リン酸化ペプチドの精製方法及び精製装置
【課題】簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる、リン酸化ペプチドの精製装置及び精製方法を提供する。
【解決手段】試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラム７に保持させ、逆相系前処理カラム７に保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラム９に結合させ、チタニア前処理カラム９をアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去し、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラム13により精製した。
【解決手段】試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラム７に保持させ、逆相系前処理カラム７に保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラム９に結合させ、チタニア前処理カラム９をアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去し、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラム13により精製した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複雑な組成のペプチド混合物からリン酸化ペプチドを簡便に抽出又は分離するための、リン酸化ペプチドの精製装置及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のリン酸化は、生体内でのシグナル伝達や細胞機能の調節に幅広く用いられている調節機構である。ヒトの組織には数千種のタンパク質が含まれているが、そのうち３割はリン酸化されているといわれ、そのリン酸化状態は、細胞の状態によって変化している。よってシグナル伝達や細胞機能の調節の異常によって引き起こされるガンをはじめとした多くの病気の原因解明、診断、治療薬の開発には、どのタンパク質のどこがリン酸化されているかという情報が非常に重要なものとなる。そのため、多くのタンパク質混合物中のどのタンパク質のどのアミノ酸残基がリン酸化されているかを簡便、迅速、網羅的に解析する技術と装置は、これからの医療の発展に欠かせないものであり、医・薬業界から強い要望がある。
【０００３】
特定タンパク質の特定部位のリン酸化については一部では抗体を用いた解析系が使われているが、多くのリン酸化部位を網羅的に解析することはできない。網羅的解析では、そのままではタンパク質のどの部分がリン酸化されているか解析できないため、タンパク質分解酵素でペプチドにし、そのリン酸化ペプチドを単離精製して解析される。最終的な分析は、近年急速に発展した質量分析装置によって超高感度、迅速に行えるようになってきた。この系では、質量分析装置にかける前に、試料をいかに高度に精製して、非リン酸化ペプチドの混入の少ないものを得るかの一点にかかっている。それは、質量分析法の本質に関わることで、質量分析を行うためには、試料分子をイオン化しないと測定できないわけであるが、リン酸化ペプチドは非リン酸化ペプチドにくらべて、イオン化しやすさが１／１０から１／１０００と小さいため、十分検出できる量のリン酸化ペプチドを含む試料でも、非リン酸化ペプチドを多く含んでいると、リン酸化ペプチドのイオン化が完全に抑制されて全く検出できないことは周知の事実である。このためこれまでもリン酸化ペプチド精製法、装置がいくつか報告されてきた。
【０００４】
ひとつは、放射性リン酸でラベルしたタンパク質を分解してペプチドにした後、通常のクロマトグラフィーの組み合わせで精製して解析する方法であるが、通常リン酸化タンパク質の含量が低いため、多くのリン酸化部位を解析しようとすると、精製に膨大な時間がかかる。一方、網羅的にリン酸化ペプチドを濃縮する方法としてはこれまでに、ＩＭＡＣ法が開発されている。この方法は、キレート担体に鉄イオンなどを担持させ、これにリン酸化ペプチドを配位させ、よく洗浄した後リン酸化ペプチドを溶離する方法である。この方法では、リン酸化ペプチドが高度に精製されるが、カラムに対するリン酸化ペプチドの結合力が弱いため、リン酸化ペプチドの約３０％は結合しない。よって網羅的な解析には不十分な方法である。
【０００５】
その後、チタニアが強くリン酸化合物を結合する性質を利用してチタニアカラムによるリン酸化ペプチドの精製法が開発された（特許文献１、２）。このカラムはリン酸化ペプチドを９０％近く結合することから網羅性に優れ、精製タンパク質の分解物等の単純な混合物からのリン酸化ペプチドの精製には威力を発揮した。しかし、チタニアカラムはリン酸化ペプチドだけでなく、非リン酸化ペプチドも非特異的に結合してしまうため、これまでの方法と装置では、実際の研究、診断等で使いたい複雑な組成のタンパク質混合物を分解して得られるペプチド混合物から、質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることが困難であった。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３／０６５０３１号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２８３５１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる、リン酸化ペプチドの精製装置及び精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
通常、前処理カラムと逆相系分離カラムの組み合わせにより十分な精製度が達成できない場合には、前処理の効率を上げるために、逆相系分離カラムとは異なる分離モードの前処理カラムを追加する。しかし、本発明者らは、逆相系分離カラムと同じ分離モードの逆相系前処理カラムを追加することにより、前処理の効率が向上することを見出した。つまり、前処理カラムに通す試料から、逆相系分離カラムに結合しないもの、及び結合しても溶出されにくいものを予め逆相系前処理カラムを用いて徹底的に除くことによって、リン酸化ペプチドの精製を理想的な形で行うことができることを見出した。その結果、本発明に想到した。
【０００８】
すなわち、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法は、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
また、前記非リン酸化ペプチド成分除去工程において、前記チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することを特徴とする。
【００１０】
また、前記リン酸化ペプチド成分精製工程において、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする。
【００１１】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置は、逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備え、前記２つのスイッチングバルブを切換えることにより、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第１の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムと前記チタニア前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第２の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記ドレインに至る第３の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記逆相系分離カラムへ至る第４の流路とを切換え可能に構成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリン酸化ペプチドの精製方法によれば、逆相系前処理カラム、チタニア前処理カラムを用いて２段階の前処理を行い、かつ、前処理において、チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去することによって、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１３】
また、チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することにより、より効果的に非リン酸化ペプチド成分を除去し、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１４】
また、チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることにより、効果的にリン酸化ペプチド成分を溶出させて、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１５】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置によれば、逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備えた簡単な構成でありながら、２つのスイッチングバルブを操作して流路を切換えることにより、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法及び精製装置について、詳細に説明する。
【００１７】
本発明のリン酸化ペプチドの精製方法は、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えている。
【００１８】
ペプチド成分保持工程においては、逆相系前処理カラムにリン酸化ペプチドを含む試料溶液を通す。なお、ここでは逆相系前処理カラムを酸性雰囲気下とするのが好ましく、逆相系前処理カラムに通す溶媒としては、トリフルオロ酢酸水溶液などが好適に用いられる。逆相系前処理カラムに試料成分を通すことにより、つぎの工程で用いるチタニア前処理カラムに強く結合する非リン酸化難溶性ペプチドと、リン酸化ペプチドのチタニアカラムへの結合を阻害するリン酸基含有低分子化合物等が除去される。これにより、チタニア前処理カラムによるリン酸化ペプチド精製に対する妙害物質が少なくなり、後工程において、より精製されたリン酸化ペプチドが得られる。
【００１９】
ペプチド成分結合工程においては、逆相系前処理カラムからチタニア前処理カラムへ溶離液を通す。なお、溶離液としては、アセトニトリルを含有しているものが好適に用いられる。逆相系前処理カラムへ溶離液を通すことにより逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離して、その溶離液をチタニア前処理カラムに通すことにより、目的成分のリン酸化ペプチドが選択的にチタニア前処理カラムに結合する。
【００２０】
非リン酸化ペプチド成分除去工程においては、チタニア前処理カラムにアルコール又はアルコールを含む溶媒を通して、チタニア前処理カラムを洗浄する。この洗浄により、チタニア前処理カラムに非特異的に結合していた非リン酸化ペプチド成分がチタニア前処理カラムから除去される。アルコール又はアルコールを含む溶媒でチタニア前処理カラムを洗浄することで、従来の方法では除去できなかった非リン酸化ペプチド成分をチタニア前処理カラムから除去することができ、後工程で得られるリン酸化ペプチドの精製度が格段に高められる。その結果、質量分析計で検出可能なリン酸化ペプチドの数が飛躍的に増加し、生体由来の複雑なタンパク質混合物を分離することなく酵素分解した複雑なペプチド混合物の試料についても、リン酸化ペプチドの網羅的解析が可能となる。
【００２１】
また、チタニア前処理カラムを洗浄するアルコール又はアルコールを含む溶媒としては、特に、イソプロピルアルコールが好適に用いられる。チタニア前処理カラムをイソプロピルアルコールを用いて洗浄することにより、より効果的に非リン酸化ペプチド成分を除去し、後工程において、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２２】
リン酸化ペプチド成分精製工程においては、チタニア前処理カラムから逆相系分離カラムへリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を通す。チタニア前処理カラムへリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を通すことによりチタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させ、その溶出液を逆相系分離カラムに通すことによりリン酸化ペプチド成分中の個々の成分を分離し、精製する。ここで、チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させるリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液としては、リン酸緩衝液やｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液が好適に用いられる。チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸緩衝液やｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることにより、効果的にリン酸化ペプチド成分を溶出させて、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２３】
逆相系分離カラムにより精製されたリン酸化ペプチド成分は、常法により質量分析装置などの分析手段により分析される。
【００２４】
以上のように、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法によれば、逆相系前処理カラム、チタニア前処理カラムを用いて２段階の前処理を行い、かつ、前処理において、チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去することによって、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２５】
つぎに、添付した図面を参照しながら、本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例について説明する。
【００２６】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例の構成を示す図１において、１，２は溶媒が収容される溶媒容器であり、それぞれポンプ３，４の一端に接続している。そして、ポンプ３，４の他端は、インジェクター５に接続するとともに、インジェクター５は、２ポジション６ポートのスイッチングバルブ６の第１ポート61に接続している。なお、スイッチングバルブ６は、第１ポート61と第２ポート62、第３ポート63と第４ポート64、第５ポート65と第６ポート66をそれぞれ接続する第１ポジションと、第２ポート62と第３ポート63、第４ポート64と第５ポート65、第６ポート66と第１ポート61をそれぞれ接続する第２ポジションを切換え可能に構成されている。
【００２７】
スイッチングバルブ６の第２ポート62には、逆相系前処理カラム７の一端が接続している。逆相系前処理カラム７としては、例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｒ３（アプライドバイオシステムズ）などを用いることができる。そして、逆相系前処理カラム７の他端は、２ポジション６ポートのスイッチングバルブ８の第１ポート81に接続している。なお、スイッチングバルブ８は、第１ポート81と第２ポート82、第３ポート83と第４ポート84、第５ポート85と第６ポート86をそれぞれ接続する第１ポジションと、第２ポート82と第３ポート83、第４ポート84と第５ポート85、第６ポート86と第１ポート81をそれぞれ接続する第２ポジションを切換え可能に構成されている。
【００２８】
スイッチングバルブ８の第２ポート82には、チタニア前処理カラム９の一端が接続し、チタニア前処理カラム９の他端は、スイッチングバルブ８の第５ポート85に接続している。
【００２９】
10は溶媒容器であり、溶媒容器10には、チタニア前処理カラム９の洗浄や、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチドの溶出に使用される複数の溶媒が収容されている。溶媒容器10は、６方バルブ11を介してポンプ12の一端に接続し、６方バルブ11を切換えることによって、溶媒容器10からポンプ12に供給される溶媒を切換えることができるように構成されている。そして、ポンプ12の他端は、スイッチングバルブ８の第３ポート83に接続している。
【００３０】
このように、スイッチングバルブ８にポンプ12を接続したことにより、チタニア前処理カラム９を徹底的に洗浄して、リン酸化ペプチドを高度に精製することができるようになっている。
【００３１】
スイッチングバルブ８の第４ポート84は、スイッチングバルブ６の第５ポート65に接続し、スイッチングバルブ６の第６ポート86には、逆相系分離カラム13の一端が接続している。そして、逆相系分離カラム13の他端には、ＵＶ検出器14の一端が接続している。なお、ＵＶ検出器14の代わりに、質量分析装置、電気化学検出器、示唆屈折率検出計などの検出器や分析装置を接続してもよい。
【００３２】
また、スイッチングバルブ６の第４ポート64、スイッチングバルブ８の第６ポート86には、それぞれドレイン15，16が接続し、ドレイン15，16は、逆相系カラム13の他端とＵＶ検出器14の一端をつなぐ流路に接続している。そして、ＵＶ検出器14の他端には、分離した画分の分取口17が接続している。分取口17には、さらに質量分析装置などの分析装置を接続してもよい。
【００３３】
なお、ポンプ３，４，12、スイッチングバルブ６，８、６方バルブ11は、図示しない制御手段により動作が制御されるように構成されている。そして、プログラムにより制御手段を動作させることにより、試料溶液の注入からリン酸化ペプチドの精製までを全自動で行うことができるようになっている。
【００３４】
つぎに、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置を用いたリン酸化ペプチドの精製方法について説明する。
【００３５】
はじめのペプチド成分保持工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とを順に経由してドレイン16へ至る第１の流路が形成される。そして、インジェクター５から試料溶液を注入するとともに、ポンプ３又はポンプ４から所定の溶媒を供給して、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラム７に保持させる。
【００３６】
つぎのペプチド成分結合工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第１ポジションとする。これにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とチタニア前処理カラム９とを順に経由してドレイン16へ至る第２の流路が形成される。そして、ポンプ３又はポンプ４から所定の溶媒を供給して、逆相系前処理カラム７に保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラム９に結合させる。
【００３７】
なお、ポンプ３，４の流速を調節することで溶媒容器１に収容された溶媒と溶媒容器２に収容された溶媒の供給量を変えることができ、ポンプ３，４のいずれか一方を停止させることにより溶媒容器１に収容された溶媒と溶媒容器２に収容された溶媒を切換えることができる。
【００３８】
その後の非リン酸化ペプチド成分除去工程においては、スイッチングバルブ６を第２ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由してドレイン15に至る第３の流路が形成される。このとき、ポンプ３，４は停止させる。そして、ポンプ12からアルコール又はアルコールを含む溶媒等を供給して、チタニア前処理カラム９を洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する。
【００３９】
最後のリン酸化ペプチド成分精製工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ至る第４の流路が形成される。そして、ポンプ12からリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を供給して、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させて逆相系分離カラム13により精製する。
【００４０】
そして、精製されたリン酸化ペプチド成分の画分は、ＵＶ検出器14により検出された後、分取口17から分取される。
【００４１】
以上のように、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置は、逆相系前処理カラム７と、チタニア前処理カラム９と、逆相系分離カラム13と、２つのスイッチングバルブ６，８と、複数のポンプ３，４，12と、インジェクター５と、ドレイン15，16とを備え、２つのスイッチングバルブ６，８を切換えることにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とを順に経由してドレイン16へ至る第１の流路と、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とチタニア前処理カラム９とを順に経由してドレイン16へ至る第２の流路と、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由してドレイン15に至る第３の流路と、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ至る第４の流路とを切換え可能に構成したものである。逆相系前処理カラム７と、チタニア前処理カラム９と、逆相系分離カラム13と、２つのスイッチングバルブ６，８と、複数のポンプ３，４，12と、インジェクター５と、ドレイン15，16とを備えた簡単な構成でありながら、２つのスイッチングバルブ６，８を操作して流路を切換えることにより、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００４２】
また、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置を構成するカラムの分離モードは、逆相系前処理カラムと逆相系分離カラムの逆相系と、チタニア前処理カラムのチタニアの２つのみであるため、用いる溶媒の種類が少なくて済み、装置の構成を簡略化できる。
【００４３】
なお、本実施例においては、インジェクターに接続するポンプを２台とした例について説明したが、１台のポンプとしてもよい。
【００４４】
以下の実施例において、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法について、より具体例に説明する。なお、本発明は、下記の実施例に限定されるものではなく、種々の変形実施が可能である。
【実施例１】
【００４５】
カエルの分裂期卵の抽出液（ＭＣ）の全タンパク質をトリプシンで加水分解して得た複雑な組成のペプチド混合物を試料とし、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法にしたがって設定した全自動プログラムを用いて、図１に示すリン酸化ペプチドの精製装置を用いて、リン酸化ペプチドを精製した。
【００４６】
ここで、逆相系前処理カラム７には、Ｏｌｉｇｏ Ｒ３（内径４．６ｍｍ×１００ｍｍ）（アプライドバイオシステムズ）、チタニア前処理カラム９には、Ｔｉｔａｎｓｐｈｅｒｅ ＴｉＯ（登録商標）（内径４．０ｍｍ×１０ｍｍ）（ＧＬサイエンス）、逆相系分離カラム13には、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧII（内径４．６ｍｍ×１００ｍｍ）（資生堂）を用いた。
【００４７】
はじめのペプチド成分保持工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、インジェクター５に試料４ｍｇを注入し、ポンプ３から逆相系前処理カラム７へ０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で６０分間送った。
【００４８】
つぎのペプチド成分結合工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第１ポジションとし、ポンプ３から０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液、ポンプ４から０．０８２％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を２０：８０の比で送り、流速０．１ｍｌ／分で逆相系前処理カラム７からチタニア前処理カラム９へ３０分間流した。その後、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、ポンプ３を停止し、ポンプ４から０．０８２％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った後、ポンプ４を停止し、ポンプ３から０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った。その後、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第１ポジションとし、ポンプ３から０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った。
【００４９】
その後の非リン酸化ペプチド成分除去工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第２ポジション、第２ポジションとし、ポンプ12からチタニア前処理カラム９へ０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液で調製した１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を流速０．５ｍｌ／分で１５分間送り、その後、６方バルブ11を切換えることにより、順次０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間、７５０ｍＭトリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル水溶液を１０分間、０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間、イソプロピルアルコールを１０分間、０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間送って、チタニア前処理カラム９を洗浄した。そして、上記の一連の洗浄の操作をもう一度繰り返した。
【００５０】
最後のリン酸化ペプチド成分精製工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ０．５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）を流速０．２〜０．３ｍｌ／分で１０分、流速０．３〜０．５ｍｌ／分で１５分、流速０．５ｍｌ／分で５分送り、その後、６方バルブ11を切換えることにより、３％ギ酸水溶液を１０分間送った。
【００５１】
その結果、精製されたリン酸化ペプチドが、約９０の画分に分けられて回収された。溶媒を除いた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型の質量分析計で分析したところ、２９２種類のリン酸化ペプチドが検出された。また、リン酸化ペプチドの純度は、６３％であった。
【００５２】
比較例として、逆相系前処理カラム７を用いない従来の方法により、試料を直接、チタニア前処理カラム９へ通して、リン酸化ペプチドを精製した。なお、従来の方法との比較を行うため、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法の特徴の一つである、非リン酸化ペプチド成分除去工程におけるイソプロピルアルコールによる洗浄を行わず、その代わりにトリフルオロ酢酸を含む７０％アセトニトリル水溶液による洗浄を行った。また、チタニア前処理カラム９には、Ｔｉｔａｎｓｐｈｅｒｅ ＴｉＯ（登録商標）（内径４．０ｍｍ×１０ｍｍ）（ＧＬサイエンス）、逆相系分離カラム13には、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８ ＳＧ３００（内径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）（資生堂）を用いた。その結果、１７本しかリン酸化ペプチドを検出できなかった。
【００５３】
このように、従来の方法で精製して得られた画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型の質量分析計で測定しても、リン酸化ペプチドはほとんど検出されなかった。これは、非リン酸化ペプチドがリン酸化ペプチドよりも１０〜１０００倍イオン化しやすいため、非リン酸化ペプチドが混入しているとリン酸化ペプチドのイオン化が抑制されるためである。
【実施例２】
【００５４】
上記実施例１の非リン酸化ペプチド成分除去工程において、種々の溶媒を用いて洗浄を行い、洗浄効果を比較した。なお、非リン酸化ペプチド成分除去工程における洗浄用の溶媒と試料を変えたほかは、実施例１と同様の条件で操作を行った。試料は、２０μｇのα-カゼイン、２０μｇのβ-カゼイン、２０μｇの卵白アルブミン、１ｍｇのウシ血清アルブミン、１ｍｇのβ-ラクトグロブリン及び１ｍｇのカルボニックアンヒドラーゼタンパク質をトリプシンで分解した混合物を用いた。
【００５５】
１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリルを用いて洗浄した結果得られたリン酸化ペプチドの液体クロマトグラフを図２に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合を図３に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、７０％イソプロピルアルコールを用いた場合を図４に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、メチルアルコールを用いた場合を図５に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０％ブチルアルコール／８０％イソプロピルアルコールを用いた場合を図６に、１Ｍ ＮａＣｌ、イソプロピルアルコールを用いた場合を図７に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合を図８に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（ｐＨ４．２５）を用いた場合を図９に、実施例１と同様の条件である１Ｍ ＮａＣｌ、７５０ｍＭ トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合を図１０に示す。なお、図中、点を付したピークがリン酸化ペプチドである。
【００５６】
この結果、実施例１と同様の条件であるトリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコール併用した場合（図１０）において最も洗浄効果が高かった。ついで、アセトニトリルとイソプロピルアルコールを併用した場合（図３、図４、図６）において、洗浄効果が高かった。また、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合（図８）においては、洗浄効果が非常に高いものの、目的物であるリン酸化ペプチドのロスが見られた。
【００５７】
以上の結果より、非リン酸化ペプチド成分除去工程において、アルコール又はアルコールを含む洗浄液を用いることによって洗浄効果が大幅に改善されることが確認された。これは、チタニア表面に水素結合と疎水結合の共同作用で非特異的に結合している非リン酸化ペプチド成分が、疎水結合と水素結合の両方の結合を同時に切断する作用を持つアルコールで特異的、効率的に洗い流されたためと思われる。
【実施例３】
【００５８】
上記実施例１のリン酸化ペプチド成分精製工程において、０．５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）の代わりに、０．５Ｍ亜リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９９）を用いて酸性条件下とし、チタニア前処理カラム９からのリン酸化ペプチドの溶出効果を比較した。
【００５９】
試料には、リン酸化タンパク質であるβ−カゼインをトリプシンで加水分解して得たβ−カゼイン消化物２０μｇを用いた。
【００６０】
亜リン酸ナトリウム水溶液による溶出を３回、コントロールとしてリン酸ナトリウム水溶液による溶出を１回行い、１リン酸化ペプチドについて、高速液体クロマトグラフィーによりピーク面積を測定した。その結果を以下に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
亜リン酸ナトリウム水溶液により溶出を行った場合においても、リン酸により溶出を行った場合と同等の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例を示す構成図である。
【図２】実施例２における１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリルを用いて洗浄した結果得られたリン酸化ペプチドの逆相クロマトグラムである。
【図３】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合の液体クロマトグラフである。
【図４】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、７０％イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図５】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、メチルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図６】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０％ブチルアルコール／８０％イソプロピルアルコールを用いた場合の液体クロマトグラフである。
【図７】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図８】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図９】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（ｐＨ４．２５）を用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図１０】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７５０ｍＭ トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【符号の説明】
【００６４】
３，４，12 ポンプ
５ インジェクター
６，８ スイッチングバルブ
７ 逆相系前処理カラム
９ チタニア前処理カラム
13 逆相系分離カラム
15，16 ドレイン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複雑な組成のペプチド混合物からリン酸化ペプチドを簡便に抽出又は分離するための、リン酸化ペプチドの精製装置及び精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のリン酸化は、生体内でのシグナル伝達や細胞機能の調節に幅広く用いられている調節機構である。ヒトの組織には数千種のタンパク質が含まれているが、そのうち３割はリン酸化されているといわれ、そのリン酸化状態は、細胞の状態によって変化している。よってシグナル伝達や細胞機能の調節の異常によって引き起こされるガンをはじめとした多くの病気の原因解明、診断、治療薬の開発には、どのタンパク質のどこがリン酸化されているかという情報が非常に重要なものとなる。そのため、多くのタンパク質混合物中のどのタンパク質のどのアミノ酸残基がリン酸化されているかを簡便、迅速、網羅的に解析する技術と装置は、これからの医療の発展に欠かせないものであり、医・薬業界から強い要望がある。
【０００３】
特定タンパク質の特定部位のリン酸化については一部では抗体を用いた解析系が使われているが、多くのリン酸化部位を網羅的に解析することはできない。網羅的解析では、そのままではタンパク質のどの部分がリン酸化されているか解析できないため、タンパク質分解酵素でペプチドにし、そのリン酸化ペプチドを単離精製して解析される。最終的な分析は、近年急速に発展した質量分析装置によって超高感度、迅速に行えるようになってきた。この系では、質量分析装置にかける前に、試料をいかに高度に精製して、非リン酸化ペプチドの混入の少ないものを得るかの一点にかかっている。それは、質量分析法の本質に関わることで、質量分析を行うためには、試料分子をイオン化しないと測定できないわけであるが、リン酸化ペプチドは非リン酸化ペプチドにくらべて、イオン化しやすさが１／１０から１／１０００と小さいため、十分検出できる量のリン酸化ペプチドを含む試料でも、非リン酸化ペプチドを多く含んでいると、リン酸化ペプチドのイオン化が完全に抑制されて全く検出できないことは周知の事実である。このためこれまでもリン酸化ペプチド精製法、装置がいくつか報告されてきた。
【０００４】
ひとつは、放射性リン酸でラベルしたタンパク質を分解してペプチドにした後、通常のクロマトグラフィーの組み合わせで精製して解析する方法であるが、通常リン酸化タンパク質の含量が低いため、多くのリン酸化部位を解析しようとすると、精製に膨大な時間がかかる。一方、網羅的にリン酸化ペプチドを濃縮する方法としてはこれまでに、ＩＭＡＣ法が開発されている。この方法は、キレート担体に鉄イオンなどを担持させ、これにリン酸化ペプチドを配位させ、よく洗浄した後リン酸化ペプチドを溶離する方法である。この方法では、リン酸化ペプチドが高度に精製されるが、カラムに対するリン酸化ペプチドの結合力が弱いため、リン酸化ペプチドの約３０％は結合しない。よって網羅的な解析には不十分な方法である。
【０００５】
その後、チタニアが強くリン酸化合物を結合する性質を利用してチタニアカラムによるリン酸化ペプチドの精製法が開発された（特許文献１、２）。このカラムはリン酸化ペプチドを９０％近く結合することから網羅性に優れ、精製タンパク質の分解物等の単純な混合物からのリン酸化ペプチドの精製には威力を発揮した。しかし、チタニアカラムはリン酸化ペプチドだけでなく、非リン酸化ペプチドも非特異的に結合してしまうため、これまでの方法と装置では、実際の研究、診断等で使いたい複雑な組成のタンパク質混合物を分解して得られるペプチド混合物から、質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることが困難であった。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０３／０６５０３１号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２８３５１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる、リン酸化ペプチドの精製装置及び精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
通常、前処理カラムと逆相系分離カラムの組み合わせにより十分な精製度が達成できない場合には、前処理の効率を上げるために、逆相系分離カラムとは異なる分離モードの前処理カラムを追加する。しかし、本発明者らは、逆相系分離カラムと同じ分離モードの逆相系前処理カラムを追加することにより、前処理の効率が向上することを見出した。つまり、前処理カラムに通す試料から、逆相系分離カラムに結合しないもの、及び結合しても溶出されにくいものを予め逆相系前処理カラムを用いて徹底的に除くことによって、リン酸化ペプチドの精製を理想的な形で行うことができることを見出した。その結果、本発明に想到した。
【０００８】
すなわち、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法は、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
また、前記非リン酸化ペプチド成分除去工程において、前記チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することを特徴とする。
【００１０】
また、前記リン酸化ペプチド成分精製工程において、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする。
【００１１】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置は、逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備え、前記２つのスイッチングバルブを切換えることにより、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第１の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムと前記チタニア前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第２の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記ドレインに至る第３の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記逆相系分離カラムへ至る第４の流路とを切換え可能に構成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリン酸化ペプチドの精製方法によれば、逆相系前処理カラム、チタニア前処理カラムを用いて２段階の前処理を行い、かつ、前処理において、チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去することによって、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１３】
また、チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することにより、より効果的に非リン酸化ペプチド成分を除去し、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１４】
また、チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることにより、効果的にリン酸化ペプチド成分を溶出させて、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００１５】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置によれば、逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備えた簡単な構成でありながら、２つのスイッチングバルブを操作して流路を切換えることにより、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法及び精製装置について、詳細に説明する。
【００１７】
本発明のリン酸化ペプチドの精製方法は、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えている。
【００１８】
ペプチド成分保持工程においては、逆相系前処理カラムにリン酸化ペプチドを含む試料溶液を通す。なお、ここでは逆相系前処理カラムを酸性雰囲気下とするのが好ましく、逆相系前処理カラムに通す溶媒としては、トリフルオロ酢酸水溶液などが好適に用いられる。逆相系前処理カラムに試料成分を通すことにより、つぎの工程で用いるチタニア前処理カラムに強く結合する非リン酸化難溶性ペプチドと、リン酸化ペプチドのチタニアカラムへの結合を阻害するリン酸基含有低分子化合物等が除去される。これにより、チタニア前処理カラムによるリン酸化ペプチド精製に対する妙害物質が少なくなり、後工程において、より精製されたリン酸化ペプチドが得られる。
【００１９】
ペプチド成分結合工程においては、逆相系前処理カラムからチタニア前処理カラムへ溶離液を通す。なお、溶離液としては、アセトニトリルを含有しているものが好適に用いられる。逆相系前処理カラムへ溶離液を通すことにより逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離して、その溶離液をチタニア前処理カラムに通すことにより、目的成分のリン酸化ペプチドが選択的にチタニア前処理カラムに結合する。
【００２０】
非リン酸化ペプチド成分除去工程においては、チタニア前処理カラムにアルコール又はアルコールを含む溶媒を通して、チタニア前処理カラムを洗浄する。この洗浄により、チタニア前処理カラムに非特異的に結合していた非リン酸化ペプチド成分がチタニア前処理カラムから除去される。アルコール又はアルコールを含む溶媒でチタニア前処理カラムを洗浄することで、従来の方法では除去できなかった非リン酸化ペプチド成分をチタニア前処理カラムから除去することができ、後工程で得られるリン酸化ペプチドの精製度が格段に高められる。その結果、質量分析計で検出可能なリン酸化ペプチドの数が飛躍的に増加し、生体由来の複雑なタンパク質混合物を分離することなく酵素分解した複雑なペプチド混合物の試料についても、リン酸化ペプチドの網羅的解析が可能となる。
【００２１】
また、チタニア前処理カラムを洗浄するアルコール又はアルコールを含む溶媒としては、特に、イソプロピルアルコールが好適に用いられる。チタニア前処理カラムをイソプロピルアルコールを用いて洗浄することにより、より効果的に非リン酸化ペプチド成分を除去し、後工程において、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２２】
リン酸化ペプチド成分精製工程においては、チタニア前処理カラムから逆相系分離カラムへリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を通す。チタニア前処理カラムへリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を通すことによりチタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させ、その溶出液を逆相系分離カラムに通すことによりリン酸化ペプチド成分中の個々の成分を分離し、精製する。ここで、チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させるリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液としては、リン酸緩衝液やｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液が好適に用いられる。チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸緩衝液やｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることにより、効果的にリン酸化ペプチド成分を溶出させて、高い精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２３】
逆相系分離カラムにより精製されたリン酸化ペプチド成分は、常法により質量分析装置などの分析手段により分析される。
【００２４】
以上のように、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法によれば、逆相系前処理カラム、チタニア前処理カラムを用いて２段階の前処理を行い、かつ、前処理において、チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去することによって、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００２５】
つぎに、添付した図面を参照しながら、本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例について説明する。
【００２６】
本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例の構成を示す図１において、１，２は溶媒が収容される溶媒容器であり、それぞれポンプ３，４の一端に接続している。そして、ポンプ３，４の他端は、インジェクター５に接続するとともに、インジェクター５は、２ポジション６ポートのスイッチングバルブ６の第１ポート61に接続している。なお、スイッチングバルブ６は、第１ポート61と第２ポート62、第３ポート63と第４ポート64、第５ポート65と第６ポート66をそれぞれ接続する第１ポジションと、第２ポート62と第３ポート63、第４ポート64と第５ポート65、第６ポート66と第１ポート61をそれぞれ接続する第２ポジションを切換え可能に構成されている。
【００２７】
スイッチングバルブ６の第２ポート62には、逆相系前処理カラム７の一端が接続している。逆相系前処理カラム７としては、例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｒ３（アプライドバイオシステムズ）などを用いることができる。そして、逆相系前処理カラム７の他端は、２ポジション６ポートのスイッチングバルブ８の第１ポート81に接続している。なお、スイッチングバルブ８は、第１ポート81と第２ポート82、第３ポート83と第４ポート84、第５ポート85と第６ポート86をそれぞれ接続する第１ポジションと、第２ポート82と第３ポート83、第４ポート84と第５ポート85、第６ポート86と第１ポート81をそれぞれ接続する第２ポジションを切換え可能に構成されている。
【００２８】
スイッチングバルブ８の第２ポート82には、チタニア前処理カラム９の一端が接続し、チタニア前処理カラム９の他端は、スイッチングバルブ８の第５ポート85に接続している。
【００２９】
10は溶媒容器であり、溶媒容器10には、チタニア前処理カラム９の洗浄や、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチドの溶出に使用される複数の溶媒が収容されている。溶媒容器10は、６方バルブ11を介してポンプ12の一端に接続し、６方バルブ11を切換えることによって、溶媒容器10からポンプ12に供給される溶媒を切換えることができるように構成されている。そして、ポンプ12の他端は、スイッチングバルブ８の第３ポート83に接続している。
【００３０】
このように、スイッチングバルブ８にポンプ12を接続したことにより、チタニア前処理カラム９を徹底的に洗浄して、リン酸化ペプチドを高度に精製することができるようになっている。
【００３１】
スイッチングバルブ８の第４ポート84は、スイッチングバルブ６の第５ポート65に接続し、スイッチングバルブ６の第６ポート86には、逆相系分離カラム13の一端が接続している。そして、逆相系分離カラム13の他端には、ＵＶ検出器14の一端が接続している。なお、ＵＶ検出器14の代わりに、質量分析装置、電気化学検出器、示唆屈折率検出計などの検出器や分析装置を接続してもよい。
【００３２】
また、スイッチングバルブ６の第４ポート64、スイッチングバルブ８の第６ポート86には、それぞれドレイン15，16が接続し、ドレイン15，16は、逆相系カラム13の他端とＵＶ検出器14の一端をつなぐ流路に接続している。そして、ＵＶ検出器14の他端には、分離した画分の分取口17が接続している。分取口17には、さらに質量分析装置などの分析装置を接続してもよい。
【００３３】
なお、ポンプ３，４，12、スイッチングバルブ６，８、６方バルブ11は、図示しない制御手段により動作が制御されるように構成されている。そして、プログラムにより制御手段を動作させることにより、試料溶液の注入からリン酸化ペプチドの精製までを全自動で行うことができるようになっている。
【００３４】
つぎに、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置を用いたリン酸化ペプチドの精製方法について説明する。
【００３５】
はじめのペプチド成分保持工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とを順に経由してドレイン16へ至る第１の流路が形成される。そして、インジェクター５から試料溶液を注入するとともに、ポンプ３又はポンプ４から所定の溶媒を供給して、試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラム７に保持させる。
【００３６】
つぎのペプチド成分結合工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第１ポジションとする。これにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とチタニア前処理カラム９とを順に経由してドレイン16へ至る第２の流路が形成される。そして、ポンプ３又はポンプ４から所定の溶媒を供給して、逆相系前処理カラム７に保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラム９に結合させる。
【００３７】
なお、ポンプ３，４の流速を調節することで溶媒容器１に収容された溶媒と溶媒容器２に収容された溶媒の供給量を変えることができ、ポンプ３，４のいずれか一方を停止させることにより溶媒容器１に収容された溶媒と溶媒容器２に収容された溶媒を切換えることができる。
【００３８】
その後の非リン酸化ペプチド成分除去工程においては、スイッチングバルブ６を第２ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由してドレイン15に至る第３の流路が形成される。このとき、ポンプ３，４は停止させる。そして、ポンプ12からアルコール又はアルコールを含む溶媒等を供給して、チタニア前処理カラム９を洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する。
【００３９】
最後のリン酸化ペプチド成分精製工程においては、スイッチングバルブ６を第１ポジション、スイッチングバルブ８を第２ポジションとする。これにより、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ至る第４の流路が形成される。そして、ポンプ12からリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を供給して、チタニア前処理カラム９に結合したリン酸化ペプチド成分を溶出させて逆相系分離カラム13により精製する。
【００４０】
そして、精製されたリン酸化ペプチド成分の画分は、ＵＶ検出器14により検出された後、分取口17から分取される。
【００４１】
以上のように、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置は、逆相系前処理カラム７と、チタニア前処理カラム９と、逆相系分離カラム13と、２つのスイッチングバルブ６，８と、複数のポンプ３，４，12と、インジェクター５と、ドレイン15，16とを備え、２つのスイッチングバルブ６，８を切換えることにより、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とを順に経由してドレイン16へ至る第１の流路と、ポンプ３，４からインジェクター５と逆相系前処理カラム７とチタニア前処理カラム９とを順に経由してドレイン16へ至る第２の流路と、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由してドレイン15に至る第３の流路と、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ至る第４の流路とを切換え可能に構成したものである。逆相系前処理カラム７と、チタニア前処理カラム９と、逆相系分離カラム13と、２つのスイッチングバルブ６，８と、複数のポンプ３，４，12と、インジェクター５と、ドレイン15，16とを備えた簡単な構成でありながら、２つのスイッチングバルブ６，８を操作して流路を切換えることにより、簡便、迅速、網羅的に、複雑な組成の試料から質量分析装置で分析可能な精製度のリン酸化ペプチドを得ることができる。
【００４２】
また、本実施例のリン酸化ペプチドの精製装置を構成するカラムの分離モードは、逆相系前処理カラムと逆相系分離カラムの逆相系と、チタニア前処理カラムのチタニアの２つのみであるため、用いる溶媒の種類が少なくて済み、装置の構成を簡略化できる。
【００４３】
なお、本実施例においては、インジェクターに接続するポンプを２台とした例について説明したが、１台のポンプとしてもよい。
【００４４】
以下の実施例において、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法について、より具体例に説明する。なお、本発明は、下記の実施例に限定されるものではなく、種々の変形実施が可能である。
【実施例１】
【００４５】
カエルの分裂期卵の抽出液（ＭＣ）の全タンパク質をトリプシンで加水分解して得た複雑な組成のペプチド混合物を試料とし、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法にしたがって設定した全自動プログラムを用いて、図１に示すリン酸化ペプチドの精製装置を用いて、リン酸化ペプチドを精製した。
【００４６】
ここで、逆相系前処理カラム７には、Ｏｌｉｇｏ Ｒ３（内径４．６ｍｍ×１００ｍｍ）（アプライドバイオシステムズ）、チタニア前処理カラム９には、Ｔｉｔａｎｓｐｈｅｒｅ ＴｉＯ（登録商標）（内径４．０ｍｍ×１０ｍｍ）（ＧＬサイエンス）、逆相系分離カラム13には、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧII（内径４．６ｍｍ×１００ｍｍ）（資生堂）を用いた。
【００４７】
はじめのペプチド成分保持工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、インジェクター５に試料４ｍｇを注入し、ポンプ３から逆相系前処理カラム７へ０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で６０分間送った。
【００４８】
つぎのペプチド成分結合工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第１ポジションとし、ポンプ３から０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液、ポンプ４から０．０８２％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を２０：８０の比で送り、流速０．１ｍｌ／分で逆相系前処理カラム７からチタニア前処理カラム９へ３０分間流した。その後、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、ポンプ３を停止し、ポンプ４から０．０８２％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った後、ポンプ４を停止し、ポンプ３から０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った。その後、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第１ポジションとし、ポンプ３から０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を流速１．０ｍｌ／分で１０分間送った。
【００４９】
その後の非リン酸化ペプチド成分除去工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第２ポジション、第２ポジションとし、ポンプ12からチタニア前処理カラム９へ０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液で調製した１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を流速０．５ｍｌ／分で１５分間送り、その後、６方バルブ11を切換えることにより、順次０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間、７５０ｍＭトリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル水溶液を１０分間、０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間、イソプロピルアルコールを１０分間、０．１００％トリフルオロ酢酸水溶液を７分間送って、チタニア前処理カラム９を洗浄した。そして、上記の一連の洗浄の操作をもう一度繰り返した。
【００５０】
最後のリン酸化ペプチド成分精製工程において、スイッチングバルブ６，８をそれぞれ第１ポジション、第２ポジションとし、ポンプ12からチタニア前処理カラム９を経由して逆相系分離カラム13へ０．５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）を流速０．２〜０．３ｍｌ／分で１０分、流速０．３〜０．５ｍｌ／分で１５分、流速０．５ｍｌ／分で５分送り、その後、６方バルブ11を切換えることにより、３％ギ酸水溶液を１０分間送った。
【００５１】
その結果、精製されたリン酸化ペプチドが、約９０の画分に分けられて回収された。溶媒を除いた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型の質量分析計で分析したところ、２９２種類のリン酸化ペプチドが検出された。また、リン酸化ペプチドの純度は、６３％であった。
【００５２】
比較例として、逆相系前処理カラム７を用いない従来の方法により、試料を直接、チタニア前処理カラム９へ通して、リン酸化ペプチドを精製した。なお、従来の方法との比較を行うため、本発明のリン酸化ペプチドの精製方法の特徴の一つである、非リン酸化ペプチド成分除去工程におけるイソプロピルアルコールによる洗浄を行わず、その代わりにトリフルオロ酢酸を含む７０％アセトニトリル水溶液による洗浄を行った。また、チタニア前処理カラム９には、Ｔｉｔａｎｓｐｈｅｒｅ ＴｉＯ（登録商標）（内径４．０ｍｍ×１０ｍｍ）（ＧＬサイエンス）、逆相系分離カラム13には、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ８ ＳＧ３００（内径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）（資生堂）を用いた。その結果、１７本しかリン酸化ペプチドを検出できなかった。
【００５３】
このように、従来の方法で精製して得られた画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型の質量分析計で測定しても、リン酸化ペプチドはほとんど検出されなかった。これは、非リン酸化ペプチドがリン酸化ペプチドよりも１０〜１０００倍イオン化しやすいため、非リン酸化ペプチドが混入しているとリン酸化ペプチドのイオン化が抑制されるためである。
【実施例２】
【００５４】
上記実施例１の非リン酸化ペプチド成分除去工程において、種々の溶媒を用いて洗浄を行い、洗浄効果を比較した。なお、非リン酸化ペプチド成分除去工程における洗浄用の溶媒と試料を変えたほかは、実施例１と同様の条件で操作を行った。試料は、２０μｇのα-カゼイン、２０μｇのβ-カゼイン、２０μｇの卵白アルブミン、１ｍｇのウシ血清アルブミン、１ｍｇのβ-ラクトグロブリン及び１ｍｇのカルボニックアンヒドラーゼタンパク質をトリプシンで分解した混合物を用いた。
【００５５】
１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリルを用いて洗浄した結果得られたリン酸化ペプチドの液体クロマトグラフを図２に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合を図３に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、７０％イソプロピルアルコールを用いた場合を図４に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、メチルアルコールを用いた場合を図５に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０％ブチルアルコール／８０％イソプロピルアルコールを用いた場合を図６に、１Ｍ ＮａＣｌ、イソプロピルアルコールを用いた場合を図７に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合を図８に、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（ｐＨ４．２５）を用いた場合を図９に、実施例１と同様の条件である１Ｍ ＮａＣｌ、７５０ｍＭ トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合を図１０に示す。なお、図中、点を付したピークがリン酸化ペプチドである。
【００５６】
この結果、実施例１と同様の条件であるトリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコール併用した場合（図１０）において最も洗浄効果が高かった。ついで、アセトニトリルとイソプロピルアルコールを併用した場合（図３、図４、図６）において、洗浄効果が高かった。また、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合（図８）においては、洗浄効果が非常に高いものの、目的物であるリン酸化ペプチドのロスが見られた。
【００５７】
以上の結果より、非リン酸化ペプチド成分除去工程において、アルコール又はアルコールを含む洗浄液を用いることによって洗浄効果が大幅に改善されることが確認された。これは、チタニア表面に水素結合と疎水結合の共同作用で非特異的に結合している非リン酸化ペプチド成分が、疎水結合と水素結合の両方の結合を同時に切断する作用を持つアルコールで特異的、効率的に洗い流されたためと思われる。
【実施例３】
【００５８】
上記実施例１のリン酸化ペプチド成分精製工程において、０．５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）の代わりに、０．５Ｍ亜リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．９９）を用いて酸性条件下とし、チタニア前処理カラム９からのリン酸化ペプチドの溶出効果を比較した。
【００５９】
試料には、リン酸化タンパク質であるβ−カゼインをトリプシンで加水分解して得たβ−カゼイン消化物２０μｇを用いた。
【００６０】
亜リン酸ナトリウム水溶液による溶出を３回、コントロールとしてリン酸ナトリウム水溶液による溶出を１回行い、１リン酸化ペプチドについて、高速液体クロマトグラフィーによりピーク面積を測定した。その結果を以下に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
亜リン酸ナトリウム水溶液により溶出を行った場合においても、リン酸により溶出を行った場合と同等の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のリン酸化ペプチドの精製装置の一実施例を示す構成図である。
【図２】実施例２における１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリルを用いて洗浄した結果得られたリン酸化ペプチドの逆相クロマトグラムである。
【図３】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合の液体クロマトグラフである。
【図４】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、７０％イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図５】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、メチルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図６】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０％ブチルアルコール／８０％イソプロピルアルコールを用いた場合の液体クロマトグラフである。
【図７】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図８】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、エチレングリコールモノエチルエーテルを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図９】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７０％アセトニトリル、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（ｐＨ４．２５）を用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【図１０】同上、１Ｍ ＮａＣｌ、７５０ｍＭ トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル、イソプロピルアルコールを用いた場合の逆相クロマトグラムである。
【符号の説明】
【００６４】
３，４，12 ポンプ
５ インジェクター
６，８ スイッチングバルブ
７ 逆相系前処理カラム
９ チタニア前処理カラム
13 逆相系分離カラム
15，16 ドレイン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えたことを特徴とするリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項２】
前記非リン酸化ペプチド成分除去工程において、前記チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することを特徴とする請求項１記載のリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項３】
前記リン酸化ペプチド成分精製工程において、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする請求項１又は２記載のリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項４】
逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備え、前記２つのスイッチングバルブを切換えることにより、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第１の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムと前記チタニア前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第２の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記ドレインに至る第３の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記逆相系分離カラムへ至る第４の流路とを切換え可能に構成したことを特徴とするリン酸化ペプチドの精製装置。
【請求項１】
試料溶液に含まれるペプチド成分を逆相系前処理カラムに保持させるペプチド成分保持工程と、前記逆相系前処理カラムに保持されたペプチド成分を溶離させてチタニア前処理カラムに結合させるペプチド成分結合工程と、前記チタニア前処理カラムをアルコール又はアルコールを含む溶媒を用いて洗浄して非リン酸化ペプチド成分を除去する非リン酸化ペプチド成分除去工程と、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をリン酸塩又は亜リン酸塩を含む溶液を用いて溶出させて逆相系分離カラムにより精製するリン酸化ペプチド成分精製工程とを備えたことを特徴とするリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項２】
前記非リン酸化ペプチド成分除去工程において、前記チタニア前処理カラムをプロピルアルコールを用いて洗浄することを特徴とする請求項１記載のリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項３】
前記リン酸化ペプチド成分精製工程において、前記チタニア前処理カラムに結合したリン酸化ペプチド成分をｐＨ７未満の亜リン酸緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする請求項１又は２記載のリン酸化ペプチドの精製方法。
【請求項４】
逆相系前処理カラムと、チタニア前処理カラムと、逆相系分離カラムと、２つのスイッチングバルブと、複数のポンプと、インジェクターと、ドレインとを備え、前記２つのスイッチングバルブを切換えることにより、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第１の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記インジェクターと前記逆相系前処理カラムと前記チタニア前処理カラムとを順に経由して前記ドレインへ至る第２の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記ドレインに至る第３の流路と、前記複数のポンプのうち少なくとも１つから前記チタニア前処理カラムを経由して前記逆相系分離カラムへ至る第４の流路とを切換え可能に構成したことを特徴とするリン酸化ペプチドの精製装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２７０９５６（Ｐ２００９−２７０９５６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２２１５６（Ｐ２００８−１２２１５６）
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）講演要旨集 ２００７年１１月２５日 ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）発行
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）講演要旨集 ２００７年１１月２５日 ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）発行
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
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