リンパ球の製造方法
【課題】
医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法を提供すること。
【解決手段】
フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインもしくはその一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が極めて高く、例えば、養子免疫療法に好適に使用されることから、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法を提供すること。
【解決手段】
フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインもしくはその一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養する工程を包含するリンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が極めて高く、例えば、養子免疫療法に好適に使用されることから、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
【０００４】
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特にヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている（例えば、非特許文献１および２）。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
【０００５】
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
【０００６】
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
【０００７】
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（例えば、非特許文献６）、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法（例えば、非特許文献７）が報告されている。
【０００８】
さらに、特許文献１にはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
【０００９】
また、特許文献２には改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。
【００１０】
ＣＴＬ以外の疾病の治療に有効なリンパ球としては、例えば、リンフォカイン活性化細胞（例えば、非特許文献３）、高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、非特許文献４および５）が知られている。
【００１１】
リンフォカイン活性化細胞は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。リンフォカイン活性化細胞の培養工程において、抗ＣＤ３抗体を加えることにより、さらにリンフォカイン活性化細胞の増殖は加速する。このようにして得られたリンフォカイン活性化細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。
【００１２】
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する。）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する。）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献８〜１０）。
【００１３】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用することについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献３、４および５）。しかしながら、養子免疫療法への適用を考えた場合、上記文献の方法では決して満足できるものではなく、さらなる細胞増殖率の向上や、安全性の観点からフィーダ細胞を使用しない拡大培養方法が求められていた。
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｐ． Ｄ．著，１９９２年発行，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献２】Ｒｅｕｓｓｅｒ Ｐ． 他３名，Ｂｌｏｏｄ，１９９１年，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．５，Ｐ１３７３〜１３８０
【非特許文献３】Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ． Ａ． 他４名，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１４６，Ｎｏ．８，Ｐ２７９５〜２８０４
【非特許文献４】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｄ． 他１名，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０年，Ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．２，Ｐ１８９〜２０１
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ． Ａ．他，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．１９８７年，Ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．１５，Ｐ８８９〜８９７
【非特許文献６】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ． Ａ．他，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．１９８８年，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２５，Ｐ１６７６〜１６８０
【非特許文献７】Ｈｏ Ｍ． 他９名，Ｂｌｏｏｄ，１９９３年，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．８，Ｐ２０９３〜２１０１
【非特許文献８】Ｄｅａｎｅ Ｆ． Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ， ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ ＩＮＣ．，Ｐ１〜８
【非特許文献９】Ｋｉｍｉｚｕｋａ Ｆ． 他８名，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１
【非特許文献１０】Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ Ｈ． 他５名，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６
【特許文献１】国際公開第９６／０６９２９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／３２９７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の発明は、下記ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法に関する。
ポリペプチド（Ｘ）：配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）を２個以上含有し、かつ配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｎ）を１個以上含む、
ただし、ポリペプチド（Ｘ）は配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含む、
ポリペプチド（Ｙ）：前記ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有する。
本発明の第１の発明において、ポリペプチド（ｍ）としては、配列表の配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、ポリペプチド（ｍ）を２個含んでなるものが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、ポリペプチド（ｎ）を２個含んでなるものが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。本発明の第１の発明において、製造されるリンパ球としては、細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞が例示される。
また、本発明においては、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する本発明の第１の発明の製造方法も提供される。当該方法において、外来遺伝子としては、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウィルスベクターが例示される。
【００１７】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の製造方法によって得られるリンパ球に関する。
【００１８】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の製造方法によって得られるリンパ球を有効成分とする医薬に関する。
【００１９】
本発明の第４の発明は、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドに関する。
【００２０】
本発明の第５の発明は、下記から選択される核酸に関する。
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドをコードする核酸（ｒ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養することにより、拡大培養率が高く、細胞傷害活性も高いリンパ球が得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２３】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）
本願明細書中に記載のポリペプチド（Ｘ）は、２個以上のポリペプチド（ｍ）、１個以上のポリペプチド（ｎ）を必須領域として含み、かつ配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含むポリペプチドである。
【００２５】
ポリペプチド（ｍ）は、その配列中にフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部である配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドである。なお、配列表の配列番号１〜３はフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの部分アミノ酸配列を示し、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４のアミノ酸配列である（第１図参照）。
【００２６】
当該ポリペプチド（ｍ）としては、ヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。ヘパリン結合活性は、ポリペプチド（ｍ）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、ウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕の細胞接着活性の測定法を利用し、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することによりポリペプチド（ｍ）とヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００２７】
当該ポリペプチド（ｍ）としては、特に好適には配列表の配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列のすべてを含む、すなわちＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４をすべて含むポリペプチドが例示される。
【００２８】
当該ポリペプチド（ｍ）はその配列中に配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであり、ポリペプチド（Ｘ）として本発明の所望の効果が得られるものであれば、前記のアミノ酸配列が直接結合されていても２つのアミノ酸配列間にその他のアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えばリンカーとして複数のアミノ酸が含まれていても良い。
【００２９】
当該ポリペプチド（ｍ）は、ポリペプチド（Ｘ）中に２個以上含まれるが、これらの２個以上のポリペプチド（ｍ）のそれぞれは上記の要件を満たす限り、それぞれ異なるアミノ酸配列であってもよく、また同一であっても良い。また、ポリペプチド（ｍ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば２〜５個、好適には２〜４個、特に好適には２〜３個含有されていることが好ましい。
【００３０】
ポリペプチド（ｎ）は、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインである配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ポリペプチド（ｎ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば１〜５個、好適には１〜４個、特に好適には１〜３個含有されていることが好ましい。
【００３１】
前述したように、ポリペプチド（Ｘ）は２個以上のポリペプチド（ｍ）、１個以上のポリペプチド（ｎ）を含有し、かつポリペプチド（Ｘ）中に配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含むことを必須として構成されるポリペプチドであるが、本発明の所望の効果が得られるものであれば、その他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えばリンカー等に由来するアミノ酸残基が含まれていても良い。
【００３２】
ポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のポリペプチド（ｍ）と１個以上のポリペプチド（ｎ）の位置関係については、本発明の所望の効果が得られるものであれば、特に限定はないが、例えば少なくとも１つのポリペプチド（ｍ）に対してＣ末端側にポリペプチド（ｎ）が連結されているものが好ましい。また、ポリペプチド（Ｘ）中のＮ末端側にはポリペプチド（ｍ）が位置しており、Ｃ末端側にはポリペプチド（ｎ）が位置していることが好ましい。特に好適には、ポリペプチド（Ｘ）中において、ポリペプチド（ｍ）とポリペプチド（ｎ）が交互に位置していることが好ましい。
【００３３】
本発明において、ポリペプチド（Ｘ）としては、例えば配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６）が好適に使用される。Ｈ２９６−Ｈ２９６については、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６ 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託されたプラスミドを用いて製造することができる；
ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸を含有するプラスミド；寄託日 ２００５年７月２２日）。
Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にメチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６は本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。Ｈ２９６−Ｈ２９６については、後述の「（４）Ｈ２９６−Ｈ２９６」において詳細に記載する。
【００３４】
本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）および（Ｙ）は、後述の実施例９〜１４にも記載のとおり、後述の本発明のリンパ球の製造方法において、公知のフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）やＨ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）と比較しても、明らかに細胞増殖率が高いこと、本発明のＣＴＬの製造に使用した場合、細胞傷害活性を高く維持できることから、非常に有用なポリペプチドである。さらに後述の（２）−１−３でも示すようにポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）をＣＴＬの拡大培養に使用することにより、フィーダ細胞を使用しなくとも高い細胞増殖率、細胞傷害活性の維持が実現できるという、極めて有用な利点がある。これらのポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）を構成するアミノ酸数としては、特に限定はないが、好適には１００〜３０００アミノ酸、より好適には１５０〜２８００アミノ酸、さらに好適には２００〜２６００アミノ酸である。
【００３５】
ポリペプチド（Ｘ）の調製に関する有用な情報として、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００３６】
本明細書中に記載のポリペプチド（Ｙ）は、前述のポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有するポリペプチドである。当該置換、欠失、挿入もしくは付加としては、例えば１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。
【００３７】
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチド（Ｘ）の物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチド（Ｘ）におけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
【００３８】
アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、前述のポリペプチド（Ｘ）をコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、当該ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｙ）を製造することができる。
【００３９】
また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、比較対照であるポリペプチド（Ｘ）を使用して後述のリンパ球の製造を実施した場合、同等の細胞増殖率が得られること、又は同等の細胞傷害活性が維持されていることをいう。すなわち、後述のリンパ球の製造方法、特に後述の実施例２〜２１に記載の方法に沿って実施することにより、その機能を適宜確認することができる。また、ポリペプチド（Ｙ）としては、ヘパリン結合活性を有するものが好適である。ヘパリン結合活性は、前記活性測定方法に準じて評価することができる。当該ポリペプチド（Ｘ）及び当該ポリペプチド（Ｙ）は、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して後述のリンパ球の製造方法に使用することができる。
【００４０】
（２）リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする、リンパ球の製造方法である。なお、本願明細書において、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）を本発明の有効成分と称することがある。
【００４１】
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において本発明の培養工程を実施することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。
【００４２】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。これらのうち、本発明は、特にＣＴＬおよびリンフォカイン活性化細胞の製造に適している。これらの製造方法については後述の（２）−１および（２）−２において具体的に説明する。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。
【００４３】
なお、本発明の製造方法により得られるリンパ球の細胞傷害活性を評価する場合は公知の方法により評価でき、例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を、細胞傷害性リンパ球により破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えば細胞傷害性リンパ球を細胞傷害性リンパ球特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をフローサイトメーターで分析することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を評価することができる
【００４４】
本発明の培養工程は、ＣＴＬになり得る細胞からのＣＴＬへの誘導、ＣＴＬの維持、もしくはＣＴＬやその他の上記のリンパ球の拡大培養を目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群を意味し、ＣＴＬとはＣＴＬを含有する細胞群を意味する。なお、培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００４５】
本発明の培養工程において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００４６】
本発明の有効成分を含め、培地中に使用される成分（例えば後述の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、インターロイキン−２等）は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４７】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養用器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００４８】
例えば、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりリンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、該リンパ球と本発明の有効成分とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
【００４９】
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
【００５０】
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。
なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００５１】
本発明において前記成分の存在下とは、リンパ球の培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０００１〜１００００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００５〜５０００μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬである。
【００５２】
本発明のリンパ球の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、さらに後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００５３】
本発明のリンパ球の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０〜２０容量％、特に自己由来の血清または血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０〜５容量％とするのが好ましい。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００５４】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００５５】
（２）−１ ＣＴＬの製造方法
以下、本発明の製造方法によりＣＴＬを製造する例（以下、本発明のＣＴＬの製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００５６】
本発明の製造方法によってＣＴＬを製造する場合は、ＣＴＬになり得る能力を有する細胞をＣＴＬに誘導するための培養（本発明のＣＴＬの誘導方法）、ＣＴＬを維持するための培養（本発明のＣＴＬの維持方法）、又はＣＴＬを拡大培養するための培養（本発明のＣＴＬの拡大培養方法）において、本発明の培養する工程を実施することができる。
【００５７】
（２）−１−１ 本発明のＣＴＬの誘導方法
ＣＴＬの誘導のために本発明のリンパ球の培養工程を実施することについて説明する。ＣＴＬの誘導はＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬになり得る細胞を培養することにより実施される。
【００５８】
ＣＴＬになり得る能力を有する細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、もしくはリンフォカイン活性化細胞等が例示される。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はなく、例えば単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、必要に応じてＸ線照射等を施すことにより増殖性を失活させて本発明に使用することができる。また、抗原提示細胞による刺激は、ＣＴＬの培養期間中、数回に分けて実施することができる。
【００５９】
また、ＣＴＬの誘導においては、好適には培地に本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と称することがある）を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００６０】
その他、ＣＴＬの誘導の一般的な条件としては、公知の条件（Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４７，Ｎｏ．１２，Ｐ４０４７−４０５３，１９９１）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００６１】
このように本発明の培養工程を実施してＣＴＬの誘導を行なうことにより、ＣＴＬ誘導後の細胞増殖率が高く、さらに誘導されたＣＴＬを拡大培養に供した際に極めて高い細胞増殖率を実現することができる。さらに、このようにして誘導されたＣＴＬは、長期間にわたって維持培養、あるいは拡大培養させても、誘導直後に観察されたような高い細胞傷害活性を維持されているという特徴を有している。この維持培養や拡大培養については、好ましくは後述するＣＴＬの維持培養方法や拡大培養方法により行うことができるが、それ以外の公知の方法、すなわち前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の非存在下にＣＴＬの維持培養や拡大培養が実施されても、得られた細胞は前述のような細胞傷害活性を高く維持し、かつ高い細胞増殖率が認められる。これらの効果については、例えばフィブロネクチンの既知のフラグメントであるＨ−２９６（後述の実施例９〜１４参照）の存在下にＣＴＬの誘導を行なった結果と比較しても有意に高い効果を発揮する。さらに本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬを用いて拡大培養を実施した場合、フィーダ細胞を用いなくとも、高い細胞増殖率を実現できる。また、例えば誘導されたＣＴＬをクローン化することにより、安定したＣＴＬを維持することもできる。
【００６２】
（２）−１−２ 本発明のＣＴＬの維持方法
本発明のＣＴＬの維持方法は、ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで維持する方法である。該方法は前述の本発明の培養工程をＣＴＬの維持培養の際に実施することを特徴としており、これによりＣＴＬの細胞傷害活性を維持させることができる。
【００６３】
該方法を適用可能なＣＴＬは特に限定はなく、公知の方法により得られたＣＴＬや、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬ、もしくは後述のＣＴＬの拡大培養方法により得られたＣＴＬの維持に使用される。また、ここでＣＴＬとはＣＴＬを含む細胞集団を意味する。
【００６４】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類（特にＩＬ−２）、その他の成分を含んでいてもよい。
【００６５】
ＣＴＬの維持培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１， Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養日数については、特に限定はない。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００６６】
（２）−１−３ 本発明のＣＴＬの拡大培養方法
本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで細胞数を急速に拡大培養させる方法である。該方法は前述の本発明の培養工程をＣＴＬの拡大培養の際に実施することを特徴とする。
【００６７】
該方法を適用可能なＣＴＬは、特に限定はなく、例えば公知の方法で得られたＣＴＬや、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬ、もしくは前述のＣＴＬの維持方法により維持培養されたＣＴＬが使用される。
【００６８】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。
【００６９】
ＣＴＬの拡大培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１， Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。
【００７０】
本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共培養することもできる。
【００７１】
また、本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、必要に応じて適当なフィーダ細胞と共培養することもできる。ＣＴＬの拡大培養方法において、フィーダ細胞は前記抗ＣＤ３抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプター又は各刺激受容体を活性化するものであれば特に限定はない。本発明においてフィーダ細胞としては、特に限定はないが、例えば自己もしくは非自己由来のＰＢＭＣやＥＢＶ−Ｂ細胞が使用されるが、安全性の観点からはＥＢＶ−Ｂ以外の細胞を使用することが好ましい。通常、フィーダ細胞はＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行うことにより増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は、公知の方法に従って決定すればよく、特に限定はないが、例えば１〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。
【００７２】
しかしながら、養子免疫療法においてフィーダ細胞の使用は、患者への負担、安全性の観点からは使用しないことが好ましい。本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、フィーダ細胞を使用しない場合でも高い拡大培養率を実現することも一つの特徴である。すなわち、本発明により、フィーダ細胞を使用しないＣＴＬの拡大培養方法が提供される。なお、フィーダ細胞を使用せずにＣＴＬの製造を行なう場合、本発明の拡大培養方法に供するＣＴＬは、高い拡大培養率を実現するという観点から、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬを使用することが望ましい。
【００７３】
（２）−２ リンフォカイン活性化細胞の製造方法
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００７４】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、ＩＬ−２の存在下にリンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を本発明の培養に供することにより実施される。
【００７５】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００７６】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、上記の培地を使用する点を除いては、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １７， ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００７７】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子と共培養することもできる。
【００７９】
（２）−３ 外来遺伝子の導入工程を包含する本発明のリンパ球の製造方法
本発明は、前述したリンパ球の製造方法において、さらに外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００８０】
本発明のリンパ球の製造方法、特にリンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００８１】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のＣＴＬの拡大培養方法やリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００８２】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００８３】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００８４】
レトロウイルスベクターならびにレンチウィルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００８５】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００８６】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００８７】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００８８】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）が例示される。
【００８９】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【００９０】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、本発明の有効成分を含有するリンパ球培養用培地
さらに本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球を提供する。また、本発明は当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
【００９１】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ等のウィルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患が例示される。また、前述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【００９２】
本発明の別の態様として、本発明の有効成分を含有する培地が提供される。当該培地は、さらにその他の任意の成分、たとえば、公知の細胞培養に用いられる培地成分、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。本発明の培地の一態様としては、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用担体を含有する培地、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用器材に封入して提供される培地が包含される。
【００９３】
（４）Ｈ２９６−Ｈ２９６
本発明においては、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものである、新規なポリペプチド、およびこれをコードする核酸（ｒ）も提供される。当該核酸としては、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸）、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）が例示される。なお、本明細書において、前記新規なポリペプチドを本発明のポリペプチドと称し、これをコードする核酸を本発明の核酸と称することがある。
【００９４】
以下、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、該ポリペプチドの製造方法について説明する。本発明のポリペプチドは、前述のようなリンパ球の製造において所望の機能を有するものであれば、上記アミノ酸配列において１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加の１以上が生じた配列のものも本発明のポリペプチドに含まれる。Ｈ２９６−Ｈ２９６以外の本発明のポリペプチドとしては、好適には配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列に１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、該ポリペプチドの作製法は前述の「（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）」に記載の方法と同様に行なうことができる。
【００９５】
本発明のポリペプチドをコードする配列表の配列番号６で表される核酸は天然型のフィブロネクチンをコードする遺伝子、もしくは組み替え型のフィブロネクチンフラグメント、例えば前述のＣＨ−２９６やＨ−２９６等をコードする遺伝子を用いて、本発明のポリペプチドを構成する各ドメインをコードする核酸を取得し、公知の方法によりこれらをつなぎ合わせることにより取得することができる。例えば、後述の実施例１に記載のとおり、ＣＨ−２９６をコードする核酸からヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインをコードする核酸を取得し、これを重複してつなぎ合わせることにより取得することができる。
【００９６】
また、本発明の核酸としては、配列表の配列番号６で表される核酸の塩基配列において、１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものも含まれる。例えば配列表の配列番号６に記載の塩基配列から１〜６０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜３０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜１５塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、塩基の置換等は、核酸にコードされるポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、塩基の置換等の方法については前記のアミノ酸の置換等に関する記載に準ずる。
【００９７】
さらに配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のポリペプチドと同等な機能、すなわち前述のリンパ球の製造において所望の効果を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。上記「ストリンジェントな条件」とは特に限定されず、配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度および塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第３版〔サンブルーク（ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられる。
【００９８】
具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃、好ましくは６５℃で保温する条件が例示される。前記の温度は用いるＤＮＡのＴｍ値が既知である場合は、その値より５〜１２℃低い温度としてもよい。さらに、非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件および／またはより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上等の条件下で洗浄を行なう、という条件等を追加してもよい。
【００９９】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
【０１００】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
【０１０１】
一方、このようにして得られた核酸を用いて、配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを遺伝子工学的に取得することができる。すなわち、当該核酸を適切な発現用ベクター、特に限定はないが、例えばｐＥＴベクターやｐＣｏｌｄベクター等に挿入し、公知の方法により、当該ポリペプチドを、例えば、大腸菌等で発現させることにより取得することができる。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸を含むプラスミドについては、前述のとおり、ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２として寄託されている。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【０１０３】
調製例１ Ｈ−２９６の調製
Ｈ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２０）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。
【０１０４】
調製例２ ＣＨ−２９６の調製
ＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。
【０１０５】
実施例１ Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製
本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．）に記載の方法によった。
【０１０６】
（１）発現ベクターの構築
（ｉ）Ｈ−２９６発現ベクターの構築
配列表の配列番号７記載のＣＨ−２９６のアミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸２７９〜５７５（塩基番号８３５〜１７２５）よりなるポリペプチドをＨ−２９６とし、このＨ−２９６が２つ連結した変異体タンパク質（Ｈ２９６−Ｈ２９６）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。以下、図２を参照。
【０１０７】
まず、配列表の配列番号８記載のＣＨ−２９６の塩基配列（国際公開第０３／０８０８１７パンフレット参照）より、配列表の配列番号９及び１０に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ及びＨ２９６−ＨｉｎｄＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号２７９〜２８４に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７１〜５７５に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３４にもつ合成ＤＮＡである。
【０１０８】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２ 約０．１μｇ、５μｌの１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【０１０９】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【０１１０】
次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した（これ以降、このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターをｐＣｏｌｄ１４ベクターとする）。
【０１１１】
次に上記ｐＣｏｌｄ１４ベクターを上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【０１１２】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９〜５７５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。
【０１１３】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６発現ベクターの構築
次に、国際公開第０３／０８０８１７パンフレットで公開されている塩基配列より、配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７５〜５７０に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３４にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号１２記載のＮＣ２ベクターの５’ＵＴＲ部分にアニ−リングするプライマー（ＮＣ２−５’ＵＴＲ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
【０１１４】
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６約０．１μｇ、１０μｌの１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、２０ｐｍｏｌのＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、５Ｕのｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９６℃ １分、６８℃ ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【０１１５】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をＢｉｏ ｒａｄカラムにより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを３９μｌの滅菌水に懸濁、全量５０μｌとした反応液で制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【０１１６】
次に、（ｉ）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【０１１７】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６とした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６と命名、表示され、２００５年７月２２日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２として寄託されている。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９〜５７５のアミノ酸配列をコードする塩基配列が間にアミノ酸“Ａ”を挟んで２つ連結した形で含むプラスミドである。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
【０１１８】
（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１２０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝１．０ｌ／ｍｉｎの条件で行なった。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約４０ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，５０ｍＭ ＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。これを２ｌのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍｌを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行なった。
【０１１９】
すなわち、樹脂容積にして１００ｍｌ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ］で飽和させたカラム（Φ４ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＮａＣｌ］で５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。５ｍｌずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍｌを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行なった。
【０１２０】
次に、樹脂容積にして５０ｍｌ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ×１６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより目的タンパク質のみを多く含む画分を調べたところ、非吸着画分に多く含まれ、この約１００ｍｌを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒ Ｄ［５０ ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ９．５］で透析を行なった。
【０１２１】
その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で約２０倍の５ｍｌまで濃縮を行い、さらに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−Ｈ２９６とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．１６ｍｇ／ｍｌであった（分子量から計算して、約３３．４ｍＭ）。
【０１２２】
実施例２ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ＨＬＡ−Ａ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ〔アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕上に重層後、６００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕に懸濁した後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン〔ブミネート：バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）社製〕を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
【０１２３】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレート〔ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製〕に１ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１２４】
（３）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導は、ベドナレク（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）らの方法〔Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第１４７巻、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）〕を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ〔全てキャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製〕、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２−（２）で作製した２４穴細胞培養プレートに１ｍｌ／ウェルずつ添加し、５％ＣＯ２湿式インキュベーター内にて、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６固定化処理を行っていないプレートを使用）。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして５μｇ／ｍｌのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号１３に記載のマトリックスプロテイン由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および１μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリン〔スクリプス（Ｓｃｒｉｐｓ）社製〕を含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍｌずつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍｌ／ウェルずつ抗原提示細胞上に添加したのち、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培養開始後１日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（プロロイキン：ＣＨＩＲＯＮ社製）を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、同様のＩＬ−２含有培地を１ｍｌずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を回収し、４４０×ｇで１０分間遠心した。遠心後、レスポンダー細胞を１ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に１ｍｌ／ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、プレートはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化したものを使用した（対照には固定化していないプレートを使用）。再刺激後１日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また４日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌずつ添加し、さらに培養を３日続け、ＣＴＬを誘導した。１４日間培養後の細胞増殖率を表１に示す。細胞増殖率はＣＴＬ誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する誘導終了地点での細胞数の比を増殖率として求めた。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
その結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群では固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１２７】
実施例３ 実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを１２．５ｃｍ２フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を立てて２．７ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のフラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１２８】
（２）実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。一方、実施例２−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣを２ドナー混合したのちＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した（フィーダ細胞とする）。これら３×１０４ｃｅｌｌｓのＣＴＬおよび４×１０６ｃｅｌｌｓのフィーダ細胞を５ｍｌの１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩと略す）に懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコに入れ、３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、実施例３−（１）のＨ２９６−Ｈ２９６固定化フラスコを使用した（対照については非固定化フラスコを使用）。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ ５ｍｌと終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加し、１４日間拡大培養を行った。結果を表２に示す。拡大培養時の増殖率は拡大培養開始時の細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比を増殖率として求め、誘導からの増殖率は誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する拡大培養終了地点の細胞数の比として求めた。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群より高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１３１】
実施例４ 実施例３のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例３で調製した拡大培養開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ Ｒ． ｅｔ ａｌ．）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。一晩エピトープペプチド存在下、もしくは非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ， ウシ胎児血清、Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞は、３０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）と混合し、細胞傷害活性測定用細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。
【０１３２】
実施例３で調製した抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）の各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注しておき、これらにＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞濃度が１×１０５／ｍｌとなるように調整した細胞傷害活性測定用細胞を１００μｌ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０、１０、３、１について測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清 １００μｌを採取し、蛍光プレートリーダー〔ベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕（励起４８５ｎｍ／測定５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の式１にしたがって算出した。
【０１３３】
式１：特異的細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００
【０１３４】
上式において最小放出量は細胞傷害活性測定用細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は細胞傷害活性測定用細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。また、Ｅ／Ｔ比３において、拡大培養前の細胞障害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として以下の式２にしたがって算出した。
【０１３５】
式２：細胞傷害活性維持（％）＝
〔拡大培養後の細胞傷害活性（％）／拡大培養前の細胞傷害活性（％）〕×１００
【０１３６】
測定結果を表３に示す。
【０１３７】
【表３】
【０１３８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントを固定化した群については、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１３９】
実施例５ 実施例３のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
今回、ＣＴＬ誘導に用いたＨＬＡ Ａ２．１結合性インフルエンザウイルスタンパク質由来ペプチドはＴＣＲ Ｖβ１７陽性Ｔ細胞により認識されることがＬｅｈｎｅｒらによって示されている〔Ｌｅｈｎｅｒ Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、第１８１巻、第７９〜９１頁（１９９５）〕。したがって、ＴＣＲ Ｖβ１７の陽性細胞含有比率を測定することにより、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの指標となり得る。
実施例３で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬをＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む１５μｌのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１７抗体〔ともにベックマンコールター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）社製〕を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表４に示す。
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化したＣＴＬは、固定化しなかった対照群と比較して明らかに高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％、固定化していない対照群については７３．０％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１４２】
実施例６ 実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。
【０１４３】
（２） フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ ３００μｌに懸濁し、実施例６−（１）で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１３日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表５に示す。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。
【０１４６】
実施例７ 実施例６のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例６−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表６に示す。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１３日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１４９】
実施例８ 実施例６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例６−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６の非存在下で拡大培養したＣＴＬを用いた対照群については拡大培養後に得られた細胞数が少なかったため、試験を実施しなかった。結果を表７に示す。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群において、高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１５２】
実施例９ Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに１ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１５３】
（２）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき使用した培養プレートは、実施例９−（１）で作製したものを用いた（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化していないプレートを使用）。誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表８に示す。
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
この結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついでＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群はこれらと比較して低い増殖率であった。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を使用した方がより高い効果が得られた。
【０１５６】
実施例１０ 実施例９のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例９で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表９に示す。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、対照群のＣＴＬに比べて特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時に使用することにより、高い細胞傷害活性を持ったＣＴＬを誘導することが可能となった。
【０１５９】
実施例１１ 実施例９のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例９で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１０に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。
【０１６０】
【表１０】
【０１６１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用した群において、使用していない対照群に比べて高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用することにより、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬを効率よく誘導出来ることが明らかとなった。
【０１６２】
実施例１２ 実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。
【０１６３】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の存在下で誘導したＣＴＬ（対照は非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ ３００μｌに懸濁し、実施例１２で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加、５日目以降は５ＨＲＰＭＩを用いて固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。すなわち、培養開始後５日目には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、８日目には１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１２日目には３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１１に示す。
【０１６４】
【表１１】
【０１６５】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついで誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群は最も低い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となり、その効果はＨ２９６−Ｈ２９６を使用した方が高いことが示された。
【０１６６】
実施例１３ 実施例１２のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例１２−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１２に示す。
【０１６７】
【表１２】
【０１６８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。また、誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を添加した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を添加した群より低いが、特異的な細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的な細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになり、Ｈ２９６−Ｈ２９６の方が高い効果が得られた。
【０１６９】
実施例１４ 実施例１２のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１２−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１３に示す。
【０１７０】
【表１３】
【０１７１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が最も高い陽性細胞含有比率を示し、次いでＨ−２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が高く、固定化していない対照群は最も低い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、対照群については５０．６％、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７３．５％、Ｈ−２９６を固定化した群については７３．２％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１７２】
実施例１５ ３０ｍＬ採血を想定した実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダを用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみ固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。
【０１７３】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９でＨ２９６−Ｈ２９６を用いて誘導したＣＴＬを３％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下３ＨＲＰＭＩと略す）で洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを３００μｌの３ＨＲＰＭＩに懸濁し、実施例１５−（１）で作製した９６穴培養プレートに入れ、３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。この際、３０ｍＬ採血から得られると予想されるＰＢＭＣ ３×１０７ｃｅｌｌｓを用いた培養スケールにおいて、誘導から拡大培養までのヒトＡＢ型血清の使用量を最大１５ｍＬ、ＲＰＭＩ培地使用量を最大１０Ｌに制限して拡大培養をおこなった。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、５日目には１％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には０．２％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、１２日目には終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２のみ添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せずに１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１４に示す。
【０１７４】
【表１４】
【０１７５】
拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時に用いて得られたＣＴＬについて、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を使用することにより高い細胞増殖効果が見られた。
【０１７６】
実施例１６ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導（自己血漿）
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、５％自己血漿、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ培地（以下５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩと略す）を用いた。こうして調製した誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表１５に示す。
【０１７７】
【表１５】
【０１７８】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群において、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群よりも高い増殖率が得られた。つまり、自己血漿を含む培地において、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１７９】
実施例１７ 実施例１６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１６で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１６に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。
【０１８０】
【表１６】
【０１８１】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群と比較して高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を用いることで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬを効率よく誘導できることが明らかとなった。
【０１８２】
実施例１８ 実施例１６のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例１６で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を用い、実施例３と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩ培地を用いて培養し、１４日間拡大培養を行った。１４日後の細胞増殖率を表１７に示す。
【０１８３】
【表１７】
【０１８４】
誘導時及び拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時あるいは拡大培養時に使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１８５】
実施例１９ 実施例１８のＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１８で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１８に示す。
【０１８６】
【表１８】
【０１８７】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群は１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しない対照群については、その活性は明らかに低下していた。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１８８】
実施例２０ 実施例１８のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１８で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１９に示す。
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、固定化していない対照群と比較して、明らかに高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後すなわち拡大培養前のＣＴＬについてのＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、表１６に示したように、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については８０．１％であり、固定化していない群については７２．１％であった。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが明らかとなった。
【０１９１】
実施例２１ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ上に重層して５００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。リンパ球拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
【０１９２】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬずつ添加した。この時、Ｈ２９６−Ｈ２９６添加群には実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１９３】
（３）リンパ球の拡大培養
３％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下３％ＡＩＭ−Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに３％ＡＩＭ−Ｖを ２ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群とも０．０７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、培養液を何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。血清濃度は、３０ｍＬ採血より得られたＰＢＭＣを培地１０Ｌで培養することを想定して決定した。培養を継続し、７日目には各群とも０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、対照群（Ｈ２９６−Ｈ２９６非固定化）では０．１％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて、およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化群では０．０９％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて希釈した培養液（液量１２．６ｍＬ）を何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目には、７日目と同じ血清濃度のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて０．４１３×１０６／ｍＬとなるように細胞液を希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２０に示す。
【０１９４】
【表２０】
【０１９５】
表２０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してリンパ球の拡大培養率が高かった。このことから、Ｈ２９６−Ｈ２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図２】Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製法を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９８】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:6 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:8 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Primer H296-NcoF.
SEQ ID NO:10 ; Primer H296-HindR.
SEQ ID NO:11 ; Primer H296-NcoR.
SEQ ID NO:12 ; Primer NC2-5' UTR.
SEQ ID NO:13 ; Designed peptide based on matrix-protein derived from influenza virus.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なリンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
【０００４】
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特にヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている（例えば、非特許文献１および２）。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
【０００５】
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
【０００６】
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
【０００７】
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（例えば、非特許文献６）、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法（例えば、非特許文献７）が報告されている。
【０００８】
さらに、特許文献１にはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
【０００９】
また、特許文献２には改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。
【００１０】
ＣＴＬ以外の疾病の治療に有効なリンパ球としては、例えば、リンフォカイン活性化細胞（例えば、非特許文献３）、高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（例えば、非特許文献４および５）が知られている。
【００１１】
リンフォカイン活性化細胞は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。リンフォカイン活性化細胞の培養工程において、抗ＣＤ３抗体を加えることにより、さらにリンフォカイン活性化細胞の増殖は加速する。このようにして得られたリンフォカイン活性化細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。
【００１２】
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する。）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する。）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献８〜１０）。
【００１３】
リンフォカイン活性化細胞や細胞傷害性リンパ球の製造において、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することで、細胞増殖率の向上作用、細胞傷害活性の維持作用することについては、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献３、４および５）。しかしながら、養子免疫療法への適用を考えた場合、上記文献の方法では決して満足できるものではなく、さらなる細胞増殖率の向上や、安全性の観点からフィーダ細胞を使用しない拡大培養方法が求められていた。
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｐ． Ｄ．著，１９９２年発行，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献２】Ｒｅｕｓｓｅｒ Ｐ． 他３名，Ｂｌｏｏｄ，１９９１年，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．５，Ｐ１３７３〜１３８０
【非特許文献３】Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ． Ａ． 他４名，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１４６，Ｎｏ．８，Ｐ２７９５〜２８０４
【非特許文献４】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｐ．Ｄ． 他１名，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０年，Ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．２，Ｐ１８９〜２０１
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ． Ａ．他，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．１９８７年，Ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．１５，Ｐ８８９〜８９７
【非特許文献６】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ． Ａ．他，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．１９８８年，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２５，Ｐ１６７６〜１６８０
【非特許文献７】Ｈｏ Ｍ． 他９名，Ｂｌｏｏｄ，１９９３年，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．８，Ｐ２０９３〜２１０１
【非特許文献８】Ｄｅａｎｅ Ｆ． Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ， ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ ＩＮＣ．，Ｐ１〜８
【非特許文献９】Ｋｉｍｉｚｕｋａ Ｆ． 他８名，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１
【非特許文献１０】Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ Ｈ． 他５名，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６
【特許文献１】国際公開第９６／０６９２９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／３２９７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、医療への使用に適した、効率的なリンパ球の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の発明は、下記ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法に関する。
ポリペプチド（Ｘ）：配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）を２個以上含有し、かつ配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｎ）を１個以上含む、
ただし、ポリペプチド（Ｘ）は配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含む、
ポリペプチド（Ｙ）：前記ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有する。
本発明の第１の発明において、ポリペプチド（ｍ）としては、配列表の配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、ポリペプチド（ｍ）を２個含んでなるものが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、ポリペプチド（ｎ）を２個含んでなるものが例示される。また、ポリペプチド（Ｘ）としては、配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。本発明の第１の発明において、製造されるリンパ球としては、細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞が例示される。
また、本発明においては、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する本発明の第１の発明の製造方法も提供される。当該方法において、外来遺伝子としては、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウィルスベクターが例示される。
【００１７】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の製造方法によって得られるリンパ球に関する。
【００１８】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の製造方法によって得られるリンパ球を有効成分とする医薬に関する。
【００１９】
本発明の第４の発明は、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドに関する。
【００２０】
本発明の第５の発明は、下記から選択される核酸に関する。
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドをコードする核酸（ｒ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規な改変型組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部を重複して有する改変型組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下にリンパ球を培養することにより、拡大培養率が高く、細胞傷害活性も高いリンパ球が得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２３】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２４】
（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）
本願明細書中に記載のポリペプチド（Ｘ）は、２個以上のポリペプチド（ｍ）、１個以上のポリペプチド（ｎ）を必須領域として含み、かつ配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含むポリペプチドである。
【００２５】
ポリペプチド（ｍ）は、その配列中にフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの一部である配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドである。なお、配列表の配列番号１〜３はフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインの部分アミノ酸配列を示し、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４のアミノ酸配列である（第１図参照）。
【００２６】
当該ポリペプチド（ｍ）としては、ヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。ヘパリン結合活性は、ポリペプチド（ｍ）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、ウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕の細胞接着活性の測定法を利用し、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することによりポリペプチド（ｍ）とヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００２７】
当該ポリペプチド（ｍ）としては、特に好適には配列表の配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列のすべてを含む、すなわちＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４をすべて含むポリペプチドが例示される。
【００２８】
当該ポリペプチド（ｍ）はその配列中に配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであり、ポリペプチド（Ｘ）として本発明の所望の効果が得られるものであれば、前記のアミノ酸配列が直接結合されていても２つのアミノ酸配列間にその他のアミノ酸配列を含んでいてもよく、例えばリンカーとして複数のアミノ酸が含まれていても良い。
【００２９】
当該ポリペプチド（ｍ）は、ポリペプチド（Ｘ）中に２個以上含まれるが、これらの２個以上のポリペプチド（ｍ）のそれぞれは上記の要件を満たす限り、それぞれ異なるアミノ酸配列であってもよく、また同一であっても良い。また、ポリペプチド（ｍ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば２〜５個、好適には２〜４個、特に好適には２〜３個含有されていることが好ましい。
【００３０】
ポリペプチド（ｎ）は、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインである配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ポリペプチド（ｎ）はポリペプチド（Ｘ）中に、例えば１〜５個、好適には１〜４個、特に好適には１〜３個含有されていることが好ましい。
【００３１】
前述したように、ポリペプチド（Ｘ）は２個以上のポリペプチド（ｍ）、１個以上のポリペプチド（ｎ）を含有し、かつポリペプチド（Ｘ）中に配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含むことを必須として構成されるポリペプチドであるが、本発明の所望の効果が得られるものであれば、その他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えばリンカー等に由来するアミノ酸残基が含まれていても良い。
【００３２】
ポリペプチド（Ｘ）中の２個以上のポリペプチド（ｍ）と１個以上のポリペプチド（ｎ）の位置関係については、本発明の所望の効果が得られるものであれば、特に限定はないが、例えば少なくとも１つのポリペプチド（ｍ）に対してＣ末端側にポリペプチド（ｎ）が連結されているものが好ましい。また、ポリペプチド（Ｘ）中のＮ末端側にはポリペプチド（ｍ）が位置しており、Ｃ末端側にはポリペプチド（ｎ）が位置していることが好ましい。特に好適には、ポリペプチド（Ｘ）中において、ポリペプチド（ｍ）とポリペプチド（ｎ）が交互に位置していることが好ましい。
【００３３】
本発明において、ポリペプチド（Ｘ）としては、例えば配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｈ２９６−Ｈ２９６）が好適に使用される。Ｈ２９６−Ｈ２９６については、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６ 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託されたプラスミドを用いて製造することができる；
ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸を含有するプラスミド；寄託日 ２００５年７月２２日）。
Ｈ２９６−Ｈ２９６は、Ｎ末端側から順にメチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１、アラニン、メチオニン、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＣＳ−１で構成されるポリペプチドである。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６は本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。Ｈ２９６−Ｈ２９６については、後述の「（４）Ｈ２９６−Ｈ２９６」において詳細に記載する。
【００３４】
本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）および（Ｙ）は、後述の実施例９〜１４にも記載のとおり、後述の本発明のリンパ球の製造方法において、公知のフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）やＨ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）と比較しても、明らかに細胞増殖率が高いこと、本発明のＣＴＬの製造に使用した場合、細胞傷害活性を高く維持できることから、非常に有用なポリペプチドである。さらに後述の（２）−１−３でも示すようにポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）をＣＴＬの拡大培養に使用することにより、フィーダ細胞を使用しなくとも高い細胞増殖率、細胞傷害活性の維持が実現できるという、極めて有用な利点がある。これらのポリペプチド（Ｘ）又は（Ｙ）を構成するアミノ酸数としては、特に限定はないが、好適には１００〜３０００アミノ酸、より好適には１５０〜２８００アミノ酸、さらに好適には２００〜２６００アミノ酸である。
【００３５】
ポリペプチド（Ｘ）の調製に関する有用な情報として、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００３６】
本明細書中に記載のポリペプチド（Ｙ）は、前述のポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有するポリペプチドである。当該置換、欠失、挿入もしくは付加としては、例えば１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。
【００３７】
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチド（Ｘ）の物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチド（Ｘ）の持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチド（Ｘ）におけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
【００３８】
アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、前述のポリペプチド（Ｘ）をコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、当該ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（Ｙ）を製造することができる。
【００３９】
また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、比較対照であるポリペプチド（Ｘ）を使用して後述のリンパ球の製造を実施した場合、同等の細胞増殖率が得られること、又は同等の細胞傷害活性が維持されていることをいう。すなわち、後述のリンパ球の製造方法、特に後述の実施例２〜２１に記載の方法に沿って実施することにより、その機能を適宜確認することができる。また、ポリペプチド（Ｙ）としては、ヘパリン結合活性を有するものが好適である。ヘパリン結合活性は、前記活性測定方法に準じて評価することができる。当該ポリペプチド（Ｘ）及び当該ポリペプチド（Ｙ）は、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して後述のリンパ球の製造方法に使用することができる。
【００４０】
（２）リンパ球の製造方法
以下、本発明のリンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする、リンパ球の製造方法である。なお、本願明細書において、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）を本発明の有効成分と称することがある。
【００４１】
本発明のリンパ球の製造方法は、リンパ球製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において本発明の培養工程を実施することにより行われる。すなわち、リンパ球の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。
【００４２】
本発明の製造方法により得られるリンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団等が挙げられる。これらのうち、本発明は、特にＣＴＬおよびリンフォカイン活性化細胞の製造に適している。これらの製造方法については後述の（２）−１および（２）−２において具体的に説明する。なお、本明細書においてリンフォカイン活性化細胞とは、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間培養することにより得られる機能的細胞集団を示す。このような細胞集団のことを一般的にリンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と称することがあるが、当該細胞集団には細胞傷害性を有さない細胞（例えば、ナイーブ細胞等）も含まれていることから、本願明細書においては当該細胞集団をリンフォカイン活性化細胞と称することとする。
【００４３】
なお、本発明の製造方法により得られるリンパ球の細胞傷害活性を評価する場合は公知の方法により評価でき、例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を、細胞傷害性リンパ球により破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えば細胞傷害性リンパ球を細胞傷害性リンパ球特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をフローサイトメーターで分析することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を評価することができる
【００４４】
本発明の培養工程は、ＣＴＬになり得る細胞からのＣＴＬへの誘導、ＣＴＬの維持、もしくはＣＴＬやその他の上記のリンパ球の拡大培養を目的とするものである。本発明のリンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整してリンパ球の培養を行うことにより、養子免疫療法等に有用なリンパ球を製造することができる。なお、本明細書においてリンパ球とはリンパ球を含有する細胞群を意味し、ＣＴＬとはＣＴＬを含有する細胞群を意味する。なお、培養に使用される細胞は製造するリンパ球の種類に応じて適宜設定できるが、当該細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００４５】
本発明の培養工程において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００４６】
本発明の有効成分を含め、培地中に使用される成分（例えば後述の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、インターロイキン−２等）は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４７】
培養条件は、リンパ球の公知の培養条件で行なえばよく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養用器材を交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は後述のとおり、製造するリンパ球の種類によって、適宜設定することができる。
【００４８】
例えば、ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンのフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりリンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、該リンパ球と本発明の有効成分とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
【００４９】
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いて培養してもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
【００５０】
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。
なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００５１】
本発明において前記成分の存在下とは、リンパ球の培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０００１〜１００００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００５〜５０００μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬである。
【００５２】
本発明のリンパ球の培養工程に使用される培地としては、細胞培養に使用される公知の培地を使用すればよく、さらに後述するとおり製造するリンパ球の種類に応じて各種サイトカイン等を添加すれば良い。
【００５３】
本発明のリンパ球の培養工程においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０〜２０容量％、特に自己由来の血清または血漿を用いる場合、患者への負担を考慮して、０〜５容量％とするのが好ましい。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養するリンパ球と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養するリンパ球と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
【００５４】
例えば、本発明の方法において、リンパ球の拡大培養を行う場合、本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００５５】
（２）−１ ＣＴＬの製造方法
以下、本発明の製造方法によりＣＴＬを製造する例（以下、本発明のＣＴＬの製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００５６】
本発明の製造方法によってＣＴＬを製造する場合は、ＣＴＬになり得る能力を有する細胞をＣＴＬに誘導するための培養（本発明のＣＴＬの誘導方法）、ＣＴＬを維持するための培養（本発明のＣＴＬの維持方法）、又はＣＴＬを拡大培養するための培養（本発明のＣＴＬの拡大培養方法）において、本発明の培養する工程を実施することができる。
【００５７】
（２）−１−１ 本発明のＣＴＬの誘導方法
ＣＴＬの誘導のために本発明のリンパ球の培養工程を実施することについて説明する。ＣＴＬの誘導はＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬになり得る細胞を培養することにより実施される。
【００５８】
ＣＴＬになり得る能力を有する細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、もしくはリンフォカイン活性化細胞等が例示される。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はなく、例えば単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、必要に応じてＸ線照射等を施すことにより増殖性を失活させて本発明に使用することができる。また、抗原提示細胞による刺激は、ＣＴＬの培養期間中、数回に分けて実施することができる。
【００５９】
また、ＣＴＬの誘導においては、好適には培地に本発明の有効成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と称することがある）を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
【００６０】
その他、ＣＴＬの誘導の一般的な条件としては、公知の条件（Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１４７，Ｎｏ．１２，Ｐ４０４７−４０５３，１９９１）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００６１】
このように本発明の培養工程を実施してＣＴＬの誘導を行なうことにより、ＣＴＬ誘導後の細胞増殖率が高く、さらに誘導されたＣＴＬを拡大培養に供した際に極めて高い細胞増殖率を実現することができる。さらに、このようにして誘導されたＣＴＬは、長期間にわたって維持培養、あるいは拡大培養させても、誘導直後に観察されたような高い細胞傷害活性を維持されているという特徴を有している。この維持培養や拡大培養については、好ましくは後述するＣＴＬの維持培養方法や拡大培養方法により行うことができるが、それ以外の公知の方法、すなわち前述のポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の非存在下にＣＴＬの維持培養や拡大培養が実施されても、得られた細胞は前述のような細胞傷害活性を高く維持し、かつ高い細胞増殖率が認められる。これらの効果については、例えばフィブロネクチンの既知のフラグメントであるＨ−２９６（後述の実施例９〜１４参照）の存在下にＣＴＬの誘導を行なった結果と比較しても有意に高い効果を発揮する。さらに本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬを用いて拡大培養を実施した場合、フィーダ細胞を用いなくとも、高い細胞増殖率を実現できる。また、例えば誘導されたＣＴＬをクローン化することにより、安定したＣＴＬを維持することもできる。
【００６２】
（２）−１−２ 本発明のＣＴＬの維持方法
本発明のＣＴＬの維持方法は、ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで維持する方法である。該方法は前述の本発明の培養工程をＣＴＬの維持培養の際に実施することを特徴としており、これによりＣＴＬの細胞傷害活性を維持させることができる。
【００６３】
該方法を適用可能なＣＴＬは特に限定はなく、公知の方法により得られたＣＴＬや、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬ、もしくは後述のＣＴＬの拡大培養方法により得られたＣＴＬの維持に使用される。また、ここでＣＴＬとはＣＴＬを含む細胞集団を意味する。
【００６４】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類（特にＩＬ−２）、その他の成分を含んでいてもよい。
【００６５】
ＣＴＬの維持培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１， Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養日数については、特に限定はない。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００６６】
（２）−１−３ 本発明のＣＴＬの拡大培養方法
本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、ＣＴＬの細胞傷害活性を保ったままで細胞数を急速に拡大培養させる方法である。該方法は前述の本発明の培養工程をＣＴＬの拡大培養の際に実施することを特徴とする。
【００６７】
該方法を適用可能なＣＴＬは、特に限定はなく、例えば公知の方法で得られたＣＴＬや、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬ、もしくは前述のＣＴＬの維持方法により維持培養されたＣＴＬが使用される。
【００６８】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。
【００６９】
ＣＴＬの拡大培養の一般的な条件については公知の方法（例えばＣａｒｔｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１， Ｐ１２３−１２９，１９９６）に従えば良い。
【００７０】
本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子を共培養することもできる。
【００７１】
また、本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、必要に応じて適当なフィーダ細胞と共培養することもできる。ＣＴＬの拡大培養方法において、フィーダ細胞は前記抗ＣＤ３抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプター又は各刺激受容体を活性化するものであれば特に限定はない。本発明においてフィーダ細胞としては、特に限定はないが、例えば自己もしくは非自己由来のＰＢＭＣやＥＢＶ−Ｂ細胞が使用されるが、安全性の観点からはＥＢＶ−Ｂ以外の細胞を使用することが好ましい。通常、フィーダ細胞はＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行うことにより増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は、公知の方法に従って決定すればよく、特に限定はないが、例えば１〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。
【００７２】
しかしながら、養子免疫療法においてフィーダ細胞の使用は、患者への負担、安全性の観点からは使用しないことが好ましい。本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、フィーダ細胞を使用しない場合でも高い拡大培養率を実現することも一つの特徴である。すなわち、本発明により、フィーダ細胞を使用しないＣＴＬの拡大培養方法が提供される。なお、フィーダ細胞を使用せずにＣＴＬの製造を行なう場合、本発明の拡大培養方法に供するＣＴＬは、高い拡大培養率を実現するという観点から、前述の本発明のＣＴＬの誘導方法により得られたＣＴＬを使用することが望ましい。
【００７３】
（２）−２ リンフォカイン活性化細胞の製造方法
以下、本発明の製造方法によりリンフォカイン活性化細胞を製造する例（以下、本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法と称することがある）について詳細に記載する。
【００７４】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法は、ＩＬ−２の存在下にリンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞を本発明の培養に供することにより実施される。
【００７５】
リンフォカイン活性化細胞になり得る能力を有する細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられ、血球系細胞であれば使用できる。また、前記細胞を含有する材料、例えば末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００７６】
また、リンフォカイン活性化細胞を培養するための一般的な条件は、上記の培地を使用する点を除いては、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １７， ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件は特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
【００７７】
使用される培地については特に限定はなく、公知の培地を使用することができ、また前述のＣＴＬの誘導と同様に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明のリンフォカイン活性化細胞の製造方法においては、高い拡大培養率を実現する観点から、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体と共培養することが好ましい。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。また、さらに副刺激として抗ＣＤ２８抗体、特に好適には抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体と共培養することもできる。また、レクチン等のリンパ球刺激因子と共培養することもできる。
【００７９】
（２）−３ 外来遺伝子の導入工程を包含する本発明のリンパ球の製造方法
本発明は、前述したリンパ球の製造方法において、さらに外来遺伝子を導入する工程を包含するリンパ球の製造方法も提供する。すなわち、本発明は、その一態様として、リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むリンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００８０】
本発明のリンパ球の製造方法、特にリンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明のリンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００８１】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記本発明のＣＴＬの拡大培養方法やリンフォカイン活性化細胞の製造方法中の細胞増殖時に実施するのが好適である。
【００８２】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００８３】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００８４】
レトロウイルスベクターならびにレンチウィルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００８５】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００８６】
本発明においてリンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００８７】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００８８】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）が例示される。
【００８９】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【００９０】
（３）本発明の製造方法により得られるリンパ球、当該リンパ球を含有する医薬、本発明の有効成分を含有するリンパ球培養用培地
さらに本発明は、上記の本発明の製造方法で得られたリンパ球を提供する。また、本発明は当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適したリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
【００９１】
本発明の方法により製造されるリンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ等のウィルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患が例示される。また、前述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるリンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
【００９２】
本発明の別の態様として、本発明の有効成分を含有する培地が提供される。当該培地は、さらにその他の任意の成分、たとえば、公知の細胞培養に用いられる培地成分、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。本発明の培地の一態様としては、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用担体を含有する培地、本発明の有効成分が固定化された細胞培養用器材に封入して提供される培地が包含される。
【００９３】
（４）Ｈ２９６−Ｈ２９６
本発明においては、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）（Ｈ２９６−Ｈ２９６）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものである、新規なポリペプチド、およびこれをコードする核酸（ｒ）も提供される。当該核酸としては、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）（Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸）、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）が例示される。なお、本明細書において、前記新規なポリペプチドを本発明のポリペプチドと称し、これをコードする核酸を本発明の核酸と称することがある。
【００９４】
以下、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、該ポリペプチドの製造方法について説明する。本発明のポリペプチドは、前述のようなリンパ球の製造において所望の機能を有するものであれば、上記アミノ酸配列において１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加の１以上が生じた配列のものも本発明のポリペプチドに含まれる。Ｈ２９６−Ｈ２９６以外の本発明のポリペプチドとしては、好適には配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列に１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、該ポリペプチドの作製法は前述の「（１）本発明に使用されるポリペプチド（Ｘ）またはポリペプチド（Ｙ）」に記載の方法と同様に行なうことができる。
【００９５】
本発明のポリペプチドをコードする配列表の配列番号６で表される核酸は天然型のフィブロネクチンをコードする遺伝子、もしくは組み替え型のフィブロネクチンフラグメント、例えば前述のＣＨ−２９６やＨ−２９６等をコードする遺伝子を用いて、本発明のポリペプチドを構成する各ドメインをコードする核酸を取得し、公知の方法によりこれらをつなぎ合わせることにより取得することができる。例えば、後述の実施例１に記載のとおり、ＣＨ−２９６をコードする核酸からヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインをコードする核酸を取得し、これを重複してつなぎ合わせることにより取得することができる。
【００９６】
また、本発明の核酸としては、配列表の配列番号６で表される核酸の塩基配列において、１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものも含まれる。例えば配列表の配列番号６に記載の塩基配列から１〜６０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜３０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜１５塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、塩基の置換等は、核酸にコードされるポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、塩基の置換等の方法については前記のアミノ酸の置換等に関する記載に準ずる。
【００９７】
さらに配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のポリペプチドと同等な機能、すなわち前述のリンパ球の製造において所望の効果を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。上記「ストリンジェントな条件」とは特に限定されず、配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度および塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第３版〔サンブルーク（ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられる。
【００９８】
具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃、好ましくは６５℃で保温する条件が例示される。前記の温度は用いるＤＮＡのＴｍ値が既知である場合は、その値より５〜１２℃低い温度としてもよい。さらに、非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件および／またはより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上等の条件下で洗浄を行なう、という条件等を追加してもよい。
【００９９】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
【０１００】
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
【０１０１】
一方、このようにして得られた核酸を用いて、配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを遺伝子工学的に取得することができる。すなわち、当該核酸を適切な発現用ベクター、特に限定はないが、例えばｐＥＴベクターやｐＣｏｌｄベクター等に挿入し、公知の方法により、当該ポリペプチドを、例えば、大腸菌等で発現させることにより取得することができる。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６をコードする核酸を含むプラスミドについては、前述のとおり、ＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２として寄託されている。
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【０１０３】
調製例１ Ｈ−２９６の調製
Ｈ−２９６（フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２０）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。
【０１０４】
調製例２ ＣＨ−２９６の調製
ＣＨ−２９６（フィブロネクチンの細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメインおよびＣＳ−１ドメインからなるポリペプチド）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００）を用い、これを米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて調製した。
【０１０５】
実施例１ Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製
本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．）に記載の方法によった。
【０１０６】
（１）発現ベクターの構築
（ｉ）Ｈ−２９６発現ベクターの構築
配列表の配列番号７記載のＣＨ−２９６のアミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸２７９〜５７５（塩基番号８３５〜１７２５）よりなるポリペプチドをＨ−２９６とし、このＨ−２９６が２つ連結した変異体タンパク質（Ｈ２９６−Ｈ２９６）を発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。以下、図２を参照。
【０１０７】
まず、配列表の配列番号８記載のＣＨ−２９６の塩基配列（国際公開第０３／０８０８１７パンフレット参照）より、配列表の配列番号９及び１０に記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ及びＨ２９６−ＨｉｎｄＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号２７９〜２８４に相当する塩基配列を塩基番号１３〜３０にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７１〜５７５に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３４にもつ合成ＤＮＡである。
【０１０８】
上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＨ１０２ 約０．１μｇ、５μｌの１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＦ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＨｉｎｄＲ、０．５ＵのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【０１０９】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを１０μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【０１１０】
次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した（これ以降、このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターをｐＣｏｌｄ１４ベクターとする）。
【０１１１】
次に上記ｐＣｏｌｄ１４ベクターを上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【０１１２】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６とした。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９〜５７５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。
【０１１３】
（ｉｉ）Ｈ２９６−Ｈ２９６発現ベクターの構築
次に、国際公開第０３／０８０８１７パンフレットで公開されている塩基配列より、配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有する合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を塩基番号１０〜１５に、さらにＣＨ−２９６のアミノ酸配列（配列番号７）のアミノ酸番号５７５〜５７０に相当する塩基配列を塩基番号１７〜３４にもつ合成ＤＮＡである。上記合成プライマーと配列表の配列番号１２記載のＮＣ２ベクターの５’ＵＴＲ部分にアニ−リングするプライマー（ＮＣ２−５’ＵＴＲ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
【０１１４】
すなわち、鋳型ＤＮＡとしてｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６約０．１μｇ、１０μｌの１０×ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、８μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、２０ｐｍｏｌのＮＣ２−５’ＵＴＲ、２０ｐｍｏｌの合成プライマーＨ２９６−ＮｃｏＲ、５Ｕのｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９６℃ １分、６８℃ ４分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
【０１１５】
反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約０．９ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液をＢｉｏ ｒａｄカラムにより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを３９μｌの滅菌水に懸濁、全量５０μｌとした反応液で制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化物を抽出精製し、ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片を得た。
【０１１６】
次に、（ｉ）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
【０１１７】
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６とした。当該プラスミドは、ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６と命名、表示され、２００５年７月２２日より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２０６０２として寄託されている。このｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６は、ＣＨ−２９６のアミノ酸番号２７９〜５７５のアミノ酸配列をコードする塩基配列が間にアミノ酸“Ａ”を挟んで２つ連結した形で含むプラスミドである。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
【０１１８】
（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１２０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝１．０ｌ／ｍｉｎの条件で行なった。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、約４０ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，５０ｍＭ ＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。これを２ｌのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍｌを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行なった。
【０１１９】
すなわち、樹脂容積にして１００ｍｌ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ ＮａＣｌ］で飽和させたカラム（Φ４ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＮａＣｌ］で５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。５ｍｌずつ分画を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質を多く含む画分、約１００ｍｌを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行なった。
【０１２０】
次に、樹脂容積にして５０ｍｌ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ×１６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。その後、２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡと２５０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで５０ｍＭから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配により目的タンパク質の溶出を行なった。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより目的タンパク質のみを多く含む画分を調べたところ、非吸着画分に多く含まれ、この約１００ｍｌを回収し、２ｌのｂｕｆｆｅｒ Ｄ［５０ ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ９．５］で透析を行なった。
【０１２１】
その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で約２０倍の５ｍｌまで濃縮を行い、さらに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約６４．６ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＨ２９６−Ｈ２９６とした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、２．１６ｍｇ／ｍｌであった（分子量から計算して、約３３．４ｍＭ）。
【０１２２】
実施例２ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
ＨＬＡ−Ａ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ〔アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕上に重層後、６００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕に懸濁した後、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）と２５％ヒト血清アルブミン〔ブミネート：バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）社製〕を１７：８の割合で混合した保存液を等量加えて懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
【０１２３】
（２）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレート〔ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製〕に１ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１２４】
（３）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導は、ベドナレク（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）らの方法〔Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第１４７巻、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）〕を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ〔全てキャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製〕、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例２−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２−（２）で作製した２４穴細胞培養プレートに１ｍｌ／ウェルずつ添加し、５％ＣＯ２湿式インキュベーター内にて、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６固定化処理を行っていないプレートを使用）。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして５μｇ／ｍｌのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号１３に記載のマトリックスプロテイン由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および１μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリン〔スクリプス（Ｓｃｒｉｐｓ）社製〕を含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍｌずつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍｌ／ウェルずつ抗原提示細胞上に添加したのち、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。培養開始後１日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（プロロイキン：ＣＨＩＲＯＮ社製）を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、同様のＩＬ−２含有培地を１ｍｌずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を回収し、４４０×ｇで１０分間遠心した。遠心後、レスポンダー細胞を１ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に１ｍｌ／ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、プレートはＨ２９６−Ｈ２９６を固定化したものを使用した（対照には固定化していないプレートを使用）。再刺激後１日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また４日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌずつ添加し、さらに培養を３日続け、ＣＴＬを誘導した。１４日間培養後の細胞増殖率を表１に示す。細胞増殖率はＣＴＬ誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する誘導終了地点での細胞数の比を増殖率として求めた。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】
その結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群では固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１２７】
実施例３ 実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを１２．５ｃｍ２フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を立てて２．７ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のフラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１２８】
（２）実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。一方、実施例２−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣを２ドナー混合したのちＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した（フィーダ細胞とする）。これら３×１０４ｃｅｌｌｓのＣＴＬおよび４×１０６ｃｅｌｌｓのフィーダ細胞を５ｍｌの１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩと略す）に懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ２のフラスコに入れ、３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、実施例３−（１）のＨ２９６−Ｈ２９６固定化フラスコを使用した（対照については非固定化フラスコを使用）。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ ５ｍｌと終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加し、１４日間拡大培養を行った。結果を表２に示す。拡大培養時の増殖率は拡大培養開始時の細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比を増殖率として求め、誘導からの増殖率は誘導開始時のレスポンダー細胞数に対する拡大培養終了地点の細胞数の比として求めた。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群より高い増殖率を示した。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１３１】
実施例４ 実施例３のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例３で調製した拡大培養開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ Ｒ． ｅｔ ａｌ．）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。一晩エピトープペプチド存在下、もしくは非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ， ウシ胎児血清、Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞は、３０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）と混合し、細胞傷害活性測定用細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。
【０１３２】
実施例３で調製した抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）の各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注しておき、これらにＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞濃度が１×１０５／ｍｌとなるように調整した細胞傷害活性測定用細胞を１００μｌ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０、１０、３、１について測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清 １００μｌを採取し、蛍光プレートリーダー〔ベルトールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕（励起４８５ｎｍ／測定５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の式１にしたがって算出した。
【０１３３】
式１：特異的細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００
【０１３４】
上式において最小放出量は細胞傷害活性測定用細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は細胞傷害活性測定用細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。また、Ｅ／Ｔ比３において、拡大培養前の細胞障害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として以下の式２にしたがって算出した。
【０１３５】
式２：細胞傷害活性維持（％）＝
〔拡大培養後の細胞傷害活性（％）／拡大培養前の細胞傷害活性（％）〕×１００
【０１３６】
測定結果を表３に示す。
【０１３７】
【表３】
【０１３８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントを固定化した群については、１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった対照群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１３９】
実施例５ 実施例３のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
今回、ＣＴＬ誘導に用いたＨＬＡ Ａ２．１結合性インフルエンザウイルスタンパク質由来ペプチドはＴＣＲ Ｖβ１７陽性Ｔ細胞により認識されることがＬｅｈｎｅｒらによって示されている〔Ｌｅｈｎｅｒ Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、第１８１巻、第７９〜９１頁（１９９５）〕。したがって、ＴＣＲ Ｖβ１７の陽性細胞含有比率を測定することにより、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの指標となり得る。
実施例３で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬをＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む１５μｌのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１７抗体〔ともにベックマンコールター（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）社製〕を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＣｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞の含有率を測定した。測定結果を表４に示す。
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化したＣＴＬは、固定化しなかった対照群と比較して明らかに高い陽性細胞含有率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％、固定化していない対照群については７３．０％であった。つまり、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの含有率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１４２】
実施例６ 実施例２のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。
【０１４３】
（２） フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例２−（３）で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ ３００μｌに懸濁し、実施例６−（１）で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加、さらに培養開始後５日目以降は２〜３日ごとに固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１３日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表５に示す。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、固定化していない対照群と比較して高い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となった。
【０１４６】
実施例７ 実施例６のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例６−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表６に示す。
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、対照群と比較して、１３日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１４９】
実施例８ 実施例６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例６−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。なお、Ｈ２９６−Ｈ２９６の非存在下で拡大培養したＣＴＬを用いた対照群については拡大培養後に得られた細胞数が少なかったため、試験を実施しなかった。結果を表７に示す。
【０１５０】
【表７】
【０１５１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群において、高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７８．０％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１５２】
実施例９ Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導
（１）Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを２４穴細胞培養プレートに１ｍｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した。
【０１５３】
（２）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき使用した培養プレートは、実施例９−（１）で作製したものを用いた（対照にはＨ２９６−Ｈ２９６およびＨ−２９６を固定化していないプレートを使用）。誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表８に示す。
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
この結果、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついでＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群はこれらと比較して低い増殖率であった。つまり、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を使用した方がより高い効果が得られた。
【０１５６】
実施例１０ 実施例９のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例９で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表９に示す。
【０１５７】
【表９】
【０１５８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性において、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、対照群のＣＴＬに比べて特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時に使用することにより、高い細胞傷害活性を持ったＣＴＬを誘導することが可能となった。
【０１５９】
実施例１１ 実施例９のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例９で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１０に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。
【０１６０】
【表１０】
【０１６１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用した群において、使用していない対照群に比べて高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を誘導時に使用することにより、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬを効率よく誘導出来ることが明らかとなった。
【０１６２】
実施例１２ 実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の固定化
以下のフィーダ細胞を用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみを固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。
【０１６３】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９で調製したＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６の存在下で誘導したＣＴＬ（対照は非存在下で誘導したＣＴＬ）を５ＨＲＰＭＩで洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを５ＨＲＰＭＩ ３００μｌに懸濁し、実施例１２で作製した９６穴培養プレートを用いて３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍｌとなるようにＩＬ−２を添加、５日目以降は５ＨＲＰＭＩを用いて固定化を行っていないプレートに継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。すなわち、培養開始後５日目には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、８日目には１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１２日目には３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１１に示す。
【０１６４】
【表１１】
【０１６５】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群が最も高い増殖率を示し、ついで誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を固定化した群で、固定化していない対照群は最も低い増殖率を示した。つまり、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６を使用することで、フィーダ細胞を用いずにＣＴＬの拡大培養が可能となり、その効果はＨ２９６−Ｈ２９６を使用した方が高いことが示された。
【０１６６】
実施例１３ 実施例１２のＣＴＬの細胞傷害活性の測定
実施例１２−（２）で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１２に示す。
【０１６７】
【表１２】
【０１６８】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を添加した群のＣＴＬは、１５日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。また、誘導時および拡大培養時にＨ−２９６を添加した群のＣＴＬは、Ｈ２９６−Ｈ２９６を添加した群より低いが、特異的な細胞傷害活性を保持していた。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６あるいはＨ−２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的な細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、フィーダ細胞を用いない方法で拡大培養が可能になることが明らかになり、Ｈ２９６−Ｈ２９６の方が高い効果が得られた。
【０１６９】
実施例１４ 実施例１２のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１２−（２）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１３に示す。
【０１７０】
【表１３】
【０１７１】
Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が最も高い陽性細胞含有比率を示し、次いでＨ−２９６を誘導時および拡大培養時に使用した群が高く、固定化していない対照群は最も低い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後のＣＴＬ、すなわち拡大培養前のＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、対照群については５０．６％、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については７３．５％、Ｈ−２９６を固定化した群については７３．２％であった。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時および拡大培養時に使用することにより、フィーダ細胞を用いない系で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬ含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが認められた。
【０１７２】
実施例１５ ３０ｍＬ採血を想定した実施例９のＣＴＬのフィーダ細胞を用いない拡大培養
（１）抗ＣＤ３抗体とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６フラグメントの固定化
以下のフィーダを用いないＣＴＬ拡大培養実験で使用する培養用器材（容器）にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した。すなわち、抗ＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍｌ）とＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６（終濃度２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを９６穴細胞培養プレートに１６０μｌ添加し、４℃で一晩インキュベートした（対照には抗ＣＤ３抗体のみ固定化）。また、上記のプレートは使用前にＰＢＳで２回洗浄したのちＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。
【０１７３】
（２）フィーダ細胞を用いないＣＴＬの拡大培養
実施例９でＨ２９６−Ｈ２９６を用いて誘導したＣＴＬを３％ヒトＡＢ型血清、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下３ＨＲＰＭＩと略す）で洗浄したのち、１×１０５ｃｅｌｌｓを３００μｌの３ＨＲＰＭＩに懸濁し、実施例１５−（１）で作製した９６穴培養プレートに入れ、３７℃ 湿式ＣＯ２インキュベーター中で培養を開始した。この際、３０ｍＬ採血から得られると予想されるＰＢＭＣ ３×１０７ｃｅｌｌｓを用いた培養スケールにおいて、誘導から拡大培養までのヒトＡＢ型血清の使用量を最大１５ｍＬ、ＲＰＭＩ培地使用量を最大１０Ｌに制限して拡大培養をおこなった。培養開始１日目に終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、５日目には１％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には０．２％ヒトＡＢ型血清ＲＰＭＩ培地を用いて固定化を行っていないプレートに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、１２日目には終濃度５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２のみ添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せずに１５日間拡大培養を行った。細胞増殖率を表１４に示す。
【０１７４】
【表１４】
【０１７５】
拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化した群のＣＴＬは、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時に用いて得られたＣＴＬについて、拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６あるいはＣＨ−２９６を使用することにより高い細胞増殖効果が見られた。
【０１７６】
実施例１６ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの誘導（自己血漿）
実施例２−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例２−（３）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、５％自己血漿、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１％ストレプトマイシン−ペニシリンを含むＲＰＭＩ培地（以下５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩと略す）を用いた。こうして調製した誘導開始後１４日目の細胞増殖率を表１５に示す。
【０１７７】
【表１５】
【０１７８】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群において、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群よりも高い増殖率が得られた。つまり、自己血漿を含む培地において、ＣＴＬ誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１７９】
実施例１７ 実施例１６のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１６で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１６に示す。なお、ＣＴＬ誘導前のレスポンダー細胞のＶβ１７陽性細胞含有率は２．５％であった。
【０１８０】
【表１６】
【０１８１】
誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化していない対照群と比較して高い陽性細胞含有比率を示した。すなわち、誘導時にＨ２９６−Ｈ２９６を用いることで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬを効率よく誘導できることが明らかとなった。
【０１８２】
実施例１８ 実施例１６のＣＴＬのフィーダ細胞を用いた拡大培養
実施例１６で調製したＨ２９６−Ｈ２９６存在下で誘導したＣＴＬ（対照はＨ２９６−Ｈ２９６非存在下で誘導したＣＴＬ）を用い、実施例３と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、５ＰｌａｓｍａＲＰＭＩ培地を用いて培養し、１４日間拡大培養を行った。１４日後の細胞増殖率を表１７に示す。
【０１８３】
【表１７】
【０１８４】
誘導時及び拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化しなかった群より高い増殖率を示した。つまり、Ｈ２９６−Ｈ２９６を誘導時あるいは拡大培養時に使用することで、細胞の増殖率を高めることが明らかとなった。
【０１８５】
実施例１９ 実施例１８のＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１８で得られたＣＴＬを実施例４と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１８に示す。
【０１８６】
【表１８】
【０１８７】
ペプチド非存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性はほぼ０％であり、非特異的な活性はないことを確認した。ペプチド存在下で培養したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に対する細胞傷害活性について、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群は１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化しない対照群については、その活性は明らかに低下していた。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。
【０１８８】
実施例２０ 実施例１８のＣＴＬ細胞集団中におけるＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定
実施例１８で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを実施例５と同様の方法にてＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有比率の測定を行った。結果を表１９に示す。
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
誘導時および拡大培養時にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した群について、固定化していない対照群と比較して、明らかに高い陽性細胞含有比率を示した。なお、誘導後すなわち拡大培養前のＣＴＬについてのＴＣＲ Ｖβ１７陽性細胞含有率は、表１６に示したように、Ｈ２９６−Ｈ２９６を固定化した群については８０．１％であり、固定化していない群については７２．１％であった。つまり、自己血漿を用いた拡大培養で、Ｈ２９６−Ｈ２９６をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に使用することで、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの含有比率を高く保持したまま拡大培養が可能であることが明らかとなった。
【０１９１】
実施例２１ Ｈ２９６−Ｈ２９６を用いたリンパ球（リンフォカイン活性化細胞）の拡大培養
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ上に重層して５００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。リンパ球拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
【０１９２】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬずつ添加した。この時、Ｈ２９６−Ｈ２９６添加群には実施例１で調製したＨ２９６−Ｈ２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
【０１９３】
（３）リンパ球の拡大培養
３％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、以下３％ＡＩＭ−Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化プレートに３％ＡＩＭ−Ｖを ２ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群とも０．０７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、培養液を何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。血清濃度は、３０ｍＬ採血より得られたＰＢＭＣを培地１０Ｌで培養することを想定して決定した。培養を継続し、７日目には各群とも０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、対照群（Ｈ２９６−Ｈ２９６非固定化）では０．１％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて、およびＨ２９６−Ｈ２９６固定化群では０．０９％ ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて希釈した培養液（液量１２．６ｍＬ）を何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目には、７日目と同じ血清濃度のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて０．４１３×１０６／ｍＬとなるように細胞液を希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２０に示す。
【０１９４】
【表２０】
【０１９５】
表２０に示されるように、リンパ球拡大培養初期にＨ２９６−Ｈ２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してリンパ球の拡大培養率が高かった。このことから、Ｈ２９６−Ｈ２９６はリンパ球拡大培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明により、リンパ球の製造方法が提供される。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られるリンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図２】Ｈ２９６−Ｈ２９６の作製法を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９８】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:6 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named H296-H296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:8 ; Polynucleotide coding Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Primer H296-NcoF.
SEQ ID NO:10 ; Primer H296-HindR.
SEQ ID NO:11 ; Primer H296-NcoR.
SEQ ID NO:12 ; Primer NC2-5' UTR.
SEQ ID NO:13 ; Designed peptide based on matrix-protein derived from influenza virus.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法、
ポリペプチド（Ｘ）：配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）を２個以上含有し、かつ配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｎ）を１個以上含む、
ただし、ポリペプチド（Ｘ）は配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含む、
ポリペプチド（Ｙ）：前記ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有する。
【請求項２】
ポリペプチド（ｍ）が、配列表の配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列を含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ポリペプチド（Ｘ）が、ポリペプチド（ｍ）を２個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ポリペプチド（Ｘ）が、ポリペプチド（ｎ）を２個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
ポリペプチド（Ｘ）が配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有する請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
リンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である請求項１〜５いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する請求項１〜６いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
外来遺伝子をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウィルスベクターを用いて導入する請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球を有効成分として含有する医薬。
【請求項１１】
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチド。
【請求項１２】
下記から選択される核酸、
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドをコードする核酸（ｒ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）。
【請求項１】
下記ポリペプチド（Ｘ）及び／又はポリペプチド（Ｙ）の存在下での培養工程を包含することを特徴とするリンパ球の製造方法、
ポリペプチド（Ｘ）：配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）を２個以上含有し、かつ配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｎ）を１個以上含む、
ただし、ポリペプチド（Ｘ）は配列表の配列番号１〜３から選択されるいずれかのアミノ酸配列を重複して含む、
ポリペプチド（Ｙ）：前記ポリペプチド（Ｘ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含み、当該置換、欠失、挿入もしくは付加が前記ポリペプチド（ｍ）及び／又は前記ポリペプチド（ｎ）中に含まれるポリペプチド（Ｙ）であって、前記ポリペプチド（Ｘ）と同等な機能を有する。
【請求項２】
ポリペプチド（ｍ）が、配列表の配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列を含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ポリペプチド（Ｘ）が、ポリペプチド（ｍ）を２個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ポリペプチド（Ｘ）が、ポリペプチド（ｎ）を２個含んでなる請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
ポリペプチド（Ｘ）が配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有する請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
リンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球又はリンフォカイン活性化細胞である請求項１〜５いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含する請求項１〜６いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
外来遺伝子をレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レンチウィルスベクターまたはシミアンウィルスベクターを用いて導入する請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法により得られるリンパ球を有効成分として含有する医薬。
【請求項１１】
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチド。
【請求項１２】
下記から選択される核酸、
配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）、またはアミノ酸配列（ｊ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｋ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリペプチドをコードする核酸（ｒ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）、
配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸（ｓ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（ｔ）であって、当該核酸（ｔ）によってコードされるポリペプチドが配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列（ｊ）を有するポリペプチドと同等な機能を有する核酸（ｔ）。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−６１０２０（Ｐ２００７−６１０２０Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５２７１２（Ｐ２００５−２５２７１２）
【出願日】平成１７年８月３１日（２００５．８．３１）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月３１日（２００５．８．３１）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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