レチノイン酸効果増強剤およびこれを用いたリンパ腫治療剤キット、並びに、活性酸素産生促進剤およびこれを用いた免疫賦活剤
【課題】安全性が高い新規な癌治療手段および免疫賦活手段を提供する。
【解決手段】クルクミンやクルクミンを含むウコン属植物の抽出物を、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤の有効成分として用いる。また、当該増強剤を、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤と併用してリンパ腫治療剤キットとする。さらに、クルクミンやクルクミンを含むウコン属植物の抽出物を、活性酸素産生促進剤の有効成分として用いる。また、当該促進剤を免疫賦活剤として用いる。
【解決手段】クルクミンやクルクミンを含むウコン属植物の抽出物を、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤の有効成分として用いる。また、当該増強剤を、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤と併用してリンパ腫治療剤キットとする。さらに、クルクミンやクルクミンを含むウコン属植物の抽出物を、活性酸素産生促進剤の有効成分として用いる。また、当該促進剤を免疫賦活剤として用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なレチノイン酸効果増強剤およびこれを用いたリンパ腫治療剤キット、並びに、活性酸素産生促進剤およびこれを用いた免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸（ＲＡ）は、ビタミンＡの誘導体であり、このＲＡには、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓの全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ａｌｌ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）と、９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸がある。これらのうちＡＴＲＡは分化誘導能を有することから、急性前骨髄球性白血病の治療薬として用いられている。しかしながら、その治療効果は限定的であるため、抗癌剤との併用による治療が主流となっている。抗癌剤はそれ自体が毒性を有することから、抗癌剤に起因する毒性が患者の健康やＱＯＬを損なうという問題がある。したがって、ＡＴＲＡの抗癌効果を増強させることができれば、併用される抗癌剤の投与量を減らすことができ、副作用の低減とこれによるＱＯＬの大幅な向上が図られるため、患者にとっては大きな福音となる。
【０００３】
ところで、クルクミンは、カレーのスパイスの１種であるウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ）属植物に含まれる黄色色素であり、天然の食用色素として用いられている。そして、クルクミンについては近年、その抗腫瘍作用や抗酸化作用、抗炎症作用などが注目を集めている。クルクミンの抗腫瘍作用や抗酸化作用を利用して、クルクミンを癌細胞の増殖抑制や白血病の治療といった用途に用いる提案が従来なされている（例えば、特許文献１〜３を参照）。また、クルクミンがＡＴＲＡによる白血球の分化誘導能を増強することも報告されている（例えば、非特許文献１および２を参照）。ここで、非特許文献１および２におけるクルクミンの作用は、ヒト前骨髄球性白血病細胞であるＨＬ−６０細胞を用いた実験により実証されたものである。しかしながら、ＡＴＲＡによるリンパ腫治療効果にクルクミンが及ぼす影響については、いまだ知見は存在しない。
【０００４】
ここで、クルクミンの抗酸化作用は、生体内に既に生成している活性酸素を消去するスカベンジャーとしてクルクミンが機能することにより発揮されることが知られている。生体内で生成する活性酸素はＤＮＡ損傷や生体膜の酸化といった作用を及ぼす有害物質としての側面も有しており、ときには生命維持に支障を来す可能性もあるが、クルクミンはこの活性酸素を消去することで、抗酸化作用を発揮すると考えられているのである。また、活性酸素は、その毒性を逆手に取って、他の生物の侵略から生体を防御する目的にも用いられている。例えば、白血球は細菌等の侵入時に感染局所に移動して細菌を捕食するが、この際に白血球は、活性酸素の１種であるスーパーオキシドを産生することで、より高い殺菌効果を実現している。
【０００５】
なお、患者自身の免疫能力を高める薬剤は「免疫賦活剤」と総称され、特に癌の免疫細胞療法における用途が注目されている。例えば、上述した生体防御系としての活性酸素（スーパーオキシドなど）の産生を増強できる薬剤が開発されれば、癌の免疫細胞療法などに利用可能な免疫賦活剤の選択肢が１つ加わることになる。また、食細胞（マクロファージなど）の活性酸素の産生を増強できる薬剤が提供されれば、白血病により併発される感染症を軽減できる可能性もある。ちなみに、クルクミンがかような免疫賦活作用を有することについては、いまだ知見は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５２９１２３号公報
【特許文献２】特表２００５−５３５６２６号公報
【特許文献３】特表２００８−５１６９５４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（１），１９−２９（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｏｋｏｌｏｓｋｉ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（２），１５３−６１（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高い新規な癌治療手段および免疫賦活手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行なった。その結果、ＲＡをヒト組織球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）に作用させる際にクルクミンを併存させると、ＲＡにより誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能が強力に促進されることを見出した。また、クルクミンによるかようなスーパーオキシド産生促進作用は、ある種のスーパーオキシド産生系構成細胞質因子（タンパク質）の細胞質における存在量が顕著に増加することによるものであることも判明した。これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一形態によれば、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤が提供される。そして、当該増強剤は、クルクミンを有効成分として含有する。
【００１１】
上述した本発明の一形態によるレチノイン酸効果増強剤においては、リンパ腫が組織球性リンパ腫であることが好ましい。また、レチノイン酸は全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸であることが好ましい。そして、上述した本発明のレチノイン酸効果増強剤を、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤と組み合わせることで、リンパ腫治療剤キットが提供される。
【００１２】
また、本発明の他の形態によれば、クルクミンを有効成分として含有する活性酸素産生促進剤が提供される。
【００１３】
上述した本発明の他の形態による活性酸素産生促進剤において、活性酸素はスーパーオキシドであることが好ましい。そして、上述した活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤として用いられうる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安全性が高い新規な癌治療手段および免疫賦活手段が提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例の（２）において、化学発光法に基づき、クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例の（３）において、抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、細胞表面マーカーＣＤ１１ｂの発現を指標として、クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例の（４）において、半定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子の遺伝子発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した結果を示すグラフである。
【図４】実施例の（５）において、ウェスタンブロット解析を用いたタンパク質発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子のタンパク質発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。
【００１７】
［レチノイン酸効果増強剤］
本発明の一形態は、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤であって、クルクミンを有効成分として含有する、レチノイン酸効果増強剤である。
【００１８】
本形態のレチノイン酸効果増強剤の有効成分であるクルクミン(ｃｕｒｃｕｍｉｎ)は、ウコン（ターメリック、学名Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）の黄色色素であり、ポリフェノールの１種であるクルクミノイドに分類される。本発明において、クルクミンは純品として増強剤に含まれていてもよいし、ショウガ科ウコン属（Ｃｕｒｃｕｍａ属）植物の根茎からの抽出物として増強剤に含まれていてもよい。ここで、ウコン属植物の根茎はカレー粉の原料として世界的に広く食用とされ、さらに中国や我が国では薬用植物として古くから利用されてきたことから、その安全性は極めて高い。以下、ウコン属植物の根茎からの抽出物としてのクルクミンをレチノイン酸増強剤の有効成分として用いる場合の抽出物の入手方法について簡単に説明する。ただし、本発明の技術的範囲が下記の具体的な手段によって限定されるわけではない。
【００１９】
抽出物の原料となるウコン属植物の根茎としては、秋ウコンと称される狭義のウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）のほか、春ウコン（キョウオウ、Ｃｕｒｃｕｍａ ａｒｏｍａｔｉｃａ）、紫ウコン（ガジュツ、Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ）等の根茎が用いられる。これらは亜熱帯地域や沖縄県などで商品作物として栽培されているが、本発明に用いる場合、産地はとくに限定されない。
【００２０】
また、これらの根茎の収穫時期は食用、薬用等の目的で従来収穫されてきた時期とする。収穫された新鮮根茎はそのままでもエタノール等で当該活性成分を抽出することができるが、薄切り後、陰干し等で乾燥させたものや、それをさらに細断・粉砕したものが抽出効率の点からは好適である。また、ウコン粉末等から水蒸気蒸留等で精油を採取した残渣も原料に用いることができる。抽出に用いる溶媒としてはエタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、これらを乾燥ウコン根茎スライス・粉末の１グラムあたり３ｍＬから３０ｍＬ程度添加し、攪拌または密栓静置して抽出する。パーコレーター等の公知の抽出器具を用いてもよい。抽出時間は溶媒の種類、原料の形態、原料／溶媒の量比、攪拌の有無、温度等により異なり、場合に応じて適当な条件を選択する。例えば乾燥スライスを５倍量のエタノールに沈積して静置しておく場合、２週間程度で目的とする画分は十分に抽出される。また、乾燥粉末を１０倍量のエタノールとともに室温で攪拌すれば、一昼夜で抽出することも可能である。
【００２１】
このようにして得られた抽出物をロータリーエバポレーター等で濃縮し、溶媒を減圧下で除去する。この残液はそのままでもレチノイン酸効果増強剤として用いられるが、より好ましくは活性炭処理やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の手段で不要成分や活性阻害成分を除いてから用いるのがよい。例えば、粗抽出物の濃縮エキスを酢酸エチルとヘキサンとの混合溶媒で再抽出し、活性炭に吸着させる。非吸着成分をヘキサンで洗い去り、吸着成分を５％から５０％のアセトンを含むヘキサンで溶離回収してもよい。また、乾燥根茎粉末を予めヘキサンで抽出後、５％から１００％のアセトンやエタノールを含むヘキサンで抽出してもよい。さらに、粗抽出物をシリカゲルに吸着させ、ヘキサンまたは数％のアセトンを含むヘキサンで洗浄後、吸着成分を５％から７０％のアセトンを含むヘキサンで溶出させてもよい。ただし、上述の精製法は例示であって、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
これらの抽出物、溶出物は溶媒を減圧下で除去した後、レチノイン酸効果増強剤の有効成分として用いられるが、その方法として、エタノールに溶解し飲用水に添加する方法、適当なリン脂質等の界面活性剤を含む水に懸濁し飲用水や食物に添加する等のほか、適当な補助剤と混合し錠剤の形で利用する方法等が挙げられる。なお、これらのウコン抽出物に代えて、その活性成分の１つであるクルクミンを用いる場合、クルクミンはウコン抽出物からクロマトグラフィー等公知の方法で製取することもできるし、公知の方法で化学合成することも容易である。
【００２３】
本形態のレチノイン酸効果増強剤は、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するものである。上述したように、レチノイン酸（ＲＡ）はビタミンＡの誘導体であり、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓの全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ａｌｌ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）と、９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸がある。本形態のレチノイン酸効果増強剤は、ＡＴＲＡまたは９−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれのリンパ腫治療効果を増強するものであってもよいが、好ましくはＡＴＲＡのリンパ腫治療効果を増強するものである。本形態において「リンパ腫」とは、リンパ・網内系組織の悪性新生物を全て包含する概念であり、その発生部位は特に制限されず、リンパ節、脾臓、その他リンパ・網内系細胞の存在する任意の部位でありうる。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とに大別される。そして、非ホジキンリンパ腫としては、例えば、組織球性リンパ腫、小細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、結節型リンパ腫、未分化型リンパ性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔリンパ球豊富Ｂ細胞リンパ腫、分化型リンパ性リンパ腫などが挙げられる。なかでも、本形態のレチノイン酸効果増強剤の対象としては、非ホジキンリンパ腫が好ましく、組織球性リンパ腫が特に好ましい。なお、「レチノイン酸効果増強剤」とは、レチノイン酸がリンパ腫に対して示す治療効果を増強する薬剤を意味し、その具体的な態様について特に制限はない。また、レチノイン酸の効果を増強するメカニズムについても特に制限はない。なお、後述する実施例の結果から明らかなように、クルクミンやウコン属植物の抽出物を有効成分として含有する本形態のレチノイン酸効果増強剤は、スーパーオキシド産生系を構成する細胞質因子（特に、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）のタンパク質量を増加させることで細胞におけるスーパーオキシド産生を促進させ、これによりレチノイン酸の効果の増強作用を示すものと考えられる。ただし、本形態の増強剤の技術的範囲が当該メカニズムによって制限されるわけではない。
【００２４】
［リンパ腫治療剤キット］
以上のレチノイン酸効果増強剤は、レチノイン酸の投与が必要と診断されたリンパ腫患者に対してレチノイン酸と併用投与することによって、レチノイン酸によるリンパ腫治療効果を大幅に増強することができる。つまり、本発明の他の形態によれば、上述したレチノイン酸効果増強剤と、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤とを含む、リンパ腫治療剤キットが提供される。
【００２５】
なお、本形態のリンパ腫治療剤キットの使用時において、レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤は、（１）双方を含む単一の医薬組成物、（２）これらの一方のみをそれぞれ含む別個の医薬組成物、のいずれの組成物として投与してもよい。また、（２）の投与例の場合、これら別個の医薬組成物を同時に投与してもよいし、逐次的に別々に投与してもよい。レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤逐次的に別々に投与する場合とは、レチノイン酸またはレチノイン酸効果増強剤を最初に投与し、次に他方を投与する投与例である。両薬剤の有効血中濃度が比較的長時間維持されるため、そのような逐次投与は、時間間隔を空けずに行ってもよいし、時間間隔を空けて行ってもよい。本形態におけるレチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤は、あらゆる適切な経路で投与されうる。好適な経路としては、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔内および舌下を含む）、膣内、および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）が挙げられる。好ましい経路は、例えばこの組合せ薬剤のレシピエントの症状に応じて様々に変わり得ることが理解されよう。また、投与される薬剤は同じ経路で投与されてもよいし異なる経路で投与されてもよい。
【００２６】
レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤のそれぞれの投与量についても特に制限はなく、疾患の状態や患者のサイズ、年齢などの因子に応じて当業者が適宜設定可能である。
【００２７】
［活性酸素産生促進剤］
後述する実施例の結果に示されるように、クルクミンやウコン属植物の抽出物は、スーパーオキシド産生系を構成する細胞質因子（特に、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）のタンパク質量を増加させることで細胞におけるスーパーオキシド産生を促進させる。したがって、本発明のさらに他の形態によれば、上述したレチノイン酸効果増強剤と同様の有効成分（クルクミンやウコン属植物の抽出物）を有効成分として含有する活性酸素産生促進剤が提供される。当該活性酸素産生促進剤は、好ましくは白血球の活性酸素産生促進剤であり、より好ましくは単球の活性酸素産生促進剤である。また、当該促進剤によって産生が促進される活性酸素の種類について特に制限はなく、例えば、スーパーオキシド（Ｏ２・−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）などが挙げられるが、好ましくはスーパーオキシドである。
【００２８】
本形態の活性酸素産生促進剤は、上述した有効成分（クルクミンやウコン属植物の抽出物）が有する活性酸素産生促進作用を通じて、免疫機能を賦活させ、免疫機能の低下等に伴う各種疾病を予防、治療または改善する目的に用いることができる。つまり、当該活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤として用いられうる。かような免疫賦活剤は、患者自身の免疫機能を向上させることにより、癌の免疫細胞療法などに好適に用いられうる。ただし、本形態の活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤としての用途以外にも、活性酸素産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。
【００２９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕
ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕
ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕
ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１１〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【００３１】
（１）細胞培養
ヒト組織球性リンパ腫由来のＵ９３７細胞株を、独立行政法人理化学研究所の細胞バンクより購入した（ＪＣＲＢ９０２１）。このＵ９３７細胞株（２×１０６個）を１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％胎児ウシ血清を含む）に懸濁し、３７℃にて培養した。培養開始時に添加なし（Ｎｏｎｅ）の系のほか、５μＭクルクミン（Ｃｕｒｃ）（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、１μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ社）または５μＭクルクミン＋１μＭレチノイン酸（ＲＡ＋Ｃｕｒｃ）をそれぞれ添加した系を設定した。
【００３２】
（２）クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響
以下の手法による化学発光法に基づき、クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響を調べた。
【００３３】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収し、そのうち２×１０６個の細胞を化学発光プローブＤｉｏｇｅｎｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）−ルミノールを含む１ｍＬのＰＢＳ（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコースおよび０．０３％ウシ血清アルブミンを含有）に再懸濁した。最終濃度２００ｎｇ／ｍＬになるようにホルボールエステル（ＰＭＡ）を添加し、３７℃にてインキュベートした。１０分毎にルミノメーターＴＤ−２０/２０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて化学発光量を測定し、それぞれの系におけるスーパーオキシド産生能を比較した。結果を図１に示す。なお、図１（並びに、後述する図３および図４）に示す定量データは全て独立して行った３回の実験データの平均値である（ｍｅａｎ±ＳＤ）。
【００３４】
図１に示すように、ＲＡ単独処理によってスーパーオキシド産生能の亢進が認められたが、ＲＡ＋Ｃｕｒｃの系ではＲＡ単独の場合を大幅に上回る（４倍超）スーパーオキシド産生能を示した。一方、クルクミン単独ではスーパーオキシド産生能亢進効果は全く認められなかった。この結果から、クルクミンには単独でスーパーオキシド産生を促進する能力はないものの、ＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能を強力に促進する能力を有することが示された。
【００３５】
（３）クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響
以下の手法による抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、細胞表面マーカーＣＤ１１ｂの発現を指標として、クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響を調べた。なお、ＲＡ処理によってＵ９３７細胞はマクロファージ様細胞へと分化する。そしてこの際、マクロファージの細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｂの発現が増加する。つまり、ＣＤ１１ｂは未分化の細胞（Ｕ９３７）がマクロファージ様細胞に分化する際に細胞表面に発現されるマーカータンパク質である。
【００３６】
１μＭレチノイン酸（ＲＡ）または５μＭクルクミン＋１μＭレチノイン酸（ＲＡ＋Ｃｕｒｃ）を添加して４８時間培養した細胞を用いて、その細胞表面のＣＤ１１ｂ（マクロファージの細胞表面マーカーの１種）の発現量を調べた。最初に１０μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、続いて１／１０００希釈ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で細胞を処理した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。結果を図２に示す。
【００３７】
図２に示すように、ＲＡ＋クルクミンで処理した細胞はＲＡ単独処理の細胞よりもＣＤ１１ｂの発現がわずかに増加していた。この結果から、ＲＡによる分化誘導の際にクルクミンを添加するとＵ９３７細胞のマクロファージへの分化も促進されることが示された。しかしながら、その効果はさほど強くはなく、クルクミンは分化誘導よりもスーパーオキシド産生能をより強力に亢進させることが明らかとなった。
【００３８】
（４）クルクミン添加がスーパーオキシド産生系構成因子の遺伝子発現に及ぼす影響
以下の手法による半定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子の遺伝子発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した。この際、ｍＲＮＡ発現量を測定する対象とした白血球のスーパーオキシド産生系を構成する特異的なタンパク質は、細胞膜に存在するｐ２２−ｐｈｏｘおよびｇｐ９１−ｐｈｏｘ（この２つがチトクロームｂ５５８となる）、並びに、細胞質に存在するｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘの計５種類である。
【００３９】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを抽出・精製した。逆転写反応キット（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いて逆転写反応を行い、これらを鋳型として使用した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、ｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ、ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのそれぞれのｍＲＮＡ発現量を半定量性ＰＣＲにより解析した。なお、この半定量性ＰＣＲに用いたプライマーを下記の表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
次いで、ＰＣＲにより得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動法により分離し、イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。定量結果を図３に示す。
【００４２】
図３に示すように、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する５つの特異的因子である（ｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ、ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）の遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量はいずれもＲＡ処理によって増加した。そして、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ以外の遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現は、クルクミン添加によってさらに増強された。この結果から、クルクミンの添加によってスーパーオキシド産生系構成因子の遺伝子発現が亢進することが示された。ただし、クルクミンの添加は非添加（ＲＡ単独）と比べて１．３〜１．５倍程度の増強を示すのみであり、上記（２）で示されたようにクルクミンの添加がスーパーオキシド産生能を約４倍に増強する原因としては不十分であると考えられた。
【００４３】
（５）クルクミン添加がスーパーオキシド産生系構成因子タンパク質発現量に及ぼす影響
以下の手法によるウェスタンブロット解析を用いたタンパク質発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子のタンパク質発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した。この際、発現量の測定対象としては、上記（４）と同様の５種類のタンパク質を採用した。
【００４４】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収して超音波処理により破砕し、遠心分離法により細胞質画分（ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ用）と膜画分（ｐ２２−ｐｈｏｘおよびｇｐ９１−ｐｈｏｘ用）とに分離した。これらの画分をそれぞれＳＤＳ処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりタンパク質を分離し、続くウェスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。次いで、タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を一次抗体（抗ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、抗ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ抗体、抗ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ抗体および抗ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ抗体はＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からそれぞれ購入、抗ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ抗体は川崎医科大学生化学教室の栗林太教授より供与された）とインキュベートし、続いてＨＲＰ標識二次抗体（Ｄａｋｏ社）で処理した後、ＨＲＰ基質を添加し、生じた化学発光をイメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量分析した。なお、コントロール抗体として抗ヒトβ−アクチン抗体（ａｂｃａｍ社）を使用した。定量結果を図４に示す。なお、図４における「ＲＡ＋Ｃｕｒｃ＋／ＲＡ＋Ｃｕｒｃ−」という表記は、ＲＡ＋ＣｕｒｃのデータをＲＡ＋（ＲＡ単独）のデータで除した比の値を表す。
【００４５】
図４に示す結果から、ＲＡで分化誘導したＵ９３７細胞におけるｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘおよびｐ４０−ｐｈｏｘのタンパク質量は、未分化Ｕ９３７細胞における発現量と比較すると増加してはいるものの、クルクミン添加による影響を殆ど受けなかった。一方、非常に興味深いことに、ＲＡ分化誘導時におけるクルクミンの添加によって、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのタンパク質量は劇的に増加した（それぞれ約７倍および約４倍）。このことから、クルクミン存在下でＲＡを用いてＵ９３７細胞を分化誘導する際に、細胞質因子であるｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのタンパク質量がクルクミンの作用で劇的に増加することで、スーパーオキシド産生能が強力に亢進されることが示唆された。
【００４６】
以上の結果をまとめると、クルクミンはＲＡによって誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能を劇的に増強する（４倍超）が、その効果は主として、クルクミン添加によって２つのスーパーオキシド産生系構成細胞質因子ｐ４７−ｐｈｏｘ（約７倍）およびｐ６７−ｐｈｏｘ（約４倍）のタンパク質量が顕著に増加することによりもたらされるものと考えられた。クルクミンはこれらのタンパク質を翻訳レベルで増強しているか、もしくは当該タンパク質の分解を抑制している可能性が高いと考えられる。クルクミンのかような作用に基づき、本願では、クルクミンやウコン抽出物の、レチノイン酸効果増強剤としての用途や、活性酸素産生促進剤およびこれを用いた免疫賦活剤としての用途を提案するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なレチノイン酸効果増強剤およびこれを用いたリンパ腫治療剤キット、並びに、活性酸素産生促進剤およびこれを用いた免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイン酸（ＲＡ）は、ビタミンＡの誘導体であり、このＲＡには、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓの全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ａｌｌ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）と、９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸がある。これらのうちＡＴＲＡは分化誘導能を有することから、急性前骨髄球性白血病の治療薬として用いられている。しかしながら、その治療効果は限定的であるため、抗癌剤との併用による治療が主流となっている。抗癌剤はそれ自体が毒性を有することから、抗癌剤に起因する毒性が患者の健康やＱＯＬを損なうという問題がある。したがって、ＡＴＲＡの抗癌効果を増強させることができれば、併用される抗癌剤の投与量を減らすことができ、副作用の低減とこれによるＱＯＬの大幅な向上が図られるため、患者にとっては大きな福音となる。
【０００３】
ところで、クルクミンは、カレーのスパイスの１種であるウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ）属植物に含まれる黄色色素であり、天然の食用色素として用いられている。そして、クルクミンについては近年、その抗腫瘍作用や抗酸化作用、抗炎症作用などが注目を集めている。クルクミンの抗腫瘍作用や抗酸化作用を利用して、クルクミンを癌細胞の増殖抑制や白血病の治療といった用途に用いる提案が従来なされている（例えば、特許文献１〜３を参照）。また、クルクミンがＡＴＲＡによる白血球の分化誘導能を増強することも報告されている（例えば、非特許文献１および２を参照）。ここで、非特許文献１および２におけるクルクミンの作用は、ヒト前骨髄球性白血病細胞であるＨＬ−６０細胞を用いた実験により実証されたものである。しかしながら、ＡＴＲＡによるリンパ腫治療効果にクルクミンが及ぼす影響については、いまだ知見は存在しない。
【０００４】
ここで、クルクミンの抗酸化作用は、生体内に既に生成している活性酸素を消去するスカベンジャーとしてクルクミンが機能することにより発揮されることが知られている。生体内で生成する活性酸素はＤＮＡ損傷や生体膜の酸化といった作用を及ぼす有害物質としての側面も有しており、ときには生命維持に支障を来す可能性もあるが、クルクミンはこの活性酸素を消去することで、抗酸化作用を発揮すると考えられているのである。また、活性酸素は、その毒性を逆手に取って、他の生物の侵略から生体を防御する目的にも用いられている。例えば、白血球は細菌等の侵入時に感染局所に移動して細菌を捕食するが、この際に白血球は、活性酸素の１種であるスーパーオキシドを産生することで、より高い殺菌効果を実現している。
【０００５】
なお、患者自身の免疫能力を高める薬剤は「免疫賦活剤」と総称され、特に癌の免疫細胞療法における用途が注目されている。例えば、上述した生体防御系としての活性酸素（スーパーオキシドなど）の産生を増強できる薬剤が開発されれば、癌の免疫細胞療法などに利用可能な免疫賦活剤の選択肢が１つ加わることになる。また、食細胞（マクロファージなど）の活性酸素の産生を増強できる薬剤が提供されれば、白血病により併発される感染症を軽減できる可能性もある。ちなみに、クルクミンがかような免疫賦活作用を有することについては、いまだ知見は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５２９１２３号公報
【特許文献２】特表２００５−５３５６２６号公報
【特許文献３】特表２００８−５１６９５４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（１），１９−２９（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｏｋｏｌｏｓｋｉ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（２），１５３−６１（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高い新規な癌治療手段および免疫賦活手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行なった。その結果、ＲＡをヒト組織球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）に作用させる際にクルクミンを併存させると、ＲＡにより誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能が強力に促進されることを見出した。また、クルクミンによるかようなスーパーオキシド産生促進作用は、ある種のスーパーオキシド産生系構成細胞質因子（タンパク質）の細胞質における存在量が顕著に増加することによるものであることも判明した。これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一形態によれば、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤が提供される。そして、当該増強剤は、クルクミンを有効成分として含有する。
【００１１】
上述した本発明の一形態によるレチノイン酸効果増強剤においては、リンパ腫が組織球性リンパ腫であることが好ましい。また、レチノイン酸は全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸であることが好ましい。そして、上述した本発明のレチノイン酸効果増強剤を、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤と組み合わせることで、リンパ腫治療剤キットが提供される。
【００１２】
また、本発明の他の形態によれば、クルクミンを有効成分として含有する活性酸素産生促進剤が提供される。
【００１３】
上述した本発明の他の形態による活性酸素産生促進剤において、活性酸素はスーパーオキシドであることが好ましい。そして、上述した活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤として用いられうる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安全性が高い新規な癌治療手段および免疫賦活手段が提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例の（２）において、化学発光法に基づき、クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例の（３）において、抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、細胞表面マーカーＣＤ１１ｂの発現を指標として、クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例の（４）において、半定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子の遺伝子発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した結果を示すグラフである。
【図４】実施例の（５）において、ウェスタンブロット解析を用いたタンパク質発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子のタンパク質発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。
【００１７】
［レチノイン酸効果増強剤］
本発明の一形態は、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤であって、クルクミンを有効成分として含有する、レチノイン酸効果増強剤である。
【００１８】
本形態のレチノイン酸効果増強剤の有効成分であるクルクミン(ｃｕｒｃｕｍｉｎ)は、ウコン（ターメリック、学名Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）の黄色色素であり、ポリフェノールの１種であるクルクミノイドに分類される。本発明において、クルクミンは純品として増強剤に含まれていてもよいし、ショウガ科ウコン属（Ｃｕｒｃｕｍａ属）植物の根茎からの抽出物として増強剤に含まれていてもよい。ここで、ウコン属植物の根茎はカレー粉の原料として世界的に広く食用とされ、さらに中国や我が国では薬用植物として古くから利用されてきたことから、その安全性は極めて高い。以下、ウコン属植物の根茎からの抽出物としてのクルクミンをレチノイン酸増強剤の有効成分として用いる場合の抽出物の入手方法について簡単に説明する。ただし、本発明の技術的範囲が下記の具体的な手段によって限定されるわけではない。
【００１９】
抽出物の原料となるウコン属植物の根茎としては、秋ウコンと称される狭義のウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）のほか、春ウコン（キョウオウ、Ｃｕｒｃｕｍａ ａｒｏｍａｔｉｃａ）、紫ウコン（ガジュツ、Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ）等の根茎が用いられる。これらは亜熱帯地域や沖縄県などで商品作物として栽培されているが、本発明に用いる場合、産地はとくに限定されない。
【００２０】
また、これらの根茎の収穫時期は食用、薬用等の目的で従来収穫されてきた時期とする。収穫された新鮮根茎はそのままでもエタノール等で当該活性成分を抽出することができるが、薄切り後、陰干し等で乾燥させたものや、それをさらに細断・粉砕したものが抽出効率の点からは好適である。また、ウコン粉末等から水蒸気蒸留等で精油を採取した残渣も原料に用いることができる。抽出に用いる溶媒としてはエタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、これらを乾燥ウコン根茎スライス・粉末の１グラムあたり３ｍＬから３０ｍＬ程度添加し、攪拌または密栓静置して抽出する。パーコレーター等の公知の抽出器具を用いてもよい。抽出時間は溶媒の種類、原料の形態、原料／溶媒の量比、攪拌の有無、温度等により異なり、場合に応じて適当な条件を選択する。例えば乾燥スライスを５倍量のエタノールに沈積して静置しておく場合、２週間程度で目的とする画分は十分に抽出される。また、乾燥粉末を１０倍量のエタノールとともに室温で攪拌すれば、一昼夜で抽出することも可能である。
【００２１】
このようにして得られた抽出物をロータリーエバポレーター等で濃縮し、溶媒を減圧下で除去する。この残液はそのままでもレチノイン酸効果増強剤として用いられるが、より好ましくは活性炭処理やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の手段で不要成分や活性阻害成分を除いてから用いるのがよい。例えば、粗抽出物の濃縮エキスを酢酸エチルとヘキサンとの混合溶媒で再抽出し、活性炭に吸着させる。非吸着成分をヘキサンで洗い去り、吸着成分を５％から５０％のアセトンを含むヘキサンで溶離回収してもよい。また、乾燥根茎粉末を予めヘキサンで抽出後、５％から１００％のアセトンやエタノールを含むヘキサンで抽出してもよい。さらに、粗抽出物をシリカゲルに吸着させ、ヘキサンまたは数％のアセトンを含むヘキサンで洗浄後、吸着成分を５％から７０％のアセトンを含むヘキサンで溶出させてもよい。ただし、上述の精製法は例示であって、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
これらの抽出物、溶出物は溶媒を減圧下で除去した後、レチノイン酸効果増強剤の有効成分として用いられるが、その方法として、エタノールに溶解し飲用水に添加する方法、適当なリン脂質等の界面活性剤を含む水に懸濁し飲用水や食物に添加する等のほか、適当な補助剤と混合し錠剤の形で利用する方法等が挙げられる。なお、これらのウコン抽出物に代えて、その活性成分の１つであるクルクミンを用いる場合、クルクミンはウコン抽出物からクロマトグラフィー等公知の方法で製取することもできるし、公知の方法で化学合成することも容易である。
【００２３】
本形態のレチノイン酸効果増強剤は、レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するものである。上述したように、レチノイン酸（ＲＡ）はビタミンＡの誘導体であり、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓの全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ＡＴＲＡ；Ａｌｌ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ）と、９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸がある。本形態のレチノイン酸効果増強剤は、ＡＴＲＡまたは９−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれのリンパ腫治療効果を増強するものであってもよいが、好ましくはＡＴＲＡのリンパ腫治療効果を増強するものである。本形態において「リンパ腫」とは、リンパ・網内系組織の悪性新生物を全て包含する概念であり、その発生部位は特に制限されず、リンパ節、脾臓、その他リンパ・網内系細胞の存在する任意の部位でありうる。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とに大別される。そして、非ホジキンリンパ腫としては、例えば、組織球性リンパ腫、小細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、結節型リンパ腫、未分化型リンパ性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔリンパ球豊富Ｂ細胞リンパ腫、分化型リンパ性リンパ腫などが挙げられる。なかでも、本形態のレチノイン酸効果増強剤の対象としては、非ホジキンリンパ腫が好ましく、組織球性リンパ腫が特に好ましい。なお、「レチノイン酸効果増強剤」とは、レチノイン酸がリンパ腫に対して示す治療効果を増強する薬剤を意味し、その具体的な態様について特に制限はない。また、レチノイン酸の効果を増強するメカニズムについても特に制限はない。なお、後述する実施例の結果から明らかなように、クルクミンやウコン属植物の抽出物を有効成分として含有する本形態のレチノイン酸効果増強剤は、スーパーオキシド産生系を構成する細胞質因子（特に、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）のタンパク質量を増加させることで細胞におけるスーパーオキシド産生を促進させ、これによりレチノイン酸の効果の増強作用を示すものと考えられる。ただし、本形態の増強剤の技術的範囲が当該メカニズムによって制限されるわけではない。
【００２４】
［リンパ腫治療剤キット］
以上のレチノイン酸効果増強剤は、レチノイン酸の投与が必要と診断されたリンパ腫患者に対してレチノイン酸と併用投与することによって、レチノイン酸によるリンパ腫治療効果を大幅に増強することができる。つまり、本発明の他の形態によれば、上述したレチノイン酸効果増強剤と、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤とを含む、リンパ腫治療剤キットが提供される。
【００２５】
なお、本形態のリンパ腫治療剤キットの使用時において、レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤は、（１）双方を含む単一の医薬組成物、（２）これらの一方のみをそれぞれ含む別個の医薬組成物、のいずれの組成物として投与してもよい。また、（２）の投与例の場合、これら別個の医薬組成物を同時に投与してもよいし、逐次的に別々に投与してもよい。レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤逐次的に別々に投与する場合とは、レチノイン酸またはレチノイン酸効果増強剤を最初に投与し、次に他方を投与する投与例である。両薬剤の有効血中濃度が比較的長時間維持されるため、そのような逐次投与は、時間間隔を空けずに行ってもよいし、時間間隔を空けて行ってもよい。本形態におけるレチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤は、あらゆる適切な経路で投与されうる。好適な経路としては、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔内および舌下を含む）、膣内、および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）が挙げられる。好ましい経路は、例えばこの組合せ薬剤のレシピエントの症状に応じて様々に変わり得ることが理解されよう。また、投与される薬剤は同じ経路で投与されてもよいし異なる経路で投与されてもよい。
【００２６】
レチノイン酸およびレチノイン酸効果増強剤のそれぞれの投与量についても特に制限はなく、疾患の状態や患者のサイズ、年齢などの因子に応じて当業者が適宜設定可能である。
【００２７】
［活性酸素産生促進剤］
後述する実施例の結果に示されるように、クルクミンやウコン属植物の抽出物は、スーパーオキシド産生系を構成する細胞質因子（特に、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）のタンパク質量を増加させることで細胞におけるスーパーオキシド産生を促進させる。したがって、本発明のさらに他の形態によれば、上述したレチノイン酸効果増強剤と同様の有効成分（クルクミンやウコン属植物の抽出物）を有効成分として含有する活性酸素産生促進剤が提供される。当該活性酸素産生促進剤は、好ましくは白血球の活性酸素産生促進剤であり、より好ましくは単球の活性酸素産生促進剤である。また、当該促進剤によって産生が促進される活性酸素の種類について特に制限はなく、例えば、スーパーオキシド（Ｏ２・−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）などが挙げられるが、好ましくはスーパーオキシドである。
【００２８】
本形態の活性酸素産生促進剤は、上述した有効成分（クルクミンやウコン属植物の抽出物）が有する活性酸素産生促進作用を通じて、免疫機能を賦活させ、免疫機能の低下等に伴う各種疾病を予防、治療または改善する目的に用いることができる。つまり、当該活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤として用いられうる。かような免疫賦活剤は、患者自身の免疫機能を向上させることにより、癌の免疫細胞療法などに好適に用いられうる。ただし、本形態の活性酸素産生促進剤は、免疫賦活剤としての用途以外にも、活性酸素産生促進作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。
【００２９】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕
ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：７〕
ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕
ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１１〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。
【００３１】
（１）細胞培養
ヒト組織球性リンパ腫由来のＵ９３７細胞株を、独立行政法人理化学研究所の細胞バンクより購入した（ＪＣＲＢ９０２１）。このＵ９３７細胞株（２×１０６個）を１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％胎児ウシ血清を含む）に懸濁し、３７℃にて培養した。培養開始時に添加なし（Ｎｏｎｅ）の系のほか、５μＭクルクミン（Ｃｕｒｃ）（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、１μＭレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ社）または５μＭクルクミン＋１μＭレチノイン酸（ＲＡ＋Ｃｕｒｃ）をそれぞれ添加した系を設定した。
【００３２】
（２）クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響
以下の手法による化学発光法に基づき、クルクミン添加がＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能に与える影響を調べた。
【００３３】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収し、そのうち２×１０６個の細胞を化学発光プローブＤｉｏｇｅｎｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）−ルミノールを含む１ｍＬのＰＢＳ（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコースおよび０．０３％ウシ血清アルブミンを含有）に再懸濁した。最終濃度２００ｎｇ／ｍＬになるようにホルボールエステル（ＰＭＡ）を添加し、３７℃にてインキュベートした。１０分毎にルミノメーターＴＤ−２０/２０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて化学発光量を測定し、それぞれの系におけるスーパーオキシド産生能を比較した。結果を図１に示す。なお、図１（並びに、後述する図３および図４）に示す定量データは全て独立して行った３回の実験データの平均値である（ｍｅａｎ±ＳＤ）。
【００３４】
図１に示すように、ＲＡ単独処理によってスーパーオキシド産生能の亢進が認められたが、ＲＡ＋Ｃｕｒｃの系ではＲＡ単独の場合を大幅に上回る（４倍超）スーパーオキシド産生能を示した。一方、クルクミン単独ではスーパーオキシド産生能亢進効果は全く認められなかった。この結果から、クルクミンには単独でスーパーオキシド産生を促進する能力はないものの、ＲＡで誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能を強力に促進する能力を有することが示された。
【００３５】
（３）クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響
以下の手法による抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、細胞表面マーカーＣＤ１１ｂの発現を指標として、クルクミン添加がＵ９３７細胞のマクロファージへの分化誘導に及ぼす影響を調べた。なお、ＲＡ処理によってＵ９３７細胞はマクロファージ様細胞へと分化する。そしてこの際、マクロファージの細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｂの発現が増加する。つまり、ＣＤ１１ｂは未分化の細胞（Ｕ９３７）がマクロファージ様細胞に分化する際に細胞表面に発現されるマーカータンパク質である。
【００３６】
１μＭレチノイン酸（ＲＡ）または５μＭクルクミン＋１μＭレチノイン酸（ＲＡ＋Ｃｕｒｃ）を添加して４８時間培養した細胞を用いて、その細胞表面のＣＤ１１ｂ（マクロファージの細胞表面マーカーの１種）の発現量を調べた。最初に１０μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社）、続いて１／１０００希釈ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で細胞を処理した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。結果を図２に示す。
【００３７】
図２に示すように、ＲＡ＋クルクミンで処理した細胞はＲＡ単独処理の細胞よりもＣＤ１１ｂの発現がわずかに増加していた。この結果から、ＲＡによる分化誘導の際にクルクミンを添加するとＵ９３７細胞のマクロファージへの分化も促進されることが示された。しかしながら、その効果はさほど強くはなく、クルクミンは分化誘導よりもスーパーオキシド産生能をより強力に亢進させることが明らかとなった。
【００３８】
（４）クルクミン添加がスーパーオキシド産生系構成因子の遺伝子発現に及ぼす影響
以下の手法による半定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子の遺伝子発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した。この際、ｍＲＮＡ発現量を測定する対象とした白血球のスーパーオキシド産生系を構成する特異的なタンパク質は、細胞膜に存在するｐ２２−ｐｈｏｘおよびｇｐ９１−ｐｈｏｘ（この２つがチトクロームｂ５５８となる）、並びに、細胞質に存在するｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘの計５種類である。
【００３９】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを抽出・精製した。逆転写反応キット（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いて逆転写反応を行い、これらを鋳型として使用した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、ｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ、ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのそれぞれのｍＲＮＡ発現量を半定量性ＰＣＲにより解析した。なお、この半定量性ＰＣＲに用いたプライマーを下記の表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
次いで、ＰＣＲにより得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動法により分離し、イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。定量結果を図３に示す。
【００４２】
図３に示すように、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する５つの特異的因子である（ｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ、ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ）の遺伝子（ｍＲＮＡ）発現量はいずれもＲＡ処理によって増加した。そして、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ以外の遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現は、クルクミン添加によってさらに増強された。この結果から、クルクミンの添加によってスーパーオキシド産生系構成因子の遺伝子発現が亢進することが示された。ただし、クルクミンの添加は非添加（ＲＡ単独）と比べて１．３〜１．５倍程度の増強を示すのみであり、上記（２）で示されたようにクルクミンの添加がスーパーオキシド産生能を約４倍に増強する原因としては不十分であると考えられた。
【００４３】
（５）クルクミン添加がスーパーオキシド産生系構成因子タンパク質発現量に及ぼす影響
以下の手法によるウェスタンブロット解析を用いたタンパク質発現量の測定により、白血球のスーパーオキシド産生系を構成する因子のタンパク質発現にクルクミン添加が及ぼす影響を解析した。この際、発現量の測定対象としては、上記（４）と同様の５種類のタンパク質を採用した。
【００４４】
上記（１）で樹立した４つの系からそれぞれ培養開始４８時間後の細胞を回収して超音波処理により破砕し、遠心分離法により細胞質画分（ｐ４０−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘ用）と膜画分（ｐ２２−ｐｈｏｘおよびｇｐ９１−ｐｈｏｘ用）とに分離した。これらの画分をそれぞれＳＤＳ処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりタンパク質を分離し、続くウェスタンブロット法によりＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。次いで、タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を一次抗体（抗ヒトｐ４０−ｐｈｏｘ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、抗ヒトｐ４７−ｐｈｏｘ抗体、抗ヒトｐ６７−ｐｈｏｘ抗体および抗ヒトｇｐ９１−ｐｈｏｘ抗体はＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からそれぞれ購入、抗ヒトｐ２２−ｐｈｏｘ抗体は川崎医科大学生化学教室の栗林太教授より供与された）とインキュベートし、続いてＨＲＰ標識二次抗体（Ｄａｋｏ社）で処理した後、ＨＲＰ基質を添加し、生じた化学発光をイメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量分析した。なお、コントロール抗体として抗ヒトβ−アクチン抗体（ａｂｃａｍ社）を使用した。定量結果を図４に示す。なお、図４における「ＲＡ＋Ｃｕｒｃ＋／ＲＡ＋Ｃｕｒｃ−」という表記は、ＲＡ＋ＣｕｒｃのデータをＲＡ＋（ＲＡ単独）のデータで除した比の値を表す。
【００４５】
図４に示す結果から、ＲＡで分化誘導したＵ９３７細胞におけるｐ２２−ｐｈｏｘ、ｇｐ９１−ｐｈｏｘおよびｐ４０−ｐｈｏｘのタンパク質量は、未分化Ｕ９３７細胞における発現量と比較すると増加してはいるものの、クルクミン添加による影響を殆ど受けなかった。一方、非常に興味深いことに、ＲＡ分化誘導時におけるクルクミンの添加によって、ｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのタンパク質量は劇的に増加した（それぞれ約７倍および約４倍）。このことから、クルクミン存在下でＲＡを用いてＵ９３７細胞を分化誘導する際に、細胞質因子であるｐ４７−ｐｈｏｘおよびｐ６７−ｐｈｏｘのタンパク質量がクルクミンの作用で劇的に増加することで、スーパーオキシド産生能が強力に亢進されることが示唆された。
【００４６】
以上の結果をまとめると、クルクミンはＲＡによって誘導されるＵ９３７細胞のスーパーオキシド産生能を劇的に増強する（４倍超）が、その効果は主として、クルクミン添加によって２つのスーパーオキシド産生系構成細胞質因子ｐ４７−ｐｈｏｘ（約７倍）およびｐ６７−ｐｈｏｘ（約４倍）のタンパク質量が顕著に増加することによりもたらされるものと考えられた。クルクミンはこれらのタンパク質を翻訳レベルで増強しているか、もしくは当該タンパク質の分解を抑制している可能性が高いと考えられる。クルクミンのかような作用に基づき、本願では、クルクミンやウコン抽出物の、レチノイン酸効果増強剤としての用途や、活性酸素産生促進剤およびこれを用いた免疫賦活剤としての用途を提案するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤であって、
クルクミンを有効成分として含有する、レチノイン酸効果増強剤。
【請求項２】
前記リンパ腫が組織球性リンパ腫である、請求項１に記載のレチノイン酸効果増強剤。
【請求項３】
前記レチノイン酸が全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸である、請求項１または２に記載のレチノイン酸効果増強剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のレチノイン酸効果増強剤と、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤とを含む、リンパ腫治療剤キット。
【請求項５】
クルクミンを有効成分として含有する、活性酸素産生促進剤。
【請求項６】
前記活性酸素がスーパーオキシドである、請求項５に記載の活性酸素産生促進剤。
【請求項７】
請求項５または６に記載の活性酸素産生促進剤を含む、免疫賦活剤。
【請求項１】
レチノイン酸のリンパ腫治療効果を増強するレチノイン酸効果増強剤であって、
クルクミンを有効成分として含有する、レチノイン酸効果増強剤。
【請求項２】
前記リンパ腫が組織球性リンパ腫である、請求項１に記載のレチノイン酸効果増強剤。
【請求項３】
前記レチノイン酸が全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸である、請求項１または２に記載のレチノイン酸効果増強剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のレチノイン酸効果増強剤と、レチノイン酸を有効成分とするリンパ腫治療剤とを含む、リンパ腫治療剤キット。
【請求項５】
クルクミンを有効成分として含有する、活性酸素産生促進剤。
【請求項６】
前記活性酸素がスーパーオキシドである、請求項５に記載の活性酸素産生促進剤。
【請求項７】
請求項５または６に記載の活性酸素産生促進剤を含む、免疫賦活剤。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図１】
【図２】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１９０２２８（Ｐ２０１１−１９０２２８Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５９７３４（Ｐ２０１０−５９７３４）
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１６日（２０１０．３．１６）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
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