ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
本発明は、大部分が生物学的に活性なウイルスの高純度で安定なウイルス調製物をもたらしうる、ワクシニアウイルス（VV）及び/又はワクシニアウイルス（VV）粒子の精製方法に関する。本発明は、工業生産にとって有利な側面である純度、生物学的活性及び安定性に関して、高い効率及び望ましい収率で、ウイルス調製物を無菌的に精製することを包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はネイティブ及び組換えワクシニアウイルス及び/又はワクシニアウイルス粒子の精製方法を提供する。本発明によれば、この方法の使用は、純度、生物学的活性、及び安定性に関して、高い効率及び望ましい収率でのワクチンの精製を容易にし、さらにまた、実験室規模、パイロット規模、及び工業規模での無菌生産プロセスにも応用することができる。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に医学において、ベクターとは、疾患そのものを引き起こすわけではないが、ある宿主から別の宿主へと病原体（疾患を引き起こす因子）を「運ぶ」ことによって感染を拡げる生命体である。ワクチンベクターは、挿入された抗原（身体によって異物と認識されるタンパク質をコードするもの）を疾患原因因子からワクチン接種対象へと運ぶ、弱体化された又は殺されたウイルス又は細菌である。ワクチンベクターは抗原を自然な形で身体中に送達し、「安全な感染」に対して作用するように免疫系を刺激する。免疫系は、その抗原に対する免疫応答（ワクチン接種された対象を将来の「危険な感染」から防御するもの）を生じるように導かれる。
【０００３】
ワクチン開発では、遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクル又はワクチンベクターとして、組換え修飾ウイルスを使用することができる。ひとたび細胞内に入ると、遺伝情報は転写され、タンパク質（特異的疾患を標的とする挿入された抗原を含む）に翻訳される。ベクターによって細胞中に送達された抗原がタンパク質を産生し、それが、その抗原に対する身体の免疫応答を誘発することによって、その疾患から防御するのであれば、処置は成功である。
【０００４】
ウイルスベクターは弱毒化ウイルスに基づくことができ、この弱毒化ウイルスは、宿主中で複製することはできないが、感染細胞に外来遺伝子を導入してそれを感染細胞中で発現させることはできる。それにより、ウイルス又は組換えウイルスは、タンパク質を作り、それを宿主の免疫系にディスプレイすることができる。ウイルスベクターの重要な特徴の一つに、それらが強い体液性（B細胞）及び細胞性（T細胞）免疫応答を引き出すことができる点がある。
【０００５】
ウイルスベクターは、感染性疾患及びがんを予防及び処置するためのワクチンの開発に、研究者によってよく使用され、そのなかでは、ポックスウイルス（カナリア痘、ワクシニア、及び鶏痘を含む）が最も一般的なベクターワクチン候補である。
【０００６】
ポックスウイルスは、ウイルスゲノムのサイズが比較的大きい（約150/200kb）ことと、感染細胞の核ではなく細胞質内で複製する能力を持ち、それゆえに宿主細胞のゲノム中に遺伝物質を組み込むリスクが最小限に抑えられることから、新しい宿主への遺伝物質の伝達にとって、好ましい選択肢である。ポックスウイルスの中ではワクシニア種と天然痘種の二つが最もよく知られている。ポックスウイルスのウイルス粒子は、他の大半の動物ウイルスと比較して大きい（さらなる詳細については、Fieldsら編「Virology」第3版、第2巻、第83章、2637頁以降を参照されたい）。
【０００７】
天然痘ウイルスは痘瘡の原因である。天然痘ウイルスとは対照的に、ワクシニアウイルスは、通常、免疫適格個体では全身性疾患を引き起こさず、したがって痘瘡に対する免疫を与えるための生ワクチンとして使用されてきた。ワクシニアウイルスによる世界的なワクチン接種の成功は最終的に自然疾患としての痘瘡を1980年代に根絶させることになった（非特許文献1）。それ以来、ポックスウイルス感染のリスクが高い人々（例えば研究室職員）を除いて、ワクチン接種は長年にわたって中断されてきた。しかし、例えば天然痘を引き起こす痘瘡ウイルスが生物テロ兵器として使用されるかもしれないという不安が増大しつつある。さらにまた、牛痘、ラクダ痘、及びサル痘などといった他のポックスウイルスが、淘汰機構によって潜在的に突然変異を起こし、天然痘と類似する表現型を獲得するリスクもある。したがっていくつかの政府は、推定の又は現実の痘瘡攻撃のばく露前（天然痘ウイルスとの遭遇前）又はばく露後（天然痘ウイルスとの遭遇後）に使用されるワクシニア系ワクチンの備蓄を増強しているところである。
【０００８】
ワクシニアウイルスは免疫刺激性が高く、それ自身の遺伝子産物に対しても、ワクシニアゲノム中に挿入された遺伝子から生じるどの外来遺伝子産物に対しても、強いB細胞（体液性）免疫及びT細胞性免疫を惹起する。したがってワクシニアウイルスは、痘瘡並びに他の感染性疾患及びがんに対する、組換えワクチンの形態をしたワクチンにとって、理想的なベクターであると考えられる。文献に記載されている組換えワクシニアウイルスの大半は、完全な複製能を持つワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ（Western Reserve）株に基づく。この株は高い神経毒性を持つことがわかっており、それゆえに、ヒト及び動物での使用にはあまり適していない（非特許文献2）。
【０００９】
対照的に、修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（Modified Vaccinia virus Ankara: MVA）は例外的に安全であることがわかっている。MVAは、ワクシニアウイルスの漿尿膜ワクシニア・アンカラ（CVA）株をニワトリ胚線維芽細胞（CEF）で長期間にわたって連続継代することによって作製された（概観するには非特許文献3；特許文献1を参照されたい）。ブダペスト条約の要件に従って寄託されたMVAウイルス株の例は、European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）（英国ソールズベリー）にそれぞれ受託番号ECACC V94012707、ECACC V00120707及びECACC V00083008として寄託されたMVA572株、MVA575株、及びMVA-BN株であり、これらは特許文献2及び特許文献3に記載されている。
【００１０】
MVAは、その前駆体CVAと比較して、その著しい弱毒プロファイルによって識別される。これは、良好な免疫原性を維持しつつ、減少したビルレンス又は感染性を持つ。MVAウイルスは、解析が行われて、野生型CVA株との比較でゲノム中の変化が決定されている。全部で31,000塩基対に達する六つの主要なゲノムDNAの欠失（欠失I、II、III、IV、V、及びVI）が同定されている（非特許文献4）。その結果生じたMVAウイルスは、宿主細胞が鳥類細胞に厳しく制限されることになった。MVA株の優れた性質は広範囲にわたる臨床試験で証明されており（非特許文献5；非特許文献6）、この臨床試験では、二段階プログラムで、MVA571をプライミングワクチンとして低用量で使用してから、従来の痘瘡ワクチンが投与され、ドイツにおける120,000人を越える一次ワクチン接種者に、有意な有害事象（SAE）は一切見られなかった（非特許文献6；非特許文献5）。
【００１１】
MVA-BN（登録商標）は、スタンドアロン（stand-alone）第3世代痘瘡ワクチンの生産に使用されるワクチンである。MVA-BN（登録商標）は、MVA571/572株から、さらなる継代によって開発された。現在までに、アトピー性皮膚炎（AD）を持つ被験者及びHIV感染を持つ被験者を含めて、1500人を越える被験者が、MVA-BN（登録商標）系のワクチンを使った臨床試験でワクチン接種を受けている。
【００１２】
ワクシニア系ワクチンによる痘瘡ワクチンキャンペーンへの新たな関心が、大規模痘瘡ワクチン生産に対する世界的需要の増大を引き起こしている。さらにまた、組換えワクチンを調製するためのツールとしてワクシニアウイルスが使用されることにより、ネイティブワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスの生産（増殖及び精製）方法にも、大きな工業的関心が寄せられるようになっている。
【００１３】
ワクチンの生産に使用されるウイルス又は診断目的で使用されるウイルスは、ウイルスのタイプに応じて、いくつかの方法で精製することができる。伝統的に、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスを含むポックスウイルスの精製は、分子のサイズ差を利用して分子を分離する方法に基づいて行われてきた。宿主細胞夾雑物（例えばDNA及びタンパク質）、特にDNAの除去を強化するために、サイズ分離を利用した一次精製が、DNAの酵素消化（例えばベンゾナーゼ処理）などの二次的方法によって補足されてきた。最も一般的には、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスの一次精製が、さまざまなショ糖濃度でのショ糖クッション又はショ糖勾配遠心分離によって行われてきた。最近では、超遠心分離も単独で、又はショ糖クッション若しくはショ糖勾配精製と組合わせて応用されるようになっている。
【００１４】
ワクシニアウイルス系ワクチンは、一般に、初代CEF（ニワトリ胚線維芽細胞）培養中で生産されてきた。初代CEF培養中で生産されたワクチンは、一般に、残留夾雑物に関して安全であるとみなされる。第1に、健康なニワトリ胚に由来する初代細胞培養が何らかの有害夾雑物（タンパク質、DNA）を含有するとは、科学的に考えがたい。第2に、何百万人という人々が、CEF培養で生産されたワクチンによるワクチン接種を受けているが、夾雑物（CEFタンパク質及びCEF DNA）がもたらす有害作用は何も認められていない。したがって、初代CEF培養中で生産されたワクチン中の宿主細胞夾雑物のレベルに関する規制要件はないが、各ワクチンごとに生産者はその安全性を証拠文書で立証しなければならない。初代CEF培養中で生産されたワクチンに関する規制上の懸念は、外因性因子（生物学的製剤の製造に意図せず導入される微生物（細菌、真菌、マイコプラズマ/スピロプラズマ、マイコバクテリア、リケッチア、ウイルス、原虫、寄生虫、TSE因子を含む））のリスクに関する。
【００１５】
初代CEF培養中で生産されたワクシニアウイルスを精製するための現行の方法では、TCID50で測定して、1×108の用量で、CEFタンパク質のレベルが最高1mg/用量になる場合があり、CEF DNAレベルは10μg/用量を越える場合がある。これらのレベルは、最終製剤（Final Drug Product：FDP）中に見出されるレベルが意図するヒト適応症において安全であることを、個々のワクチン生産者が証明する限り、安全上及び規制上の観点からは許容することができるとみなされる。初代細胞培養中で生産されたワクチン中に外因性因子が存在するリスクがあること、及びそれに伴って、生産されたワクチンバッチごとに広範な、費用のかかるバイオセーフティ試験が必要になることから、ワクチン産業には連続継代性細胞株に変えようという強い刺激がある。ひとたび連続継代性細胞株が特徴づけられると、製造バッチの外因性因子に関する試験の必要はごくわずかになる。
【００１６】
しかし、ワクシニア及びワクシニア組換えワクチンの製造に関して、初代細胞培養から連続継代性細胞培養への切り替えは、より厳密な安全上及び規制上の要件を課すことになると予想される。実際、規制当局は、連続継代性細胞株を使って生産されるワクチン中のDNA夾雑物のレベルに関して新しい要件を提案しており（FDAガイドライン案を参照されたい）、それは10ng宿主細胞DNA/用量という低いものになりうる。そのような低レベルの宿主細胞夾雑物を達成するには、新しい改良された精製方法が必要になる。
【００１７】
ワクシニアウイルス粒子は表面タンパク質A27Lを介してヘパリンに結合することができるようである（非特許文献7）。さらに、一定のウイルス調製物については精製の基礎としてアフィニティクロマトグラフィ（非特許文献8）を使用しうることが、示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】スイス国特許第568,392号
【特許文献２】米国特許第7,094,412号
【特許文献３】米国特許第7,189,536号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication」History of Public Health、No.4、ジュネーブ：世界保健機関、1980
【非特許文献２】Moritaら 1987, Vaccine 5, 65-70
【非特許文献３】Mayr, A.ら 1975, Infection 3, 6-14
【非特許文献４】Meyer, H.ら 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038
【非特許文献５】Mayr, A.ら 1978, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390
【非特許文献６】Stickl, H.ら 1974, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392
【非特許文献７】Chungら 1998, J. Virol. 72, 1577-1585
【非特許文献８】Zahn, A及びAllain, J.-P. 2005, J. Gen. Virol. 86, 677-685
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの効率のよい精製には、いくつかの大きな難題を克服する必要がある。
【００２１】
1．ワクシニアウイルス粒子は、市販のヘパリンカラム、例えば他の研究者ら（Zahn, A及びAllain, J.-P. 2005, J. Gen. Virol. 86, 677-685）がC型及びB型肝炎ウイルスの実験室規模精製に使用したAmersham BiosciencesのHi-Trapヘパリンカラムに効果的に負荷するには、あまりにも大きすぎる。ワクシニアウイルス粒子の体積は肝炎ウイルス粒子より約125倍大きい（すなわち、C型及びB型肝炎ウイルス粒子の直径が約50nmであるのに対して、ワクシニアウイルスの直径は約250nmである）。したがって、例えばカラムベースのアプローチに使用されるような、入手可能なマトリックスでは、工業規模精製の要求を満たすほどには、マトリックス中へのウイルス粒子の十分な進入、十分な量のウイルス粒子の負荷、又は十分に高速なカラムを通過する流れが可能にならないだろう。ZahnとAllainは1.0mlまでの体積に1×106までのウイルス負荷量で作業した。初期臨床試験用に十分な材料を獲得するためのパイロット規模精製の場合、5Lより大きい、好ましくは50Lまでの体積に、1×1011より高い、好ましくは1×1013までのウイルス負荷容量が必要である。ワクシニアウイルスの工業的精製には、300Lより大きい、好ましくは600Lより大きい体積に、1×1013より高い、好ましくは1×1014より高い負荷容量が必要である。
【００２２】
2．ワクシニアウイルスの大きなサイズは、ウイルス粒子の特異的表面タンパク質とマトリックスに固定化されたリガンドとの間の効果的な立体アクセスを妨げうる。したがって、小さなウイルス粒子の精製に関して現在記載されている実験室規模の使用方法を、ワクシニアウイルスの精製に工業的に応用することはできないだろう。
【００２３】
3．ワクシニアウイルス粒子の結合に使用されるリガンドと相互作用する機能的表面分子の数が多いため、結合したワクシニアウイルスの溶出には、生物学的に有効な形態のワクシニアウイルス粒子を高い収率で溶出させ回収するために、より苛酷な、そしてそれゆえに潜在的に変性的な、条件が要求されるだろう。それゆえに、マトリックス、リガンド設計、リガンド固定化の方法、及びリガンド密度には、ワクシニアウイルスの効果的な結合が媒介され、且つ生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の効果的な溶出が可能になるように、注意深い設計が要求されるだろう。
【００２４】
4．高い生物学的活性を持つワクシニアウイルス粒子の生体分子特異的精製を達成するには、ワクシニアのターゲット細胞侵入のための推定ネイティブリガンドと同一であるか極めて類似する工業的に利用できるリガンドを開発する必要が、当技術分野にはある。例えば、ワクシニアウイルスに対して著しく特異的且つ著しく効果的な結合を示すリガンドの使用は、有利であるだろう。というのも、それは、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子を特異的に選別し、その結果、精製ワクシニアウイルスの純度、生存能、及び機能性を増加させるその能力により、精製を改善するだろうからである。
【００２５】
5．ワクシニアウイルス粒子は大きすぎて滅菌濾過することができない。したがって、本発明で使用される方法は、ワクチンの滅菌性に関する規制上の要件への完全な準拠が保証されるような形で無菌的な工業規模生産プロセスに応用することができるように開発された。上記を踏まえて、本発明の目的には、リガンドで置換されたカラムは、定置滅菌に応用することができるか、又は滅菌済ユニットとして利用できるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
特に本発明は、
a）リガンドが取付けられた固相マトリックスに、液相培養に含有されるワクシニアウイルスを負荷すること；
b）マトリックスを洗浄すること、及び
c）ウイルスを溶出させること
を含む、生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製方法に向けられる。
【００２７】
リガンドは、一方では、固相マトリックスに、例えばそこへの結合又はカップリングによって取付けることができ、他方では、ワクシニアウイルスとの可逆的複合体を形成することができる物質である。したがって、ウイルスと相互作用することにより、ウイルスは可逆的に保持される。リガンドは、例えばペプチド及び/又はレクチン及び/又は抗体及び/又は好ましくは糖質のような生物学的分子であることができる。リガンドは、スルフェートを含むか、スルフェートからなることもできる。さらなる一実施形態では、リガンドが一つ以上の負に帯電したスルフェート基を含む。さらにまたリガンドは、例えば芳香族フェニル基のような疎水性分子であることもできる。リガンドは、マトリックスに直接的に、例えば直接結合によって取付けるか、別の分子を介して間接的に、例えばリンカー又はスペーサーを介したカップリングによって、マトリックスに取付けることができる。
【００２８】
固相マトリックスはゲル、ビーズ、ウェル、メンブレン、カラムなどであることができる。本発明の好ましい一実施形態では、固相がメンブレン、特にセルロースメンブレンを含むか、メンブレン、特にセルロースメンブレンである。しかし、ウイルスを結合する能力を持つ特異的な基で修飾された広範囲にわたる他のポリマーも使用することができる。好ましいのは親水性ポリマーである。その例は、セルロース誘導体（セルロースエステル及びその混合物、セルロース水和物、酢酸セルロース、硝酸セルロース）；アガロース及びその誘導体；キチン及びキトサンのような他の多糖類；ポリオレフィン類（ポリプロピレン）；ポリスルホン；ポリエーテルスルホン；ポリスチレン；芳香族及び脂肪族ポリアミド類；ポリスルホンアミド類；ハロゲン化ポリマー類（ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン）；ポリエステル類；アクリロニトリルのホモポリマー及びコポリマー類である。
【００２９】
本発明の方法及びさらなる実施形態は、高い生物学的活性と純度とを持つワクシニアウイルス粒子の工業規模での効果的な精製を妨げている既知の方法の制約を克服することができる。本方法は、主としてショ糖クッション遠心分離及び/又はダイアフィルトレーション又は非特異的イオン交換クロマトグラフィに基づくワクシニアウイルス粒子の既存のパイロット規模精製法と比較して、収率、プロセス時間、純度、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の回収率及びコストの面で優れている。また、限外濾過、酵素的DNA消化、及びダイアフィルトレーションに基づくワクシニアウイルス粒子の唯一既存の大規模精製法と比較しても、収率、プロセス時間、純度、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の回収率、及びコストの面で優れている。
【００３０】
本発明によれば、ワクシニアウイルスを無菌条件下で精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得ることができる。ワクシニアウイルスはネイティブウイルス又は組換えウイルスであることができる。
【００３１】
本発明は、ワクシニアウイルスを実験室規模、パイロット規模、そして好ましくは工業規模で無菌精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得るための、改良された方法を提供する。
【００３２】
本発明は、ワクシニアウイルス及び組換えワクシニアウイルス、修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）及び組換えMVA、MVA-BN（登録商標）及び組換えMVA-BN（登録商標）を精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得るための、時間効果及び費用効果のより高いプロセスを提供する。
【００３３】
もう一つの実施形態において、本発明は、本発明の方法によって製造されるウイルス調製物を提供する。
【００３４】
医薬組成物、特にワクチンを調製するための、溶出されたワクシニアウイルス若しくは組換えワクシニアウイルス、又は修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）若しくは組換えMVA、又はMVA-BN（登録商標）若しくは組換えMVA-BN（登録商標）（いずれも好ましくは本発明の方法で取得されたもの）の使用も、本発明の一実施形態である。本ウイルス及び/又は医薬調製物は好ましくはがん及び/又は感染性疾患の処置及び/又は予防に使用される。
【００３５】
免疫応答の誘発又はワクチン接種を必要とする動物、具体的にはヒトを含む哺乳動物の、免疫応答を誘発するための方法又はワクチン接種の方法であって、上述のような精製ステップを含むプロセスによって調製されるワクシニアウイルス若しくは組換えワクシニアウイルス、又は修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）若しくは組換えMVA、又はMVA-BN（登録商標）若しくは組換えMVA-BN（登録商標）ワクチンの投与を特徴とする方法は、本発明のさらなる一実施形態である。
【００３６】
本明細書にいう「弱毒化ウイルス」は、その病原性がその前駆体と比較して例えば一定の細胞株での連続継代及び/又はプラーク精製又は他の手段によって低減されることにより、複製しないか又は極めてわずかな複製しか示さないために、毒性は低くなっているが、特異的疾患をもたらすことなく、天然ウイルスと同等以上の、強い免疫応答を開始させ刺激する能力は依然として持っている、ウイルス株である。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、グルコサミングリカン（glucosamine glycan）（GAG）、特にヘパラン硫酸若しくはヘパリン、又はGAG様物質が、リガンドとして使用される。
【００３８】
本明細書にいう「グリコサミノグリカン」（GAG）は、繰返し二糖単位からなる長い非分岐多糖である。いくつかのGAGは細胞表面上に配置され、そこで、発生プロセス、血液凝固、腫瘍転移、及びウイルス感染などの様々な生物学的活性を調節する。
【００３９】
本明細書にいう「GAG様剤」は、既知のGAGに類似するが、例えば余分なスルフェート基の付加など（例えば過硫酸化（over-sulfated）ヘパリン）によって修飾されていてよい、任意の分子と定義される。「GAG様リガンド」は合成又は天然物質であることができる。また、「GAG様リガンド」という用語は、リガンド-固相複合体において、リガンドとしてのGAGの性質を模倣する物質も包含する。リガンドとしてのGAG（具体的にはヘパリン）を模倣する「GAG様リガンド」の一例は、固相としての強化セルロースに取付けられてリガンド-固相複合体としての硫酸化強化セルロース（SRC）を形成するスルフェート（Sulfate）である。SRC複合体の使用は、本発明の好ましい一実施形態でもある。安定化強化セルロースメンブレンは例えばSartorius AGから入手することができる。
【００４０】
本明細書にいう「原薬（Bulk Drug Substance）」は、最終ワクチンへと製剤し、充填し、完成させるステップの直前の精製ウイルス調製物を指す。
【００４１】
本明細書にいう「生物学的活性」は、1）少なくとも一つの細胞タイプ、例えばCEFにおいて感染性であるか、2）ヒトにおいて免疫原性であるか、又は3）感染性であり且つ免疫原性である、ワクシニアウイルスのウイルス粒子と定義される。「生物学的に活性な」ワクシニアウイルスは、少なくとも一つの細胞タイプ、例えばCEFにおいて感染性であるか、又はヒトにおいて免疫原性であるか、又はその両方であるものである。好ましい一実施形態では、ワクシニアウイルスがCEFにおいて感染性であり、且つヒトにおいて免疫原性である。
【００４２】
本明細書にいう「夾雑物」は、ウイルス増殖に使用される宿主細胞に由来するか（例えば宿主細胞DNA又はタンパク質）、又は上流プロセス（例えばゲンタマイシン）及び下流プロセス（例えばベンゾナーゼ）を含む生産プロセス中に使用される任意の添加剤に由来しうる、任意の望まれていない物質を包含する。
【００４３】
本明細書にいう「連続継代性細胞培養（又は不死化細胞培養）」は、初代培養の樹立以来、培養中で増殖されてきた細胞を表し、それらは自然の老化の限界を越えて増殖し、生存することができる。そのような生残細胞は不死であるとみなされる。不死化細胞という用語は、最初は、テロメア延長酵素を発現させることによってアポトーシスを回避することができるがん細胞に適用された。連続継代性又は不死化細胞株は、例えばがん遺伝子の誘導又は腫瘍抑制遺伝子の喪失によって作製することができる。
【００４４】
本明細書にいう「ヘパラン硫酸」は、グリコサミノグリカン糖質ファミリの一構成要素である。ヘパラン硫酸は構造がヘパリンと極めて近い関係にあり、それらはどちらも様々に硫酸化された繰返し二糖単位からなる。ヘパラン硫酸中の最も一般的な二糖単位はN-アセチルグルコサミンに連結されたグルクロン酸（glucuronic）からなり、それが典型的には全二糖単位の約50％を構成する。
【００４５】
本明細書にいう「ヘパリン」は、グリコサミノグリカン糖質ファミリの一構成要素である。ヘパリンは構造がヘパラン硫酸と極めて密接な関係にあり、それらはどちらも様々に硫酸化された繰返し二糖単位からなる。ヘパリンの場合、最も一般的な二糖単位は硫酸化グルコピラノシルに連結された硫酸化イズロン酸からなる。ヘパリンをヘパラン硫酸と区別するには、あるGAGをヘパリンと認定するために、N-スルフェート基の含量がN-アセチル基の含量を大きく上回るべきであり、O-スルフェート基の濃度がN-スルフェートの濃度を上回るべきであることが示唆されている（Gallagherら 1985, Biochem. J. 230:665-674）。
【００４６】
ワクシニアウイルス系又は組換えワクシニアウイルス系ワクチンの生産に関して、本明細書にいう「工業規模」又は大規模は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で最低50,000回分（合計で最低5.0×1012ウイルス粒子）を与える能力を持つ方法を含む。好ましくは、1バッチ（製造連）につき1×108ウイルス粒子の用量で100,000回分を上回る量（合計で最低1.0×1013ウイルス粒子）が得られる。
【００４７】
本明細書にいう「実験室規模」は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で5,000回分未満の量（合計で5.0×1011ウイルス粒子未満）を与えるウイルス調製方法を含む。
【００４８】
本明細書にいう「パイロット規模」は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で5,000回分を上回る（合計で5.0×1011ウイル粒子を上回る）が、1.0×108ウイルス粒子の用量で50,000回分未満の量（合計で最低5.0×1012ウイルス粒子）を与えるウイルス調製方法を含む。
【００４９】
本明細書にいう「初代細胞培養」は、細胞は該当組織から（例えば特定病原体フリー（SPF）鶏卵から）単離されているが、最初の継代培養の前である段階を指す。これは、その細胞が元々の起源からさらには増殖又は分裂していないことを意味する。
【００５０】
本明細書にいうワクシニアウイルス調製物又はワクチンの「純度」は、不純物であるDNA、タンパク質、ベンゾナーゼ、及びゲンタマイシンの含量に関して調べられる。純度は、1用量あたりの各不純物の量（例えばng DNA/用量）である比不純度（specific impurity）として表される。
【００５１】
本明細書にいうワクシニアウイルス調製物の「精製」は、ワクシニアウイルス調製物中の何らかの夾雑物の除去又はそのレベルの測定可能な低下を指す。
【００５２】
本明細書にいう「組換えワクシニアウイルス」は、外来遺伝物質の一片（例えばHIVウイルスに由来するもの）がウイルスゲノム中に挿入されているウイルスである。これにより、宿主細胞では、そのワクシニアウイルスの感染時に、ワクシニアウイルス遺伝子と挿入された任意の遺伝子の両方が発現されることになる。
【００５３】
本明細書にいう「安定性」とは、ウイルス調製物（原薬（BDS）又は最終製剤（FDP））の品質が温度、湿度及び光などの様々な環境因子の影響を受けて時間と共にどれほど変化するかの尺度であり、推奨貯蔵条件におけるBDSの再試験時期又はFDPの貯蔵寿命を確定する（業界向けガイダンスQ1A(R2)）。
【００５４】
本明細書にいう「ウイルス調製物」は、ウイルスを含有する懸濁液である。この懸濁液は、生産プロセス中の以下のステップのどこからでも得ることができる：ウイルス増殖後、ウイルス収集後、ウイルス精製後（典型的にはBDS）、製剤後、又は最終ワクチン（FDP）。
【００５５】
本明細書にいう「ワクシニアウイルス型」は、感染ターゲット細胞によって産生されるウイルス粒子の三つの異なるタイプ、すなわち成熟ウイルス粒子（MV）、包膜（wrapped）ウイルス粒子（WV）、及び細胞外ウイルス粒子（EV）を指す（Moss, B. 2006, Virology, 344:48-54）。EV型は、以前は細胞関連（cell-associated）エンベロープウイルス（CEV）及び細胞外エンベロープウイルス（EEV）と呼ばれていた二つの型を含む（Smith, G.L. 2002, J. Gen. Virol. 83:2915-2931）。
【００５６】
MV型及びEV型は形態学的に異なる。EV型は追加のリポタンパク質エンベロープを含有するからである。さらにまた、これら二つの型は異なる表面タンパク質を含有し（表1参照）、それらは、ターゲット細胞上の表面分子、例えばグリコサミングリカン（glycosaminglycan）（GAG）との相互作用によってターゲット細胞の感染に関与する（Carter, G. C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。本発明には全ての型のワクシニアウイルスの精製の使用が関わる。
【００５７】
異なる型のワクシニアウイルス粒子は異なる表面タンパク質を含有し、それらは、ターゲット細胞上の表面分子、例えばグリコサミングリカン（GAG）などとの相互作用によって、ターゲット細胞の感染に関与する（Carter, G.C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。これらの表面タンパク質を、上述のように、受容体と呼ぶことにする。MV型上では、p14又はA27L（本願では後者の用語を使用することにする）と名付けられた表面タンパク質が、ターゲット細胞へのウイルス粒子の初期付着に関与する。A27Lは細胞への侵入前にターゲット細胞上のGAG構造に結合する（Chung C.ら 1998, J. Virol. 72:1577-1585）、（Hsiao J.C.ら 1998 J. Virol. 72:8374-8379）、（Vazquez M.ら 1999, J. Virol. 73:9098-9109）（Carter G.C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。A27Lの天然リガンドはヘパラン硫酸（HS）と呼ばれるGAGであると推定される。ヘパラン硫酸はグリコサミングリカン（GAG）と呼ばれる分子群に属する。GAGは細胞表面上に遍在的に見出される（Taylor及びDrickamer「Introduction to Glycobiology」第2版、Oxford University Press、2006）。GAGは、スルフェート基を含有する負に帯電した分子である。A27Lタンパク質はウイルス粒子の表面上に配置され、A17Lタンパク質との相互作用によって膜に係留される（Rodriguez D.ら 1993, J. Virol. 67:3435-3440）（Vazquez M.ら 1998, J. Virol. 72:10126-10137）。したがって、ウイルス粒子の生物学的活性を完全に保つために、単離中は、A27LとAl17Lとの間の相互作用を完全な状態に維持することができる。A17LとA27Lとの間のタンパク質-タンパク質相互作用の特異的性質は、まだ完全には解明されていないが、A27L中の推定「ロイシンジッパー」領域がA17Lとの相互作用に関与することが示唆されている（Vazquez M.ら 19981, J. Virol. 72:10126-10137）。
【００５８】
本発明は、MV型のワクシニアウイルスを精製するための、MV型上のA27L表面タンパク質とグルコサミングリカン（glucosaminglycan）、特にヘパラン硫酸との間のアフィニティ相互作用の使用を包含する。
【００５９】
したがって、用語「リガンド」は、ターゲット細胞上の受容体と、ワクシニアの精製に使用される固相マトリックスに取付けられた特異的結合構造との両方を指す。
【００６０】
上記と同じ原理を、他のターゲット細胞表面構造と、ワクシニアウイルスによるターゲット細胞の認識、ターゲット細胞への付着、ターゲット細胞への侵入及び/又はターゲット細胞との融合に参加するMV型の他のワクシニア表面タンパク質（表1参照）との間の相互作用にも適用することができる。他のWV及びEV表面タンパク質を表1に要約する。A27Lタンパク質全体又はGAGリガンドに対する結合領域を含有するそのフラグメントは、ワクシニアウイルス-GAG複合体を本発明の固相カラムから溶出させるための剤として使用することができる。フラグメントは、日常的な分子技法によって容易に生成させ、ワクシニアウイルス-GAG複合体を解離させるその能力について、当技術分野で知られる日常的な技法を使って、例えば溶出した生物学的に活性なウイルスを測定することなどにより、スクリーニングすることができる。
【００６１】
MV型のワクシニアの場合、推定ネイティブGAGリガンドはヘパラン硫酸（HS）であり、これは適切なリガンドの一つになりうる。本発明は、ワクシニアウイルスを精製するための、「非ネイティブ」リガンドの使用も含む。そのような非ネイティブリガンドは、ネイティブリガンドに対して高度な構造及び/又はコンフォメーション類似性を持つ化合物である。一例として、A27LにとってのネイティブリガンドであるHSに近い類似体であるヘパリンを、A27L表面タンパク質との相互作用によるMV型のアフィニティ精製に使用することができる（下記参照）。ヘパリンは、ターゲット細胞とワクシニアウイルスとの間の結合を部分的に阻害することが示されており、したがってMV型のワクシニアのアフィニティ精製にも使用することができる。他のGAGリガンド及びGAG様リガンドも使用することができる。
【００６２】
本発明の一実施形態では、MV型のワクシニアのアフィニティ精製に使用されるヘパラン硫酸が、生物学的に活性なワクシニアウイルス上のA27Lを結合するが、不活性ワクシニアウイルス又はワクシニアウイルスフラグメントを結合しない。
【００６３】
リガンドは、ワクシニアウイルスがその生物学的活性を完全に保つような温和な条件下での、結合したワクシニアウイルスの溶出を可能にする。これは、A27Lの構造及びA27LとA17Lとの間の相互作用が完全な状態に維持されうることを意味する。
【００６４】
GAGリガンド置換マトリックスの結合及び溶出特徴は、マトリックス及びリガンドの個々の特徴に依存するだけでなく、それら二つの間の相互関係にも依存する。
【００６５】
例えばリガンド密度を変更することによって、又は異なる長さ及び化学的特徴（疎水性、親水性）を持つ「アーム」若しくは「スペーサー」によるマトリックスへのリガンドの取付け、例えば結合若しくはカップリングによって、ターゲットGAGリガンド構造とワクシニアウイルス上のA27L表面タンパク質との間の結合強度を変化させることができ、それを使って、例えば捕捉を強化し、又は溶出を容易にすることができる。
【００６６】
精製方法を強化するには、精製に使用するためのクロマトグラフィゲル又はメンブレンの形態をしたマトリックスが、好ましくは、
・高いポアサイズを持ち（可能な限り多くのリガンドがワクシニアウイルスにアクセスできるようにするため）、
・速い流速に備えて堅い構造を持ち、
・リガンドの（例えば結合又はカップリングによる）直接的又は間接的取付けが可能な形態で入手することができ、
・例えば照射を使用することにより、定置滅菌用に応用できるか、又は滅菌済ユニットとして利用できる。
【００６７】
ある実施形態では、固相マトリックスが、実際の精製条件下で10cm/分、好ましくは20cm/分の線流速を示す、0.25μmの、好ましくは0.25μmを上回る、より好ましくは1.0〜3.0μmのポアサイズを持つ、ゲル又はメンブレンである。マトリックスのポアサイズは0.25〜0.5μm、0.5〜0.75μm、0.75〜1.0μm、1.0〜2.0μm、2.0〜3.0μm、又は3.0μm超であることができる。
【００６８】
ある実施形態では、固定化リガンドとしてヘパラン硫酸を含有する固相マトリックスを使って、上流ウイルス増殖プロセスからのウイルス収集物が、10cm/分、好ましくは20cm/分の流速で、パイロット規模では1mLあたり106ウイルス粒子のウイルス濃度、工業規模では1mLあたり107ウイルス粒子のウイルス濃度で、粗製物（未精製物）の形態で負荷される。
【００６９】
ある実施形態では、本発明の精製プロセスに、大半のアフィニティクロマトグラフィプロセスにとって一般的な3ステップ、すなわち
1）固相へのワクシニアウイルス又はワクシニア組換えウイルスの負荷；
2）夾雑物を除去するための固相の洗浄；及び
3）単離されるべきワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出
が含まれる。
【００７０】
ステップ1．固相マトリックスへのワクシニアウイルス又はワクシニア組換えウイルスの負荷
例えばヘパラン硫酸又は他のGAG若しくはGAG様構造がリガンドとして取付けられている固相への負荷は、バッチ法、カラム法、又はメンブレン法で行うことができる。メンブレン法は、とりわけ大きな生体分子、特にワクシニアウイルスのような大きなウイルスにとって、いくつかの利点を持ちうる。例えば、メンブレンはポアサイズが大きく、表面上のリガンドが利用可能であることにより、大きなウイルス粒子でも、高い結合容量が可能になる。したがってメンブレン法は本発明の好ましい実施形態である。上述の全ての実施形態では、単離されるべきワクシニアウイルス又は組換えウイルスが液相に存在する。ワクシニアウイルス又は組換えウイルスがGAG又はGAG様リガンドに接近すると、ワクシニアウイルスはGAGリガンドに特異的に結合し、又はGAGリガンド「によって捕捉され」、それにより、ワクシニアウイルス又は組換えワクシニアウイルスを一時的に固相上に固定化することができ、その一方で、夾雑物は液相中に留まることになる。
【００７１】
リガンドタイプを適当に選択することにより、リガンド密度及びリガンド立体配置、A27L表面タンパク質を介したカラムへのワクシニアウイルスの結合パラメータを変化させ、それをもって、精製パラメータを最適化するための手段とすることができる。
【００７２】
ステップ2．夾雑物を除去するための固相の洗浄
リガンドへの生物学的に活性なワクシニアウイルス又は組換えウイルスの結合が十分に進行すると、ワクシニアウイルスが結合される固相を、適当な洗浄媒質で洗浄することによって、液相に留まる宿主細胞夾雑物（特に宿主細胞DNA及びタンパク質）を除去することができる。
【００７３】
ステップ3．特異的又は非特異的剤によるワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出
生物学的に活性なワクシニアウイルス又は組換えウイルスを溶出させることができる。捕捉されたワクシニアウイルスの溶出は、例えば
1）例えばGAGリガンドとワクシニアウイルス上のA27L表面タンパク質との間の特異的相互作用を特異的に破壊する剤（これを特異的剤と呼ぶ）、又は
2）例えば負に帯電したGAGリガンドと正に帯電したA27L表面タンパク質との間の静電相互作用を非特異的に破壊する剤（これを非特異的剤と呼ぶ）
によって行うことができる。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態によれば、GAG若しくはGAG様リガンド又はその一部、A27LのGAG結合ドメイン又はその一部、及び/又は0-グリコシド結合切断酵素で、ワクシニアウイルスを溶出させる。
【００７５】
ウイルスの溶出は、さらに、好ましくは塩化ナトリウムを使って行われ、より好ましくは、0.15Mから2.0Mまでの範囲の増加するNaCl濃度勾配によって行われる。
前処理
固相に負荷する前に、ウイルス懸濁液の前処理を、とりわけ液相培養中のワクシニアウイルスから夾雑物を除去するために行うことができる。前処理は、単独の、又は組合わされた、以下のステップの一つ以上であることができる：
1）宿主細胞のホモジナイゼーション
・超音波処理
・凍結/融解
・低浸透圧溶解
・高圧処理
2）細胞残渣の除去
・遠心分離
・濾過
3）宿主細胞DNAの除去/低減
・ベンゾナーゼ処理
・陽イオン交換
・陽イオン界面活性剤による選択的沈殿。
【００７６】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リガンドへのウイルス粒子の結合を改善するために、ウイルス懸濁液のpH値を、負荷の直前に低下させる。ウイルス懸濁液のpH値は、約pH7.0〜8.0から4.0〜6.9に、特にpH4.0、4.2、4.4、4.5、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.8、6.9に低下させることができる。好ましくはpH値をpH7.0〜8.0からpH5.8に低下させる。次に、負荷直後且つ溶出前に、ウイルス粒子の安定性を改善するために、pH値を再びpH7.0〜8.0に、特にpH7.0、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0に、好ましくはpH7.7に上昇させる。
【００７７】
後処理
ワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出に使用した剤に応じて、ウイルス調製物の純度を高めるために、後処理を行うことができる。後処理は、不純物及び/又は溶出に使用した特異的若しくは非特異的剤をさらに除去するための限外濾過/ダイアフィルトレーションであることができる。ウイルスの効率的な精製を達成するには、本発明による精製を、一つ以上のさらなる精製ステップ（例えばイオン交換によるもの）と組合わせることも好ましい。その場合はイオン交換を後処理ステップとして行うこともできる。
【００７８】
精製ウイルス懸濁液の凝集を防ぐには、したがってなかんずく感染性粒子の検出（特にTCID50法によるもの）を改善するには、ウイルスの溶出後にpHを、特に9まで又はそれ以上のpH値に、特にpH7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8,4、8.5、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.5、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.5に上昇させることも適切でありうる。好ましくはpH値を、特にpH7.0、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0、好ましくはpH7.7から、pH9.0に上昇させる。
【００７９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ワクシニアウイルス試料が、本発明の精製ステップの実施後に、すなわちウイルスの溶出後に、1用量（1×108TCID50〜3.2×108TCID50）あたり10〜20μgの範囲の宿主細胞DNA、好ましくは108ウイルス粒子あたり10ng、より好ましくは10ng未満の宿主細胞DNAを含有する。
【００８０】
本発明の実施には、分子生物学、タンパク質分析、及び微生物学における技法を使用し、それらは当業者の知識の範囲内にある。そのような技法は、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク、1995）に詳しく説明されている。
【００８１】
本発明の変更及び変形は当業者には明白になるだろう。本明細書に記載する具体的実施形態は、例示のために記載するに過ぎず、本発明がそれらによって限定されるとみなしてはならない。
【００８２】
ある実施形態では、本発明は、以下のステップの一つ以上を含む、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスをより高い収率で精製するための、時間効果及び費用効果のより高いプロセスを提供する：
a）固相マトリックス（この固相マトリックスは、例えばウイルスを可逆的に結合することなどによって、ウイルスと相互作用するのに適したリガンドを含む）に液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b）マトリックスを洗浄するステップ、及び
c）ウイルスを溶出させるステップ。
【００８３】
本発明の他の態様及び利点は、一部は以下の説明で述べられ、一部は以下の説明から自明になるか、本発明の実施によって習得することができる。
【００８４】
好ましい一実施形態では、本方法が以下のステップを含む：
a．一つ以上の適当なウイルス結合リガンドを含むカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b．夾雑物を除去するためにマトリックスを適当な溶媒で洗浄するステップ、及び
c．純度が高く生物学的に活性で安定なウイルス調製物を得るために、適当な溶媒でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８５】
さらなる好ましい一実施形態では、本方法は、以下のステップを含む：
a．一つ以上の適当なグルコサミングリカン（GAG）又はGAG様ウイルス結合リガンドを含むカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b．夾雑物を除去するためにマトリックスを適当な溶媒で洗浄するステップ、及び
c．純度が高く生物学的に活性で安定なウイルス調製物を得るために、NaCl、H+などの非特異的溶離剤の濃度勾配、或いはGAG様化合物又は／及びA27Lペプチド若しくはペプチドフラグメントなどの特異的溶離剤の濃度勾配をもたらす溶媒でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８６】
特に好ましい一実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．ワクシニアウイルス粒子より弱いアフィニティを持つ夾雑物をまず最初に除去し、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子を最後に溶出させるために、0.15M NaClから2.0M NaClまでの、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８７】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15Mである）、
b．280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される、全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液、例えばPBS（0.01Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5）でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．0.15M NaClから出発して2.0M NaClで終わる、PBS中の、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８８】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15M NaCl、pH8.0、及びHEPES-NaCl、例えば0.01〜0.1M HEPES、0.15M NaCl、pH7.5である）、
b．280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される、全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液、例えばPBS（0.01Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5）でマトリックスを洗浄するステップ（洗浄1）、
c．緩く結合した夾雑物を除去するために、追加の洗浄緩衝液、例えばグリシン緩衝食塩水（GBS）、0.02M、0.15M NaCl、pH9.0）で、マトリックスを洗浄するステップ（洗浄2）、及び
d．0.15M NaClから出発して2.0M NaClで終わる、GBS 0.02M pH9.0中の、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８９】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15Mである）、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．PBS 0.1M、NaCl 0.15M、pH7.5中の、濃度が増加する低分子量ヘパリン0.01〜0.5Mで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００９０】
特に好ましいもう一つの実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．濃度が増加するHS由来オリゴ糖でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。HS由来オリゴ糖中の基本繰返し二糖単位は、グルコサミンとウロン酸の(31→4結合配列である。グルコサミン残基はN-アセチル化されるか（GlcNAc）又はN-硫酸化される（GlcNSO3-）。他の単糖残基、例えばイズロン酸及び置換体、例えば2-O-硫酸化イズロン酸が存在してもよい。オリゴ糖は2〜10個の繰返し二糖単位からなる。ワクシニアウイルス粒子の溶出に使用されるオリゴ糖濃度は、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5中、0.01Mから0.5Mに至る。
【００９１】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．濃度が増加するワクシニアウイルス粒子表面タンパク質又はそれに由来するペプチド若しくはペプチドフラグメントで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。好ましい表面タンパク質はA27Lであり、好ましいペプチドはA27Lであり、好ましいA27Lペプチドフラグメントは、A27LとHSとの間の結合を担うA27Lペプチド配列の4〜10アミノ酸残基を含有するフラグメントである。ワクシニアウイルス粒子の溶出に使用されるペプチド濃度は、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5中、0.01Mから0.5Mに達する。
【００９２】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．繰返し二糖単位間、繰返し二糖単位内、又はHS分子中のどこか他の位置において一つ以上のグリコシド結合を部分的に切断する能力を持つ酵素で、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。好ましい酵素はヘパリンリアーゼI、II及びIIIである。溶出は、カラムを酵素溶液で飽和させることによって行われる。適当な消化時間後に、結合が解かれたワクシニアウイルス粒子とワクシニアウイルス粒子に結合したGAG残基との複合体を、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5で溶出させる。ワクシニアウイルス粒子-GAG残基複合体を、温和なNaCl溶液、例えばPBS 0.02M、0.15M NaCl、pH7.5で解離させ、GAG残基をダイアフィルトレーションによって除去する。
【実施例】
【００９３】
例えばToyopearlによるカラムクロマトグラフィ又は例えばメンブレン（例：Sartobind MA75（Sartorius））を使ったメンブレンクロマトグラフィ（どちらもGAGリガンド（例えばヘパリン又はヘパラン硫酸）で置換されたもの）を応用して、アフィニティ精製を行う。以下に挙げる例は全て実験室規模である。
【００９４】
実施例１
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、Toyopearl AF-ヘパリンを充填したカラムに適用した。
【００９５】
2）カラムをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.2で洗浄した。ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度のモニタリングに使用したA280吸光度シグナルは、12分後にベースライン（負荷前値）に復帰した。洗浄を合計25分間続けた。
【００９６】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をPBS 0.01M、pH7.2中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度を0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計30分後（勾配を開始した5分後）ぐらいに始まった。主要ピークは7分後（T＝37分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。溶出は約25分後（T＝55分）に完了した。
【００９７】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約70％〜90％のウイルス回収率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約10％のタンパク質が示された。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、洗液及び素通り画分中に約40％のDNAのさらなる除去が示された。
【００９８】
実施例２
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用した。
【００９９】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄した。ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度のモニタリングに使用したA280吸光度シグナルは、12分後にベースライン（負荷前値）に復帰した。洗浄を合計16分間続けた。
【０１００】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をPBS 0.01M、pH7.5中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度を0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計20分後（勾配を開始した4分後）ぐらいに始まった。主要ピークは5分後（T＝25分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。
【０１０１】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約55％のウイルス回復率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約5％のタンパク質回収が明らかになった。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、溶出液中に約10％のDNAが明らかになった。
【０１０２】
実施例３
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１０３】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１０４】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をGBS 0.02M、0.15M NaCl中のpH濃度勾配で溶出させる。初期pHは8.5で、pH10.5まで増加する。NaClの濃度は0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させる。
【０１０５】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞60％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞75％であることができる。
【０１０６】
実施例４
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１０７】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１０８】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中の低分子量ヘパリン（LMW-HP）の濃度勾配で行う。勾配は0.01Mから0.5MのLMW-ヘパリンに至る。
【０１０９】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１０】
実施例５
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１１１】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１１２】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中のA27Lペプチド（A27LP）の濃度勾配で行う。勾配は0.01Mから0.5MのA27LPに至る。
【０１１３】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１４】
実施例６
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１１５】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１１６】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中のグリコシド結合切断酵素ヘパリンリアーゼで行う。2体積のヘパリンリアーゼをカラムに通すことにより、メンブレンをヘパリンリアーゼで飽和させる。
【０１１７】
4）グリコシド結合の酵素切断のために60分間待ってから、結合が解かれたワクシニアウイルス粒子とワクシニアウイルス粒子に結合したヘパリン残基との複合体を、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5で溶出させる。ワクシニアウイルス粒子-GAG残基複合体を、PBS 0.02M、0.3M NaCl、pH7.5で解離させる。ヘパリン残基をダイアフィルトレーションによって除去する。
【０１１８】
5）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１９】
実施例７
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、硫酸化強化セルロースメンブレンに適用した。
【０１２０】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄した。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングした。洗浄を合計25分間続けた。
【０１２１】
3）結合したワクシニアウイルス粒子を、PBS 0.01M、pH7.5中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度は0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計30分後（勾配を開始した5分後）ぐらいに始まった。主要ピークは5分後（T＝35分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。
【０１２２】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約40％のウイルス回収率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約5％のタンパク質回収が示された。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、溶出液中に約5％のDNAが示された。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
【０１２５】
表1で言及した参考文献の一覧：
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【技術分野】
【０００１】
本発明はネイティブ及び組換えワクシニアウイルス及び/又はワクシニアウイルス粒子の精製方法を提供する。本発明によれば、この方法の使用は、純度、生物学的活性、及び安定性に関して、高い効率及び望ましい収率でのワクチンの精製を容易にし、さらにまた、実験室規模、パイロット規模、及び工業規模での無菌生産プロセスにも応用することができる。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に医学において、ベクターとは、疾患そのものを引き起こすわけではないが、ある宿主から別の宿主へと病原体（疾患を引き起こす因子）を「運ぶ」ことによって感染を拡げる生命体である。ワクチンベクターは、挿入された抗原（身体によって異物と認識されるタンパク質をコードするもの）を疾患原因因子からワクチン接種対象へと運ぶ、弱体化された又は殺されたウイルス又は細菌である。ワクチンベクターは抗原を自然な形で身体中に送達し、「安全な感染」に対して作用するように免疫系を刺激する。免疫系は、その抗原に対する免疫応答（ワクチン接種された対象を将来の「危険な感染」から防御するもの）を生じるように導かれる。
【０００３】
ワクチン開発では、遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクル又はワクチンベクターとして、組換え修飾ウイルスを使用することができる。ひとたび細胞内に入ると、遺伝情報は転写され、タンパク質（特異的疾患を標的とする挿入された抗原を含む）に翻訳される。ベクターによって細胞中に送達された抗原がタンパク質を産生し、それが、その抗原に対する身体の免疫応答を誘発することによって、その疾患から防御するのであれば、処置は成功である。
【０００４】
ウイルスベクターは弱毒化ウイルスに基づくことができ、この弱毒化ウイルスは、宿主中で複製することはできないが、感染細胞に外来遺伝子を導入してそれを感染細胞中で発現させることはできる。それにより、ウイルス又は組換えウイルスは、タンパク質を作り、それを宿主の免疫系にディスプレイすることができる。ウイルスベクターの重要な特徴の一つに、それらが強い体液性（B細胞）及び細胞性（T細胞）免疫応答を引き出すことができる点がある。
【０００５】
ウイルスベクターは、感染性疾患及びがんを予防及び処置するためのワクチンの開発に、研究者によってよく使用され、そのなかでは、ポックスウイルス（カナリア痘、ワクシニア、及び鶏痘を含む）が最も一般的なベクターワクチン候補である。
【０００６】
ポックスウイルスは、ウイルスゲノムのサイズが比較的大きい（約150/200kb）ことと、感染細胞の核ではなく細胞質内で複製する能力を持ち、それゆえに宿主細胞のゲノム中に遺伝物質を組み込むリスクが最小限に抑えられることから、新しい宿主への遺伝物質の伝達にとって、好ましい選択肢である。ポックスウイルスの中ではワクシニア種と天然痘種の二つが最もよく知られている。ポックスウイルスのウイルス粒子は、他の大半の動物ウイルスと比較して大きい（さらなる詳細については、Fieldsら編「Virology」第3版、第2巻、第83章、2637頁以降を参照されたい）。
【０００７】
天然痘ウイルスは痘瘡の原因である。天然痘ウイルスとは対照的に、ワクシニアウイルスは、通常、免疫適格個体では全身性疾患を引き起こさず、したがって痘瘡に対する免疫を与えるための生ワクチンとして使用されてきた。ワクシニアウイルスによる世界的なワクチン接種の成功は最終的に自然疾患としての痘瘡を1980年代に根絶させることになった（非特許文献1）。それ以来、ポックスウイルス感染のリスクが高い人々（例えば研究室職員）を除いて、ワクチン接種は長年にわたって中断されてきた。しかし、例えば天然痘を引き起こす痘瘡ウイルスが生物テロ兵器として使用されるかもしれないという不安が増大しつつある。さらにまた、牛痘、ラクダ痘、及びサル痘などといった他のポックスウイルスが、淘汰機構によって潜在的に突然変異を起こし、天然痘と類似する表現型を獲得するリスクもある。したがっていくつかの政府は、推定の又は現実の痘瘡攻撃のばく露前（天然痘ウイルスとの遭遇前）又はばく露後（天然痘ウイルスとの遭遇後）に使用されるワクシニア系ワクチンの備蓄を増強しているところである。
【０００８】
ワクシニアウイルスは免疫刺激性が高く、それ自身の遺伝子産物に対しても、ワクシニアゲノム中に挿入された遺伝子から生じるどの外来遺伝子産物に対しても、強いB細胞（体液性）免疫及びT細胞性免疫を惹起する。したがってワクシニアウイルスは、痘瘡並びに他の感染性疾患及びがんに対する、組換えワクチンの形態をしたワクチンにとって、理想的なベクターであると考えられる。文献に記載されている組換えワクシニアウイルスの大半は、完全な複製能を持つワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ（Western Reserve）株に基づく。この株は高い神経毒性を持つことがわかっており、それゆえに、ヒト及び動物での使用にはあまり適していない（非特許文献2）。
【０００９】
対照的に、修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（Modified Vaccinia virus Ankara: MVA）は例外的に安全であることがわかっている。MVAは、ワクシニアウイルスの漿尿膜ワクシニア・アンカラ（CVA）株をニワトリ胚線維芽細胞（CEF）で長期間にわたって連続継代することによって作製された（概観するには非特許文献3；特許文献1を参照されたい）。ブダペスト条約の要件に従って寄託されたMVAウイルス株の例は、European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）（英国ソールズベリー）にそれぞれ受託番号ECACC V94012707、ECACC V00120707及びECACC V00083008として寄託されたMVA572株、MVA575株、及びMVA-BN株であり、これらは特許文献2及び特許文献3に記載されている。
【００１０】
MVAは、その前駆体CVAと比較して、その著しい弱毒プロファイルによって識別される。これは、良好な免疫原性を維持しつつ、減少したビルレンス又は感染性を持つ。MVAウイルスは、解析が行われて、野生型CVA株との比較でゲノム中の変化が決定されている。全部で31,000塩基対に達する六つの主要なゲノムDNAの欠失（欠失I、II、III、IV、V、及びVI）が同定されている（非特許文献4）。その結果生じたMVAウイルスは、宿主細胞が鳥類細胞に厳しく制限されることになった。MVA株の優れた性質は広範囲にわたる臨床試験で証明されており（非特許文献5；非特許文献6）、この臨床試験では、二段階プログラムで、MVA571をプライミングワクチンとして低用量で使用してから、従来の痘瘡ワクチンが投与され、ドイツにおける120,000人を越える一次ワクチン接種者に、有意な有害事象（SAE）は一切見られなかった（非特許文献6；非特許文献5）。
【００１１】
MVA-BN（登録商標）は、スタンドアロン（stand-alone）第3世代痘瘡ワクチンの生産に使用されるワクチンである。MVA-BN（登録商標）は、MVA571/572株から、さらなる継代によって開発された。現在までに、アトピー性皮膚炎（AD）を持つ被験者及びHIV感染を持つ被験者を含めて、1500人を越える被験者が、MVA-BN（登録商標）系のワクチンを使った臨床試験でワクチン接種を受けている。
【００１２】
ワクシニア系ワクチンによる痘瘡ワクチンキャンペーンへの新たな関心が、大規模痘瘡ワクチン生産に対する世界的需要の増大を引き起こしている。さらにまた、組換えワクチンを調製するためのツールとしてワクシニアウイルスが使用されることにより、ネイティブワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスの生産（増殖及び精製）方法にも、大きな工業的関心が寄せられるようになっている。
【００１３】
ワクチンの生産に使用されるウイルス又は診断目的で使用されるウイルスは、ウイルスのタイプに応じて、いくつかの方法で精製することができる。伝統的に、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスを含むポックスウイルスの精製は、分子のサイズ差を利用して分子を分離する方法に基づいて行われてきた。宿主細胞夾雑物（例えばDNA及びタンパク質）、特にDNAの除去を強化するために、サイズ分離を利用した一次精製が、DNAの酵素消化（例えばベンゾナーゼ処理）などの二次的方法によって補足されてきた。最も一般的には、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスの一次精製が、さまざまなショ糖濃度でのショ糖クッション又はショ糖勾配遠心分離によって行われてきた。最近では、超遠心分離も単独で、又はショ糖クッション若しくはショ糖勾配精製と組合わせて応用されるようになっている。
【００１４】
ワクシニアウイルス系ワクチンは、一般に、初代CEF（ニワトリ胚線維芽細胞）培養中で生産されてきた。初代CEF培養中で生産されたワクチンは、一般に、残留夾雑物に関して安全であるとみなされる。第1に、健康なニワトリ胚に由来する初代細胞培養が何らかの有害夾雑物（タンパク質、DNA）を含有するとは、科学的に考えがたい。第2に、何百万人という人々が、CEF培養で生産されたワクチンによるワクチン接種を受けているが、夾雑物（CEFタンパク質及びCEF DNA）がもたらす有害作用は何も認められていない。したがって、初代CEF培養中で生産されたワクチン中の宿主細胞夾雑物のレベルに関する規制要件はないが、各ワクチンごとに生産者はその安全性を証拠文書で立証しなければならない。初代CEF培養中で生産されたワクチンに関する規制上の懸念は、外因性因子（生物学的製剤の製造に意図せず導入される微生物（細菌、真菌、マイコプラズマ/スピロプラズマ、マイコバクテリア、リケッチア、ウイルス、原虫、寄生虫、TSE因子を含む））のリスクに関する。
【００１５】
初代CEF培養中で生産されたワクシニアウイルスを精製するための現行の方法では、TCID50で測定して、1×108の用量で、CEFタンパク質のレベルが最高1mg/用量になる場合があり、CEF DNAレベルは10μg/用量を越える場合がある。これらのレベルは、最終製剤（Final Drug Product：FDP）中に見出されるレベルが意図するヒト適応症において安全であることを、個々のワクチン生産者が証明する限り、安全上及び規制上の観点からは許容することができるとみなされる。初代細胞培養中で生産されたワクチン中に外因性因子が存在するリスクがあること、及びそれに伴って、生産されたワクチンバッチごとに広範な、費用のかかるバイオセーフティ試験が必要になることから、ワクチン産業には連続継代性細胞株に変えようという強い刺激がある。ひとたび連続継代性細胞株が特徴づけられると、製造バッチの外因性因子に関する試験の必要はごくわずかになる。
【００１６】
しかし、ワクシニア及びワクシニア組換えワクチンの製造に関して、初代細胞培養から連続継代性細胞培養への切り替えは、より厳密な安全上及び規制上の要件を課すことになると予想される。実際、規制当局は、連続継代性細胞株を使って生産されるワクチン中のDNA夾雑物のレベルに関して新しい要件を提案しており（FDAガイドライン案を参照されたい）、それは10ng宿主細胞DNA/用量という低いものになりうる。そのような低レベルの宿主細胞夾雑物を達成するには、新しい改良された精製方法が必要になる。
【００１７】
ワクシニアウイルス粒子は表面タンパク質A27Lを介してヘパリンに結合することができるようである（非特許文献7）。さらに、一定のウイルス調製物については精製の基礎としてアフィニティクロマトグラフィ（非特許文献8）を使用しうることが、示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】スイス国特許第568,392号
【特許文献２】米国特許第7,094,412号
【特許文献３】米国特許第7,189,536号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication」History of Public Health、No.4、ジュネーブ：世界保健機関、1980
【非特許文献２】Moritaら 1987, Vaccine 5, 65-70
【非特許文献３】Mayr, A.ら 1975, Infection 3, 6-14
【非特許文献４】Meyer, H.ら 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038
【非特許文献５】Mayr, A.ら 1978, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390
【非特許文献６】Stickl, H.ら 1974, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392
【非特許文献７】Chungら 1998, J. Virol. 72, 1577-1585
【非特許文献８】Zahn, A及びAllain, J.-P. 2005, J. Gen. Virol. 86, 677-685
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの効率のよい精製には、いくつかの大きな難題を克服する必要がある。
【００２１】
1．ワクシニアウイルス粒子は、市販のヘパリンカラム、例えば他の研究者ら（Zahn, A及びAllain, J.-P. 2005, J. Gen. Virol. 86, 677-685）がC型及びB型肝炎ウイルスの実験室規模精製に使用したAmersham BiosciencesのHi-Trapヘパリンカラムに効果的に負荷するには、あまりにも大きすぎる。ワクシニアウイルス粒子の体積は肝炎ウイルス粒子より約125倍大きい（すなわち、C型及びB型肝炎ウイルス粒子の直径が約50nmであるのに対して、ワクシニアウイルスの直径は約250nmである）。したがって、例えばカラムベースのアプローチに使用されるような、入手可能なマトリックスでは、工業規模精製の要求を満たすほどには、マトリックス中へのウイルス粒子の十分な進入、十分な量のウイルス粒子の負荷、又は十分に高速なカラムを通過する流れが可能にならないだろう。ZahnとAllainは1.0mlまでの体積に1×106までのウイルス負荷量で作業した。初期臨床試験用に十分な材料を獲得するためのパイロット規模精製の場合、5Lより大きい、好ましくは50Lまでの体積に、1×1011より高い、好ましくは1×1013までのウイルス負荷容量が必要である。ワクシニアウイルスの工業的精製には、300Lより大きい、好ましくは600Lより大きい体積に、1×1013より高い、好ましくは1×1014より高い負荷容量が必要である。
【００２２】
2．ワクシニアウイルスの大きなサイズは、ウイルス粒子の特異的表面タンパク質とマトリックスに固定化されたリガンドとの間の効果的な立体アクセスを妨げうる。したがって、小さなウイルス粒子の精製に関して現在記載されている実験室規模の使用方法を、ワクシニアウイルスの精製に工業的に応用することはできないだろう。
【００２３】
3．ワクシニアウイルス粒子の結合に使用されるリガンドと相互作用する機能的表面分子の数が多いため、結合したワクシニアウイルスの溶出には、生物学的に有効な形態のワクシニアウイルス粒子を高い収率で溶出させ回収するために、より苛酷な、そしてそれゆえに潜在的に変性的な、条件が要求されるだろう。それゆえに、マトリックス、リガンド設計、リガンド固定化の方法、及びリガンド密度には、ワクシニアウイルスの効果的な結合が媒介され、且つ生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の効果的な溶出が可能になるように、注意深い設計が要求されるだろう。
【００２４】
4．高い生物学的活性を持つワクシニアウイルス粒子の生体分子特異的精製を達成するには、ワクシニアのターゲット細胞侵入のための推定ネイティブリガンドと同一であるか極めて類似する工業的に利用できるリガンドを開発する必要が、当技術分野にはある。例えば、ワクシニアウイルスに対して著しく特異的且つ著しく効果的な結合を示すリガンドの使用は、有利であるだろう。というのも、それは、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子を特異的に選別し、その結果、精製ワクシニアウイルスの純度、生存能、及び機能性を増加させるその能力により、精製を改善するだろうからである。
【００２５】
5．ワクシニアウイルス粒子は大きすぎて滅菌濾過することができない。したがって、本発明で使用される方法は、ワクチンの滅菌性に関する規制上の要件への完全な準拠が保証されるような形で無菌的な工業規模生産プロセスに応用することができるように開発された。上記を踏まえて、本発明の目的には、リガンドで置換されたカラムは、定置滅菌に応用することができるか、又は滅菌済ユニットとして利用できるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
特に本発明は、
a）リガンドが取付けられた固相マトリックスに、液相培養に含有されるワクシニアウイルスを負荷すること；
b）マトリックスを洗浄すること、及び
c）ウイルスを溶出させること
を含む、生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製方法に向けられる。
【００２７】
リガンドは、一方では、固相マトリックスに、例えばそこへの結合又はカップリングによって取付けることができ、他方では、ワクシニアウイルスとの可逆的複合体を形成することができる物質である。したがって、ウイルスと相互作用することにより、ウイルスは可逆的に保持される。リガンドは、例えばペプチド及び/又はレクチン及び/又は抗体及び/又は好ましくは糖質のような生物学的分子であることができる。リガンドは、スルフェートを含むか、スルフェートからなることもできる。さらなる一実施形態では、リガンドが一つ以上の負に帯電したスルフェート基を含む。さらにまたリガンドは、例えば芳香族フェニル基のような疎水性分子であることもできる。リガンドは、マトリックスに直接的に、例えば直接結合によって取付けるか、別の分子を介して間接的に、例えばリンカー又はスペーサーを介したカップリングによって、マトリックスに取付けることができる。
【００２８】
固相マトリックスはゲル、ビーズ、ウェル、メンブレン、カラムなどであることができる。本発明の好ましい一実施形態では、固相がメンブレン、特にセルロースメンブレンを含むか、メンブレン、特にセルロースメンブレンである。しかし、ウイルスを結合する能力を持つ特異的な基で修飾された広範囲にわたる他のポリマーも使用することができる。好ましいのは親水性ポリマーである。その例は、セルロース誘導体（セルロースエステル及びその混合物、セルロース水和物、酢酸セルロース、硝酸セルロース）；アガロース及びその誘導体；キチン及びキトサンのような他の多糖類；ポリオレフィン類（ポリプロピレン）；ポリスルホン；ポリエーテルスルホン；ポリスチレン；芳香族及び脂肪族ポリアミド類；ポリスルホンアミド類；ハロゲン化ポリマー類（ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン）；ポリエステル類；アクリロニトリルのホモポリマー及びコポリマー類である。
【００２９】
本発明の方法及びさらなる実施形態は、高い生物学的活性と純度とを持つワクシニアウイルス粒子の工業規模での効果的な精製を妨げている既知の方法の制約を克服することができる。本方法は、主としてショ糖クッション遠心分離及び/又はダイアフィルトレーション又は非特異的イオン交換クロマトグラフィに基づくワクシニアウイルス粒子の既存のパイロット規模精製法と比較して、収率、プロセス時間、純度、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の回収率及びコストの面で優れている。また、限外濾過、酵素的DNA消化、及びダイアフィルトレーションに基づくワクシニアウイルス粒子の唯一既存の大規模精製法と比較しても、収率、プロセス時間、純度、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子の回収率、及びコストの面で優れている。
【００３０】
本発明によれば、ワクシニアウイルスを無菌条件下で精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得ることができる。ワクシニアウイルスはネイティブウイルス又は組換えウイルスであることができる。
【００３１】
本発明は、ワクシニアウイルスを実験室規模、パイロット規模、そして好ましくは工業規模で無菌精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得るための、改良された方法を提供する。
【００３２】
本発明は、ワクシニアウイルス及び組換えワクシニアウイルス、修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）及び組換えMVA、MVA-BN（登録商標）及び組換えMVA-BN（登録商標）を精製して、生物学的に活性で、安定で、純度の高いウイルス調製物を高い収率で得るための、時間効果及び費用効果のより高いプロセスを提供する。
【００３３】
もう一つの実施形態において、本発明は、本発明の方法によって製造されるウイルス調製物を提供する。
【００３４】
医薬組成物、特にワクチンを調製するための、溶出されたワクシニアウイルス若しくは組換えワクシニアウイルス、又は修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）若しくは組換えMVA、又はMVA-BN（登録商標）若しくは組換えMVA-BN（登録商標）（いずれも好ましくは本発明の方法で取得されたもの）の使用も、本発明の一実施形態である。本ウイルス及び/又は医薬調製物は好ましくはがん及び/又は感染性疾患の処置及び/又は予防に使用される。
【００３５】
免疫応答の誘発又はワクチン接種を必要とする動物、具体的にはヒトを含む哺乳動物の、免疫応答を誘発するための方法又はワクチン接種の方法であって、上述のような精製ステップを含むプロセスによって調製されるワクシニアウイルス若しくは組換えワクシニアウイルス、又は修飾ワクシニア・ウイルス・アンカラ（MVA）若しくは組換えMVA、又はMVA-BN（登録商標）若しくは組換えMVA-BN（登録商標）ワクチンの投与を特徴とする方法は、本発明のさらなる一実施形態である。
【００３６】
本明細書にいう「弱毒化ウイルス」は、その病原性がその前駆体と比較して例えば一定の細胞株での連続継代及び/又はプラーク精製又は他の手段によって低減されることにより、複製しないか又は極めてわずかな複製しか示さないために、毒性は低くなっているが、特異的疾患をもたらすことなく、天然ウイルスと同等以上の、強い免疫応答を開始させ刺激する能力は依然として持っている、ウイルス株である。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施形態によれば、グルコサミングリカン（glucosamine glycan）（GAG）、特にヘパラン硫酸若しくはヘパリン、又はGAG様物質が、リガンドとして使用される。
【００３８】
本明細書にいう「グリコサミノグリカン」（GAG）は、繰返し二糖単位からなる長い非分岐多糖である。いくつかのGAGは細胞表面上に配置され、そこで、発生プロセス、血液凝固、腫瘍転移、及びウイルス感染などの様々な生物学的活性を調節する。
【００３９】
本明細書にいう「GAG様剤」は、既知のGAGに類似するが、例えば余分なスルフェート基の付加など（例えば過硫酸化（over-sulfated）ヘパリン）によって修飾されていてよい、任意の分子と定義される。「GAG様リガンド」は合成又は天然物質であることができる。また、「GAG様リガンド」という用語は、リガンド-固相複合体において、リガンドとしてのGAGの性質を模倣する物質も包含する。リガンドとしてのGAG（具体的にはヘパリン）を模倣する「GAG様リガンド」の一例は、固相としての強化セルロースに取付けられてリガンド-固相複合体としての硫酸化強化セルロース（SRC）を形成するスルフェート（Sulfate）である。SRC複合体の使用は、本発明の好ましい一実施形態でもある。安定化強化セルロースメンブレンは例えばSartorius AGから入手することができる。
【００４０】
本明細書にいう「原薬（Bulk Drug Substance）」は、最終ワクチンへと製剤し、充填し、完成させるステップの直前の精製ウイルス調製物を指す。
【００４１】
本明細書にいう「生物学的活性」は、1）少なくとも一つの細胞タイプ、例えばCEFにおいて感染性であるか、2）ヒトにおいて免疫原性であるか、又は3）感染性であり且つ免疫原性である、ワクシニアウイルスのウイルス粒子と定義される。「生物学的に活性な」ワクシニアウイルスは、少なくとも一つの細胞タイプ、例えばCEFにおいて感染性であるか、又はヒトにおいて免疫原性であるか、又はその両方であるものである。好ましい一実施形態では、ワクシニアウイルスがCEFにおいて感染性であり、且つヒトにおいて免疫原性である。
【００４２】
本明細書にいう「夾雑物」は、ウイルス増殖に使用される宿主細胞に由来するか（例えば宿主細胞DNA又はタンパク質）、又は上流プロセス（例えばゲンタマイシン）及び下流プロセス（例えばベンゾナーゼ）を含む生産プロセス中に使用される任意の添加剤に由来しうる、任意の望まれていない物質を包含する。
【００４３】
本明細書にいう「連続継代性細胞培養（又は不死化細胞培養）」は、初代培養の樹立以来、培養中で増殖されてきた細胞を表し、それらは自然の老化の限界を越えて増殖し、生存することができる。そのような生残細胞は不死であるとみなされる。不死化細胞という用語は、最初は、テロメア延長酵素を発現させることによってアポトーシスを回避することができるがん細胞に適用された。連続継代性又は不死化細胞株は、例えばがん遺伝子の誘導又は腫瘍抑制遺伝子の喪失によって作製することができる。
【００４４】
本明細書にいう「ヘパラン硫酸」は、グリコサミノグリカン糖質ファミリの一構成要素である。ヘパラン硫酸は構造がヘパリンと極めて近い関係にあり、それらはどちらも様々に硫酸化された繰返し二糖単位からなる。ヘパラン硫酸中の最も一般的な二糖単位はN-アセチルグルコサミンに連結されたグルクロン酸（glucuronic）からなり、それが典型的には全二糖単位の約50％を構成する。
【００４５】
本明細書にいう「ヘパリン」は、グリコサミノグリカン糖質ファミリの一構成要素である。ヘパリンは構造がヘパラン硫酸と極めて密接な関係にあり、それらはどちらも様々に硫酸化された繰返し二糖単位からなる。ヘパリンの場合、最も一般的な二糖単位は硫酸化グルコピラノシルに連結された硫酸化イズロン酸からなる。ヘパリンをヘパラン硫酸と区別するには、あるGAGをヘパリンと認定するために、N-スルフェート基の含量がN-アセチル基の含量を大きく上回るべきであり、O-スルフェート基の濃度がN-スルフェートの濃度を上回るべきであることが示唆されている（Gallagherら 1985, Biochem. J. 230:665-674）。
【００４６】
ワクシニアウイルス系又は組換えワクシニアウイルス系ワクチンの生産に関して、本明細書にいう「工業規模」又は大規模は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で最低50,000回分（合計で最低5.0×1012ウイルス粒子）を与える能力を持つ方法を含む。好ましくは、1バッチ（製造連）につき1×108ウイルス粒子の用量で100,000回分を上回る量（合計で最低1.0×1013ウイルス粒子）が得られる。
【００４７】
本明細書にいう「実験室規模」は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で5,000回分未満の量（合計で5.0×1011ウイルス粒子未満）を与えるウイルス調製方法を含む。
【００４８】
本明細書にいう「パイロット規模」は、1バッチ（製造連）につき1.0×108ウイルス粒子の用量で5,000回分を上回る（合計で5.0×1011ウイル粒子を上回る）が、1.0×108ウイルス粒子の用量で50,000回分未満の量（合計で最低5.0×1012ウイルス粒子）を与えるウイルス調製方法を含む。
【００４９】
本明細書にいう「初代細胞培養」は、細胞は該当組織から（例えば特定病原体フリー（SPF）鶏卵から）単離されているが、最初の継代培養の前である段階を指す。これは、その細胞が元々の起源からさらには増殖又は分裂していないことを意味する。
【００５０】
本明細書にいうワクシニアウイルス調製物又はワクチンの「純度」は、不純物であるDNA、タンパク質、ベンゾナーゼ、及びゲンタマイシンの含量に関して調べられる。純度は、1用量あたりの各不純物の量（例えばng DNA/用量）である比不純度（specific impurity）として表される。
【００５１】
本明細書にいうワクシニアウイルス調製物の「精製」は、ワクシニアウイルス調製物中の何らかの夾雑物の除去又はそのレベルの測定可能な低下を指す。
【００５２】
本明細書にいう「組換えワクシニアウイルス」は、外来遺伝物質の一片（例えばHIVウイルスに由来するもの）がウイルスゲノム中に挿入されているウイルスである。これにより、宿主細胞では、そのワクシニアウイルスの感染時に、ワクシニアウイルス遺伝子と挿入された任意の遺伝子の両方が発現されることになる。
【００５３】
本明細書にいう「安定性」とは、ウイルス調製物（原薬（BDS）又は最終製剤（FDP））の品質が温度、湿度及び光などの様々な環境因子の影響を受けて時間と共にどれほど変化するかの尺度であり、推奨貯蔵条件におけるBDSの再試験時期又はFDPの貯蔵寿命を確定する（業界向けガイダンスQ1A(R2)）。
【００５４】
本明細書にいう「ウイルス調製物」は、ウイルスを含有する懸濁液である。この懸濁液は、生産プロセス中の以下のステップのどこからでも得ることができる：ウイルス増殖後、ウイルス収集後、ウイルス精製後（典型的にはBDS）、製剤後、又は最終ワクチン（FDP）。
【００５５】
本明細書にいう「ワクシニアウイルス型」は、感染ターゲット細胞によって産生されるウイルス粒子の三つの異なるタイプ、すなわち成熟ウイルス粒子（MV）、包膜（wrapped）ウイルス粒子（WV）、及び細胞外ウイルス粒子（EV）を指す（Moss, B. 2006, Virology, 344:48-54）。EV型は、以前は細胞関連（cell-associated）エンベロープウイルス（CEV）及び細胞外エンベロープウイルス（EEV）と呼ばれていた二つの型を含む（Smith, G.L. 2002, J. Gen. Virol. 83:2915-2931）。
【００５６】
MV型及びEV型は形態学的に異なる。EV型は追加のリポタンパク質エンベロープを含有するからである。さらにまた、これら二つの型は異なる表面タンパク質を含有し（表1参照）、それらは、ターゲット細胞上の表面分子、例えばグリコサミングリカン（glycosaminglycan）（GAG）との相互作用によってターゲット細胞の感染に関与する（Carter, G. C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。本発明には全ての型のワクシニアウイルスの精製の使用が関わる。
【００５７】
異なる型のワクシニアウイルス粒子は異なる表面タンパク質を含有し、それらは、ターゲット細胞上の表面分子、例えばグリコサミングリカン（GAG）などとの相互作用によって、ターゲット細胞の感染に関与する（Carter, G.C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。これらの表面タンパク質を、上述のように、受容体と呼ぶことにする。MV型上では、p14又はA27L（本願では後者の用語を使用することにする）と名付けられた表面タンパク質が、ターゲット細胞へのウイルス粒子の初期付着に関与する。A27Lは細胞への侵入前にターゲット細胞上のGAG構造に結合する（Chung C.ら 1998, J. Virol. 72:1577-1585）、（Hsiao J.C.ら 1998 J. Virol. 72:8374-8379）、（Vazquez M.ら 1999, J. Virol. 73:9098-9109）（Carter G.C.ら 2005, J. Gen. Virol. 86:1279-1290）。A27Lの天然リガンドはヘパラン硫酸（HS）と呼ばれるGAGであると推定される。ヘパラン硫酸はグリコサミングリカン（GAG）と呼ばれる分子群に属する。GAGは細胞表面上に遍在的に見出される（Taylor及びDrickamer「Introduction to Glycobiology」第2版、Oxford University Press、2006）。GAGは、スルフェート基を含有する負に帯電した分子である。A27Lタンパク質はウイルス粒子の表面上に配置され、A17Lタンパク質との相互作用によって膜に係留される（Rodriguez D.ら 1993, J. Virol. 67:3435-3440）（Vazquez M.ら 1998, J. Virol. 72:10126-10137）。したがって、ウイルス粒子の生物学的活性を完全に保つために、単離中は、A27LとAl17Lとの間の相互作用を完全な状態に維持することができる。A17LとA27Lとの間のタンパク質-タンパク質相互作用の特異的性質は、まだ完全には解明されていないが、A27L中の推定「ロイシンジッパー」領域がA17Lとの相互作用に関与することが示唆されている（Vazquez M.ら 19981, J. Virol. 72:10126-10137）。
【００５８】
本発明は、MV型のワクシニアウイルスを精製するための、MV型上のA27L表面タンパク質とグルコサミングリカン（glucosaminglycan）、特にヘパラン硫酸との間のアフィニティ相互作用の使用を包含する。
【００５９】
したがって、用語「リガンド」は、ターゲット細胞上の受容体と、ワクシニアの精製に使用される固相マトリックスに取付けられた特異的結合構造との両方を指す。
【００６０】
上記と同じ原理を、他のターゲット細胞表面構造と、ワクシニアウイルスによるターゲット細胞の認識、ターゲット細胞への付着、ターゲット細胞への侵入及び/又はターゲット細胞との融合に参加するMV型の他のワクシニア表面タンパク質（表1参照）との間の相互作用にも適用することができる。他のWV及びEV表面タンパク質を表1に要約する。A27Lタンパク質全体又はGAGリガンドに対する結合領域を含有するそのフラグメントは、ワクシニアウイルス-GAG複合体を本発明の固相カラムから溶出させるための剤として使用することができる。フラグメントは、日常的な分子技法によって容易に生成させ、ワクシニアウイルス-GAG複合体を解離させるその能力について、当技術分野で知られる日常的な技法を使って、例えば溶出した生物学的に活性なウイルスを測定することなどにより、スクリーニングすることができる。
【００６１】
MV型のワクシニアの場合、推定ネイティブGAGリガンドはヘパラン硫酸（HS）であり、これは適切なリガンドの一つになりうる。本発明は、ワクシニアウイルスを精製するための、「非ネイティブ」リガンドの使用も含む。そのような非ネイティブリガンドは、ネイティブリガンドに対して高度な構造及び/又はコンフォメーション類似性を持つ化合物である。一例として、A27LにとってのネイティブリガンドであるHSに近い類似体であるヘパリンを、A27L表面タンパク質との相互作用によるMV型のアフィニティ精製に使用することができる（下記参照）。ヘパリンは、ターゲット細胞とワクシニアウイルスとの間の結合を部分的に阻害することが示されており、したがってMV型のワクシニアのアフィニティ精製にも使用することができる。他のGAGリガンド及びGAG様リガンドも使用することができる。
【００６２】
本発明の一実施形態では、MV型のワクシニアのアフィニティ精製に使用されるヘパラン硫酸が、生物学的に活性なワクシニアウイルス上のA27Lを結合するが、不活性ワクシニアウイルス又はワクシニアウイルスフラグメントを結合しない。
【００６３】
リガンドは、ワクシニアウイルスがその生物学的活性を完全に保つような温和な条件下での、結合したワクシニアウイルスの溶出を可能にする。これは、A27Lの構造及びA27LとA17Lとの間の相互作用が完全な状態に維持されうることを意味する。
【００６４】
GAGリガンド置換マトリックスの結合及び溶出特徴は、マトリックス及びリガンドの個々の特徴に依存するだけでなく、それら二つの間の相互関係にも依存する。
【００６５】
例えばリガンド密度を変更することによって、又は異なる長さ及び化学的特徴（疎水性、親水性）を持つ「アーム」若しくは「スペーサー」によるマトリックスへのリガンドの取付け、例えば結合若しくはカップリングによって、ターゲットGAGリガンド構造とワクシニアウイルス上のA27L表面タンパク質との間の結合強度を変化させることができ、それを使って、例えば捕捉を強化し、又は溶出を容易にすることができる。
【００６６】
精製方法を強化するには、精製に使用するためのクロマトグラフィゲル又はメンブレンの形態をしたマトリックスが、好ましくは、
・高いポアサイズを持ち（可能な限り多くのリガンドがワクシニアウイルスにアクセスできるようにするため）、
・速い流速に備えて堅い構造を持ち、
・リガンドの（例えば結合又はカップリングによる）直接的又は間接的取付けが可能な形態で入手することができ、
・例えば照射を使用することにより、定置滅菌用に応用できるか、又は滅菌済ユニットとして利用できる。
【００６７】
ある実施形態では、固相マトリックスが、実際の精製条件下で10cm/分、好ましくは20cm/分の線流速を示す、0.25μmの、好ましくは0.25μmを上回る、より好ましくは1.0〜3.0μmのポアサイズを持つ、ゲル又はメンブレンである。マトリックスのポアサイズは0.25〜0.5μm、0.5〜0.75μm、0.75〜1.0μm、1.0〜2.0μm、2.0〜3.0μm、又は3.0μm超であることができる。
【００６８】
ある実施形態では、固定化リガンドとしてヘパラン硫酸を含有する固相マトリックスを使って、上流ウイルス増殖プロセスからのウイルス収集物が、10cm/分、好ましくは20cm/分の流速で、パイロット規模では1mLあたり106ウイルス粒子のウイルス濃度、工業規模では1mLあたり107ウイルス粒子のウイルス濃度で、粗製物（未精製物）の形態で負荷される。
【００６９】
ある実施形態では、本発明の精製プロセスに、大半のアフィニティクロマトグラフィプロセスにとって一般的な3ステップ、すなわち
1）固相へのワクシニアウイルス又はワクシニア組換えウイルスの負荷；
2）夾雑物を除去するための固相の洗浄；及び
3）単離されるべきワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出
が含まれる。
【００７０】
ステップ1．固相マトリックスへのワクシニアウイルス又はワクシニア組換えウイルスの負荷
例えばヘパラン硫酸又は他のGAG若しくはGAG様構造がリガンドとして取付けられている固相への負荷は、バッチ法、カラム法、又はメンブレン法で行うことができる。メンブレン法は、とりわけ大きな生体分子、特にワクシニアウイルスのような大きなウイルスにとって、いくつかの利点を持ちうる。例えば、メンブレンはポアサイズが大きく、表面上のリガンドが利用可能であることにより、大きなウイルス粒子でも、高い結合容量が可能になる。したがってメンブレン法は本発明の好ましい実施形態である。上述の全ての実施形態では、単離されるべきワクシニアウイルス又は組換えウイルスが液相に存在する。ワクシニアウイルス又は組換えウイルスがGAG又はGAG様リガンドに接近すると、ワクシニアウイルスはGAGリガンドに特異的に結合し、又はGAGリガンド「によって捕捉され」、それにより、ワクシニアウイルス又は組換えワクシニアウイルスを一時的に固相上に固定化することができ、その一方で、夾雑物は液相中に留まることになる。
【００７１】
リガンドタイプを適当に選択することにより、リガンド密度及びリガンド立体配置、A27L表面タンパク質を介したカラムへのワクシニアウイルスの結合パラメータを変化させ、それをもって、精製パラメータを最適化するための手段とすることができる。
【００７２】
ステップ2．夾雑物を除去するための固相の洗浄
リガンドへの生物学的に活性なワクシニアウイルス又は組換えウイルスの結合が十分に進行すると、ワクシニアウイルスが結合される固相を、適当な洗浄媒質で洗浄することによって、液相に留まる宿主細胞夾雑物（特に宿主細胞DNA及びタンパク質）を除去することができる。
【００７３】
ステップ3．特異的又は非特異的剤によるワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出
生物学的に活性なワクシニアウイルス又は組換えウイルスを溶出させることができる。捕捉されたワクシニアウイルスの溶出は、例えば
1）例えばGAGリガンドとワクシニアウイルス上のA27L表面タンパク質との間の特異的相互作用を特異的に破壊する剤（これを特異的剤と呼ぶ）、又は
2）例えば負に帯電したGAGリガンドと正に帯電したA27L表面タンパク質との間の静電相互作用を非特異的に破壊する剤（これを非特異的剤と呼ぶ）
によって行うことができる。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態によれば、GAG若しくはGAG様リガンド又はその一部、A27LのGAG結合ドメイン又はその一部、及び/又は0-グリコシド結合切断酵素で、ワクシニアウイルスを溶出させる。
【００７５】
ウイルスの溶出は、さらに、好ましくは塩化ナトリウムを使って行われ、より好ましくは、0.15Mから2.0Mまでの範囲の増加するNaCl濃度勾配によって行われる。
前処理
固相に負荷する前に、ウイルス懸濁液の前処理を、とりわけ液相培養中のワクシニアウイルスから夾雑物を除去するために行うことができる。前処理は、単独の、又は組合わされた、以下のステップの一つ以上であることができる：
1）宿主細胞のホモジナイゼーション
・超音波処理
・凍結/融解
・低浸透圧溶解
・高圧処理
2）細胞残渣の除去
・遠心分離
・濾過
3）宿主細胞DNAの除去/低減
・ベンゾナーゼ処理
・陽イオン交換
・陽イオン界面活性剤による選択的沈殿。
【００７６】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リガンドへのウイルス粒子の結合を改善するために、ウイルス懸濁液のpH値を、負荷の直前に低下させる。ウイルス懸濁液のpH値は、約pH7.0〜8.0から4.0〜6.9に、特にpH4.0、4.2、4.4、4.5、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.8、6.9に低下させることができる。好ましくはpH値をpH7.0〜8.0からpH5.8に低下させる。次に、負荷直後且つ溶出前に、ウイルス粒子の安定性を改善するために、pH値を再びpH7.0〜8.0に、特にpH7.0、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0に、好ましくはpH7.7に上昇させる。
【００７７】
後処理
ワクシニアウイルス又は組換えウイルスの溶出に使用した剤に応じて、ウイルス調製物の純度を高めるために、後処理を行うことができる。後処理は、不純物及び/又は溶出に使用した特異的若しくは非特異的剤をさらに除去するための限外濾過/ダイアフィルトレーションであることができる。ウイルスの効率的な精製を達成するには、本発明による精製を、一つ以上のさらなる精製ステップ（例えばイオン交換によるもの）と組合わせることも好ましい。その場合はイオン交換を後処理ステップとして行うこともできる。
【００７８】
精製ウイルス懸濁液の凝集を防ぐには、したがってなかんずく感染性粒子の検出（特にTCID50法によるもの）を改善するには、ウイルスの溶出後にpHを、特に9まで又はそれ以上のpH値に、特にpH7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8,4、8.5、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.5、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.5に上昇させることも適切でありうる。好ましくはpH値を、特にpH7.0、7.2、7.4、7.5、7.6、7.8、8.0、好ましくはpH7.7から、pH9.0に上昇させる。
【００７９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ワクシニアウイルス試料が、本発明の精製ステップの実施後に、すなわちウイルスの溶出後に、1用量（1×108TCID50〜3.2×108TCID50）あたり10〜20μgの範囲の宿主細胞DNA、好ましくは108ウイルス粒子あたり10ng、より好ましくは10ng未満の宿主細胞DNAを含有する。
【００８０】
本発明の実施には、分子生物学、タンパク質分析、及び微生物学における技法を使用し、それらは当業者の知識の範囲内にある。そのような技法は、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク、1995）に詳しく説明されている。
【００８１】
本発明の変更及び変形は当業者には明白になるだろう。本明細書に記載する具体的実施形態は、例示のために記載するに過ぎず、本発明がそれらによって限定されるとみなしてはならない。
【００８２】
ある実施形態では、本発明は、以下のステップの一つ以上を含む、ワクシニアウイルス及び組換え修飾ワクシニアウイルスをより高い収率で精製するための、時間効果及び費用効果のより高いプロセスを提供する：
a）固相マトリックス（この固相マトリックスは、例えばウイルスを可逆的に結合することなどによって、ウイルスと相互作用するのに適したリガンドを含む）に液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b）マトリックスを洗浄するステップ、及び
c）ウイルスを溶出させるステップ。
【００８３】
本発明の他の態様及び利点は、一部は以下の説明で述べられ、一部は以下の説明から自明になるか、本発明の実施によって習得することができる。
【００８４】
好ましい一実施形態では、本方法が以下のステップを含む：
a．一つ以上の適当なウイルス結合リガンドを含むカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b．夾雑物を除去するためにマトリックスを適当な溶媒で洗浄するステップ、及び
c．純度が高く生物学的に活性で安定なウイルス調製物を得るために、適当な溶媒でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８５】
さらなる好ましい一実施形態では、本方法は、以下のステップを含む：
a．一つ以上の適当なグルコサミングリカン（GAG）又はGAG様ウイルス結合リガンドを含むカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに液相ウイルス調製物を負荷するステップ、
b．夾雑物を除去するためにマトリックスを適当な溶媒で洗浄するステップ、及び
c．純度が高く生物学的に活性で安定なウイルス調製物を得るために、NaCl、H+などの非特異的溶離剤の濃度勾配、或いはGAG様化合物又は／及びA27Lペプチド若しくはペプチドフラグメントなどの特異的溶離剤の濃度勾配をもたらす溶媒でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８６】
特に好ましい一実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．ワクシニアウイルス粒子より弱いアフィニティを持つ夾雑物をまず最初に除去し、生物学的に活性なワクシニアウイルス粒子を最後に溶出させるために、0.15M NaClから2.0M NaClまでの、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８７】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15Mである）、
b．280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される、全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液、例えばPBS（0.01Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5）でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．0.15M NaClから出発して2.0M NaClで終わる、PBS中の、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８８】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパリン（HP）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15M NaCl、pH8.0、及びHEPES-NaCl、例えば0.01〜0.1M HEPES、0.15M NaCl、pH7.5である）、
b．280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される、全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液、例えばPBS（0.01Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5）でマトリックスを洗浄するステップ（洗浄1）、
c．緩く結合した夾雑物を除去するために、追加の洗浄緩衝液、例えばグリシン緩衝食塩水（GBS）、0.02M、0.15M NaCl、pH9.0）で、マトリックスを洗浄するステップ（洗浄2）、及び
d．0.15M NaClから出発して2.0M NaClで終わる、GBS 0.02M pH9.0中の、濃度が増加するNaClで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００８９】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、生理的塩濃度（約150mM NaCl）を持つ中性緩衝液（pH6.5〜8.5、好ましくは≧pH7.5）に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ（適当な緩衝液はリン酸緩衝食塩水（PBS）、例えば0.01〜0.1Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5である。別の適当な緩衝液はTris-NaCl、例えば0.01〜0.1M Tris、0.15Mである）、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．PBS 0.1M、NaCl 0.15M、pH7.5中の、濃度が増加する低分子量ヘパリン0.01〜0.5Mで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。
【００９０】
特に好ましいもう一つの実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．濃度が増加するHS由来オリゴ糖でワクシニアウイルスを溶出させるステップ。HS由来オリゴ糖中の基本繰返し二糖単位は、グルコサミンとウロン酸の(31→4結合配列である。グルコサミン残基はN-アセチル化されるか（GlcNAc）又はN-硫酸化される（GlcNSO3-）。他の単糖残基、例えばイズロン酸及び置換体、例えば2-O-硫酸化イズロン酸が存在してもよい。オリゴ糖は2〜10個の繰返し二糖単位からなる。ワクシニアウイルス粒子の溶出に使用されるオリゴ糖濃度は、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5中、0.01Mから0.5Mに至る。
【００９１】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．濃度が増加するワクシニアウイルス粒子表面タンパク質又はそれに由来するペプチド若しくはペプチドフラグメントで、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。好ましい表面タンパク質はA27Lであり、好ましいペプチドはA27Lであり、好ましいA27Lペプチドフラグメントは、A27LとHSとの間の結合を担うA27Lペプチド配列の4〜10アミノ酸残基を含有するフラグメントである。ワクシニアウイルス粒子の溶出に使用されるペプチド濃度は、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5中、0.01Mから0.5Mに達する。
【００９２】
もう一つの特に好ましい実施形態では、本方法が生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製に使用され、以下のステップを含む：
a．ヘパラン硫酸（HS）で置換されたカラム、メンブレン、フィルター又は類似の固相マトリックスに、リン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5に溶解したワクシニアウイルス調製物を負荷するステップ、
b．例えば、280nm吸光度シグナルの負荷前ベースラインへの復帰によって測定される全ての非結合ワクシニアウイルス粒子及び非結合夾雑物の完全な溶出が保証されるように、十分な量の負荷緩衝液でマトリックスを洗浄するステップ、及び
c．繰返し二糖単位間、繰返し二糖単位内、又はHS分子中のどこか他の位置において一つ以上のグリコシド結合を部分的に切断する能力を持つ酵素で、ワクシニアウイルスを溶出させるステップ。好ましい酵素はヘパリンリアーゼI、II及びIIIである。溶出は、カラムを酵素溶液で飽和させることによって行われる。適当な消化時間後に、結合が解かれたワクシニアウイルス粒子とワクシニアウイルス粒子に結合したGAG残基との複合体を、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5で溶出させる。ワクシニアウイルス粒子-GAG残基複合体を、温和なNaCl溶液、例えばPBS 0.02M、0.15M NaCl、pH7.5で解離させ、GAG残基をダイアフィルトレーションによって除去する。
【実施例】
【００９３】
例えばToyopearlによるカラムクロマトグラフィ又は例えばメンブレン（例：Sartobind MA75（Sartorius））を使ったメンブレンクロマトグラフィ（どちらもGAGリガンド（例えばヘパリン又はヘパラン硫酸）で置換されたもの）を応用して、アフィニティ精製を行う。以下に挙げる例は全て実験室規模である。
【００９４】
実施例１
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、Toyopearl AF-ヘパリンを充填したカラムに適用した。
【００９５】
2）カラムをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.2で洗浄した。ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度のモニタリングに使用したA280吸光度シグナルは、12分後にベースライン（負荷前値）に復帰した。洗浄を合計25分間続けた。
【００９６】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をPBS 0.01M、pH7.2中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度を0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計30分後（勾配を開始した5分後）ぐらいに始まった。主要ピークは7分後（T＝37分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。溶出は約25分後（T＝55分）に完了した。
【００９７】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約70％〜90％のウイルス回収率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約10％のタンパク質が示された。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、洗液及び素通り画分中に約40％のDNAのさらなる除去が示された。
【００９８】
実施例２
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用した。
【００９９】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄した。ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度のモニタリングに使用したA280吸光度シグナルは、12分後にベースライン（負荷前値）に復帰した。洗浄を合計16分間続けた。
【０１００】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をPBS 0.01M、pH7.5中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度を0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計20分後（勾配を開始した4分後）ぐらいに始まった。主要ピークは5分後（T＝25分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。
【０１０１】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約55％のウイルス回復率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約5％のタンパク質回収が明らかになった。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、溶出液中に約10％のDNAが明らかになった。
【０１０２】
実施例３
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１０３】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１０４】
3）結合したワクシニアウイルス粒子をGBS 0.02M、0.15M NaCl中のpH濃度勾配で溶出させる。初期pHは8.5で、pH10.5まで増加する。NaClの濃度は0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させる。
【０１０５】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞60％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞75％であることができる。
【０１０６】
実施例４
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１０７】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１０８】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中の低分子量ヘパリン（LMW-HP）の濃度勾配で行う。勾配は0.01Mから0.5MのLMW-ヘパリンに至る。
【０１０９】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１０】
実施例５
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１１１】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１１２】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中のA27Lペプチド（A27LP）の濃度勾配で行う。勾配は0.01Mから0.5MのA27LPに至る。
【０１１３】
4）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１４】
実施例６
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮ワクシニアウイルス調製物2mlを、Sartobind MA75ヘパリンメンブレンに適用する。
【０１１５】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄する。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングする。洗浄を合計20分間続ける。
【０１１６】
3）溶出は、PBS 0.1M、0.15M NaCl、pH7.5中のグリコシド結合切断酵素ヘパリンリアーゼで行う。2体積のヘパリンリアーゼをカラムに通すことにより、メンブレンをヘパリンリアーゼで飽和させる。
【０１１７】
4）グリコシド結合の酵素切断のために60分間待ってから、結合が解かれたワクシニアウイルス粒子とワクシニアウイルス粒子に結合したヘパリン残基との複合体を、PBS、0.02Mリン酸、0.15M NaCl、pH7.5で溶出させる。ワクシニアウイルス粒子-GAG残基複合体を、PBS 0.02M、0.3M NaCl、pH7.5で解離させる。ヘパリン残基をダイアフィルトレーションによって除去する。
【０１１８】
5）溶出液を、組織培養細胞変性効果アッセイ（TCID50）により、生（感染性）ワクシニアウイルス粒子に関する力価測定で分析し、ワクシニアDNAに関するリアルタイムqPCRにより、ワクシニアウイルス粒子の総数について分析し、BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質について分析し、リアルタイムqPCRを利用して宿主細胞DNAについて分析する。回収率は＞70％であることができ、回収されたワクシニアウイルスの生物学的活性は＞80％であることができる。
【０１１９】
実施例７
1）1mlあたり約2×109ウイルス粒子の高濃縮事前精製ワクシニアウイルス調製物2mlを、硫酸化強化セルロースメンブレンに適用した。
【０１２０】
2）メンブレンをPBS 0.01M、0.15M NaCl、pH7.5で洗浄した。A280吸光度シグナルを使って、それがベースライン（負荷前値）に復帰するまで、ワクシニアウイルス粒子及び宿主細胞タンパク質濃度をモニタリングした。洗浄を合計25分間続けた。
【０１２１】
3）結合したワクシニアウイルス粒子を、PBS 0.01M、pH7.5中のNaCl濃度勾配で溶出させた。NaClの濃度は0.15Mから2.0Mまで直線的に増加させた。溶出は、計30分後（勾配を開始した5分後）ぐらいに始まった。主要ピークは5分後（T＝35分）に溶出した。ワクシニアウイルス粒子のモニタリングに使用したレーザー散乱シグナルで評価したところ、このピークは高濃度のワクシニアウイルス粒子を含有していた。
【０１２２】
4）溶出液をワクシニアウイルス特異的ELISAで分析したところ、約40％のウイルス回収率が示された。BCA総タンパク質アッセイを利用して宿主細胞タンパク質を分析したところ、溶出液中に約5％のタンパク質回収が示された。総DNAアッセイによって宿主細胞DNAを分析したところ、溶出液中に約5％のDNAが示された。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
【０１２５】
表1で言及した参考文献の一覧：
(1) Senkevich TG, White CL, Weisberg A, Granek JA, Wolfe EJ, Koonin EV, Moss B: Expression of the vaccinia virus A2.5L redox protein is required for virion morphogenesis. Virology 2002; 300(2):296-303.
(2) Yeh WW, Moss B, Wolfe EJ: The vaccinia virus A9L gene encodes a membrane protein required for an early step in virion morphogenesis. J Virol 2000; 74(20):9701-9711.
(3) Unger B, Traktman P: Vaccinia virus morphogenesis: a13 phosphoprotein is required for assembly of mature virions. J Virol 2004; 78(16):8885-8901.
(4) Traktman P, Liu K, DeMasi J, Rollins R, Jesty S, Unger B: Elucidating the essential role of the A14 phosphoprotein in vaccinia virus morphogenesis: construction and characterization of a tetracycline-inducible recombinant. J Virol 2000; 74(8):3682-3695.
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(6) Mercer J, Traktman P: Investigation of structural and functional motifs within the vaccinia virus A14 phosphoprotein, an essential component of the virion membrane. J Virol 2003; 77(16):8857-8871.
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(8) Betakova T, Wolffe EJ, Moss B: The vaccinia virus A14.5L gene encodes a hydrophobic 53-amino-acid virion membrane protein that enhances virulence in mice and is conserved among vertebrate poxviruses. J Virol 2000; 74(9):4085-4092.
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(10) Ojeda S, Senkevich TG, Moss B: Entry of vaccinia virus and cell-cell fusion require a highly conserved cysteine-rich membrane protein encoded by the Al 6L gene. J Virol 2006; 80(1):51-61.
(11) Betakova T, Wolfe EJ, Moss B: Membrane topology of the vaccinia virus A17L envelope protein. Virology 1999; 261(2):347-356.
(12) Rodriguez D, Esteban M, Rodriguez JR: Vaccinia virus A17L gene product is essential for an early step in virion morphogenesis. J Virol 1995; 69(8):4640-4648.
(13) Wolffe EJ, Moore DM, Peters PJ, Moss B: Vaccinia virus A17L open
reading frame encodes an essential component of nascent viral membranes that is required to initiate morphogenesis. J Virol 1996; 70(5):2797-2808.
(14) Townsley AC, Senkevich TG, Moss B: Vaccinia virus A21 virion membrane protein is required for cell entry and fusion. J Virol 2005; 79(15):9458-9469.
(15) Ulaeto D, Grosenbach D, Hruby DE: The vaccinia virus 4c and A-type inclusion proteins are specific markers for the intracellular mature virus particle. J Virol 1996; 70(6):3372-3377.
(16) McKelvey TA, Andrews SC, Miller SE, Ray CA, Pickup DJ: Identification of the orthopoxvirus p4c gene, which encodes a structural protein that directs intracellular mature virus particles into A-type inclusions. J Virol 2002; 76(22):11216-11225.
(17) Ho Y, Hsiao JC, Yang MH, Chung CS, Peng YC, Lin TH, Chang W, Tzou DL: The oligomeric structure of vaccinia viral envelope protein A27L is essential for binding to heparin and heparan sulfates on cell surfaces: a structural and functional approach using site-specific mutagenesis. J Mol Biol 2005; 349(5):1060-1071.
(18) Vazquez MI, Esteban M: Identification of functional domains in the 14- kilodalton envelope protein (A27L) of vaccinia virus. J Virol 1999; 73(11):9098-9109.
(19) Hsiao JC, Chung CS, Chang W: Cell surface proteoglycans are necessary for A27L protein-mediated cell fusion: identification of the N-terminal region of A27L protein as the glycosaminoglycan-binding domain. J Virol 1998; 72(10):8374-8379.
(20) Chung CS, Hsiao JC, Chang YS, Chang W: A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. J Virol 1998; 72(2):1577-1585.
(21) Vazquez MI, Rivas G, Cregut D, Serrano L, Esteban M: The vaccinia virus 14-kilodalton (A27L) fusion protein forms a triple coiled-coil structure and interacts with the 21-kilodalton (A17L) virus membrane protein through a C-terminal alpha-helix. J Virol 1998; 72(12):10126-10137.
(22) Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M: The vaccinia virus 14-kilodalton fusion protein forms a stable complex with the processed protein encoded by the vaccinia virus Al 7L gene. J Virol 1993; 67(6):3435-3440.
(23) Senkevich TG, Ward BM, Moss B: Vaccinia virus entry into cells is dependent on a virion surface protein encoded by the A28L gene. J Virol 2004; 78(5):2357-2366.
(24) Senkevich TG, Ward BM, Moss B: Vaccinia virus A28L gene encodes an essential protein component of the virion membrane with intramolecular disulfide bonds formed by the viral cytoplasmic redox pathway. J Virol 2004; 78(5):2348-2356.
(25) Roper RL, Wolffe EJ, Weisberg A, Moss B: The envelope protein encoded by the A33R gene is required for formation of actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell spread of vaccinia virus. J Virol 1998; 72(5):4192-4204.
(26) Roper RL, Payne LG, Moss B: Extracellular vaccinia virus envelope glycoprotein encoded by the A33R gene. J Virol 1996; 70(6):3753-3762.
(27) Wolffe EJ, Weisberg AS, Moss B: The vaccinia virus A33R protein provides a chaperone function for viral membrane localization and tyrosine phosphorylation of the A36R protein. J Virol 2001; 75(1):303-310.
(28) Duncan SA, Smith GL: Identification and characterization of an extracellular envelope glycoprotein affecting vaccinia virus egress. J Virol 1992; 66(3):1610-1621.
(29) Rottger S, Frischknecht F, Reckmann I, Smith GL, Way M: Interactions between vaccinia virus IEV membrane proteins and their roles in IEV assembly and actin tail formation. J Virol 1999; 73(4):2863-2875.
(30) Wolffe EJ, Katz E, Weisberg A, Moss B: The A34R glycoprotein gene is required for induction of specialized actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell transmission of vaccinia virus. J Virol 1997; 71(5):3904-3915.
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(32) Sanderson CM, Frischknecht F, Way M, Hollinshead M, Smith GL: Roles of vaccinia virus EEV-specific proteins in intracellular actin tail formation and low pH-induced cell-cell fusion. J Gen Virol 1998; 79 ( Pt 6):1415- 1425.
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(40) Seki M, Oie M, Ichihashi Y, Shida H: Hemadsorption and fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia virus mutants. Virology 1990; 175(2):372-384.
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(46) Ward BM, Moss B: Golgi network targeting and plasma membrane internalization signals in vaccinia virus B5R envelope protein. J Virol 2000; 74(8):3771-3780.
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(48) Senkevich TG, Weisberg AS, Moss B: Vaccinia virus E1OR protein is associated with the membranes of intracellular mature virions and has a role in morphogenesis. Virology 2000; 278(1):244-252.
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(50) Zhang WH, Wilcock D, Smith GL: Vaccinia virus F12L protein is required for actin tail formation, normal plaque size, and virulence. J Virol 2000; 74(24):11654-11662.
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(52) Husain M, Moss B: Similarities in the induction of post-Golgi vesicles by the vaccinia virus F13L protein and phospholipase D. J Virol 2002; 76(15):7777-7789.
(53) Husain M, Weisberg A, Moss B: Topology of epitope-tagged F13L protein, a major membrane component of extracellular vaccinia virions. Virology 2003; 308(2):233-242.
(54) Roper RL, Moss B: Envelope formation is blocked by mutation of a sequence related to the HKD phospholipid metabolism motif in the vaccinia virus F13L protein. J Virol 1999; 73(2):1108-1117.
(55) Schmutz C, Rindisbacher L, Galmiche MC, Wittek R: Biochemical analysis of the major vaccinia virus envelope antigen. Virology 1995; 213(1):19-27.
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(58) Ojeda S, Domi A, Moss B: Vaccinia virus G9 protein is an essential component of the poxvirus entry-fusion complex. J Virol 2006; 80(19):9822-9830.
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Townsley AC, Senkevich TG, Moss B: The product of the vaccinia virus L5R gene is a fourth membrane protein encoded by all poxviruses that is required for cell entry and cell-cell fusion. J Virol 2005; 79(17):10988- 10998.
(70) Townsley AC, Senkevich TG, Moss B: The product of the vaccinia virus L5R gene is a fourth membrane protein encoded by all poxviruses that is required for cell entry and cell-cell fusion. J Virol 2005; 79(17):10988- 10998.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i）リガンドが取付けられた固相マトリックスに、液相培養に含有されるワクシニアウイルスを負荷すること；
ii）マトリックスを洗浄すること、及び
iii）ウイルスを溶出させること
を含む、生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製方法。
【請求項２】
工業規模プロセスである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
無菌である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
溶出されたワクシニアウイルスが108ウイルス粒子あたり10ng未満の宿主細胞DNAを含有する、請求項1〜3のいずれ一項に記載の方法。
【請求項５】
ワクシニアウイルスが組換えワクシニアウイルスである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ワクシニアウイルスがMVA又は組換えMVAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
固相マトリックスがメンブレンを含むか、又はメンブレンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固相マトリックスがセルロースメンブレンを含むか、又はセルロースメンブレンである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記マトリックスが0.25μmより大きいポアサイズを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
リガンドがグルコサミングリカン（glucosamine glycan）（GAG）又はGAG様リガンドである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドが負に帯電したスルフェート基を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドがヘパラン硫酸又はヘパリンである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
夾雑物が液相培養中のワクシニアウイルスから除去される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ワクシニアウイルスをGAG若しくはGAG様リガンド又はその一部で溶出させる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ワクシニアウイルスをA27LのGAG結合ドメイン又はその一部で溶出させる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ワクシニアウイルスを0-グリコシド結合切断酵素で溶出させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ワクシニアウイルスを塩化ナトリウム（NaCl）で溶出させる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ワクシニアウイルスを0.15M〜2.0Mの範囲の増加するNaCl濃度勾配によって溶出させる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
イオン交換による精製ステップを追加して含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルス調製物のpH値が4.0〜11.0の範囲のpHに調節される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物として使用するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルス。
【請求項２２】
ワクチンとして使用するための、請求項21に記載のウイルス。
【請求項２３】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルス。
【請求項２４】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスと、場合により、薬学的に許容できる担体及び/又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
ワクチンである、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための医薬組成物、好ましくはワクチンを調製するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスの使用。
【請求項２８】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスを、ヒトを含む動物に投与することを含む、免疫応答を生じさせるための方法。
【請求項２９】
動物が哺乳動物である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである、請求項29に記載の方法。
【請求項１】
i）リガンドが取付けられた固相マトリックスに、液相培養に含有されるワクシニアウイルスを負荷すること；
ii）マトリックスを洗浄すること、及び
iii）ウイルスを溶出させること
を含む、生物学的に活性なワクシニアウイルスの精製方法。
【請求項２】
工業規模プロセスである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
無菌である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
溶出されたワクシニアウイルスが108ウイルス粒子あたり10ng未満の宿主細胞DNAを含有する、請求項1〜3のいずれ一項に記載の方法。
【請求項５】
ワクシニアウイルスが組換えワクシニアウイルスである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ワクシニアウイルスがMVA又は組換えMVAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
固相マトリックスがメンブレンを含むか、又はメンブレンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固相マトリックスがセルロースメンブレンを含むか、又はセルロースメンブレンである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記マトリックスが0.25μmより大きいポアサイズを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
リガンドがグルコサミングリカン（glucosamine glycan）（GAG）又はGAG様リガンドである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドが負に帯電したスルフェート基を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドがヘパラン硫酸又はヘパリンである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
夾雑物が液相培養中のワクシニアウイルスから除去される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ワクシニアウイルスをGAG若しくはGAG様リガンド又はその一部で溶出させる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ワクシニアウイルスをA27LのGAG結合ドメイン又はその一部で溶出させる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ワクシニアウイルスを0-グリコシド結合切断酵素で溶出させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ワクシニアウイルスを塩化ナトリウム（NaCl）で溶出させる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ワクシニアウイルスを0.15M〜2.0Mの範囲の増加するNaCl濃度勾配によって溶出させる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
イオン交換による精製ステップを追加して含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルス調製物のpH値が4.0〜11.0の範囲のpHに調節される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
医薬組成物として使用するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルス。
【請求項２２】
ワクチンとして使用するための、請求項21に記載のウイルス。
【請求項２３】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルス。
【請求項２４】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスと、場合により、薬学的に許容できる担体及び/又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
ワクチンである、請求項24に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がん及び/又は感染性疾患を処置及び/又は予防するための医薬組成物、好ましくはワクチンを調製するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスの使用。
【請求項２８】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法によって得られる溶出されたワクシニアウイルスを、ヒトを含む動物に投与することを含む、免疫応答を生じさせるための方法。
【請求項２９】
動物が哺乳動物である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである、請求項29に記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５２６５４６（Ｐ２０１０−５２６５４６Ａ）
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７８２７（Ｐ２０１０−５０７８２７）
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３６７９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８５３３
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９２９６４４３）バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月７日（２００８．５．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３６７９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８５３３
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９２９６４４３）バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ (9)
【Ｆターム（参考）】
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