リステリアに基づくワクチン及びＬＬＯに基づくワクチン
この発明は、抗原発現腫瘍を治療して予防接種し、そして抗原の準顕性エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の抗原への融合物又は抗原を発現する組換えリステリア株を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に用いられるリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び同一のものを含む、Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して、Ｈｅｒ−２発現腫瘍を治療して予防接種する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【０００２】
発明の背景
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（「Ｈｅｒ−２」とも呼ばれる）は、チロシンキナーゼの表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである１８５ｋＤａの糖蛋白質であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞シグナリングに関与することがわかっている細胞内ドメインからなる（Ｂａｒｇｍａｎｎ ＣＩ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２２６，１９８６；Ｋｉｎｇ ＣＲ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９７４，１９８５）。それは全乳癌の２５から４０％において過剰発現されて、多数の卵巣癌、肺癌、膵臓癌、及び胃腸系の癌においても過剰発現される。Ｈｅｒ−２の過剰発現は制御されない細胞成長及びシグナリングに関連し、両者は腫瘍の発生に寄与する。Ｈｅｒ−２を過剰発現する癌を有する患者は、Ｈｅｒ−２に対して向けられた検出可能な体液性のＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答によってさえ寛容を呈する。
【０００３】
リステリアモノサイトゲネスは主に抗原提示細胞に感染する細胞内病原体であって、これらの細胞の細胞質において生涯適合される。マクロファージのような宿主細胞は活動的にリステリアモノサイトゲネスを食菌して、大多数の細菌がファゴリソソーム中で分解される。いくつかの細菌は、ヘモリジン、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）の作用によりファゴソームの膜に穴を開けて宿主の細胞質に逃げ込む。細胞質に入ったら、リステリアモノサイトゲネスは宿主のアクチンを重合することができて、細胞から細胞へと直接通過して、さらに、宿主の免疫系を逃れて、リステリアモノサイトゲネスに対しての無視できる抗体応答しかもたらさない。
【０００４】
発明の概要
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【０００５】
一つの態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片、約１５０から約４２０アミノ酸の長さを有するＨｅｒ−２蛋白質の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたか又はその断片に融合された、ＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００１２】
別の態様において、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００１３】
発明の詳細な説明
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【００１４】
本明細書に提供される本発明の結果は、本発明の組成物の投与が腫瘍細胞を認識して殺傷する抗原特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の形成を誘導し、それにより腫瘍細胞の成長を停止させて腫瘍細胞を萎縮させ、そして結果の癌を治療するための有用性を有することを証明する（本明細書中の実施例）。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片、約１５０から約４２０アミノ酸の長さを有するＨｅｒ−２蛋白質の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたか又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片を含む組換えポリペプチドを提供する。一つの態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ３０３−５０１からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ４７９−６５５からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ６９０−１０８１からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ１０２０−１２５５からなる。別の態様において、当該断片は、以下に記載されるＨｅｒ−２断片の何れかからなる。各可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００１７】
一つの態様において、本発明の方法と組成物のＨｅｒ−２蛋白質は、ヒトＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、マウスＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はラットＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は霊長類のＨｅｒ―２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は当業界公知のあらゆるその他の動物種のＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はＨｅｒ−２蛋白質のバリアントである。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はＨｅｒ−２蛋白質のホモログである。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【００１８】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、配列：
【００１９】
【化１】
【００２０】
（配列番号：４０）を有するラットＨｅｒ−２蛋白質である。配列番号：４０は実施例１において断片を創製するために使用した。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は配列番号：４１により示される核酸配列によりコードされる。
【００２１】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、配列：
【００２２】
【化２】
【００２３】
（配列番号：４３）を有するヒトＨｅｒ−２蛋白質である。配列番号：４３は実施例１０において断片を創製するために使用した。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は配列番号：４４により示される核酸配列によりコードされる。
【００２４】
他の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００４４４８又はＮＭ＿００１００５８６２に示された配列を有する。これらのＨｅｒ−２蛋白質は、それぞれＡＡ６５３−６７５及び６２３−６４５にまたがる膜貫通（ＴＭ）領域を有する。配列番号：４３に示されたヒトＨｅｒ−２蛋白質は６５３−６７６にまたがるＴＭ領域を有する。即ち、別の態様において、これらのような配列番号：４０のバリエーションからの本発明のものに対応するＨｅｒ−２断片の生成は、以下に記載されるように、断片を規定する残基の数の調節を必要とする。
【００２５】
他の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、又は「ｃＮｅｕ」と呼ばれる蛋白質である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２６】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２の断片は、おおよそアミノ酸（ＡＡ）２０−３２６からなる（実施例１のＥＣ１；配列番号：３５）。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ３０３−５０１（ＥＣ２；配列番号：３６）からなる。当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ４７９−６５５（ＥＣ３；配列番号：３７）からなる。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ６９０−１０８１（ＩＣ１；配列番号：３８）からなる。別の態様において、当該断片は、おおよそＡＡ１０２０−１２５５（ＩＣ２；配列番号：３９）からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２７】
上で掲載されたＡＡ数と範囲はラットのＨｅｒ−２配列に基づき、ＴＭドメインは残基６５６−６８９にまたがる。別の態様において、他のＨｅｒ−２蛋白質（例えば、他の種由来のＨｅｒ−２蛋白質）の対応する領域は、他のＨｅｒ−２蛋白質のＴＭドメインと並べて、ＡＡ範囲を調節することにより決定される。例えば、ヒトＨｅｒ−２転写物バリアント２、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００１００５８６２に関しては、ＴＭ領域はＡＡ６２３−６４５にまたがる。即ち、この態様において、ＥＣ３に対応するこの蛋白質の領域は、おおよそＡＡ４４６−６２２であり、ＡＡ数から３３を差し引いてＴＭドメインの細胞外境界内の３３ＡＡの差異を参酌することにより決定された。同様に、ＩＣ１に対応するこの蛋白質の領域は６４６−１０３７であり、ＡＡ数から４４を差し引いてＴＭドメインの細胞外境界内の４４ＡＡの差異を参酌することにより決定された。別の態様において、他のＨｅｒ−２蛋白質の対応する領域は当該蛋白質のエンドとのアラインメントにより決定される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２８】
別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞外ドメインの断片である。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞外ドメインの約３分の１から半分からなる。別の態様において、当該断片は、そのおおよそ１０分の１から５分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その５分の１から４分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その約４分の１から３分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その３分の１から半分からなる。当該断片はその半分から４分の３からなる。別の態様において、当該断片は、全部細胞外ドメインに対して約４分の３からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−１０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−１５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−１５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６５−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６５−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−８５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７５−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８０−９５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８５−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−１００％からなる。
【００２９】
別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１２％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１８％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約２０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約２５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約３０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約３５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約４０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約４５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約７０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約７５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約９０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約９５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１００％からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３０】
別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞内ドメインの断片である。一つの態様において、当該断片は細胞内ドメインの約３分の１から半分である。別の態様において、細胞内ドメインの断片は細胞外ドメインに関して上で掲載された量、フラクション、又は範囲の何れかである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３１】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２蛋白質の断片は、そのシグナル配列を含まない。一つの態様において、シグナル配列の削除は、シグナル配列の高い疎水性のために、Ｈｅｒ−２断片がリステリアにおいて首尾よく発現されることを可能にさせる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３２】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２蛋白質の断片は、そのＴＭ配列を含まない。一つの態様において、ＴＭ配列の削除は、ＴＭ配列の高い疎水性のために、Ｈｅｒ−２断片がリステリアにおいて首尾よく発現されることを可能にさせる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３３】
「含まない」は、一つの態様において、限定ではないが、１より多いアミノ酸（ＡＡ）のシグナル配列又はＴＭドメインを意味する。別の態様において、当該用語は、２より多いＡＡを含まないことを意味する。他の態様において、当該用語は、上記配列の３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０より多いＡＡを含まないことを意味する。別の態様において、配列不在が包含される。別の態様において、ほとんどの配列が包含されない。他の態様において、上記配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０のＡＡが包含されない。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３４】
本発明の方法及び組成物において利用されるＬＬＯは、一つの態様において、リステリアのＬＬＯである。一つの態様において、ＬＬＯが由来するリステリアは、リステリアモノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の態様において、リステリアはリステリアイバノビイである。他の態様において、リステリアはリステリアウエルシメリ（ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の態様において、リステリアはリステリアシーリゲリ（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、非リステリアＬＬＯ蛋白質である。
【００３５】
別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列：
【００３６】
【化３】
【００３７】
（ジェンバンク受け入れ番号Ｐ１３１２８；配列番号：３４；核酸配列はジェンバンク受け入れ番号Ｘ１５１２７に示される；配列番号：３３）を有する。この配列に対応するプロ蛋白質の最初の２５アミノ酸はシグナル配列であって、細菌から分泌される場合にＬＬＯから分割される。即ち、一つの態様において、完全長の活性なＬＬＯ蛋白質は５０４残基の長さである。他の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ジェンバンク受け入れ番号ＤＱ０５４５８８，ＤＱ０５４５８９，ＡＹ８７８６４９，Ｕ２５４５２，又はＵ２５４５２に示される配列を有する。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ＬＬＯ蛋白質のバリアントである。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ＬＬＯ蛋白質のホモログである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３８】
別の態様において、「末端削除されたＬＬＯ」又は「△ＬＬＯ」は、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を意味する。別の態様において、当該用語は、アミノ末端に活性化ドメインを含まず且つシステイン４８４を含まないＬＬＯ断片を意味する。別の態様において、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列を含む。別の態様において、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯ蛋白質のおおよそ最初の４４１アミノ酸からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯ蛋白質の非溶血形態である。
【００３９】
一つの態様において、上で言及されたＰＥＳＴ様ドメインは、配列番号：４２に示される配列を有する。別の態様において、ＰＥＳＴ様ドメインは、当業界公知のあらゆる他のＰＥＳＴ様ドメインである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４０】
別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１１７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−４００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−４２５からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。別の態様において、本発明は、上記ヌクレオチド核酸を含むワクチンを提供する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むベクターを提供する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のリステリアの組換え形態を含むワクチンを提供する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本発明のリステリアの組換え形態の培養物を提供する。
別の態様において、本発明の方法及び組成物のリステリアは、ＬＭである。別の態様において、リステリアはリステリアイバノビイである。他の態様において、リステリアはリステリアウエルシメリ（ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の態様において、リステリアはリステリアシーリゲリ（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態を提供する。
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供するが、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【００４７】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物の融合蛋白質は、ＬＬＯからのＬＬＯシグナル配列を含む。別の態様において、当該蛋白質の２つの分子（ＬＬＯ断片と抗原）は直接連結される。別の態様において、当該２つの分子は、一つ又はそれより多いアミノ酸からなる短いスペーサーペプチドにより連結される。一つの態様において、スペーサーは、蛋白質と連結するか又はいくらかの最小距離を保つか又はそれらの間の他の空間的関係を保つ以外に生物学上の活性を有さない。
【００４８】
別の態様において、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のいくつかの特性、例えば、フォールディング、正味の荷電、又は疎水性に影響しないように選択される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４９】
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供するが、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【００５０】
一つの態様において、本発明の組換えポリペプチド又は組換えポリヌクレオチドを投与する工程は、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される。別の態様において、投与することは、別の細菌ベクターにより実施される。別の態様において、投与することは、ウイルスベクターにより実施される。別の態様において、投与することは、ＤＮＡワクチン（例えば、はだかのＤＮＡワクチン）により実施される。別の態様において、本発明の組換えポリペプチドの投与は、蛋白質を組換え生産し、次に組換え蛋白質を被験者に投与することにより実施される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００５１】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答から主としてなる。別の態様において、免疫応答の唯一の検出可能な成分はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答である。
【００５２】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答から主としてなる。別の態様において、免疫応答の唯一の検出可能な成分はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答である。別の態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答により達せられる。別の態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答により達せられない。
【００５３】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、抗原の準顕性エピトープに対する免疫応答を含む。別の態様において、当該免疫応答性は、準顕性エピトープに対する免疫応答を含まない。別の態様において、当該免疫応答性は、準顕性エピトープに対する免疫応答から主としてなる。別の態様において、当該免疫応答性の唯一の測定可能な成分は、準顕性エピトープに対する免疫応答である。
【００５４】
免疫応答性の各種は、本発明の別々の態様を表す。
免疫応答性を測定する方法は、当業界でよく知られており、例えば、腫瘍の成長の抑圧を測定すること（本明細書中の実施例２、５、８、及び９）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ；実施例３）、標的細胞溶解アッセイ（例えば、クロミウム放出アッセイ；実施例４及び６）、テトラマーの使用、及びその他を含む。各方法は、本発明の別々の態様を表す。
【００５５】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５７】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００５８】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００６０】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それによりＨｅｒ−２発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６１】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する方法を提供するが、ＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片をコードするヌクレオチドを、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片をコードするヌクレオチドに融合させることにより組換えヌクレオチドを創製し、それによりＨｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する工程を含む。
【００６２】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する方法は、さらに、組換えヌクレオチドを発現するようにリステリア株を操作することを含む。別の態様において、別の細菌ベクターを用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、ウイルスベクターを用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、ＤＮＡワクチン（例えば、はだかのＤＮＡワクチン）を用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、当該ヌクレオチドによりコードされるＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ペプチドの投与は、蛋白質を組換えにより生産して、次に、組換え蛋白質を被験者に投与することにより実施される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００６３】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性は、断片中に存在するＨｅｒ−２蛋白質のエピトープに対しての第１の免疫応答及び断片中に存在しないＨｅｒ−２蛋白質のエピトープに対する第２の免疫応答を含み、以下に詳細にされる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該ポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、上記抗原は一つ又はそれより多い顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６５】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原の断片をコードし、上記抗原は一つ又はそれより多い顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６６】
別の態様において、本発明は、抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供し、（ａ）当該抗原をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片に融合させ、それによりＬＬＯ−抗原融合蛋白質の組換えヌクレオチドを創製し；（ｂ）ＬＬＯ−抗原融合物を被験者に投与し；（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を被験者から単離し；（ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるエピトープを決定し；それにより抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定する工程を含む。
【００６７】
「顕性（ｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一つの態様において、予防接種、感染、又は悪性腫瘍成長により、蛋白質又は病原体又は上記蛋白質を含む癌細胞により誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９６％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９７％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９８％より多くに認識されるエピトープを意味する。
【００６８】
「準顕性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一つの態様において、予防接種、感染、又は悪性腫瘍成長により、蛋白質又は病原体又は上記蛋白質を含む癌細胞により誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．５％未満に認識されるエピトープを意味する。
【００６９】
別の態様において、「顕性エピトープ」は、一つの態様において、予防接種の他の方法により現れない（ｎｏｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ）エピトープを意味する。例えば、Ｅｒｃｏｌｉｎｉら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３，１７０：４２７３−４２８０）は、ＧＭ−ＣＳＦをトランスフェクトされたｎｅｕ発現腫瘍細胞とＨｅｒ−２を発現する組換えワクシニアの両方を被験者に予防接種したが、単一の顕性エピトープＡＡ４２０−４２９しか発見しなかった。対照的に、本明細書に記載された実験における△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物の使用は、ＡＡ４２０−４２９に加えて追加のエピトープを明らかにした。融合物の組換えＬＭによるデリバリーは、さらに多数のエピトープを明らかにする。
【００７０】
別の態様において、顕性エピトープ又は準顕性エピトープは、処置された被験者において、それぞれ顕性又は準顕性である。別の態様において、顕性エピトープ又は準顕性エピトープは、処置された集団において、それぞれ顕性又は準顕性である。
【００７１】
顕性エピトープ及び準顕性エピトープの各タイプは、本発明の別々の態様を表す。
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供するが、但し、当該抗原は被験者の非腫瘍細胞において検出可能なレベルで発現されるものであり、被験者に対して、抗原に融合させたか又はその断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与することを含み、その際、被験者が抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００７２】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供するが、但し、当該抗原は被験者の非腫瘍細胞において検出可能なレベルで発現されるものであり、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与することを含むが、但し、当該組換えヌクレオチドは上記抗原をコードするものであり、その際、被験者が抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００７３】
「検出可能なレベル」は、一つの態様において、標準アッセイにより検出可能なレベルを意味する。一つの態様において、当該アッセイは免疫アッセイである。一つの態様において、当該アッセイはエンザイムリンクトイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。別の態様において、当該アッセイはウエスタンブロットである（実施例１）。別の態様において、当該アッセイは、ＦＡＣＳである（実施例３）。別の態様において、検出可能なレベルは、特定のアッセイのバックグラウンドレベルに関して決定される。これらの技術の各々を実施する方法は当業者によく知られており、各々の技術は本発明の別々の態様を表す。
【００７４】
本発明の方法及び組成物における抗原は、一つの態様において、被験者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の態様において、当該抗原は、被験者の少なくとも特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、又は５％）の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。一つの態様において、「非腫瘍細胞」は、腫瘍の本体の外の細胞を意味する。別の態様において、「非腫瘍細胞」は非悪性腫瘍細胞を意味する。別の態様において、「非腫瘍細胞」は、非形質転換細胞を意味する。別の態様において、非腫瘍細胞は体細胞である。別の態様において、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００７５】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法を提供するが、（ａ）当該抗原又はその断片をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片に融合させ、それによりＬＬＯ−抗原融合蛋白質をコードする組換えヌクレオチドを創製し；そして（ｂ）組換えヌクレオチド又はＬＬＯ−抗原融合物を被験者に投与し；それにより被験者において抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する工程を含む。
【００７６】
別の態様において、本発明は、腫瘍又は感染因子上で抗原を発現する動物において、抗原の第１エピトープに対する免疫応答性を誘導する方法を提供し、当該動物に、上記抗原の断片を発現する組換えリステリアを予防接種することにより誘導するが、その際、予防接種に用いられた断片は上記第１のエピトープを含まない。むしろ、当該断片は、動物が免疫応答性をマウントするのと同じ抗原の第２のエピトープを含む。腫瘍又は感染因子に対する継続する免疫応答性は、本明細書にて示されるとおり、エピトープスプレディング（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）により第１のエピトープの認識をもたらす。
【００７７】
別の態様において、本発明は、腫瘍又は感染因子上で抗原を発現する動物において、抗原の第１エピトープに対する免疫応答性を誘導する方法を提供し、当該動物に、上記抗原の断片に融合させたＬＬＯを含むワクチンを予防接種することにより誘導するが、その際、予防接種に用いられた断片は上記第１のエピトープを含まない。むしろ、当該断片は、動物が免疫応答性をマウントするのと同じ抗原の第２のエピトープを含む。腫瘍又は感染因子に対する継続する免疫応答性は、本明細書にて示されるとおり、エピトープスプレディングにより第１のエピトープの認識をもたらす。
【００７８】
一つの態様において、第１のエピトープに対する免疫応答性は、投与の工程の少なくとも２週後に開始される。別の態様において、第１のエピトープに対する免疫応答性は、投与の工程の終結の少なくとも２週後に開始される。別の態様において、タイムフレームは１週間である。別の態様において、タイムフレームは１０日である。別の態様において、タイムフレームは１７日である。別の態様において、タイムフレームは３週間である。別の態様において、タイムフレームは４週間である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００７９】
本明細書にて提供されるとおり、本発明の結果は、さらに、組換え抗原発現ＬＭの予防接種がエピトープスプレディングを誘導することを証明する。別の態様において、ＬＭのコンテクストの外部でさえＬＬＯ−抗原融合による予防接種はエピトープスプレディングをいっそう誘導する。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００８０】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与することを含むが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者は抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する。
【００８１】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与することを含むが、当該組換えヌクレオチドは抗原の断片をコードし、但し、当該抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者は抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する。
【００８２】
別の態様において、本発明の方法の抗原は、Ｈｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、抗原はＨＰＶ−１６ Ｅ７蛋白質である。別の態様において、抗原はｂｃｒ／ａｂｌである。別の態様において、抗原はＭＺ２−Ｅである。別の態様において、抗原はＭＡＧＥ−１である。別の態様において、抗原はＭＵＣ−１である。別の態様において、抗原はＮＹ／ＥＳＯ−１である。別の態様において、抗原はウイルムス腫瘍抗原である。別の態様において、抗原はテロメラーゼである。別の態様において、抗原はプロテイナーゼ３である。別の態様において、抗原はチロシナーゼ関連蛋白質２である。別の態様において、抗原はＨＩＶ−１ Ｇａｇ蛋白質である。別の態様において、抗原はＳＩＶ−１ Ｇａｇ蛋白質である。別の態様において、抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ蛋白質である。別の態様において、抗原は当業界公知のあらゆるその他の腫瘍抗原である。別の態様において、抗原は当業界公知のあらゆる他の感染性疾患抗原である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００８３】
他の態様において、抗原は腫瘍又は感染性生物に由来し、限定ではないが、真菌病原体、細菌、寄生虫、ウイルス等を含む。他の態様において、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０，ＨＩＶ ｇａｇ蛋白質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ，スポンゴスポラサテラネア（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）抗原、ビブリオース抗原、サルモネラ抗原、ニューモコッカス抗原、レスピラトリーシンチアルウイルス抗原、ヘモフィルスインフルエンザ外膜蛋白質、ヘリコバクターピロリウレアーゼ、ナイセリアメニンギティディスのピリン（ｐｉｌｉｎｓ）、ナイセリアゴノロエのピリン、メラノーマ関連抗原（ＴＲＰ−２，ＭＡＧＥ−１，ＭＡＧＥ−３，ｇｐ−１００，チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１，ＨＳＰ−７０，ベータ−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６，−１８，−３１，−３３，−３５又は−４５ヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１及びＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、ｒａｓ蛋白質、変異したか又はその他、ｐ５３蛋白質、変異したか又はその他、ＭｕｃＩ，又はｐＳＡを含む。
【００８４】
他の態様において、抗原は、以下の疾患の一つに関連する抗原である：コレラ、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、はしか、髄膜炎、おたふくかぜ、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、天然痘、肺炎双球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、チフス、水痘帯状疱疹、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ）３黄熱病、アジソン病からの免疫原及び抗原、アレルギー、ハシモト甲状腺炎、多発性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植拒絶、例えば、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、及び肝臓移植物、グレブス病、内分泌性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体−媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、血清反応陰性脊椎炎、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化症性胆管炎、ウエゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギランバレー症候群、重症性筋無力症、ランバート−イートン症候群、鞏膜、上鞏膜、ブドウ膜炎、慢性皮膚粘膜カンジダ症、蕁麻疹、幼少期の一過性低グロブリン血症、ミエローマ、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウイスコット−アルドリッチ症候群、失調症性毛細管拡張症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、自己免疫溶血性貧血症、自己免疫血小板減少症、自己免疫好中球減少症、ワルデンシュトーム型マクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ球白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリア周種虫（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）蛋白質、細菌抗原、ウイルス抗原、自己抗原、及びリステリア症。
【００８５】
他の態様において、抗原は以下の腫瘍抗原のうちの一つである：ＭＡＧＥ（メラノーマ−関連抗原Ｅ）蛋白質、例えば、ＭＡＧＥ１，ＭＡＧＥ２，ＭＡＧＥ３，ＭＡＧＥ４，チロシナーゼ；変異ｒａｓ蛋白質；変異ｐ５３蛋白質；ｐ９７メラノーマ抗原、進行した癌に付随するｒａｓペプチド又はｐ５３ペプチド；頸部癌に付随するＨＰＶ １６／１８抗原、乳癌に付随するＫＬＨ抗原、結腸直腸癌に付随するＣＥＡ（癌胚抗原）、ｇｐ１００，メラノーマに付随するＭＡＲＴ１抗原、又は前立腺癌に付随するＰＳＡ。
【００８６】
当業者は、上記抗原の何れもがＬＬＯ断片に融合できることを理解する。上記抗原の各々は、本発明の別々の態様を表す。
別の態様において、本発明は、宿主において腫瘍の形成を抑圧する方法を提供するが、宿主に対して、本発明の組成物を投与し、それにより宿主において腫瘍の形成を抑圧することを含む。
【００８７】
別の態様において、本発明は、癌を有する被験者において腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供するが、本発明の組成物を投与し、それにより癌を有する被験者において腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の形成を誘導することを含む。
【００８８】
別の態様において、本発明は、癌を有する被験者において細胞障害性Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供するが、本発明の組成物を投与し、それにより癌を有する被験者において細胞障害性Ｔ細胞の形成を誘導することを含む。
【００８９】
別の態様において、本発明は、癌の影響を減少させる方法を提供するが、本発明の組成物を投与することを含む。別の態様において、本発明は、癌を改善する方法を提供するが、本発明の組成物を投与することを含む。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９０】
本発明の方法の一つの態様において、上記組成物は、エクスビボにおいて被験者の細胞に投与され、別の態様において、組成物はエクスビボにおいてドナーの細胞に投与され、別の態様において、インビボにおいてドナーの細胞に投与され、次に、被験者に移される。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９１】
一つの態様において、本発明の方法により処置される癌は乳癌である。別の態様において、癌はメラノーマである。別の態様において、癌は膵臓癌である。別の態様において、癌は卵巣癌である。別の態様において、癌は胃癌である。別の態様において、癌は膵臓の癌腫症病変、別の態様において、癌は肺アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は結腸直腸アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は肺の偏平上皮アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は胃のアデノカルシノーマである。別の態様において、癌は卵巣表面の上皮腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）（例えば、良性腫瘍、その増殖性又は悪性バラエティ）である。別の態様において、癌は口腔の偏平上皮細胞のカルシノーマである。別の態様において、癌は非小細胞肺カルシノーマである。別の態様において、癌は子宮内膜カルシノーマである。別の態様において、癌は膀胱癌である。別の態様において、癌は頭部及び頸部の癌である。別の態様において、癌は前立腺カルシノーマである。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９２】
本発明の方法の別の態様において、被験者が抗原発現腫瘍又は標的抗原に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗腫瘍効果を媒介する。
別の態様において、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物を提供し、当該組成物は末端削除されたＬＬＯのＨｅｒ−２蛋白質への融合物を含む。別の態様において、当該免疫原性組成物は、さらに、融合物を発現するリステリア株を含む。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９３】
別の態様において、本発明は癌を治療するための免疫原組成物を提供し、当該組成物はＨｅｒ−２蛋白質を発現するリステリア株を含む。
一つの態様において、本発明の治療プロトコルは治療用である。別の態様において、プロトコルは予防用である。別の態様において、家族の遺伝又は特定の種類の癌にかかりやすい他の環境、例えば、その夫がパピローマウイルスを有する女性において頸部癌にかかりやすい他の環境ゆえに、癌の危険のある人を保護するために、本発明のワクチンを用いる。別の態様において、外科手術、慣用の化学治療又は放射線治療による腫瘍成長の脱巨大化（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）の後に、上記ワクチンを癌免疫治療として用いる。そのような治療の後に、本発明のワクチンを投与することにより、当該ワクチンの腫瘍抗原のＣＴＬ応答が残存する転移を撲滅して、癌からの緩解を長くする。別の態様において、本発明のワクチンを用いて、以前に確立された腫瘍の成長を変化させて（ｅｆｆｅｃｔ）、存在する腫瘍細胞を殺傷する。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９４】
別の態様において、上記の方法の何れかにおいて利用可能なワクチン及び免疫原組成物は、本発明のワクチン及び免疫原組成物の特徴の何れかを有する。各特徴は本発明の別の態様を表す。
【００９５】
用量の範囲の様々な態様は、この発明により意図される。一つの態様において、ワクチンベクターの場合、用量は０．００１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００６ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００８ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０６ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０８ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．１５ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．２５ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．５ ＬＤ５０／用量である。
【００９６】
別の態様において、用量が１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が４ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が４ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０１１細菌／用量である。各特徴は本発明の別の態様を表す。
【００９７】
別の態様において、組換えポリペプチドの場合、用量が１ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１．５ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１５ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１５０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１０００ｍｇ／用量である。
【００９８】
上記の用量の各々は本発明の別の態様を表す。
一つの態様において、本発明のワクチン又は免疫原組成物は、単独で被験者に投与される。別の態様において、ワクチン又は免疫原組成物を別の癌治療剤と共に投与する。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９９】
本発明の方法及び組成物の組換えリステリアは、一つの態様において、抗原又はＬＬＯ−抗原融合物をコードする構築物により安定に形質転換される。一つの態様において、当該構築物は、さらなるクローニングを促進させるためにポリリンカーを含む。組換えリステリアを生産するためのいくつかの技術は公知である。
【０１００】
一つの態様において、当該構築物又は異種遺伝子は、相同組換えを用いてリステリアの染色体に挿入される。相同組換えの技術は当業界でよく知られており、例えば、Ｂａｌｏｇｕ Ｓ，Ｂｏｙｌｅ ＳＭ，ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｐａｒｔｉａｌ ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ ｏｒ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｌ７／Ｌ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５，１０９（１−２）：１−７；及びＪｉａｎｇ ＬＬ，Ｓｏｎｇ ＨＨ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５，３７（１）：１９−２４の何れかに記載される。別の態様において、相同組換えは米国特許番号６，８５５，３２０に記載されたとおりに実施される。この場合、Ｅ７を発現する組換えＬＭ株を、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによりｈｌｙプロモーターの制御下で、且つｈｌｙシグナル配列の封入を伴って作成することにより、遺伝子産物の分泌を保証し、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と命名された組換え体を生じさせた。別の態様において、温度感受性プラスミドを用いて組換え体を選択する。各技術は本発明の別々の態様を表す。
【０１０１】
別の態様において、構築物又は異種遺伝子を、リステリアの染色体へトランスポゾン挿入を用いて挿入する。トランスポゾン挿入の技術は当業界でよく知られており、とりわけ、Ｓｕｎら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９０，５８：３７７０−３７７８）によるＤＰ−Ｌ９６７の構築において記載されている。トランスポゾンの変異導入は有利であり、別の態様において、安定なゲノミック挿入変異体が形成できるが、外来遺伝子が挿入されたゲノム内の位置が分からないのが不都合である。
【０１０２】
別の態様において、構築物又は異種遺伝子をリステリアの染色体へ、ファージ組み込み部位を用いて挿入する（Ｌａｕｅｒ Ｐ，Ｃｈｏｗ ＮＹ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法の特定の態様において、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３又はＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子と付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）部位を用いて異種遺伝子を対応する付着部位へ挿入するが、ゲノム中の如何なる適切な位置でもよい（例えば、ａｒｇ ｔＲＮＡ遺伝子のｃｏｍＫ又は３’エンド）。別の態様において、内生プロファージを、構築物又は異種遺伝子の組み込みの前に利用された付着部位から救済する（ｃｕｒｅｄ）。別の態様において、この方法は単コピーの組み込み物をもたらす。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【０１０３】
別の態様において、上記構築物は、リステリア株によりプラスミドに運ばれる。ｐｒｆＡ（−）リステリアを相補するために、遺伝子をｐｒｆＡ−含有ベクターへクローニングすることとこのプラスミドを使用することが、ＤＰ−Ｌ２０２８を構築するのに使用された。ＤＰ−Ｌ２０２８は腫瘍防御実験において使用されたインフルエンザＮＰ発現株である。Ｅ７融合蛋白質を発現するＬＭベクターも、この技術により構築された。Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７は、米国特許番号６，５６５，８５２に記載されるとおり、ｐｒｆＡ−欠失変異体を、ｐｒｆＡ遺伝子のコピーと、酵素の溶血活性を排除するために末端削除されたＬＬＯ（ｈｌｙ）遺伝子の形態に融合されたＥ７Ａ遺伝子のコピーを含むプラスミドにより捕捉することにより作成した。機能性ＬＬＯは、ｈｌｙの内生染色体コピーにより、生物中で保持される。
【０１０４】
他の態様において、いくつかのアプローチの一つを採用してリステリア内で腫瘍抗原を発現させる。一つの態様において、選択された腫瘍抗原とリステリア蛋白質、例えばＰＩ−ＰＬＣの融合蛋白質、又はそれをコードする構築物を生成する。別の態様において、分泌されたリステリア蛋白質、例えばヘモリジン又はホスホリパーゼのシグナル配列を抗原コード遺伝子に融合させる。
【０１０５】
別の態様において、上記構築物をエピソームの様式でリステリア株に含ませる。別の態様において、外来遺伝子を組換えリステリア株により運ばれるベクターから発現させる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０６】
他の態様において、様々なプロモーターの一つを用いて、抗原又は同じものを含む融合蛋白質を発現させる。一つの態様において、ＬＭプロモーターを用いるが、例えば、遺伝子ｈｌｙ，ａｃｔａ，ｐｉｃａ，ｐｌｃＢ及びｍｐｌのプロモーターであり、それぞれ、リステリア蛋白質ヘモリジン、ａｃｔ Ａ，ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、及びメタロプロテアーゼをコードする。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０７】
抗原のパネルは、一つの態様において、腫瘍の抗原損失バリアントが免疫系の圧迫下で芽生え得るという事実を補償するための癌に対する免疫治療において有用である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８ ４：２６６９；Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ ５９：１）。即ち、別の態様において、本発明の方法及び組成物は、組換え融合蛋白質のカクテルを含み、各融合蛋白質は、末端削除されたＬＬＯに融合された異なる腫瘍関連抗原を含むか、又は組換えＬＭ株のカクテル各々が異なる腫瘍関連抗原を発現する。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０８】
別の態様において、本発明の方法及び組成物は、本発明のＨｅｒ−２又はＬＬＯ配列の相同体を利用する（例えば、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４）。用語「相同性」、「相同」等は、蛋白質又はペプチドに関して使用されるとき、一つの態様において、もし必要なら最大パーセント相同性を達成するために、配列を並べて（ａｌｉｇｎｉｎｇ）ギャップを導入した後に、そして配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考えずに、対応する天然ペプチドの残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。アラインメントのための方法とコンピュータープログラムは、当業界でよく知られている。
【０１０９】
別の態様において、用語「相同」は、あらゆる核酸に対して言及されるとき、同様に、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一の候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１１０】
相同性は、一つの態様において、配列アラインメントのコンピューター計算式、当業界でよく知られている方法により決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューター計算式分析は、如何なる数の利用可能なソフトウエアパッケージの利用を含んでもよく、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＤＯＭＡＩＮ，ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ），ＧＥＮＰＥＰＴ及びＴＲＥＭＢＬパッケージである。
【０１１１】
別の態様において、「相同性」は、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４から選択される配列に対して７０％を超える同一性を意味する。別の態様において、「相同性」は、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４から選択される配列に対して７２％を超える同一性を意味する。別の態様において、相同性は７５％を超える。別の態様において、相同性は７８％を超える。別の態様において、相同性は８０％を超える。別の態様において、相同性は８２％を超える。別の態様において、相同性は８３％を超える。別の態様において、相同性は８５％を超える。別の態様において、相同性は８７％を超える。別の態様において、相同性は８８％を超える。別の態様において、相同性は９０％を超える。別の態様において、相同性は９２％を超える。別の態様において、相同性は９３％を超える。別の態様において、相同性は９５％を超える。別の態様において、相同性は９６％を超える。別の態様において、相同性は９７％を超える。別の態様において、相同性は９８％を超える。別の態様において、相同性は９９％を超える。別の態様において、相同性は１００％である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１２】
別の態様において、相同性は、候補配列のハイブリダイゼーションの測定、当業界でよく記述された方法（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編纂（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，）Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ参照）による。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、中程度からストリンジェントな条件下で、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補体に対して実施してよい。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、４２℃において１０−２０％ホルムアルデヒド、５Ｘ ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６），５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性専断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションである。
【０１１３】
本発明の一つの態様において、「核酸」は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの糸を意味する。当該用語は、一つの態様において、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、一つの態様において、核酸ポリマーのモノマーユニットを意味する。ＲＮＡは、一つの態様において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡの使用は、記載された（Ｃａｕｄｙ ＡＡ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ １６：２４９１−９６及びそれに引用された文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡ又はこれらの群の誘導体の形態であってよい。さらに、ＤＮＡ及びＲＮＡのこれらの形態は、一本鎖、二重鎖、三重鎖又は四重であってよい。当該用語は、別の態様において、他の種類のバックボーンを含むかもしれないが同じ塩基を含む人工核酸も含む。一つの態様において、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチドバックボーンと核酸塩基を含み、一つの態様において、ＤＮＡとＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の態様において、ヌクレオチドが修飾されたオキセタン（ｏｘｅｔａｎｅ）である。別の態様において、一つ又はそれより多くのホスホジエステルのホスホロチオエート結合による置換によりヌクレオチドが修飾される。別の態様において、人工核酸は、当業界で知られた天然核酸のリン酸バックボーンのあらゆるその他のバリアントを含む。ホスホロチオエート核酸及びＰＮＡの使用は当業界でよく知られており、例えばＮｅｉｌｓｅｎ ＰＥ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：３５３−５７；及びＲａｚ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載されている。核酸の生産と使用は当業者にはよく知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，編纂、及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ ａｎｄ Ｇ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載されている。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１４】
本明細書に掲載されたあらゆるアミノ酸の蛋白質及び／又はペプチドの相同性は、一つの態様において、当業界で良く知られた方法により決定され、イムノブロット分析、又はアミノ酸配列のコンピューター計算式による分析、利用可能な多数のソフトウエアパッケージを利用すること、確立された方法によることを含む。これらのパッケージのいくつかは、ＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴ，ＭＰｓｒｃｈ又はスキャンプスパッケージを含んでよく、そしてスミスアンドウオーターマン計算式、及び／又はグローバル／ローカル又はＢＬＯＣＫＳアラインメントの分析のための使用を例えば含んでよい。相同性を決定するための各方法は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するのに利用される試薬を含むキットを提供する。別の態様において、本発明は、本発明の組成物、ツール、又は装置を含むキットを提供する。
【０１１６】
用語「接触させる」又は「投与する」は、癌細胞又は腫瘍を本発明の組成物に直接接触させることを意味する。別の態様において、当該用語は、癌細胞又は腫瘍を本発明の組成物に間接に接触させることを意味する。別の態様において、本発明の方法は、被験者に本発明の組成物を接触させ、その後組成物が拡散によるか又は化合物が体内を循環することが当業界にて知られている他の任意の活性輸送体又は受動的輸送プロセスにより癌細胞又は腫瘍と接触する、方法を含む。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１７】
薬学組成物
本発明のワクチン及び組成物を含む薬学組成物は、別の態様において、当業者によく知られたあらゆる方法により被験者に投与することができ、例えば、非経口、癌近辺（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、経筋肉、静脈内、皮内（ｉｎｔｒａ−ｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹膜内、心室内、頭蓋内、膣内、又は腫瘍内（ｔｕｍｏｒａｌｌｙ）である。
【０１１８】
本発明の方法及び組成物の別の態様において、ワクチン又は組成物を経口投与し、そして即ち、経口投与に適した形態、即ち、固形又は流体調製物にて製剤化される。適切な固形経口製剤は、タブレット、カプセル、ピル、顆粒、ペレット等を含む。適切な流体経口製剤は、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイル等を含む。本発明の別の態様において、活性成分をカプセル内に製剤化する。この態様によれば、本発明の組成物は、活性化合物及び不活性担体又は希釈剤に加えて、ハードゼラチン化合カプセルを含む。
【０１１９】
別の態様において、ワクチン又は組成物を、流体調製物の静脈内、動脈内、又は筋肉内注射により投与する。適切な流体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイル等を含む。一つの態様において、薬学組成物は静脈内投与され、即ち、静脈内投与に適した形態にて製剤化される。別の態様において、薬学組成物は動脈内投与され、即ち、動脈内投与に適した形態で製剤化される。別の態様において、薬学組成物は筋肉内投与され、即ち、筋肉内投与に適した形態で製剤化される。
【０１２０】
一つの態様において、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患を直すことを意味する。別の態様において、「治療する」は、疾患を予防することを意味する。別の態様において、「治療する」は疾患の発病率を減少させることを意味する。別の態様において、「治療する」は疾患の兆候を改善することを意味する。別の態様において、「兆候」は疾患の進行を遅延させることを意味する。用語「減少させる」、「抑圧する」及び「阻害する」は、別の態様において、減らすこと（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）又は低下させること（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）を意味する。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１２１】
実験の詳細のセクション
実施例１
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌する
リステリアモノサイトゲネス株の生成
材料と実験方法
サブクローニング
実施例において使用されたリステリアＨｅｒ−２構築物のバックボーンｐＧＧ−５５をｐＡＭ４０１から創製した。グラム＋及びグラム−細菌の両方において複製できるシャトルベクターであるｐＡＭ４０１は、グラム＋クロラムフェニコール耐性遺伝子とグラム−テトラサイクリン耐性遺伝子を含む（Ｗｉｒｔｈ，Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６５：８３１，１９８６）。ｐＧＧ−５５を生産するため、ｈｌｙ−ＨＰＶ １６ Ｅ７融合遺伝子（ｈｌｙプロモーターとＬＬＯの最初の４４１アミノ酸をコードするｈｌｙの一部を含み、「△ＬＬＯ」と命名された）と、多能性転写因子ｐｒｆＡ（リステリオリジン発現の陽性制御因子）遺伝子をｐＡＭ４０１にクローン化した（図１）。
【０１２２】
リステリアモノサイトゲネス（ＬＭ）株、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１，及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２は、各々、リステリアｈｌｙ遺伝子に融合されたラットのＨｅｒ−２の断片を発現するプラスミドを含む。Ｈｅｒ−２の細胞外及び細胞内ドメインの以下のオーバーラップ断片を、プラスミドｐＧＧ−５５：塩基対（ｂｐ）７４−９９４，（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１；Ｈｅｒ−２のＡＡ２０−３２６に相当），９２３−１５１９（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２；ＡＡ３０３−５０１に相当），１４５１−１９８１（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３；ＡＡ４７９−６５５に相当），２０８４−３２５９（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１；ＡＡ６９０−１０８１に相当），及び３０７３−３７９６（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２；ＡＡ１０２０−１２５５に相当）にクローン化した。上記断片は図２Ａに描写される。ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３，ＩＣ１，及びＩＣ２のＬＤ５０は、それぞれ、１ｘ１０８，１ｘ１０９，５ｘ１０８，１ｘ１０８，及び１ｘ１０８であった。
【０１２３】
各Ｈｅｒ−２断片をＰＣＲにより完全長のラットＨｅｒ−２遺伝子を含むｐＮＮＡプラスミドから以下のプライマーを用いて増幅した。制限部位（ＥＣ１，ＩＣ１，及びＩＣ２の５’プライマーの場合ＸｈｏＩ；３’プライマーに関してはＳｐｅＩ；そしてＥＣ２とＥＣ３の５’プライマーに関してはＳａｌＩ）には下線が引かれ、そしてＥＣ２とＥＣ３の３’プライマー中のＦＬＡＧのｔａｇ配列をイタリックで示す。
【０１２４】
【化４】
【０１２５】
断片をＰＣＲにより増幅してＰＣＲ２．１発現系（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）にクローン化して、次に、直鎖状化酵素により切り出す。Ｅ７遺伝子をｐＧＧ−５５プライマーからＸｈｏＩとＳｐｅＩを用いて切り出し、次に、Ｈｅｒ−２断片を融合してＥ７部位（ＳａｌＩにより消化したエンドはＸｈｏＩエンドに互換性がある）へ連結した。ＸＦＬ−７はＬＭのｐｆｒＡ陰性株であり（Ｇｕｎｎ ＧＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：６４７，２００１）、エレクトロポレーションによりプライマーをトランスフェクトした。
【０１２６】
細菌
細菌を脳心臓注入培地（ＢＤ，スパークス、ＭＤ）内で５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと共に生育させ、そして１ｍｌアリコートにて−８０℃において凍結させた。
【０１２７】
ウエスタンブロット
△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２発現株を一晩３７℃においてルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のクロラムフェニコールと共に生育させた。上清をＴＣＡ沈殿させて、１Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（インビトロジェン、サンディエゴ、ＣＡ）に懸濁した。１５マイクロリットル（μｌ）の各サンプルを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン、サンディエゴ、ＣＡ）に負荷した。ゲルをインモビロン−Ｐポリビニリデンフルオライド膜（ミリポア、ビレリア、ＭＡ）に転写し、そしてＬＬＯの残基１−３０を認識するポリクローナルウサギ血清によりブロットし、次に、ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギ抗体（アマシャムファルマシアバイオテック、ＵＫ）をブロットした。
【０１２８】
統計分析
統計分析は実施例を通してスチューデントｔテストを用いて実施した。
【０１２９】
結果
リステリアモノサイトゲネスＬＬＯ蛋白質のＮ末端部分に融合させたラットのＨｅｒ−２遺伝子のオーバーラップする断片を発現して分泌する５つの組換えＬＢ株を構築した（図２Ａ）。Ｈｅｒ−２のシグナル配列と膜貫通ドメインは、それらの疎水性と疎水性ドメインを極度に分泌することに関するＬＭの無能性のため、断片には含まれなかった。各Ｈｅｒ−２断片の分泌はウエスタンブロットにより確認された（図２Ｂ）。蛋白質、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１，及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２の分子量は、それぞれ、８３、７０、６８、９２．５、及び７４−ｋＤａ（キロドルトン）であった。上記株は野生型１０１０３Ｓ株に比較して減弱され（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７に匹敵する毒性を呈した；即ち、それぞれ、１ｘ１０８，５ｘ１０８，１ｘ１０９，１ｘ１０８，１ｘ１０８，及び１ｘ１０８コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）であった。
【０１３０】
実施例２
Ｈｅｒ−２発現腫瘍の成長を停止させて逆転させる
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２構築物による予防接種
材料と実験方法
マウス
６週から８週齢のメスのＦＶＢ／Ｎマウスをチャールズリバーラボラトリーズ（ウイルミントン、ＭＡ）から購入した。
【０１３１】
細胞系
ＦＶＢ／Ｎ Ｈｅｒ−２トランスジェニックマウス中の自然発生乳房腫瘍に由来するＦＶＢ／Ｎ同系ＮＴ−２腫瘍細胞系（Ｒｅｉｌｌｙ ＲＴ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ６０：３５６９，２０００）は、低レベルのラットＨｅｒ−２を構成的に発現し、そして野生型の同系マウスにおいて腫瘍形成性である。ＮＴ−２細胞をＲＰＭＩ １６４０培地中で２０％ＦＣＳ，１０．２ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ミリモラー（ｍＭ）Ｌ−グルタミン、１００マイクロモラー（μＭ）非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ（ユニット）／ｍｌペニシリンＧ，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌインスリン、及び２μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に、３７℃において５％ＣＯ２と共に生育させた。
【０１３２】
実験セットアップ
６−８週齢のＦＶＢ／Ｎマウス（ｎ＝８）に、２００μｌのＰＢＳ中の２ｘ１０６ＮＴ−２腫瘍細胞を右脇腹（ｒｉｇｈｔ ｆｌａｎｋ）に皮下注射した。接種の７日後に、４−５ｍｍの触知できる腫瘍が観察され、その後、マウスの腹膜内に組換えＬＭ又はＰＢＳを７日、１４日及び２１日目に注射した。腫瘍の最短直径と最長直径を２日ごとにカリバスを用いて測定した。平均腫瘍直径が２０ｍｍに達する点に到達したら、マウスを犠牲にした。
【０１３３】
結果
△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物を発現するＬＭ株をＰＢＳ及びＬｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７と、ラットＨｅｒ−２発現腫瘍系ＮＴ−２から構成される腫瘍の免疫性予防（ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ）と減少を誘導するそれらの能力に関して比較した。ＦＶＢ／ＮマウスにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、腫瘍接種の７日、１４日、及び２１後に０．１ＬＤ５０の、組換えＬＭ又はＰＢＳを投与した。△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物を発現するＬＭの注射は、最初の注射後に腫瘍の成長を停止させた（ｈａｌｔｅｄ）（図２Ａ及びＢ）；腫瘍の成長の停止は最後の時間点まで継続し、最後のＨｅｒ−２予防接種の９週後を超えた。さらに、腫瘍の完全な退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が、のちに８匹のＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２とＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３マウスのうちの３匹及び８匹のＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１マウスのうちの１匹において観察された。△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２グループの全５匹の追加のマウスは、腫瘍サイズの減少を呈した。予測されたとおり、腫瘍はＰＢＳと△ＬＬＯ−Ｅ７を注射したマウスにおいて継続して成長した。
【０１３４】
これらの発見は、ＬＬＯ断片のＨｅｒ−２への融合がＨｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫性の誘導を可能にすることを証明する。これらの発見は、さらに、誘導された免疫性が、（ａ）７５％を超える、確立されたＨｅｒ−２発現腫瘍の完全な退行を誘導するのに十分強く；そして（ｂ）少なくとも数カ月の期間は継続するのに十分強いことを示す。
【０１３５】
実施例３
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンにより誘導された
免疫応答性はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む
材料と実験方法
ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇
腫瘍注射後の６、７、８、１１、１４、１７、２０、及び２３日目に、０．５ｍｇの抗−ＣＤ８抗体２．４３の注射により、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２５（６）：２６６５−７２，１９８０）。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は２４日目にフローサイトメトリーの分析により測定したところ、９５％より多く減少していた。
【０１３６】
フローサイトメトリー分析
ＣＤ８（５３−６．７，ＦＩＴＣをコンジュゲートされた），ＣＤ６２リガンド（Ｍｅｌ−１４，ＡＰＣをコンジュゲートされた）（ＢＤバイオサイエンセスファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ）及びＨｅｒ−２ Ｈ−２ｑテトラマー（ＰＥをコンジュゲートされた）の３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒフローサイトメーターをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベクトンディッキンソン、サンホセ、ＣＡ）と共に用いて実施した。ＮＩＡＩＤテトラマーコアフェシリティーオブエモリーユニバーシティー及びＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチアンドレファレンスリージェントプログラムにより提供されたテトラマーを、Ｈ−２ｑ特異的ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦペプチドと共に負荷した。脾臓細胞を室温（ｒｔ）において上記テトラマーと共に１時間（ｈｒ）１：２００希釈にて染色し、次に、４℃において抗−ＣＤ８及び抗−ＣＤ６２Ｌ抗体により３０分間（ｍｉｎ）染色した。ＣＤ８＋，ＣＤ６２Ｌｌｏｗサブセットを選択して（「ゲートオン（ｇａｔｅｄ ｏｎ）」）、そしてテトラマー＋の細胞のパーセンテージをＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ツリースター社、アシュランド、ＯＲ）を用いて比較した。
【０１３７】
結果
観察された抗−Ｈｅｒ−２免疫応答を媒介したＴ細胞の種類を決定するために、ＮＴ−２腫瘍を有するＦＶＢ／ＮマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたが、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンによる予防接種の１日前に始め、次に、実施例２に記載されたとおりに予防接種した。ＣＤ８＋を注射されたマウスにおいては、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々が効果を喪失した（図３Ａ及びＢ）；しかるに、非枯渇マウスにおいては、実施例２に観察されるとおり、腫瘍の成長が制御された。
【０１３８】
テトラマー分析を次に用いることにより、上の結果を確認した。非腫瘍生産６−８週齢ＦＶＢ／Ｎマウスに、ＰＢＳ又は０．１ ＬＤ５０ Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２を免疫し、そして２１日後にブーストした。脾臓細胞をブーストの５日後に回収し、そしてアミノ酸４２０−４２９（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ）により規定されるエピトープに特異的なＨ−２ｑテトラマーにより染色した。テトラマー陽性細胞における３倍の増加がＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２−予防接種マウスにおいて観察された（図５）。
【０１３９】
これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンにより誘導された免疫性に特徴を有することを示す。
実施例４
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンは準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞
エピトープに対する免疫応答性を誘導する
材料と実験方法
細胞
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞はマウスの繊維芽細胞系であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞と全ての誘導細胞を、１０％ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧ，及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを付加されたＤＭＥＭ内で培養した。３Ｔ３−ｎｅｕ細胞系のための培養培地には、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を付加した。細胞を３７℃において５％ＣＯ２と共に生育した。
【０１４０】
３Ｔ３−Ｈｅｒ−２系
簡単に言えば、野生型３Ｔ３細胞をラットＨｅｒ−２遺伝子のオーバーラッピング断片でトランスデュースし、９つの３Ｔ３ Ｈｅｒ−２断片系及び１つの完全長ラットＨｅｒ−２を創製したＨｅｒ−２断片を以下のプライマーを用いて創製した。
【０１４１】
【化５】
【０１４２】
断片１−９は、Ｈｅｒ−２のそれぞれアミノ酸１−１６５、１４８−２９１、２７４−４２６、４１０−５５３、５３１−６８７、６５５−８２０、７９７−９５２、９２９−１０８５、１０６３−１２５５にまたがる。各断片をｐｃＤＮＡ３．１哺乳類トランスフェクションベクターに連結したが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）をマルチクローニング部位に含む。構築物を、３Ｔ３細胞へ、エレクトロポレーション（２０μｇ／ｌｘ１０７細胞）又はリポフェクタミン（１．５μｇ／３ｘ１０５細胞；ライフテクノロジーズ）を用いてトランスフェクトした。各断片に関して数クローンを限定希釈法により単離した。クローン中のＨｅｒ−２断片の発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【０１４３】
クロミウム放出アッセイ
ＦＶＢ／Ｎマウスを０．１ ＬＤ５０のＬｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々により免疫した。脾臓細胞を９日後に回収し、そして、４日間、照射された（２０，０００ラッド）ＮＴ−２腫瘍細胞と共に脾臓細胞対収容細胞を１００：１の比にして、２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（ロッシュ、インディアナポリス、ＩＮ）と共に培養した。次に、脾臓細胞をエフェクター細胞として標準５１Ｃｒ放出アッセイにおいて用いた。標的細胞をクロミウム−５１（５１Ｃｒ）で標識して、４日間、脾臓細胞と共に、エフェクター：細胞比を２００：１、１００：１、５０：１及び２５：１にして、３通り培養した。インキュベーション後に、１００μｌの上清を５１Ｃｒ放出に関してアッセイした。特異的溶解のパーセントを［（分あたりの実験カウント−分あたりの自発カウント）／（分あたりの全カウント−分あたりの自発カウント）］ｘ１００として測定した。「分あたりの全カウント」は、標識を表紙記してカウントした後で細胞を溶解することにより測定された、標的細胞集団中の全カウント数を意味する。換言すると、これは放出され得た５１Ｃｒの最大量である。
【０１４４】
結果
Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々が抗−Ｈｅｒ−２ ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答性を用いて誘導することを確認するために、ＣＴＬアッセイを実施した。マウスに△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンの各々を予防接種し、そして脾臓細胞を単離して、溶解を誘導する能力に関して、完全長のラットＨｅｒ−２（Ｂ）をトランスデュースされた３Ｔ３細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによる測定により、野生型３Ｔ３細胞を陰性対照として用いて（Ａ）試験した。各ワクチンは抗−Ｈｅｒ−２ ＣＴＬ応答性を誘導したが、２００：１又は１００：１のＥ：Ｔ比における有意なレベルの溶解により証明された。追加の陰性対照であるＰＢＳを予防接種されたマウスからの脾臓細胞は、ほんのバックグラウンドレベルの溶解しか誘導しなかった（図６）。これらの発見は、△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンの各々が抗−Ｈｅｒ−２ ＣＴＬ免疫応答性を誘導するという、さらなる証拠を提供する。
【０１４５】
各ワクチンにより誘導されたＣＴＬにより認識されるエピトープを描写する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）ために、対応する△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンによる予防接種後に、９つのＨｅｒ−２断片の各々を発現する３Ｔ３細胞のパネルを標的細胞として上記の溶解アッセイにおいて用いた。各ワクチンは少なくとも一つのＨｅｒ−２断片に対してＣＴＬ応答性を誘導した。Ｈｅｒ−２断片のいくつかに関しては、バックグラウンドを超える溶解のレベルが統計上有意に達した（ｐ＜０．０５）。陰性及び陽性の結果の組み合わせに基づき、準顕性エピトープを含むＨｅｒ−２の領域を描写した（表１）。即ち、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片により予防接種はＨｅｒ−２蛋白質内の準顕性エピトープを明らかにした。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
実施例５
ＬＬＯへの融合とＬＭによるデリバリーはＨｅｒ−２の免疫原性を増強する
材料と実験方法
ＤＮＡワクチン
ｐｃＤＮＡ３．１を用いてＤＮＡワクチンを構築した。Ｈｅｒ−２とＥＣ１断片をＰＣＲにより以下のプライマー：
完全長、未融合 Ｈｅｒ−２：
【０１４８】
【化６】
【０１４９】
（ＮｈｅＩ部位に下線；配列番号：２９）及び
【０１５０】
【化７】
【０１５１】
（ＥｃｏＲＶ部位に下線、ＦＬＡＧタグをイタリックにて、停止コドンを太字にて；配列番号：３０）を用いて増幅した。上記の５’プライマーは未融合ＥＣ１を増幅するのにも使用し、そして３’プライマーは△ＬＬＯ−完全長Ｈｅｒ−２を増幅するのにも使用した。
△ＬＬＯ−完全長Ｈｅｒ−２：
【０１５２】
【化８】
【０１５３】
（ＳａｌＩ部位に下線；配列番号：３１）。このプライマーは△ＬＬＯ−ＥＣ１を増幅するのにも使用した。
未融合ＥＣ１：
【０１５４】
【化９】
【０１５５】
（ＥｃｏＲＶ部位に下線、ＦＬＡＧタグをイタリックにて、停止コドンを太字にて；配列番号：３２）。このプライマーは、△ＬＬＯに融合された未融合ＥＣ１を増幅するのにも使用した。
【０１５６】
断片をｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニング部位へクローン化して、エシェリヒアコリを形質転換するのに使用した。細菌をルリア−ベルターニ培地（ＢＤ，スパークス、ＭＤ）中で５０マイクログラム／リットル（μｇ／ｍｌ）のペニシリンと共に生育させた。
【０１５７】
腫瘍退行実験
７ｘ１０５ＮＴ−２細胞を利用し、そして予防接種を３、１０、そして１８日目に投与した以外は、実施例２に記載されたとおりに腫瘍の退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）実験を実施した。ＤＮＡワクチン（各５０μｇのｐｃＤＮＡプラスミド＋ＧＭ−ＣＳＦプラスミド又はＧＭ−ＣＳＦ単独）を筋肉内投与して、Ｌｍを腹腔内投与した。
【０１５８】
結果
いくつかの因子が準顕性エピトープの認識に寄与するかもしれないＬｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチン内に存在した：（ａ）ＬＭによるデリバリー；（ｂ）標的抗原の△ＬＬＯへの融合；（ｃ）Ｈｅｒ−２の断片への破壊。どの一つ又はそれより多くのこれら因子が準顕性エピトープに寄与するかを決定するため、増強された抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性による証拠として、マウスに（ａ）ｐｃＤＮＡ３．１完全長Ｈｅｒ−２（ＤＮＡワクチン；「ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ」）；（ｂ）ｐｃＤＮＡ３．１△ＬＬＯ完全長Ｈｅｒ−２（ｐｃＤＮＡ ＬＬＯ−ｎｅｕ）；（ｃ）ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＣ１（ｐｃＤＮＡ ＥＣ１）；（ｄ）ｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−ＥＣ１（ｐｃＤＮＡ ＬＬＯ−ＥＣ１）又は；（ｅ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１を予防接種し、そして腫瘍退行実験を実施した。ＤＮＡワクチンの有効性を増強するその能力のため、ＧＭ−ＣＳＦをＤＮＡワクチンと共に含ませた（ＭｃＬａｙ ＰＦ，Ｂａｒｏｕｃｈ ＤＨ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４ Ａｐｒ；３４（４）：１０１１−２０．）。
【０１５９】
図７Ａに描写されるとおり、腫瘍の成長の最良の制御がＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２に観察された；マウスの２／８は触知できる腫瘍を発症しなかった；腫瘍は他の２匹においては完全に退行した；そして、その他の４匹は偽予防接種の対照よりも緩慢な（遅延した）腫瘍成長を呈した。ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１においては、１匹のマウスが腫瘍を発症せず、そして他のマウスの数匹は遅延した腫瘍成長を呈した。ｐｃＤＮＡ ＥＣ１対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１及びｐｃＤＮＡ ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕの比較により観察されるとおり（図６Ｂ−Ｃ）、△ＬＬＯへの融合はＥＣ１の免疫原性を増強した；抗原を融合しなかったワクチンは偽予防接種対照と同じ速度で生育する腫瘍を呈した。Ｈｅｒ−２の小さな断片へ分割することの増強効果は、△ＬＬＯ融合の場合に、ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１の比較から観察され、後者の群は優秀な腫瘍対照を呈した（図７Ｄ）。ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ ＥＣ１の比較から観察されるとおり、融合しなかった抗原に関しては効果が観察されなかった（図７Ｅ）。
【０１６０】
実施例６
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２のＤＮＡワクチンは準顕性
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して免疫応答性を誘導する
ＤＮＡワクチンに対する免疫応答性を、さらに、実施例４に記載されるとおりに、Ｈｅｒ−２断片をトランスデュースされた３Ｔ３細胞の溶解を測定することにより分析した。ｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２又はｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−ＥＣ１を予防接種されたマウスからのＴ細胞は、対応する非融合ＤＮＡワクチンよりもさらに多くの３Ｔ３−Ｈｅｒ−２標的細胞群から細胞を溶解した（表２）。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
即ち、ＬＬＯ断片の完全長Ｈｅｒ−２又はＨｅｒ−２断片への融合は、ＣＴＬｓにより認識される領域の広域化をもたらした。従って、実施例５−６の結果に基づくと、準顕性ＣＤ８＋抗原エピトープは、（ａ）ＬＭによるデリバリー；（ｂ）抗原のＬＬＯ断片への融合；又は（ｃ）抗原の小断片への分割のいずれかにより明らかにされ得る。
【０１６３】
実施例７
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２の予防接種はエピトープの拡散を誘導する
材料と実験方法
ＦＶＢ／ＮにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、実施例２に記載されるとおりＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片の各々又は実施例５に記載されるとおりにＤＮＡ △ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片を予防接種する。リンパ球を予防接種の後に様々な時間点において腫瘍部位の膿を出すリンパ腫から単離した。リンパ球により認識されるエピトープは、実施例４に記載されるとおり、溶解アッセイにより、９つのＨｅｒ−２断片の各々を発現する３Ｔ３細胞を用いて決定される。
【０１６４】
結果
最後のブーストから１カ月以上を経た腫瘍の退行の誘導は他の種類のワクチンを用いた観察と対照的であり、Ｔ細胞サブセットの数がエピトープの拡散により拡大しつつあることを示唆する。例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状突起細胞は死に行く細胞の破片を獲得し、膿を出すリンパ腫に到達し、そしてワクチン断片には存在しないＨｅｒ−２エピトープを提示して、Ｈｅｒ−２ ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの広域化をもたらすかもしれない。この結論を確認するため、マウスにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、ＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片株又はＤＮＡ △ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片ワクチンの各々を予防接種する。リンパ球を腫瘍膿リンパ腫（ｔｕｍｏｒ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）から様々な時間点において単離し、そしてリンパ球により認識されるエピトープを決定する。Ｔ細胞応答のこの広域化は、おおよそ、特定の時期の（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ）腫瘍退行に相関する。
【０１６５】
この結果は、組換え−抗原発現ＬＭによる予防接種がエピトープ拡散を誘導することを証明する。さらに、ＬＬＯ−抗原融合物による予防接種はＬＭのコンテクスト外であってさえ、なおエピトープ拡散を誘導する。
【０１６６】
実施例８
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２による予防接種は自己抗原に対する寛容を克服する
材料と実験方法
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｍｕｌｌｅｒ博士より提供された。自発的に腫瘍を発症しなかった若い未交尾のＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに、５ｘ１０４のＮＴ−２細胞を注射した。当該トランスジェニックマウスはＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して大いに寛容であるため、１００％の動物において腫瘍成長に必要な最小の用量は野生型のマウスよりも低い（Ｒｅｉｌｌｙ ＲＴ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ＭＢ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｊｕｌ １；６０（１３）：３５６９−７６）。ＮＴ−２細胞を脇腹の皮下スペースに注射した。４−５ｍｍの触知できる腫瘍が検出されたときに（普通は腫瘍の移植の７日目）、マウスは０．１ ＬＤ５０のリステリアワクチンを受け、そして、さらに毎週その後、追加の４週間であった。
【０１６７】
結果
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子は、ラットｎｅｕと５−６％のアミノ酸残基が異なるので、即ち、マウスにおいては免疫原性である（Ｎａｇａｔａ Ｙ，Ｆｕｒｕｇｅｎ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−４３）。マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター及びエンハンサーの転写制御下でラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰に発現するトランスジェニックマウスは免疫学上はラットＨｅｒ−２／ｎｅｕに対して寛容である。これらのマウスは自発的に乳癌を発症する。ＭＭＴＶプロモーターは造血細胞においても作動して、マウスをＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して大いに寛容にする。このマウスは、ヒト乳癌、及び一般には抗原、例えば正常な組織において低レベルで発現されるＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍のストリンジェントなモデルであると考えられる（Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．Ｊ．（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １０：２１７−２７）。
【０１６８】
６−８週齢のＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにＮＴ−２細胞を注射し、次に、ＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々又はＰＢＳ又は△ＬＬＯ−Ｅ７（陰性対照）により免疫した。ほとんどの対照マウスはそれらの腫瘍の苦しみのために４２日目に犠牲にされたが、腫瘍成長は予防接種を受けたマウスの全てにおいて制御された（図８）。
【０１６９】
即ち、確立されたＮＴ−２腫瘍の退行を誘導するそれらの能力により証明されるとおり、△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２及びリステリアに基づくＨｅｒ−２ワクチンは腫瘍細胞上に発現される自己抗原に対する寛容を破壊することができる。
【０１７０】
実施例９
ＬＬＯ−ＨＥＲ−２ワクチンはＨＥＲ−２／ＮＥＵ
トランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を制御する
材料と実験方法
△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを以下の量にて投与した：Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１：１ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２：５ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ３：１ｘ１０＾８ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２：１ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１：１ｘ１０＾７ｃｆｕ。
【０１７１】
結果
△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を阻止する能力に関して評価した。トランスジェニックマウス（ワクチン群あたりｎ＝１２）を５回０．１ ＬＤ５０のワクチン株の一つで免疫したが、６週例から開始して３週に１回継続した。マウスを乳腺内の腫瘍形成に関して監視した。３５週目に、対照マウスの全て（ＰＢＳ又はＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１−免疫された）が腫瘍を発症した。対照的に、９２％のＬｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１群は腫瘍がなく、マウスＬｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１，及びＬｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２の５０％、及びＬｍ−ＬＬＯ−ＥＣ３により免疫されたマウスの２５％がそうであった（図９）。
【０１７２】
実施例１０
ヒトＨＥＲ−２蛋白質能力に断片を含むＬＬＯ−ワクチンの生成
ラットＨｅｒ−２に関して使用されたように（実施例１）、類似の戦略を用いてヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現させた。完全長のＨＥＲ−２遺伝子を、細胞外ドメイン（ＥＣ−１，ＥＣ−２及びＥＣ−３）及び細胞質ドメイン（ＩＮ−１及びＩＣ−２）のオーバーラップする断片に構成させて５つの断片に分けた（図１０）。疎水性領域は、当該構築物中に含まれなかった。これらの配列はラットの配列とはわずかに異なったが、２つの配列の間の小さな非類似性のためであった。ラット断片に想到するヒト断片は２２−３２６，３０３−５０１，４７９−６５２，６７７−１０８１，及び１０２０−１２５５であった。
【０１７３】
ヒトＨＥＲ−２配列を、ヒト乳房細胞癌系列、例えば、ＳＫ−ＢＲ３（ＡＴＣＣ）から、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、標準分子生物学の方法を用いて単離する。例えば、全細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標）キット（キアゲン）を用いて単離し、そしてオリゴ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡプールを生じさせる（チタン−ワン−チューブＰＣＲシステム（登録商標）、ロッシュ）。目的のＨＥＲ−２配列を第２工程ＰＣＲにより以下のプライマーを用いて特異的に増幅する。
【０１７４】
【表３】
【０１７５】
制限部位ＸｈｏＩ（５’）及びＳｐｅＩ（３’）を加えて、リステリアワクチンクローンへののちのクローニングを可能にさせ、そしてオーカーコドンをリバースプライマーに含ませることにより、融合蛋白質の翻訳を停止させる。ヒトＨＥＲ−２遺伝子のこれらの断片中にはＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ配列がない。ＰＣＲ産物を精製して（Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット、キアゲン）、そして中間のエシェリヒアコリベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン）にクローン化する。ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン）の形質転換の後に、コロニーを含むプラスミドをＰＣＲによりプライマーＭ１３フォワード及びＭ１３リバース（インビトロジェン）を用いて同定する。各構築物に関して一つの陽性のクローンを生育し、プラスミドＤＮＡが調製され（Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標），キアゲン）、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕ挿入物の配列を配列決定により確認する。
【０１７６】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原配列をリステリアベクターに導入するため、ｐＬＬＯ−Ｅ７をＸｈｏＩにより完全消化し、そしてＳｐｅＩにより部分消化し、それにより、Ｅ７遺伝子を除去する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列を同じ酵素で消化し、全ての消化物をアガロースゲル電気泳動により分離して、ＬＬＯ−Ｅ７ベクターとＨＥＲ−２／ｎｅｕ挿入物配列を精製する（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原配列をｐＬＬＯ−Ｅ７に連結し、そして連結された混合物によりｄ−アラニンラセマーゼ欠損エシェリヒアコリ株ＭＢ２１５９をエレクトロポレーションにより形質転換する。コロニーをＰＣＲによりＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列に関して試験し、そしてルリアブロス（ＬＢ）培地中で増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、次に、各構築物に関して特定のバンドパターンを生じさせるＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，ＮｃｏＩによるか又はＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により確認する。プラスミドによりリステリア株Ｌｍ（ＤＡ−）をエレクトロポレーションにより形質転換し、そして個々のクローンを５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ培地中で生育させる。プラスミドの存在及び不在を、再び、制限分析により確認する。ＬＬＯ−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合蛋白質の発現と分泌を、ＴＣＡ−沈殿培養培地のウエスタンブロットにより、ポリクローナルＰＥＳＴ配列特異的抗体を用いて確認する。
【０１７７】
実施例１１
ヒトＨＥＲ−２蛋白質の断片を含むＬＬＯ−ＨＥＲ−２ワクチンの試験
ＬＬＯ−ヒトＨｅｒ−２株をマウスとヒトボランティアにおける免疫原性に関して試験する。次に、ワクチン株を、上記実施例に記載されたとおりに、ヒトＨｅｒ−２を発現する腫瘍細胞によるチャレンジに対してマウスを防御するそれらの能力に関して試験する。成功した株をＨｅｒ−２発現腫瘍を有するヒトに投与し、そして腫瘍退行を誘導するそれらの能力に関して試験する。さらに、上記株を遺伝因子又は環境因子のためにＨｅｒ−２発現癌を発症する危険からヒト被験者を防御するそれらの能力に関して試験する。当該ワクチン株は免疫原性であることがわかり、そして実質上の抗−腫瘍活性を呈することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】Ｌｍ−△−ＬＬＯ−ＨＥＲ−２−ワクチンを構築するのに用いられた、ｐＧＧ５５の模式的描写。
【図２Ａ】組換えリステリアモノサイトゲネスは、△ＬＬＯ−融合蛋白質としてＨｅｒ−２断片の各々を分泌することができる。（Ａ）ラットのＨｅｒ−２断片のマップ。
【図２Ｂ】（Ｂ）ウエスタンブロットにより融合ペプチドの分泌の確認。マーカー（レーン１）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１（レーン３）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２（レーン４）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３（レーン５）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１（レーン６）、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２（レーン７）。
【図３Ａ】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、各々、確立されたＮＴ−２腫瘍の腫瘍成長において休止（ｈａｌｔ）を誘導する。各データ点は、所定の時間点における１匹のマウスの最短及び最長の表面腫瘍直径の平均を表す。マウスは平均腫瘍直径が２．０ｃｍに達したときに犠牲にした；腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。２つの実験の代表的な図を示す。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３。
【図３Ｂ】（Ｂ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１。
【図４Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞はＬｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２誘導腫瘍停滞に関与する。腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３、共にＣＤ８＋Ｔ細胞に関して枯渇されるか又は枯渇されない。
【図４Ｂ】（Ｂ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、共にＣＤ８＋Ｔ細胞に関して枯渇されるか又は枯渇されない。
【図５】Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２は、テトラマー＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞において３倍増加を誘導する。ＦＶＢ／ＮマウスをＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２又はＰＢＳにより免疫した。次に、脾臓細胞をＨ−２ｑＨｅｒ−２テトラマー、抗−ＣＤ８，及び抗−ＣＤ６２Ｌで染色した。
【図６】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチン構築物の各々は、同様なレベルの抗−Ｈｅｒ−２ＣＴＬ活性を誘導する。Ａ．野生型３Ｔ３（陰性対照）。Ｂ．３Ｔ３−ｎｅｕ（完全長Ｈｅｒ−２）。結果は、３重の培養の平均として表し、そして５つの実験の代表である。
【図７Ａ】ＬＭによるデリバリー及び△ＬＬＯへの融合はＨｅｒ−２ワクチンの抗−腫瘍免疫応答性を増加させる。各マウスの平均腫瘍直径を描写する。腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｂ】（Ｂ）ｐｃＤＮＡ ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬ−ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｄ】（Ｄ）ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｅ】（Ｅ）ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図８】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、ラットＨｅｒ−２は自己抗原として発現されるラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて、確立されたラットＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を遅延させる。
【図９】ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的な腫瘍成長を制御する。
【図１０】ＬＬＯ−ヒトＨｅｒ−２ワクチンを創製するために用いられたヒトＨｅｒ−２断片の模式的描写。
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【０００２】
発明の背景
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（「Ｈｅｒ−２」とも呼ばれる）は、チロシンキナーゼの表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである１８５ｋＤａの糖蛋白質であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞シグナリングに関与することがわかっている細胞内ドメインからなる（Ｂａｒｇｍａｎｎ ＣＩ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２２６，１９８６；Ｋｉｎｇ ＣＲ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９７４，１９８５）。それは全乳癌の２５から４０％において過剰発現されて、多数の卵巣癌、肺癌、膵臓癌、及び胃腸系の癌においても過剰発現される。Ｈｅｒ−２の過剰発現は制御されない細胞成長及びシグナリングに関連し、両者は腫瘍の発生に寄与する。Ｈｅｒ−２を過剰発現する癌を有する患者は、Ｈｅｒ−２に対して向けられた検出可能な体液性のＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答によってさえ寛容を呈する。
【０００３】
リステリアモノサイトゲネスは主に抗原提示細胞に感染する細胞内病原体であって、これらの細胞の細胞質において生涯適合される。マクロファージのような宿主細胞は活動的にリステリアモノサイトゲネスを食菌して、大多数の細菌がファゴリソソーム中で分解される。いくつかの細菌は、ヘモリジン、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）の作用によりファゴソームの膜に穴を開けて宿主の細胞質に逃げ込む。細胞質に入ったら、リステリアモノサイトゲネスは宿主のアクチンを重合することができて、細胞から細胞へと直接通過して、さらに、宿主の免疫系を逃れて、リステリアモノサイトゲネスに対しての無視できる抗体応答しかもたらさない。
【０００４】
発明の概要
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【０００５】
一つの態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片、約１５０から約４２０アミノ酸の長さを有するＨｅｒ−２蛋白質の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたか又はその断片に融合された、ＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００１２】
別の態様において、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００１３】
発明の詳細な説明
この発明は、抗原発現腫瘍に対して治療して予防接種し、そして抗原の準顕性エピトープに対して免疫応答性を誘導する方法を提供し、ＬＬＯ断片の上記抗原に対する融合又は上記抗原を発現する組換えリステリア株への融合を含む。本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質断片を含む組換えペプチド又はその断片、Ｈｅｒ−２蛋白質を発現する組換えリステリア株、同一のものを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導して同一のものを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対して治療して予防接種する方法も提供する。
【００１４】
本明細書に提供される本発明の結果は、本発明の組成物の投与が腫瘍細胞を認識して殺傷する抗原特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の形成を誘導し、それにより腫瘍細胞の成長を停止させて腫瘍細胞を萎縮させ、そして結果の癌を治療するための有用性を有することを証明する（本明細書中の実施例）。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片、約１５０から約４２０アミノ酸の長さを有するＨｅｒ−２蛋白質の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質に融合されたか又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片を含む組換えポリペプチドを提供する。一つの態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ３０３−５０１からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ４７９−６５５からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ６９０−１０８１からなる。別の態様において、当該断片は、そのおよそＡＡ１０２０−１２５５からなる。別の態様において、当該断片は、以下に記載されるＨｅｒ−２断片の何れかからなる。各可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００１７】
一つの態様において、本発明の方法と組成物のＨｅｒ−２蛋白質は、ヒトＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、マウスＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はラットＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は霊長類のＨｅｒ―２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は当業界公知のあらゆるその他の動物種のＨｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はＨｅｒ−２蛋白質のバリアントである。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質はＨｅｒ−２蛋白質のホモログである。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【００１８】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、配列：
【００１９】
【化１】
【００２０】
（配列番号：４０）を有するラットＨｅｒ−２蛋白質である。配列番号：４０は実施例１において断片を創製するために使用した。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は配列番号：４１により示される核酸配列によりコードされる。
【００２１】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、配列：
【００２２】
【化２】
【００２３】
（配列番号：４３）を有するヒトＨｅｒ−２蛋白質である。配列番号：４３は実施例１０において断片を創製するために使用した。別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は配列番号：４４により示される核酸配列によりコードされる。
【００２４】
他の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００４４４８又はＮＭ＿００１００５８６２に示された配列を有する。これらのＨｅｒ−２蛋白質は、それぞれＡＡ６５３−６７５及び６２３−６４５にまたがる膜貫通（ＴＭ）領域を有する。配列番号：４３に示されたヒトＨｅｒ−２蛋白質は６５３−６７６にまたがるＴＭ領域を有する。即ち、別の態様において、これらのような配列番号：４０のバリエーションからの本発明のものに対応するＨｅｒ−２断片の生成は、以下に記載されるように、断片を規定する残基の数の調節を必要とする。
【００２５】
他の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質は、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、又は「ｃＮｅｕ」と呼ばれる蛋白質である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２６】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２の断片は、おおよそアミノ酸（ＡＡ）２０−３２６からなる（実施例１のＥＣ１；配列番号：３５）。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ３０３−５０１（ＥＣ２；配列番号：３６）からなる。当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ４７９−６５５（ＥＣ３；配列番号：３７）からなる。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質のおおよそＡＡ６９０−１０８１（ＩＣ１；配列番号：３８）からなる。別の態様において、当該断片は、おおよそＡＡ１０２０−１２５５（ＩＣ２；配列番号：３９）からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２７】
上で掲載されたＡＡ数と範囲はラットのＨｅｒ−２配列に基づき、ＴＭドメインは残基６５６−６８９にまたがる。別の態様において、他のＨｅｒ−２蛋白質（例えば、他の種由来のＨｅｒ−２蛋白質）の対応する領域は、他のＨｅｒ−２蛋白質のＴＭドメインと並べて、ＡＡ範囲を調節することにより決定される。例えば、ヒトＨｅｒ−２転写物バリアント２、ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ＿００１００５８６２に関しては、ＴＭ領域はＡＡ６２３−６４５にまたがる。即ち、この態様において、ＥＣ３に対応するこの蛋白質の領域は、おおよそＡＡ４４６−６２２であり、ＡＡ数から３３を差し引いてＴＭドメインの細胞外境界内の３３ＡＡの差異を参酌することにより決定された。同様に、ＩＣ１に対応するこの蛋白質の領域は６４６−１０３７であり、ＡＡ数から４４を差し引いてＴＭドメインの細胞外境界内の４４ＡＡの差異を参酌することにより決定された。別の態様において、他のＨｅｒ−２蛋白質の対応する領域は当該蛋白質のエンドとのアラインメントにより決定される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００２８】
別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞外ドメインの断片である。別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞外ドメインの約３分の１から半分からなる。別の態様において、当該断片は、そのおおよそ１０分の１から５分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その５分の１から４分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その約４分の１から３分の１からなる。別の態様において、当該断片は、その３分の１から半分からなる。当該断片はその半分から４分の３からなる。別の態様において、当該断片は、全部細胞外ドメインに対して約４分の３からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−１０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−１５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−１５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６５−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−２０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２５−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３５−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４５−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５５−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６５−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−８５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７５−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８０−９５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８５−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−２５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−３０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約８０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−３５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−４０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約７０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−４５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−５０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約６０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−５５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−６０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−６５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−７０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約４０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約５−７５％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−８０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約３０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−９０％からなる。別の態様において、当該断片は、その約２０−１００％からなる。別の態様において、当該断片は、その約１０−１００％からなる。
【００２９】
別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１２％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１８％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約２０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約２５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約３０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約３５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約４０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約４５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約５５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約６５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約７０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約７５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約８５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約９０％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約９５％からなる。別の態様において、当該断片は、細胞外ドメインの約１００％からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３０】
別の態様において、当該断片は、Ｈｅｒ−２蛋白質の細胞内ドメインの断片である。一つの態様において、当該断片は細胞内ドメインの約３分の１から半分である。別の態様において、細胞内ドメインの断片は細胞外ドメインに関して上で掲載された量、フラクション、又は範囲の何れかである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３１】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２蛋白質の断片は、そのシグナル配列を含まない。一つの態様において、シグナル配列の削除は、シグナル配列の高い疎水性のために、Ｈｅｒ−２断片がリステリアにおいて首尾よく発現されることを可能にさせる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３２】
別の態様において、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２蛋白質の断片は、そのＴＭ配列を含まない。一つの態様において、ＴＭ配列の削除は、ＴＭ配列の高い疎水性のために、Ｈｅｒ−２断片がリステリアにおいて首尾よく発現されることを可能にさせる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３３】
「含まない」は、一つの態様において、限定ではないが、１より多いアミノ酸（ＡＡ）のシグナル配列又はＴＭドメインを意味する。別の態様において、当該用語は、２より多いＡＡを含まないことを意味する。他の態様において、当該用語は、上記配列の３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０より多いＡＡを含まないことを意味する。別の態様において、配列不在が包含される。別の態様において、ほとんどの配列が包含されない。他の態様において、上記配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０のＡＡが包含されない。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３４】
本発明の方法及び組成物において利用されるＬＬＯは、一つの態様において、リステリアのＬＬＯである。一つの態様において、ＬＬＯが由来するリステリアは、リステリアモノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の態様において、リステリアはリステリアイバノビイである。他の態様において、リステリアはリステリアウエルシメリ（ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の態様において、リステリアはリステリアシーリゲリ（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、非リステリアＬＬＯ蛋白質である。
【００３５】
別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は配列：
【００３６】
【化３】
【００３７】
（ジェンバンク受け入れ番号Ｐ１３１２８；配列番号：３４；核酸配列はジェンバンク受け入れ番号Ｘ１５１２７に示される；配列番号：３３）を有する。この配列に対応するプロ蛋白質の最初の２５アミノ酸はシグナル配列であって、細菌から分泌される場合にＬＬＯから分割される。即ち、一つの態様において、完全長の活性なＬＬＯ蛋白質は５０４残基の長さである。他の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ジェンバンク受け入れ番号ＤＱ０５４５８８，ＤＱ０５４５８９，ＡＹ８７８６４９，Ｕ２５４５２，又はＵ２５４５２に示される配列を有する。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ＬＬＯ蛋白質のバリアントである。別の態様において、ＬＬＯ蛋白質は、ＬＬＯ蛋白質のホモログである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００３８】
別の態様において、「末端削除されたＬＬＯ」又は「△ＬＬＯ」は、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片を意味する。別の態様において、当該用語は、アミノ末端に活性化ドメインを含まず且つシステイン４８４を含まないＬＬＯ断片を意味する。別の態様において、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列を含む。別の態様において、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯ蛋白質のおおよそ最初の４４１アミノ酸からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯ蛋白質の非溶血形態である。
【００３９】
一つの態様において、上で言及されたＰＥＳＴ様ドメインは、配列番号：４２に示される配列を有する。別の態様において、ＰＥＳＴ様ドメインは、当業界公知のあらゆる他のＰＥＳＴ様ドメインである。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４０】
別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−１５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１１７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−２７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３２５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３５０からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−３７５からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−４００からなる。別の態様において、ＬＬＯ断片は、おおよそ残基１−４２５からなる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。別の態様において、本発明は、上記ヌクレオチド核酸を含むワクチンを提供する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むベクターを提供する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のリステリアの組換え形態を含むワクチンを提供する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本発明のリステリアの組換え形態の培養物を提供する。
別の態様において、本発明の方法及び組成物のリステリアは、ＬＭである。別の態様において、リステリアはリステリアイバノビイである。他の態様において、リステリアはリステリアウエルシメリ（ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の態様において、リステリアはリステリアシーリゲリ（ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４６】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態を提供する。
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供するが、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【００４７】
一つの態様において、本発明の方法及び組成物の融合蛋白質は、ＬＬＯからのＬＬＯシグナル配列を含む。別の態様において、当該蛋白質の２つの分子（ＬＬＯ断片と抗原）は直接連結される。別の態様において、当該２つの分子は、一つ又はそれより多いアミノ酸からなる短いスペーサーペプチドにより連結される。一つの態様において、スペーサーは、蛋白質と連結するか又はいくらかの最小距離を保つか又はそれらの間の他の空間的関係を保つ以外に生物学上の活性を有さない。
【００４８】
別の態様において、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のいくつかの特性、例えば、フォールディング、正味の荷電、又は疎水性に影響しないように選択される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００４９】
別の態様において、本発明は、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法を提供するが、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導することを含む。
【００５０】
一つの態様において、本発明の組換えポリペプチド又は組換えポリヌクレオチドを投与する工程は、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される。別の態様において、投与することは、別の細菌ベクターにより実施される。別の態様において、投与することは、ウイルスベクターにより実施される。別の態様において、投与することは、ＤＮＡワクチン（例えば、はだかのＤＮＡワクチン）により実施される。別の態様において、本発明の組換えポリペプチドの投与は、蛋白質を組換え生産し、次に組換え蛋白質を被験者に投与することにより実施される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００５１】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答から主としてなる。別の態様において、免疫応答の唯一の検出可能な成分はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答である。
【００５２】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答から主としてなる。別の態様において、免疫応答の唯一の検出可能な成分はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答である。別の態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答により達せられる。別の態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答により達せられない。
【００５３】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される免疫応答性は、抗原の準顕性エピトープに対する免疫応答を含む。別の態様において、当該免疫応答性は、準顕性エピトープに対する免疫応答を含まない。別の態様において、当該免疫応答性は、準顕性エピトープに対する免疫応答から主としてなる。別の態様において、当該免疫応答性の唯一の測定可能な成分は、準顕性エピトープに対する免疫応答である。
【００５４】
免疫応答性の各種は、本発明の別々の態様を表す。
免疫応答性を測定する方法は、当業界でよく知られており、例えば、腫瘍の成長の抑圧を測定すること（本明細書中の実施例２、５、８、及び９）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ；実施例３）、標的細胞溶解アッセイ（例えば、クロミウム放出アッセイ；実施例４及び６）、テトラマーの使用、及びその他を含む。各方法は、本発明の別々の態様を表す。
【００５５】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５７】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００５８】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明は、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍を萎縮させる方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害することを含む。
【００６０】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それによりＨｅｒ−２発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６１】
別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する方法を提供するが、ＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片をコードするヌクレオチドを、Ｈｅｒ−２蛋白質又はその断片をコードするヌクレオチドに融合させることにより組換えヌクレオチドを創製し、それによりＨｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する工程を含む。
【００６２】
別の態様において、Ｈｅｒ−２蛋白質の免疫原性を改善する方法は、さらに、組換えヌクレオチドを発現するようにリステリア株を操作することを含む。別の態様において、別の細菌ベクターを用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、ウイルスベクターを用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、ＤＮＡワクチン（例えば、はだかのＤＮＡワクチン）を用いて組換えヌクレオチドを発現させる。別の態様において、当該ヌクレオチドによりコードされるＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ペプチドの投与は、蛋白質を組換えにより生産して、次に、組換え蛋白質を被験者に投与することにより実施される。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【００６３】
別の態様において、本発明の方法及び組成物により誘導される抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性は、断片中に存在するＨｅｒ−２蛋白質のエピトープに対しての第１の免疫応答及び断片中に存在しないＨｅｒ−２蛋白質のエピトープに対する第２の免疫応答を含み、以下に詳細にされる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合されたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該ポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、上記抗原は一つ又はそれより多い顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６５】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原の断片をコードし、上記抗原は一つ又はそれより多い顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００６６】
別の態様において、本発明は、抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供し、（ａ）当該抗原をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片に融合させ、それによりＬＬＯ−抗原融合蛋白質の組換えヌクレオチドを創製し；（ｂ）ＬＬＯ−抗原融合物を被験者に投与し；（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を被験者から単離し；（ｄ）ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるエピトープを決定し；それにより抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定する工程を含む。
【００６７】
「顕性（ｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一つの態様において、予防接種、感染、又は悪性腫瘍成長により、蛋白質又は病原体又は上記蛋白質を含む癌細胞により誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の７５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９５％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９６％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９７％より多くに認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の９８％より多くに認識されるエピトープを意味する。
【００６８】
「準顕性（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一つの態様において、予防接種、感染、又は悪性腫瘍成長により、蛋白質又は病原体又は上記蛋白質を含む癌細胞により誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１０％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の８％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の６％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の５％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の４％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の３％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の２％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の１％未満に認識されるエピトープを意味する。別の態様において、当該用語は、それにより誘導される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．５％未満に認識されるエピトープを意味する。
【００６９】
別の態様において、「顕性エピトープ」は、一つの態様において、予防接種の他の方法により現れない（ｎｏｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ）エピトープを意味する。例えば、Ｅｒｃｏｌｉｎｉら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３，１７０：４２７３−４２８０）は、ＧＭ−ＣＳＦをトランスフェクトされたｎｅｕ発現腫瘍細胞とＨｅｒ−２を発現する組換えワクシニアの両方を被験者に予防接種したが、単一の顕性エピトープＡＡ４２０−４２９しか発見しなかった。対照的に、本明細書に記載された実験における△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物の使用は、ＡＡ４２０−４２９に加えて追加のエピトープを明らかにした。融合物の組換えＬＭによるデリバリーは、さらに多数のエピトープを明らかにする。
【００７０】
別の態様において、顕性エピトープ又は準顕性エピトープは、処置された被験者において、それぞれ顕性又は準顕性である。別の態様において、顕性エピトープ又は準顕性エピトープは、処置された集団において、それぞれ顕性又は準顕性である。
【００７１】
顕性エピトープ及び準顕性エピトープの各タイプは、本発明の別々の態様を表す。
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供するが、但し、当該抗原は被験者の非腫瘍細胞において検出可能なレベルで発現されるものであり、被験者に対して、抗原に融合させたか又はその断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与することを含み、その際、被験者が抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００７２】
別の態様において、本発明は、抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法を提供するが、但し、当該抗原は被験者の非腫瘍細胞において検出可能なレベルで発現されるものであり、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与することを含むが、但し、当該組換えヌクレオチドは上記抗原をコードするものであり、その際、被験者が抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【００７３】
「検出可能なレベル」は、一つの態様において、標準アッセイにより検出可能なレベルを意味する。一つの態様において、当該アッセイは免疫アッセイである。一つの態様において、当該アッセイはエンザイムリンクトイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。別の態様において、当該アッセイはウエスタンブロットである（実施例１）。別の態様において、当該アッセイは、ＦＡＣＳである（実施例３）。別の態様において、検出可能なレベルは、特定のアッセイのバックグラウンドレベルに関して決定される。これらの技術の各々を実施する方法は当業者によく知られており、各々の技術は本発明の別々の態様を表す。
【００７４】
本発明の方法及び組成物における抗原は、一つの態様において、被験者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の態様において、当該抗原は、被験者の少なくとも特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、又は５％）の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。一つの態様において、「非腫瘍細胞」は、腫瘍の本体の外の細胞を意味する。別の態様において、「非腫瘍細胞」は非悪性腫瘍細胞を意味する。別の態様において、「非腫瘍細胞」は、非形質転換細胞を意味する。別の態様において、非腫瘍細胞は体細胞である。別の態様において、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００７５】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法を提供するが、（ａ）当該抗原又はその断片をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片に融合させ、それによりＬＬＯ−抗原融合蛋白質をコードする組換えヌクレオチドを創製し；そして（ｂ）組換えヌクレオチド又はＬＬＯ−抗原融合物を被験者に投与し；それにより被験者において抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する工程を含む。
【００７６】
別の態様において、本発明は、腫瘍又は感染因子上で抗原を発現する動物において、抗原の第１エピトープに対する免疫応答性を誘導する方法を提供し、当該動物に、上記抗原の断片を発現する組換えリステリアを予防接種することにより誘導するが、その際、予防接種に用いられた断片は上記第１のエピトープを含まない。むしろ、当該断片は、動物が免疫応答性をマウントするのと同じ抗原の第２のエピトープを含む。腫瘍又は感染因子に対する継続する免疫応答性は、本明細書にて示されるとおり、エピトープスプレディング（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）により第１のエピトープの認識をもたらす。
【００７７】
別の態様において、本発明は、腫瘍又は感染因子上で抗原を発現する動物において、抗原の第１エピトープに対する免疫応答性を誘導する方法を提供し、当該動物に、上記抗原の断片に融合させたＬＬＯを含むワクチンを予防接種することにより誘導するが、その際、予防接種に用いられた断片は上記第１のエピトープを含まない。むしろ、当該断片は、動物が免疫応答性をマウントするのと同じ抗原の第２のエピトープを含む。腫瘍又は感染因子に対する継続する免疫応答性は、本明細書にて示されるとおり、エピトープスプレディングにより第１のエピトープの認識をもたらす。
【００７８】
一つの態様において、第１のエピトープに対する免疫応答性は、投与の工程の少なくとも２週後に開始される。別の態様において、第１のエピトープに対する免疫応答性は、投与の工程の終結の少なくとも２週後に開始される。別の態様において、タイムフレームは１週間である。別の態様において、タイムフレームは１０日である。別の態様において、タイムフレームは１７日である。別の態様において、タイムフレームは３週間である。別の態様において、タイムフレームは４週間である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００７９】
本明細書にて提供されるとおり、本発明の結果は、さらに、組換え抗原発現ＬＭの予防接種がエピトープスプレディングを誘導することを証明する。別の態様において、ＬＭのコンテクストの外部でさえＬＬＯ−抗原融合による予防接種はエピトープスプレディングをいっそう誘導する。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００８０】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、抗原の断片に融合させたＬＬＯ蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与することを含むが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者は抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する。
【００８１】
別の態様において、本発明は、被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する方法を提供し、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与することを含むが、当該組換えヌクレオチドは抗原の断片をコードし、但し、当該抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者は抗原発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者において抗原発現腫瘍の成長を妨害する。
【００８２】
別の態様において、本発明の方法の抗原は、Ｈｅｒ−２蛋白質である。別の態様において、抗原はＨＰＶ−１６ Ｅ７蛋白質である。別の態様において、抗原はｂｃｒ／ａｂｌである。別の態様において、抗原はＭＺ２−Ｅである。別の態様において、抗原はＭＡＧＥ−１である。別の態様において、抗原はＭＵＣ−１である。別の態様において、抗原はＮＹ／ＥＳＯ−１である。別の態様において、抗原はウイルムス腫瘍抗原である。別の態様において、抗原はテロメラーゼである。別の態様において、抗原はプロテイナーゼ３である。別の態様において、抗原はチロシナーゼ関連蛋白質２である。別の態様において、抗原はＨＩＶ−１ Ｇａｇ蛋白質である。別の態様において、抗原はＳＩＶ−１ Ｇａｇ蛋白質である。別の態様において、抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ蛋白質である。別の態様において、抗原は当業界公知のあらゆるその他の腫瘍抗原である。別の態様において、抗原は当業界公知のあらゆる他の感染性疾患抗原である。各々の可能性は本発明の別々の態様を表す。
【００８３】
他の態様において、抗原は腫瘍又は感染性生物に由来し、限定ではないが、真菌病原体、細菌、寄生虫、ウイルス等を含む。他の態様において、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０，ＨＩＶ ｇａｇ蛋白質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ，スポンゴスポラサテラネア（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）抗原、ビブリオース抗原、サルモネラ抗原、ニューモコッカス抗原、レスピラトリーシンチアルウイルス抗原、ヘモフィルスインフルエンザ外膜蛋白質、ヘリコバクターピロリウレアーゼ、ナイセリアメニンギティディスのピリン（ｐｉｌｉｎｓ）、ナイセリアゴノロエのピリン、メラノーマ関連抗原（ＴＲＰ−２，ＭＡＧＥ−１，ＭＡＧＥ−３，ｇｐ−１００，チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１，ＨＳＰ−７０，ベータ−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６，−１８，−３１，−３３，−３５又は−４５ヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１及びＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、ｒａｓ蛋白質、変異したか又はその他、ｐ５３蛋白質、変異したか又はその他、ＭｕｃＩ，又はｐＳＡを含む。
【００８４】
他の態様において、抗原は、以下の疾患の一つに関連する抗原である：コレラ、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、はしか、髄膜炎、おたふくかぜ、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、天然痘、肺炎双球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、チフス、水痘帯状疱疹、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ）３黄熱病、アジソン病からの免疫原及び抗原、アレルギー、ハシモト甲状腺炎、多発性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、移植拒絶、例えば、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、及び肝臓移植物、グレブス病、内分泌性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎、天疱瘡、胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体−媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、血清反応陰性脊椎炎、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化症性胆管炎、ウエゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギランバレー症候群、重症性筋無力症、ランバート−イートン症候群、鞏膜、上鞏膜、ブドウ膜炎、慢性皮膚粘膜カンジダ症、蕁麻疹、幼少期の一過性低グロブリン血症、ミエローマ、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウイスコット−アルドリッチ症候群、失調症性毛細管拡張症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、自己免疫溶血性貧血症、自己免疫血小板減少症、自己免疫好中球減少症、ワルデンシュトーム型マクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ球白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリア周種虫（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）蛋白質、細菌抗原、ウイルス抗原、自己抗原、及びリステリア症。
【００８５】
他の態様において、抗原は以下の腫瘍抗原のうちの一つである：ＭＡＧＥ（メラノーマ−関連抗原Ｅ）蛋白質、例えば、ＭＡＧＥ１，ＭＡＧＥ２，ＭＡＧＥ３，ＭＡＧＥ４，チロシナーゼ；変異ｒａｓ蛋白質；変異ｐ５３蛋白質；ｐ９７メラノーマ抗原、進行した癌に付随するｒａｓペプチド又はｐ５３ペプチド；頸部癌に付随するＨＰＶ １６／１８抗原、乳癌に付随するＫＬＨ抗原、結腸直腸癌に付随するＣＥＡ（癌胚抗原）、ｇｐ１００，メラノーマに付随するＭＡＲＴ１抗原、又は前立腺癌に付随するＰＳＡ。
【００８６】
当業者は、上記抗原の何れもがＬＬＯ断片に融合できることを理解する。上記抗原の各々は、本発明の別々の態様を表す。
別の態様において、本発明は、宿主において腫瘍の形成を抑圧する方法を提供するが、宿主に対して、本発明の組成物を投与し、それにより宿主において腫瘍の形成を抑圧することを含む。
【００８７】
別の態様において、本発明は、癌を有する被験者において腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供するが、本発明の組成物を投与し、それにより癌を有する被験者において腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の形成を誘導することを含む。
【００８８】
別の態様において、本発明は、癌を有する被験者において細胞障害性Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供するが、本発明の組成物を投与し、それにより癌を有する被験者において細胞障害性Ｔ細胞の形成を誘導することを含む。
【００８９】
別の態様において、本発明は、癌の影響を減少させる方法を提供するが、本発明の組成物を投与することを含む。別の態様において、本発明は、癌を改善する方法を提供するが、本発明の組成物を投与することを含む。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９０】
本発明の方法の一つの態様において、上記組成物は、エクスビボにおいて被験者の細胞に投与され、別の態様において、組成物はエクスビボにおいてドナーの細胞に投与され、別の態様において、インビボにおいてドナーの細胞に投与され、次に、被験者に移される。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９１】
一つの態様において、本発明の方法により処置される癌は乳癌である。別の態様において、癌はメラノーマである。別の態様において、癌は膵臓癌である。別の態様において、癌は卵巣癌である。別の態様において、癌は胃癌である。別の態様において、癌は膵臓の癌腫症病変、別の態様において、癌は肺アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は結腸直腸アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は肺の偏平上皮アデノカルシノーマである。別の態様において、癌は胃のアデノカルシノーマである。別の態様において、癌は卵巣表面の上皮腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）（例えば、良性腫瘍、その増殖性又は悪性バラエティ）である。別の態様において、癌は口腔の偏平上皮細胞のカルシノーマである。別の態様において、癌は非小細胞肺カルシノーマである。別の態様において、癌は子宮内膜カルシノーマである。別の態様において、癌は膀胱癌である。別の態様において、癌は頭部及び頸部の癌である。別の態様において、癌は前立腺カルシノーマである。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９２】
本発明の方法の別の態様において、被験者が抗原発現腫瘍又は標的抗原に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗腫瘍効果を媒介する。
別の態様において、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物を提供し、当該組成物は末端削除されたＬＬＯのＨｅｒ−２蛋白質への融合物を含む。別の態様において、当該免疫原性組成物は、さらに、融合物を発現するリステリア株を含む。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９３】
別の態様において、本発明は癌を治療するための免疫原組成物を提供し、当該組成物はＨｅｒ−２蛋白質を発現するリステリア株を含む。
一つの態様において、本発明の治療プロトコルは治療用である。別の態様において、プロトコルは予防用である。別の態様において、家族の遺伝又は特定の種類の癌にかかりやすい他の環境、例えば、その夫がパピローマウイルスを有する女性において頸部癌にかかりやすい他の環境ゆえに、癌の危険のある人を保護するために、本発明のワクチンを用いる。別の態様において、外科手術、慣用の化学治療又は放射線治療による腫瘍成長の脱巨大化（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）の後に、上記ワクチンを癌免疫治療として用いる。そのような治療の後に、本発明のワクチンを投与することにより、当該ワクチンの腫瘍抗原のＣＴＬ応答が残存する転移を撲滅して、癌からの緩解を長くする。別の態様において、本発明のワクチンを用いて、以前に確立された腫瘍の成長を変化させて（ｅｆｆｅｃｔ）、存在する腫瘍細胞を殺傷する。各々の可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９４】
別の態様において、上記の方法の何れかにおいて利用可能なワクチン及び免疫原組成物は、本発明のワクチン及び免疫原組成物の特徴の何れかを有する。各特徴は本発明の別の態様を表す。
【００９５】
用量の範囲の様々な態様は、この発明により意図される。一つの態様において、ワクチンベクターの場合、用量は０．００１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００６ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．００８ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０６ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．０８ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．１ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．１５ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．２ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．２５ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．３ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．４ ＬＤ５０／用量である。別の態様において、用量が０．５ ＬＤ５０／用量である。
【００９６】
別の態様において、用量が１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が４ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０７細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が４ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０８細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０９細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０１０細菌／用量である。別の態様において、用量が１ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が１．５ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が２ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が３ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が５ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が６ｘ１０１１細菌／用量である。別の態様において、用量が８ｘ１０１１細菌／用量である。各特徴は本発明の別の態様を表す。
【００９７】
別の態様において、組換えポリペプチドの場合、用量が１ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１．５ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１５ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１５０ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が２００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が３００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が４００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が６００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が８００ｍｇ／用量である。別の態様において、用量が１０００ｍｇ／用量である。
【００９８】
上記の用量の各々は本発明の別の態様を表す。
一つの態様において、本発明のワクチン又は免疫原組成物は、単独で被験者に投与される。別の態様において、ワクチン又は免疫原組成物を別の癌治療剤と共に投与する。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【００９９】
本発明の方法及び組成物の組換えリステリアは、一つの態様において、抗原又はＬＬＯ−抗原融合物をコードする構築物により安定に形質転換される。一つの態様において、当該構築物は、さらなるクローニングを促進させるためにポリリンカーを含む。組換えリステリアを生産するためのいくつかの技術は公知である。
【０１００】
一つの態様において、当該構築物又は異種遺伝子は、相同組換えを用いてリステリアの染色体に挿入される。相同組換えの技術は当業界でよく知られており、例えば、Ｂａｌｏｇｕ Ｓ，Ｂｏｙｌｅ ＳＭ，ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｐａｒｔｉａｌ ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ ｏｒ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｌ７／Ｌ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５，１０９（１−２）：１−７；及びＪｉａｎｇ ＬＬ，Ｓｏｎｇ ＨＨ，ｅｔ ａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５，３７（１）：１９−２４の何れかに記載される。別の態様において、相同組換えは米国特許番号６，８５５，３２０に記載されたとおりに実施される。この場合、Ｅ７を発現する組換えＬＭ株を、Ｅ７遺伝子の染色体組み込みによりｈｌｙプロモーターの制御下で、且つｈｌｙシグナル配列の封入を伴って作成することにより、遺伝子産物の分泌を保証し、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と命名された組換え体を生じさせた。別の態様において、温度感受性プラスミドを用いて組換え体を選択する。各技術は本発明の別々の態様を表す。
【０１０１】
別の態様において、構築物又は異種遺伝子を、リステリアの染色体へトランスポゾン挿入を用いて挿入する。トランスポゾン挿入の技術は当業界でよく知られており、とりわけ、Ｓｕｎら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９０，５８：３７７０−３７７８）によるＤＰ−Ｌ９６７の構築において記載されている。トランスポゾンの変異導入は有利であり、別の態様において、安定なゲノミック挿入変異体が形成できるが、外来遺伝子が挿入されたゲノム内の位置が分からないのが不都合である。
【０１０２】
別の態様において、構築物又は異種遺伝子をリステリアの染色体へ、ファージ組み込み部位を用いて挿入する（Ｌａｕｅｒ Ｐ，Ｃｈｏｗ ＮＹ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法の特定の態様において、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３又はＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子と付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）部位を用いて異種遺伝子を対応する付着部位へ挿入するが、ゲノム中の如何なる適切な位置でもよい（例えば、ａｒｇ ｔＲＮＡ遺伝子のｃｏｍＫ又は３’エンド）。別の態様において、内生プロファージを、構築物又は異種遺伝子の組み込みの前に利用された付着部位から救済する（ｃｕｒｅｄ）。別の態様において、この方法は単コピーの組み込み物をもたらす。各可能性は本発明の別の態様を表す。
【０１０３】
別の態様において、上記構築物は、リステリア株によりプラスミドに運ばれる。ｐｒｆＡ（−）リステリアを相補するために、遺伝子をｐｒｆＡ−含有ベクターへクローニングすることとこのプラスミドを使用することが、ＤＰ−Ｌ２０２８を構築するのに使用された。ＤＰ−Ｌ２０２８は腫瘍防御実験において使用されたインフルエンザＮＰ発現株である。Ｅ７融合蛋白質を発現するＬＭベクターも、この技術により構築された。Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７は、米国特許番号６，５６５，８５２に記載されるとおり、ｐｒｆＡ−欠失変異体を、ｐｒｆＡ遺伝子のコピーと、酵素の溶血活性を排除するために末端削除されたＬＬＯ（ｈｌｙ）遺伝子の形態に融合されたＥ７Ａ遺伝子のコピーを含むプラスミドにより捕捉することにより作成した。機能性ＬＬＯは、ｈｌｙの内生染色体コピーにより、生物中で保持される。
【０１０４】
他の態様において、いくつかのアプローチの一つを採用してリステリア内で腫瘍抗原を発現させる。一つの態様において、選択された腫瘍抗原とリステリア蛋白質、例えばＰＩ−ＰＬＣの融合蛋白質、又はそれをコードする構築物を生成する。別の態様において、分泌されたリステリア蛋白質、例えばヘモリジン又はホスホリパーゼのシグナル配列を抗原コード遺伝子に融合させる。
【０１０５】
別の態様において、上記構築物をエピソームの様式でリステリア株に含ませる。別の態様において、外来遺伝子を組換えリステリア株により運ばれるベクターから発現させる。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０６】
他の態様において、様々なプロモーターの一つを用いて、抗原又は同じものを含む融合蛋白質を発現させる。一つの態様において、ＬＭプロモーターを用いるが、例えば、遺伝子ｈｌｙ，ａｃｔａ，ｐｉｃａ，ｐｌｃＢ及びｍｐｌのプロモーターであり、それぞれ、リステリア蛋白質ヘモリジン、ａｃｔ Ａ，ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、及びメタロプロテアーゼをコードする。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０７】
抗原のパネルは、一つの態様において、腫瘍の抗原損失バリアントが免疫系の圧迫下で芽生え得るという事実を補償するための癌に対する免疫治療において有用である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８ ４：２６６９；Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ ５９：１）。即ち、別の態様において、本発明の方法及び組成物は、組換え融合蛋白質のカクテルを含み、各融合蛋白質は、末端削除されたＬＬＯに融合された異なる腫瘍関連抗原を含むか、又は組換えＬＭ株のカクテル各々が異なる腫瘍関連抗原を発現する。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１０８】
別の態様において、本発明の方法及び組成物は、本発明のＨｅｒ−２又はＬＬＯ配列の相同体を利用する（例えば、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４）。用語「相同性」、「相同」等は、蛋白質又はペプチドに関して使用されるとき、一つの態様において、もし必要なら最大パーセント相同性を達成するために、配列を並べて（ａｌｉｇｎｉｎｇ）ギャップを導入した後に、そして配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考えずに、対応する天然ペプチドの残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。アラインメントのための方法とコンピュータープログラムは、当業界でよく知られている。
【０１０９】
別の態様において、用語「相同」は、あらゆる核酸に対して言及されるとき、同様に、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一の候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１１０】
相同性は、一つの態様において、配列アラインメントのコンピューター計算式、当業界でよく知られている方法により決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューター計算式分析は、如何なる数の利用可能なソフトウエアパッケージの利用を含んでもよく、例えば、ＢＬＡＳＴ，ＤＯＭＡＩＮ，ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ），ＧＥＮＰＥＰＴ及びＴＲＥＭＢＬパッケージである。
【０１１１】
別の態様において、「相同性」は、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４から選択される配列に対して７０％を超える同一性を意味する。別の態様において、「相同性」は、配列番号：３３、３４、４０、４１、４３、及び４４から選択される配列に対して７２％を超える同一性を意味する。別の態様において、相同性は７５％を超える。別の態様において、相同性は７８％を超える。別の態様において、相同性は８０％を超える。別の態様において、相同性は８２％を超える。別の態様において、相同性は８３％を超える。別の態様において、相同性は８５％を超える。別の態様において、相同性は８７％を超える。別の態様において、相同性は８８％を超える。別の態様において、相同性は９０％を超える。別の態様において、相同性は９２％を超える。別の態様において、相同性は９３％を超える。別の態様において、相同性は９５％を超える。別の態様において、相同性は９６％を超える。別の態様において、相同性は９７％を超える。別の態様において、相同性は９８％を超える。別の態様において、相同性は９９％を超える。別の態様において、相同性は１００％である。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１２】
別の態様において、相同性は、候補配列のハイブリダイゼーションの測定、当業界でよく記述された方法（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編纂（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，）Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ参照）による。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、中程度からストリンジェントな条件下で、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補体に対して実施してよい。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、４２℃において１０−２０％ホルムアルデヒド、５Ｘ ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸三ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６），５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性専断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションである。
【０１１３】
本発明の一つの態様において、「核酸」は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの糸を意味する。当該用語は、一つの態様において、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、一つの態様において、核酸ポリマーのモノマーユニットを意味する。ＲＮＡは、一つの態様において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡの使用は、記載された（Ｃａｕｄｙ ＡＡ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌ １６：２４９１−９６及びそれに引用された文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡ又はこれらの群の誘導体の形態であってよい。さらに、ＤＮＡ及びＲＮＡのこれらの形態は、一本鎖、二重鎖、三重鎖又は四重であってよい。当該用語は、別の態様において、他の種類のバックボーンを含むかもしれないが同じ塩基を含む人工核酸も含む。一つの態様において、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチドバックボーンと核酸塩基を含み、一つの態様において、ＤＮＡとＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の態様において、ヌクレオチドが修飾されたオキセタン（ｏｘｅｔａｎｅ）である。別の態様において、一つ又はそれより多くのホスホジエステルのホスホロチオエート結合による置換によりヌクレオチドが修飾される。別の態様において、人工核酸は、当業界で知られた天然核酸のリン酸バックボーンのあらゆるその他のバリアントを含む。ホスホロチオエート核酸及びＰＮＡの使用は当業界でよく知られており、例えばＮｅｉｌｓｅｎ ＰＥ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：３５３−５７；及びＲａｚ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載されている。核酸の生産と使用は当業者にはよく知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，編纂、及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ ａｎｄ Ｇ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載されている。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１４】
本明細書に掲載されたあらゆるアミノ酸の蛋白質及び／又はペプチドの相同性は、一つの態様において、当業界で良く知られた方法により決定され、イムノブロット分析、又はアミノ酸配列のコンピューター計算式による分析、利用可能な多数のソフトウエアパッケージを利用すること、確立された方法によることを含む。これらのパッケージのいくつかは、ＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴ，ＭＰｓｒｃｈ又はスキャンプスパッケージを含んでよく、そしてスミスアンドウオーターマン計算式、及び／又はグローバル／ローカル又はＢＬＯＣＫＳアラインメントの分析のための使用を例えば含んでよい。相同性を決定するための各方法は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１５】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するのに利用される試薬を含むキットを提供する。別の態様において、本発明は、本発明の組成物、ツール、又は装置を含むキットを提供する。
【０１１６】
用語「接触させる」又は「投与する」は、癌細胞又は腫瘍を本発明の組成物に直接接触させることを意味する。別の態様において、当該用語は、癌細胞又は腫瘍を本発明の組成物に間接に接触させることを意味する。別の態様において、本発明の方法は、被験者に本発明の組成物を接触させ、その後組成物が拡散によるか又は化合物が体内を循環することが当業界にて知られている他の任意の活性輸送体又は受動的輸送プロセスにより癌細胞又は腫瘍と接触する、方法を含む。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１１７】
薬学組成物
本発明のワクチン及び組成物を含む薬学組成物は、別の態様において、当業者によく知られたあらゆる方法により被験者に投与することができ、例えば、非経口、癌近辺（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、経筋肉、静脈内、皮内（ｉｎｔｒａ−ｄｅｒｍａｌｌｙ）、腹膜内、心室内、頭蓋内、膣内、又は腫瘍内（ｔｕｍｏｒａｌｌｙ）である。
【０１１８】
本発明の方法及び組成物の別の態様において、ワクチン又は組成物を経口投与し、そして即ち、経口投与に適した形態、即ち、固形又は流体調製物にて製剤化される。適切な固形経口製剤は、タブレット、カプセル、ピル、顆粒、ペレット等を含む。適切な流体経口製剤は、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイル等を含む。本発明の別の態様において、活性成分をカプセル内に製剤化する。この態様によれば、本発明の組成物は、活性化合物及び不活性担体又は希釈剤に加えて、ハードゼラチン化合カプセルを含む。
【０１１９】
別の態様において、ワクチン又は組成物を、流体調製物の静脈内、動脈内、又は筋肉内注射により投与する。適切な流体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、オイル等を含む。一つの態様において、薬学組成物は静脈内投与され、即ち、静脈内投与に適した形態にて製剤化される。別の態様において、薬学組成物は動脈内投与され、即ち、動脈内投与に適した形態で製剤化される。別の態様において、薬学組成物は筋肉内投与され、即ち、筋肉内投与に適した形態で製剤化される。
【０１２０】
一つの態様において、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患を直すことを意味する。別の態様において、「治療する」は、疾患を予防することを意味する。別の態様において、「治療する」は疾患の発病率を減少させることを意味する。別の態様において、「治療する」は疾患の兆候を改善することを意味する。別の態様において、「兆候」は疾患の進行を遅延させることを意味する。用語「減少させる」、「抑圧する」及び「阻害する」は、別の態様において、減らすこと（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）又は低下させること（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）を意味する。各々の可能性は、本発明の別々の態様を表す。
【０１２１】
実験の詳細のセクション
実施例１
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌する
リステリアモノサイトゲネス株の生成
材料と実験方法
サブクローニング
実施例において使用されたリステリアＨｅｒ−２構築物のバックボーンｐＧＧ−５５をｐＡＭ４０１から創製した。グラム＋及びグラム−細菌の両方において複製できるシャトルベクターであるｐＡＭ４０１は、グラム＋クロラムフェニコール耐性遺伝子とグラム−テトラサイクリン耐性遺伝子を含む（Ｗｉｒｔｈ，Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６５：８３１，１９８６）。ｐＧＧ−５５を生産するため、ｈｌｙ−ＨＰＶ １６ Ｅ７融合遺伝子（ｈｌｙプロモーターとＬＬＯの最初の４４１アミノ酸をコードするｈｌｙの一部を含み、「△ＬＬＯ」と命名された）と、多能性転写因子ｐｒｆＡ（リステリオリジン発現の陽性制御因子）遺伝子をｐＡＭ４０１にクローン化した（図１）。
【０１２２】
リステリアモノサイトゲネス（ＬＭ）株、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１，及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２は、各々、リステリアｈｌｙ遺伝子に融合されたラットのＨｅｒ−２の断片を発現するプラスミドを含む。Ｈｅｒ−２の細胞外及び細胞内ドメインの以下のオーバーラップ断片を、プラスミドｐＧＧ−５５：塩基対（ｂｐ）７４−９９４，（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１；Ｈｅｒ−２のＡＡ２０−３２６に相当），９２３−１５１９（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２；ＡＡ３０３−５０１に相当），１４５１−１９８１（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３；ＡＡ４７９−６５５に相当），２０８４−３２５９（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１；ＡＡ６９０−１０８１に相当），及び３０７３−３７９６（Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２；ＡＡ１０２０−１２５５に相当）にクローン化した。上記断片は図２Ａに描写される。ＥＣ１，ＥＣ２，ＥＣ３，ＩＣ１，及びＩＣ２のＬＤ５０は、それぞれ、１ｘ１０８，１ｘ１０９，５ｘ１０８，１ｘ１０８，及び１ｘ１０８であった。
【０１２３】
各Ｈｅｒ−２断片をＰＣＲにより完全長のラットＨｅｒ−２遺伝子を含むｐＮＮＡプラスミドから以下のプライマーを用いて増幅した。制限部位（ＥＣ１，ＩＣ１，及びＩＣ２の５’プライマーの場合ＸｈｏＩ；３’プライマーに関してはＳｐｅＩ；そしてＥＣ２とＥＣ３の５’プライマーに関してはＳａｌＩ）には下線が引かれ、そしてＥＣ２とＥＣ３の３’プライマー中のＦＬＡＧのｔａｇ配列をイタリックで示す。
【０１２４】
【化４】
【０１２５】
断片をＰＣＲにより増幅してＰＣＲ２．１発現系（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）にクローン化して、次に、直鎖状化酵素により切り出す。Ｅ７遺伝子をｐＧＧ−５５プライマーからＸｈｏＩとＳｐｅＩを用いて切り出し、次に、Ｈｅｒ−２断片を融合してＥ７部位（ＳａｌＩにより消化したエンドはＸｈｏＩエンドに互換性がある）へ連結した。ＸＦＬ−７はＬＭのｐｆｒＡ陰性株であり（Ｇｕｎｎ ＧＲ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：６４７，２００１）、エレクトロポレーションによりプライマーをトランスフェクトした。
【０１２６】
細菌
細菌を脳心臓注入培地（ＢＤ，スパークス、ＭＤ）内で５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと共に生育させ、そして１ｍｌアリコートにて−８０℃において凍結させた。
【０１２７】
ウエスタンブロット
△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２発現株を一晩３７℃においてルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で５０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のクロラムフェニコールと共に生育させた。上清をＴＣＡ沈殿させて、１Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（インビトロジェン、サンディエゴ、ＣＡ）に懸濁した。１５マイクロリットル（μｌ）の各サンプルを４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロジェン、サンディエゴ、ＣＡ）に負荷した。ゲルをインモビロン−Ｐポリビニリデンフルオライド膜（ミリポア、ビレリア、ＭＡ）に転写し、そしてＬＬＯの残基１−３０を認識するポリクローナルウサギ血清によりブロットし、次に、ＨＲＰ−コンジュゲートされた抗ウサギ抗体（アマシャムファルマシアバイオテック、ＵＫ）をブロットした。
【０１２８】
統計分析
統計分析は実施例を通してスチューデントｔテストを用いて実施した。
【０１２９】
結果
リステリアモノサイトゲネスＬＬＯ蛋白質のＮ末端部分に融合させたラットのＨｅｒ−２遺伝子のオーバーラップする断片を発現して分泌する５つの組換えＬＢ株を構築した（図２Ａ）。Ｈｅｒ−２のシグナル配列と膜貫通ドメインは、それらの疎水性と疎水性ドメインを極度に分泌することに関するＬＭの無能性のため、断片には含まれなかった。各Ｈｅｒ−２断片の分泌はウエスタンブロットにより確認された（図２Ｂ）。蛋白質、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３，Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１，及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２の分子量は、それぞれ、８３、７０、６８、９２．５、及び７４−ｋＤａ（キロドルトン）であった。上記株は野生型１０１０３Ｓ株に比較して減弱され（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７に匹敵する毒性を呈した；即ち、それぞれ、１ｘ１０８，５ｘ１０８，１ｘ１０９，１ｘ１０８，１ｘ１０８，及び１ｘ１０８コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）であった。
【０１３０】
実施例２
Ｈｅｒ−２発現腫瘍の成長を停止させて逆転させる
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２構築物による予防接種
材料と実験方法
マウス
６週から８週齢のメスのＦＶＢ／Ｎマウスをチャールズリバーラボラトリーズ（ウイルミントン、ＭＡ）から購入した。
【０１３１】
細胞系
ＦＶＢ／Ｎ Ｈｅｒ−２トランスジェニックマウス中の自然発生乳房腫瘍に由来するＦＶＢ／Ｎ同系ＮＴ−２腫瘍細胞系（Ｒｅｉｌｌｙ ＲＴ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃ Ｒｅｓ ６０：３５６９，２０００）は、低レベルのラットＨｅｒ−２を構成的に発現し、そして野生型の同系マウスにおいて腫瘍形成性である。ＮＴ−２細胞をＲＰＭＩ １６４０培地中で２０％ＦＣＳ，１０．２ｍＭ ＨＥＰＥＳ，２ミリモラー（ｍＭ）Ｌ−グルタミン、１００マイクロモラー（μＭ）非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ（ユニット）／ｍｌペニシリンＧ，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌインスリン、及び２μｇ／ｍｌゲンタマイシンと共に、３７℃において５％ＣＯ２と共に生育させた。
【０１３２】
実験セットアップ
６−８週齢のＦＶＢ／Ｎマウス（ｎ＝８）に、２００μｌのＰＢＳ中の２ｘ１０６ＮＴ−２腫瘍細胞を右脇腹（ｒｉｇｈｔ ｆｌａｎｋ）に皮下注射した。接種の７日後に、４−５ｍｍの触知できる腫瘍が観察され、その後、マウスの腹膜内に組換えＬＭ又はＰＢＳを７日、１４日及び２１日目に注射した。腫瘍の最短直径と最長直径を２日ごとにカリバスを用いて測定した。平均腫瘍直径が２０ｍｍに達する点に到達したら、マウスを犠牲にした。
【０１３３】
結果
△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物を発現するＬＭ株をＰＢＳ及びＬｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７と、ラットＨｅｒ−２発現腫瘍系ＮＴ−２から構成される腫瘍の免疫性予防（ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ）と減少を誘導するそれらの能力に関して比較した。ＦＶＢ／ＮマウスにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、腫瘍接種の７日、１４日、及び２１後に０．１ＬＤ５０の、組換えＬＭ又はＰＢＳを投与した。△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合物を発現するＬＭの注射は、最初の注射後に腫瘍の成長を停止させた（ｈａｌｔｅｄ）（図２Ａ及びＢ）；腫瘍の成長の停止は最後の時間点まで継続し、最後のＨｅｒ−２予防接種の９週後を超えた。さらに、腫瘍の完全な退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が、のちに８匹のＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２とＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３マウスのうちの３匹及び８匹のＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１マウスのうちの１匹において観察された。△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２グループの全５匹の追加のマウスは、腫瘍サイズの減少を呈した。予測されたとおり、腫瘍はＰＢＳと△ＬＬＯ−Ｅ７を注射したマウスにおいて継続して成長した。
【０１３４】
これらの発見は、ＬＬＯ断片のＨｅｒ−２への融合がＨｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫性の誘導を可能にすることを証明する。これらの発見は、さらに、誘導された免疫性が、（ａ）７５％を超える、確立されたＨｅｒ−２発現腫瘍の完全な退行を誘導するのに十分強く；そして（ｂ）少なくとも数カ月の期間は継続するのに十分強いことを示す。
【０１３５】
実施例３
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンにより誘導された
免疫応答性はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む
材料と実験方法
ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇
腫瘍注射後の６、７、８、１１、１４、１７、２０、及び２３日目に、０．５ｍｇの抗−ＣＤ８抗体２．４３の注射により、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２５（６）：２６６５−７２，１９８０）。ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は２４日目にフローサイトメトリーの分析により測定したところ、９５％より多く減少していた。
【０１３６】
フローサイトメトリー分析
ＣＤ８（５３−６．７，ＦＩＴＣをコンジュゲートされた），ＣＤ６２リガンド（Ｍｅｌ−１４，ＡＰＣをコンジュゲートされた）（ＢＤバイオサイエンセスファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ）及びＨｅｒ−２ Ｈ−２ｑテトラマー（ＰＥをコンジュゲートされた）の３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒフローサイトメーターをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベクトンディッキンソン、サンホセ、ＣＡ）と共に用いて実施した。ＮＩＡＩＤテトラマーコアフェシリティーオブエモリーユニバーシティー及びＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチアンドレファレンスリージェントプログラムにより提供されたテトラマーを、Ｈ−２ｑ特異的ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦペプチドと共に負荷した。脾臓細胞を室温（ｒｔ）において上記テトラマーと共に１時間（ｈｒ）１：２００希釈にて染色し、次に、４℃において抗−ＣＤ８及び抗−ＣＤ６２Ｌ抗体により３０分間（ｍｉｎ）染色した。ＣＤ８＋，ＣＤ６２Ｌｌｏｗサブセットを選択して（「ゲートオン（ｇａｔｅｄ ｏｎ）」）、そしてテトラマー＋の細胞のパーセンテージをＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ツリースター社、アシュランド、ＯＲ）を用いて比較した。
【０１３７】
結果
観察された抗−Ｈｅｒ−２免疫応答を媒介したＴ細胞の種類を決定するために、ＮＴ−２腫瘍を有するＦＶＢ／ＮマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたが、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンによる予防接種の１日前に始め、次に、実施例２に記載されたとおりに予防接種した。ＣＤ８＋を注射されたマウスにおいては、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々が効果を喪失した（図３Ａ及びＢ）；しかるに、非枯渇マウスにおいては、実施例２に観察されるとおり、腫瘍の成長が制御された。
【０１３８】
テトラマー分析を次に用いることにより、上の結果を確認した。非腫瘍生産６−８週齢ＦＶＢ／Ｎマウスに、ＰＢＳ又は０．１ ＬＤ５０ Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２を免疫し、そして２１日後にブーストした。脾臓細胞をブーストの５日後に回収し、そしてアミノ酸４２０−４２９（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ）により規定されるエピトープに特異的なＨ−２ｑテトラマーにより染色した。テトラマー陽性細胞における３倍の増加がＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２−予防接種マウスにおいて観察された（図５）。
【０１３９】
これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンにより誘導された免疫性に特徴を有することを示す。
実施例４
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンは準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞
エピトープに対する免疫応答性を誘導する
材料と実験方法
細胞
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞はマウスの繊維芽細胞系であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞と全ての誘導細胞を、１０％ＦＣＳ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧ，及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを付加されたＤＭＥＭ内で培養した。３Ｔ３−ｎｅｕ細胞系のための培養培地には、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を付加した。細胞を３７℃において５％ＣＯ２と共に生育した。
【０１４０】
３Ｔ３−Ｈｅｒ−２系
簡単に言えば、野生型３Ｔ３細胞をラットＨｅｒ−２遺伝子のオーバーラッピング断片でトランスデュースし、９つの３Ｔ３ Ｈｅｒ−２断片系及び１つの完全長ラットＨｅｒ−２を創製したＨｅｒ−２断片を以下のプライマーを用いて創製した。
【０１４１】
【化５】
【０１４２】
断片１−９は、Ｈｅｒ−２のそれぞれアミノ酸１−１６５、１４８−２９１、２７４−４２６、４１０−５５３、５３１−６８７、６５５−８２０、７９７−９５２、９２９−１０８５、１０６３−１２５５にまたがる。各断片をｐｃＤＮＡ３．１哺乳類トランスフェクションベクターに連結したが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）をマルチクローニング部位に含む。構築物を、３Ｔ３細胞へ、エレクトロポレーション（２０μｇ／ｌｘ１０７細胞）又はリポフェクタミン（１．５μｇ／３ｘ１０５細胞；ライフテクノロジーズ）を用いてトランスフェクトした。各断片に関して数クローンを限定希釈法により単離した。クローン中のＨｅｒ−２断片の発現をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【０１４３】
クロミウム放出アッセイ
ＦＶＢ／Ｎマウスを０．１ ＬＤ５０のＬｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々により免疫した。脾臓細胞を９日後に回収し、そして、４日間、照射された（２０，０００ラッド）ＮＴ−２腫瘍細胞と共に脾臓細胞対収容細胞を１００：１の比にして、２０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（ロッシュ、インディアナポリス、ＩＮ）と共に培養した。次に、脾臓細胞をエフェクター細胞として標準５１Ｃｒ放出アッセイにおいて用いた。標的細胞をクロミウム−５１（５１Ｃｒ）で標識して、４日間、脾臓細胞と共に、エフェクター：細胞比を２００：１、１００：１、５０：１及び２５：１にして、３通り培養した。インキュベーション後に、１００μｌの上清を５１Ｃｒ放出に関してアッセイした。特異的溶解のパーセントを［（分あたりの実験カウント−分あたりの自発カウント）／（分あたりの全カウント−分あたりの自発カウント）］ｘ１００として測定した。「分あたりの全カウント」は、標識を表紙記してカウントした後で細胞を溶解することにより測定された、標的細胞集団中の全カウント数を意味する。換言すると、これは放出され得た５１Ｃｒの最大量である。
【０１４４】
結果
Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々が抗−Ｈｅｒ−２ ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答性を用いて誘導することを確認するために、ＣＴＬアッセイを実施した。マウスに△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンの各々を予防接種し、そして脾臓細胞を単離して、溶解を誘導する能力に関して、完全長のラットＨｅｒ−２（Ｂ）をトランスデュースされた３Ｔ３細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによる測定により、野生型３Ｔ３細胞を陰性対照として用いて（Ａ）試験した。各ワクチンは抗−Ｈｅｒ−２ ＣＴＬ応答性を誘導したが、２００：１又は１００：１のＥ：Ｔ比における有意なレベルの溶解により証明された。追加の陰性対照であるＰＢＳを予防接種されたマウスからの脾臓細胞は、ほんのバックグラウンドレベルの溶解しか誘導しなかった（図６）。これらの発見は、△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンの各々が抗−Ｈｅｒ−２ ＣＴＬ免疫応答性を誘導するという、さらなる証拠を提供する。
【０１４５】
各ワクチンにより誘導されたＣＴＬにより認識されるエピトープを描写する（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）ために、対応する△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２融合ワクチンによる予防接種後に、９つのＨｅｒ−２断片の各々を発現する３Ｔ３細胞のパネルを標的細胞として上記の溶解アッセイにおいて用いた。各ワクチンは少なくとも一つのＨｅｒ−２断片に対してＣＴＬ応答性を誘導した。Ｈｅｒ−２断片のいくつかに関しては、バックグラウンドを超える溶解のレベルが統計上有意に達した（ｐ＜０．０５）。陰性及び陽性の結果の組み合わせに基づき、準顕性エピトープを含むＨｅｒ−２の領域を描写した（表１）。即ち、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片により予防接種はＨｅｒ−２蛋白質内の準顕性エピトープを明らかにした。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
実施例５
ＬＬＯへの融合とＬＭによるデリバリーはＨｅｒ−２の免疫原性を増強する
材料と実験方法
ＤＮＡワクチン
ｐｃＤＮＡ３．１を用いてＤＮＡワクチンを構築した。Ｈｅｒ−２とＥＣ１断片をＰＣＲにより以下のプライマー：
完全長、未融合 Ｈｅｒ−２：
【０１４８】
【化６】
【０１４９】
（ＮｈｅＩ部位に下線；配列番号：２９）及び
【０１５０】
【化７】
【０１５１】
（ＥｃｏＲＶ部位に下線、ＦＬＡＧタグをイタリックにて、停止コドンを太字にて；配列番号：３０）を用いて増幅した。上記の５’プライマーは未融合ＥＣ１を増幅するのにも使用し、そして３’プライマーは△ＬＬＯ−完全長Ｈｅｒ−２を増幅するのにも使用した。
△ＬＬＯ−完全長Ｈｅｒ−２：
【０１５２】
【化８】
【０１５３】
（ＳａｌＩ部位に下線；配列番号：３１）。このプライマーは△ＬＬＯ−ＥＣ１を増幅するのにも使用した。
未融合ＥＣ１：
【０１５４】
【化９】
【０１５５】
（ＥｃｏＲＶ部位に下線、ＦＬＡＧタグをイタリックにて、停止コドンを太字にて；配列番号：３２）。このプライマーは、△ＬＬＯに融合された未融合ＥＣ１を増幅するのにも使用した。
【０１５６】
断片をｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニング部位へクローン化して、エシェリヒアコリを形質転換するのに使用した。細菌をルリア−ベルターニ培地（ＢＤ，スパークス、ＭＤ）中で５０マイクログラム／リットル（μｇ／ｍｌ）のペニシリンと共に生育させた。
【０１５７】
腫瘍退行実験
７ｘ１０５ＮＴ−２細胞を利用し、そして予防接種を３、１０、そして１８日目に投与した以外は、実施例２に記載されたとおりに腫瘍の退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）実験を実施した。ＤＮＡワクチン（各５０μｇのｐｃＤＮＡプラスミド＋ＧＭ−ＣＳＦプラスミド又はＧＭ−ＣＳＦ単独）を筋肉内投与して、Ｌｍを腹腔内投与した。
【０１５８】
結果
いくつかの因子が準顕性エピトープの認識に寄与するかもしれないＬｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチン内に存在した：（ａ）ＬＭによるデリバリー；（ｂ）標的抗原の△ＬＬＯへの融合；（ｃ）Ｈｅｒ−２の断片への破壊。どの一つ又はそれより多くのこれら因子が準顕性エピトープに寄与するかを決定するため、増強された抗−Ｈｅｒ−２免疫応答性による証拠として、マウスに（ａ）ｐｃＤＮＡ３．１完全長Ｈｅｒ−２（ＤＮＡワクチン；「ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ」）；（ｂ）ｐｃＤＮＡ３．１△ＬＬＯ完全長Ｈｅｒ−２（ｐｃＤＮＡ ＬＬＯ−ｎｅｕ）；（ｃ）ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＣ１（ｐｃＤＮＡ ＥＣ１）；（ｄ）ｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−ＥＣ１（ｐｃＤＮＡ ＬＬＯ−ＥＣ１）又は；（ｅ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１を予防接種し、そして腫瘍退行実験を実施した。ＤＮＡワクチンの有効性を増強するその能力のため、ＧＭ−ＣＳＦをＤＮＡワクチンと共に含ませた（ＭｃＬａｙ ＰＦ，Ｂａｒｏｕｃｈ ＤＨ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４ Ａｐｒ；３４（４）：１０１１−２０．）。
【０１５９】
図７Ａに描写されるとおり、腫瘍の成長の最良の制御がＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２に観察された；マウスの２／８は触知できる腫瘍を発症しなかった；腫瘍は他の２匹においては完全に退行した；そして、その他の４匹は偽予防接種の対照よりも緩慢な（遅延した）腫瘍成長を呈した。ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１においては、１匹のマウスが腫瘍を発症せず、そして他のマウスの数匹は遅延した腫瘍成長を呈した。ｐｃＤＮＡ ＥＣ１対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１及びｐｃＤＮＡ ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕの比較により観察されるとおり（図６Ｂ−Ｃ）、△ＬＬＯへの融合はＥＣ１の免疫原性を増強した；抗原を融合しなかったワクチンは偽予防接種対照と同じ速度で生育する腫瘍を呈した。Ｈｅｒ−２の小さな断片へ分割することの増強効果は、△ＬＬＯ融合の場合に、ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１の比較から観察され、後者の群は優秀な腫瘍対照を呈した（図７Ｄ）。ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ対ｐｃＤＮＡ ＥＣ１の比較から観察されるとおり、融合しなかった抗原に関しては効果が観察されなかった（図７Ｅ）。
【０１６０】
実施例６
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２のＤＮＡワクチンは準顕性
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して免疫応答性を誘導する
ＤＮＡワクチンに対する免疫応答性を、さらに、実施例４に記載されるとおりに、Ｈｅｒ−２断片をトランスデュースされた３Ｔ３細胞の溶解を測定することにより分析した。ｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２又はｐｃＤＮＡ３．１−△ＬＬＯ−ＥＣ１を予防接種されたマウスからのＴ細胞は、対応する非融合ＤＮＡワクチンよりもさらに多くの３Ｔ３−Ｈｅｒ−２標的細胞群から細胞を溶解した（表２）。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
即ち、ＬＬＯ断片の完全長Ｈｅｒ−２又はＨｅｒ−２断片への融合は、ＣＴＬｓにより認識される領域の広域化をもたらした。従って、実施例５−６の結果に基づくと、準顕性ＣＤ８＋抗原エピトープは、（ａ）ＬＭによるデリバリー；（ｂ）抗原のＬＬＯ断片への融合；又は（ｃ）抗原の小断片への分割のいずれかにより明らかにされ得る。
【０１６３】
実施例７
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２の予防接種はエピトープの拡散を誘導する
材料と実験方法
ＦＶＢ／ＮにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、実施例２に記載されるとおりＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片の各々又は実施例５に記載されるとおりにＤＮＡ △ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片を予防接種する。リンパ球を予防接種の後に様々な時間点において腫瘍部位の膿を出すリンパ腫から単離した。リンパ球により認識されるエピトープは、実施例４に記載されるとおり、溶解アッセイにより、９つのＨｅｒ−２断片の各々を発現する３Ｔ３細胞を用いて決定される。
【０１６４】
結果
最後のブーストから１カ月以上を経た腫瘍の退行の誘導は他の種類のワクチンを用いた観察と対照的であり、Ｔ細胞サブセットの数がエピトープの拡散により拡大しつつあることを示唆する。例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状突起細胞は死に行く細胞の破片を獲得し、膿を出すリンパ腫に到達し、そしてワクチン断片には存在しないＨｅｒ−２エピトープを提示して、Ｈｅｒ−２ ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの広域化をもたらすかもしれない。この結論を確認するため、マウスにＮＴ−２腫瘍を注射し、次に、ＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片株又はＤＮＡ △ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２断片ワクチンの各々を予防接種する。リンパ球を腫瘍膿リンパ腫（ｔｕｍｏｒ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）から様々な時間点において単離し、そしてリンパ球により認識されるエピトープを決定する。Ｔ細胞応答のこの広域化は、おおよそ、特定の時期の（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ）腫瘍退行に相関する。
【０１６５】
この結果は、組換え−抗原発現ＬＭによる予防接種がエピトープ拡散を誘導することを証明する。さらに、ＬＬＯ−抗原融合物による予防接種はＬＭのコンテクスト外であってさえ、なおエピトープ拡散を誘導する。
【０１６６】
実施例８
ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２による予防接種は自己抗原に対する寛容を克服する
材料と実験方法
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｍｕｌｌｅｒ博士より提供された。自発的に腫瘍を発症しなかった若い未交尾のＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに、５ｘ１０４のＮＴ−２細胞を注射した。当該トランスジェニックマウスはＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して大いに寛容であるため、１００％の動物において腫瘍成長に必要な最小の用量は野生型のマウスよりも低い（Ｒｅｉｌｌｙ ＲＴ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ＭＢ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｊｕｌ １；６０（１３）：３５６９−７６）。ＮＴ−２細胞を脇腹の皮下スペースに注射した。４−５ｍｍの触知できる腫瘍が検出されたときに（普通は腫瘍の移植の７日目）、マウスは０．１ ＬＤ５０のリステリアワクチンを受け、そして、さらに毎週その後、追加の４週間であった。
【０１６７】
結果
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子は、ラットｎｅｕと５−６％のアミノ酸残基が異なるので、即ち、マウスにおいては免疫原性である（Ｎａｇａｔａ Ｙ，Ｆｕｒｕｇｅｎ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３３６−４３）。マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター及びエンハンサーの転写制御下でラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰に発現するトランスジェニックマウスは免疫学上はラットＨｅｒ−２／ｎｅｕに対して寛容である。これらのマウスは自発的に乳癌を発症する。ＭＭＴＶプロモーターは造血細胞においても作動して、マウスをＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して大いに寛容にする。このマウスは、ヒト乳癌、及び一般には抗原、例えば正常な組織において低レベルで発現されるＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍のストリンジェントなモデルであると考えられる（Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．Ｊ．（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ １０：２１７−２７）。
【０１６８】
６−８週齢のＨＥＲ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにＮＴ−２細胞を注射し、次に、ＬＭ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンの各々又はＰＢＳ又は△ＬＬＯ−Ｅ７（陰性対照）により免疫した。ほとんどの対照マウスはそれらの腫瘍の苦しみのために４２日目に犠牲にされたが、腫瘍成長は予防接種を受けたマウスの全てにおいて制御された（図８）。
【０１６９】
即ち、確立されたＮＴ−２腫瘍の退行を誘導するそれらの能力により証明されるとおり、△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２及びリステリアに基づくＨｅｒ−２ワクチンは腫瘍細胞上に発現される自己抗原に対する寛容を破壊することができる。
【０１７０】
実施例９
ＬＬＯ−ＨＥＲ−２ワクチンはＨＥＲ−２／ＮＥＵ
トランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を制御する
材料と実験方法
△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを以下の量にて投与した：Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１：１ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２：５ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ３：１ｘ１０＾８ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２：１ｘ１０＾７ｃｆｕ；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１：１ｘ１０＾７ｃｆｕ。
【０１７１】
結果
△ＬＭ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンを、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍成長を阻止する能力に関して評価した。トランスジェニックマウス（ワクチン群あたりｎ＝１２）を５回０．１ ＬＤ５０のワクチン株の一つで免疫したが、６週例から開始して３週に１回継続した。マウスを乳腺内の腫瘍形成に関して監視した。３５週目に、対照マウスの全て（ＰＢＳ又はＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１−免疫された）が腫瘍を発症した。対照的に、９２％のＬｍ−ＬＬＯ−ＩＣ１群は腫瘍がなく、マウスＬｍ−ＬＬＯ−ＥＣ２，Ｌｍ−ＬＬＯ−ＥＣ１，及びＬｍ−ＬＬＯ−ＩＣ２の５０％、及びＬｍ−ＬＬＯ−ＥＣ３により免疫されたマウスの２５％がそうであった（図９）。
【０１７２】
実施例１０
ヒトＨＥＲ−２蛋白質能力に断片を含むＬＬＯ−ワクチンの生成
ラットＨｅｒ−２に関して使用されたように（実施例１）、類似の戦略を用いてヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現させた。完全長のＨＥＲ−２遺伝子を、細胞外ドメイン（ＥＣ−１，ＥＣ−２及びＥＣ−３）及び細胞質ドメイン（ＩＮ−１及びＩＣ−２）のオーバーラップする断片に構成させて５つの断片に分けた（図１０）。疎水性領域は、当該構築物中に含まれなかった。これらの配列はラットの配列とはわずかに異なったが、２つの配列の間の小さな非類似性のためであった。ラット断片に想到するヒト断片は２２−３２６，３０３−５０１，４７９−６５２，６７７−１０８１，及び１０２０−１２５５であった。
【０１７３】
ヒトＨＥＲ−２配列を、ヒト乳房細胞癌系列、例えば、ＳＫ−ＢＲ３（ＡＴＣＣ）から、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、標準分子生物学の方法を用いて単離する。例えば、全細胞ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標）キット（キアゲン）を用いて単離し、そしてオリゴ−ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡプールを生じさせる（チタン−ワン−チューブＰＣＲシステム（登録商標）、ロッシュ）。目的のＨＥＲ−２配列を第２工程ＰＣＲにより以下のプライマーを用いて特異的に増幅する。
【０１７４】
【表３】
【０１７５】
制限部位ＸｈｏＩ（５’）及びＳｐｅＩ（３’）を加えて、リステリアワクチンクローンへののちのクローニングを可能にさせ、そしてオーカーコドンをリバースプライマーに含ませることにより、融合蛋白質の翻訳を停止させる。ヒトＨＥＲ−２遺伝子のこれらの断片中にはＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ配列がない。ＰＣＲ産物を精製して（Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット、キアゲン）、そして中間のエシェリヒアコリベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン）にクローン化する。ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン）の形質転換の後に、コロニーを含むプラスミドをＰＣＲによりプライマーＭ１３フォワード及びＭ１３リバース（インビトロジェン）を用いて同定する。各構築物に関して一つの陽性のクローンを生育し、プラスミドＤＮＡが調製され（Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標），キアゲン）、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕ挿入物の配列を配列決定により確認する。
【０１７６】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原配列をリステリアベクターに導入するため、ｐＬＬＯ−Ｅ７をＸｈｏＩにより完全消化し、そしてＳｐｅＩにより部分消化し、それにより、Ｅ７遺伝子を除去する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列を同じ酵素で消化し、全ての消化物をアガロースゲル電気泳動により分離して、ＬＬＯ−Ｅ７ベクターとＨＥＲ−２／ｎｅｕ挿入物配列を精製する（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原配列をｐＬＬＯ−Ｅ７に連結し、そして連結された混合物によりｄ−アラニンラセマーゼ欠損エシェリヒアコリ株ＭＢ２１５９をエレクトロポレーションにより形質転換する。コロニーをＰＣＲによりＨＥＲ−２／ｎｅｕ配列に関して試験し、そしてルリアブロス（ＬＢ）培地中で増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、次に、各構築物に関して特定のバンドパターンを生じさせるＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，ＮｃｏＩによるか又はＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により確認する。プラスミドによりリステリア株Ｌｍ（ＤＡ−）をエレクトロポレーションにより形質転換し、そして個々のクローンを５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ培地中で生育させる。プラスミドの存在及び不在を、再び、制限分析により確認する。ＬＬＯ−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合蛋白質の発現と分泌を、ＴＣＡ−沈殿培養培地のウエスタンブロットにより、ポリクローナルＰＥＳＴ配列特異的抗体を用いて確認する。
【０１７７】
実施例１１
ヒトＨＥＲ−２蛋白質の断片を含むＬＬＯ−ＨＥＲ−２ワクチンの試験
ＬＬＯ−ヒトＨｅｒ−２株をマウスとヒトボランティアにおける免疫原性に関して試験する。次に、ワクチン株を、上記実施例に記載されたとおりに、ヒトＨｅｒ−２を発現する腫瘍細胞によるチャレンジに対してマウスを防御するそれらの能力に関して試験する。成功した株をＨｅｒ−２発現腫瘍を有するヒトに投与し、そして腫瘍退行を誘導するそれらの能力に関して試験する。さらに、上記株を遺伝因子又は環境因子のためにＨｅｒ−２発現癌を発症する危険からヒト被験者を防御するそれらの能力に関して試験する。当該ワクチン株は免疫原性であることがわかり、そして実質上の抗−腫瘍活性を呈することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】Ｌｍ−△−ＬＬＯ−ＨＥＲ−２−ワクチンを構築するのに用いられた、ｐＧＧ５５の模式的描写。
【図２Ａ】組換えリステリアモノサイトゲネスは、△ＬＬＯ−融合蛋白質としてＨｅｒ−２断片の各々を分泌することができる。（Ａ）ラットのＨｅｒ−２断片のマップ。
【図２Ｂ】（Ｂ）ウエスタンブロットにより融合ペプチドの分泌の確認。マーカー（レーン１）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１（レーン３）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２（レーン４）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３（レーン５）、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１（レーン６）、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ２（レーン７）。
【図３Ａ】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、各々、確立されたＮＴ−２腫瘍の腫瘍成長において休止（ｈａｌｔ）を誘導する。各データ点は、所定の時間点における１匹のマウスの最短及び最長の表面腫瘍直径の平均を表す。マウスは平均腫瘍直径が２．０ｃｍに達したときに犠牲にした；腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。２つの実験の代表的な図を示す。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３。
【図３Ｂ】（Ｂ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１。
【図４Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞はＬｍ−ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２誘導腫瘍停滞に関与する。腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２、及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ３、共にＣＤ８＋Ｔ細胞に関して枯渇されるか又は枯渇されない。
【図４Ｂ】（Ｂ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＩＣ１及びＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１、共にＣＤ８＋Ｔ細胞に関して枯渇されるか又は枯渇されない。
【図５】Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２は、テトラマー＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞において３倍増加を誘導する。ＦＶＢ／ＮマウスをＬｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ２又はＰＢＳにより免疫した。次に、脾臓細胞をＨ−２ｑＨｅｒ−２テトラマー、抗−ＣＤ８，及び抗−ＣＤ６２Ｌで染色した。
【図６】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチン構築物の各々は、同様なレベルの抗−Ｈｅｒ−２ＣＴＬ活性を誘導する。Ａ．野生型３Ｔ３（陰性対照）。Ｂ．３Ｔ３−ｎｅｕ（完全長Ｈｅｒ−２）。結果は、３重の培養の平均として表し、そして５つの実験の代表である。
【図７Ａ】ＬＭによるデリバリー及び△ＬＬＯへの融合はＨｅｒ−２ワクチンの抗−腫瘍免疫応答性を増加させる。各マウスの平均腫瘍直径を描写する。腫瘍の測定値は、所定の時間点において生存するマウスに関してのみ示される。（Ａ）Ｌｍ−△ＬＬＯ−ＥＣ１対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｂ】（Ｂ）ｐｃＤＮＡ ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬ−ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｄ】（Ｄ）ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ △ＬＬＯ−ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図７Ｅ】（Ｅ）ｐｃＤＮＡ ｎｅｕ＋ＧＭ−ＣＳＦ対ｐｃＤＮＡ ＥＣ１＋ＧＭ−ＣＳＦ。
【図８】Ｌｍ−△ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、ラットＨｅｒ−２は自己抗原として発現されるラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて、確立されたラットＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を遅延させる。
【図９】ＬＬＯ−Ｈｅｒ−２ワクチンは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的な腫瘍成長を制御する。
【図１０】ＬＬＯ−ヒトＨｅｒ−２ワクチンを創製するために用いられたヒトＨｅｒ−２断片の模式的描写。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法であって、被験者に対して、抗原の断片に融合させたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は上記組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む、方法。
【請求項２】
抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法であって、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【請求項３】
抗原が非意見者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
免疫応答性の少なくとも一部が顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れでもない上記抗原のエピトープに対して向けられたＣＤ８＋Ｔ細胞応答性である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して被験者においてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法であって、被験者に対して、抗原又はその断片へのリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片の融合物を含む組換えペプチドを投与するか又は上記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子を投与し、それにより抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導することを含む、方法。
【請求項６】
抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して被験者においてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法であって、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、それにより抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導することを含む、方法。
【請求項７】
断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項８】
断片が抗原の６分の１から半分の長さを有する、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項９】
投与の工程が、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される、請求項１、３、４、又は５記載の方法。
【請求項１０】
抗原がＨｅｒ−２，ｂｃｒ／ａｂｌ，ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７，ＭＺ２−Ｅ，ＭＡＧＥ−１及びＭＵＣ−１，ＮＹ／ＥＳＯ−１，ウイルムス腫瘍抗原、テロメラーゼ、プロテイナーゼ３、又はチロシナーゼ関連蛋白質２である、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項１１】
Ｈｅｒ−２の断片に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドであって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換えポリペプチド。
【請求項１２】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がアミノ酸２０−３２６，３０３−５０１，又は４７９−６５５からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２のアミノ酸６９０−１０８１又は１０２０−１２５５からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞外ドメインの３分の１から半分からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞内ドメインの３分の１から半分からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２のシグナル配列を含まない、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の膜貫通ドメインを含まない、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１１記載の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子。
【請求項２０】
請求項１９記載のヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態。
【請求項２１】
Ｈｅｒ−２の断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態であって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換え形態。
【請求項２２】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項２１記載のリステリア組換え形態。
【請求項２３】
請求項１１記載の組換えポリペプチド、請求項１９記載のヌクレオチド分子、請求項２０記載のリステリア組換え形態、又は請求項２１記載のリステリア組換え形態を含む、ワクチン。
【請求項２４】
被験者に対して、請求項１１記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法。
【請求項２５】
被験者に対して、請求項１１記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、被験者は抗Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項２６】
被験者に対して、請求項２２記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、被験者は抗Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項２７】
投与の工程が、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される、請求項２４、２５、又は２６記載の方法。
【請求項２８】
Ｈｅｒ−２の断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態であって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換え形態。
【請求項２９】
Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３０】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３１】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞外ドメインの３分の１から半分からなる、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３２】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞内ドメインの３分の１から半分からなる、請求項５４記載のリステリア組換え形態。
【請求項３３】
被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法であって、請求項３１記載のリステリア組換え形態を被験者に投与するが、被験者はＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項３４】
被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法であって、請求項５４記載のリステリア組換え形態を被験者に投与するが、被験者はＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項３５】
免疫応答性がＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ媒介性応答である、請求項２４、２５、２６、３３、又は３４記載の方法。
【請求項３６】
Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対免疫応答性がＨｅｒ―２蛋白質の準顕性エピトープに対する免疫応答性を含む、請求項２４、２５、２６、３３、又は３４記載の方法。
【請求項３７】
断片がＨｅｒ−２蛋白質のアミノ酸２０−３２６，３０３−５０１，又は４７９−６５５からなる、Ｈｅｒ−２の断片を含む組換えポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７記載の組換えポリペプチドを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス株。
【請求項３９】
断片がＨｅｒ−２のアミノ酸６９０−１０８１又は１０２０−１２５５からなる、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片を含む組換えポリペプチド
【請求項４０】
請求項３９記載の組換えポリペプチド発現する組換えリステリアモノサイトゲネス株。
【請求項１】
抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法であって、被験者に対して、抗原の断片に融合させたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドを投与するか又は上記組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するが、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む、方法。
【請求項２】
抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊する方法であって、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、その際、抗原は一つ又はそれより多くの顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、そして上記断片は顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れも含まず、被験者がＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより抗原発現腫瘍に対する被験者の免疫寛容を破壊することを含む。
【請求項３】
抗原が非意見者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
免疫応答性の少なくとも一部が顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの何れでもない上記抗原のエピトープに対して向けられたＣＤ８＋Ｔ細胞応答性である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して被験者においてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法であって、被験者に対して、抗原又はその断片へのリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片の融合物を含む組換えペプチドを投与するか又は上記組換えペプチドをコードするヌクレオチド分子を投与し、それにより抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導することを含む、方法。
【請求項６】
抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して被験者においてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導する方法であって、被験者に対して、組換えヌクレオチドを含むリステリアの組換え形態を投与するが、当該組換えヌクレオチドは抗原又はその断片をコードし、それにより抗原の準顕性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答性を誘導することを含む、方法。
【請求項７】
断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項８】
断片が抗原の６分の１から半分の長さを有する、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項９】
投与の工程が、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される、請求項１、３、４、又は５記載の方法。
【請求項１０】
抗原がＨｅｒ−２，ｂｃｒ／ａｂｌ，ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７，ＭＺ２−Ｅ，ＭＡＧＥ−１及びＭＵＣ−１，ＮＹ／ＥＳＯ−１，ウイルムス腫瘍抗原、テロメラーゼ、プロテイナーゼ３、又はチロシナーゼ関連蛋白質２である、請求項１、２、３、４、５、又は６記載の方法。
【請求項１１】
Ｈｅｒ−２の断片に融合されたリステリオリジン（ＬＬＯ）蛋白質のＮ末端断片を含む組換えポリペプチドであって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換えポリペプチド。
【請求項１２】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がアミノ酸２０−３２６，３０３−５０１，又は４７９−６５５からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２のアミノ酸６９０−１０８１又は１０２０−１２５５からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞外ドメインの３分の１から半分からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞内ドメインの３分の１から半分からなる、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２のシグナル配列を含まない、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の膜貫通ドメインを含まない、請求項１１記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１１記載の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子。
【請求項２０】
請求項１９記載のヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態。
【請求項２１】
Ｈｅｒ−２の断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態であって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換え形態。
【請求項２２】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項２１記載のリステリア組換え形態。
【請求項２３】
請求項１１記載の組換えポリペプチド、請求項１９記載のヌクレオチド分子、請求項２０記載のリステリア組換え形態、又は請求項２１記載のリステリア組換え形態を含む、ワクチン。
【請求項２４】
被験者に対して、請求項１１記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する、被験者において抗Ｈｅｒ−２免疫応答性を誘導する方法。
【請求項２５】
被験者に対して、請求項１１記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、被験者は抗Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項２６】
被験者に対して、請求項２２記載の組換えポリペプチド又は当該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、被験者は抗Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する、被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項２７】
投与の工程が、組換えヌクレオチドを含むか又は組換えポリペプチドを発現するリステリアの組換え形態により実施される、請求項２４、２５、又は２６記載の方法。
【請求項２８】
Ｈｅｒ−２の断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組換え形態であって、Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、組換え形態。
【請求項２９】
Ｈｅｒ−２の断片が１５０−４２０アミノ酸の長さを有する、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３０】
Ｈｅｒ−２蛋白質がヒトＨｅｒ−２蛋白質である、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３１】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞外ドメインの３分の１から半分からなる、請求項３１記載のリステリア組換え形態。
【請求項３２】
Ｈｅｒ−２蛋白質の断片がＨｅｒ−２の細胞内ドメインの３分の１から半分からなる、請求項５４記載のリステリア組換え形態。
【請求項３３】
被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法であって、請求項３１記載のリステリア組換え形態を被験者に投与するが、被験者はＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項３４】
被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法であって、請求項５４記載のリステリア組換え形態を被験者に投与するが、被験者はＨｅｒ−２発現腫瘍に対して免疫応答性をマウントし、それにより被験者においてＨｅｒ−２発現腫瘍の成長を妨害する方法。
【請求項３５】
免疫応答性がＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ媒介性応答である、請求項２４、２５、２６、３３、又は３４記載の方法。
【請求項３６】
Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対免疫応答性がＨｅｒ―２蛋白質の準顕性エピトープに対する免疫応答性を含む、請求項２４、２５、２６、３３、又は３４記載の方法。
【請求項３７】
断片がＨｅｒ−２蛋白質のアミノ酸２０−３２６，３０３−５０１，又は４７９−６５５からなる、Ｈｅｒ−２の断片を含む組換えポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３７記載の組換えポリペプチドを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス株。
【請求項３９】
断片がＨｅｒ−２のアミノ酸６９０−１０８１又は１０２０−１２５５からなる、Ｈｅｒ−２蛋白質の断片を含む組換えポリペプチド
【請求項４０】
請求項３９記載の組換えポリペプチド発現する組換えリステリアモノサイトゲネス株。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５１４１９９（Ｐ２００８−５１４１９９Ａ）
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３３５３７（Ｐ２００７−５３３５３７）
【出願日】平成１７年９月１４日（２００５．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２６８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３６５５０
【国際公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１４日（２００５．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３２６８２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３６５５０
【国際公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【出願人】（５００４２９１０３）ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア (102)
【Ｆターム（参考）】
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