リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法
【課題】本発明は、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法に関するものであり、更に詳しくは他のリン脂質と混在している状況の下で、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度で得ることができる酵素反応を利用した当該化合物の製造法に関するものである。
【解決手段】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収する。
【解決手段】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法に関するものであり、更に詳しくは他のリン脂質と混在している状況の下で、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度で得ることができる酵素反応を利用した当該化合物の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質として知られている１，２−ジアシルグリセロリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を主とする混合物として、大豆、小麦、大麦、トウモロコシ、ヒマワリ、ナタネ、落花生、綿実、キノコ等の極性脂質画分に存在している。植物リン脂質の成分としては、主にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが知られており、機能性食品として利用されている（特許文献１参照）。リン脂質は１，２−ジアシルグリセロリン脂質の状態で利用されるだけではなく、リン脂質をリゾ化したモノアシルグリセロリン脂質、例えば、植物由来のリン脂質である大豆リン脂質をリゾリン脂質に変えて利用される（特許文献２参照）。
【０００３】
即ち、大豆リン脂質に加水分解酵素としてホスホリパーゼＡ1又はＡ2を作用させて、リン脂質のアシル基を加水分解し、２−モノアシルグリセロリン脂質、又は１−モノアシルグリセロリン脂質に改質したリゾリン脂質に変える。このような大豆リゾレシチンは、通常の大豆レシチンに比べ、乳化性、タンパク質やデンプンとの結合能、離型作用が優れていることから近年その需要が増している（特許文献３参照）。
【０００４】
ところで、かかる大豆リゾレシチンの製造には、ブタ膵臓由来の酵素剤パンクレアチンや細菌に含まれるホスホリパーゼＡ2が使用されており（特許文献４参照）、ノボ・ノルディスク社で商品化されたレシターゼ１０ｌが専ら用いられている。この酵素はリン脂質の内、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を加水分解するが、ホスファチジルイノシトールには作用しない。そのために大豆リン脂質をリゾ化した際に、ホスファチジルイノシトールが加水分解されていないことから、構成リン脂質中のホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンがリゾ化されたリゾリン脂質が主要部を占める大豆リゾリン脂質が提供され、利用されている現状にある。即ち、上記大豆リゾリン脂質の特性はこれら二種の主要リン脂質で特徴づけられ、特にホスファチジルコリンのリゾ体がこの特性発現に大きく関与することから、ホスファチジルコリン含量の高いリゾ型のリン脂質を止むを得ず利用しているのが現状である。
【０００５】
また、近年、担子菌の一種であるマイタケ中のリゾホスファチジルエタノールアミンの生理活性に注目が集まっている（非特許文献１参照）。マイタケの乾燥物には５重量％程度の油脂が含まれており、このなかに０．１％程度のリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれていることがわかっている。無処理のマイタケから、リゾホスファチジルエタノールアミンを抽出した場合、たとえば、リゾホスファチジルエタノールアミンを５％含有する抽出物を調製すると、コストが市場価格とかけ離れた金額となるため、新しい製造法の確立が必要となっていた。
【０００６】
公知の技術（特許文献５参照）を用いて植物中のホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを製造する場合には、一旦ホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を回収しておき（このとき、植物中にもともと存在するリゾホスファチジルエタノールアミンが不純物として除去される）、次にホスホリパーゼＡによりリゾホスファチジルエタノールアミンを生成させる。植物中には、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンの両方が含まれるが、植物からホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を回収する際に、植物中にもともと存在するリゾホスファチジルエタノールアミンが不純物として除去されていたため、コスト的な不利が指摘されていた。
【０００７】
ホスファチジルエタノールアミンやリゾホスファチジルエタノールアミンの生理活性は、これまで明らかでなかった。しかし、近年になって、マイタケ中のリゾホスファチジルエタノールアミンが神経細胞を活性化することがわかり（非特許文献１参照）、リゾホスファチジルエタノールアミンの、ストレス性のうつ、最終的には認知症の予防への効果が期待されている。
【０００８】
リゾホスファチジルエタノールアミンは、工業的に製造する方法が確立していないため、未だ実用的なレベルでの使用に十分な量のリゾホスファチジルエタノールアミンを提供することができず、従って開発が進められていないのが現状である。又植物リン脂質の中にはスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質等生理的に有用で、応用面が期待されている物質が混在して含まれているが、その除去法はクロロホルム、アセトンを用いたシリカゲルカラム分画法（特許文献６参照）であり、工程的に煩雑であり費用面で不利であることから実用的な工業的製造方法としてはもちいられていない。
【特許文献１】特開２００７−１１０９０４
【特許文献２】特開２００６−１７４７７０
【特許文献３】特開平９−２２７８９５
【特許文献４】特開２００２−０１７３９８
【特許文献５】特表２００３−５１５３４６
【特許文献６】特開平２８２３１７４
【特許文献７】特開平７−３１４７２
【特許文献８】特開平５−０９９９１３
【非特許文献１】J Lipid Res. 47(7):1434-43. 2006
【非特許文献２】H.Pardun, Proceeding of the 2nd International Colloquimon Soya Lecithin, Brighton England, April 3(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる事情を背景にして鋭意研究の結果、為されたものであって、その解決課題とするところは、粗原料にもともと含まれているリゾホスファチジルエタノールアミンを除去せずに、ホスホリパーゼを用いて、植物リン脂質中のホスファチジルエタノールアミンから、リゾホスファチジルエタノールアミン生成させ、粗原料由来のリゾホスファチジルエタノールアミンと反応により生成したリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を回収することにより、最終的に、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得る方法を提供することにある。又、粗原料中に混在して含まれているリン脂質以外のスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質などを効率的に除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）が生産するホスホリパーゼＡ（長瀬産業株式会社で発売されている）について、その作用を鋭意研究した結果、当該酵素をリゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含む植物リン脂質に作用させるとき、その中のホスファチジルエタノールアミンは加水分解を受けて、Ｃ１位、Ｃ２位共にアシル基の離脱を起こすことを確認した。すなわち、リゾホスファチジルエタノールアミンは当該ホスホリパーゼＡの触媒毒にならないことを確認した。
【００１１】
そして、リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含む粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することにより、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得ることができることを見いだした。
【００１２】
本発明者らは、粗原料にもともと含まれているリゾホスファチジルエタノールアミンを除去せずに、ホスホリパーゼを用いて、植物リン脂質中のホスファチジルエタノールアミンから、リゾホスファチジルエタノールアミンを生成させ、粗原料由来のリゾホスファチジルエタノールアミンと反応により生成したリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を回収することにより、最終的に、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得る方法を提供する方法を見いだした。
即ち、本発明は、次の［１］〜［８］である。
［１］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［２］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、植物油の脱ガム工程で発生する含水ガム質である［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［３］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、ペースト状レシチンを加水したものである［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［４］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、キノコ、キノコの乾燥物、またはキノコの抽出物である［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［５］ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2が、細菌または動物の内蔵由来である［１］乃至［４］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［６］リゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するに先立ち、得られたリゾホスファチジルエタノールアミン生成液に対して酵素失活処理を施すことを特徴とする［１］乃至［５］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［７］エタノールを主成分とする有機溶剤を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、［１］乃至［６］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［８］アセトンを主成分とする有機溶剤を用いて不要物を除去することを特徴とする、［１］乃至［７］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【００１３】
本発明は、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法に関するものであり、更に詳しくは他のリン脂質と混在している状況の下で、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度で得ることができる酵素反応を利用した当該化合物の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、粗原料に含まれるＬＰＥをロスすることなく酵素反応を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンの濃度が高く、実用上十分安価なコストで製造できる抽出物の製造法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明方法で使用される粗原料とは、植物の原体または植物の乾燥物であって、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンを含むものならどのようなものでもよいが、粗原料中にリゾホスファチジルエタノールアミンが多く存在する場合に発明の効果が大きくなる。スフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド及びグリセロ糖脂質の１〜３種を含んでいるものでもよい。これらは通常は水を含んでいるが、場合によっては乾燥物でもよく、それらを総称して本発明は粗原料と称する。具体的には例えば、大豆、小麦、大麦、トウモロコシ、ヒマワリ、ナタネ、落花生、綿実、キノコ等の植物又はその乾燥物で上記の化学成分を含むものを使用することができる。最も好ましい原料はペースト状大豆リン脂質または乾燥マイタケであるが、これらは公知方法で容易に製造できる。
【００１６】
本発明で使用されるホスホリパーゼＡ1および／またはホスホリパーゼＡ2は公知の酵素であって、例えば特許文献７に記載の方法に従って容易に製造することが出来る。酵素の起源はアスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）または動物の内臓、たとえば豚の膵臓のうちの１種以上であり、これらを単独または組み合わせて使用することができる。これらの酵素の好ましい反応条件はｐＨ４．０〜８．０で温度約４０℃乃至７０℃程度であるから、反応条件をそのように設定するのが好ましい。ｐＨ値の調節には、自体公知の手段に従って、アルカリ水溶液（例えばＮａＯＨ水溶液）、酸性水溶液（例えば１Ｎ塩酸）を使用してよい。又、反応液からスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質の１種以上を採取する場合は、上記４種のジアシルグリセロリン脂質のいずれもがそれぞれ対応するモノアシルグリセロリン脂質を経由して対応するグリセロホスホリル体にまで加水分解されるまで加水分解反応を継続させるのが好ましい。反応終了後、自体公知の手段に従って、目的物を反応混合物から採取することが出来る。本発明の好ましい実施の態様を以下に説明する。％部は特にことわりのない限り、それぞれ重量％、重量部である。
【００１７】
本発明の粗原料を、適切な組成の含水エタノールで分画すると、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンのうち、一方が溶解し、一方を不溶物とすることができる。デカンティングや遠心分離により上清と沈殿を生じせしめた後、上清と沈殿のうち、リゾホスファチジルエタノールアミンを多く含む方を回収することにより、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度化することができる。本発明で用いる含水エタノールの水分は０．５容量％乃至５０容量％であり、適切な水分は、粗原料の状態により決定することができる。又、粗原料をヘキサンに溶解し、水性エタノールで分画すると、水性エタノール区分に糖脂質類が残留することから（非特許文献２参照）、この画分を除去してリン脂質の含有量を高めることもできる。いずれにせよ、前処理として、粗原料を適宜分画し、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する分画物を得る操作により、効率的にリゾホスファチジルエタノールアミンの純度を高めることができる。
【００１８】
本発明における酵素反応は、酵素と基質を水または含水エタノール中で接触させることにより行われ、必要に応じて非イオン性有機溶媒（例えばジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類、ヘキサン、ベンゼン、トルエンのような炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ブチルのようなエステル類等）共存下で行うことも可能である。又、水性又は湿潤体には、必要に応じて、酸、アルカリ又は緩衝液を加えて至適ｐＨに調整することが反応を促進することになる。本酵素の添加量は反応温度、反応時間、反応時のｐＨ、基質の性状や品質、夾雑する物質、要求される効果の程度等により異なるが、好適には１，０００ユニット／gの酵素を用いて、基質に対して０．０５重量%乃至５重量％である。
【００１９】
本酵素の反応温度は４０℃乃至７０℃（好適には４５℃乃至60℃）であり、反応に要する時間は、反応温度、ｐＨ、基質の種類により異なるが、通常１時間乃至６時間である。
【００２０】
本発明において、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するために用いるエタノールを主成分とする有機溶剤は、エタノールにアセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上を一定量添加したものである。このうち、水を添加した含水エタノールが安全性、回収時のコスト等の面で最も適している。エタノールに添加するアセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量は抽出原料によって異なるが、アセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量が１容量％未満または５０容量％よりも多い場合は、リゾホスファチジルエタノールアミン以外の成分の混入が多くなり、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度に含有する抽出物を得ることができない。
【００２１】
本発明において、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションから不純物を除去するために用いるアセトンを主成分とする有機溶剤は、アセトンにエタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上を一定量添加したものである。このうちエタノールにアセトン、ヘキサンまたは水のなかでは、エタノールを添加した含エタノールアセトンまたは、純アセトンが安全性、回収時のコスト等の面で最も適している。アセトンに添加するエタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量は抽出原料によって異なるが、エタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量が５０容量％よりも多い場合は、回収するリゾホスファチジルエタノールアミンの有機溶媒へ混入が多くなり、結果、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度に含有する抽出物を得ることができない。
【００２２】
次に、本発明を試験例、実施例、比較例にてさらに詳しく説明する。
試験例（反応物の分析）
反応の進行の確認は公知の方法（特許文献８参照）に従った。すなわち、一次展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：7モルのアンモニア水（130:70:8）、二次展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：酢酸：ギ酸（50:30:4.5:6.5）を用いることにより各リン脂質のリゾ体を分離した。発色剤としてリン酸、硫酸銅、水の混合物を用いた。各リン脂質のリゾ体の標品と比較することにより、各リン脂質を同定し、デンシトメーターを用いて定量（暫定値）を行った。
【００２３】
以下の実施例における百分率は何れも重量基準で示されるものであり、さらにリン脂質及びそのリゾ化物の略号としてＰＣ：ホスファチジルコリン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、ＰＩ：ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ：ホスファチジン酸、ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＬＰＩ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸を使用した。
【実施例１】
【００２４】
マイタケ石突１００ｋｇを温風乾燥機｛サンエー技研（株）製｝で乾燥してマイタケ石突乾燥物１０ｋｇを得た。マイタケ石突乾燥物１０ｋｇには５８０ｇの脂質（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v 可溶物）が含まれており、脂質中のリン脂質含量は６０ｇ、ＰＥ含量は３８ｇ、ＬＰＥ含量は２０ｇであった。マイタケ石突乾燥物に５０容量％含水エタノール１００ｌを添加し４０℃で８時間攪拌してエキス成分の抽出を行った。次にリポモッド６９９ｌ（（長瀬産業（株））１００マイクロｌと１００ｍM換算のＣａＣｌ２を添加し、４０℃で２時間攪拌し、加水分解反応を行った後、濾過により残滓を除去した。濾過する際に、未反応のＰＥの大部分は沈殿物として除去された。濾液を遠心薄膜濃縮器（大河原製作所）で濃縮後、真空凍結乾燥機で乾燥し、マイタケ抽出物８５ｇが得られた。マイタケ抽出物には３９ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は４５．９重量％）。
【実施例２】
【００２５】
実施例１で得たマイタケ抽出物８５ｇにアセトン４３５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌して、抽出物を溶剤中に完全に分散した。次に遠心分離により固液分離し、沈殿物を回収した。回収した沈殿物を減圧乾燥して非揮発物５２ｇを得た。沈殿物中には３８ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は７３．１％）。
【実施例３】
【００２６】
精製大豆レシチン（ツルーレシチン社製、SLP―ＰＩパウダー；ホスファチジルエタノールアミン３１．９重量％、リゾホスファチジルエタノールアミン２重量％）3gに精製水２００ｍＬを加え、室温で１時間攪拌した。この溶液に別途調製した塩化カルシウム水溶液（試薬特級 無水0,18g/5mL）とデオキシコール酸ナトリウム（生化学用試薬0.34g/50mL）を加え、室温で30分間攪拌した。その後、水冷下で15分間、8000rpmでホモジナイズし基質溶液とした。基質溶液２０ｍｌにリソナーゼ（サンヨーファイン製）の１０単位に相当する量を添加して６０℃で加水分解反応を行った。１時間ごとにサンプリングを行い、試験例の方法で分析を行った結果、ホスファチジルエタノールアミンが減少してリゾホスファチジルエタノールアミンが増加し、加水分解反応が進行することがわかった。６時間後に反応を止め、真空凍結乾燥により水分を蒸発せしめて反応物乾燥品０．３ｇを得た。反応物乾燥品に１．５ｇのアセトンを添加して分散後、遠心分離（８０００ｒｐｍ：２０分）を行った。遠心分離後に上清を除去し、下層に残ったアセトンを真空乾燥により除去し、反応物を得た。試験例の方法で定量した結果、反応物中のホスファチジルエタノールアミンの含有量は３．５重量％リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量は２５．０重量％であった。上清中にはリゾホスファチジルエタノールアミンは認められなかった。
【００２７】
（比較例１）
実施例１の方法で調製したマイタケ石突乾燥物に５０容量％含水エタノール１００ｌを添加し４０℃で８時間攪拌してエキス成分の抽出を行った後、濾過により残滓を除去した。濾過する際に、ＰＥの大部分は沈殿物として除去された。濾液を遠心薄膜濃縮器（大河原製作所）で濃縮後、真空凍結乾燥機で乾燥し、マイタケ抽出物７０ｇが得られた。マイタケ抽出物には１１ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は１５．７％）。
【００２８】
（比較例２）
実施例１で得たマイタケ抽出物８５ｇにエタノール４３５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌して、抽出物を溶剤中に完全に分散した。次に遠心分離により固液分離し、沈殿物を回収した。回収した沈殿物を減圧乾燥して沈殿物６０ｇを得た。沈殿物中には８ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は１３．３％）。
【００２９】
（比較例３）
特表2003-515346の実施例１に記載された方法を用いて、本願の実施例１記載のマイタケ石突乾燥物を処理した。まず実施例１に記載した、マイタケ石突乾燥物１０ｋｇを溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v）５０ｋｇで処理してマイタケ脂質５８０ｇを得た。マイタケ脂質にはＰＥが３８ｇ、ＬＰＥが２０ｇ含まれていた。マイタケ脂質８０ｇ（ＰＥ５．２ｇ、ＬＰＥ２．８ｇ含有）を８０ｍｌのクロロホルムに溶かした。シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、７０−２３０ｍｅｓｈ）４５０ｇを１，０００ｍｌのクロロホルムに加えた後、７０ｍｍ×７００ｍｍのガラスカラムに充填した。このカラムに、上記で溶解したマイタケ脂質溶液を投入した後、クロロホルム５００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒９５：５）１０００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒９０：１０）１，５００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒８５：１５）２，０００ｍｌで溶出しながら、溶出されるリン脂質を薄層クロマトグラフィーで調べた。投入したマイタケ脂質溶液中のLPEは、シリカゲルに吸着されたため、回収できなかった。そこでホスファチジルエタノールアミンが溶出される分画だけを集めて、回転式真空エバポレータ(rotary vacuum evaporator)で５０℃で濃縮した。投入したマイタケ脂質溶液中のLPEは、シリカゲルに吸着されたため、回収できなかった。得られたホスファチジルエタノールアミンを本願の試験例に記載の方法で分析した結果、純度７６％のホスファチジルエタノールアミン６．５ｇが得られた（ＰＥの収率９６％）。マイタケ石突乾燥物から得た脂質（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v 可溶物）６．５ｇを１５０ｍｌのジエルエーテルに溶かした後、ここにＣａＣｌ２が１００ｍＭ含有された酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、１００ｍＭ）２０ｍｌを添加した。この溶液に５ｍｌのレシターゼ（１０，０００ＩＵ／ｍｌ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）を添加し、３０℃で１３時間激しく攪拌しながら反応させる。溶液を静置させた後、上澄み液の分離(decantation)を行い、溶媒及び生成された脂肪酸を除去した。沈殿部分を常温で２００ｍｌのヘキサン：エタノール：水（≒１：１：０．３）の混合溶液で抽出する。下部の水層を除去し、ここに５０ｍｌのエタノールを添加して、常温でろ過する。ろ過物にさらにヘキサン：エタノール（≒１：１）溶液を１００ｍｌ処理し、ろ過し、乾燥する。得られた乾燥物を本願の試験例に記載の方法で分析した結果、純度９８％以上のＬＰＥ ３．０ｇが得られた。マイタケ石突乾燥物１０ｋｇから得られた脂質５８０ｇのすべてを処理した場合には２１．８ｇ（５８０ｇ／８０ｇ×３．０ｇ）のＬＰＥが得られることになる。本願の実施例１で得られたマイタケ石突乾燥物１０ｋｇから得られたＬＰＥは３９ｇであり、本願の方法の収率が優れていることがわかる。
【００３０】
（比較例４）
実施例１の基質溶液２０ｍｌを真空凍結乾燥して乾燥品０．３ｇを得た。乾燥品に１．５ｇのアセトンを添加して分散後、遠心分離（８０００ｒｐｍ：２０分）を行った。遠心分離後に上清を除去し、下層に残ったアセトンを真空乾燥により除去し、アセトン不溶物を得た。試験例の方法で定量した結果、アセトン不溶物のホスファチジルエタノールアミンの含有量は３０．２重量％リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量は２．０重量％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明で得られる高純度のリゾホスファチジルエタノールアミンは神経を活性化する作用が期待されている。すなわち、機能性食品や医薬品として、利用される可能性がある。また、動物用の添加物として使用される可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法に関するものであり、更に詳しくは他のリン脂質と混在している状況の下で、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度で得ることができる酵素反応を利用した当該化合物の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質として知られている１，２−ジアシルグリセロリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を主とする混合物として、大豆、小麦、大麦、トウモロコシ、ヒマワリ、ナタネ、落花生、綿実、キノコ等の極性脂質画分に存在している。植物リン脂質の成分としては、主にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが知られており、機能性食品として利用されている（特許文献１参照）。リン脂質は１，２−ジアシルグリセロリン脂質の状態で利用されるだけではなく、リン脂質をリゾ化したモノアシルグリセロリン脂質、例えば、植物由来のリン脂質である大豆リン脂質をリゾリン脂質に変えて利用される（特許文献２参照）。
【０００３】
即ち、大豆リン脂質に加水分解酵素としてホスホリパーゼＡ1又はＡ2を作用させて、リン脂質のアシル基を加水分解し、２−モノアシルグリセロリン脂質、又は１−モノアシルグリセロリン脂質に改質したリゾリン脂質に変える。このような大豆リゾレシチンは、通常の大豆レシチンに比べ、乳化性、タンパク質やデンプンとの結合能、離型作用が優れていることから近年その需要が増している（特許文献３参照）。
【０００４】
ところで、かかる大豆リゾレシチンの製造には、ブタ膵臓由来の酵素剤パンクレアチンや細菌に含まれるホスホリパーゼＡ2が使用されており（特許文献４参照）、ノボ・ノルディスク社で商品化されたレシターゼ１０ｌが専ら用いられている。この酵素はリン脂質の内、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸を加水分解するが、ホスファチジルイノシトールには作用しない。そのために大豆リン脂質をリゾ化した際に、ホスファチジルイノシトールが加水分解されていないことから、構成リン脂質中のホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンがリゾ化されたリゾリン脂質が主要部を占める大豆リゾリン脂質が提供され、利用されている現状にある。即ち、上記大豆リゾリン脂質の特性はこれら二種の主要リン脂質で特徴づけられ、特にホスファチジルコリンのリゾ体がこの特性発現に大きく関与することから、ホスファチジルコリン含量の高いリゾ型のリン脂質を止むを得ず利用しているのが現状である。
【０００５】
また、近年、担子菌の一種であるマイタケ中のリゾホスファチジルエタノールアミンの生理活性に注目が集まっている（非特許文献１参照）。マイタケの乾燥物には５重量％程度の油脂が含まれており、このなかに０．１％程度のリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれていることがわかっている。無処理のマイタケから、リゾホスファチジルエタノールアミンを抽出した場合、たとえば、リゾホスファチジルエタノールアミンを５％含有する抽出物を調製すると、コストが市場価格とかけ離れた金額となるため、新しい製造法の確立が必要となっていた。
【０００６】
公知の技術（特許文献５参照）を用いて植物中のホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを製造する場合には、一旦ホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を回収しておき（このとき、植物中にもともと存在するリゾホスファチジルエタノールアミンが不純物として除去される）、次にホスホリパーゼＡによりリゾホスファチジルエタノールアミンを生成させる。植物中には、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンの両方が含まれるが、植物からホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を回収する際に、植物中にもともと存在するリゾホスファチジルエタノールアミンが不純物として除去されていたため、コスト的な不利が指摘されていた。
【０００７】
ホスファチジルエタノールアミンやリゾホスファチジルエタノールアミンの生理活性は、これまで明らかでなかった。しかし、近年になって、マイタケ中のリゾホスファチジルエタノールアミンが神経細胞を活性化することがわかり（非特許文献１参照）、リゾホスファチジルエタノールアミンの、ストレス性のうつ、最終的には認知症の予防への効果が期待されている。
【０００８】
リゾホスファチジルエタノールアミンは、工業的に製造する方法が確立していないため、未だ実用的なレベルでの使用に十分な量のリゾホスファチジルエタノールアミンを提供することができず、従って開発が進められていないのが現状である。又植物リン脂質の中にはスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質等生理的に有用で、応用面が期待されている物質が混在して含まれているが、その除去法はクロロホルム、アセトンを用いたシリカゲルカラム分画法（特許文献６参照）であり、工程的に煩雑であり費用面で不利であることから実用的な工業的製造方法としてはもちいられていない。
【特許文献１】特開２００７−１１０９０４
【特許文献２】特開２００６−１７４７７０
【特許文献３】特開平９−２２７８９５
【特許文献４】特開２００２−０１７３９８
【特許文献５】特表２００３−５１５３４６
【特許文献６】特開平２８２３１７４
【特許文献７】特開平７−３１４７２
【特許文献８】特開平５−０９９９１３
【非特許文献１】J Lipid Res. 47(7):1434-43. 2006
【非特許文献２】H.Pardun, Proceeding of the 2nd International Colloquimon Soya Lecithin, Brighton England, April 3(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる事情を背景にして鋭意研究の結果、為されたものであって、その解決課題とするところは、粗原料にもともと含まれているリゾホスファチジルエタノールアミンを除去せずに、ホスホリパーゼを用いて、植物リン脂質中のホスファチジルエタノールアミンから、リゾホスファチジルエタノールアミン生成させ、粗原料由来のリゾホスファチジルエタノールアミンと反応により生成したリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を回収することにより、最終的に、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得る方法を提供することにある。又、粗原料中に混在して含まれているリン脂質以外のスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質などを効率的に除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）が生産するホスホリパーゼＡ（長瀬産業株式会社で発売されている）について、その作用を鋭意研究した結果、当該酵素をリゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含む植物リン脂質に作用させるとき、その中のホスファチジルエタノールアミンは加水分解を受けて、Ｃ１位、Ｃ２位共にアシル基の離脱を起こすことを確認した。すなわち、リゾホスファチジルエタノールアミンは当該ホスホリパーゼＡの触媒毒にならないことを確認した。
【００１１】
そして、リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含む粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することにより、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得ることができることを見いだした。
【００１２】
本発明者らは、粗原料にもともと含まれているリゾホスファチジルエタノールアミンを除去せずに、ホスホリパーゼを用いて、植物リン脂質中のホスファチジルエタノールアミンから、リゾホスファチジルエタノールアミンを生成させ、粗原料由来のリゾホスファチジルエタノールアミンと反応により生成したリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を回収することにより、最終的に、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度、高収率で得る方法を提供する方法を見いだした。
即ち、本発明は、次の［１］〜［８］である。
［１］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［２］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、植物油の脱ガム工程で発生する含水ガム質である［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［３］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、ペースト状レシチンを加水したものである［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［４］リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、キノコ、キノコの乾燥物、またはキノコの抽出物である［１］記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［５］ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2が、細菌または動物の内蔵由来である［１］乃至［４］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［６］リゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するに先立ち、得られたリゾホスファチジルエタノールアミン生成液に対して酵素失活処理を施すことを特徴とする［１］乃至［５］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［７］エタノールを主成分とする有機溶剤を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、［１］乃至［６］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
［８］アセトンを主成分とする有機溶剤を用いて不要物を除去することを特徴とする、［１］乃至［７］の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【００１３】
本発明は、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造法に関するものであり、更に詳しくは他のリン脂質と混在している状況の下で、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度で得ることができる酵素反応を利用した当該化合物の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、粗原料に含まれるＬＰＥをロスすることなく酵素反応を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンの濃度が高く、実用上十分安価なコストで製造できる抽出物の製造法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明方法で使用される粗原料とは、植物の原体または植物の乾燥物であって、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンを含むものならどのようなものでもよいが、粗原料中にリゾホスファチジルエタノールアミンが多く存在する場合に発明の効果が大きくなる。スフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド及びグリセロ糖脂質の１〜３種を含んでいるものでもよい。これらは通常は水を含んでいるが、場合によっては乾燥物でもよく、それらを総称して本発明は粗原料と称する。具体的には例えば、大豆、小麦、大麦、トウモロコシ、ヒマワリ、ナタネ、落花生、綿実、キノコ等の植物又はその乾燥物で上記の化学成分を含むものを使用することができる。最も好ましい原料はペースト状大豆リン脂質または乾燥マイタケであるが、これらは公知方法で容易に製造できる。
【００１６】
本発明で使用されるホスホリパーゼＡ1および／またはホスホリパーゼＡ2は公知の酵素であって、例えば特許文献７に記載の方法に従って容易に製造することが出来る。酵素の起源はアスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）または動物の内臓、たとえば豚の膵臓のうちの１種以上であり、これらを単独または組み合わせて使用することができる。これらの酵素の好ましい反応条件はｐＨ４．０〜８．０で温度約４０℃乃至７０℃程度であるから、反応条件をそのように設定するのが好ましい。ｐＨ値の調節には、自体公知の手段に従って、アルカリ水溶液（例えばＮａＯＨ水溶液）、酸性水溶液（例えば１Ｎ塩酸）を使用してよい。又、反応液からスフィンゴ糖脂質、ステリルグリコシド、グリセロ糖脂質の１種以上を採取する場合は、上記４種のジアシルグリセロリン脂質のいずれもがそれぞれ対応するモノアシルグリセロリン脂質を経由して対応するグリセロホスホリル体にまで加水分解されるまで加水分解反応を継続させるのが好ましい。反応終了後、自体公知の手段に従って、目的物を反応混合物から採取することが出来る。本発明の好ましい実施の態様を以下に説明する。％部は特にことわりのない限り、それぞれ重量％、重量部である。
【００１７】
本発明の粗原料を、適切な組成の含水エタノールで分画すると、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンのうち、一方が溶解し、一方を不溶物とすることができる。デカンティングや遠心分離により上清と沈殿を生じせしめた後、上清と沈殿のうち、リゾホスファチジルエタノールアミンを多く含む方を回収することにより、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度化することができる。本発明で用いる含水エタノールの水分は０．５容量％乃至５０容量％であり、適切な水分は、粗原料の状態により決定することができる。又、粗原料をヘキサンに溶解し、水性エタノールで分画すると、水性エタノール区分に糖脂質類が残留することから（非特許文献２参照）、この画分を除去してリン脂質の含有量を高めることもできる。いずれにせよ、前処理として、粗原料を適宜分画し、ホスファチジルエタノールアミンとリゾホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する分画物を得る操作により、効率的にリゾホスファチジルエタノールアミンの純度を高めることができる。
【００１８】
本発明における酵素反応は、酵素と基質を水または含水エタノール中で接触させることにより行われ、必要に応じて非イオン性有機溶媒（例えばジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類、ヘキサン、ベンゼン、トルエンのような炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ブチルのようなエステル類等）共存下で行うことも可能である。又、水性又は湿潤体には、必要に応じて、酸、アルカリ又は緩衝液を加えて至適ｐＨに調整することが反応を促進することになる。本酵素の添加量は反応温度、反応時間、反応時のｐＨ、基質の性状や品質、夾雑する物質、要求される効果の程度等により異なるが、好適には１，０００ユニット／gの酵素を用いて、基質に対して０．０５重量%乃至５重量％である。
【００１９】
本酵素の反応温度は４０℃乃至７０℃（好適には４５℃乃至60℃）であり、反応に要する時間は、反応温度、ｐＨ、基質の種類により異なるが、通常１時間乃至６時間である。
【００２０】
本発明において、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するために用いるエタノールを主成分とする有機溶剤は、エタノールにアセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上を一定量添加したものである。このうち、水を添加した含水エタノールが安全性、回収時のコスト等の面で最も適している。エタノールに添加するアセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量は抽出原料によって異なるが、アセトン、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量が１容量％未満または５０容量％よりも多い場合は、リゾホスファチジルエタノールアミン以外の成分の混入が多くなり、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度に含有する抽出物を得ることができない。
【００２１】
本発明において、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションから不純物を除去するために用いるアセトンを主成分とする有機溶剤は、アセトンにエタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上を一定量添加したものである。このうちエタノールにアセトン、ヘキサンまたは水のなかでは、エタノールを添加した含エタノールアセトンまたは、純アセトンが安全性、回収時のコスト等の面で最も適している。アセトンに添加するエタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量は抽出原料によって異なるが、エタノール、ヘキサンまたは水のうちの１種類または２種以上の量が５０容量％よりも多い場合は、回収するリゾホスファチジルエタノールアミンの有機溶媒へ混入が多くなり、結果、リゾホスファチジルエタノールアミンを高純度に含有する抽出物を得ることができない。
【００２２】
次に、本発明を試験例、実施例、比較例にてさらに詳しく説明する。
試験例（反応物の分析）
反応の進行の確認は公知の方法（特許文献８参照）に従った。すなわち、一次展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：7モルのアンモニア水（130:70:8）、二次展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：酢酸：ギ酸（50:30:4.5:6.5）を用いることにより各リン脂質のリゾ体を分離した。発色剤としてリン酸、硫酸銅、水の混合物を用いた。各リン脂質のリゾ体の標品と比較することにより、各リン脂質を同定し、デンシトメーターを用いて定量（暫定値）を行った。
【００２３】
以下の実施例における百分率は何れも重量基準で示されるものであり、さらにリン脂質及びそのリゾ化物の略号としてＰＣ：ホスファチジルコリン、ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン、ＰＩ：ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ：ホスファチジン酸、ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン、ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＬＰＩ：リゾホスファチジルエタノールアミン、ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸を使用した。
【実施例１】
【００２４】
マイタケ石突１００ｋｇを温風乾燥機｛サンエー技研（株）製｝で乾燥してマイタケ石突乾燥物１０ｋｇを得た。マイタケ石突乾燥物１０ｋｇには５８０ｇの脂質（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v 可溶物）が含まれており、脂質中のリン脂質含量は６０ｇ、ＰＥ含量は３８ｇ、ＬＰＥ含量は２０ｇであった。マイタケ石突乾燥物に５０容量％含水エタノール１００ｌを添加し４０℃で８時間攪拌してエキス成分の抽出を行った。次にリポモッド６９９ｌ（（長瀬産業（株））１００マイクロｌと１００ｍM換算のＣａＣｌ２を添加し、４０℃で２時間攪拌し、加水分解反応を行った後、濾過により残滓を除去した。濾過する際に、未反応のＰＥの大部分は沈殿物として除去された。濾液を遠心薄膜濃縮器（大河原製作所）で濃縮後、真空凍結乾燥機で乾燥し、マイタケ抽出物８５ｇが得られた。マイタケ抽出物には３９ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は４５．９重量％）。
【実施例２】
【００２５】
実施例１で得たマイタケ抽出物８５ｇにアセトン４３５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌して、抽出物を溶剤中に完全に分散した。次に遠心分離により固液分離し、沈殿物を回収した。回収した沈殿物を減圧乾燥して非揮発物５２ｇを得た。沈殿物中には３８ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は７３．１％）。
【実施例３】
【００２６】
精製大豆レシチン（ツルーレシチン社製、SLP―ＰＩパウダー；ホスファチジルエタノールアミン３１．９重量％、リゾホスファチジルエタノールアミン２重量％）3gに精製水２００ｍＬを加え、室温で１時間攪拌した。この溶液に別途調製した塩化カルシウム水溶液（試薬特級 無水0,18g/5mL）とデオキシコール酸ナトリウム（生化学用試薬0.34g/50mL）を加え、室温で30分間攪拌した。その後、水冷下で15分間、8000rpmでホモジナイズし基質溶液とした。基質溶液２０ｍｌにリソナーゼ（サンヨーファイン製）の１０単位に相当する量を添加して６０℃で加水分解反応を行った。１時間ごとにサンプリングを行い、試験例の方法で分析を行った結果、ホスファチジルエタノールアミンが減少してリゾホスファチジルエタノールアミンが増加し、加水分解反応が進行することがわかった。６時間後に反応を止め、真空凍結乾燥により水分を蒸発せしめて反応物乾燥品０．３ｇを得た。反応物乾燥品に１．５ｇのアセトンを添加して分散後、遠心分離（８０００ｒｐｍ：２０分）を行った。遠心分離後に上清を除去し、下層に残ったアセトンを真空乾燥により除去し、反応物を得た。試験例の方法で定量した結果、反応物中のホスファチジルエタノールアミンの含有量は３．５重量％リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量は２５．０重量％であった。上清中にはリゾホスファチジルエタノールアミンは認められなかった。
【００２７】
（比較例１）
実施例１の方法で調製したマイタケ石突乾燥物に５０容量％含水エタノール１００ｌを添加し４０℃で８時間攪拌してエキス成分の抽出を行った後、濾過により残滓を除去した。濾過する際に、ＰＥの大部分は沈殿物として除去された。濾液を遠心薄膜濃縮器（大河原製作所）で濃縮後、真空凍結乾燥機で乾燥し、マイタケ抽出物７０ｇが得られた。マイタケ抽出物には１１ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は１５．７％）。
【００２８】
（比較例２）
実施例１で得たマイタケ抽出物８５ｇにエタノール４３５ｍｌを加え、室温で２時間攪拌して、抽出物を溶剤中に完全に分散した。次に遠心分離により固液分離し、沈殿物を回収した。回収した沈殿物を減圧乾燥して沈殿物６０ｇを得た。沈殿物中には８ｇのＬＰＥが含まれていた（ＬＰＥ含量は１３．３％）。
【００２９】
（比較例３）
特表2003-515346の実施例１に記載された方法を用いて、本願の実施例１記載のマイタケ石突乾燥物を処理した。まず実施例１に記載した、マイタケ石突乾燥物１０ｋｇを溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v）５０ｋｇで処理してマイタケ脂質５８０ｇを得た。マイタケ脂質にはＰＥが３８ｇ、ＬＰＥが２０ｇ含まれていた。マイタケ脂質８０ｇ（ＰＥ５．２ｇ、ＬＰＥ２．８ｇ含有）を８０ｍｌのクロロホルムに溶かした。シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、７０−２３０ｍｅｓｈ）４５０ｇを１，０００ｍｌのクロロホルムに加えた後、７０ｍｍ×７００ｍｍのガラスカラムに充填した。このカラムに、上記で溶解したマイタケ脂質溶液を投入した後、クロロホルム５００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒９５：５）１０００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒９０：１０）１，５００ｍｌ、クロロホルム：メタノール混合溶液（≒８５：１５）２，０００ｍｌで溶出しながら、溶出されるリン脂質を薄層クロマトグラフィーで調べた。投入したマイタケ脂質溶液中のLPEは、シリカゲルに吸着されたため、回収できなかった。そこでホスファチジルエタノールアミンが溶出される分画だけを集めて、回転式真空エバポレータ(rotary vacuum evaporator)で５０℃で濃縮した。投入したマイタケ脂質溶液中のLPEは、シリカゲルに吸着されたため、回収できなかった。得られたホスファチジルエタノールアミンを本願の試験例に記載の方法で分析した結果、純度７６％のホスファチジルエタノールアミン６．５ｇが得られた（ＰＥの収率９６％）。マイタケ石突乾燥物から得た脂質（クロロホルム：メタノール＝２：１ v/v 可溶物）６．５ｇを１５０ｍｌのジエルエーテルに溶かした後、ここにＣａＣｌ２が１００ｍＭ含有された酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、１００ｍＭ）２０ｍｌを添加した。この溶液に５ｍｌのレシターゼ（１０，０００ＩＵ／ｍｌ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社）を添加し、３０℃で１３時間激しく攪拌しながら反応させる。溶液を静置させた後、上澄み液の分離(decantation)を行い、溶媒及び生成された脂肪酸を除去した。沈殿部分を常温で２００ｍｌのヘキサン：エタノール：水（≒１：１：０．３）の混合溶液で抽出する。下部の水層を除去し、ここに５０ｍｌのエタノールを添加して、常温でろ過する。ろ過物にさらにヘキサン：エタノール（≒１：１）溶液を１００ｍｌ処理し、ろ過し、乾燥する。得られた乾燥物を本願の試験例に記載の方法で分析した結果、純度９８％以上のＬＰＥ ３．０ｇが得られた。マイタケ石突乾燥物１０ｋｇから得られた脂質５８０ｇのすべてを処理した場合には２１．８ｇ（５８０ｇ／８０ｇ×３．０ｇ）のＬＰＥが得られることになる。本願の実施例１で得られたマイタケ石突乾燥物１０ｋｇから得られたＬＰＥは３９ｇであり、本願の方法の収率が優れていることがわかる。
【００３０】
（比較例４）
実施例１の基質溶液２０ｍｌを真空凍結乾燥して乾燥品０．３ｇを得た。乾燥品に１．５ｇのアセトンを添加して分散後、遠心分離（８０００ｒｐｍ：２０分）を行った。遠心分離後に上清を除去し、下層に残ったアセトンを真空乾燥により除去し、アセトン不溶物を得た。試験例の方法で定量した結果、アセトン不溶物のホスファチジルエタノールアミンの含有量は３０．２重量％リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量は２．０重量％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明で得られる高純度のリゾホスファチジルエタノールアミンは神経を活性化する作用が期待されている。すなわち、機能性食品や医薬品として、利用される可能性がある。また、動物用の添加物として使用される可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項２】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、植物油の脱ガム工程で発生する含水ガム質である請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項３】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、ペースト状レシチンを加水したものである請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項４】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、キノコまたはキノコの乾燥物である請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項５】
ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2が、細菌または動物の内蔵由来である請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項６】
リゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するに先立ち、得られたリゾホスファチジルエタノールアミン生成液に対して酵素失活処理を施すことを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項７】
エタノールを主成分とする有機溶剤を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収し、同時にホスファチジルエタノールアミン含む不要物を除去することを特徴とする、請求項１乃至請求項６の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項８】
アセトンを主成分とする有機溶剤を用いてホスファチジルエタノールアミン含む不要物を除去することを特徴とする、請求項１乃至請求項７の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項１】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンの両方を含有する粗原料に、ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2 からなる加水分解酵素をあらかじめ作用させて、ホスファチジルエタノールアミンからリゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、全リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収することを特徴とする、高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項２】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、植物油の脱ガム工程で発生する含水ガム質である請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項３】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、ペースト状レシチンを加水したものである請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項４】
リゾホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルエタノールアミンを含有する粗原料が、キノコまたはキノコの乾燥物である請求項１記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項５】
ホスホリパーゼＡ1 またはＡ2が、細菌または動物の内蔵由来である請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項６】
リゾホスファチジルエタノールアミンを生成せしめた後、リゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収するに先立ち、得られたリゾホスファチジルエタノールアミン生成液に対して酵素失活処理を施すことを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項７】
エタノールを主成分とする有機溶剤を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンを含むフラクションを回収し、同時にホスファチジルエタノールアミン含む不要物を除去することを特徴とする、請求項１乃至請求項６の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【請求項８】
アセトンを主成分とする有機溶剤を用いてホスファチジルエタノールアミン含む不要物を除去することを特徴とする、請求項１乃至請求項７の何れか一項に記載の高純度リゾホスファチジルエタノールアミンの製造方法。
【公開番号】特開２００９−１４８２４４（Ｐ２００９−１４８２４４Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５２３６４（Ｐ２００８−１５２３６４）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【出願人】（５９１０３２７０３）群馬県 (144)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【出願人】（５９１０３２７０３）群馬県 (144)
【Ｆターム（参考）】
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