ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）配列等反復配列を利用した新規タンパク質の作製方法、並びにそれにより得られる新規タンパク質及び新規タンパク質をコードする遺伝子
【課題】自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を有効に利用して多様なタンパク質を効率的かつ実用的に作製することが可能である新規タンパク質の作製方法、並びに自然界における多様な病原菌に対応する能力を有する新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供すること。
【解決手段】 本発明は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、を備える新規タンパク質の作製方法である。
【解決手段】 本発明は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、を備える新規タンパク質の作製方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物種に広く存在している多様なロイシンリッチリピート配列を利用した新規タンパク質の作製方法、並びにそれにより得られる新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物と植物病原菌との間には親和性と非親和性という二つの異なる関係が存在する。植物と植物病原菌とが親和性関係にある場合、植物が病原菌を認識できずに侵入を許し病徴発現に至ることになり、一方、植物と植物病原菌とが非親和性関係にある場合、植物が病原菌の何らかの信号を認識することで病原菌を拒絶することになる。
この病原菌認識に関わる遺伝子は、一般に植物の抵抗性遺伝子（耐病性抵抗遺伝子）と呼ばれる。かかる植物の抵抗性遺伝子は、これまでに数多く報告されており、その大半はロイシン残基に富んだリピート構造であるロイシンリッチリピート配列を有するタンパク質をコードすること知られている。
【０００３】
ロイシンリッチリピート配列はある一定の間隔に配置されたロイシン残基を骨格として、α−へリックス、βシート構造からなるくさび形の反復ユニットが多数繰り返されることにより、全体として窪みを持ったタンパク質領域が形成され、その内側の表面上のアミノ酸配列の多様性によりそれぞれ特定のタンパク質ないしは分子と特異的な相互作用をしていることが予測されており、一部ではその様子が実証されている。
【０００４】
例えば、ＲＮａｓｅインヒビターやポリガラクチュロナーゼインヒビターのロイシンリッチリピート配列はX線回折分析によりLRRとそのリガンドのタンパク質の構造が明らかにされている。すなわち、上記ロイシンリッチリピート配列の馬蹄型又は捩れたループ状構造に、ターゲットとなるＲＮａｓｅ又はポリガラクチュロナーゼが結合している様相が明らかとなっている（例えば、非特許文献１又は非特許文献２参照）。
【０００５】
一方で、動物においても免疫機構とは別に、生来的にウイルス・バクテリアの認識に関わる遺伝子が解明されつつある。かかる遺伝子は先天性免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と呼ばれる。
このウイルス・バクテリアの認識に関わる遺伝子には、植物抵抗性遺伝子と類似したロイシンリッチリピート配列を含んだ構造もある。このため、病原菌認識は、このロイシンリッチリピート配列を含む遺伝子がウイルス由来二本鎖ＲＮＡ又はバクテリア由来核酸（メチル化の違いを認識している）を直接ロイシンリッチリピート配列に結合させることにより行われると考えられている。
【０００６】
ところで、イネいもち病菌の非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｔａの認識に関わるイネ抵抗性遺伝子Ｐｉｔａが酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法により直接結合することが明らかとされ、また、バクテリアのフラジェリンタンパク質の認識に関わるシロイヌナズナの抵抗性遺伝子ＦＬＳ２は同位体ラベルしたフラジェリンタンパク質を用いて直接結合することが示されている（例えば、非特許文献３又は非特許文献４参照）。
【０００７】
しかしながら、植物抵抗性遺伝子と病原体由来エリシターとの間で直接相互作用を示した例はごくわずかに過ぎず、近年、新たな防御応答メカニズムとして、植物抵抗性遺伝子が宿主因子と結合した複合体を形成しており、病原菌侵入によりその複合体バランスが崩れることによる刺激が防御反応を導くというＧｕａｒｄ仮説が提唱されつつある（例えば、非特許文献５参照）。
この仮説によれば、植物抵抗性遺伝子は、認識を司るロイシンリッチリピート配列の進化速度が病原体の進化に間に合わず、その他宿主因子の多様性をも巻き込んだ「複合体」として認識を担っている。
【０００８】
また、ロイシンリッチリピート配列の進化はそれぞれの抵抗性遺伝子ホモログとの比較によって評価されている。この解析より明らかとなった点は、タンパク質相互作用に関わると思われる領域（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｅｘｐｏｓｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）に非同義的置換が蓄積していたことである。
このことは、多様なタンパク質を認識するために選択圧が働いていることを示している。
【０００９】
この多様性を生み出すメカニズムとして、点変異による塩基置換、あるいはオルソログやパラログ遺伝子を介した遺伝子変換等の多様性作製機構が存在することを進化系統的に推察している（例えば、非特許文献６参照）。
【００１０】
しかしながら、植物は動物のような体液循環機構を持たず、従って動物の免疫グロブリンに見られるような巧妙な個体発生の間に病原体認識分子を多様化させることは不可能で、遺伝子の構造にも特にシャフリングを起こすシステムなどは見られず、しかもゲノム内に収容できるLRR遺伝子の数にもせいぜい１０００個前後限りがあるために、LRRタンパク質の持つ無限の分子認識の可能性のごく一部を実現しているに過ぎない状況にあるものと考えられる。
【００１１】
一方、遺伝子の多様性作製方法としては、近年分子進化工学分野が発達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多様な遺伝子配列の作製に成功している（例えば、非特許文献７参照）。
植物抵抗性遺伝子もオルソログ・パラログ遺伝子の相同領域を介したファミリー間シャッフリングが行われており、病原菌認識に関わる遺伝子領域の特定などに威力を発揮している（例えば、非特許文献８参照）。
【００１２】
また、スタンプらは反復モジュールを含んだ反復タンパク質の作成方法を開示している（例えば、特許文献１参照）。
かかる発明は、典型的なロイシンリッチリピート配列基本骨格を固定位置と設定し、それ以外の無作為化位置において人工的に変異を加え、多様性を導くものである。
【特許文献１】特公表２００４−５０８０３３
【非特許文献１】Kobe B, Diesenhofer J (1995) Nature 374, 183-186.
【非特許文献２】Di Matteo A, Federici L, Mattei B, Salvi G, Johnson KA, Savino C, De Lorenzo G, Tsernoglou D, Cervone F (2003) Proceedings of the National Academy of the Science of USA 100, 10124-10128.
【非特許文献３】Jia Y, McAdams S, Bryan GT, Hershey HP, Valent B (2000) EMBO J 19, 4004-4014.
【非特許文献４】Bauer Z, Gomez-Gomez L, Boller T, Felix G (2001) Journal of Biolgoical Chemistry 276, 45669-45676.
【非特許文献５】Dangl JL, Jones JDG (2001) Nature 411, 826-833.
【非特許文献６】Parniske M, Hammond-Kosack KE, Golstein C, Thomas CM, Jones DA, Harrison K, Wulff BBH, Jones JDG (1997) Cell 91, 821-832.
【非特許文献７】Directed enzyme evolution. Farinas ET, Bulter T, Arnold FH (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 545-551.
【非特許文献８】Wulff BBH, Thomas CM, Smoker M, Grant M, Jones JDG (2001) Plant Cell 13, 255-272.
【非特許文献９】Van der Hoorn RAL, Roth R, De Wit PJGM (2001) Plant Cell 13, 273-285.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記非特許文献６記載の多様性作製機構は、１アミノ酸レベルでの変化、あるいは相同性の認められた領域に限られた変化であり、自然界における多様でかつ絶え間なく変異を続ける病原菌に対応する能力を付与させるには限界があると考えられる。
【００１４】
上記非特許文献８及び９に記載の遺伝子の多様性作製方法におけるファミリー間シャッフリングでは、それぞれが相同であるために、塩基置換レベルでの変異に等しい効果しか得られておらず、新たな抵抗性遺伝子を作製した例はない。
【００１５】
上記特許文献１記載の反復タンパク質の作製方法では、多様性を作り出すために多種類の比較的長いオリゴＤＮＡを合成する必要があり、塩基の欠失等による未熟アミノ酸が生成される可能性が非常に高い。
また、上記特許文献１においては、実施例では動物のＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを元にした新規毒素阻害タンパク質の作製方法を述べているが、ＬＲＲ部分の作製方法は効率の悪いものである。
【００１６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を有効に利用して多様なタンパク質を効率的かつ実用的に作製することが可能である新規タンパク質の作製方法、並びに自然界における多様な病原菌に対応する能力を有する新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、植物抵抗性遺伝子のロイシンリッチリピート配列の基本骨格は厳密に保存されているわけではなく、さらに個々のリピート単位長にもかなりの多様性が認められることを見出した。このような自然界に存在するＬＲＲ配列からは、進化工学的な手法を駆使することにより、自然がなし得なかった遙かに多様なＬＲＲ配列を有するタンパク質の集合からの新規タンパク質の選抜が可能になり、結果として任意のターゲット分子に対する高い認識又は結合能を持った分子を実用的な短時間内に効率的に選抜することが可能ではないかと考えた。
そして、本発明者等は、以下の各ステップを施すことにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、を備える新規タンパク質の作製方法に存する。
【００１９】
本発明は、（２）重合ステップにおいて、反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものである上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２０】
本発明は、（３）組み込みステップにおいて、Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものである上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２１】
本発明は、（４）遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子である上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２２】
本発明は、（５）作製ステップにおいて、複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製される上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２３】
本発明は、（６）新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備える上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２４】
本発明は、（７）選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備える上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２５】
本発明は、（８）選抜ステップにおいて、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いる上記（７）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２６】
本発明は、（９）上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の作製方法により得られる新規タンパク質に存する。
【００２７】
本発明は、（１０）Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列である上記（８）記載の新規タンパク質に存する。
【００２８】
本発明は、（１１）Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列である上記（８）記載の新規タンパク質に存する。
【００２９】
本発明は、（１２）アミノ酸配列が配列表の配列番号１９〜２７のうちのいずれか一つである新規タンパク質に存する。
【００３０】
本発明は、（１３）上記（９）〜（１２）のいずれか一つに記載の新規タンパク質をコードする遺伝子に存する。
【００３１】
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（１３）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の新規タンパク質の作製方法は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製し、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とし、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとし、該重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込むことにより、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列のみならず、人工的に作製したＬＲＲをも利用して、極めて多様なタンパク質を作製することが可能となる。
【００３３】
また、上記新規タンパク質の作製方法によれば、複数種類の新規タンパク質をコードする遺伝子を多様に、迅速かつ的確に作製できる。例えば、様々な病原菌又は突然変異で進化した新たな病原菌に対して、十分に病原菌認識するタンパク質をコードする遺伝子を迅速かつ的確に作製することが可能となる。
【００３４】
上記新規タンパク質の作製方法においては、重合ステップにおいて、反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものであると、及び／又は、組み込みステップにおいて、Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものであると、複数のユニットを容易にクローニングできるようになるので、多様性のあるライブラリーの作製が容易となる。
【００３５】
上記新規タンパク質の作製方法においては、遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子であると、病原菌認識するタンパク質を確実に作製することができる。
【００３６】
上記作製ステップにおいて、複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製されると、タンパク質間相互作用を司るドメインを含むので病原菌認識するタンパク質を作製しやすいという利点がある。
また、この場合、ロイシンが反復配列の共通部位に存在して疎水結合により反復単位の安定化に寄与し、かつこの疎水性部分が反復配列の相互スタッキングを促すので、分子認識部位となる窪みを持ったタンパク質を形成しやすい。
【００３７】
上記新規タンパク質の作製方法においては、新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備えると、病原菌認識に一層優れたタンパク質を選抜することができる。
【００３８】
上記新規タンパク質の作製方法においては、選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備えると、病原菌認識により一層優れたタンパク質への改良が容易に実現できる。
なお、上記選抜ステップにおいては、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることが好ましい。
【００３９】
本発明の新規タンパク質は、上述した方法で得られるので、自然界における多様でかつ常に変異を続ける病原菌に対応する能力を十分に有する。
【００４０】
上記新規タンパク質は、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数のユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であるか、又は、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であると、より確実に進化した病原菌であっても病原菌認識に対応することが可能である。
【００４１】
本発明の遺伝子は、上述したタンパク質をコードするものであるため、上述したのと同様な効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニットを増幅する重合体増幅ステップと、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、新規タンパク質の中から任意の分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップと、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ等による機能改良ステップと、を備える。
【００４３】
ここで、ＬＲＲとは、いわゆるロイシンリッチリピートを意味し、ＬＲＲ配列とは、アミノ酸配列から推定されるアミノ酸配列がロイシンを多く含む単位（モチーフ）を有し、この単位が反復単位の中で共通した特定の位置で２回以上繰り返している配列をいう。
なお、反復配列の長さやロイシンの繰り返し位置は限定されない。
また、上記Ｎ末端キャップユニットとは、ＬＲＲ配列のＮ末側に隣接した配列であり、必ずしも長さや配列の特徴など無いが、通常反復ユニットの２−３倍以内程度のそれより上流の機能ドメイン等に干渉しない部分をLRR配列のシャフリングの際の不変部分として用いるものを意味し、Ｃ末端キャップユニットとは、同様にＬＲＲのＣ末側に隣接した適当な長さの配列を意味する。
さらに、本発明の新規タンパク質には、任意のターゲット分子ないしはタンパク質に強く相互作用をする新規ターゲット結合タンパク質、及び、任意のターゲット分子ないしはタンパク質を分子レベルで認識する機能を有する分子認識タンパク質が含まれる。
【００４４】
本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法によれば、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を利用した多様なタンパク質を作製することが可能となる。
このことにより、上記新規タンパク質の作製方法によれば、様々な病原菌又は突然変異で進化した新たな病原菌に対して、十分に病原菌認識するタンパク質を作製することが可能となる。
【００４５】
以下、本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法における作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ、組み込みステップ、選抜ステップ及び機能改良ステップについて更に詳細に説明する。
【００４６】
（作製ステップ）
作製ステップは、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、前記遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製するステップである。
【００４７】
具体的には、作製ステップは、ＬＲＲ配列を有する遺伝子を、Ｎ末端側領域、Ｃ末端側領域、及び、Ｎ末端側領域とＣ末端側領域との間のＬＲＲ領域を共通の部位にロイシンを含むように複数の反復するユニット（反復配列ユニット）、に切り分けることに始まる。
ここで、上記Ｎ末端側領域とは、ＬＲＲ領域よりＮ末側にあるタンパク質の領域を意味し、Ｃ末端側領域とは、ＬＲＲ領域よりＣ末側にあるタンパク質の領域を意味する。
なお、この作製ステップにおいて、特に重要なのは、このＬＲＲを構成する各反復配列ユニットのアミノ酸配列を、一定の位置にロイシンの繰り返し単位が認められるように切り分けることである。
なお、上記のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、Ｎ末端側領域、Ｃ末端側領域のうちLRR領域に隣接した小部分である。
【００４８】
上記ＬＲＲ配列を有する遺伝子としては、由来する生物やタンパク質等、特に限定されないが、遺伝子が植物病原菌認識やそれに対する耐病抵抗性に関わる遺伝子であることが好ましい。
この場合、病原菌認識するタンパク質を確実に作製することができる。
【００４９】
上記植物病原菌に関わる遺伝子としては、特に限定されず、任意の植物種のゲノムに存在する多数のＬＲＲを含む遺伝子であればよい。
具体的には、その機能と構造が確認されたものとしてアラビドプシス（RPS2, RPM1, RPP8, RRS1, FLS2, RPW8, CLAVATA1, BRI1, SEK1）、イネ（Pi-ta, Pib, Xa21）、トマト（Cf2, Cf4, Cf5, Cf9, Prf, Ve1）レタス（Dm3）、オオムギ（MLA6, MLA13, Rpg1）、メリステム形成に関わるＣＬＡＶＡＴＡ１、ブラシノステロイド受容体のＢＲＩ１等が挙げられる。
【００５０】
また、植物の病原菌としては、サビフクロカビ(Synchytrium、ジャガイモがんしゅ病)等のツボカビ門、コウガイケカビ(Choanephora、こうがい毛かび病)等の接合菌門、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea、イネいもち病）、タフリナ(Taphrina、桜のてんぐ巣病)、ウドンコカビ(Erysiphe、うどんこ病)又はハイイロカビ(Botrytis、各種植物の灰色かび病)等の子嚢菌門、サビキン(Puccinia、各種植物のさび病等)、クロボキン(Ustilago、コムギ・オオムギの裸黒穂病等) (Tilletia、小麦・大麦のなまぐさ黒穂病) 等の担子菌門、エキビョウキン（Phytophthora、ジャガイモ疫病菌）等の卵菌綱類、あるいはシュードモナス（Pseudomonas、インゲン傘枯れ病）等のバクテリアやウイルス（ＴＭＶタバコモザイクウイルス）等の構成タンパク質、細胞外の構造タンパク質、分泌酵素タンパク質等が挙げられる。
特に植物の細胞内に注入される細菌毒素やその他の分子であることが好ましい。
なお、植物以外の病原菌としては、ヒトや動物のガン細胞や病原菌の特異的構成分子、毒素等が挙げられる。
【００５１】
ここで、Ｎ末端側領域及びＣ末端側領域と、ＬＲＲ領域とを分ける部位は、任意に定めることができる。
例えば、ＬＲＲ配列を有しない部位をＮ末端側領域及びＣ末端側領域とすればよい。
なお、遺伝子機能として重要な部位があるときは、かかる部位をＮ末端側領域又はＣ末端側領域に含めることが好ましい。
これにより、重要な遺伝子機能を保存したまま、多様なタンパク質を作製することができる。
【００５２】
ＬＲＲ領域を増幅する部位は、得られる複数の反復配列ユニットが共通の特定部位にロイシンを含むような部位であれば、特に限定されない。
こうして得られる複数の反復配列ユニットは、共通の部位にロイシンを含むものとなる。
【００５３】
ここで、上記複数の反復配列ユニットは、少なくとも２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むものであることが好ましい。
この場合、ロイシンが反復配列ユニットの共通部位に存在して疎水結合により反復単位の安定化に寄与し、かつこの疎水性部分が反復配列の相互スタッキングを促すので、分子認識部位となる窪みを持ったタンパク質を形成しやすくなる。
【００５４】
また、複数の反復配列ユニットは、５'末端側に下記式（１）又は（２）で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
Ｌ１ＸＸＬ２ＸＸＬ３ＸＬ４Ｘ （１）
式（１）中、Ｌ１はロイシンを示し、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４の中の少なくとも１つはロイシンを示し、その他のＬ２、Ｌ３又はＬ４、及びＸはアミノ酸を示す。なお、Ｃ末端側のアミノ酸数は反復配列ユニット毎に異なっている。
ＸＩＰＸＸＬ５ＸＸＬ６ＸＸＬ７ＸＸＬ８ＤＬ９ＸＸＮＸＬ１０ＴＧ （２）
式（２）中、Ｌ５〜Ｌ１０のうちの少なくとも２つはロイシンを示し、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｄ、Ｎ、Ｔ及びＧの少なくとも３つ以上は、Ｉがイソロイシン、Ｐがプロリン、Ｌがロイシン、Ｄがアスパラギン酸、Ｎがアスパラギン、Ｔがスレオニン、Ｇがグリシンを示す。なお、上記以外のＬ５〜Ｌ１０、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｇ、及びＸはアミノ酸を示す。
この場合、病原菌認識する多様なタンパク質を確実に作製することが可能となる。
【００５５】
また、上記遺伝子がイネいもち病菌抵抗性遺伝子Ｐｉｂである場合、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であることが好ましい。
この場合、病原菌認識に対応することが可能である。
【００５６】
また、上記遺伝子がバクテリアのフラジェリンを認識する抵抗性遺伝子である場合、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であることが好ましい。
この場合、病原菌認識に対応することが可能である。
【００５７】
（増幅ステップ）
増幅ステップは、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とするステップである。
【００５８】
この増幅ステップにおいては、それぞれの反復配列ユニットをＰＣＲ法により増幅する際にプライマー部分にII型制限酵素部位を追加する。
これにより、II型制限酵素処理によって共通した「のりしろ」が生じるので、後述する重合ステップが容易に行われる。
【００５９】
増幅する方法は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼチェイン反応：Polymerase Chain Reaction）である。なお、ＰＣＲ法に代わりにＬＡＭＰ法（Loop-mediated Isothermal Amplification）を用いる増幅であってもよい。
【００６０】
かかるＰＣＲ法は、まず、２本鎖のＤＮＡを鋳型とし、特定領域を挟むように短いプライマーＤＮＡを各相補鎖にハイブリッド結合させ、基質である４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、このプライマーの３'末端に、鋳型のＤＮＡ配列に従ってヌクレオチドを添加し鎖を伸長させる。そして、この反応でできた新たな２本鎖ＤＮＡを加熱して相補鎖に分離し、過剰に存在するプライマーを再び該当位置にハイブリッド結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応で新たなＤＮＡ鎖を合成させる。この反応が繰り返されることで、目的領域を含むＤＮＡ断片を大量に増やす方法である。
【００６１】
（重合ステップ）
重合ステップは、反復配列ユニットを増幅して得られる反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとするステップである。
【００６２】
このように、増幅ステップの後、反復配列ユニット遺伝子を重合し、重合ユニットとすることにより、後述するライブラリーの作製が容易となる。
したがって、これにより複数の重合ユニットをシャッフルすることが可能となる。
【００６３】
このとき、Ｎ末端キャップユニット又はＣ末端キャップユニットと重合ユニット、或いは、重合ユニット同士を読み枠通りに繋げるため、重合ユニットに制限酵素と共にライゲースを加えることが好ましい。
かかるライゲースとしては、Ｔ4 ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の公知のものが挙げられる。
【００６４】
Ｎ末端キャップユニット又はＣ末端キャップユニットと重合ユニット、或いは、重合ユニット同士を繋げる方法は、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。
具体的には、ＲＡＣＨＩＴＴ法（Random Chimeragenesis on Transient Templates）、ＣＬＥＲＹ法（Combinatorial Libraries Enhanced by Recombination in Yeast）、ＳＨＩＰＲＥＣ法（Sequence Homology Independent Protein Recombination）等が挙げられる。
また、それら遺伝子の合成においてスプリット合成法、パラレル合成法、混合物合成法、ＬＰＣＳ、マルチピン法、チップ合成法等のリコンビナントケミストリー技術を組み合わせることで自動化技術に対応することができる。
【００６５】
（組み込みステップ）
組み込みステップは、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製するステップである。
【００６６】
組み込みステップにおいては、まず、上記重合ステップで得られた複数の重合ユニットをクローニングして、ライブラリーを作製する。
そして、ライブラリーから任意に選択された重合ユニット、Ｎ末端キャップユニット、及び、Ｃ末端キャップユニットを、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットが両端に位置するようにベクターに組み込み新規タンパク質が得られる。
【００６７】
ここで、上記Ｎ末端キャップユニットとしては、特に限定されず、例えば、Ｐｉｂタンパク質ではLRRに隣接するGYFMELKNRSMILPFQQSGSSRKSIDSCKVHDLMRDIAISKSTEENLVFRVEEGCSARD
の配列等が挙げられ、上記Ｃ末端キャップユニットとしては、特に限定されず、例えば、Pibタンパク質ではLRRに隣接する
LEFLQNINEVQLSVWFPTDHDRIRAARAAGADYETAWEEEVQEARRKGGELKRKIREQLARNPNQPIIT
の配列等が挙げられる。
【００６８】
（選抜ステップ）
選抜ステップは、新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜するステップである。
選抜ステップを行うことにより、病原菌認識に一層優れたタンパク質を選抜することができる。
【００６９】
選抜する方法としては、ｍＲＮＡディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ファージディスプレイ法、酵母表面提示法、バクテリア表面提示法、酵母Ｔｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖｉｒｕｓ法、ＳＴＡＢＬＥ法（Streptavidin-biotin Linkage in Emulsions）、ＣＩＳディスプレイ法等が挙げられる。
これらの中でも、酵母Ｔｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることが好ましい。
【００７０】
（機能改良ステップ）
機能改良ステップは、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行うステップである。
ここで、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲとは、突然変異を導入する方法であり、Ｌｅｕｎｇ等により確立されている方法である（Leung, D.W., et al., (1989) J. Methods Cell Mol. Biol., 1, 11-15）。
【００７１】
本実施形態において、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法は、０．１〜０．４ｍＭマンガンイオンを添加して行うことが好ましい。
この場合、約１％程度の塩基置換を加えることができる。なお、マンガンイオンの濃度が０．４ｍＭを超えるとスメアになるおそれがある。
【００７２】
機能改良ステップを行うことにより、上述した実施形態に係る新規タンパク質の作製方法で得られた新規タンパク質を、突然変異を導入しながら増幅させることにより、更に多様な新規タンパク質を作製することが可能となる。
よって、この場合、病原菌認識により一層優れたタンパク質に改良することができる。
また、上記病原菌が突然変異等で進化し新たな病原菌となった場合であっても、ＬＲＲ配列を有する複数種類の新規タンパク質を選抜することにより、自然界において偶然生じた非病原力遺伝子産物と植物抵抗性遺伝子との組み合わせと比較して、進化した病原菌の病原菌認識により十分に優れるものとなる。
【００７３】
こうして得られる新規タンパク質は、上述した方法で得られるので、自然界における多様な病原菌に対応する能力を十分に有する。
すなわち、上記新規タンパク質は、病原菌が突然変異等で進化し新たな病原菌となった場合であっても、自然界において偶然生じた非病原力遺伝子産物と植物抵抗性遺伝子との組み合わせと比較して、進化した病原菌の病原菌認識に十分に対応することが可能である。
【００７４】
なお、新たに発見された病原菌であっても１−２ヶ月でそれらに対する新規タンパク質（新規ターゲット結合タンパク質又はその遺伝子）を作製することが可能である。
【００７５】
また、上記新規タンパク質は、バイオセンサー等のレセプターとしてなど多方面における足場タンパク質としての利用が期待される。
さらに、上記新規タンパク質は、がん治療におけるピンポイントターゲット投薬等の多様な用途に用いることができる。
なお、かかるピンポイントターゲット投薬には従来、動物免疫を司るイムノグロブリンが主に用いられているが、システイン残基による立体構造を維持する必要があり、細胞内環境によっては十分な効果を発揮できない場合がある。
【００７６】
これに対し、上記新規タンパク質は、システイン残基の影響が少ないので、イムノグロブリンの代替足場タンパク質としても用いることが可能である。
なお、本発明の遺伝子は、上述した新規タンパク質をコードするものであるため、上述したのと同様な効果が得られる。
【００７７】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００７８】
例えば、本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法によれば、本発明において例示した配列番号１〜２７のアミノ酸配列だけでなく、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を利用した多様なタンパク質を作製することが可能である。
【００７９】
また、上述した実施形態においては、作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ、組み込みステップ、選抜ステップ及び機能改良ステップを行っているが、選抜ステップ及び機能改良ステップは必ずしも必須のステップではない。
すなわち、本発明のタンパク質の作製方法は、少なくとも作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ及び組み込みステップを備えていればよい。
【００８０】
また、上述した反復配列ユニットは、既存の遺伝子に由来するものに限らず、これらを参考にコンセンサス構造を適度に保ちつつ任意に設計したものであってもよい。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８２】
（実施例１）
（作製ステップ）
（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子
植物病原菌認識に関わるＬＲＲ配列を有する遺伝子として、Ｗａｎｇ等（１９９９ Plant Journal, 19, 55-64）らによって単離されたイネいもち病菌非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｂ保有菌株に対する抵抗性遺伝子Ｐｉｂ（イネ品種シモキタ由来）を用いた。
【００８３】
（２）ＬＲＲ領域の推測
Ｐｉｂはロイシンに富んだ領域が認められるが、アミノ酸残基の基本骨格があまり保存されていない。そこで、ＬＲＲ配列の基本骨格である上記式（１）に示すＬ１ＸＸＬ２ＸＸＬ３ＸＬ４Ｘを参考にしてＬＲＲ配列の再構築を試みた。
そして、ＬＲＲ領域の保存されたロイシン残基の境界を設定した。図１に植物抵抗性遺伝子Ｐｉｂの遺伝子構造を切断して得られるＮ末端キャップユニット、Ｃ末端キャップユニット及び反復配列ユニットのアミノ酸配列を示す。
なお、反復配列ユニット６にシステインに富んだアイランド領域を設定することにより、基本骨格の保たれたＬＲＲ配列を設計することができた。
【００８４】
（増幅ステップ）
（３）プライマー合成
次に、抵抗性遺伝子Ｐｉｂを、図１に示すように、Ｎ末端キャップユニット（配列番号１）、Ｃ末端キャップユニット（配列番号１６）、及び反復配列ユニット１〜１４（配列番号２〜１５）に、各反復配列ユニットが共通の部位にロイシンを含むようにして、プライマーを合成した。
すなわち、それぞれの反復配列ユニット１〜１４を増幅できるように両端にプライマーを設計し、ロイシンをコードする塩基コドンがのりしろとなるようにした。
【００８５】
のりしろ部分は５'末端側をＢａｍＨIにて、３'末端側をＢｇｌIIにて消化された突出末端となるようにした。
また、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、遺伝子機能として重要である可能性が考えられたため、固定した。
さらに、ライブラリーをベクターにクローニングしやすいように、Ｎ末端キャップユニットには５'末端側にＢａｍＨI部位ではなくＥａｇＩ部位を、Ｃ末端キャップユニットには３'末端側にＢｇｌII部位ではなくＸｈｏＩ部位をそれぞれ付加させた。
【００８６】
（４）ＰＣＲ増幅
Ｐｉｂをクローニングしたプラスミドを鋳型とし、それぞれの反復配列ユニットを増幅するプライマーセットを用いて個々の反復配列ユニット１〜１４をＰＣＲ増幅させた。
それぞれの反復配列ユニット１〜１４はエタノール沈殿処理で精製し、制限酵素ＢａｍＨI、ＢｇｌII同時処理にてのりしろを作製した。
さらに、酵素処理したサンプルを電気泳動しゲル回収を行うことにより、両端から切り出された核酸小断片を除去した
【００８７】
（重合ステップ及び組み込みステップ）
（５）新規タンパク質の作製
このようにして得られたそれぞれの反復配列ユニット１〜１４をライブラリーの出発材料として用いた。
そして、個々の反復配列ユニット１〜１４を混合し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、制限酵素バッファー、ＢａｍＨI、ＢｇｌIIを添加して２５℃にて６時間インキュベーションした。反応後、７０℃１０分間反応させ酵素活性を失活させ、電気泳動後にゲル回収を行い重合の進んだ遺伝子断片を選抜した。
【００８８】
図２は、反復配列ユニットを重合させた遺伝子断片を示す図である。なお、図２中、Ｍはマーカーを意味し、１は未精製反応物を意味し、２はゲル回収を行い、選抜された重合の進んだ遺伝子断片を意味する。
図３は、図１に示す複数の重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製する組み込みステップを示す図である。
なお、図３中、Ｎ末端キャップユニットは「５'Ｕ」と、Ｃ末端キャップユニットは「３'Ｕ」と、重合ユニット１〜１４は単に「１」〜「１４」と示す。
図３に示すように、目的とする複数個以上の重合ユニットが組み込まれた新規タンパク質Ａ〜Ｆ（配列番号１９〜２４）を得た。
【００８９】
（実施例２）
（作製ステップ）
（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子
動物の病原菌認識に関わるＬＲＲ配列を有する遺伝子として、既報の原著論文Gomez-Gomez L. and Boller T. (2000) Molecular Cell, 5, 1003-1011を参照して、アラビドプシスのエコタイプＷｓ３のゲノミックＤＮＡからＰＣＲ法により単離したバクテリアのフラジェリンを認識する抵抗性遺伝子ＦＬＳ２を用いた。
【００９０】
（２）ＬＲＲ領域の推測
ＦＬＳ２はロイシン及びその他のアミノ酸残基の骨格がきれいに保存された２４アミノ酸で構成された典型的なロイシンリッチリピート構造を取っている。
そして、ＬＲＲ領域の保存されたロイシン残基の境界を設定した。
【００９１】
（増幅ステップ）
（３）プライマー合成
次に、抵抗性遺伝子ＦＬＳ２を、Ｎ末端キャップユニット（配列番号１７）、Ｃ末端キャップユニット（配列番号１８）、及び反復配列ユニットに、各反復配列ユニットが共通の部位にロイシンを含むようにして、プライマーを合成した。
すなわち、それぞれの反復配列ユニットを増幅できるように両端にプライマーを設計し、イソロイシンをコードする塩基コドンがのりしろとなるようにした。
【００９２】
のりしろ部分は５'末端側をＢａｍＨIにて、３'末端側をＢｇｌIIにて消化された突出末端となるようにした。
また、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、遺伝子機能として重要である可能性が考えられたため、固定した。
さらに、ライブラリーをベクターにクローニングしやすいように、Ｎ末端キャップユニットにおいては５'末端側にはＢａｍＨI部位ではなくＥａｇＩ部位を、Ｃ末端キャップユニットにおいては３'末端側にはＢｇｌII部位ではなくＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ付加させた。
【００９３】
（４）ＰＣＲ増幅
ＦＬＳ２をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、それぞれの反復配列ユニットを増幅するプライマーセットを用いて個々の反復配列ユニットをＰＣＲ増幅させた。
それぞれの反復配列ユニットはエタノール沈殿処理で精製し、制限酵素ＢａｍＨI、ＢｇｌII同時処理にてのりしろを作製した。
さらに、酵素処理したサンプルを電気泳動しゲル回収を行うことにより、両端から切り出された核酸小断片を除去した。
【００９４】
（重合ステップ及び組み込みステップ）
（５）新規タンパク質の作製
このようにして得られたそれぞれの反復配列ユニットをライブラリーの出発材料として用いた。
実施例１と同様にして、複数の重合ユニットとし、該重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製した。
【００９５】
（実施例３）
（選抜ステップ）
次に、実施例１で得られたそれぞれの新規タンパク質Ａ〜Ｆとバクテリアとの相互作用をＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ法にて評価した（図４参照）。
図４に示すＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ法は、タンパク質間相互作用を調べる手法である。
本実施例においては、生物種として大腸菌を用い、ベイトとしてＲｉｃｅ Ｄｗａｒｆ Ｖｉｒｕｓの第８分節、又はいもち病菌の感染時に発現が増強されることが確認されているハイドロフォービンＭＰＧ１（Magnaporthe oryzae）を用い、これらをターゲットタンパクとした。また、プレイとして新規タンパク質Ａ〜Ｆなどに示したようなシャッフリングライブラリー遺伝子配列を用いた。
【００９６】
イネいもち病菌のゲノミックＤＮＡよりＭＰＧ１全長をＰＣＲ増幅させ、ＭＰＧ１をベクターｐＢＴのアンカータンパク質（ｃＩ）とインフレームになるようにクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌レポーター系統へ導入してＭＰＧ１を発現する大腸菌系統を作製した。
そして、ＭＰＧ１を発現する大腸菌系統を材料としてエレクトロポレーション用のコンピテントセルを作製した。Ｒｉｃｅ Ｄｗａｒｆ Ｖｉｒｕｓの第８分節においても同様な操作を行った。
次いで、ｐＴＲＧへクローニングされたライブラリーをコンピテントセルへ導入し３-ＡＴ含有選択培地から生育する陽性クローンを観察した。
【００９７】
図５はバクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法のコントロール実験の図であり、（ａ）は完全培地、（ｂ）は３−ＡＴ試薬添加最小培地における生育状況の図である。
なお、図５の（ａ）及び（ｂ）中、ＹＴＨはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社酵母Ｔｗｏ-ｈｙｂｒｉｄシステム添付のポジティブコントロールで用いられている遺伝子配列を導入したクローンを意味し、ＢＴＨは既知のタンパク質（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄシステム添付のコントロール実験で用いられている遺伝子配列を導入したクローンを意味し、ＬＢＡは完全培地を意味し、Ｍ９ ３−ＡＴは3-AT試薬添加最小培地を意味し、Ｗｔは野生型遺伝子（相互作用を示す）の組み合わせを意味し、Ｍｕｔは変異型遺伝子（相互作用を示さない）の組み合わせを意味し、Ｐｏｓｉは相互作用を示すGal4遺伝子の組み合わせを意味し、Ｎｅｇaはベクター単独処理を意味する。
図５に示すように、バクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法において、酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法で用いられているポジティブクローンも機能することがわかった。
また、図６は、図５において示した各クローンの生育速度を示した図である。
【００９８】
図７は、選抜ステップにより選抜されたＭＰＧ1と相互作用するＰｉｂライブラリーより得られた陽性クローンの一つを示した図である。
この他にＦＬＳ２ライブラリーからも２クローンが好適に病原菌を認識した。
図７に示すように、選択培地上における陽性クローンの生育速度は既知のＢＴＨ用ポジティブコントロールにおける生育速度と比較すると遅いものであった。
選択培地における生育速度はＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムの結合強度を反映していると考えられている。
このことにより、本発明の新規ターゲット結合タンパク質とターゲットタンパク質（ＭＰＧ１）との相互作用力は弱いものと考えられる。
【００９９】
また、図７の結果より、最も病原菌認識に優れた新規タンパク質は、新規タンパク質Ｆの一部が変換されたもの（配列番号２５）であった。
図８に新規タンパク質Ｆの遺伝子断片を示す。
【０１００】
（実施例４）
（機能改良ステップ）
次に、ＭＰＧ１と相互作用した陽性クローンプラスミドを回収し、Ｎ末端キャップユニットのフォワードプライマーとＣ末端キャップユニットのリバースプライマーとを用いてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によって塩基置換を加えた。
Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法は、Ｔａｋａｒａ ｒＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、０．２５ ｍＭマンガンイオンを添加することで、約１％程度の塩基置換を加えることができた（図９参照）。
【０１０１】
変異を加えたアミノ酸配列は、再びｐＴＲＧベクターへクローニングし、評価方法１と同様にして、選択培地からより生育の早いコロニーを観察した。
得られた結果を図１０及び図１１に示す。
図１０及び図１１中、Ｐ−６はＰｉｂライブラリー由来陽性クローンプラスミドを意味し、Ｐ−６−１はＰ−６プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｐ−６−２はＰ−６プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｅ１はＰ−６−１及びＰ−６−２プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｅ２はＰ−６−１及びＰ−６−２プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味する。
【０１０２】
図１０及び図１１に示すように、より生育の早い、ポジティブコントロールに匹敵する生育速度を示すクローンが得られた。
このことはより結合力の高い新規タンパク質が選定されたことを示している。
【０１０３】
以上より、ＬＲＲの反復単位の両端には制限酵素処理により共通した付着末端を持たせ、各反復単位が重合しやすいように設計し、制限酵素存在下でのライゲーション反応とゲル分画を行うことにより、読み枠の方向性を保った任意長のリピートシャッフリングライブラリーが得られた。
【０１０４】
得られたライブラリーの中から、これまでに病原体エリシターとしては報告されていないがイネいもち病菌 (Magnaporthe oryzae)では病原力発揮に関わるとされる菌糸表層の疎水性タンパク質、ハイドロフォービン：MPG1をターゲットとする新規ＬＲＲの選抜を試み、タンパク質の相互作用はバクテリアTwo-Hybridシステムを用いＭＰＧ１をベイトとしてＬＲＲライブラリーからターゲット選抜を行い、ポジティブクローンが上記２種ライブラリーのそれぞれから得られた。
【０１０５】
図１２は、選抜された陽性クローンと、これまでに報告されている植物由来ＬＲＲ配列を有するタンパク質と病原体由来タンパク質が相互作用を示した遺伝子を単離し、バクテリアＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法にて結合様式をバクテリアの増殖速度で評価した結果を示す図である。
図１２中、Ｐｏｓｉｔｉｖｅはキットの陽性対照を、ＮｅｇａはＭＰＧ１タンパク質をベイトにしてＰｉｂタンパク質ＬＲＲ領域と相互作用を解析したもの、Ｐ−６は選抜ステップによって選抜された陽性クローン、ＦＬＳ−ＬＲＲはＦＬＳ２タンパク質のＬＲＲ領域のみと、あるいはＦＬＳ−ＡＬＬはＦＬＳ２タンパク質の全長を含んだものとタバコ野火病菌（シュードモナス）のフラジェリンタンパク質ｆｌｇ２２と相互作用を解析したもの、ＰＧＩＰ−ＡおよびＰＧＩＰ−Ｂはウズラマメ由来ポリガラクツロナーゼインヒビタータンパク質とアスペルギルス菌由来ポリガラクツロナーゼタンパク質との相互作用を解析したもの、Ｐｉｔａはイネいもち病抵抗性遺伝子Ｐｉｔａタンパク質といもち病菌非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｔａタンパク質との相互作用を解析したものである。３−ＡＴ（−）は選択試薬３−ＡＴを含まない最小培地で培養した結果で、３−ＡＴ（＋）は選択試薬３−ＡＴを含む最小培地で培養した結果を示した。
図１２に示すように、キットの陽性対照の組み合わせ（bait: Gal4-LGF2/target: Gal11P）よりも生育速度は遅かったが、これまでに抵抗性遺伝子ＬＲＲと直接結合するとされる病原体の非病原性遺伝子産物と対応するＬＲＲ、あるいはポリガラクツロナーゼインヒビターと直接結合するとされる病原体のポリガラクツロナーゼと対応するＬＲＲとの組み合わせと比較するとほぼ同等かそれ以上の生育速度を示すことがわかった。
【０１０６】
また、得られたＬＲＲについては更にＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの繰り返しによる機能改良を行い、最終的には陽性対照とほぼ同等の生育速度を示す遺伝子配列の選抜に成功した。配列表の配列番号２６にＰｉｂ由来ライブラリーより選抜された陽性クローンアミノ酸配列を、配列表の配列番号２７にＦＬＳ２由来ライブラリーより選抜された陽性クローンのアミノ酸配列を示した。
ＬＲＲ配列の特徴としては異なるＬＲＲ配列材料（ロイシン骨格の保存性の高いＦＬＳ２、ロイシン骨格の保存性の低いＰｉｂ）から、ライブラリーを作製し、どちらのタイプのＬＲＲ配列からも新たなターゲットタンパク質と結合する新規タンパク質が取得できることがわかった。
【０１０７】
このことにより、イネのいもち病抵抗性遺伝子Ｐｉｂとアラビドプシスのバクテリアフラジェリン認識遺伝子ＦＬＳ２とに由来する二つの異なるＬＲＲを出発材料として、これらのリピート遺伝子を反復単位に分解し、それらをランダムに再重合化させたリピートシャッフリングライブラリーから目的分子を認識するLRRを得る方法が確立された。
【０１０８】
よって、本発明の新規タンパク質の作製方法によれば、自然界に数多く存在しているロイシンリッチリピート配列を利用して多様なタンパク質を作製することが可能である新規タンパク質の作製方法、並びに自然界における多様な病原菌に対応する能力を有する新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、植物抵抗性遺伝子Ｐｉｂの遺伝子構造を切断して得られるＮ末端キャップユニット、Ｃ末端キャップユニット及び反復配列ユニットのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、反復配列ユニットを重合させた遺伝子断片を示す図である。
【図３】図３は、図１に示す複数の重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製する組み込みステップを示す図である。
【図４】図４は、バクテリアＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄシステムを示す図である。
【図５】図５は、バクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法のコントロール実験の図であり、（ａ）は完全培地、（ｂ）は３−ＡＴ試薬添加最小培地における生育状況の図である。
【図６】図６は、図５において示した各クローンの生育速度を示した図である。
【図７】図７は、選抜ステップにより選抜されたＭＰＧ1と相互作用するＰｉｂライブラリーより得られた陽性クローンの一つを示した図である。
【図８】図８は、新規タンパク質Ｆの遺伝子断片を示す図である。
【図９】図９は、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにおいて、マンガンイオンの濃度設定をした結果を示す図である。
【図１０】図１０は、陽性クローンをＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにより改良したクローンの生育を示す図である。
【図１１】図１１は、陽性クローンをＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにより改良したクローンの生育速度を示す図である。
【図１２】図１２は、選抜された陽性クローンと、これまでに報告されている植物由来ＬＲＲ配列を有するタンパク質と病原体由来タンパク質が相互作用を示した遺伝子を単離し、バクテリアＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法にて結合様式をバクテリアの増殖速度で評価した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物種に広く存在している多様なロイシンリッチリピート配列を利用した新規タンパク質の作製方法、並びにそれにより得られる新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物と植物病原菌との間には親和性と非親和性という二つの異なる関係が存在する。植物と植物病原菌とが親和性関係にある場合、植物が病原菌を認識できずに侵入を許し病徴発現に至ることになり、一方、植物と植物病原菌とが非親和性関係にある場合、植物が病原菌の何らかの信号を認識することで病原菌を拒絶することになる。
この病原菌認識に関わる遺伝子は、一般に植物の抵抗性遺伝子（耐病性抵抗遺伝子）と呼ばれる。かかる植物の抵抗性遺伝子は、これまでに数多く報告されており、その大半はロイシン残基に富んだリピート構造であるロイシンリッチリピート配列を有するタンパク質をコードすること知られている。
【０００３】
ロイシンリッチリピート配列はある一定の間隔に配置されたロイシン残基を骨格として、α−へリックス、βシート構造からなるくさび形の反復ユニットが多数繰り返されることにより、全体として窪みを持ったタンパク質領域が形成され、その内側の表面上のアミノ酸配列の多様性によりそれぞれ特定のタンパク質ないしは分子と特異的な相互作用をしていることが予測されており、一部ではその様子が実証されている。
【０００４】
例えば、ＲＮａｓｅインヒビターやポリガラクチュロナーゼインヒビターのロイシンリッチリピート配列はX線回折分析によりLRRとそのリガンドのタンパク質の構造が明らかにされている。すなわち、上記ロイシンリッチリピート配列の馬蹄型又は捩れたループ状構造に、ターゲットとなるＲＮａｓｅ又はポリガラクチュロナーゼが結合している様相が明らかとなっている（例えば、非特許文献１又は非特許文献２参照）。
【０００５】
一方で、動物においても免疫機構とは別に、生来的にウイルス・バクテリアの認識に関わる遺伝子が解明されつつある。かかる遺伝子は先天性免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と呼ばれる。
このウイルス・バクテリアの認識に関わる遺伝子には、植物抵抗性遺伝子と類似したロイシンリッチリピート配列を含んだ構造もある。このため、病原菌認識は、このロイシンリッチリピート配列を含む遺伝子がウイルス由来二本鎖ＲＮＡ又はバクテリア由来核酸（メチル化の違いを認識している）を直接ロイシンリッチリピート配列に結合させることにより行われると考えられている。
【０００６】
ところで、イネいもち病菌の非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｔａの認識に関わるイネ抵抗性遺伝子Ｐｉｔａが酵母Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法により直接結合することが明らかとされ、また、バクテリアのフラジェリンタンパク質の認識に関わるシロイヌナズナの抵抗性遺伝子ＦＬＳ２は同位体ラベルしたフラジェリンタンパク質を用いて直接結合することが示されている（例えば、非特許文献３又は非特許文献４参照）。
【０００７】
しかしながら、植物抵抗性遺伝子と病原体由来エリシターとの間で直接相互作用を示した例はごくわずかに過ぎず、近年、新たな防御応答メカニズムとして、植物抵抗性遺伝子が宿主因子と結合した複合体を形成しており、病原菌侵入によりその複合体バランスが崩れることによる刺激が防御反応を導くというＧｕａｒｄ仮説が提唱されつつある（例えば、非特許文献５参照）。
この仮説によれば、植物抵抗性遺伝子は、認識を司るロイシンリッチリピート配列の進化速度が病原体の進化に間に合わず、その他宿主因子の多様性をも巻き込んだ「複合体」として認識を担っている。
【０００８】
また、ロイシンリッチリピート配列の進化はそれぞれの抵抗性遺伝子ホモログとの比較によって評価されている。この解析より明らかとなった点は、タンパク質相互作用に関わると思われる領域（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｅｘｐｏｓｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）に非同義的置換が蓄積していたことである。
このことは、多様なタンパク質を認識するために選択圧が働いていることを示している。
【０００９】
この多様性を生み出すメカニズムとして、点変異による塩基置換、あるいはオルソログやパラログ遺伝子を介した遺伝子変換等の多様性作製機構が存在することを進化系統的に推察している（例えば、非特許文献６参照）。
【００１０】
しかしながら、植物は動物のような体液循環機構を持たず、従って動物の免疫グロブリンに見られるような巧妙な個体発生の間に病原体認識分子を多様化させることは不可能で、遺伝子の構造にも特にシャフリングを起こすシステムなどは見られず、しかもゲノム内に収容できるLRR遺伝子の数にもせいぜい１０００個前後限りがあるために、LRRタンパク質の持つ無限の分子認識の可能性のごく一部を実現しているに過ぎない状況にあるものと考えられる。
【００１１】
一方、遺伝子の多様性作製方法としては、近年分子進化工学分野が発達し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多様な遺伝子配列の作製に成功している（例えば、非特許文献７参照）。
植物抵抗性遺伝子もオルソログ・パラログ遺伝子の相同領域を介したファミリー間シャッフリングが行われており、病原菌認識に関わる遺伝子領域の特定などに威力を発揮している（例えば、非特許文献８参照）。
【００１２】
また、スタンプらは反復モジュールを含んだ反復タンパク質の作成方法を開示している（例えば、特許文献１参照）。
かかる発明は、典型的なロイシンリッチリピート配列基本骨格を固定位置と設定し、それ以外の無作為化位置において人工的に変異を加え、多様性を導くものである。
【特許文献１】特公表２００４−５０８０３３
【非特許文献１】Kobe B, Diesenhofer J (1995) Nature 374, 183-186.
【非特許文献２】Di Matteo A, Federici L, Mattei B, Salvi G, Johnson KA, Savino C, De Lorenzo G, Tsernoglou D, Cervone F (2003) Proceedings of the National Academy of the Science of USA 100, 10124-10128.
【非特許文献３】Jia Y, McAdams S, Bryan GT, Hershey HP, Valent B (2000) EMBO J 19, 4004-4014.
【非特許文献４】Bauer Z, Gomez-Gomez L, Boller T, Felix G (2001) Journal of Biolgoical Chemistry 276, 45669-45676.
【非特許文献５】Dangl JL, Jones JDG (2001) Nature 411, 826-833.
【非特許文献６】Parniske M, Hammond-Kosack KE, Golstein C, Thomas CM, Jones DA, Harrison K, Wulff BBH, Jones JDG (1997) Cell 91, 821-832.
【非特許文献７】Directed enzyme evolution. Farinas ET, Bulter T, Arnold FH (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 545-551.
【非特許文献８】Wulff BBH, Thomas CM, Smoker M, Grant M, Jones JDG (2001) Plant Cell 13, 255-272.
【非特許文献９】Van der Hoorn RAL, Roth R, De Wit PJGM (2001) Plant Cell 13, 273-285.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記非特許文献６記載の多様性作製機構は、１アミノ酸レベルでの変化、あるいは相同性の認められた領域に限られた変化であり、自然界における多様でかつ絶え間なく変異を続ける病原菌に対応する能力を付与させるには限界があると考えられる。
【００１４】
上記非特許文献８及び９に記載の遺伝子の多様性作製方法におけるファミリー間シャッフリングでは、それぞれが相同であるために、塩基置換レベルでの変異に等しい効果しか得られておらず、新たな抵抗性遺伝子を作製した例はない。
【００１５】
上記特許文献１記載の反復タンパク質の作製方法では、多様性を作り出すために多種類の比較的長いオリゴＤＮＡを合成する必要があり、塩基の欠失等による未熟アミノ酸が生成される可能性が非常に高い。
また、上記特許文献１においては、実施例では動物のＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを元にした新規毒素阻害タンパク質の作製方法を述べているが、ＬＲＲ部分の作製方法は効率の悪いものである。
【００１６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を有効に利用して多様なタンパク質を効率的かつ実用的に作製することが可能である新規タンパク質の作製方法、並びに自然界における多様な病原菌に対応する能力を有する新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、植物抵抗性遺伝子のロイシンリッチリピート配列の基本骨格は厳密に保存されているわけではなく、さらに個々のリピート単位長にもかなりの多様性が認められることを見出した。このような自然界に存在するＬＲＲ配列からは、進化工学的な手法を駆使することにより、自然がなし得なかった遙かに多様なＬＲＲ配列を有するタンパク質の集合からの新規タンパク質の選抜が可能になり、結果として任意のターゲット分子に対する高い認識又は結合能を持った分子を実用的な短時間内に効率的に選抜することが可能ではないかと考えた。
そして、本発明者等は、以下の各ステップを施すことにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、を備える新規タンパク質の作製方法に存する。
【００１９】
本発明は、（２）重合ステップにおいて、反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものである上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２０】
本発明は、（３）組み込みステップにおいて、Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものである上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２１】
本発明は、（４）遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子である上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２２】
本発明は、（５）作製ステップにおいて、複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製される上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２３】
本発明は、（６）新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備える上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２４】
本発明は、（７）選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備える上記（１）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２５】
本発明は、（８）選抜ステップにおいて、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いる上記（７）記載の新規タンパク質の作製方法に存する。
【００２６】
本発明は、（９）上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の作製方法により得られる新規タンパク質に存する。
【００２７】
本発明は、（１０）Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列である上記（８）記載の新規タンパク質に存する。
【００２８】
本発明は、（１１）Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列である上記（８）記載の新規タンパク質に存する。
【００２９】
本発明は、（１２）アミノ酸配列が配列表の配列番号１９〜２７のうちのいずれか一つである新規タンパク質に存する。
【００３０】
本発明は、（１３）上記（９）〜（１２）のいずれか一つに記載の新規タンパク質をコードする遺伝子に存する。
【００３１】
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（１３）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の新規タンパク質の作製方法は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製し、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とし、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとし、該重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込むことにより、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列のみならず、人工的に作製したＬＲＲをも利用して、極めて多様なタンパク質を作製することが可能となる。
【００３３】
また、上記新規タンパク質の作製方法によれば、複数種類の新規タンパク質をコードする遺伝子を多様に、迅速かつ的確に作製できる。例えば、様々な病原菌又は突然変異で進化した新たな病原菌に対して、十分に病原菌認識するタンパク質をコードする遺伝子を迅速かつ的確に作製することが可能となる。
【００３４】
上記新規タンパク質の作製方法においては、重合ステップにおいて、反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものであると、及び／又は、組み込みステップにおいて、Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものであると、複数のユニットを容易にクローニングできるようになるので、多様性のあるライブラリーの作製が容易となる。
【００３５】
上記新規タンパク質の作製方法においては、遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子であると、病原菌認識するタンパク質を確実に作製することができる。
【００３６】
上記作製ステップにおいて、複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製されると、タンパク質間相互作用を司るドメインを含むので病原菌認識するタンパク質を作製しやすいという利点がある。
また、この場合、ロイシンが反復配列の共通部位に存在して疎水結合により反復単位の安定化に寄与し、かつこの疎水性部分が反復配列の相互スタッキングを促すので、分子認識部位となる窪みを持ったタンパク質を形成しやすい。
【００３７】
上記新規タンパク質の作製方法においては、新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備えると、病原菌認識に一層優れたタンパク質を選抜することができる。
【００３８】
上記新規タンパク質の作製方法においては、選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備えると、病原菌認識により一層優れたタンパク質への改良が容易に実現できる。
なお、上記選抜ステップにおいては、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることが好ましい。
【００３９】
本発明の新規タンパク質は、上述した方法で得られるので、自然界における多様でかつ常に変異を続ける病原菌に対応する能力を十分に有する。
【００４０】
上記新規タンパク質は、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数のユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であるか、又は、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であると、より確実に進化した病原菌であっても病原菌認識に対応することが可能である。
【００４１】
本発明の遺伝子は、上述したタンパク質をコードするものであるため、上述したのと同様な効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法は、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニットを増幅する重合体増幅ステップと、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、新規タンパク質の中から任意の分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップと、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ等による機能改良ステップと、を備える。
【００４３】
ここで、ＬＲＲとは、いわゆるロイシンリッチリピートを意味し、ＬＲＲ配列とは、アミノ酸配列から推定されるアミノ酸配列がロイシンを多く含む単位（モチーフ）を有し、この単位が反復単位の中で共通した特定の位置で２回以上繰り返している配列をいう。
なお、反復配列の長さやロイシンの繰り返し位置は限定されない。
また、上記Ｎ末端キャップユニットとは、ＬＲＲ配列のＮ末側に隣接した配列であり、必ずしも長さや配列の特徴など無いが、通常反復ユニットの２−３倍以内程度のそれより上流の機能ドメイン等に干渉しない部分をLRR配列のシャフリングの際の不変部分として用いるものを意味し、Ｃ末端キャップユニットとは、同様にＬＲＲのＣ末側に隣接した適当な長さの配列を意味する。
さらに、本発明の新規タンパク質には、任意のターゲット分子ないしはタンパク質に強く相互作用をする新規ターゲット結合タンパク質、及び、任意のターゲット分子ないしはタンパク質を分子レベルで認識する機能を有する分子認識タンパク質が含まれる。
【００４４】
本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法によれば、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を利用した多様なタンパク質を作製することが可能となる。
このことにより、上記新規タンパク質の作製方法によれば、様々な病原菌又は突然変異で進化した新たな病原菌に対して、十分に病原菌認識するタンパク質を作製することが可能となる。
【００４５】
以下、本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法における作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ、組み込みステップ、選抜ステップ及び機能改良ステップについて更に詳細に説明する。
【００４６】
（作製ステップ）
作製ステップは、ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、前記遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製するステップである。
【００４７】
具体的には、作製ステップは、ＬＲＲ配列を有する遺伝子を、Ｎ末端側領域、Ｃ末端側領域、及び、Ｎ末端側領域とＣ末端側領域との間のＬＲＲ領域を共通の部位にロイシンを含むように複数の反復するユニット（反復配列ユニット）、に切り分けることに始まる。
ここで、上記Ｎ末端側領域とは、ＬＲＲ領域よりＮ末側にあるタンパク質の領域を意味し、Ｃ末端側領域とは、ＬＲＲ領域よりＣ末側にあるタンパク質の領域を意味する。
なお、この作製ステップにおいて、特に重要なのは、このＬＲＲを構成する各反復配列ユニットのアミノ酸配列を、一定の位置にロイシンの繰り返し単位が認められるように切り分けることである。
なお、上記のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、Ｎ末端側領域、Ｃ末端側領域のうちLRR領域に隣接した小部分である。
【００４８】
上記ＬＲＲ配列を有する遺伝子としては、由来する生物やタンパク質等、特に限定されないが、遺伝子が植物病原菌認識やそれに対する耐病抵抗性に関わる遺伝子であることが好ましい。
この場合、病原菌認識するタンパク質を確実に作製することができる。
【００４９】
上記植物病原菌に関わる遺伝子としては、特に限定されず、任意の植物種のゲノムに存在する多数のＬＲＲを含む遺伝子であればよい。
具体的には、その機能と構造が確認されたものとしてアラビドプシス（RPS2, RPM1, RPP8, RRS1, FLS2, RPW8, CLAVATA1, BRI1, SEK1）、イネ（Pi-ta, Pib, Xa21）、トマト（Cf2, Cf4, Cf5, Cf9, Prf, Ve1）レタス（Dm3）、オオムギ（MLA6, MLA13, Rpg1）、メリステム形成に関わるＣＬＡＶＡＴＡ１、ブラシノステロイド受容体のＢＲＩ１等が挙げられる。
【００５０】
また、植物の病原菌としては、サビフクロカビ(Synchytrium、ジャガイモがんしゅ病)等のツボカビ門、コウガイケカビ(Choanephora、こうがい毛かび病)等の接合菌門、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea、イネいもち病）、タフリナ(Taphrina、桜のてんぐ巣病)、ウドンコカビ(Erysiphe、うどんこ病)又はハイイロカビ(Botrytis、各種植物の灰色かび病)等の子嚢菌門、サビキン(Puccinia、各種植物のさび病等)、クロボキン(Ustilago、コムギ・オオムギの裸黒穂病等) (Tilletia、小麦・大麦のなまぐさ黒穂病) 等の担子菌門、エキビョウキン（Phytophthora、ジャガイモ疫病菌）等の卵菌綱類、あるいはシュードモナス（Pseudomonas、インゲン傘枯れ病）等のバクテリアやウイルス（ＴＭＶタバコモザイクウイルス）等の構成タンパク質、細胞外の構造タンパク質、分泌酵素タンパク質等が挙げられる。
特に植物の細胞内に注入される細菌毒素やその他の分子であることが好ましい。
なお、植物以外の病原菌としては、ヒトや動物のガン細胞や病原菌の特異的構成分子、毒素等が挙げられる。
【００５１】
ここで、Ｎ末端側領域及びＣ末端側領域と、ＬＲＲ領域とを分ける部位は、任意に定めることができる。
例えば、ＬＲＲ配列を有しない部位をＮ末端側領域及びＣ末端側領域とすればよい。
なお、遺伝子機能として重要な部位があるときは、かかる部位をＮ末端側領域又はＣ末端側領域に含めることが好ましい。
これにより、重要な遺伝子機能を保存したまま、多様なタンパク質を作製することができる。
【００５２】
ＬＲＲ領域を増幅する部位は、得られる複数の反復配列ユニットが共通の特定部位にロイシンを含むような部位であれば、特に限定されない。
こうして得られる複数の反復配列ユニットは、共通の部位にロイシンを含むものとなる。
【００５３】
ここで、上記複数の反復配列ユニットは、少なくとも２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むものであることが好ましい。
この場合、ロイシンが反復配列ユニットの共通部位に存在して疎水結合により反復単位の安定化に寄与し、かつこの疎水性部分が反復配列の相互スタッキングを促すので、分子認識部位となる窪みを持ったタンパク質を形成しやすくなる。
【００５４】
また、複数の反復配列ユニットは、５'末端側に下記式（１）又は（２）で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
Ｌ１ＸＸＬ２ＸＸＬ３ＸＬ４Ｘ （１）
式（１）中、Ｌ１はロイシンを示し、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４の中の少なくとも１つはロイシンを示し、その他のＬ２、Ｌ３又はＬ４、及びＸはアミノ酸を示す。なお、Ｃ末端側のアミノ酸数は反復配列ユニット毎に異なっている。
ＸＩＰＸＸＬ５ＸＸＬ６ＸＸＬ７ＸＸＬ８ＤＬ９ＸＸＮＸＬ１０ＴＧ （２）
式（２）中、Ｌ５〜Ｌ１０のうちの少なくとも２つはロイシンを示し、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｄ、Ｎ、Ｔ及びＧの少なくとも３つ以上は、Ｉがイソロイシン、Ｐがプロリン、Ｌがロイシン、Ｄがアスパラギン酸、Ｎがアスパラギン、Ｔがスレオニン、Ｇがグリシンを示す。なお、上記以外のＬ５〜Ｌ１０、Ｉ、Ｐ、Ｌ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｇ、及びＸはアミノ酸を示す。
この場合、病原菌認識する多様なタンパク質を確実に作製することが可能となる。
【００５５】
また、上記遺伝子がイネいもち病菌抵抗性遺伝子Ｐｉｂである場合、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であることが好ましい。
この場合、病原菌認識に対応することが可能である。
【００５６】
また、上記遺伝子がバクテリアのフラジェリンを認識する抵抗性遺伝子である場合、Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であることが好ましい。
この場合、病原菌認識に対応することが可能である。
【００５７】
（増幅ステップ）
増幅ステップは、反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とするステップである。
【００５８】
この増幅ステップにおいては、それぞれの反復配列ユニットをＰＣＲ法により増幅する際にプライマー部分にII型制限酵素部位を追加する。
これにより、II型制限酵素処理によって共通した「のりしろ」が生じるので、後述する重合ステップが容易に行われる。
【００５９】
増幅する方法は、ＰＣＲ法（ポリメラーゼチェイン反応：Polymerase Chain Reaction）である。なお、ＰＣＲ法に代わりにＬＡＭＰ法（Loop-mediated Isothermal Amplification）を用いる増幅であってもよい。
【００６０】
かかるＰＣＲ法は、まず、２本鎖のＤＮＡを鋳型とし、特定領域を挟むように短いプライマーＤＮＡを各相補鎖にハイブリッド結合させ、基質である４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、このプライマーの３'末端に、鋳型のＤＮＡ配列に従ってヌクレオチドを添加し鎖を伸長させる。そして、この反応でできた新たな２本鎖ＤＮＡを加熱して相補鎖に分離し、過剰に存在するプライマーを再び該当位置にハイブリッド結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応で新たなＤＮＡ鎖を合成させる。この反応が繰り返されることで、目的領域を含むＤＮＡ断片を大量に増やす方法である。
【００６１】
（重合ステップ）
重合ステップは、反復配列ユニットを増幅して得られる反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとするステップである。
【００６２】
このように、増幅ステップの後、反復配列ユニット遺伝子を重合し、重合ユニットとすることにより、後述するライブラリーの作製が容易となる。
したがって、これにより複数の重合ユニットをシャッフルすることが可能となる。
【００６３】
このとき、Ｎ末端キャップユニット又はＣ末端キャップユニットと重合ユニット、或いは、重合ユニット同士を読み枠通りに繋げるため、重合ユニットに制限酵素と共にライゲースを加えることが好ましい。
かかるライゲースとしては、Ｔ4 ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ等の公知のものが挙げられる。
【００６４】
Ｎ末端キャップユニット又はＣ末端キャップユニットと重合ユニット、或いは、重合ユニット同士を繋げる方法は、公知の方法を用いることができ、特に限定されない。
具体的には、ＲＡＣＨＩＴＴ法（Random Chimeragenesis on Transient Templates）、ＣＬＥＲＹ法（Combinatorial Libraries Enhanced by Recombination in Yeast）、ＳＨＩＰＲＥＣ法（Sequence Homology Independent Protein Recombination）等が挙げられる。
また、それら遺伝子の合成においてスプリット合成法、パラレル合成法、混合物合成法、ＬＰＣＳ、マルチピン法、チップ合成法等のリコンビナントケミストリー技術を組み合わせることで自動化技術に対応することができる。
【００６５】
（組み込みステップ）
組み込みステップは、反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製するステップである。
【００６６】
組み込みステップにおいては、まず、上記重合ステップで得られた複数の重合ユニットをクローニングして、ライブラリーを作製する。
そして、ライブラリーから任意に選択された重合ユニット、Ｎ末端キャップユニット、及び、Ｃ末端キャップユニットを、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットが両端に位置するようにベクターに組み込み新規タンパク質が得られる。
【００６７】
ここで、上記Ｎ末端キャップユニットとしては、特に限定されず、例えば、Ｐｉｂタンパク質ではLRRに隣接するGYFMELKNRSMILPFQQSGSSRKSIDSCKVHDLMRDIAISKSTEENLVFRVEEGCSARD
の配列等が挙げられ、上記Ｃ末端キャップユニットとしては、特に限定されず、例えば、Pibタンパク質ではLRRに隣接する
LEFLQNINEVQLSVWFPTDHDRIRAARAAGADYETAWEEEVQEARRKGGELKRKIREQLARNPNQPIIT
の配列等が挙げられる。
【００６８】
（選抜ステップ）
選抜ステップは、新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜するステップである。
選抜ステップを行うことにより、病原菌認識に一層優れたタンパク質を選抜することができる。
【００６９】
選抜する方法としては、ｍＲＮＡディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ファージディスプレイ法、酵母表面提示法、バクテリア表面提示法、酵母Ｔｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖｉｒｕｓ法、ＳＴＡＢＬＥ法（Streptavidin-biotin Linkage in Emulsions）、ＣＩＳディスプレイ法等が挙げられる。
これらの中でも、酵母Ｔｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることが好ましい。
【００７０】
（機能改良ステップ）
機能改良ステップは、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行うステップである。
ここで、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲとは、突然変異を導入する方法であり、Ｌｅｕｎｇ等により確立されている方法である（Leung, D.W., et al., (1989) J. Methods Cell Mol. Biol., 1, 11-15）。
【００７１】
本実施形態において、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法は、０．１〜０．４ｍＭマンガンイオンを添加して行うことが好ましい。
この場合、約１％程度の塩基置換を加えることができる。なお、マンガンイオンの濃度が０．４ｍＭを超えるとスメアになるおそれがある。
【００７２】
機能改良ステップを行うことにより、上述した実施形態に係る新規タンパク質の作製方法で得られた新規タンパク質を、突然変異を導入しながら増幅させることにより、更に多様な新規タンパク質を作製することが可能となる。
よって、この場合、病原菌認識により一層優れたタンパク質に改良することができる。
また、上記病原菌が突然変異等で進化し新たな病原菌となった場合であっても、ＬＲＲ配列を有する複数種類の新規タンパク質を選抜することにより、自然界において偶然生じた非病原力遺伝子産物と植物抵抗性遺伝子との組み合わせと比較して、進化した病原菌の病原菌認識により十分に優れるものとなる。
【００７３】
こうして得られる新規タンパク質は、上述した方法で得られるので、自然界における多様な病原菌に対応する能力を十分に有する。
すなわち、上記新規タンパク質は、病原菌が突然変異等で進化し新たな病原菌となった場合であっても、自然界において偶然生じた非病原力遺伝子産物と植物抵抗性遺伝子との組み合わせと比較して、進化した病原菌の病原菌認識に十分に対応することが可能である。
【００７４】
なお、新たに発見された病原菌であっても１−２ヶ月でそれらに対する新規タンパク質（新規ターゲット結合タンパク質又はその遺伝子）を作製することが可能である。
【００７５】
また、上記新規タンパク質は、バイオセンサー等のレセプターとしてなど多方面における足場タンパク質としての利用が期待される。
さらに、上記新規タンパク質は、がん治療におけるピンポイントターゲット投薬等の多様な用途に用いることができる。
なお、かかるピンポイントターゲット投薬には従来、動物免疫を司るイムノグロブリンが主に用いられているが、システイン残基による立体構造を維持する必要があり、細胞内環境によっては十分な効果を発揮できない場合がある。
【００７６】
これに対し、上記新規タンパク質は、システイン残基の影響が少ないので、イムノグロブリンの代替足場タンパク質としても用いることが可能である。
なお、本発明の遺伝子は、上述した新規タンパク質をコードするものであるため、上述したのと同様な効果が得られる。
【００７７】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００７８】
例えば、本実施形態に係る新規タンパク質の作製方法によれば、本発明において例示した配列番号１〜２７のアミノ酸配列だけでなく、自然界に数多く存在しているＬＲＲ配列を利用した多様なタンパク質を作製することが可能である。
【００７９】
また、上述した実施形態においては、作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ、組み込みステップ、選抜ステップ及び機能改良ステップを行っているが、選抜ステップ及び機能改良ステップは必ずしも必須のステップではない。
すなわち、本発明のタンパク質の作製方法は、少なくとも作製ステップ、増幅ステップ、重合ステップ及び組み込みステップを備えていればよい。
【００８０】
また、上述した反復配列ユニットは、既存の遺伝子に由来するものに限らず、これらを参考にコンセンサス構造を適度に保ちつつ任意に設計したものであってもよい。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８２】
（実施例１）
（作製ステップ）
（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子
植物病原菌認識に関わるＬＲＲ配列を有する遺伝子として、Ｗａｎｇ等（１９９９ Plant Journal, 19, 55-64）らによって単離されたイネいもち病菌非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｂ保有菌株に対する抵抗性遺伝子Ｐｉｂ（イネ品種シモキタ由来）を用いた。
【００８３】
（２）ＬＲＲ領域の推測
Ｐｉｂはロイシンに富んだ領域が認められるが、アミノ酸残基の基本骨格があまり保存されていない。そこで、ＬＲＲ配列の基本骨格である上記式（１）に示すＬ１ＸＸＬ２ＸＸＬ３ＸＬ４Ｘを参考にしてＬＲＲ配列の再構築を試みた。
そして、ＬＲＲ領域の保存されたロイシン残基の境界を設定した。図１に植物抵抗性遺伝子Ｐｉｂの遺伝子構造を切断して得られるＮ末端キャップユニット、Ｃ末端キャップユニット及び反復配列ユニットのアミノ酸配列を示す。
なお、反復配列ユニット６にシステインに富んだアイランド領域を設定することにより、基本骨格の保たれたＬＲＲ配列を設計することができた。
【００８４】
（増幅ステップ）
（３）プライマー合成
次に、抵抗性遺伝子Ｐｉｂを、図１に示すように、Ｎ末端キャップユニット（配列番号１）、Ｃ末端キャップユニット（配列番号１６）、及び反復配列ユニット１〜１４（配列番号２〜１５）に、各反復配列ユニットが共通の部位にロイシンを含むようにして、プライマーを合成した。
すなわち、それぞれの反復配列ユニット１〜１４を増幅できるように両端にプライマーを設計し、ロイシンをコードする塩基コドンがのりしろとなるようにした。
【００８５】
のりしろ部分は５'末端側をＢａｍＨIにて、３'末端側をＢｇｌIIにて消化された突出末端となるようにした。
また、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、遺伝子機能として重要である可能性が考えられたため、固定した。
さらに、ライブラリーをベクターにクローニングしやすいように、Ｎ末端キャップユニットには５'末端側にＢａｍＨI部位ではなくＥａｇＩ部位を、Ｃ末端キャップユニットには３'末端側にＢｇｌII部位ではなくＸｈｏＩ部位をそれぞれ付加させた。
【００８６】
（４）ＰＣＲ増幅
Ｐｉｂをクローニングしたプラスミドを鋳型とし、それぞれの反復配列ユニットを増幅するプライマーセットを用いて個々の反復配列ユニット１〜１４をＰＣＲ増幅させた。
それぞれの反復配列ユニット１〜１４はエタノール沈殿処理で精製し、制限酵素ＢａｍＨI、ＢｇｌII同時処理にてのりしろを作製した。
さらに、酵素処理したサンプルを電気泳動しゲル回収を行うことにより、両端から切り出された核酸小断片を除去した
【００８７】
（重合ステップ及び組み込みステップ）
（５）新規タンパク質の作製
このようにして得られたそれぞれの反復配列ユニット１〜１４をライブラリーの出発材料として用いた。
そして、個々の反復配列ユニット１〜１４を混合し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ、制限酵素バッファー、ＢａｍＨI、ＢｇｌIIを添加して２５℃にて６時間インキュベーションした。反応後、７０℃１０分間反応させ酵素活性を失活させ、電気泳動後にゲル回収を行い重合の進んだ遺伝子断片を選抜した。
【００８８】
図２は、反復配列ユニットを重合させた遺伝子断片を示す図である。なお、図２中、Ｍはマーカーを意味し、１は未精製反応物を意味し、２はゲル回収を行い、選抜された重合の進んだ遺伝子断片を意味する。
図３は、図１に示す複数の重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製する組み込みステップを示す図である。
なお、図３中、Ｎ末端キャップユニットは「５'Ｕ」と、Ｃ末端キャップユニットは「３'Ｕ」と、重合ユニット１〜１４は単に「１」〜「１４」と示す。
図３に示すように、目的とする複数個以上の重合ユニットが組み込まれた新規タンパク質Ａ〜Ｆ（配列番号１９〜２４）を得た。
【００８９】
（実施例２）
（作製ステップ）
（１）ＬＲＲ配列を有する遺伝子
動物の病原菌認識に関わるＬＲＲ配列を有する遺伝子として、既報の原著論文Gomez-Gomez L. and Boller T. (2000) Molecular Cell, 5, 1003-1011を参照して、アラビドプシスのエコタイプＷｓ３のゲノミックＤＮＡからＰＣＲ法により単離したバクテリアのフラジェリンを認識する抵抗性遺伝子ＦＬＳ２を用いた。
【００９０】
（２）ＬＲＲ領域の推測
ＦＬＳ２はロイシン及びその他のアミノ酸残基の骨格がきれいに保存された２４アミノ酸で構成された典型的なロイシンリッチリピート構造を取っている。
そして、ＬＲＲ領域の保存されたロイシン残基の境界を設定した。
【００９１】
（増幅ステップ）
（３）プライマー合成
次に、抵抗性遺伝子ＦＬＳ２を、Ｎ末端キャップユニット（配列番号１７）、Ｃ末端キャップユニット（配列番号１８）、及び反復配列ユニットに、各反復配列ユニットが共通の部位にロイシンを含むようにして、プライマーを合成した。
すなわち、それぞれの反復配列ユニットを増幅できるように両端にプライマーを設計し、イソロイシンをコードする塩基コドンがのりしろとなるようにした。
【００９２】
のりしろ部分は５'末端側をＢａｍＨIにて、３'末端側をＢｇｌIIにて消化された突出末端となるようにした。
また、Ｎ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットは、遺伝子機能として重要である可能性が考えられたため、固定した。
さらに、ライブラリーをベクターにクローニングしやすいように、Ｎ末端キャップユニットにおいては５'末端側にはＢａｍＨI部位ではなくＥａｇＩ部位を、Ｃ末端キャップユニットにおいては３'末端側にはＢｇｌII部位ではなくＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ付加させた。
【００９３】
（４）ＰＣＲ増幅
ＦＬＳ２をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、それぞれの反復配列ユニットを増幅するプライマーセットを用いて個々の反復配列ユニットをＰＣＲ増幅させた。
それぞれの反復配列ユニットはエタノール沈殿処理で精製し、制限酵素ＢａｍＨI、ＢｇｌII同時処理にてのりしろを作製した。
さらに、酵素処理したサンプルを電気泳動しゲル回収を行うことにより、両端から切り出された核酸小断片を除去した。
【００９４】
（重合ステップ及び組み込みステップ）
（５）新規タンパク質の作製
このようにして得られたそれぞれの反復配列ユニットをライブラリーの出発材料として用いた。
実施例１と同様にして、複数の重合ユニットとし、該重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製した。
【００９５】
（実施例３）
（選抜ステップ）
次に、実施例１で得られたそれぞれの新規タンパク質Ａ〜Ｆとバクテリアとの相互作用をＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ法にて評価した（図４参照）。
図４に示すＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ法は、タンパク質間相互作用を調べる手法である。
本実施例においては、生物種として大腸菌を用い、ベイトとしてＲｉｃｅ Ｄｗａｒｆ Ｖｉｒｕｓの第８分節、又はいもち病菌の感染時に発現が増強されることが確認されているハイドロフォービンＭＰＧ１（Magnaporthe oryzae）を用い、これらをターゲットタンパクとした。また、プレイとして新規タンパク質Ａ〜Ｆなどに示したようなシャッフリングライブラリー遺伝子配列を用いた。
【００９６】
イネいもち病菌のゲノミックＤＮＡよりＭＰＧ１全長をＰＣＲ増幅させ、ＭＰＧ１をベクターｐＢＴのアンカータンパク質（ｃＩ）とインフレームになるようにクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌レポーター系統へ導入してＭＰＧ１を発現する大腸菌系統を作製した。
そして、ＭＰＧ１を発現する大腸菌系統を材料としてエレクトロポレーション用のコンピテントセルを作製した。Ｒｉｃｅ Ｄｗａｒｆ Ｖｉｒｕｓの第８分節においても同様な操作を行った。
次いで、ｐＴＲＧへクローニングされたライブラリーをコンピテントセルへ導入し３-ＡＴ含有選択培地から生育する陽性クローンを観察した。
【００９７】
図５はバクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法のコントロール実験の図であり、（ａ）は完全培地、（ｂ）は３−ＡＴ試薬添加最小培地における生育状況の図である。
なお、図５の（ａ）及び（ｂ）中、ＹＴＨはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社酵母Ｔｗｏ-ｈｙｂｒｉｄシステム添付のポジティブコントロールで用いられている遺伝子配列を導入したクローンを意味し、ＢＴＨは既知のタンパク質（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社バクテリアＴｗｏ-Ｈｙｂｒｉｄシステム添付のコントロール実験で用いられている遺伝子配列を導入したクローンを意味し、ＬＢＡは完全培地を意味し、Ｍ９ ３−ＡＴは3-AT試薬添加最小培地を意味し、Ｗｔは野生型遺伝子（相互作用を示す）の組み合わせを意味し、Ｍｕｔは変異型遺伝子（相互作用を示さない）の組み合わせを意味し、Ｐｏｓｉは相互作用を示すGal4遺伝子の組み合わせを意味し、Ｎｅｇaはベクター単独処理を意味する。
図５に示すように、バクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法において、酵母Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法で用いられているポジティブクローンも機能することがわかった。
また、図６は、図５において示した各クローンの生育速度を示した図である。
【００９８】
図７は、選抜ステップにより選抜されたＭＰＧ1と相互作用するＰｉｂライブラリーより得られた陽性クローンの一つを示した図である。
この他にＦＬＳ２ライブラリーからも２クローンが好適に病原菌を認識した。
図７に示すように、選択培地上における陽性クローンの生育速度は既知のＢＴＨ用ポジティブコントロールにおける生育速度と比較すると遅いものであった。
選択培地における生育速度はＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムの結合強度を反映していると考えられている。
このことにより、本発明の新規ターゲット結合タンパク質とターゲットタンパク質（ＭＰＧ１）との相互作用力は弱いものと考えられる。
【００９９】
また、図７の結果より、最も病原菌認識に優れた新規タンパク質は、新規タンパク質Ｆの一部が変換されたもの（配列番号２５）であった。
図８に新規タンパク質Ｆの遺伝子断片を示す。
【０１００】
（実施例４）
（機能改良ステップ）
次に、ＭＰＧ１と相互作用した陽性クローンプラスミドを回収し、Ｎ末端キャップユニットのフォワードプライマーとＣ末端キャップユニットのリバースプライマーとを用いてＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法によって塩基置換を加えた。
Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法は、Ｔａｋａｒａ ｒＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、０．２５ ｍＭマンガンイオンを添加することで、約１％程度の塩基置換を加えることができた（図９参照）。
【０１０１】
変異を加えたアミノ酸配列は、再びｐＴＲＧベクターへクローニングし、評価方法１と同様にして、選択培地からより生育の早いコロニーを観察した。
得られた結果を図１０及び図１１に示す。
図１０及び図１１中、Ｐ−６はＰｉｂライブラリー由来陽性クローンプラスミドを意味し、Ｐ−６−１はＰ−６プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｐ−６−２はＰ−６プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｅ１はＰ−６−１及びＰ−６−２プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味し、Ｅ２はＰ−６−１及びＰ−６−２プラスミドのＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ派生遺伝子の一つを意味する。
【０１０２】
図１０及び図１１に示すように、より生育の早い、ポジティブコントロールに匹敵する生育速度を示すクローンが得られた。
このことはより結合力の高い新規タンパク質が選定されたことを示している。
【０１０３】
以上より、ＬＲＲの反復単位の両端には制限酵素処理により共通した付着末端を持たせ、各反復単位が重合しやすいように設計し、制限酵素存在下でのライゲーション反応とゲル分画を行うことにより、読み枠の方向性を保った任意長のリピートシャッフリングライブラリーが得られた。
【０１０４】
得られたライブラリーの中から、これまでに病原体エリシターとしては報告されていないがイネいもち病菌 (Magnaporthe oryzae)では病原力発揮に関わるとされる菌糸表層の疎水性タンパク質、ハイドロフォービン：MPG1をターゲットとする新規ＬＲＲの選抜を試み、タンパク質の相互作用はバクテリアTwo-Hybridシステムを用いＭＰＧ１をベイトとしてＬＲＲライブラリーからターゲット選抜を行い、ポジティブクローンが上記２種ライブラリーのそれぞれから得られた。
【０１０５】
図１２は、選抜された陽性クローンと、これまでに報告されている植物由来ＬＲＲ配列を有するタンパク質と病原体由来タンパク質が相互作用を示した遺伝子を単離し、バクテリアＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法にて結合様式をバクテリアの増殖速度で評価した結果を示す図である。
図１２中、Ｐｏｓｉｔｉｖｅはキットの陽性対照を、ＮｅｇａはＭＰＧ１タンパク質をベイトにしてＰｉｂタンパク質ＬＲＲ領域と相互作用を解析したもの、Ｐ−６は選抜ステップによって選抜された陽性クローン、ＦＬＳ−ＬＲＲはＦＬＳ２タンパク質のＬＲＲ領域のみと、あるいはＦＬＳ−ＡＬＬはＦＬＳ２タンパク質の全長を含んだものとタバコ野火病菌（シュードモナス）のフラジェリンタンパク質ｆｌｇ２２と相互作用を解析したもの、ＰＧＩＰ−ＡおよびＰＧＩＰ−Ｂはウズラマメ由来ポリガラクツロナーゼインヒビタータンパク質とアスペルギルス菌由来ポリガラクツロナーゼタンパク質との相互作用を解析したもの、Ｐｉｔａはイネいもち病抵抗性遺伝子Ｐｉｔａタンパク質といもち病菌非病原力遺伝子ａｖｒＰｉｔａタンパク質との相互作用を解析したものである。３−ＡＴ（−）は選択試薬３−ＡＴを含まない最小培地で培養した結果で、３−ＡＴ（＋）は選択試薬３−ＡＴを含む最小培地で培養した結果を示した。
図１２に示すように、キットの陽性対照の組み合わせ（bait: Gal4-LGF2/target: Gal11P）よりも生育速度は遅かったが、これまでに抵抗性遺伝子ＬＲＲと直接結合するとされる病原体の非病原性遺伝子産物と対応するＬＲＲ、あるいはポリガラクツロナーゼインヒビターと直接結合するとされる病原体のポリガラクツロナーゼと対応するＬＲＲとの組み合わせと比較するとほぼ同等かそれ以上の生育速度を示すことがわかった。
【０１０６】
また、得られたＬＲＲについては更にＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの繰り返しによる機能改良を行い、最終的には陽性対照とほぼ同等の生育速度を示す遺伝子配列の選抜に成功した。配列表の配列番号２６にＰｉｂ由来ライブラリーより選抜された陽性クローンアミノ酸配列を、配列表の配列番号２７にＦＬＳ２由来ライブラリーより選抜された陽性クローンのアミノ酸配列を示した。
ＬＲＲ配列の特徴としては異なるＬＲＲ配列材料（ロイシン骨格の保存性の高いＦＬＳ２、ロイシン骨格の保存性の低いＰｉｂ）から、ライブラリーを作製し、どちらのタイプのＬＲＲ配列からも新たなターゲットタンパク質と結合する新規タンパク質が取得できることがわかった。
【０１０７】
このことにより、イネのいもち病抵抗性遺伝子Ｐｉｂとアラビドプシスのバクテリアフラジェリン認識遺伝子ＦＬＳ２とに由来する二つの異なるＬＲＲを出発材料として、これらのリピート遺伝子を反復単位に分解し、それらをランダムに再重合化させたリピートシャッフリングライブラリーから目的分子を認識するLRRを得る方法が確立された。
【０１０８】
よって、本発明の新規タンパク質の作製方法によれば、自然界に数多く存在しているロイシンリッチリピート配列を利用して多様なタンパク質を作製することが可能である新規タンパク質の作製方法、並びに自然界における多様な病原菌に対応する能力を有する新規タンパク質及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、植物抵抗性遺伝子Ｐｉｂの遺伝子構造を切断して得られるＮ末端キャップユニット、Ｃ末端キャップユニット及び反復配列ユニットのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、反復配列ユニットを重合させた遺伝子断片を示す図である。
【図３】図３は、図１に示す複数の重合ユニットをシャッフルし、両端にＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットを組み込むことにより新規タンパク質を作製する組み込みステップを示す図である。
【図４】図４は、バクテリアＴｗｏ-ｈｙｂｒｉｄシステムを示す図である。
【図５】図５は、バクテリアにおけるＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法のコントロール実験の図であり、（ａ）は完全培地、（ｂ）は３−ＡＴ試薬添加最小培地における生育状況の図である。
【図６】図６は、図５において示した各クローンの生育速度を示した図である。
【図７】図７は、選抜ステップにより選抜されたＭＰＧ1と相互作用するＰｉｂライブラリーより得られた陽性クローンの一つを示した図である。
【図８】図８は、新規タンパク質Ｆの遺伝子断片を示す図である。
【図９】図９は、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにおいて、マンガンイオンの濃度設定をした結果を示す図である。
【図１０】図１０は、陽性クローンをＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにより改良したクローンの生育を示す図である。
【図１１】図１１は、陽性クローンをＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにより改良したクローンの生育速度を示す図である。
【図１２】図１２は、選抜された陽性クローンと、これまでに報告されている植物由来ＬＲＲ配列を有するタンパク質と病原体由来タンパク質が相互作用を示した遺伝子を単離し、バクテリアＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法にて結合様式をバクテリアの増殖速度で評価した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、前記遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、
前記反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、
前記反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、
前記重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、
を備えることを特徴とする新規タンパク質の作製方法。
【請求項２】
前記重合ステップにおいて、前記反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものであることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項３】
前記組み込みステップにおいて、前記Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものであることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項５】
前記作製ステップにおいて、前記複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製されることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の作製方法。
【請求項６】
前記新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備えることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項７】
前記選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備えることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項８】
前記選抜ステップにおいて、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることを特徴とする請求項６記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の作製方法により得られる新規タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、前記Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、前記複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８記載の新規タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、前記Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８記載の新規タンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸配列が配列表の配列番号１９〜２７のうちのいずれか一つであることを特徴とする新規タンパク質。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の新規タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１】
ＬＲＲ配列を有する遺伝子のＬＲＲ領域を、前記遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列情報に基づいて、共通の部位にロイシンを含むように複数の反復配列ユニットを作製する作製ステップと、
前記反復配列ユニットそれぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅により反復配列ユニット遺伝子とする増幅ステップと、
前記反復配列ユニット遺伝子をランダムに重合させ重合ユニットとする重合ステップと、
前記重合ユニット、所定のＮ末端キャップユニット及びＣ末端キャップユニットをベクターに組み込んでライブラリーを作製する組み込みステップと、
を備えることを特徴とする新規タンパク質の作製方法。
【請求項２】
前記重合ステップにおいて、前記反復配列ユニット遺伝子がライゲーションされたものであることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項３】
前記組み込みステップにおいて、前記Ｎ末側キャップユニット及びＣ末側キャップユニットが、それぞれにプライマーを設計して、ＰＣＲ増幅させたものであることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、植物病原菌認識又は耐病抵抗性に関わる遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項５】
前記作製ステップにおいて、前記複数の反復配列ユニットが２箇所以上の共通の部位にロイシンを含むように作製されることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の作製方法。
【請求項６】
前記新規タンパク質の中から病原菌認識の対象となる分子又はタンパク質と相互作用する新規タンパク質を選抜する選抜ステップを更に備えることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項７】
前記選抜ステップ後、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる機能改良ステップを更に備えることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項８】
前記選抜ステップにおいて、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏｈｙｂｒｉｄ法、ファージディスプレイ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法を用いることを特徴とする請求項６記載の新規タンパク質の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の作製方法により得られる新規タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、前記Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１６のアミノ酸配列であり、前記複数の反復配列ユニットが配列表の配列番号２〜１５のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８記載の新規タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｎ末端キャップユニットが配列表の配列番号１７のアミノ酸配列であり、前記Ｃ末端キャップユニットが配列表の配列番号１８のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項８記載の新規タンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸配列が配列表の配列番号１９〜２７のうちのいずれか一つであることを特徴とする新規タンパク質。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の新規タンパク質をコードする遺伝子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−１２５４０１（Ｐ２００８−１２５４０１Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１２２９２（Ｐ２００６−３１２２９２）
【出願日】平成１８年１１月１７日（２００６．１１．１７）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１７日（２００６．１１．１７）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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