されたように調製し(Lasky,L.等,Cell 50:975-985(1987))、Ｍel１４モノクローナル抗体とプロテインＡ・セファロースとの間に挟まれた抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体を使用することによって、Ｍel１４モノクローナル抗体(免疫アフィニティー・クロマトグラフィーで精製したもの)で免疫沈降した。
【０２０９】
同時に、ＭＬＨＲを発現することがわかっている細胞、Ｂ-細胞リンパ腫３８Ｃ１３を、上清ＭＬＨＲを分析するためにメチオニンあるいはシステインで代謝的に標識するか、もしくは細胞に結合したＬＨＲを分析するためにこの細胞表面糖タンパク質をＩ１２５およびラクトペルオキシダーゼで標識し、Ｍel１４抗体免疫沈降によって分析した。
【０２１０】
得られた免疫沈降物を７.５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルで分析し、−７０℃で終夜オートラジオグラフィーにかけた。
【０２１１】
これらの検定結果を図１０に示す。この図におけるレーンＡ〜Ｆの意味を次に説明する：
Ａ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液；
Ｂ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清；
Ｃ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液；
Ｄ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶ外被発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清；
Ｅ．Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した３８Ｃ１３細胞上清；
Ｆ．Ｉ１２５で表面標識し、Ｍel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した３８Ｃ１３細胞溶解液。
【０２１２】
図１０からわかるように、この構築物でトランスフェクションした細胞は、Ｍel１４抗体と特異的に反応する２種類の細胞結合性タンパク質を生産する。これ
らの細胞結合性タンパク質は約〜７００００ダルトンおよび〜８５０００ダルトンに移動し、このことは〜４２２００ダルトンの核タンパク質がトランスフェクション細胞中でグリコシル化されるようになることを示唆している。シアリダーゼ処理を行うと、より大きなバンドの分子量が変化する(データは示していない)ことは、このタンパク質が相対的に成熟型の糖タンパク質であることを示唆し、一方、より低分子量のバンドがこの酵素に対して耐性であることは、このタンパク質が前駆体型であり得ることを示している。
【０２１３】
一時的トランスフェクション細胞株のＭel１４抗体によるＦＡＣ分析は、これらの細胞中で発現したＬＨＲの一部が細胞表面上で検出可能であることを明らかにした(データは示していない)。
【０２１４】
このトランスフェクション細胞株中で生産される、より高分子量の糖タンパク質は、他のトランスフェクション細胞株で得た結果、即ち末梢リンパ節誘導性Ｂ-細胞リンパ腫３８Ｃ１３が産出するもの(図１０レーンＦ)より僅かに小さいことがわかった。これはグリコシル化の細胞特異的相違によるものであろう。
【０２１５】
興味深いことに、３８Ｃ１３細胞とトランスフェクションしたヒト細胞はどちらも、より低分子量型のＭＬＨＲを培地中に放出するようである(図１０レーンＢおよびＥ)。この放出分子の性質は明らかではないが、その分子量が小さいことは、これが膜アンカー付近のタンパク加水分解によって生じた細胞表面型の切断産物であることを示唆している。
【０２１６】
結論として、これらの結果は、本発明者等が単離したｃＤＮＡクローンがＭＬＨＲをコードしていることを明確に立証している。
【０２１７】
実施例４：先端が欠失したＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの構築、精製および分析 図１５は、レクチン、レクチン-ｅｇｆおよびレクチン-ｅｇｆ-補体調節モチーフを含有するＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の構築を示している。この図の最上段は、貫膜アンカードメイン(ＴＭＤ)および短い細胞質配列と共にＮ-末端シグナル配列(ＳＳ)、レクチン・ドメイン、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメインおよび重複した補体調節ドメイン(ＣＤＢ)を含有するネズミリンパ球誘導受容体(ＭＬＨＲ)のタンパク質ドメインを示している。レクチン(ＭＬＨＲ-Ｌ＋ＩｇＧ)、レクチンおよびｅｇｆ(ＭＬＨＲ-ＬＥ＋ＩｇＧ)、およびレクチン、ｅｇｆおよび２つの補体調節モチーフ(ＭＬＨＲ-ＬＥＣ＋ＩｇＧ)を含有する３種類の先端欠失型ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類も図１５に示されている。これらの先端欠失型タンパク質はすべて、これらのキメラがＣＨ２およびＣＨ３定常領域と共に、免疫グロブリン二量化に寄与するヒンジの２個のシステイン残基(Ｃ)を含有するように、ヒンジ・ドメイン(Ｈ)の直ぐ上流のヒト重鎖ガンマ１領域に結合している。過去に特徴づけられたヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域カセット(Caponet等,前掲(1989))を使用した。ＬＨＲ配列とヒトＩｇＧ配列との接合部位は、ヒンジ領域近傍におけるこれらの分子の結合によって、軽鎖が産出されない条件下でキメラ分子が効率的に合成され、二量化されるように選択した。さらに、ヒトＩｇＧ１定常領域を使用することにより、以下に記述する免疫組織化学的実験において、内因性のネズミＩｇＧ類との交差反応性に起因する問題を避けることができる。
【０２１８】
図１６からわかるように、これらのキメラはこれらの一時的トランスフェクション検定中で効率良く合成され、分泌された。抗体を添加しない条件下でのこれらのキメラとプロテインＡセファロースとの反応性は、これらの定常領域ドメインが正常に畳み込まれていることを立証している。図１６は、これらの分子が非還元的条件下で二量化することを示しており、これらのキメラにおいてヒンジ領域が完全に機能的であることを立証している。最後に、プロテインＡ反応性は、プロテインＡセファロース・カラムによるこれらのキメラのほぼ均一な精製をも可能にする。この実施例の結果は、定常ドメインがヒトＩｇＧガンマ１重鎖由来であり、一方、"可変"ドメインがＭＬＨＲ由来であると言える抗体様物質の生産を立証している。
【０２１９】
キメラの構築
過去に記述されたＭＬＨＲ-ＰＲＫ５発現プラスミド(Eaton等(1986)；Lasky等,Cell 50:975-985(1987))およびヒト重鎖ＩｇＧのｃＤＮＡコピー(Capon等,Nature 337:525-531(1989))から出発して、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１-ＣＨ３領域をコードする１１００bpのＨindIII断片を、ＭＬＨＲｃＤＮＡのポリＡ部位の３'に挿入した。ｍ１３複製起点およびＫＯ７ヘルパー・ファージを用いてこのプラスミドを一本鎖鋳型に変換した後、貫膜固定領域と推定される領域のＮ-末端側のレクチン、ｅｇｆおよび第２補体結合反復とヒンジとの間の領域を、インビトロ変異法(ZollerおよびSmith(1982))により、４８マー・オリゴヌクレオチドでループ・アウトした。得られた変異体を、欠失接合部をまたぐ３２Ｐで標識した２１マー・オリゴヌクレオチドでスクリーニングし、単離した変異体をスーパーコイル配列決定法を用いて配列決定した。
【０２２０】
過去に記述された方法を用いてヒト腎２９３細胞をトランスフェクションすることによる発現について、正しい変異体を試験した。３５Ｓメチオニンおよびシステインで標識した上清を、抗体を添加しない条件下でプロテインＡセファロース・ビーズによる免疫沈降によって分析した。沈降したタンパク質を、β-メルカプトエタノールによる還元下または非還元下、７.５％ポリアクリルアミド-ＳＤＳゲルで分析した。正しく発現したキメラを齎すプラスミドを、Ｇ４１８に対する耐性をコードしている選択プラスミドおよびジヒドロ葉酸レダクターゼの存在下でトランスフェクションすることにより、２９３細胞中に導入した。クローンをＧ４１８中で選択し、挿入されたプラスミドをメソトレキセートの存在下で増幅した。各構築物を高レベルで発現する永久細胞株をＴ-フラスコ中で大量に生育させ、その細胞上清を遠心分離および濾過によって透明化した。得られた上清をアミコン濾過によって濃縮し、標準的プロテインＡセファロースカラムに通し、ＰＢＳで洗浄し、０.１M 酢酸、０.１５M ＮａＣｌ(ｐＨ３.５)で溶出させた。溶出した物質を直ちに３M Ｔｒｉｓ(ｐＨ９)で中和し、ＳＤＳゲル電気泳動およびＥＬＩＳＡ検定法で定量した。
【０２２１】
前段落に記述したゲル電気泳動の結果を図１６に示す。還元されたタンパク質をレーンＡ〜Ｆに、非還元タンパク質をレーンＧ〜Ｉに、また精製したタンパク質をレーンＪ〜Ｌに示す。マーカーの分子量をキロダルトンで示す。各レーンの同定を次に説明する：Ａ．分泌されたＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｂ．細胞内ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｃ．分泌されたＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｄ．細胞内ＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｅ．分泌されたＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｆ．細胞内ＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｇ．分泌されたＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｈ．分泌されたＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｉ．分泌されたＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ、Ｊ．精製したＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ、Ｋ．精製したＭＬＨＲＬＥ-ＩｇＧ、Ｌ．精製したＭＬＨＲＬ-ＩｇＧ。
【０２２２】
抗ヒトＩｇＧ１-特異的マウス・モノクローナル抗体で被覆したウェルからなる形式のＥＬＩＳＡを用いて、単離したＬＨＲ-ＩｇＧキメラを定量した。未知試料と高度に精製したヒトＣＤ４-ＩｇＧ１免疫アドヘシン(immunoadhesin)標準を、抗体で被覆したプレートと共にインキュベートした後、そのプレートを洗浄し、結合した物質を西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ１と反応させ、次いでさらに洗浄し、基質を添加した。この定量的検定法によって、サブナノグラム量の単離ＬＨＲ-ＩｇＧキメラが測定できた。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡによるＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラＰＰＭＥ反応性の分析
種々のＩｇＧキメラが酵母細胞壁炭水化物、ポリホスホマンナンエステルまたはＰＰＭＥを認識する能力を、過去に記述された形式のＥＬＩＳＡで分析した(Imai等(1989))。簡単に記述すると、約等量の精製キメラを４℃で終夜微量滴定ウェルに被覆する。非特異的部位をＢＳＡで遮断した後、結合した抗原を５μｇ／mlのＰＰＭＥ溶液と反応させた。結合した炭水化物を、これに対するポリクローナル抗体および標準的(ベクター(Vector))免疫組織化学的染色試薬を用いて検出した。Ｍel１４による阻害を、ＰＰＭＥ添加前にＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ含有ウェルをこのモノクローナル抗体と共に予備インキュベートすることにより実行し、一方、結合反応中に１０mM ＥＧＴＡを添加することにより、この誘導受容体-炭水化物相互作用のカルシウム依存性を立証した。阻害を調べる検定として、ＰＰＭＥインキュベーションの前に他の種々の添加物を加えた。２２℃で１時間後、プレートを洗浄し、ＰＰＭＥに対するウサギ・ポリクローナル抗体と共に２２℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ベクターＡＢＣ-ＡＰと共に３０分間インキュベートし、洗浄し、発色させた。得られた検定をプレート読み取り機で測定した。阻害検定に使用した炭水化物はシグマ・ケミカル・コーポレイテッド(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO.)から入手した。
【０２２４】
ＰＰＭＥ結合分析の結果を図１７に示す。各レーンは次のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを含有する：Ａ．ＭＬＨＲＬ-、ＭＬＨＲＬＥ-およびＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラに対するＰＰＭＥの結合、Ｂ．Ｍel１４モノクローナル抗体およびＥＧＴＡによるＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ-ＰＰＭＥ結合の阻害、Ｃ．他の炭水化物によるＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧ-ＰＰＭＥ結合の阻害。
【０２２５】
過去に行われた研究によって、ＬＨＲが酵母細胞壁マンナン、ホスホマンナンエステルまたはＰＰＭＥに結合し得ること(Yednock等,J.Cell Biol.104:725-731(1987))、並びに、この結合がリンパ球の末梢リンパ節高内皮小嚢に対する吸着能を阻害することが立証されており、これは末梢リンパ節ＬＨＲレクチン・ドメインが末梢リンパ節内皮上の炭水化物を認識するであろうという仮説に合致している。さらにＭel１４抗体がリンパ球表面に対するＰＰＭＥの結合を阻害することも発見され(Yednock等,前掲(1987))、これは、この炭水化物が末梢リンパ節ＬＨＲのレクチン・ドメイン内に結合するという理解と合致している。
【０２２６】
レクチン、ｅｇｆおよび重複した補体結合反復構造を含有するキメラがＰＰＭＥを結合することがわかった。この結合はＭel１４抗体によって阻害可能であり、このことは、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラがこの抗体によって認識されることを立証するデータ(データは示していない)と合致している。またこの結合は、脾細胞から単離されたＭＬＨＲ(Imai等,印刷中(1989))を用いて過去に認められたものと定量的に同等であり、このことは、これがリンパ球表面上のＬＨＲで認められているタンパク質-炭水化物相互作用(Yednock等,前掲(1987))と同じであることを示唆している。さらに、この結合はカルシウム依存性であることもわかり(StoolmanおよびRosen,J.Cell Biol.96:722-729(1983))、このことは、リンパ球結合受容体について既に示されているように、Ｃ型またはカルシウム依存性レクチン・ドメイン(Drickamer,J.Biol.Chem.263:9557-9560(1988))が少なくとも部分的にこの相互作用に寄与することを暗示している(図１６ｂ)。
【０２２７】
過去に行われた研究によって、ＰＰＭＥ以外の種々の炭水化物が脾臓由来のＭＬＨＲによって認識され得ることが立証されている(Yednock等,前掲(1987)；Imai等,前掲(1989))。これらには、フコイジン、硫酸デキストランおよび脳由来のスルファチド類が含まれる。これらの炭水化物がＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラとＰＰＭＥとの相互作用を阻害する能力を、この分子の特異性を過去に記述された脾臓由来の糖タンパク質(Imai等,前掲(1989))と比較するために試験した。図１６からわかるように、フコイジン、硫酸デキストランおよびスルファチドはすべてＰＰＭＥとＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧとの相互作用を阻害することができ、このことは、組換え法で誘導したこのタンパク質の炭水化物特異性が、天然に存在するタンパク質に関して過去に記述されたものとよく似ていることを示している。他の２種類の荷電炭水化物、硫酸コンドロイチンおよびヘパリンによって阻害されないことは、この阻害が特異的炭水化物認識に起因するものであり、これらの化合物の高度に荷電した性質による非特異的相互作用に起因するものではないことを示唆している。
【０２２８】
ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラによる細胞遮断検定
過去に記述された(GeoffreyおよびRosen,J.Cell Biol.,印刷中(1989))パイエル斑およびマウスの末梢リンパ節のクリオスタット切断切片を用いて、スタンプファー・ウッドルフ(Stampfer-Woodruff)細胞遮断検定法(StamperおよびWoodruff,J.Exp.Med.144:828-833(1976))を実行した。簡単に説明すると、ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ、単離した脾臓由来ＭＬＨＲもしくは緩衝液単独の存在下で、凍結組織切片を腸間膜リンパ球と共にインキュベートした。ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを１０μｇ／切片程度の濃度で添加し、１ｘ１０７細胞／mlの添加前に凍結切片上で予備インキュベートした。このスライドを洗浄し、デジタル生物形態計測によって、リンパ球付着を、単位面積あたりのこれらのリンパ様器官中のＨＥＶに結合したリンパ細胞数として測定した。
【０２２９】
データは示さないが、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラは末梢リンパ節ＨＥＶに対するリンパ球の結合を約７５％阻害のレベルで阻害し、一方この検定において、脾臓由来のＭＬＨＲは約５０％のレベルで遮断することがわかった。この阻害はカルシウム依存性であり、ＭＥＬ１４モノクローナル抗体の添加によって遮断された(データは示していない)。
【０２３０】
ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの免疫組織化学的分析
単離したＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを、モノクローナル抗体のために用いる方法と同一の方法を用いる免疫組織化学的実験に使用した。８〜１０ミクロンの組織切片をクリオスタット中で切断し、０.１M カコジレート、１％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で３０分間固定した。この切片をダルベッコＰＢＳ中で洗浄し、５％正常マウス血清中の種々の量のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラを用いて４℃で３０分間染色した。次にこれらの切片を洗浄し、ビオチニル化したヤギ抗ヒトＦｃ特異的抗体(ベクター)を含む第２段階と共にインキュベートした。第２段階の試薬の添加後およびベクターＡＢＣ錯体の添加前に切片を過酸化水素-メタノールで処理することにより、内因性のペルオキシダーゼを除去した。切片を洗浄し、基質(ＡＥＣ)と共に５〜１０分間インキュベートした。最後に切片を水性ヘマトキシリン(バイオメディア(Biomedia))で対比染色し、ツァイス・アキシオプロット(Zeiss Axioplot)で検査した。
【０２３１】
３種類のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラのこれらの免疫組織化学的分析では末梢リンパ節を組織源として用いた。組織学的供給源として末梢リンパ節を選択したのは、リンパ球がこのリンパ様組織のＨＥＶに対して、Ｍel１４によって遮断され得る様式で結合することが多くの過去の文献によって立証されており、これによりＭＬＨＲによって認識される最大レベルのリガンドがこの組織中に存在するはずであることが示唆されている(Gallatin等,Nature 304:30-34(1983))ことに基づく。ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラは末梢リンパ節ＨＥＶを染色することができた。この染色は専ら高壁(high walled)内皮細胞上に認められ、内腔外または内腔近傍領域は染色されなかった。さらに、この染色はＭＥＬ１４抗体によって遮断可能であり、カルシウムの存在に依存した。このことはＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧの末梢リンパ節ＨＥＶに対する結合が、リンパ球とＨＥＶとの接着に似ていることを示唆している。ＰＰＭＥ結合データと合致して、ＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧによる末梢リンパ節ＨＥＶの染色はフコイジンおよび硫酸デキストランによって阻害可能であり(図１０)、一方、硫酸コンドロイチンおよび単純なマンナン類はこの染色反応を阻害できなかった(データは示していない)。このこともまた、この染色反応が、この末梢リンパ節ＨＥＶ上に発現した炭水化物リガンドの認識によるものであることを示唆している。これらのデータは、末梢リンパ節ＬＨＲと相互作用し得る内皮分子の組織分布を調べるために、この型の免疫組織化学的試薬を使用し得ることを明らかにしている。
【０２３２】
ＭＬＨＲリガンドがパイエル斑中に存在する
ここには示さないが、免疫組織化学的検定の結果、本発明者等は、予想外にもＭＬＨＲＬＥＣ-ＩｇＧキメラがパイエル斑の内皮を特異的に認識し得ることを発見した。このキメラは、リンパ細胞を含有するパイエル斑管の高壁内皮を染色するようである。この染色はＭＥＬ１４抗体によって阻害可能であり、カルシウム依存性でもあった。興味深いことに、パイエル斑ＨＥＶの染色は、末梢リンパ節ＨＥＶの染色と比較するといくらか弱いように見え、このことは、このリンパ様器官において発現するＭＬＨＲリガンドがより低レベルであることを示唆している。これらの結果は、他の接着系もこの器官に含まれ得るが(Holzman等,Cell 56:37-46(1989))、末梢リンパ節ＬＨＲに対するリガンドが発現し、それゆえに、このリガンドがこのリンパ様器官の内皮に対するリンパ球の結合に関与することを立証している。
【０２３３】
実施例５：ＣＤ４-ＩｇＧ-ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラの構築
過去に構築された２種類のＰＲＫプラスミドをＭＬＨＲ-ＩｇＧおよびヒトＣＤ４-ＩｇＧの直接発現に使用した。ＭＬＨＲプラスミドは上の実施例に記述したものである。ＣＤ４-Ｉｇプラスミドは、ＣＨ１ドメインおよび最初のシステイン残基までのヒンジ領域部分をコードする領域を削除することによって改変した、Capon等の文献(前掲)に記述されているものである。これらのプラスミドを上述の標準的リン酸カルシウム法を用いて、２つの遺伝子が高レベルで一時的に発現する細胞を作成するためにＰＳＶＴ ａｎｔｉｇｅｎと共に、もしくは２つの遺伝子が安定に発現する細胞クローンを選択するためのネオマイシン耐性を付与するためにＰＳＶｎｅｏと共に、ヒト２９３細胞中に同時トランスフェクションした。放射免疫沈降によって発現を分析した；ＣＤ４-ＩｇＧ、ＬＨＲ-ＩｇＧおよびＣＤ４-ＩｇＧ-ＬＨＲ-ＩｇＧはすべてＩｇＧ Ｆｃ部分を含有しているので、これらはすべて標準的方法でプロテインＡによって直接沈降させ得る。３種類の分子、ＣＤ４-ＩｇＧホモ二量体、ＬＨＲ-ＩｇＧホモ二量体およびＣＤ４-ＩｇＧ-ＬＨＲ-ＩｇＧヘテロ二量体を検出した。これらの分子は還元によってそれぞれの単量体成分に分離し、このことは各二量体の構成成分が、ヘテロ二量体を含めて、ジスルフィド結合によって互いに共有結合していることを示している。
【０２３４】
実施例の参考文献
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10.Drickamer,K.等,J.Biol.Chem.262:2582(1987)
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30.Mole,J.等,J.Biol.Chem.259:3407(1984)
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34.Caras,I.等,Nature 325:545(1987)
35.Kotwal,G.等,Nature 335:176(1988)。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、ヒトＬＨＲ(ＨｕＬＨＲ)のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。
【図２】図２は、図１の続きである。
【図３】図３は、図２の続きである。
【図４】図４は、ネズミＬＨＲ(ＭＬＨＲ)のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を表す。
【図５】図５は、図４の続きである。
【図６】図６は、図５の続きである。
【図７】図７は、成熟したＨｕＬＨＲとＭＬＨＲのアミノ酸配列間の比較を示す。
【図８】図８は、図７の続きである。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＭＬＨＲの単離およびＮ末端配列決定の結果を示す。図９Ａは、ネズミ脾臓の界面活性剤抽出物からMel１４モノクローナル抗体アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製した物質のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルから得た９００００ダルトンのバンドの気相エドマン分解を表す。下線を付したアミノ酸７〜１５の残基を、図９Ｂに示すオリゴヌクレオチド・プローブを作成するために選択した。図９Ｂに３２倍に縮重した２６マー(２６量体)・ヌクレオチド・プローブとして示す。
【図１０】図１０は、ＭＬＨＲｃＤＮＡクローンの一時的発現を表す。レーンＡ〜Ｆを次に説明する。Ａ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液。Ｂ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＭＬＨＲ発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清。Ｃ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫した、ＨＩＶｇｐ１２０外被糖タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の溶解液。Ｄ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、ＨＩＶ外被発現プラスミドでトランスフェクションした２９３細胞の上清。Ｅ：Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、３８Ｃ１３細胞の上清。Ｆ：Ｉ１２５で表面標識し、Mel１４モノクローナル抗体で免疫沈降した、３８Ｃ１３細胞の溶解液。
【図１１】図１１は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１１は炭水化物結合ドメインを比較している。
【図１２】図１２は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１２は表皮成長因子ドメインを比較している。
【図１３】図１３は、ＭＬＨＲと異種であるが、機能的には類似しているタンパク質配列を示す。“ＭＬＨＲ”と表記した列は図４〜６のＭＬＨＲに相当する。図１３は補体結合因子ドメインを比較している。
【図１４】図１４は、ＬＨＲ中に認められるタンパク質ドメインの模式図であり、これにはシグナル配列、炭水化物結合ドメイン、表皮成長因子(ｅｇｆ)ドメイン、２つの補体結合ドメイン反復(矢印)、貫膜結合ドメイン(ＴＭＤ)、および荷電細胞内ドメインが含まれる。
【図１５】図１５は、レクチン、レクチン-ｅｇｆおよびレクチン-ｅｇｆ-補体調節モチーフを含有するＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の構築を表す。
【図１６】図１６は、ＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類の発現産物および精製物のゲル電気泳動を示す。
【図１７】図１７は、種々のＭＬＨＲ-ＩｇＧキメラ類のポリホスホマンナンエステル(ＰＰＭＥ)結合分析を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン軽鎖を有さない免疫グロブリン重鎖二量体を含むポリペプチドであって、受容体、担体タンパク質、ホルモン、成長因子、酵素または栄養物質であって、リンパ球誘導受容体、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素、それに相同なタンパク質、または分離した遺伝子によってコードされている複数サブユニットポリペプチドではないリガンド結合パートナーのアミノ酸配列が少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖の可変領域を置換しており、その結合パートナーがＣ末端で免疫グロブリン定常領域のアミノ酸配列に融合し、結合特性を保持している、ポリペプチド。
【請求項２】
免疫グロブリン重鎖二量体が、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＣＨ１ドメインを欠損している、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
リガンド結合パートナーが受容体である請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得られる請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ重鎖の定常ドメインである請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
免疫グロブリン重鎖がヒトのものである請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
リガンド結合パートナーがヒトのものである請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
リガンド結合パートナーが一本鎖である請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーであるポリペプチド融合物であって、該融合物がさらに第２リガンド結合パートナーと免疫グロブリンとの追加融合物を含む請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド融合物。
【請求項１１】
第２リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーとは異なる請求項１０に記載のポリペプチド融合物。
【請求項１２】
生理学的に許容し得る担体中の請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
担体が滅菌等張溶液である請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換した細胞を含む組成物。
【請求項１７】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞がチャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞株である請求項１７の組成物。
【請求項１９】
形質転換細胞を培養し、その細胞培養物からポリペプチドを回収することを含む請求項１６〜１８のいずれかに記載の細胞を培養する方法
。
【請求項２０】
ポリペプチドを宿主細胞から回収する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが培養培地中に分泌され、その培養培地から回収される請求項２０の方法。
【請求項１】
免疫グロブリン軽鎖を有さない免疫グロブリン重鎖二量体を含むポリペプチドであって、受容体、担体タンパク質、ホルモン、成長因子、酵素または栄養物質であって、リンパ球誘導受容体、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成要素、それに相同なタンパク質、または分離した遺伝子によってコードされている複数サブユニットポリペプチドではないリガンド結合パートナーのアミノ酸配列が少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖の可変領域を置換しており、その結合パートナーがＣ末端で免疫グロブリン定常領域のアミノ酸配列に融合し、結合特性を保持している、ポリペプチド。
【請求項２】
免疫グロブリン重鎖二量体が、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＣＨ１ドメインを欠損している、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
リガンド結合パートナーが受容体である請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得られる請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
免疫グロブリン重鎖がＩｇＧ重鎖の定常ドメインである請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
免疫グロブリン重鎖がヒトのものである請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
リガンド結合パートナーがヒトのものである請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
リガンド結合パートナーが一本鎖である請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーであるポリペプチド融合物であって、該融合物がさらに第２リガンド結合パートナーと免疫グロブリンとの追加融合物を含む請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド融合物。
【請求項１１】
第２リガンド結合パートナーが第１リガンド結合パートナーとは異なる請求項１０に記載のポリペプチド融合物。
【請求項１２】
生理学的に許容し得る担体中の請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
担体が滅菌等張溶液である請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む複製可能な発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換した細胞を含む組成物。
【請求項１７】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞がチャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞株である請求項１７の組成物。
【請求項１９】
形質転換細胞を培養し、その細胞培養物からポリペプチドを回収することを含む請求項１６〜１８のいずれかに記載の細胞を培養する方法
。
【請求項２０】
ポリペプチドを宿主細胞から回収する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが培養培地中に分泌され、その培養培地から回収される請求項２０の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００９−１６５４８９（Ｐ２００９−１６５４８９Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０５１８０（Ｐ２００９−１０５１８０）
【出願日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【分割の表示】特願２００２−２６８２５（Ｐ２００２−２６８２５）の分割
【原出願日】平成２年１１月２１日（１９９０．１１．２１）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【分割の表示】特願２００２−２６８２５（Ｐ２００２−２６８２５）の分割
【原出願日】平成２年１１月２１日（１９９０．１１．２１）
【出願人】（５９６１６８３１７）ジェネンテック・インコーポレーテッド (372)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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