ワクチン
本発明は、改良された、カルボジイミド縮合反応の実施方法に関する。特に、本発明は、カルボジイミド縮合を用いた糖類（特にチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ莢膜糖類）とタンパク質とのコンジュゲート化に関する。本発明はさらに、本発明の糖類−タンパク質コンジュゲートを含むように作製できる免疫原性組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルボジイミド縮合反応を行う改良法に関する。具体的には、本発明はカルボジイミド縮合を用いた糖類およびタンパク質のコンジュゲート化に関する。本発明はまた、本発明の糖類−タンパク質コンジュゲートを含むように作製できる免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌莢膜多糖の使用は、細菌性疾患の予防のため、長年にわたり免疫学において広く使われてきた。しかしながら、そのような使用に関連する問題は、免疫応答のＴ非依存性の性質である。これらの抗原はすなわち、幼児において免疫抗原性が低い。この問題は多糖抗原をタンパク質キャリア（Ｔヘルパーエピトープの供給源）にコンジュゲート化することによって克服されており、これを用いて、生後１年でさえも、Ｔ依存性免疫応答を誘発することができる。
【０００３】
さまざまなコンジュゲート化技術は当技術分野において公知である。コンジュゲートは米国特許第４３６５１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４６７３５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記述の直接還元的アミノ化法によって調製することができる。その他の方法は欧州特許第０−１６１−１８８号、欧州特許第２０８３７５号および欧州特許第０−４７７５０８号に記述されている。または、コンジュゲート化法は１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いた糖類のヒドロキシル基の活性化に依って、シアン酸エステルを形成させてもよい。活性化糖類をこのように直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介してキャリアタンパク質のアミノ基にカップリングさせることができる。例えば、シアン酸エステルをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨまたはＡＨ）とカップリングさせることができ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質キャリアのカルボキシル基を介したカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応によってキャリアタンパク質にコンジュゲート化する。そのようなコンジュゲートはＰＣＴ公開出願の国際公開公報第９３／１５７６０号（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ならびに国際公開公報第９５／０８３４８号および国際公開公報第９６／２９０９４号に記述されている。Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256も参照されたい。
【０００４】
一般に、以下のタイプのタンパク質キャリアの化学基を、カップリング／コンジュゲート化に使用することができる：
（Ａ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたアミノ基にコンジュゲート化できる、カルボキシル（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸による）；
（Ｂ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたカルボキシル基にコンジュゲート化できる、アミノ基（例えばリジンによる）；
（Ｃ）スルフヒドリル（例えばシステインによる）；
（Ｄ）ヒドロキシル基（例えばチロシンによる）；
（Ｅ）イミダゾリル基（例えばヒスチジンによる）；
（Ｆ）グアニジル基（例えばアルギニンによる）；および
（Ｇ）インドリル基（例えばトリプトファンによる）。
【０００５】
糖類では、一般に以下の基：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２をカップリングに使用することができる。アルデヒド基は過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当技術分野において公知の異なる処理の後に作出することができる。
【０００６】
直接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ シッフ塩基 ＋ ＮａＣＮＢＨ３ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＮＨ２−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート。
【０００７】
スペーサー（リンカー）を介した間接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２ −−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる）−−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾）−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ハロアセチル化−タンパク質−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−＞ 糖類−−−−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる）−−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾）−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−＞糖類−ＳＨ ＋ ハロアセチル化−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート。
【０００８】
本明細においてＥＤＡＣを記載する場合、任意の適切なカルボジイミドを代わりに使用できることに留意されたい。
【０００９】
見て分かるとおり、カルボジイミド化学反応（例えば、ＥＤＡＣを用いる）は、天然に存在しうるかまたは誘導体化によって容易に挿入されうる糖類および／またはタンパク質の基を利用するので、コンジュゲート化反応にとって非常に都合が良い。それはまた、好都合なことに、ペプチド結合を通じて成分を連結する。
【００１０】
カルボジイミド（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）は、アレン構造を有する不飽和化合物である（Nakajima and Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6 :123-130；Hoare and Koshland 1967 JBC 242:2447-2453）。この化合物はその反応ｐＨ（４．５〜６．５）で比較的不安定であり、それ故に糖類／タンパク質／カルボジイミドコンジュゲート化反応の全成分は当技術分野において一緒に加えられる傾向がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、コンジュゲート化の対象となる糖類およびタンパク質の性質に応じ、ある種の反応成分を混合物にゆっくり加えることで、ワクチン用に最終コンジュゲートの良好な特性を達成できることを見出した。そうすることで、コンジュゲート中の糖類収量、コンジュゲートの滅菌濾過性、コンジュゲート化の良好な制御、再現性の容易さ、および／または成分内架橋の阻止などの、１以上の利益／改善を実現することができる。
【００１２】
したがって、１つの実施形態ではカルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
水性媒体中で糖類およびタンパク質をコンジュゲート化できる限り、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。１つの実施形態では、カルボジイミドはＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）［ＥＤＣとしても知られる］であることができ、またはそれはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドであることができる。任意の実施態様において本明細書でＥＤＡＣまたはＥＤＣに言及する場合、任意のカルボジイミドを代わりに使用できることが想定される。
【００１４】
本明細書の全体を通して「糖類」という用語は、多糖またはオリゴ糖を示すことができ、この両者を含む。それはリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を示すことができる。使用前に、多糖（細菌多糖などの）を供給源の菌株（例えば、細菌の）から単離してもよく、または供給源の菌株から単離し、公知の方法（例えば欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号；Shousun Chen Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)を参照のこと）により、例えばマイクロ流動化によりある程度までサイズ分類（sized）してもよい。多糖は多糖サンプルの粘性を低減するためおよび／またはコンジュゲート化生成物の濾過性を向上するためサイズ分類されてもよい。オリゴ糖は反復単位の数が少なく（典型的には５〜３０の反復単位）、典型的には加水分解された多糖である。
【００１５】
「タンパク質キャリア」という用語は、小さなペプチドと大きなポリペプチド（＞１０ｋＤａ）の両者を網羅するよう意図される。明らかに大きなポリペプチドは、何の修飾もなしに反応性アミノ基と反応性カルボキシル基の両者を含む可能性がいっそう高い。
【００１６】
本発明の目的で、「天然の（native）多糖」とは、糖類のサイズを低減することが目的のプロセスに供されていない糖類をいう。多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減るようになることがある。そのような糖類は依然として天然である。多糖がサイズ分類技術に供されている場合に限り、多糖は天然であると見なされないであろう。
【００１７】
本発明の目的で、「×２倍以下にサイズ分類される」とは、糖類のサイズを減らすが天然多糖のサイズの半分以上のサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供されることを意味する。×３、×４などは同じように解釈されるべきである。すなわち、多糖のサイズを減らすが天然多糖のサイズの３分の１以上、４分の１以上などのサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供される。
【００１８】
最終成分の全アリコートの添加のための方法ステップ（ｂ）における３５秒間〜６時間は、５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間とすることができる。それは１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、３０分間〜２時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間であってもよい。この時間は、コンジュゲート化される正確な糖類およびタンパク質に準じて調整することができる。
【００１９】
１つの実施形態では、（例えば、カルボジイミド、糖類またはタンパク質の）最終成分のアリコートを前記時間の間に一定速度で反応混合物に添加する（これは一定速度で作動するポンプを用いて達成されることが好都合である）。または、それは前記時間にわたって段階的に添加されてもよい。これはさまざまな形で行うことができるが、一般にアリコートの一部分が前記時間の全体を通して添加されるべきである。例えば、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加してもよい。例えば、ｍＬまたはｍｇで測定されるアリコート「ａ」の総量が前記時間の全体を通して４〜１００の段階（「ｓ」）において添加されてもよい。１つの実施形態では、均一な量（ａ／ｓ）が全ての段階で導入されるように、前記段階は設定される。１つの実施形態では、前記段階は前記時間「ｐ」の全体を通して（秒で）均一に間隔をあけられる。すなわち、１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われうる。ステップ（ｂ）において添加される最終成分のアリコートの量は、所望の時間内での反応物へのアリコートの添加の容易さという観点で調整することができる。カルボジイミドは水溶液（反応物に添加される前に典型的にはｐＨ７．５に緩衝化されている）としてまたは固体粉末（ＥＤＡＣは例えば、水媒体に高溶解性である）として添加されてもよい。もちろん、カルボジイミドが反応物に添加される最後の成分である場合（状況ＩＩＩ、ステップ（ｂ））、ゆっくりと溶解するカルボジイミドが使用されてもよく、したがって粉末のアリコート全体が反応物に一度に添加されるが、しかしそれは、アリコートが反応に利用可能とされる所望の時間と一致する速度で溶解する。
【００２０】
タンパク質および／または糖類がアミノまたはカルボキシル基を持っていない（あるいはこれらのうちの一方を持っているにすぎない）場合、それを誘導体化して、一方をそれに与えても（またはそれがまだ持っていないもう一方をそれに与えても）よい。例えば、反応性ヒドロキシル基のみを含む糖類（例えば、髄膜炎菌（meningococcal）血清型Ａ莢膜糖類）の場合、そのような基はＥＤＡＣ縮合を実行できるように、アミノまたはカルボキシル基に対する誘導体化に使用されるはずである。これは反復サブユニット内で行われてもよく、または糖類分子の末端にのみ存在する基であってもよい。
【００２１】
誘導体化が行われる場合、その成分を部分的にだけ誘導体化することが有益でありうることに留意されたい。反復サブユニットを有する糖類の場合、標的エピトープは各反復の中に存在しうる。それ故に、部分的誘導体化が行われる場合（この場合、例えば標的とされる反応性基の０．５〜２０、１〜１５、３〜１２、または５〜１０％が実際に誘導体化されることを意味する）、これはエピトープの大部分を保存しているという利点、および過度の架橋結合を阻止するという利点を有しうる。
【００２２】
糖類またはタンパク質がアミノまたはカルボキシル基だけを既に持っている場合（例えば、本来、カルボキシル基を持っているが、アミノ基を持っていないチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類）、誘導体化を行って、もう一方の種の基（すなわち、Ｖｉの場合にはアミノ基）をそれに与えることができる。しかしながら、誘導体化は部分的でありうるので、この行為はＩ型からＩＩＩ型までの本発明の好ましい反応を変えうることに留意されたい。例えば、Ｖｉ糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含んだタンパク質キャリアにコンジュゲート化される場合、状況Ｉではステップ（ｂ）においてゆっくりタンパク質のアリコートを添加する。Ｖｉ糖類のカルボキシル基がアミノ基で部分的に誘導体化されている場合、それはカルボキシル基とアミノ基の両者を持っているはずであり、したがってステップ（ｂ）においてゆっくりカルボジイミドのアリコートを添加する状況ＩＩＩが最も適切になる。
【００２３】
誘導体化はヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介して行われてもよい。それは糖類−タンパク質コンジュゲート化ステップについて上述したのと同様の化学反応（例えば、ＣＤＡＰまたはカルボジイミド化学反応）によって行われてもよい。リンカーは４〜２０、４〜１２、または５〜１０炭素原子を有することができる。それは２つの反応性アミノ基、２つの反応性カルボキシル基、または各々の１つ（例えば、ヘキサンジアミン、６−アミノカプロン酸、またはアジピン酸ジヒドラジド）を有することができる。典型的には、誘導体化は、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる。これにより最小限の成分内架橋結合で誘導体化を行うことが可能になる（これはそれ以外には、例えば、糖類のカルボキシル基がカルボジイミド縮合によってアミノ基で誘導体化されている場合に可能であるかもしれない）。過剰なリンカーはダイアフィルトレーション法などの技術を用いて容易に除去される。
【００２４】
１つの実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、ＣＤＡＰ化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。別の実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。さらなる実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて−例えば、部分的誘導体化ステップにおいてカルボジイミドは０．０１〜０．５、０．０１５〜０．１、０．０２〜０．０７５、または０．０２５〜０．０５ ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類で存在する）部分的に誘導体化されている。
【００２５】
コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートは（本発明の反応のステップ（ａ）または（ｂ）にあろうとも）、０．０１〜３、０．０５〜２、または０．０９〜１ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類（例えば０．０７〜０．２５、または０．１〜０．２ ｍｇ／ｍｇ糖類）である。これらの数（および本明細書に挙げるカルボジイミドの量）はカルボジイミドであるＥＤＡＣに関して計算されるが、これらの数はその他任意のカルボジイミドが使用される場合、その範囲の数に（その他のカルボジイミドの分子量）／（ＥＤＡＣの分子量）を乗じることによって適宜調整されてもよい。
【００２６】
一般に、糖類は本発明の方法のなかでステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。例えば、オリゴ糖の場合にはいっそう高い濃度が必要とされるが、大きな多糖の場合にはずっと低い濃度がいっそう適しているであろう。それがアミノまたはカルボキシル基で誘導体化されているうちの高い側（high end）に向けられるならば、任意の架橋結合の可能性を減らすため、いっそう低い濃度が適しているかもしれない。タンパク質キャリアはステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。
【００２７】
本発明の方法のなかでタンパク質キャリアと糖類との当初比率は、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）とすることができる。この場合もやはり、これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。
【００２８】
塩条件（例えば、ＮａＣｌ）も糖類／タンパク質の性質によって変えられてもよい。通常、およそ０．２Ｍ ＮａＣｌが本発明の方法のステップ（ｂ）において存在してもよいが、これは０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍであってもよい。
【００２９】
本発明の方法のステップ（ｂ）におけるｐＨという観点で、反応ｐＨは、カルボジイミドが活性化される任意のｐＨ、例えば、ｐＨ ４．５〜６．５、ｐＨ ４．７〜６．０、またはｐＨ ５〜５．５であってよい。このｐＨは典型的には、必要に応じて酸／塩基の添加により反応の全体を通して維持される。ＥＤＡＣは、通常、ｐＨ ７．５で安定であるけれども、コンジュゲート化がさらに高いｐＨで行われる必要がある場合、反応中間体を安定に保つことが知られている化合物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）がステップ（ｂ）において反応物の中に存在してもよく、その場合にはステップ（ｂ）における反応ｐＨはｐＨ ４．５〜７．５に維持されうる。
【００３０】
本発明の方法のステップ（ｂ）の間の反応温度は、４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃、または２２〜２７℃とすることができ、典型的には反応の全体を通して維持される。
【００３１】
本発明の方法のなかで、ステップ（ｂ）においてアリコート全体が添加されたら、反応は典型的には、さらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間、または１〜３時間、例えば１０〜１２０、１０〜８０、１０〜５０、２０〜４０、または２５〜３０分間維持される。反応が完了したら、ｐＨを７．５〜９に（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが存在する場合にはこの高い方の側に）調整して、カルボジイミドの安定なｐＨ域に戻す。
【００３２】
コンジュゲート化されたら、糖質−タンパク質コンジュゲートを未反応成分、遊離糖類などから、そのコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラム（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入することによって精製することができる。これは典型的には、２〜８℃で行われる。コンジュゲートを滅菌濾過し、その後で保存してもよい。最終的に、有効用量（例えば１〜２０、２〜１５、または３〜１０μｇ糖類／用量）の糖質−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤（例えば塩またはアジュバント）とともに製剤化して、免疫原性組成物またはワクチンを製造することができる。
【００３３】
本発明の糖類に関して、ウイルス、真菌、細菌または真核生物供給源のいずれの糖類が本発明の方法を用いてコンジュゲート化されてもよい。それはチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類、またはＶｉ以外の糖類であってもよい。それはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型由来の莢膜糖類Ｈｉｂであってもよく、またはＨｉｂ以外の糖類であってもよい。１つの実施形態では、糖類は細菌莢膜糖類であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ（ＭｅｎＡ）、Ｂ（ＭｅｎＢ）、Ｃ（ＭｅｎＣ）、Ｗ１３５（ＭｅｎＷ）もしくはＹ（ＭｅｎＹ）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである。
【００３４】
糖類の重量平均分子量は１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００とすることができる。本明細書において糖類の分子量または平均分子量は、コンジュゲート化の前に測定された糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）をいい、ＭＡＬＬＳによって測定される。ＭＡＬＬＳ技術は当技術分野において周知であり、典型的には、実施例２に記述されているように行われる。糖類のＭＡＬＬＳ分析の場合、２つのカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）が併せて使用されてもよく、糖類は水の中に溶出される。糖類は光散乱検出器（例えば４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（例えばＰ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。１つの実施形態では、糖類の多分散性は１〜１．５、１〜１．３、１〜１．２、１〜１．１または１〜１．０５であり、キャリアタンパク質とのコンジュゲート化の後、コンジュゲートの多分散性は１．０〜２．５、１．０〜２．０、１．０〜１．５、１．０〜１．２、１．５〜２．５、１．７〜２．２または１．５〜２．０である。多分散性測定は全てＭＡＬＬＳによる。
【００３５】
糖類は天然の多糖であっても、または２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍もしくは２０倍以下にサイズ分類されてもよい（例えばマイクロ流動化により［例えばＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器により］もしくはその他公知の技術［例えば加熱法、化学法、酸化法、超音波処理法］により）。オリゴ糖がさらに実質的にサイズ分類されていてもよい［例えば公知の加熱法、化学法、または酸化法により］。
【００３６】
これらの糖類の大部分の構造は公知である（それ故にそれらがカルボジイミド化学反応のための任意のアミノもしくはカルボキシル基、またはアミノもしくはカルボキシル基で誘導体化できるその他任意の反応性基をもともと有するかどうかは公知である）（下記表参照）。
【表１】
【００３７】
糖類は細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖（上記表参照）であっても、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitides）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来してもよい。ＬＯＳは髄膜炎菌（meningococcal）免疫型Ｌ２、Ｌ３またはＬ１０であってもよい。ＬＯＳはその脂質Ａ成分のアルカリ処理によって解毒されてもよい。
【００３８】
１つの実施形態では、ＭｅｎＡ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−３の位置に少なくとも存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＣ莢膜糖類は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の（α２→９）−連結ＮｅｕＮＡｃ反復単位が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−８の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＷ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−９の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＹ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の７位および／または９位に存在している。Ｏ−アセチル化の割合は、Ｏ−アセチル化を有する反復単位の割合をいう。これはコンジュゲート化する前におよび／またはコンジュゲート化後に糖類において測定することができる。
【００３９】
タンパク質キャリアは任意のペプチドまたはタンパク質とすることができる。それは１以上のＴヘルパーエピトープを含んでもよい。本発明の１つの実施形態では、タンパク質キャリアは以下のもの：ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される。タンパク質キャリアは、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドフラグメントＣ、破傷風毒素の無毒性突然変異体［ＴＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい］、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素の他の無毒性突然変異体［例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ １９７、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ ４５（Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973）；ＣＲＭ ９、ＣＲＭ ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ １０３およびＣＲＭ１０７ならびにNicholls and ＹouleによりGenetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992のなかで記述されている他の突然変異；欠失あるいは１４８位のＧｌｕ（Ｇｌｕ−１４８）のＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの突然変異および／または１５８位のＡｌａ（Ａｌａ １５８）のＧｌｙへの突然変異ならびに米国特許第４７０９０１７号もしくは米国特許第４９５０７４０号に開示されている他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の突然変異ならびに米国特許第５９１７０１７号または米国特許第６４５５６７３号に開示されている他の突然変異；あるいは米国特許第５８４３７１１号に開示されているフラグメント］（ＤＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい）、肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ（Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌（meningococcal）外膜タンパク質−通常は髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂから抽出される−欧州特許
第０３７２５０１号）、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（国際公開公報第９３／１７７１２号、国際公開公報第９４／０３２０８号）、百日咳タンパク質（国際公開公報第９８／５８６６８号、欧州特許第０４７１１７７号）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン（国際公開公報第９１／０１１４６号）、Ｎ１９タンパク質（Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7）のような種々の病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824）、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ（国際公開公報第０２／０９１９９８号）、鉄取込みタンパク質（iron uptake proteins）（国際公開公報第０１／７２３３７号）、偏性嫌気性有芽胞グラム陽性桿菌（C. difficile）の毒素ＡもしくはＢ（国際公開公報第００／６１７６１号）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（欧州特許第５９４６１０号および国際公開公報第００／５６３６０号）、肺炎球菌のＰｈｔＡ（国際公開公報第９８／１８９３０号、Ｓｐ３６ともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＤ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＢ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂともいわれる）、またはＰｈｔＥ（国際公開公報第００／３０２９９号に開示されており、ＢＶＨ−３といわれる）であってもよい。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法により取得することができるまたは取得された糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート（または免疫原性組成物もしくはワクチン）が提供される。従って、本発明の方法は、本発明のコンジュゲート化方法を行い、得られた糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートを免疫原性組成物またはワクチン中に製剤化する（例えばコンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化することにより）ことによる、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの作製方法に包含され得る。
【００４１】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用、および有効用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法がさらに提供される。前記の使用または方法は、疾患が以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌(Group B Streptococcus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものでありうる。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物はＤＴＰａまたはＤＴＰｗワクチン（例えばＤＴ、ＴＴ、および全細胞百日咳（Ｐｗ）ワクチンまたは無細胞百日咳（Ｐａ）ワクチン（例えば百日咳トキソイド、ＦＨＡ、ペルタクチン、ならびに任意で、アグルチノーゲン２および３を含む）のいずれかを含有するもの）を含んでもよい。そのような組合せにはＢ型肝炎に対するワクチンが含まれてもよい（例えばそれには、リン酸アルミニウムに吸着されていてもよいＢ型肝炎表面抗原［ＨｅｐＢ］が含まれてもよい）。１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つ、２つもしくは全ての糖類コンジュゲートが本発明の方法によって作製されているＨｉｂ、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂ、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲート、またはＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲートを含む。
【００４３】
本発明の免疫原性組成物は任意で、麻疹および／または流行性耳下腺炎および／または風疹および／または水痘により引き起こされる疾患に対する防御を与える追加のウイルス抗原を含む。例えば、本発明の免疫原性組成物は、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹（ＭＭＲ）または麻疹、流行性耳下腺炎、風疹および水痘（ＭＭＲＶ）の抗原を含有する。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は、組成物の中に存在している髄膜炎菌（meningococcal）のおよび／またはＨｉｂの糖類コンジュゲートと同じ容器の中に存在していてもよい。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は凍結乾燥されている。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの抗原をさらに含む。この抗原は任意で、欧州特許第３０１９９２号、国際公開公報第０１／０９３５０号、国際公開公報第０４／１４４１７号、国際公開公報第０４／１４４１８号および国際公開公報第０４／１４４１９号に記述の髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの外膜小胞調製物である。
【００４５】
一般に、本発明の免疫原性組成物は、糖類０．１〜２０μｇ、２〜１０μｇ、２〜６μｇまたは４〜７μｇの各糖類コンジュゲートの用量を含むことができる。
【００４６】
「およそ」または「約」は、本発明の目的で所与の数量の１０％くらいの範囲内と定義される。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はｐＨ ７．０〜８．０、ｐＨ ７．２〜７．６またはおよそもしくは正確にｐＨ ７．４に調整されもしくはそれらのｐＨで緩衝化され、またはそれらのｐＨに調整されている。
【００４８】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは任意で、安定化剤、例えばスクロースまたはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で凍結乾燥されてもよい。
【００４９】
任意で、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含んでもよい。適当なアジュバントはアルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875によって記述されているものなどの免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
髄膜炎菌（N. meningitidis）またはＨｉｂＭｅｎの組合せの場合、どのアルミニウム塩アジュバントもまたはどのアジュバントも全く使用しないことが好都合であるかもしれない。
【００５１】
全ての免疫原性組成物またはワクチンと同様に、免疫学的に有効な量の免疫原は実験的に決定されなければならない。考慮されるべき要因としては、免疫原性、免疫原がアジュバントまたはキャリアタンパク質もしくはその他のキャリアと複合体形成されるかまたはそれらに共有結合されるか否か、投与経路、および投与される免疫量の数が挙げられる。
【００５２】
本発明の医薬組成物またはワクチンの中にさまざまな濃度で活性な作用物質が存在していてもよい。典型的には、この物質の最小濃度はその目的の用途を達成するのに必要な量であり、その一方で最大濃度は、溶解状態のままでいられるか、または最初の混合物のなかで均一に懸濁されていられる最大量である。例えば、治療薬の最小量は任意で、単回の治療的に有効な投与量を与えられるものであってもよい。生物活性物質の場合、最小濃度は再構成時の生物活性に必要な量であり、最大濃度は均一な懸濁液を維持することができないポイントである。単回用量単位の場合には、その量は単回の治療的投与のものである。一般に、各用量はタンパク質抗原を１〜１００μｇ、任意で５〜５０μｇまたは５〜２５μｇ含むものと予想される。例えば、細菌糖類の用量はコンジュゲート中にて糖類１０〜２０μｇ、５〜１０μｇ、２．５〜５μｇまたは１〜２．５μｇである。
【００５３】
本発明のワクチン調製物は、全身経路または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することによって、感染を受けやすい哺乳動物（例えばヒト患者）を防御するためにまたは治療するために使用することができる。ヒト患者は任意で、乳児（月齢１２ヵ月未満の）、幼児（月齢１２〜２４ヵ月、１２〜１６ヵ月もしくは１２−１４ヵ月）、小児（２〜１０歳、３〜８歳もしくは３〜５歳）、青年（１２〜２１歳、１４〜２０歳もしくは１５〜１９歳）または成人であってもよい。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下の経路による注入、または口腔／消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与による注入を挙げることができる。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻腔内投与が好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をいっそう効果的に予防し、したがってその最も初期段階で感染を弱められるからである）。本発明のワクチンは単回用量として投与することができるが、その成分を同時にまたは異なった時間に共投与することもできる（例えば、ワクチンの中に糖類が存在する場合、相互に免疫応答の最適な協調性を得るため、これらを同時にまたは細菌タンパク質ワクチンの投与から１〜２週間後に別々に投与することができる）。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、ウイルス抗原をＩＤ（皮内）投与することができ、一方で細菌タンパク質をＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻腔内）投与することができる。糖類が存在する場合、それらをＩＭ（またはＩＤ）投与することができ、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンを初回投与ではＩＭ投与、および追加投与ではＩＮ投与することができる。
【００５４】
ワクチン調製物はVaccine Design (The subunit and adjuvant approach (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)に広く記述されている。リポソーム内の封入はFullerton、米国特許第４，２３５，８７７号に記述されている。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって作製された本発明のＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類を、本発明によって作製されていないＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ、ならびに製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法である。
【００５６】
本発明のチフス菌（Salmonella typhi）免疫原性組成物／ワクチン
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、本発明の方法により作製されたＶｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む。Ｖｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートは、ヒト用量あたり０.５〜１５、１〜１０、２.０〜７.５または２.５〜５ μｇのＶｉ糖類を含んでいてもよい。
【００５７】
コンジュゲート中のチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類は、登録された製品であるＴｙｐｈｅｒｉｘ（登録商標）（GlaxoSmithKline Biologicals s.a.）中のＶｉ糖類と同じであってもよく、これは欧州特許第１１０７７８７号に記載されている。１つの実施形態では、本発明のＶｉ糖類コンジュゲートは、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、または水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、Ｖｉ糖類コンジュゲートは、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００５８】
１つの態様では、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、Ｈｉｂ莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含む。これは、本発明の方法により、または当技術分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えばこれは、GlaxoSmithKline Biologicals s.a.のＨｉｂｅｒｉｘ（登録商標）製品であってもよい。インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Ｈｉｂ）ＰＲＰ多糖のＴＴとの共有結合は、Chuら（Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256）により開発されたカップリング化学反応により行うことができる。ＣＮＢｒを添加し、ｐＨ１０．５で６分間インキュベートすることにより、Ｈｉｂ ＰＲＰ多糖を活性化する。ｐＨをｐＨ８．７５に下げ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、インキュベーションをさらに９０分間続ける。１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド縮合により、活性化されたＰＲＰを、例えば、精製された破傷風トキソイドにカップリングすることができる。最終比率０．６ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、活性化されたＰＲＰにＥＤＡＣを添加する。ｐＨを５．０に調整し、２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、精製された破傷風トキソイドを添加する。得られた溶液を穏やかに撹拌しながら３日間放置する。０．４５μｍのメンブレンを通した濾過の後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００ＨＲ（Pharmacia, Sweden）カラムにてコンジュゲートを精製する。
【００５９】
Ｈｉｂ抗原コンジュゲートは、任意で国際公開公報第９７／００６９７号に記載されているようにリン酸アルミニウムに吸着されていても、または国際公開公報第０２／００２４９号に記載されているように吸着されていなくても、または吸着させるための特別な工程に付されていなくてもよい。本明細書において「アルミニウムアジュバント塩に吸着されていない」抗原は、新鮮なアルミニウムアジュバント塩上での抗原の発現または特定の吸着ステップが、組成物を製剤化する方法に含まれないことを意味する。１つの実施形態では、Ｈｉｂは、国際公開公報第０２／００２４９号に記載されているように、低用量（例えば１〜６μｇ、２〜４μｇまたは約もしくは正確に２．５μｇの糖類）で存在する。
【００６０】
１つの実施形態では、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートは、Ｖｉ糖類コンジュゲートの糖類用量よりも低い糖類用量で存在する。例えば、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートは、ヒト用量（通常０．５ ｍＬ）あたり０．１〜９、１〜５、または２〜３ μｇの糖類を含んでいてもよい。Ｈｉｂ糖類は、本明細書に記載される任意のタンパク質キャリア、例えばＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、プロテインＤ、ＯＭＰＣおよびＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される１つにコンジュゲート化されていてもよい。１つの態様では、同一のタンパク質キャリアが、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートおよびＶｉ糖類コンジュゲート中に（例えば独立に）使用される（例えばＴＴ）。Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率は、１:５〜５:１（ｗ／ｗ）、例えば１:１〜１:４、１:２〜１:３．５または約１:３（ｗ／ｗ）であってもよい。Ｈｉｂ糖類は、典型的には二官能性（ホモまたはヘテロ二官能性）であるリンカーを介してタンパク質キャリアにコンジュゲート化されていてもよい。リンカーは、２つの反応性アミノ基（各末端に１つ）、または２つの反応性カルボン酸基、または一方の末端に反応性アミノ基および他方の末端に反応性カルボン酸基を有していてもよい。リンカーは４〜１２炭素原子を有していてもよい。１つの態様では、リンカーはＡＤＨである。Ｈｉｂ糖類は、ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰを用いてタンパク質キャリアまたはリンカーにコンジュゲート化されていてもよい。タンパク質キャリアは、カルボジイミド化学反応、任意でＥＤＡＣ化学反応を用いてＨｉｂ糖類またはリンカーにコンジュゲート化されていてもよい。本発明のＶｉコンジュゲートを使用することができる、Ｖｉおよび／またはＨｉｂコンジュゲート抗原を含むさらなるワクチンの組み合わせは、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２１０、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６１８８、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６９、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６８、またはＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２２０に記載されている。
【００６１】
さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物またはワクチン中のＶｉまたはＶｉ ＋ Ｈｉｂコンジュゲートはさらなる抗原と混合されている。例えば以下のリストからの１以上を、単独でまたは任意に組み合わせて添加することができる（以下にさらに詳細に記載する）：ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチン、Ｂ型肝炎表面抗原などのＢ型肝炎ワクチン／抗原(任意でリン酸アルミニウムに吸着されている）、不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物などのＡ型肝炎ワクチン／抗原、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物（任意で１、２および３型を含む）などのポリオウイルスワクチン／抗原、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート［ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである］、ＲＴＳ，Ｓなどのマラリアワクチン／抗原。
【００６２】
さらなる態様では、ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートは、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、共凍結乾燥（co-lyophilised）されている。凍結乾燥製剤は、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート（ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである）をさらに含んでいてもよい。本発明の凍結乾燥組成物は、投与前に水性媒体により再構成されてもよい。水性媒体は緩衝化されていてもよい。水性媒体は、例えば上に挙げられ、凍結乾燥組成物中にまだ含まれていないさらなる抗原［例えば以下のリストからの１以上が、単独でまたは任意の組み合わせで（以下にさらに詳細に記載する）水性媒体に存在していてもよい：ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチン、Ｂ型肝炎表面抗原などのＢ型肝炎ワクチン／抗原(任意でリン酸アルミニウムに吸着されている）、不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物などのＡ型肝炎ワクチン／抗原、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物（任意で１、２および３型を含む）などのポリオウイルスワクチン／抗原、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート［ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである］、ＲＴＳ，Ｓなどのマラリアワクチン／抗原)を有していてもよい。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたは両方の混合物を含んでいてもよい。あるいは、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、アルミニウム塩を含んでいなくても、またはアジュバント化されていなくてもよい。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ｐＨ７．０〜８．０に緩衝化されていてもよい。
【００６４】
本発明のさらなる態様では、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、チフス菌（Salmonella typhi）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）により引き起こされる疾患に対する防御を宿主に付与するための２種の多価免疫原性組成物を含む同時または連続投与のためのワクチンキットが提供され、前記キットは：
破傷風トキソイド（ＴＴ）、
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、および
全細胞または無細胞百日咳成分（ＰｗまたはＰａ）
を含む第１容器と、
本発明の免疫原性組成物またはワクチンを含む第２容器
とを含む。第１容器は、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、Ｂ型肝炎表面抗原をさらに含んでいてもよい。第１容器または第２容器は、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）をさらに含んでいてもよい。
【００６５】
疾患の予防または治療のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物またはワクチンあるいはキットの使用も提供され、これは、有効用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンをそのような処置が必要な患者に投与するステップを含む疾患の予防または治療方法である。本発明の使用または方法は、以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）からなるリストより選択される１以上の細菌により引き起こされる疾患に関するものであってもよい。
【００６６】
本発明の組成物／ワクチンに追加するさらなる抗原／ワクチン
ＤＴＰワクチン／抗原成分
ＤＴＰワクチンは、ジフテリア、破傷風および百日咳（B. pertussis）疾患を予防または治療するためのよく知られているワクチンである。本発明のワクチンは、ジフテリア、破傷風および／または百日咳成分を含んでいてもよい。
【００６７】
ジフテリア抗原は、典型的にはジフテリアトキソイドである。ジフテリアトキソイド（ＤＴ）の調製物は多く報告されている。任意の適切なジフテリアトキソイドを使用することができる。例えば、ＤＴは、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の培養物からの毒素を精製し、次いで化学的に解毒することにより製造することができるが、代わりに、組み換え、または遺伝子操作により解毒された毒素の類似体（例えば、ＣＲＭ１９７、または米国特許第４,７０９,０１７号、米国特許第５,８４３,７１１号、米国特許第５,６０１,８２７号、および米国特許第５,９１７,０１７号に記載されているような他の突然変異体）を精製することにより製造する。１つの実施形態では、本発明のジフテリアトキソイドは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のジフテリアトキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ジフテリアトキソイドは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００６８】
本発明の破傷風抗原は、典型的には破傷風トキソイドである。破傷風トキソイド（ＴＴ）の調製方法は当技術分野において周知である。１つの実施形態では、ＴＴは、破傷風菌（Clostridium tetani）の培養物から毒素を精製し、次いで化学的に解毒することにより製造されるが、代わりに、組み換え、または遺伝子操作により解毒された毒素の類似体（例えば、欧州特許第２０９２８１号に記載されているような）を精製することにより製造される。任意の適切な破傷風トキソイドを使用することができる。「破傷風トキソイド」には、全長タンパク質の免疫原性フラグメント（例えばＣフラグメント−欧州特許第４７８６０２号を参照）が含まれ得る。１つの実施形態では、本発明の破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の破傷風トキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００６９】
本発明の百日咳成分は、精製された百日咳抗原を使用する無細胞（Ｐａ）であっても、死滅全細胞百日咳菌を百日咳成分として使用する全細胞（Ｐｗ）のどちらであってもよい。Ｐｗは、水銀を使用しない方法を含むいくつかの方法により不活化されていてもよい。このような方法には、熱不活化（例えば５５〜６５℃または５６〜６０℃、５〜６０分間または１０〜３０分間、例えば６０℃で３０分間）、ホルムアルデヒド不活化（例えば３７℃で０．１％、２４時間）、グルタルアルデヒド不活化（例えば室温で０．０５％、１０分間）、アセトン−I不活化（例えば室温で３回処理）およびアセトン−II不活化（例えば室温で３回処理および３７℃で４回処理）（例えばGupta et al., 1987, J. Biol. Stand. 15:87; Gupta et al., 1986, Vaccine, 4:185を参照）が含まれ得る。本発明に適切な死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）（Ｐｗ）の調製方法は、国際公開公報第９３／２４１４８号に開示されており、これはＤＴ-ＴＴ-Ｐｗ-ＨｅｐＢワクチンの製造に適切な製剤化方法である。チオメルサールは、過去において死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）の調製に使用されてきた。しかしながら、１つの実施形態では、本発明のワクチンの製剤化方法において、チオマーサルは使用されない。
【００７０】
典型的には、５〜５０ ＩＯＵ、７〜４０ ＩＯＵ、９〜３５ ＩＯＵ、１１〜３０ ＩＯＵ、１３〜２５ ＩＯＵ、１５〜２１ ＩＯＵまたは約もしくは正確に２０ ＩＯＵのＰｗ用量が使用される。
無細胞Ｐａワクチンも周知であり、以下のものからの２以上の抗原を含んでいてもよい：百日咳トキソイド［または公知の百日咳毒素の解毒化された遺伝子突然変異体］（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン（ＰＲＮ）、アグルチノーゲン２および３。１つの実施形態では、ＰａワクチンはＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮを含む。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明の百日咳成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の百日咳成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、百日咳成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００７２】
Ｂ型肝炎抗原／ワクチン
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の調製は、多数報告されている。例えば、Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54:125、Gregg et al., 1987, Biotechnology 5:479、欧州特許第０２２６８４６号、欧州特許第０２９９１０８号を参照されたい。ＨＢｓＡｇは以下のように調製することができる。一つの方法は、多量のＨＢｓＡｇは肝臓において合成されＨＢＶ感染中血流中に放出されるため、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子形態の抗原を精製することを含む。別の方法は、組み換えDNA法によりタンパク質を発現させることを含む。ＨＢｓＡｇは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母、ピキア属、昆虫細胞（例えばＨｉ５）または哺乳動物細胞において発現させることにより調製することができる。ＨＢｓＡｇはプラスミドに挿入することができ、またプラスミドからのＨＢｓＡｇの発現を「ＧＡＰＤＨ」プロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来）などのプロモーターにより制御することができる。酵母菌は合成培地中で培養することができる。次に、ＨＢｓＡｇは、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、および限外ろ過などのステップを含む方法により精製することができる。精製後、ＨＢｓＡｇは、（例えばシステインに関する）透析に供することができる。ＨＢｓＡｇは粒子形態で使用することができる。
【００７３】
本明細書において使用される表現「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」は、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示す任意のＨＢｓＡｇ抗原またはその断片を含む。ＨＢｓＡｇ Ｓ抗原の２２６アミノ酸配列（Tiollais et al., 1985, Nature 317:489およびその中の参考文献を参照されたい）に加えて、本明細書に記載されるＨＢｓＡｇは、所望により、上記文献および欧州特許第０２７８９４０号に記載されているように、プレ−Ｓ配列の全部又は一部を含んでいてもよいと理解されるであろう。特に、ＨＢｓＡｇは、ad血清型のＢ型肝炎ウイルス上のオープン・リーディング・フレームに対応するＨＢｓＡｇのＬ−タンパク質の残基１３３〜１４５、その後の残基１７５〜４００を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド（このポリペプチドをＬ*と呼ぶ；欧州特許第０４１４３７４号参照）を含んでいてもよい。本発明の範囲のＨＢｓＡｇは、欧州特許第０１９８４７４号（Endotronics）に記載されるプレＳ１−プレＳ２−Ｓポリペプチドまたは欧州特許第０３０４５７８号（McCormickおよびJones）に記載されるようなこれらの類似体を含んでいてもよい。本明細書に記載されるＨＢｓＡｇは、突然変異体、例えば国際公開公報第９１／１４７０３号またはＥＰ０５１１８５５Ａ１号に記載される「エスケープ突然変異体（escape mutant）」、特に１４５位におけるアミノ酸がグリシンからアルギニンに置換されているＨＢｓＡｇも指し得る。
【００７４】
ＨＢｓＡｇは粒子形態にあってもよい。粒子は例えばＳプロテインを単独で含んでいてもよく、また複合粒子、例えば(Ｌ*、Ｓ）（ここで、Ｌ*は上に定義した通りであり、ＳはＨＢｓＡｇのＳ−プロテインを表す）であってもよい。前記粒子は有利には、ＨＢｓＡｇが酵母中に発現されている形態である。
【００７５】
１つの実施形態では、ＨＢｓＡｇはＥｎｇｅｒｉｘＢ（商標）（GlaxoSmithKline Biologicals S.A.）中に使用される抗原であり、これは国際公開公報第９３／２４１４８号にさらに記載されている。
【００７６】
Ｂ型肝炎表面抗原はリン酸アルミニウムに吸着されていてもよく、これを他の成分と混合する前に行ってもよい（国際公開公報第９３／２４１４８号に記載されている）。Ｂ型肝炎成分は実質的にチオメルサール不含であるべきである（チオメルサールを含まないＨＢｓＡｇの調製方法は欧州特許第１３０７４７３号において既に公開されている）。
【００７７】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ、Ｃ、ＷまたはＹ型抗原
本発明のワクチン／組成物は、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｗ型（ＭｅｎＷ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、および髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｙ型（ＭｅｎＹ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）からなる群より選択される細菌の莢膜糖類をさらに含んでいてもよい。
【００７８】
本発明のワクチンは、髄膜炎菌（N. meningitidis）の異種菌株由来の１以上の抗原を含んでいてもよく、以下に詳述するように、これらは単独で使用されても、または２、３もしくは４成分の任意の組み合わせで使用されてもよい：ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ、またはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹまたはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹまたはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹ。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。コンジュゲートは任意の方法で作製することができ、１つの実施形態では、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２１０、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６１８８、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６９、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６８、またはＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２２０に記載の方法が利用される。コンジュゲートは、本発明のコンジュゲート化方法を用いて作製することができる。
【００８０】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ型ブレブ（bleb）または抗原
本発明のワクチンは、国際公開公報第０１／０９３５０号、国際公開公報第０３／１０５８９０号、国際公開公報第０４／０１４４１７号、または国際公開公報第０４／０１４４１８号に記載されるような外膜小胞またはブレブ（bleb）などのＭｅｎＢ成分またはコンジュゲート化されたＭｅｎＢ莢膜糖類（またはその誘導体）抗原（例えば国際公開公報第９６／４０２３９号参照）を含んでいてもよい。１つの実施形態では、本発明のＭｅｎＢ成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＭｅｎＢ成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ＭｅｎＢ成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、ＭｅｎＢ成分は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００８１】
Ａ型肝炎抗原／ワクチン
Ａ型肝炎に対する防御を与える成分は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のＨＭ−１７５菌株由来の死滅弱毒化ワクチンであるＨａｖｒｉｘ（商標）（GlaxoSmithKline Biologicals S.A.の登録商標）として知られている製品であってもよい（F.E. Andreらによる「Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A」、1980, Prog. Med. Virol. 37:72 およびSmithKline Beecham Biologicals 1991により刊行された製品モノグラフ「Havrix」を参照されたい）。Flehmigら（1990, Prog. Med Virol. 37:56）には、Ａ型肝炎の臨床面、ウイルス学、免疫学および疫学が総論としてまとめられており、またこの一般的なウイルス感染に対するワクチンの開発アプローチについて議論されている。本明細書において使用される表現「ＨＡＶ抗原」または「ＨＡＶワクチン」または「Ａ型肝炎ワクチン」は、ヒトにおいてＨＡＶに対する中和抗体を刺激することができる任意の抗原を指す。１つの実施形態では、ＨＡＶ抗原は不活化弱毒化ウイルス粒子を含み、あるいは別の実施形態では、ＨＡＶ抗原は、組み換えDNA技術により好都合に取得できるＨＡＶカプシドまたはＨＡＶウイルスタンパク質であり得る。１つの実施形態では、本発明のＡ型肝炎成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＡ型肝炎成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、Ａ型肝炎成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、Ａ型肝炎ワクチンを含む本発明の組成物はフェノールを含まない。
【００８２】
マラリア抗原／ワクチン
本発明のワクチンは、マラリア抗原をさらに含んでいてもよい。マラリア抗原は、ＲＴＳ，Ｓ（米国特許第６,３０６,６２５号および欧州特許第０６１４４６５号に記載されるＣＳおよびＨＢｓＡｇのハイブリッドタンパク質）であってもよい。１つの実施形態では、ＲＴＳ，ＳをＨＢｓＡｇの代わりに本発明のワクチン中に使用してもよい。他のマラリア抗原を本発明のワクチン中に使用してもよく、これには、ＣＳタンパク質、ＲＴＳ、ＴＲＡＰ、Ｂ２９９２の１６ｋＤタンパク質、ＡＭＡ-１、ＭＳＰ１が含まれ、任意でＣｐＧが含まれる（国際公開公報第２００６／０２９８８７号、国際公開公報第９８／０５３５５号、国際公開公報第０１／００２３１号）。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明のマラリア抗原は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のマラリア抗原は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、マラリア抗原は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、マラリア抗原は、水中油型乳剤および／または脂質Ａ誘導体（ＭＰＬなど）および／またはステロール（コレステロールなど）および／またはトコール（α-トコフェロールなど）でアジュバント化されている。別の実施形態では、マラリア抗原は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００８４】
ポリオウイルス抗原／ワクチン
本発明のワクチンは、ポリオウイルスに対する防御を与える抗原をさらに含んでいてもよい。１つの実施形態では、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）が含まれる。本発明のワクチン／組成物は、ＩＰＶ１型（例えばＭａｈｏｎｅｙまたはＢｒｕｎｈｉｌｄｅ）またはＩＰＶ２型（例えばＭＥＦ−１）またはＩＰＶ３型（例えばＳａｕｋｅｔｔ）、あるいはＩＰＶ１および２型、またはＩＰＶ１および３型、またはＩＰＶ２および３型、あるいはＩＰＶ１、２および３型を含んでよい。
【００８５】
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）の調製方法は当技術分野において周知である。１つの実施形態では、ＩＰＶはワクチンの分野において一般的であるように１、２および３型を含むべきであり、またホルムアルデヒドで不活化されているソークポリオワクチンであってもよい（例えば、Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287；Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113；Salk et al., 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563；Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255を参照されたい）。
【００８６】
１つの実施形態では、（例えば他の成分と混合する前に）ＩＰＶは吸着されていない。別の実施形態では、本発明のＩＰＶ成分は、（例えば他の成分と混合する前または後に）水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＩＰＶ成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ＩＰＶ成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。吸着されている場合、１以上のＩＰＶ成分は、別個にまたは混合物として一緒に吸着されていてもよい。ＩＰＶは、国際公開公報第２００４／０３９４１７号に記載されているような特別な乾燥工程により安定化されていてもよい。
【００８７】
ポリオウイルスは、細胞培養物中で増殖させることができる。細胞培養物は、サル腎臓由来の継代細胞株であるＶＥＲＯ細胞株またはＰＭＫＣであってよい。ＶＥＲＯ細胞は、好都合にはマイクロキャリア上で培養することができる。ウイルス感染前および感染中のＶＥＲＯ細胞の培養には仔ウシ血清などのウシ由来物質の使用が含まれてよく、またこの物質はウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得るべきである。培養物はラクトアルブミン加水分解物などの物質を含んでいてもよい。増殖させた後、ビリオンは、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技術を用いて精製することができる。患者への投与の前に、ウイルスを不活化しなければならず、またこれはホルムアルデヒドで処理することにより達成することができる。
【００８８】
ウイルスは、個別に増殖、精製、そして不活化でき、次いで組み合わされて、ＩＰＶワクチンに使用するまたは他の抗原に加えるためのバルク混合物（bulk mixture）を与えることができる。
【００８９】
本発明のワクチン中の抗原は、「免疫学的に有効な量」で存在する、すなわちその量の個体への投与が、単回用量においてまたは一連の部分として、疾患の治療または予防に有効である。投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画（例えば追加投与を含む）であってもよい。
【００９０】
入手可能なポリオワクチンの標準的な用量は、不活化ポリオウイルス１型の４０Ｄ抗原ユニット、不活化ポリオウイルス２型の８Ｄ抗原ユニットおよび不活化ポリオウイルス３型の３２Ｄ抗原ユニットを含む（例えばＩｎｆａｎｒｉｘ−ＩＰＶ（商標））。
【００９１】
アジュバント
本発明のワクチン／組成物は、適切なアジュバントなどの製薬上許容される賦形剤を含んでいてもよい。適切なアジュバントには水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、またはアシル化糖の不溶性懸濁液であってもよく、またはカチオンもしくはアニオンで誘導体化された糖類、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、脂質Ａ誘導体（例えば毒性が低減されている）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ［３Ｄ-ＭＰＬ］、ｑｕｉｌ Ａ、サポニン、ＱＳ２１、フロイントの不完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）、メルクアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）、ＡＳ−２（Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、生体接着剤および粘膜付着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、ムラミルペプチドもしくはイミダゾキノロン化合物（例えばイミクアモド（imiquamod）およびそのホモログ）であってもよい。本発明においてアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節剤にはサイトカインが含まれ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）もアジュバントとして使用することができる。
【００９２】
本発明の１つの実施形態では、製剤のアジュバント組成物は、主にＴＨ１型の免疫応答を誘発する。高レベルのＴＨ１型サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）には、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘発を促進する傾向がある。応答が主にＴＨ１型である１つの実施形態においては、ＴＨ１型サイトカインのレベルは、ＴＨ２型サイトカインのレベルを超える程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの総論については、Mosmann and Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:145を参照されたい。
【００９３】
従って、主にＴＨ１応答を促進する適切なアジュバント系には、脂質Ａの誘導体（例えば毒性が低減されている）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはその誘導体、特に３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ-ＭＰＬ）、およびモノホスホリル脂質Ａ、任意で３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、とアルミニウム塩との組み合わせが含まれる。強化された系には、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ、特に国際公開公報第９４／００１５３号に開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ-ＭＰＬとの組み合わせ、または国際公開公報第９６／３３７３９号に開示されているようなＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応性の低い（less reactogenic）組成物が含まれる。水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ-ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第９５／１７２１０号に記載されている。ワクチンは、サポニン（ＱＳ２１でもよい）をさらに含んでいてもよい。製剤は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含んでいてもよい（国際公開公報第９５／１７２１０号）。オリゴヌクレオチドを含む非メチル化ＣｐＧ（国際公開公報第９６／０２５５５号）もＴＨ１応答の優先的誘導剤であり、また本発明における使用に適切である。
【００９４】
本発明のワクチンは、上に特定した１以上のアジュバントの態様の組み合わせを含んでいてもよい。
【００９５】
Ａｌ（ＯＨ）３／ＡｌＰＯ４比率は、０／１１５、２３／９２、６９／４６、４６／６９、９２／２３または１１５／０であり得る。
【００９６】
一方、本発明のワクチンの特定の成分は、アジュバント、特にアルミニウム塩に明確に吸着されていなくてもよい。
【００９７】
ＩＰＶは吸着されていなくてもまたはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＤＴはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＴＴはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＰｗはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたはこれと混合されていてもよく、ＰＲＮはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＦＨＡはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＰＴはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＨＢ（ＨｅｐＢ表面抗原）はＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＨｉｂはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、Ｍｅｎ ＡＣＷＹはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＭｅｎＢはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＶｉはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＨｅｐＡはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよい。
アルミニウム塩に予め吸着されている抗原は、混合前に個別に予め吸着させることができる。別の実施形態では、抗原の混合物は、さらなるアジュバントとの混合の前に予め吸着させてもよい。１つの実施形態では、ＩＰＶは、個別にまたはＩＰＶ１、２および３型の混合物として吸着されてもよい。
【００９８】
「吸着されている抗原」は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超えて吸着されていることを意味すると解される。
【００９９】
本明細書に使用される用語「リン酸アルミニウム」および「水酸化アルミニウム」の意味には、ワクチンをアジュバント化するのに適切な水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの全ての形態が含まれる。例えば、リン酸アルミニウムは不溶性リン酸アルミニウム（非晶質、半結晶性または結晶性）の沈殿物であり得、これは、任意でしかしこれに限定されることなく、可溶性アルミニウム塩およびリン酸塩を混合することにより調製することができる。「水酸化アルミニウム」は不溶性（非晶質、半結晶性または結晶性）水酸化アルミニウムの沈殿物であり得、これは、任意でしかしこれに限定されることなく、アルミニウム塩の溶液を中和することにより調製することができる。商業的供給源から入手可能な水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムゲルの種々形態、例えば、Brenntag Biosector(Denmark)により供給されているＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム、水中の３％懸濁液）およびＡｄｊｕｐｈｏｓ（リン酸アルミニウム、生理食塩水中の２％懸濁液）が特に適切である。
【０１００】
本発明のワクチンの非免疫学的成分
本発明のワクチンは、典型的には、上記の抗原性成分およびアジュバント成分に加えて、１以上の「製薬上許容される担体または賦形剤」を含み、これには、それ自体は組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意の賦形剤が含まれる。適切な賦形剤は、典型的には、大きく、代謝が遅い巨大分子、例えばタンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19:2118）、トレハロース（国際公開公報第００／５６３６５号）、ラクトースおよび脂質凝集物（油滴またはリポソームなど）である。このような担体は当業者に周知である。ワクチンは、水、生理食塩水、グリセロール等などの希釈剤を含んでいてもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在していてもよい。無菌の発熱性物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水が典型的な担体である。製薬上許容される賦形剤についての詳細な議論は参考文献Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472で得られる。
【０１０１】
本発明の組成物は、凍結乾燥されていても、または水性形態、すなわち溶液もしくは懸濁液であってもよい。このタイプの液体製剤は、水性媒体中で再構成する必要なしにパッケージングされた形態から組成物を直接投与することができ、よって注射に理想的である。組成物はバイアル中に存在させることができ、またはこれらは既充填（ready-filled）シリンジ中に存在させることができる。シリンジには針があってもなくてもよい。バイアルが単回用量または複数回用量（例えば２回用量）を含むことができるのに対し、シリンジは単回用量の組成物を含むであろう。
【０１０２】
本発明の液体ワクチンは、凍結乾燥された形態から他のワクチンを再構築するのにも適切である。ワクチンをこのように即座に再構成するのに使用する場合、本発明はキットを提供するが、これは２つのバイアルを含むことができるか、または1つの既充填（ready-filled）シリンジおよび１つのバイアルを含むことができ、このシリンジの内容物が注射前にバイアルの内容物の再構築に使用される。
【０１０３】
本発明のワクチンは、単回用量形態または複数回用量形態（例えば２回用量）にパッケージングすることができる。複数回用量形態については、バイアルは予め充填されたシリンジが好ましい。有効な投与体積は、慣用的に確立することができるが、注射用組成物の典型的なヒト用量は０．５ｍＬの体積を有する。
【０１０４】
１つの実施形態では本発明のワクチンはｐＨ６．０〜８．０を有し、別の実施形態では本発明のワクチンはｐＨ６．３〜６．９、例えば６．６±０．２を有する。ワクチンはこのｐＨに緩衝化されていてもよい。安定なｐＨは緩衝液の使用により維持することができる。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することができる（国際公開公報第０３／００９８６９号）。組成物は無菌であるべきでありおよび／または発熱性物質を含まないべきである。
【０１０５】
本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であってもよい。
【０１０６】
本発明のワクチンは、特に複数回用量形態にパッケージングする場合、抗菌剤を含んでいてもよい。チオメルサールは、ＩＰＶ成分の効力を損失させるので避けるべきである。２-フェノキシエタノールまたはパラベン（メチル、エチル、プロピルパラベン）などの他の抗菌剤を使用することができる。任意の防腐剤を低いレベルで存在させることが好ましい。防腐剤は外から加えられたものでもよく、および／または混合されて組成物を形成するバルク抗原の成分であってもよい（例えば 百日咳抗原中に防腐剤として存在する）。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明のワクチンはチオメルサールを含まないかまたは実質的に含まない。チオメルサールを含まないまたは実質的に含まないとは、ＩＰＶ成分の効力に負の影響を与えるのに十分なチオメルサールが最終製剤中に存在しないことを意味する。例えば、チオメルサールをＰｗまたはＢ型肝炎表面抗原精製工程中に使用する場合、ＩＰＶと混合する前にチオメルサールは実質的に除去されるべきである。最終ワクチン中のチオメルサール含有量は０．０２５μｇ／μｇタンパク質未満、０．０２μｇ／μｇタンパク質未満、０．０１μｇ／μｇタンパク質未満または０．００１μｇ／μｇタンパク質未満、例えば０μｇ／μｇタンパク質であるべきである。１つの実施形態では、チオメルサールはいずれの成分の精製においても添加も使用もされない。例えばＢ型肝炎については欧州特許第１３０７４７３号を、チオメルサールの非存在下で死滅が達成されるＰｗの工程については上記を参照されたい。
【０１０８】
本発明のワクチンは、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてもよい。界面活性剤は一般に、例えば＜０．０１％の低いレベルで存在する。
【０１０９】
本発明のワクチンは、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。組成物は塩化ナトリウムを含んでいてもよい。１つの実施形態では、本発明の組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１００ ｍｇ／ｍＬ（例えば１〜５０ｍｇ／ｍＬ、２〜２０ｍｇ／ｍＬ、５〜１５ｍｇ／ｍＬ）の範囲にあり、さらなる実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は１０±２ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌ例えば約９ｍｇ／ｍＬである。
【０１１０】
本発明のワクチンは一般に緩衝液を含むであろう。リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液が典型的である。
【０１１１】
本発明のワクチンは、抗原が吸着されないようにするために、（例えばリン酸緩衝液を使用することにより）溶液中に遊離したリン酸を含んでいてもよい。本発明の組成物中の遊離したリン酸イオンの濃度は、１つの実施形態では０．１〜１０．０ｍＭ、または別の実施形態では１〜５ｍＭ、またはさらなる実施形態では約２．５ｍＭである。
【０１１２】
ワクチン製剤
１つの実施形態では、本発明のワクチンは、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためのワクチンとして、各抗原の成分の血清防御がヒト被験者の許容割合の基準を超える抗体力価を付与するように製剤化される。これは、集団全体におけるワクチン効力の評価において重要な試験である。それを超えると宿主が抗原に対して血清変換されたとみなされる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、このような力価はＷＨＯなどの機関により公表されている。１つの実施形態では、８０％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、別の実施形態では、９０％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、さらなる実施形態では、９３％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、さらに別の実施態様では、９６〜１００％の統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換される。
【０１１３】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン中で顕著な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原を用いるかによって変化するであろう。一般に、各用量は、１〜１０００μｇの総免疫原、または１〜１００μｇ、または１〜４０μｇ、または１〜５μｇを含むことが予想される。特定のワクチンに最適な量は、被験者における抗体力価および他の応答の監視を含む研究により確定することができる。初回ワクチン接種コースは、例えばＤＴＰ予防接種についてのＷＨＯの勧告に従い１〜２ヶ月の間隔で与えられる、２〜３回のワクチン投与を含み得る。
【０１１４】
本発明のワクチンのパッケージング
本発明のワクチンは、例えばバイアル、シリンジ等の種々のタイプの容器にパッケージングすることができる。複数回投与バイアルは、典型的には、１用量のワクチンを取り出すために消毒針を挿入することができ、針を取り出した時点で再密封する、再密封可能なプラスチックポートを有するであろう。
【０１１５】
ワクチンは、種々の容器（例えば２または３個）に供給することができる。容器の内容物は、宿主に単回注射で投与する前に即座に混合することができ、または異なる部位に同時に投与することができる。ワクチンの用量は、典型的には０．５ｍＬであろう。
【０１１６】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、ポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）および任意で１以上のＢ型肝炎、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）Ｂ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ型、チフス菌（Salmonella typhi）、Ａ型肝炎またはマラリアにより引き起こされる疾患に対する防御を宿主に与えるための２種の多価ワクチンを含むキットが提供される。
【０１１７】
キットは、
（１）（ａ）任意で不活化されたポリオウイルス（ＩＰＶ）、
（ｂ）ジフテリアトキソイド（ＤＴまたはＤ）、
（ｃ）破傷風トキソイド（ＴＴまたはＴ）、
（ｄ）死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）（Ｐｗ）または２以上の無細胞百日咳成分（Ｐａ）（上記）、
（ｅ）任意でＢ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢまたはＨＢ）、
（ｆ）任意でキャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート、
（ｇ）任意でキャリアタンパク質と髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ）または髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ）の莢膜糖類のコンジュゲートのいずれかまたは両方［例えば本発明のコンジュゲート化方法により作製される］
を含む第１容器と、
（２Ａ）（ａ）キャリアタンパク質と髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｗ型（ＭｅｎＷ）および／または髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｙ型（ＭｅｎＹ）の莢膜糖類（本発明の種々のＭｅｎ糖類の組み合わせについては上記参照）のコンジュゲート［例えば本発明のコンジュゲート化方法により作製される］、および
（ｂ）任意でキャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート；または
（２Ｂ）（ａ）キャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート、および
（ｂ）キャリアタンパク質とチフス菌（Salmonella typhi）のＶｉ糖類のコンジュゲート(本発明のコンジュゲート化方法により作製される)
を含む第２容器
を含む。
【０１１８】
容器は、いずれの場合にも、ＨｅｐＡ抗原および／またはＭｅｎＢ抗原および／またはＲＴＳ，Ｓおよび／または肺炎球菌（Streptococcus pneumonia）抗原をさらに含んでいてもよい。
【０１１９】
いずれの場合にも、同一の抗原を両方の容器に存在させるべきではない。
【０１２０】
１つの実施形態では、第１容器成分は、ｂ）、ｃ）、ｄ）に加えて、ａ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｅ）＋ｆ）、ｅ）＋ｇ）、ｆ）＋ｇ）またはｅ）＋ｆ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）、ａ）＋ｆ）、ａ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）＋ｆ）、ａ）＋ｅ）＋ｇ）、ａ）＋ｆ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）＋ｆ）＋ｇ）をさらに有する。
【０１２１】
１つの実施形態では、第１容器のワクチンは液体であってもよく、第２容器のワクチンは液体であっても凍結乾燥されていてもよい（例えばスクロースまたはトレハロースなどの公知の安定化賦形剤の存在下）。
【０１２２】
キットの容器は、別個にパッケージングすることができ、または任意で、一緒にパッケージングすることもできる。１つの実施形態では、キットは２以上の容器内のワクチンを投与するための説明書のリストと共に提供される。
【０１２３】
１つの実施形態では、キット中の容器が特定の糖類コンジュゲートを含む場合、キットの他方の容器中には同一のコンジュゲートは存在しない。
【０１２４】
１つの実施形態では、第１容器および第２容器のワクチンは、（「本発明のワクチンの投与」で以下に記載するように）同時に異なる部位に投与され、代替の実施態様では、本発明者らは、第１容器および第２容器の内容物を投与前に単独のワクチンとして（任意で即座に）混合できることを想定している。
【０１２５】
本発明のワクチンの調製
本発明は、ワクチンの成分を製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含むワクチン製剤の製造方法も提供する。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態では、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎による感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬において使用するための、本明細書に記載されるワクチンが提供される。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎による感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造における、本発明のワクチンの使用が提供される。
【０１２８】
さらに、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法であって、宿主に免疫保護用量の本発明のワクチンを投与することを含む前記方法が提供される。
【０１２９】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン中で顕著な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量はどの特定の免疫原を用いるか、および特定の免疫原をどのように存在させるかによって変化するであろう。１つの実施形態では、各用量は０．１〜１００μｇの糖類を含み、別の実施形態では、各用量は０．１〜５０μｇを含み、さらなる実施形態では、各用量は０．１〜１０μｇを含み、さらに別の実施形態では、各用量は１〜５μｇ糖類を含むであろう。
【０１３０】
１つの実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は１〜１００μｇの範囲にあり、別の実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は５〜５０μｇの範囲にあり、さらなる実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は５〜２５μｇの範囲にあるであろう。
【０１３１】
ワクチン調製物は一般に、Vaccine Design［The subunit and adjuvant approach(Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York］に記載されている。リポソーム内へのカプセル化はFullerton、米国特許第４,２３５,８７７号により記載されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲート化は、例えばLikhite、米国特許第４,３７２,９４５号およびArmorら、米国特許第４,４７４,７５７号により開示されている。Ｑｕｉｌ Ａの使用は、Dalsgaardら、1977, Acta Vet Scand. 18:349により開示されている。３Ｄ-ＭＰＬはRibi immunochem, USAから入手でき、英国特許出願公開第２２２０２１１号および米国特許第４,９１２,０９４号に開示されている。ＱＳ２１は米国特許第５,０５７,５４０号に開示されている。
【０１３２】
１つの実施形態では、０．５ｍＬ用量のバルクワクチンあたりの糖類コンジュゲートの量は、１０μg未満（のコンジュゲート中の糖類）であり、別の実施形態では、コンジュゲートの量は１〜７であり、別の実施形態では、コンジュゲートの量は２〜６μg、またはさらなる実施形態では、約２．５、３、４または５μgである。
【０１３３】
特定の成分、例えばＤＴＰｗ成分を、吸着されているＨＢｓＡｇまたは他の成分を添加する前に別個に混合できることが理解されよう。
【０１３４】
一般に、本発明の任意の態様に係る混合ワクチン組成物は以下のように調製することができる：ＩＰＶ、ＤＴＰｗ、ＨｅｐＢ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＢ、Ｖｉ、Ａ型肝炎または他の成分を、適切なアジュバント、特に水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムまたはその両方の混合物に予め吸着させる。それぞれの成分を完全かつ安定に吸着させた後、異なる成分を適切な条件下で混合する。Ｈｉｂ、Ｖｉ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷおよび／またはＭｅｎＹコンジュゲートは、ＤＴＰｗワクチンと混合する前に、アルミニウムアジュバント塩に吸着されても、吸着されていなくてもよい。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明のワクチンを１５℃〜３０℃（例えば１９℃〜２７℃、または２３±４℃）で調製する。
【０１３６】
本発明のワクチンの投与
本発明は、有効量の本発明のワクチンを投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を引き起こす方法を提供する。ワクチンは、予防的に（すなわち感染を予防するために）または治療的に（すなわち感染後に疾患を治療するために）投与することができる。免疫応答は防御的であることが好ましく、また抗体が関与することが好ましい。本方法は、既往反応を引き起こすこともできる。
【０１３７】
初回ワクチン接種の後、被験者は適切な間隔を空けて１または数回の追加免疫接種を受けてもよい。投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与は、初回免疫接種計画および／または追加免疫接種計画において使用することができる。初回投与計画（生後１年以内でありうる）に続いて、追加投与計画を行うことができる。初回投与間の適切なタイミング（例えば４〜１６週間）、ならびに初回投与および追加投与間の適切なタイミングは、慣用的に決定することができる。
【０１３８】
１つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。ワクチンが予防的に使用される場合、ヒトは、好ましくは子供（例えば幼児および乳児）または十代の若者であり；ワクチンを治療的に使用する場合、ヒトは好ましくは成人である。子供を対象とするワクチンは、例えば安全性、投与量、免疫原性等を評価するために成人に投与してもよい。
【０１３９】
本発明のワクチン調製物は、前記ワクチンを患者に直接投与することにより、感染しやすい哺乳動物を防御または治療するために使用することができる。直接的な送達は、非経口注射（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈、または組織の間質腔）により;あるいは直腸投与、経口投与、膣内投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、耳内投与、肺内投与または他の粘膜投与により達成することができる。１つの実施形態では、投与は腿または上腕への筋肉注射による。注射は、針（例えば皮下注射針）を用いて行うことができるが、代わりに無針注射を使用することもできる。典型的な筋肉投与量は０．５ｍＬである。
【０１４０】
細菌感染は体の種々の領域に影響を与えるため、本発明の組成物は種々の形態に調製することができる。例えば、本組成物は、注入物質として、溶液または懸濁液のいずれかで調製することができる。本組成物は、微粉末またはスプレーを用いて例えば吸入器として、肺内投与用に調製することができる。本組成物は、坐薬またはペッサリーとして調製することができる。本組成物は、例えばスプレー、点眼薬（drops）、ゲルまたは粉末として鼻腔投与、耳内投与または眼内投与用に調製することができる（例えばAlmeida & Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455；Bergquist et al., 1998, APMIS, 106:800を参照）。ＤＴＰワクチンの成功した鼻腔内投与は報告されている（Ryan et al., 1999, Infect. Immun., 67:6270；Nagai et al., 2001, Vaccine, 19:4824）。
【０１４１】
１つの実施形態では、第１容器および第２容器（および適用可能な場合には第３容器）のワクチンは異なる部位に同時に投与され、代替の実施態様では、本発明者らは第１容器および第２容器の内容物を投与前に単独のワクチンとして（任意で即座に）混合できることを想定している。
【０１４２】
本発明は、全身および／または粘膜免疫を誘発するために使用することができる。
【０１４３】
治療上の処置の効力を確認する一つの方法には、本発明の組成物の投与後に細菌感染をモニタリングすることが含まれる。予防的処置の効力を確認する一つの方法には、組成物の投与後に抗原に対する免疫応答をモニタリングすることが含まれる。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験者（例えば１２〜１６月齢の子供、または動物モデル−国際公開公報第０１／３０３９０号）にこれらを投与し、次いで標準的な免疫学的パラメーターを測定することにより判定することができる。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与後約４週間に測定し、組成物の投与前に測定した値と比較する。患者における実際の予防効力を評価するよりも、ＤＴＰワクチンの効力を評価するための標準的な動物およびｉｎ ｖｉｔｒｏモデル並びに保護の相関がよく知られている。
【０１４４】
本明細書において「含む（comprising）」、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」という用語は本発明者らによれば、あらゆる場合において、それぞれ「からなる（consisting of）」、「からなる（consist of）」および「からなる（consists of）」という用語と任意で置き換え可能であることが意図される。「免疫原性組成物」という用語は、本明細書において「ワクチン」という用語と置き換え可能であり、逆もまた同様である。
【０１４５】
この特許明細書のなかで引用される参考文献または特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
本発明を添付の実施例のなかで例示する。以下の実施例は、他に詳細に記述されている場合を除き、当業者には周知かつ慣用的である標準的な技術を用いて行われる。これらの実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１４７】
実施例１−多糖コンジュゲートの調製
実施例１ａ−本発明による髄膜炎菌（meningococcal）ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ莢膜多糖コンジュゲートの調製
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１４８】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＡ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じて反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【０１４９】
１０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＡ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＡ比率０．７５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＡ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、このｐＨを維持しながら（温度を２５℃に保持して）２時間反応を進めた。
【０１５０】
ＰＳＡＡＨ溶液をその当初容量の４分の１に濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーション（diafilter）し、保持物（retentate）を濾過した。
【０１５１】
コンジュゲート化（カルボジイミド縮合）反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＡＡＨ溶液をＰＳＡＡＨの場合１０ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合１０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう希釈した。
【０１５２】
最終比率０．９ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）をＰＳＡＨ溶液（糖類２ｇ）に添加した。ｐＨを５．０に調整した。２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドを蠕動ポンプにより（６０分で）添加した。得られた溶液を撹拌しながら＋２５℃で６０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【０１５３】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約６６０ｍＬ）をカラムに充填した（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．３０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【０１５４】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＣ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じて反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【０１５５】
２０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＣ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＣ比率１．５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。活性化ｐＨで５Ｍ ＮａＣｌを添加して、最終濃度２ＭのＮａＣｌを達成した。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＣ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、（２５℃に維持して）２時間反応を進めた。
【０１５６】
ＰＳＣＡＨ溶液を最小限の１５０ｍＬに濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーションし、保持物を濾過した。
【０１５７】
コンジュゲート化反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＣＡＨ溶液（２ｇスケール）をＰＳＣＡＨの場合１５ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合２０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１５８】
２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドをＰＳＣＡＨ溶液に添加した。ｐＨを５．０に調整した。最終比率０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ ｐＨ ７．５中にて１６．７ｍｇ／ｍＬ）を蠕動ポンプにより（１０分で）添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【０１５９】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約４６０ｍＬ）をカラムに充填した（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．２０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【０１６０】
ＥＤＡＣを１０〜４５分間かけて添加する種々の実験を行った。いずれの場合にも良質のＭｅｎＣコンジュゲートが得られた。しかしながら、ＴＴキャリアをＭｅｎＣ−ＡＤＨ ＋ ＥＤＡＣ混合物に最後にゆっくりと添加した場合、これはゲル、つまり精製できないコンジュゲートをもたらした。
【０１６１】
ＥＤＡＣを一度に反応物の中に添加する実験も行ったが、コンジュゲートのＴＴ／ＰＳ最終比率（２．７／１）（ｗ／ｗ）は、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって得られたコンジュゲートの場合（３．３／１）よりも低かった；さらに、αＴＴおよびαＰＳ抗原性はともに、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって作製されたコンジュゲートに関して測定されたものよりも低かった。
【０１６２】
多糖の％誘導体化近似値に関する注記
ＭｅｎＣＡＨ：ＡＤＨでのＣＤＡＰ処理後、約３．４７％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復サブユニットあたり利用可能なヒドロキシル基は２つと推定される）。ＭｅｎＡの場合：約１１．５％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復単位あたり利用可能なヒドロキシル基は１つしかないと考えられる）。
【０１６３】
実施例１ｂ−肺炎球菌の莢膜ＰＳ ３多糖コンジュゲートの調製
１）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３−ＴＴＡＨ２０８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１０％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度３ｍｇ／ｍＬで２Ｍ ＮａＣｌに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を５μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【０１６４】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧（circuit pressure）、プランジャー補給圧（plunger alimentation pressure）に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することであった。
【０１６５】
サイズ低減は６０００±５００ ｐｓｉで行い、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、２．０±０．２ ｃｐの目標に達した時点で止めた。
【０１６６】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過した。
【０１６７】
ＴＴ誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＴＴをＮａＣｌ ０．２Ｍに希釈して、ＴＴ最終濃度２５ｍｇ／ｍＬを得た。０．２Ｍの最終濃度に達するように、ＡＤＨをＴＴ溶液に固体形態で添加した。完全なＡＤＨ溶解の後、溶液をＨＣｌでｐＨ ６．２＋／−０．１に設定した。
【０１６８】
その後、最終濃度０．０２Ｍに達するように、ＥＤＡＣをＴＴ／ＡＤＨ溶液に添加した。ｐＨをＨＣｌで６．２＋／−０．１に設定し、１時間の間ｐＨ調節下に保った。
【０１６９】
誘導体化ステップの後、ｐＨをＮａＯＨにより最大ｐＨ９．５まで上げて、反応を停止した。ダイアフィルトレーション（diafiltration）ステップの前に溶液を２時間の間ｐＨ調節下に置いた。
【０１７０】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＴＴＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１７１】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物（permeate）におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１７２】
０．２２μｍに対する濾過
ＴＴＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＴＴＡＨを−７０℃で保存した。
【０１７３】
ＰＳ３−ＴＴＡＨコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１７４】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴＡＨ／ＰＳ３当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１７５】
ＰＳ３ ５０ｍｇを２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴＡＨ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１７６】
このＰＳ３溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１７７】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴＡＨを１１分間（アリコート／分）で手動により添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１０９分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１７８】
２）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴ２１５
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１７９】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１８０】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＣＤＡＰ（０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、アセトニトリル／ＷＦＩ混合物中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にＰＳ溶液をｐＨ６．０に設定した。ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に増加させた。ｐＨを９．５に保持し、６０分の間、調節した。誘導体化の割合は２．４％（２．４ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）に相当した。これは公知の技術で測定することができる：ＡＤＨの推定の場合にはＴＮＢＳ；およびＰＳ定量化の場合にはＤＭＡＢまたはレゾルシノール（Monsigny et al (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530）。この場合、ＴＮＢＳ投与量は２２８μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５２５０μｇ／ｍＬであった。
【０１８１】
ＡＤＨのＭｗが１７４．２であり、ＰＳ３の反復単位のＭｗが３３８．２７である（１つのＣＯＯＨ基および４つのＯＨ基を有する）ことを考えれば、１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１５．５２μｍｏｌｅの反復単位、または１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／６２．０８μｍｏｌｅの反応性ヒドロキシル基が存在する。２．０９％のＰＳ３ヒドロキシル基がＡＤＨ修飾ヒドロキシル基であった。
【０１８２】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＣＤＡＰ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１８３】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１８４】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【０１８５】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１８６】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１８７】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１８８】
このＰＳ３ＡＨ溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１８９】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３ＡＨ溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴを蠕動ポンプにより１０分で添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１９０】
３）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１７
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１９１】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１９２】
ＰＳ３誘導体化
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９３】
ダイアフィルトレーション
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９４】
０．２２μｍに対する濾過
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９５】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１９６】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１９７】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１９８】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を混合し、ＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１９９】
ＥＤＡＣをＴｒｉｓ １Ｍ ｐＨ ７．５緩衝液に溶解した。ＥＤＡＣ ４０μＬを毎分添加した（ＥＤＡＣ／ＰＳ比率（０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳ）に達するように１０分間）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０２００】
４）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０２０１】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０２０２】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＥＤＡＣ／ＰＳ比率０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣを固体形態で添加した。完全な溶解後、溶液のｐＨを５に設定した。その後、ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）を蠕動ポンプにより４４分で添加した（したがって過剰のＡＤＨが存在していたが、直接的な添加も問題がなかった）。ｐＨを５．０＋／−０．１に保持し、１２０分（４４秒＋７６秒）の間、調節した。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に上昇させることにより、反応を停止した。誘導体化の割合は３．７％（ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）に相当した。ＴＮＢＳ投与量は２２０μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５９０２μｇ／ｍＬであった。すなわち１．２６μｍｏｌｅのＡＤＨ／１７．４４μｍｏｌｅの反復単位（＝μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基）が存在する。したがって、７．２２％のＰＳ３カルボキシル基がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０２０３】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２３容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０２０４】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０２０５】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【０２０６】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０２０７】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３ＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０２０８】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０２０９】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を一緒に混合した。
【０２１０】
ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＥＤＡＣを１０分間で手動により添加した（等量のアリコートを毎分添加した）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０２１１】
結論：
コンジュゲート化ステップのなかでカルボジイミド化学反応を用いて、異なるコンジュゲートを作製した。反応溶液に添加される最後の成分は、ＴＴタンパク質またはＥＤＡＣ試薬のいずれかとすることができる。添加の時間は、得られるコンジュゲートに影響を与えることがある。
【０２１２】
ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５および２１７コンジュゲート：
両コンジュゲートを調製するため、同じ成分および条件を使用した。最後の成分を添加した方法は異なっていた。ＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートは、インビトロ（in-vitro）での判定基準に合った生成物をもたらした。この生成物はＥＤＡＣを１０分で添加することにより作製された。
【０２１３】
しかしながら、ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５コンジュゲートは、滅菌メンブレンに対して濾過することができなかった。このコンジュゲートの場合、反応媒体に添加された最後の成分はＴＴであった（１０分で）。
【０２１４】
ＴＴ／ＰＳ最終比率は両コンジュゲートでかなり異なっていた（０．９８／１に対して０．５０／１）。ＥＤＡＣがＰＳＡＨ（反応性アミノ基とカルボキシル基の両者を有する）に最初に添加される場合、これは多糖に存在するヒドラジンおよびカルボン酸基の分子内架橋結合をもたらしうるので、いっそう架橋結合されたコンジュゲートを生じさせることになり、１０分間でのＴＴの添加後の最終比率がずっと低くなるのかもしれない。
【０２１５】
この影響はＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートでは認められていない。ＴＴ取込みは、おそらくいっそう低い分子内架橋結合や、ＰＳ３ＡＨのヒドラジン基と該タンパク質のカルボン酸基との間のいっそう良好な分子間架橋結合のため、１０分間でのＥＤＡＣの添加によっていっそう功を奏した。
【０２１６】
２１８コンジュゲートの場合、ＰＳ３ ＥＤＡＣ誘導体化は（多糖エピトープの大部分を保全するため）多糖を部分的に誘導体化するだけなので、反応性アミノ基とカルボキシル基の両者が存在しており、それ故に最終のコンジュゲート化ステップにおけるＥＤＡＣの緩徐な添加が有益である理由も先と同様である。
【０２１７】
（しかしながら）ＴＴはＡＤＨ誘導体化され（かつアミノ基およびカルボキシル基を含む）、その一方でＰＳ３はその反復サブユニットの一部としてその天然の反応性−ＯＨ基および−ＣＯＯＨ基が残された２０８コンジュゲートの場合、最終のコンジュゲート化ステップにおける緩徐なＴＴ添加が有益であった。ＰＳ ３へのＥＤＡＣの添加は上記の架橋結合の影響がなく、誘導体化されたＴＴの緩徐な添加によってインビトロでの特性の良好なコンジュゲートが得られた。下記を参照されたい。
【０２１８】
インビトロでの特性決定：
【表２】
【表３】
【表４】
【０２１９】
実施例１ｃ−本発明のチフス菌（S. typhi）Ｖｉ多糖コンジュゲートの調製
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１５％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度７ｍｇ／ｍＬでＷＦＩに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を流速５０ｍＬ／分で１０μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【０２２０】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧、プランジャー補給圧に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することである。
【０２２１】
サイズ低減は１５０００±５００ ｐｓｉで達成し、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、５．０±０．３ ｃｐの目標に達した時点で止める。
【０２２２】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過する。濾過済のサイズ分類されたＰＳを−２０℃で保存する。
【０２２３】
多糖Ｖｉの誘導体化
サイズ分類されたＶｉ ＰＳ １．５ｇを撹拌しながらＥＰＩに２５℃で溶解した（５ｍｇ／ｍＬ）。このＰＳ溶液にＡＤＨ １３．３５ｇ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）を添加する。完全な溶解後、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ５．０±０．０５に調整した。ＥＤＡＣ（０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を固体形態で添加した。この溶液を２５℃で６０分間放置した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、２５℃で少なくとも３０分間放置した（最大２時間）。ＴＮＢＳ投与量（ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）により、誘導体化のレベルは４．５５％であると推定された。ＴＮＢＳ投与量は２００μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は４０３４μｇ／ｍＬであった；したがって０．０６９７μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反復単位（Ｍｗ２４５）であった。Ｖｉでの１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基、したがってＶｉのＣＯＯＨ基の７％がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０２２４】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳＶｉＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０２２５】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は３、５、１０および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０２２６】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＶｉＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。濾過したＰＳＶｉＡＨを最大４日間＋２／＋８℃で保存した。
【０２２７】
ＰＳＶｉＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０２２８】
０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳＶｉＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳＶｉＡＨ当初比率２．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳおよび０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０２２９】
ＰＳＶｉＡＨ １ｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た（ウロン酸投与量）。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０２３０】
最終比率２．５ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＴＴをＰＳＶｉＡＨ溶液に添加した。ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで５．０±０．０５に調整する。その後、０．２５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＶｉＡＨに達するように、ＥＤＡＣ溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５中にて７．５ ｍｇ／ｍＬ）を添加した（蠕動ポンプにより１０分で）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で５０分間インキュベートして、６０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。クロマトグラフィーステップの前に、コンジュゲートを４℃に移し、連続的にゆっくり撹拌しながら終夜放置した。
【０２３１】
精製
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに対する溶出の前に、１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターを用いてコンジュゲートを清澄化した。流速は１００ｍＬ／分に固定した。その後、コンジュゲートをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに注入し、回収プールはＫｄ値に基づいた。以下の判定基準をプール回収に用いた：２８０ｎｍのＯＤ＝０．０５から収集を開始し、Ｋｄ＝０．２２の時点で終了した。
【０２３２】
滅菌濾過
濾過の前に、バルクを室温に戻した。その後、コンジュゲートをＯｐｔｉｃａｐ ４’’滅菌用メンブレンに対して濾過した。流速は３０ｍＬ／分に固定した。
【０２３３】
分析
得られたコンジュゲートはＴＴ／ＰＳ最終比率（ｗ／ｗ）２．４４／１、遊離ＰＳ含有率３．７％およびαＰＳ／αＰＳ抗原性５８％であった。
【０２３４】
実施例１ｃ（ｉｉ）−本発明のチフス菌（S. typhi）Ｖｉ多糖コンジュゲートの他の調製方法
コンジュゲート化は実施例１ｃに記載された条件と異なる条件で行うことができると考えられる。要するに、実施例１ｃを行うが、以下の条件は変更する。
【表５】
【０２３５】
実施例１ｄ−その他の多糖コンジュゲートの調製
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Ｈｉｂ）ＰＲＰ多糖のＴＴとの共有結合は、Chuら（Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256）により開発されたカップリング化学反応によって行った。ＣＮＢｒを添加し、ｐＨ １０．５で６分間インキュベートすることにより、Ｈｉｂ ＰＲＰ多糖を活性化した。ｐＨをｐＨ ８．７５に下げ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、インキュベーションをさらに９０分間続けた。１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド縮合により、活性化されたＰＲＰを精製された破傷風トキソイドにカップリングした。最終比率０．６ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ 活性化ＰＲＰに達するように、活性化されたＰＲＰにＥＤＡＣを添加した。ｐＨを５．０に調整し、２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、精製された破傷風トキソイドを添加した。得られた溶液を穏やかに撹拌しながら３日間放置した。０．４５μｍのメンブレンを通した濾過の後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにてコンジュゲートを精製した。
【０２３６】
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲートを、ＭＡＬＬＳで測定したところおよそ１００〜２００ｋＤａのサイズ分類された多糖を用いて作出した（実施例２参照）。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０２３７】
活性化および直接的カップリングは、国際公開公報第９６／２９０９４号および国際公開公報第００／５６３６０号に記述されているように行った。手短に言えば、２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ５．５〜６．０中の濃度１０〜２０ｍｇ／ｍＬの多糖をＣＤＡＰ／多糖最終比率０．７５／１または１．５／１までＣＤＡＰ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、アセトニトリル／ＷＦＩ，５０／５０中にて新たに調製）と混合した。１．５分後に、ｐＨを水酸化ナトリウムによりｐＨ１０．０に上げた。３分後、ＭｅｎＷの場合１．５／１、ＭｅｎＹの場合１．２／１、ＭｅｎＡの場合１．５／１またはＭｅｎＣの場合１．５／１のタンパク質／多糖比率に達するように、破傷風トキソイドを添加した。反応を１〜２時間続けた。
【０２３８】
カップリングステップの後、グリシンをグリシン／ＰＳ（ｗ／ｗ）の最終比率７．５／１まで添加し、ｐＨをｐＨ９．０に調整した。この混合物を３０分間放置した。１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターによってコンジュゲートを清澄化し、次に１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭまたは５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５の溶出用緩衝液を用いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに充填した。臨床用ロット（Clinical lots）をＯｐｔｉｃａｐ ４滅菌用メンブレンに対して濾過した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質の平均比率が１：１〜１：５（ｗ／ｗ）であった。
【０２３９】
実施例２−ＭＡＬＬＳを用いた分子量の測定
サンプルが溶出されるＨＰＬＣサイズ排除カラムに検出器を連結した。一方では、レーザー光散乱検出器によって、高分子溶液により１６の角度で散乱された光強度を測定し、他方では、オンラインで配置された干渉屈折計によって、溶出されたサンプル量の測定を可能にした。これらの強度から、溶液中の高分子のサイズおよび形状を測定することができる。
【０２４０】
重量平均分子量（Ｍｗ）は、全ての、種の重量×その各種分子量、の総和÷全ての種の重量の総和、と定義される。
【０２４１】
ａ）重量平均分子量：−Ｍｗ−
【数１】
【０２４２】
ｂ）数平均分子量：−Ｍｎ−
【数２】
【０２４３】
ｃ）二乗平均平方根半径（Root mean square radius）：−Ｒｗ−およびＲ２ｗは以下により定義される二乗半径である：
【数３】
【０２４４】
（−ｍｉ−は散乱中心ｉの質量であり、−ｒｉ−は散乱中心ｉと高分子の重心との間の距離である）。
【０２４５】
ｄ）多分散性は比率−Ｍｗ／Ｍｎ−と定義される。
【０２４６】
髄膜炎菌（meningococcal）多糖を、併用で用いた２本のＨＰＬＣカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）に充填することによってＭＡＬＬＳで分析した。多糖２５μＬをカラムに充填し、濾過水０．７５ｍＬで溶出した。糖類は光散乱検出器（４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。
【０２４７】
全サンプルの分子量多分散性および回収率は、Ａｓｔｒａ ４．７２ソフトウェアにおいて多項式適合度１を用いＤｅｂｙｅ法によって計算した。
【０２４８】
実施例３−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡ中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨ（ＡＤＨ）スペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ４−任意のコンジュゲートにおいてスペーサーなしで破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０２４９】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０２５０】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−抗体力価＞４倍のワクチン接種前の抗体力価、と定義された。
【０２５１】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＡコンジュゲートでのスペーサーの使用によってＭｅｎＡに対する免疫応答の増大がもたらされた。応答者の割合は、ＡＨスペーサーを付加した場合、６６％から９０〜９５％に上昇した。これはＳＢＡ ＧＭＴでの４３３５から１００００の増大およびＧＭＣでの５から２０〜４０の増大に反映されていた。意外にも、応答者の割合の増大およびＳＢＡ ＧＭＴでの増大から分かるとおり、ＡＨスペーサーの使用によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大も起こった。スペーサーが導入された場合、増大は同様にＳＢＡ−ＧＭＴにおいてＭｅｎＹ（６７４２〜７１２２）に対しておよびＭｅｎＷ（４６２１〜５４１８）に対して認めることができた。
【表６】
【０２５２】
実施例４−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲート中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／２．５／２．５／２．５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ４−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０２５３】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０２５４】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−抗体力価＞４倍のワクチン接種前の抗体力価、と定義された。
【０２５５】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＣコンジュゲートへのＡＨスペーサーの導入によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大がもたらされた。これはＳＢＡ ＧＭＴでの１９４３から４３２９の増大および抗ＰＳＣ ＧＭＣでの７．６５から１３．１３の増大によって実証される。ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹに対する良好な免疫応答が維持されていた。
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルボジイミド縮合反応を行う改良法に関する。具体的には、本発明はカルボジイミド縮合を用いた糖類およびタンパク質のコンジュゲート化に関する。本発明はまた、本発明の糖類−タンパク質コンジュゲートを含むように作製できる免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌莢膜多糖の使用は、細菌性疾患の予防のため、長年にわたり免疫学において広く使われてきた。しかしながら、そのような使用に関連する問題は、免疫応答のＴ非依存性の性質である。これらの抗原はすなわち、幼児において免疫抗原性が低い。この問題は多糖抗原をタンパク質キャリア（Ｔヘルパーエピトープの供給源）にコンジュゲート化することによって克服されており、これを用いて、生後１年でさえも、Ｔ依存性免疫応答を誘発することができる。
【０００３】
さまざまなコンジュゲート化技術は当技術分野において公知である。コンジュゲートは米国特許第４３６５１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４６７３５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記述の直接還元的アミノ化法によって調製することができる。その他の方法は欧州特許第０−１６１−１８８号、欧州特許第２０８３７５号および欧州特許第０−４７７５０８号に記述されている。または、コンジュゲート化法は１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いた糖類のヒドロキシル基の活性化に依って、シアン酸エステルを形成させてもよい。活性化糖類をこのように直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介してキャリアタンパク質のアミノ基にカップリングさせることができる。例えば、シアン酸エステルをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨまたはＡＨ）とカップリングさせることができ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質キャリアのカルボキシル基を介したカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応によってキャリアタンパク質にコンジュゲート化する。そのようなコンジュゲートはＰＣＴ公開出願の国際公開公報第９３／１５７６０号（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ならびに国際公開公報第９５／０８３４８号および国際公開公報第９６／２９０９４号に記述されている。Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256も参照されたい。
【０００４】
一般に、以下のタイプのタンパク質キャリアの化学基を、カップリング／コンジュゲート化に使用することができる：
（Ａ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたアミノ基にコンジュゲート化できる、カルボキシル（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸による）；
（Ｂ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたカルボキシル基にコンジュゲート化できる、アミノ基（例えばリジンによる）；
（Ｃ）スルフヒドリル（例えばシステインによる）；
（Ｄ）ヒドロキシル基（例えばチロシンによる）；
（Ｅ）イミダゾリル基（例えばヒスチジンによる）；
（Ｆ）グアニジル基（例えばアルギニンによる）；および
（Ｇ）インドリル基（例えばトリプトファンによる）。
【０００５】
糖類では、一般に以下の基：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２をカップリングに使用することができる。アルデヒド基は過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当技術分野において公知の異なる処理の後に作出することができる。
【０００６】
直接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ シッフ塩基 ＋ ＮａＣＮＢＨ３ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＮＨ２−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート。
【０００７】
スペーサー（リンカー）を介した間接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２ −−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる）−−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾）−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ハロアセチル化−タンパク質−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−＞ 糖類−−−−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる）−−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾）−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−＞糖類−ＳＨ ＋ ハロアセチル化−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート。
【０００８】
本明細においてＥＤＡＣを記載する場合、任意の適切なカルボジイミドを代わりに使用できることに留意されたい。
【０００９】
見て分かるとおり、カルボジイミド化学反応（例えば、ＥＤＡＣを用いる）は、天然に存在しうるかまたは誘導体化によって容易に挿入されうる糖類および／またはタンパク質の基を利用するので、コンジュゲート化反応にとって非常に都合が良い。それはまた、好都合なことに、ペプチド結合を通じて成分を連結する。
【００１０】
カルボジイミド（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）は、アレン構造を有する不飽和化合物である（Nakajima and Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6 :123-130；Hoare and Koshland 1967 JBC 242:2447-2453）。この化合物はその反応ｐＨ（４．５〜６．５）で比較的不安定であり、それ故に糖類／タンパク質／カルボジイミドコンジュゲート化反応の全成分は当技術分野において一緒に加えられる傾向がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、コンジュゲート化の対象となる糖類およびタンパク質の性質に応じ、ある種の反応成分を混合物にゆっくり加えることで、ワクチン用に最終コンジュゲートの良好な特性を達成できることを見出した。そうすることで、コンジュゲート中の糖類収量、コンジュゲートの滅菌濾過性、コンジュゲート化の良好な制御、再現性の容易さ、および／または成分内架橋の阻止などの、１以上の利益／改善を実現することができる。
【００１２】
したがって、１つの実施形態ではカルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
水性媒体中で糖類およびタンパク質をコンジュゲート化できる限り、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。１つの実施形態では、カルボジイミドはＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）［ＥＤＣとしても知られる］であることができ、またはそれはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドであることができる。任意の実施態様において本明細書でＥＤＡＣまたはＥＤＣに言及する場合、任意のカルボジイミドを代わりに使用できることが想定される。
【００１４】
本明細書の全体を通して「糖類」という用語は、多糖またはオリゴ糖を示すことができ、この両者を含む。それはリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を示すことができる。使用前に、多糖（細菌多糖などの）を供給源の菌株（例えば、細菌の）から単離してもよく、または供給源の菌株から単離し、公知の方法（例えば欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号；Shousun Chen Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)を参照のこと）により、例えばマイクロ流動化によりある程度までサイズ分類（sized）してもよい。多糖は多糖サンプルの粘性を低減するためおよび／またはコンジュゲート化生成物の濾過性を向上するためサイズ分類されてもよい。オリゴ糖は反復単位の数が少なく（典型的には５〜３０の反復単位）、典型的には加水分解された多糖である。
【００１５】
「タンパク質キャリア」という用語は、小さなペプチドと大きなポリペプチド（＞１０ｋＤａ）の両者を網羅するよう意図される。明らかに大きなポリペプチドは、何の修飾もなしに反応性アミノ基と反応性カルボキシル基の両者を含む可能性がいっそう高い。
【００１６】
本発明の目的で、「天然の（native）多糖」とは、糖類のサイズを低減することが目的のプロセスに供されていない糖類をいう。多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減るようになることがある。そのような糖類は依然として天然である。多糖がサイズ分類技術に供されている場合に限り、多糖は天然であると見なされないであろう。
【００１７】
本発明の目的で、「×２倍以下にサイズ分類される」とは、糖類のサイズを減らすが天然多糖のサイズの半分以上のサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供されることを意味する。×３、×４などは同じように解釈されるべきである。すなわち、多糖のサイズを減らすが天然多糖のサイズの３分の１以上、４分の１以上などのサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供される。
【００１８】
最終成分の全アリコートの添加のための方法ステップ（ｂ）における３５秒間〜６時間は、５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間とすることができる。それは１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、３０分間〜２時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間であってもよい。この時間は、コンジュゲート化される正確な糖類およびタンパク質に準じて調整することができる。
【００１９】
１つの実施形態では、（例えば、カルボジイミド、糖類またはタンパク質の）最終成分のアリコートを前記時間の間に一定速度で反応混合物に添加する（これは一定速度で作動するポンプを用いて達成されることが好都合である）。または、それは前記時間にわたって段階的に添加されてもよい。これはさまざまな形で行うことができるが、一般にアリコートの一部分が前記時間の全体を通して添加されるべきである。例えば、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加してもよい。例えば、ｍＬまたはｍｇで測定されるアリコート「ａ」の総量が前記時間の全体を通して４〜１００の段階（「ｓ」）において添加されてもよい。１つの実施形態では、均一な量（ａ／ｓ）が全ての段階で導入されるように、前記段階は設定される。１つの実施形態では、前記段階は前記時間「ｐ」の全体を通して（秒で）均一に間隔をあけられる。すなわち、１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われうる。ステップ（ｂ）において添加される最終成分のアリコートの量は、所望の時間内での反応物へのアリコートの添加の容易さという観点で調整することができる。カルボジイミドは水溶液（反応物に添加される前に典型的にはｐＨ７．５に緩衝化されている）としてまたは固体粉末（ＥＤＡＣは例えば、水媒体に高溶解性である）として添加されてもよい。もちろん、カルボジイミドが反応物に添加される最後の成分である場合（状況ＩＩＩ、ステップ（ｂ））、ゆっくりと溶解するカルボジイミドが使用されてもよく、したがって粉末のアリコート全体が反応物に一度に添加されるが、しかしそれは、アリコートが反応に利用可能とされる所望の時間と一致する速度で溶解する。
【００２０】
タンパク質および／または糖類がアミノまたはカルボキシル基を持っていない（あるいはこれらのうちの一方を持っているにすぎない）場合、それを誘導体化して、一方をそれに与えても（またはそれがまだ持っていないもう一方をそれに与えても）よい。例えば、反応性ヒドロキシル基のみを含む糖類（例えば、髄膜炎菌（meningococcal）血清型Ａ莢膜糖類）の場合、そのような基はＥＤＡＣ縮合を実行できるように、アミノまたはカルボキシル基に対する誘導体化に使用されるはずである。これは反復サブユニット内で行われてもよく、または糖類分子の末端にのみ存在する基であってもよい。
【００２１】
誘導体化が行われる場合、その成分を部分的にだけ誘導体化することが有益でありうることに留意されたい。反復サブユニットを有する糖類の場合、標的エピトープは各反復の中に存在しうる。それ故に、部分的誘導体化が行われる場合（この場合、例えば標的とされる反応性基の０．５〜２０、１〜１５、３〜１２、または５〜１０％が実際に誘導体化されることを意味する）、これはエピトープの大部分を保存しているという利点、および過度の架橋結合を阻止するという利点を有しうる。
【００２２】
糖類またはタンパク質がアミノまたはカルボキシル基だけを既に持っている場合（例えば、本来、カルボキシル基を持っているが、アミノ基を持っていないチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類）、誘導体化を行って、もう一方の種の基（すなわち、Ｖｉの場合にはアミノ基）をそれに与えることができる。しかしながら、誘導体化は部分的でありうるので、この行為はＩ型からＩＩＩ型までの本発明の好ましい反応を変えうることに留意されたい。例えば、Ｖｉ糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含んだタンパク質キャリアにコンジュゲート化される場合、状況Ｉではステップ（ｂ）においてゆっくりタンパク質のアリコートを添加する。Ｖｉ糖類のカルボキシル基がアミノ基で部分的に誘導体化されている場合、それはカルボキシル基とアミノ基の両者を持っているはずであり、したがってステップ（ｂ）においてゆっくりカルボジイミドのアリコートを添加する状況ＩＩＩが最も適切になる。
【００２３】
誘導体化はヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介して行われてもよい。それは糖類−タンパク質コンジュゲート化ステップについて上述したのと同様の化学反応（例えば、ＣＤＡＰまたはカルボジイミド化学反応）によって行われてもよい。リンカーは４〜２０、４〜１２、または５〜１０炭素原子を有することができる。それは２つの反応性アミノ基、２つの反応性カルボキシル基、または各々の１つ（例えば、ヘキサンジアミン、６−アミノカプロン酸、またはアジピン酸ジヒドラジド）を有することができる。典型的には、誘導体化は、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる。これにより最小限の成分内架橋結合で誘導体化を行うことが可能になる（これはそれ以外には、例えば、糖類のカルボキシル基がカルボジイミド縮合によってアミノ基で誘導体化されている場合に可能であるかもしれない）。過剰なリンカーはダイアフィルトレーション法などの技術を用いて容易に除去される。
【００２４】
１つの実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、ＣＤＡＰ化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。別の実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。さらなる実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて−例えば、部分的誘導体化ステップにおいてカルボジイミドは０．０１〜０．５、０．０１５〜０．１、０．０２〜０．０７５、または０．０２５〜０．０５ ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類で存在する）部分的に誘導体化されている。
【００２５】
コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートは（本発明の反応のステップ（ａ）または（ｂ）にあろうとも）、０．０１〜３、０．０５〜２、または０．０９〜１ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類（例えば０．０７〜０．２５、または０．１〜０．２ ｍｇ／ｍｇ糖類）である。これらの数（および本明細書に挙げるカルボジイミドの量）はカルボジイミドであるＥＤＡＣに関して計算されるが、これらの数はその他任意のカルボジイミドが使用される場合、その範囲の数に（その他のカルボジイミドの分子量）／（ＥＤＡＣの分子量）を乗じることによって適宜調整されてもよい。
【００２６】
一般に、糖類は本発明の方法のなかでステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。例えば、オリゴ糖の場合にはいっそう高い濃度が必要とされるが、大きな多糖の場合にはずっと低い濃度がいっそう適しているであろう。それがアミノまたはカルボキシル基で誘導体化されているうちの高い側（high end）に向けられるならば、任意の架橋結合の可能性を減らすため、いっそう低い濃度が適しているかもしれない。タンパク質キャリアはステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。
【００２７】
本発明の方法のなかでタンパク質キャリアと糖類との当初比率は、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）とすることができる。この場合もやはり、これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。
【００２８】
塩条件（例えば、ＮａＣｌ）も糖類／タンパク質の性質によって変えられてもよい。通常、およそ０．２Ｍ ＮａＣｌが本発明の方法のステップ（ｂ）において存在してもよいが、これは０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍであってもよい。
【００２９】
本発明の方法のステップ（ｂ）におけるｐＨという観点で、反応ｐＨは、カルボジイミドが活性化される任意のｐＨ、例えば、ｐＨ ４．５〜６．５、ｐＨ ４．７〜６．０、またはｐＨ ５〜５．５であってよい。このｐＨは典型的には、必要に応じて酸／塩基の添加により反応の全体を通して維持される。ＥＤＡＣは、通常、ｐＨ ７．５で安定であるけれども、コンジュゲート化がさらに高いｐＨで行われる必要がある場合、反応中間体を安定に保つことが知られている化合物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなど）がステップ（ｂ）において反応物の中に存在してもよく、その場合にはステップ（ｂ）における反応ｐＨはｐＨ ４．５〜７．５に維持されうる。
【００３０】
本発明の方法のステップ（ｂ）の間の反応温度は、４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃、または２２〜２７℃とすることができ、典型的には反応の全体を通して維持される。
【００３１】
本発明の方法のなかで、ステップ（ｂ）においてアリコート全体が添加されたら、反応は典型的には、さらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間、または１〜３時間、例えば１０〜１２０、１０〜８０、１０〜５０、２０〜４０、または２５〜３０分間維持される。反応が完了したら、ｐＨを７．５〜９に（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが存在する場合にはこの高い方の側に）調整して、カルボジイミドの安定なｐＨ域に戻す。
【００３２】
コンジュゲート化されたら、糖質−タンパク質コンジュゲートを未反応成分、遊離糖類などから、そのコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラム（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入することによって精製することができる。これは典型的には、２〜８℃で行われる。コンジュゲートを滅菌濾過し、その後で保存してもよい。最終的に、有効用量（例えば１〜２０、２〜１５、または３〜１０μｇ糖類／用量）の糖質−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤（例えば塩またはアジュバント）とともに製剤化して、免疫原性組成物またはワクチンを製造することができる。
【００３３】
本発明の糖類に関して、ウイルス、真菌、細菌または真核生物供給源のいずれの糖類が本発明の方法を用いてコンジュゲート化されてもよい。それはチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類、またはＶｉ以外の糖類であってもよい。それはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型由来の莢膜糖類Ｈｉｂであってもよく、またはＨｉｂ以外の糖類であってもよい。１つの実施形態では、糖類は細菌莢膜糖類であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ（ＭｅｎＡ）、Ｂ（ＭｅｎＢ）、Ｃ（ＭｅｎＣ）、Ｗ１３５（ＭｅｎＷ）もしくはＹ（ＭｅｎＹ）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである。
【００３４】
糖類の重量平均分子量は１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００とすることができる。本明細書において糖類の分子量または平均分子量は、コンジュゲート化の前に測定された糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）をいい、ＭＡＬＬＳによって測定される。ＭＡＬＬＳ技術は当技術分野において周知であり、典型的には、実施例２に記述されているように行われる。糖類のＭＡＬＬＳ分析の場合、２つのカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）が併せて使用されてもよく、糖類は水の中に溶出される。糖類は光散乱検出器（例えば４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（例えばＰ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。１つの実施形態では、糖類の多分散性は１〜１．５、１〜１．３、１〜１．２、１〜１．１または１〜１．０５であり、キャリアタンパク質とのコンジュゲート化の後、コンジュゲートの多分散性は１．０〜２．５、１．０〜２．０、１．０〜１．５、１．０〜１．２、１．５〜２．５、１．７〜２．２または１．５〜２．０である。多分散性測定は全てＭＡＬＬＳによる。
【００３５】
糖類は天然の多糖であっても、または２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍もしくは２０倍以下にサイズ分類されてもよい（例えばマイクロ流動化により［例えばＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器により］もしくはその他公知の技術［例えば加熱法、化学法、酸化法、超音波処理法］により）。オリゴ糖がさらに実質的にサイズ分類されていてもよい［例えば公知の加熱法、化学法、または酸化法により］。
【００３６】
これらの糖類の大部分の構造は公知である（それ故にそれらがカルボジイミド化学反応のための任意のアミノもしくはカルボキシル基、またはアミノもしくはカルボキシル基で誘導体化できるその他任意の反応性基をもともと有するかどうかは公知である）（下記表参照）。
【表１】
【００３７】
糖類は細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖（上記表参照）であっても、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitides）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来してもよい。ＬＯＳは髄膜炎菌（meningococcal）免疫型Ｌ２、Ｌ３またはＬ１０であってもよい。ＬＯＳはその脂質Ａ成分のアルカリ処理によって解毒されてもよい。
【００３８】
１つの実施形態では、ＭｅｎＡ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−３の位置に少なくとも存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＣ莢膜糖類は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の（α２→９）−連結ＮｅｕＮＡｃ反復単位が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−８の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＷ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−９の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＹ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の７位および／または９位に存在している。Ｏ−アセチル化の割合は、Ｏ−アセチル化を有する反復単位の割合をいう。これはコンジュゲート化する前におよび／またはコンジュゲート化後に糖類において測定することができる。
【００３９】
タンパク質キャリアは任意のペプチドまたはタンパク質とすることができる。それは１以上のＴヘルパーエピトープを含んでもよい。本発明の１つの実施形態では、タンパク質キャリアは以下のもの：ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される。タンパク質キャリアは、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドフラグメントＣ、破傷風毒素の無毒性突然変異体［ＴＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい］、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素の他の無毒性突然変異体［例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ １９７、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ ４５（Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973）；ＣＲＭ ９、ＣＲＭ ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ １０３およびＣＲＭ１０７ならびにNicholls and ＹouleによりGenetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992のなかで記述されている他の突然変異；欠失あるいは１４８位のＧｌｕ（Ｇｌｕ−１４８）のＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの突然変異および／または１５８位のＡｌａ（Ａｌａ １５８）のＧｌｙへの突然変異ならびに米国特許第４７０９０１７号もしくは米国特許第４９５０７４０号に開示されている他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の突然変異ならびに米国特許第５９１７０１７号または米国特許第６４５５６７３号に開示されている他の突然変異；あるいは米国特許第５８４３７１１号に開示されているフラグメント］（ＤＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい）、肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ（Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌（meningococcal）外膜タンパク質−通常は髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂから抽出される−欧州特許
第０３７２５０１号）、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（国際公開公報第９３／１７７１２号、国際公開公報第９４／０３２０８号）、百日咳タンパク質（国際公開公報第９８／５８６６８号、欧州特許第０４７１１７７号）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン（国際公開公報第９１／０１１４６号）、Ｎ１９タンパク質（Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7）のような種々の病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824）、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ（国際公開公報第０２／０９１９９８号）、鉄取込みタンパク質（iron uptake proteins）（国際公開公報第０１／７２３３７号）、偏性嫌気性有芽胞グラム陽性桿菌（C. difficile）の毒素ＡもしくはＢ（国際公開公報第００／６１７６１号）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（欧州特許第５９４６１０号および国際公開公報第００／５６３６０号）、肺炎球菌のＰｈｔＡ（国際公開公報第９８／１８９３０号、Ｓｐ３６ともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＤ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＢ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂともいわれる）、またはＰｈｔＥ（国際公開公報第００／３０２９９号に開示されており、ＢＶＨ−３といわれる）であってもよい。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法により取得することができるまたは取得された糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート（または免疫原性組成物もしくはワクチン）が提供される。従って、本発明の方法は、本発明のコンジュゲート化方法を行い、得られた糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートを免疫原性組成物またはワクチン中に製剤化する（例えばコンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化することにより）ことによる、本発明の免疫原性組成物またはワクチンの作製方法に包含され得る。
【００４１】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用、および有効用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法がさらに提供される。前記の使用または方法は、疾患が以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌(Group B Streptococcus)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものでありうる。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物はＤＴＰａまたはＤＴＰｗワクチン（例えばＤＴ、ＴＴ、および全細胞百日咳（Ｐｗ）ワクチンまたは無細胞百日咳（Ｐａ）ワクチン（例えば百日咳トキソイド、ＦＨＡ、ペルタクチン、ならびに任意で、アグルチノーゲン２および３を含む）のいずれかを含有するもの）を含んでもよい。そのような組合せにはＢ型肝炎に対するワクチンが含まれてもよい（例えばそれには、リン酸アルミニウムに吸着されていてもよいＢ型肝炎表面抗原［ＨｅｐＢ］が含まれてもよい）。１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つ、２つもしくは全ての糖類コンジュゲートが本発明の方法によって作製されているＨｉｂ、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂ、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲート、またはＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲートを含む。
【００４３】
本発明の免疫原性組成物は任意で、麻疹および／または流行性耳下腺炎および／または風疹および／または水痘により引き起こされる疾患に対する防御を与える追加のウイルス抗原を含む。例えば、本発明の免疫原性組成物は、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹（ＭＭＲ）または麻疹、流行性耳下腺炎、風疹および水痘（ＭＭＲＶ）の抗原を含有する。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は、組成物の中に存在している髄膜炎菌（meningococcal）のおよび／またはＨｉｂの糖類コンジュゲートと同じ容器の中に存在していてもよい。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は凍結乾燥されている。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの抗原をさらに含む。この抗原は任意で、欧州特許第３０１９９２号、国際公開公報第０１／０９３５０号、国際公開公報第０４／１４４１７号、国際公開公報第０４／１４４１８号および国際公開公報第０４／１４４１９号に記述の髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの外膜小胞調製物である。
【００４５】
一般に、本発明の免疫原性組成物は、糖類０．１〜２０μｇ、２〜１０μｇ、２〜６μｇまたは４〜７μｇの各糖類コンジュゲートの用量を含むことができる。
【００４６】
「およそ」または「約」は、本発明の目的で所与の数量の１０％くらいの範囲内と定義される。
【００４７】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はｐＨ ７．０〜８．０、ｐＨ ７．２〜７．６またはおよそもしくは正確にｐＨ ７．４に調整されもしくはそれらのｐＨで緩衝化され、またはそれらのｐＨに調整されている。
【００４８】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは任意で、安定化剤、例えばスクロースまたはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で凍結乾燥されてもよい。
【００４９】
任意で、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含んでもよい。適当なアジュバントはアルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875によって記述されているものなどの免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
髄膜炎菌（N. meningitidis）またはＨｉｂＭｅｎの組合せの場合、どのアルミニウム塩アジュバントもまたはどのアジュバントも全く使用しないことが好都合であるかもしれない。
【００５１】
全ての免疫原性組成物またはワクチンと同様に、免疫学的に有効な量の免疫原は実験的に決定されなければならない。考慮されるべき要因としては、免疫原性、免疫原がアジュバントまたはキャリアタンパク質もしくはその他のキャリアと複合体形成されるかまたはそれらに共有結合されるか否か、投与経路、および投与される免疫量の数が挙げられる。
【００５２】
本発明の医薬組成物またはワクチンの中にさまざまな濃度で活性な作用物質が存在していてもよい。典型的には、この物質の最小濃度はその目的の用途を達成するのに必要な量であり、その一方で最大濃度は、溶解状態のままでいられるか、または最初の混合物のなかで均一に懸濁されていられる最大量である。例えば、治療薬の最小量は任意で、単回の治療的に有効な投与量を与えられるものであってもよい。生物活性物質の場合、最小濃度は再構成時の生物活性に必要な量であり、最大濃度は均一な懸濁液を維持することができないポイントである。単回用量単位の場合には、その量は単回の治療的投与のものである。一般に、各用量はタンパク質抗原を１〜１００μｇ、任意で５〜５０μｇまたは５〜２５μｇ含むものと予想される。例えば、細菌糖類の用量はコンジュゲート中にて糖類１０〜２０μｇ、５〜１０μｇ、２．５〜５μｇまたは１〜２．５μｇである。
【００５３】
本発明のワクチン調製物は、全身経路または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することによって、感染を受けやすい哺乳動物（例えばヒト患者）を防御するためにまたは治療するために使用することができる。ヒト患者は任意で、乳児（月齢１２ヵ月未満の）、幼児（月齢１２〜２４ヵ月、１２〜１６ヵ月もしくは１２−１４ヵ月）、小児（２〜１０歳、３〜８歳もしくは３〜５歳）、青年（１２〜２１歳、１４〜２０歳もしくは１５〜１９歳）または成人であってもよい。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下の経路による注入、または口腔／消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与による注入を挙げることができる。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻腔内投与が好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をいっそう効果的に予防し、したがってその最も初期段階で感染を弱められるからである）。本発明のワクチンは単回用量として投与することができるが、その成分を同時にまたは異なった時間に共投与することもできる（例えば、ワクチンの中に糖類が存在する場合、相互に免疫応答の最適な協調性を得るため、これらを同時にまたは細菌タンパク質ワクチンの投与から１〜２週間後に別々に投与することができる）。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、ウイルス抗原をＩＤ（皮内）投与することができ、一方で細菌タンパク質をＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻腔内）投与することができる。糖類が存在する場合、それらをＩＭ（またはＩＤ）投与することができ、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンを初回投与ではＩＭ投与、および追加投与ではＩＮ投与することができる。
【００５４】
ワクチン調製物はVaccine Design (The subunit and adjuvant approach (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)に広く記述されている。リポソーム内の封入はFullerton、米国特許第４，２３５，８７７号に記述されている。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって作製された本発明のＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類を、本発明によって作製されていないＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ、ならびに製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法である。
【００５６】
本発明のチフス菌（Salmonella typhi）免疫原性組成物／ワクチン
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、本発明の方法により作製されたＶｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む。Ｖｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートは、ヒト用量あたり０.５〜１５、１〜１０、２.０〜７.５または２.５〜５ μｇのＶｉ糖類を含んでいてもよい。
【００５７】
コンジュゲート中のチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類は、登録された製品であるＴｙｐｈｅｒｉｘ（登録商標）（GlaxoSmithKline Biologicals s.a.）中のＶｉ糖類と同じであってもよく、これは欧州特許第１１０７７８７号に記載されている。１つの実施形態では、本発明のＶｉ糖類コンジュゲートは、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、または水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、Ｖｉ糖類コンジュゲートは、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００５８】
１つの態様では、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、Ｈｉｂ莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含む。これは、本発明の方法により、または当技術分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えばこれは、GlaxoSmithKline Biologicals s.a.のＨｉｂｅｒｉｘ（登録商標）製品であってもよい。インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Ｈｉｂ）ＰＲＰ多糖のＴＴとの共有結合は、Chuら（Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256）により開発されたカップリング化学反応により行うことができる。ＣＮＢｒを添加し、ｐＨ１０．５で６分間インキュベートすることにより、Ｈｉｂ ＰＲＰ多糖を活性化する。ｐＨをｐＨ８．７５に下げ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、インキュベーションをさらに９０分間続ける。１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド縮合により、活性化されたＰＲＰを、例えば、精製された破傷風トキソイドにカップリングすることができる。最終比率０．６ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、活性化されたＰＲＰにＥＤＡＣを添加する。ｐＨを５．０に調整し、２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、精製された破傷風トキソイドを添加する。得られた溶液を穏やかに撹拌しながら３日間放置する。０．４５μｍのメンブレンを通した濾過の後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００ＨＲ（Pharmacia, Sweden）カラムにてコンジュゲートを精製する。
【００５９】
Ｈｉｂ抗原コンジュゲートは、任意で国際公開公報第９７／００６９７号に記載されているようにリン酸アルミニウムに吸着されていても、または国際公開公報第０２／００２４９号に記載されているように吸着されていなくても、または吸着させるための特別な工程に付されていなくてもよい。本明細書において「アルミニウムアジュバント塩に吸着されていない」抗原は、新鮮なアルミニウムアジュバント塩上での抗原の発現または特定の吸着ステップが、組成物を製剤化する方法に含まれないことを意味する。１つの実施形態では、Ｈｉｂは、国際公開公報第０２／００２４９号に記載されているように、低用量（例えば１〜６μｇ、２〜４μｇまたは約もしくは正確に２．５μｇの糖類）で存在する。
【００６０】
１つの実施形態では、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートは、Ｖｉ糖類コンジュゲートの糖類用量よりも低い糖類用量で存在する。例えば、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートは、ヒト用量（通常０．５ ｍＬ）あたり０．１〜９、１〜５、または２〜３ μｇの糖類を含んでいてもよい。Ｈｉｂ糖類は、本明細書に記載される任意のタンパク質キャリア、例えばＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、プロテインＤ、ＯＭＰＣおよびＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される１つにコンジュゲート化されていてもよい。１つの態様では、同一のタンパク質キャリアが、Ｈｉｂ糖類コンジュゲートおよびＶｉ糖類コンジュゲート中に（例えば独立に）使用される（例えばＴＴ）。Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率は、１:５〜５:１（ｗ／ｗ）、例えば１:１〜１:４、１:２〜１:３．５または約１:３（ｗ／ｗ）であってもよい。Ｈｉｂ糖類は、典型的には二官能性（ホモまたはヘテロ二官能性）であるリンカーを介してタンパク質キャリアにコンジュゲート化されていてもよい。リンカーは、２つの反応性アミノ基（各末端に１つ）、または２つの反応性カルボン酸基、または一方の末端に反応性アミノ基および他方の末端に反応性カルボン酸基を有していてもよい。リンカーは４〜１２炭素原子を有していてもよい。１つの態様では、リンカーはＡＤＨである。Ｈｉｂ糖類は、ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰを用いてタンパク質キャリアまたはリンカーにコンジュゲート化されていてもよい。タンパク質キャリアは、カルボジイミド化学反応、任意でＥＤＡＣ化学反応を用いてＨｉｂ糖類またはリンカーにコンジュゲート化されていてもよい。本発明のＶｉコンジュゲートを使用することができる、Ｖｉおよび／またはＨｉｂコンジュゲート抗原を含むさらなるワクチンの組み合わせは、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２１０、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６１８８、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６９、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６８、またはＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２２０に記載されている。
【００６１】
さらなる態様では、本発明の免疫原性組成物またはワクチン中のＶｉまたはＶｉ ＋ Ｈｉｂコンジュゲートはさらなる抗原と混合されている。例えば以下のリストからの１以上を、単独でまたは任意に組み合わせて添加することができる（以下にさらに詳細に記載する）：ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチン、Ｂ型肝炎表面抗原などのＢ型肝炎ワクチン／抗原(任意でリン酸アルミニウムに吸着されている）、不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物などのＡ型肝炎ワクチン／抗原、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物（任意で１、２および３型を含む）などのポリオウイルスワクチン／抗原、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート［ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである］、ＲＴＳ，Ｓなどのマラリアワクチン／抗原。
【００６２】
さらなる態様では、ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートは、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、共凍結乾燥（co-lyophilised）されている。凍結乾燥製剤は、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート（ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである）をさらに含んでいてもよい。本発明の凍結乾燥組成物は、投与前に水性媒体により再構成されてもよい。水性媒体は緩衝化されていてもよい。水性媒体は、例えば上に挙げられ、凍結乾燥組成物中にまだ含まれていないさらなる抗原［例えば以下のリストからの１以上が、単独でまたは任意の組み合わせで（以下にさらに詳細に記載する）水性媒体に存在していてもよい：ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチン、Ｂ型肝炎表面抗原などのＢ型肝炎ワクチン／抗原(任意でリン酸アルミニウムに吸着されている）、不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物などのＡ型肝炎ワクチン／抗原、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物（任意で１、２および３型を含む）などのポリオウイルスワクチン／抗原、１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート［ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである］、ＲＴＳ，Ｓなどのマラリアワクチン／抗原)を有していてもよい。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたは両方の混合物を含んでいてもよい。あるいは、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、アルミニウム塩を含んでいなくても、またはアジュバント化されていなくてもよい。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ｐＨ７．０〜８．０に緩衝化されていてもよい。
【００６４】
本発明のさらなる態様では、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、チフス菌（Salmonella typhi）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）により引き起こされる疾患に対する防御を宿主に付与するための２種の多価免疫原性組成物を含む同時または連続投与のためのワクチンキットが提供され、前記キットは：
破傷風トキソイド（ＴＴ）、
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、および
全細胞または無細胞百日咳成分（ＰｗまたはＰａ）
を含む第１容器と、
本発明の免疫原性組成物またはワクチンを含む第２容器
とを含む。第１容器は、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、Ｂ型肝炎表面抗原をさらに含んでいてもよい。第１容器または第２容器は、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）をさらに含んでいてもよい。
【００６５】
疾患の予防または治療のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物またはワクチンあるいはキットの使用も提供され、これは、有効用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンをそのような処置が必要な患者に投与するステップを含む疾患の予防または治療方法である。本発明の使用または方法は、以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）からなるリストより選択される１以上の細菌により引き起こされる疾患に関するものであってもよい。
【００６６】
本発明の組成物／ワクチンに追加するさらなる抗原／ワクチン
ＤＴＰワクチン／抗原成分
ＤＴＰワクチンは、ジフテリア、破傷風および百日咳（B. pertussis）疾患を予防または治療するためのよく知られているワクチンである。本発明のワクチンは、ジフテリア、破傷風および／または百日咳成分を含んでいてもよい。
【００６７】
ジフテリア抗原は、典型的にはジフテリアトキソイドである。ジフテリアトキソイド（ＤＴ）の調製物は多く報告されている。任意の適切なジフテリアトキソイドを使用することができる。例えば、ＤＴは、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の培養物からの毒素を精製し、次いで化学的に解毒することにより製造することができるが、代わりに、組み換え、または遺伝子操作により解毒された毒素の類似体（例えば、ＣＲＭ１９７、または米国特許第４,７０９,０１７号、米国特許第５,８４３,７１１号、米国特許第５,６０１,８２７号、および米国特許第５,９１７,０１７号に記載されているような他の突然変異体）を精製することにより製造する。１つの実施形態では、本発明のジフテリアトキソイドは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のジフテリアトキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ジフテリアトキソイドは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００６８】
本発明の破傷風抗原は、典型的には破傷風トキソイドである。破傷風トキソイド（ＴＴ）の調製方法は当技術分野において周知である。１つの実施形態では、ＴＴは、破傷風菌（Clostridium tetani）の培養物から毒素を精製し、次いで化学的に解毒することにより製造されるが、代わりに、組み換え、または遺伝子操作により解毒された毒素の類似体（例えば、欧州特許第２０９２８１号に記載されているような）を精製することにより製造される。任意の適切な破傷風トキソイドを使用することができる。「破傷風トキソイド」には、全長タンパク質の免疫原性フラグメント（例えばＣフラグメント−欧州特許第４７８６０２号を参照）が含まれ得る。１つの実施形態では、本発明の破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の破傷風トキソイドは、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、破傷風トキソイドは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００６９】
本発明の百日咳成分は、精製された百日咳抗原を使用する無細胞（Ｐａ）であっても、死滅全細胞百日咳菌を百日咳成分として使用する全細胞（Ｐｗ）のどちらであってもよい。Ｐｗは、水銀を使用しない方法を含むいくつかの方法により不活化されていてもよい。このような方法には、熱不活化（例えば５５〜６５℃または５６〜６０℃、５〜６０分間または１０〜３０分間、例えば６０℃で３０分間）、ホルムアルデヒド不活化（例えば３７℃で０．１％、２４時間）、グルタルアルデヒド不活化（例えば室温で０．０５％、１０分間）、アセトン−I不活化（例えば室温で３回処理）およびアセトン−II不活化（例えば室温で３回処理および３７℃で４回処理）（例えばGupta et al., 1987, J. Biol. Stand. 15:87; Gupta et al., 1986, Vaccine, 4:185を参照）が含まれ得る。本発明に適切な死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）（Ｐｗ）の調製方法は、国際公開公報第９３／２４１４８号に開示されており、これはＤＴ-ＴＴ-Ｐｗ-ＨｅｐＢワクチンの製造に適切な製剤化方法である。チオメルサールは、過去において死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）の調製に使用されてきた。しかしながら、１つの実施形態では、本発明のワクチンの製剤化方法において、チオマーサルは使用されない。
【００７０】
典型的には、５〜５０ ＩＯＵ、７〜４０ ＩＯＵ、９〜３５ ＩＯＵ、１１〜３０ ＩＯＵ、１３〜２５ ＩＯＵ、１５〜２１ ＩＯＵまたは約もしくは正確に２０ ＩＯＵのＰｗ用量が使用される。
無細胞Ｐａワクチンも周知であり、以下のものからの２以上の抗原を含んでいてもよい：百日咳トキソイド［または公知の百日咳毒素の解毒化された遺伝子突然変異体］（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、ペルタクチン（ＰＲＮ）、アグルチノーゲン２および３。１つの実施形態では、ＰａワクチンはＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮを含む。
【００７１】
１つの実施形態では、本発明の百日咳成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の百日咳成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、百日咳成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。
【００７２】
Ｂ型肝炎抗原／ワクチン
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の調製は、多数報告されている。例えば、Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54:125、Gregg et al., 1987, Biotechnology 5:479、欧州特許第０２２６８４６号、欧州特許第０２９９１０８号を参照されたい。ＨＢｓＡｇは以下のように調製することができる。一つの方法は、多量のＨＢｓＡｇは肝臓において合成されＨＢＶ感染中血流中に放出されるため、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子形態の抗原を精製することを含む。別の方法は、組み換えDNA法によりタンパク質を発現させることを含む。ＨＢｓＡｇは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母、ピキア属、昆虫細胞（例えばＨｉ５）または哺乳動物細胞において発現させることにより調製することができる。ＨＢｓＡｇはプラスミドに挿入することができ、またプラスミドからのＨＢｓＡｇの発現を「ＧＡＰＤＨ」プロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来）などのプロモーターにより制御することができる。酵母菌は合成培地中で培養することができる。次に、ＨＢｓＡｇは、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、および限外ろ過などのステップを含む方法により精製することができる。精製後、ＨＢｓＡｇは、（例えばシステインに関する）透析に供することができる。ＨＢｓＡｇは粒子形態で使用することができる。
【００７３】
本明細書において使用される表現「Ｂ型肝炎表面抗原」または「ＨＢｓＡｇ」は、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示す任意のＨＢｓＡｇ抗原またはその断片を含む。ＨＢｓＡｇ Ｓ抗原の２２６アミノ酸配列（Tiollais et al., 1985, Nature 317:489およびその中の参考文献を参照されたい）に加えて、本明細書に記載されるＨＢｓＡｇは、所望により、上記文献および欧州特許第０２７８９４０号に記載されているように、プレ−Ｓ配列の全部又は一部を含んでいてもよいと理解されるであろう。特に、ＨＢｓＡｇは、ad血清型のＢ型肝炎ウイルス上のオープン・リーディング・フレームに対応するＨＢｓＡｇのＬ−タンパク質の残基１３３〜１４５、その後の残基１７５〜４００を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド（このポリペプチドをＬ*と呼ぶ；欧州特許第０４１４３７４号参照）を含んでいてもよい。本発明の範囲のＨＢｓＡｇは、欧州特許第０１９８４７４号（Endotronics）に記載されるプレＳ１−プレＳ２−Ｓポリペプチドまたは欧州特許第０３０４５７８号（McCormickおよびJones）に記載されるようなこれらの類似体を含んでいてもよい。本明細書に記載されるＨＢｓＡｇは、突然変異体、例えば国際公開公報第９１／１４７０３号またはＥＰ０５１１８５５Ａ１号に記載される「エスケープ突然変異体（escape mutant）」、特に１４５位におけるアミノ酸がグリシンからアルギニンに置換されているＨＢｓＡｇも指し得る。
【００７４】
ＨＢｓＡｇは粒子形態にあってもよい。粒子は例えばＳプロテインを単独で含んでいてもよく、また複合粒子、例えば(Ｌ*、Ｓ）（ここで、Ｌ*は上に定義した通りであり、ＳはＨＢｓＡｇのＳ−プロテインを表す）であってもよい。前記粒子は有利には、ＨＢｓＡｇが酵母中に発現されている形態である。
【００７５】
１つの実施形態では、ＨＢｓＡｇはＥｎｇｅｒｉｘＢ（商標）（GlaxoSmithKline Biologicals S.A.）中に使用される抗原であり、これは国際公開公報第９３／２４１４８号にさらに記載されている。
【００７６】
Ｂ型肝炎表面抗原はリン酸アルミニウムに吸着されていてもよく、これを他の成分と混合する前に行ってもよい（国際公開公報第９３／２４１４８号に記載されている）。Ｂ型肝炎成分は実質的にチオメルサール不含であるべきである（チオメルサールを含まないＨＢｓＡｇの調製方法は欧州特許第１３０７４７３号において既に公開されている）。
【００７７】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ、Ｃ、ＷまたはＹ型抗原
本発明のワクチン／組成物は、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｗ型（ＭｅｎＷ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）、および髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｙ型（ＭｅｎＹ、任意でキャリアタンパク質にコンジュゲート化されている）からなる群より選択される細菌の莢膜糖類をさらに含んでいてもよい。
【００７８】
本発明のワクチンは、髄膜炎菌（N. meningitidis）の異種菌株由来の１以上の抗原を含んでいてもよく、以下に詳述するように、これらは単独で使用されても、または２、３もしくは４成分の任意の組み合わせで使用されてもよい：ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ、またはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹまたはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＡ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹ、ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹまたはＭｅｎＡ＋ＭｅｎＣ＋ＭｅｎＷ＋ＭｅｎＹ。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）成分は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。コンジュゲートは任意の方法で作製することができ、１つの実施形態では、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２１０、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６１８８、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６９、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２６８、またはＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６２２０に記載の方法が利用される。コンジュゲートは、本発明のコンジュゲート化方法を用いて作製することができる。
【００８０】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ型ブレブ（bleb）または抗原
本発明のワクチンは、国際公開公報第０１／０９３５０号、国際公開公報第０３／１０５８９０号、国際公開公報第０４／０１４４１７号、または国際公開公報第０４／０１４４１８号に記載されるような外膜小胞またはブレブ（bleb）などのＭｅｎＢ成分またはコンジュゲート化されたＭｅｎＢ莢膜糖類（またはその誘導体）抗原（例えば国際公開公報第９６／４０２３９号参照）を含んでいてもよい。１つの実施形態では、本発明のＭｅｎＢ成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＭｅｎＢ成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ＭｅｎＢ成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、ＭｅｎＢ成分は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００８１】
Ａ型肝炎抗原／ワクチン
Ａ型肝炎に対する防御を与える成分は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のＨＭ−１７５菌株由来の死滅弱毒化ワクチンであるＨａｖｒｉｘ（商標）（GlaxoSmithKline Biologicals S.A.の登録商標）として知られている製品であってもよい（F.E. Andreらによる「Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A」、1980, Prog. Med. Virol. 37:72 およびSmithKline Beecham Biologicals 1991により刊行された製品モノグラフ「Havrix」を参照されたい）。Flehmigら（1990, Prog. Med Virol. 37:56）には、Ａ型肝炎の臨床面、ウイルス学、免疫学および疫学が総論としてまとめられており、またこの一般的なウイルス感染に対するワクチンの開発アプローチについて議論されている。本明細書において使用される表現「ＨＡＶ抗原」または「ＨＡＶワクチン」または「Ａ型肝炎ワクチン」は、ヒトにおいてＨＡＶに対する中和抗体を刺激することができる任意の抗原を指す。１つの実施形態では、ＨＡＶ抗原は不活化弱毒化ウイルス粒子を含み、あるいは別の実施形態では、ＨＡＶ抗原は、組み換えDNA技術により好都合に取得できるＨＡＶカプシドまたはＨＡＶウイルスタンパク質であり得る。１つの実施形態では、本発明のＡ型肝炎成分は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＡ型肝炎成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、Ａ型肝炎成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、Ａ型肝炎ワクチンを含む本発明の組成物はフェノールを含まない。
【００８２】
マラリア抗原／ワクチン
本発明のワクチンは、マラリア抗原をさらに含んでいてもよい。マラリア抗原は、ＲＴＳ，Ｓ（米国特許第６,３０６,６２５号および欧州特許第０６１４４６５号に記載されるＣＳおよびＨＢｓＡｇのハイブリッドタンパク質）であってもよい。１つの実施形態では、ＲＴＳ，ＳをＨＢｓＡｇの代わりに本発明のワクチン中に使用してもよい。他のマラリア抗原を本発明のワクチン中に使用してもよく、これには、ＣＳタンパク質、ＲＴＳ、ＴＲＡＰ、Ｂ２９９２の１６ｋＤタンパク質、ＡＭＡ-１、ＭＳＰ１が含まれ、任意でＣｐＧが含まれる（国際公開公報第２００６／０２９８８７号、国際公開公報第９８／０５３５５号、国際公開公報第０１／００２３１号）。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明のマラリア抗原は、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のマラリア抗原は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、マラリア抗原は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。１つの実施形態では、マラリア抗原は、水中油型乳剤および／または脂質Ａ誘導体（ＭＰＬなど）および／またはステロール（コレステロールなど）および／またはトコール（α-トコフェロールなど）でアジュバント化されている。別の実施形態では、マラリア抗原は、アジュバント、例えばアルミニウムアジュバント塩に吸着されていなくてもよい。
【００８４】
ポリオウイルス抗原／ワクチン
本発明のワクチンは、ポリオウイルスに対する防御を与える抗原をさらに含んでいてもよい。１つの実施形態では、不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）が含まれる。本発明のワクチン／組成物は、ＩＰＶ１型（例えばＭａｈｏｎｅｙまたはＢｒｕｎｈｉｌｄｅ）またはＩＰＶ２型（例えばＭＥＦ−１）またはＩＰＶ３型（例えばＳａｕｋｅｔｔ）、あるいはＩＰＶ１および２型、またはＩＰＶ１および３型、またはＩＰＶ２および３型、あるいはＩＰＶ１、２および３型を含んでよい。
【００８５】
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）の調製方法は当技術分野において周知である。１つの実施形態では、ＩＰＶはワクチンの分野において一般的であるように１、２および３型を含むべきであり、またホルムアルデヒドで不活化されているソークポリオワクチンであってもよい（例えば、Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47:287；Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59:113；Salk et al., 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5):563；Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47:139; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255を参照されたい）。
【００８６】
１つの実施形態では、（例えば他の成分と混合する前に）ＩＰＶは吸着されていない。別の実施形態では、本発明のＩＰＶ成分は、（例えば他の成分と混合する前または後に）水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。別の実施形態では、本発明のＩＰＶ成分は、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩に吸着されていてもよい。さらなる実施形態では、ＩＰＶ成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物に吸着されていてもよい。吸着されている場合、１以上のＩＰＶ成分は、別個にまたは混合物として一緒に吸着されていてもよい。ＩＰＶは、国際公開公報第２００４／０３９４１７号に記載されているような特別な乾燥工程により安定化されていてもよい。
【００８７】
ポリオウイルスは、細胞培養物中で増殖させることができる。細胞培養物は、サル腎臓由来の継代細胞株であるＶＥＲＯ細胞株またはＰＭＫＣであってよい。ＶＥＲＯ細胞は、好都合にはマイクロキャリア上で培養することができる。ウイルス感染前および感染中のＶＥＲＯ細胞の培養には仔ウシ血清などのウシ由来物質の使用が含まれてよく、またこの物質はウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得るべきである。培養物はラクトアルブミン加水分解物などの物質を含んでいてもよい。増殖させた後、ビリオンは、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技術を用いて精製することができる。患者への投与の前に、ウイルスを不活化しなければならず、またこれはホルムアルデヒドで処理することにより達成することができる。
【００８８】
ウイルスは、個別に増殖、精製、そして不活化でき、次いで組み合わされて、ＩＰＶワクチンに使用するまたは他の抗原に加えるためのバルク混合物（bulk mixture）を与えることができる。
【００８９】
本発明のワクチン中の抗原は、「免疫学的に有効な量」で存在する、すなわちその量の個体への投与が、単回用量においてまたは一連の部分として、疾患の治療または予防に有効である。投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画（例えば追加投与を含む）であってもよい。
【００９０】
入手可能なポリオワクチンの標準的な用量は、不活化ポリオウイルス１型の４０Ｄ抗原ユニット、不活化ポリオウイルス２型の８Ｄ抗原ユニットおよび不活化ポリオウイルス３型の３２Ｄ抗原ユニットを含む（例えばＩｎｆａｎｒｉｘ−ＩＰＶ（商標））。
【００９１】
アジュバント
本発明のワクチン／組成物は、適切なアジュバントなどの製薬上許容される賦形剤を含んでいてもよい。適切なアジュバントには水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシン、またはアシル化糖の不溶性懸濁液であってもよく、またはカチオンもしくはアニオンで誘導体化された糖類、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、脂質Ａ誘導体（例えば毒性が低減されている）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ［３Ｄ-ＭＰＬ］、ｑｕｉｌ Ａ、サポニン、ＱＳ２１、フロイントの不完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）、メルクアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）、ＡＳ−２（Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、生体接着剤および粘膜付着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、ムラミルペプチドもしくはイミダゾキノロン化合物（例えばイミクアモド（imiquamod）およびそのホモログ）であってもよい。本発明においてアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節剤にはサイトカインが含まれ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）もアジュバントとして使用することができる。
【００９２】
本発明の１つの実施形態では、製剤のアジュバント組成物は、主にＴＨ１型の免疫応答を誘発する。高レベルのＴＨ１型サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）には、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘発を促進する傾向がある。応答が主にＴＨ１型である１つの実施形態においては、ＴＨ１型サイトカインのレベルは、ＴＨ２型サイトカインのレベルを超える程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの総論については、Mosmann and Coffman, 1989, Ann. Rev. Immunol. 7:145を参照されたい。
【００９３】
従って、主にＴＨ１応答を促進する適切なアジュバント系には、脂質Ａの誘導体（例えば毒性が低減されている）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはその誘導体、特に３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ-ＭＰＬ）、およびモノホスホリル脂質Ａ、任意で３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、とアルミニウム塩との組み合わせが含まれる。強化された系には、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ、特に国際公開公報第９４／００１５３号に開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ-ＭＰＬとの組み合わせ、または国際公開公報第９６／３３７３９号に開示されているようなＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応性の低い（less reactogenic）組成物が含まれる。水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ-ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第９５／１７２１０号に記載されている。ワクチンは、サポニン（ＱＳ２１でもよい）をさらに含んでいてもよい。製剤は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含んでいてもよい（国際公開公報第９５／１７２１０号）。オリゴヌクレオチドを含む非メチル化ＣｐＧ（国際公開公報第９６／０２５５５号）もＴＨ１応答の優先的誘導剤であり、また本発明における使用に適切である。
【００９４】
本発明のワクチンは、上に特定した１以上のアジュバントの態様の組み合わせを含んでいてもよい。
【００９５】
Ａｌ（ＯＨ）３／ＡｌＰＯ４比率は、０／１１５、２３／９２、６９／４６、４６／６９、９２／２３または１１５／０であり得る。
【００９６】
一方、本発明のワクチンの特定の成分は、アジュバント、特にアルミニウム塩に明確に吸着されていなくてもよい。
【００９７】
ＩＰＶは吸着されていなくてもまたはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＤＴはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＴＴはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＰｗはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたはこれと混合されていてもよく、ＰＲＮはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＦＨＡはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＰＴはＡｌ（ＯＨ）３に吸着されていてもよく、ＨＢ（ＨｅｐＢ表面抗原）はＡｌＰＯ４に吸着されていてもよく、ＨｉｂはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、Ｍｅｎ ＡＣＷＹはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＭｅｎＢはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＶｉはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもまたは吸着されていなくてもよく、ＨｅｐＡはＡｌ（ＯＨ）３もしくはＡｌＰＯ４に吸着されていてもよい。
アルミニウム塩に予め吸着されている抗原は、混合前に個別に予め吸着させることができる。別の実施形態では、抗原の混合物は、さらなるアジュバントとの混合の前に予め吸着させてもよい。１つの実施形態では、ＩＰＶは、個別にまたはＩＰＶ１、２および３型の混合物として吸着されてもよい。
【００９８】
「吸着されている抗原」は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超えて吸着されていることを意味すると解される。
【００９９】
本明細書に使用される用語「リン酸アルミニウム」および「水酸化アルミニウム」の意味には、ワクチンをアジュバント化するのに適切な水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの全ての形態が含まれる。例えば、リン酸アルミニウムは不溶性リン酸アルミニウム（非晶質、半結晶性または結晶性）の沈殿物であり得、これは、任意でしかしこれに限定されることなく、可溶性アルミニウム塩およびリン酸塩を混合することにより調製することができる。「水酸化アルミニウム」は不溶性（非晶質、半結晶性または結晶性）水酸化アルミニウムの沈殿物であり得、これは、任意でしかしこれに限定されることなく、アルミニウム塩の溶液を中和することにより調製することができる。商業的供給源から入手可能な水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムゲルの種々形態、例えば、Brenntag Biosector(Denmark)により供給されているＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム、水中の３％懸濁液）およびＡｄｊｕｐｈｏｓ（リン酸アルミニウム、生理食塩水中の２％懸濁液）が特に適切である。
【０１００】
本発明のワクチンの非免疫学的成分
本発明のワクチンは、典型的には、上記の抗原性成分およびアジュバント成分に加えて、１以上の「製薬上許容される担体または賦形剤」を含み、これには、それ自体は組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意の賦形剤が含まれる。適切な賦形剤は、典型的には、大きく、代謝が遅い巨大分子、例えばタンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19:2118）、トレハロース（国際公開公報第００／５６３６５号）、ラクトースおよび脂質凝集物（油滴またはリポソームなど）である。このような担体は当業者に周知である。ワクチンは、水、生理食塩水、グリセロール等などの希釈剤を含んでいてもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在していてもよい。無菌の発熱性物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水が典型的な担体である。製薬上許容される賦形剤についての詳細な議論は参考文献Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472で得られる。
【０１０１】
本発明の組成物は、凍結乾燥されていても、または水性形態、すなわち溶液もしくは懸濁液であってもよい。このタイプの液体製剤は、水性媒体中で再構成する必要なしにパッケージングされた形態から組成物を直接投与することができ、よって注射に理想的である。組成物はバイアル中に存在させることができ、またはこれらは既充填（ready-filled）シリンジ中に存在させることができる。シリンジには針があってもなくてもよい。バイアルが単回用量または複数回用量（例えば２回用量）を含むことができるのに対し、シリンジは単回用量の組成物を含むであろう。
【０１０２】
本発明の液体ワクチンは、凍結乾燥された形態から他のワクチンを再構築するのにも適切である。ワクチンをこのように即座に再構成するのに使用する場合、本発明はキットを提供するが、これは２つのバイアルを含むことができるか、または1つの既充填（ready-filled）シリンジおよび１つのバイアルを含むことができ、このシリンジの内容物が注射前にバイアルの内容物の再構築に使用される。
【０１０３】
本発明のワクチンは、単回用量形態または複数回用量形態（例えば２回用量）にパッケージングすることができる。複数回用量形態については、バイアルは予め充填されたシリンジが好ましい。有効な投与体積は、慣用的に確立することができるが、注射用組成物の典型的なヒト用量は０．５ｍＬの体積を有する。
【０１０４】
１つの実施形態では本発明のワクチンはｐＨ６．０〜８．０を有し、別の実施形態では本発明のワクチンはｐＨ６．３〜６．９、例えば６．６±０．２を有する。ワクチンはこのｐＨに緩衝化されていてもよい。安定なｐＨは緩衝液の使用により維持することができる。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することができる（国際公開公報第０３／００９８６９号）。組成物は無菌であるべきでありおよび／または発熱性物質を含まないべきである。
【０１０５】
本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であってもよい。
【０１０６】
本発明のワクチンは、特に複数回用量形態にパッケージングする場合、抗菌剤を含んでいてもよい。チオメルサールは、ＩＰＶ成分の効力を損失させるので避けるべきである。２-フェノキシエタノールまたはパラベン（メチル、エチル、プロピルパラベン）などの他の抗菌剤を使用することができる。任意の防腐剤を低いレベルで存在させることが好ましい。防腐剤は外から加えられたものでもよく、および／または混合されて組成物を形成するバルク抗原の成分であってもよい（例えば 百日咳抗原中に防腐剤として存在する）。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明のワクチンはチオメルサールを含まないかまたは実質的に含まない。チオメルサールを含まないまたは実質的に含まないとは、ＩＰＶ成分の効力に負の影響を与えるのに十分なチオメルサールが最終製剤中に存在しないことを意味する。例えば、チオメルサールをＰｗまたはＢ型肝炎表面抗原精製工程中に使用する場合、ＩＰＶと混合する前にチオメルサールは実質的に除去されるべきである。最終ワクチン中のチオメルサール含有量は０．０２５μｇ／μｇタンパク質未満、０．０２μｇ／μｇタンパク質未満、０．０１μｇ／μｇタンパク質未満または０．００１μｇ／μｇタンパク質未満、例えば０μｇ／μｇタンパク質であるべきである。１つの実施形態では、チオメルサールはいずれの成分の精製においても添加も使用もされない。例えばＢ型肝炎については欧州特許第１３０７４７３号を、チオメルサールの非存在下で死滅が達成されるＰｗの工程については上記を参照されたい。
【０１０８】
本発明のワクチンは、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてもよい。界面活性剤は一般に、例えば＜０．０１％の低いレベルで存在する。
【０１０９】
本発明のワクチンは、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。組成物は塩化ナトリウムを含んでいてもよい。１つの実施形態では、本発明の組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１００ ｍｇ／ｍＬ（例えば１〜５０ｍｇ／ｍＬ、２〜２０ｍｇ／ｍＬ、５〜１５ｍｇ／ｍＬ）の範囲にあり、さらなる実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は１０±２ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌ例えば約９ｍｇ／ｍＬである。
【０１１０】
本発明のワクチンは一般に緩衝液を含むであろう。リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液が典型的である。
【０１１１】
本発明のワクチンは、抗原が吸着されないようにするために、（例えばリン酸緩衝液を使用することにより）溶液中に遊離したリン酸を含んでいてもよい。本発明の組成物中の遊離したリン酸イオンの濃度は、１つの実施形態では０．１〜１０．０ｍＭ、または別の実施形態では１〜５ｍＭ、またはさらなる実施形態では約２．５ｍＭである。
【０１１２】
ワクチン製剤
１つの実施形態では、本発明のワクチンは、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためのワクチンとして、各抗原の成分の血清防御がヒト被験者の許容割合の基準を超える抗体力価を付与するように製剤化される。これは、集団全体におけるワクチン効力の評価において重要な試験である。それを超えると宿主が抗原に対して血清変換されたとみなされる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、このような力価はＷＨＯなどの機関により公表されている。１つの実施形態では、８０％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、別の実施形態では、９０％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、さらなる実施形態では、９３％を超える統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換され、さらに別の実施態様では、９６〜１００％の統計学的に有意な被験者サンプルが血清変換される。
【０１１３】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン中で顕著な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原を用いるかによって変化するであろう。一般に、各用量は、１〜１０００μｇの総免疫原、または１〜１００μｇ、または１〜４０μｇ、または１〜５μｇを含むことが予想される。特定のワクチンに最適な量は、被験者における抗体力価および他の応答の監視を含む研究により確定することができる。初回ワクチン接種コースは、例えばＤＴＰ予防接種についてのＷＨＯの勧告に従い１〜２ヶ月の間隔で与えられる、２〜３回のワクチン投与を含み得る。
【０１１４】
本発明のワクチンのパッケージング
本発明のワクチンは、例えばバイアル、シリンジ等の種々のタイプの容器にパッケージングすることができる。複数回投与バイアルは、典型的には、１用量のワクチンを取り出すために消毒針を挿入することができ、針を取り出した時点で再密封する、再密封可能なプラスチックポートを有するであろう。
【０１１５】
ワクチンは、種々の容器（例えば２または３個）に供給することができる。容器の内容物は、宿主に単回注射で投与する前に即座に混合することができ、または異なる部位に同時に投与することができる。ワクチンの用量は、典型的には０．５ｍＬであろう。
【０１１６】
本発明のこの態様の１つの実施形態では、ポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）および任意で１以上のＢ型肝炎、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）Ｂ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｂ型、チフス菌（Salmonella typhi）、Ａ型肝炎またはマラリアにより引き起こされる疾患に対する防御を宿主に与えるための２種の多価ワクチンを含むキットが提供される。
【０１１７】
キットは、
（１）（ａ）任意で不活化されたポリオウイルス（ＩＰＶ）、
（ｂ）ジフテリアトキソイド（ＤＴまたはＤ）、
（ｃ）破傷風トキソイド（ＴＴまたはＴ）、
（ｄ）死滅全細胞百日咳菌（Bordetella pertussis）（Ｐｗ）または２以上の無細胞百日咳成分（Ｐａ）（上記）、
（ｅ）任意でＢ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢまたはＨＢ）、
（ｆ）任意でキャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート、
（ｇ）任意でキャリアタンパク質と髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ）または髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ）の莢膜糖類のコンジュゲートのいずれかまたは両方［例えば本発明のコンジュゲート化方法により作製される］
を含む第１容器と、
（２Ａ）（ａ）キャリアタンパク質と髄膜炎菌（N. meningitidis）Ａ型（ＭｅｎＡ）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｃ型（ＭｅｎＣ）、髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｗ型（ＭｅｎＷ）および／または髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｙ型（ＭｅｎＹ）の莢膜糖類（本発明の種々のＭｅｎ糖類の組み合わせについては上記参照）のコンジュゲート［例えば本発明のコンジュゲート化方法により作製される］、および
（ｂ）任意でキャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート；または
（２Ｂ）（ａ）キャリアタンパク質とインフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜糖類のコンジュゲート、および
（ｂ）キャリアタンパク質とチフス菌（Salmonella typhi）のＶｉ糖類のコンジュゲート(本発明のコンジュゲート化方法により作製される)
を含む第２容器
を含む。
【０１１８】
容器は、いずれの場合にも、ＨｅｐＡ抗原および／またはＭｅｎＢ抗原および／またはＲＴＳ，Ｓおよび／または肺炎球菌（Streptococcus pneumonia）抗原をさらに含んでいてもよい。
【０１１９】
いずれの場合にも、同一の抗原を両方の容器に存在させるべきではない。
【０１２０】
１つの実施形態では、第１容器成分は、ｂ）、ｃ）、ｄ）に加えて、ａ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｅ）＋ｆ）、ｅ）＋ｇ）、ｆ）＋ｇ）またはｅ）＋ｆ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）、ａ）＋ｆ）、ａ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）＋ｆ）、ａ）＋ｅ）＋ｇ）、ａ）＋ｆ）＋ｇ）、ａ）＋ｅ）＋ｆ）＋ｇ）をさらに有する。
【０１２１】
１つの実施形態では、第１容器のワクチンは液体であってもよく、第２容器のワクチンは液体であっても凍結乾燥されていてもよい（例えばスクロースまたはトレハロースなどの公知の安定化賦形剤の存在下）。
【０１２２】
キットの容器は、別個にパッケージングすることができ、または任意で、一緒にパッケージングすることもできる。１つの実施形態では、キットは２以上の容器内のワクチンを投与するための説明書のリストと共に提供される。
【０１２３】
１つの実施形態では、キット中の容器が特定の糖類コンジュゲートを含む場合、キットの他方の容器中には同一のコンジュゲートは存在しない。
【０１２４】
１つの実施形態では、第１容器および第２容器のワクチンは、（「本発明のワクチンの投与」で以下に記載するように）同時に異なる部位に投与され、代替の実施態様では、本発明者らは、第１容器および第２容器の内容物を投与前に単独のワクチンとして（任意で即座に）混合できることを想定している。
【０１２５】
本発明のワクチンの調製
本発明は、ワクチンの成分を製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含むワクチン製剤の製造方法も提供する。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態では、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎による感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬において使用するための、本明細書に記載されるワクチンが提供される。
【０１２７】
本発明の別の実施形態では、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎による感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造における、本発明のワクチンの使用が提供される。
【０１２８】
さらに、１以上のポリオウイルス、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ａ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｗ型、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｙ型、チフス菌（Salmonella typhi）またはＡ型肝炎により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法であって、宿主に免疫保護用量の本発明のワクチンを投与することを含む前記方法が提供される。
【０１２９】
各ワクチン用量中の抗原の量は、典型的なワクチン中で顕著な副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。このような量はどの特定の免疫原を用いるか、および特定の免疫原をどのように存在させるかによって変化するであろう。１つの実施形態では、各用量は０．１〜１００μｇの糖類を含み、別の実施形態では、各用量は０．１〜５０μｇを含み、さらなる実施形態では、各用量は０．１〜１０μｇを含み、さらに別の実施形態では、各用量は１〜５μｇ糖類を含むであろう。
【０１３０】
１つの実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は１〜１００μｇの範囲にあり、別の実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は５〜５０μｇの範囲にあり、さらなる実施形態では、ワクチン中のタンパク質抗原の含有量は５〜２５μｇの範囲にあるであろう。
【０１３１】
ワクチン調製物は一般に、Vaccine Design［The subunit and adjuvant approach(Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York］に記載されている。リポソーム内へのカプセル化はFullerton、米国特許第４,２３５,８７７号により記載されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲート化は、例えばLikhite、米国特許第４,３７２,９４５号およびArmorら、米国特許第４,４７４,７５７号により開示されている。Ｑｕｉｌ Ａの使用は、Dalsgaardら、1977, Acta Vet Scand. 18:349により開示されている。３Ｄ-ＭＰＬはRibi immunochem, USAから入手でき、英国特許出願公開第２２２０２１１号および米国特許第４,９１２,０９４号に開示されている。ＱＳ２１は米国特許第５,０５７,５４０号に開示されている。
【０１３２】
１つの実施形態では、０．５ｍＬ用量のバルクワクチンあたりの糖類コンジュゲートの量は、１０μg未満（のコンジュゲート中の糖類）であり、別の実施形態では、コンジュゲートの量は１〜７であり、別の実施形態では、コンジュゲートの量は２〜６μg、またはさらなる実施形態では、約２．５、３、４または５μgである。
【０１３３】
特定の成分、例えばＤＴＰｗ成分を、吸着されているＨＢｓＡｇまたは他の成分を添加する前に別個に混合できることが理解されよう。
【０１３４】
一般に、本発明の任意の態様に係る混合ワクチン組成物は以下のように調製することができる：ＩＰＶ、ＤＴＰｗ、ＨｅｐＢ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＢ、Ｖｉ、Ａ型肝炎または他の成分を、適切なアジュバント、特に水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムまたはその両方の混合物に予め吸着させる。それぞれの成分を完全かつ安定に吸着させた後、異なる成分を適切な条件下で混合する。Ｈｉｂ、Ｖｉ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷおよび／またはＭｅｎＹコンジュゲートは、ＤＴＰｗワクチンと混合する前に、アルミニウムアジュバント塩に吸着されても、吸着されていなくてもよい。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明のワクチンを１５℃〜３０℃（例えば１９℃〜２７℃、または２３±４℃）で調製する。
【０１３６】
本発明のワクチンの投与
本発明は、有効量の本発明のワクチンを投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を引き起こす方法を提供する。ワクチンは、予防的に（すなわち感染を予防するために）または治療的に（すなわち感染後に疾患を治療するために）投与することができる。免疫応答は防御的であることが好ましく、また抗体が関与することが好ましい。本方法は、既往反応を引き起こすこともできる。
【０１３７】
初回ワクチン接種の後、被験者は適切な間隔を空けて１または数回の追加免疫接種を受けてもよい。投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与は、初回免疫接種計画および／または追加免疫接種計画において使用することができる。初回投与計画（生後１年以内でありうる）に続いて、追加投与計画を行うことができる。初回投与間の適切なタイミング（例えば４〜１６週間）、ならびに初回投与および追加投与間の適切なタイミングは、慣用的に決定することができる。
【０１３８】
１つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。ワクチンが予防的に使用される場合、ヒトは、好ましくは子供（例えば幼児および乳児）または十代の若者であり；ワクチンを治療的に使用する場合、ヒトは好ましくは成人である。子供を対象とするワクチンは、例えば安全性、投与量、免疫原性等を評価するために成人に投与してもよい。
【０１３９】
本発明のワクチン調製物は、前記ワクチンを患者に直接投与することにより、感染しやすい哺乳動物を防御または治療するために使用することができる。直接的な送達は、非経口注射（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈、または組織の間質腔）により;あるいは直腸投与、経口投与、膣内投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、耳内投与、肺内投与または他の粘膜投与により達成することができる。１つの実施形態では、投与は腿または上腕への筋肉注射による。注射は、針（例えば皮下注射針）を用いて行うことができるが、代わりに無針注射を使用することもできる。典型的な筋肉投与量は０．５ｍＬである。
【０１４０】
細菌感染は体の種々の領域に影響を与えるため、本発明の組成物は種々の形態に調製することができる。例えば、本組成物は、注入物質として、溶液または懸濁液のいずれかで調製することができる。本組成物は、微粉末またはスプレーを用いて例えば吸入器として、肺内投与用に調製することができる。本組成物は、坐薬またはペッサリーとして調製することができる。本組成物は、例えばスプレー、点眼薬（drops）、ゲルまたは粉末として鼻腔投与、耳内投与または眼内投与用に調製することができる（例えばAlmeida & Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455；Bergquist et al., 1998, APMIS, 106:800を参照）。ＤＴＰワクチンの成功した鼻腔内投与は報告されている（Ryan et al., 1999, Infect. Immun., 67:6270；Nagai et al., 2001, Vaccine, 19:4824）。
【０１４１】
１つの実施形態では、第１容器および第２容器（および適用可能な場合には第３容器）のワクチンは異なる部位に同時に投与され、代替の実施態様では、本発明者らは第１容器および第２容器の内容物を投与前に単独のワクチンとして（任意で即座に）混合できることを想定している。
【０１４２】
本発明は、全身および／または粘膜免疫を誘発するために使用することができる。
【０１４３】
治療上の処置の効力を確認する一つの方法には、本発明の組成物の投与後に細菌感染をモニタリングすることが含まれる。予防的処置の効力を確認する一つの方法には、組成物の投与後に抗原に対する免疫応答をモニタリングすることが含まれる。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験者（例えば１２〜１６月齢の子供、または動物モデル−国際公開公報第０１／３０３９０号）にこれらを投与し、次いで標準的な免疫学的パラメーターを測定することにより判定することができる。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与後約４週間に測定し、組成物の投与前に測定した値と比較する。患者における実際の予防効力を評価するよりも、ＤＴＰワクチンの効力を評価するための標準的な動物およびｉｎ ｖｉｔｒｏモデル並びに保護の相関がよく知られている。
【０１４４】
本明細書において「含む（comprising）」、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」という用語は本発明者らによれば、あらゆる場合において、それぞれ「からなる（consisting of）」、「からなる（consist of）」および「からなる（consists of）」という用語と任意で置き換え可能であることが意図される。「免疫原性組成物」という用語は、本明細書において「ワクチン」という用語と置き換え可能であり、逆もまた同様である。
【０１４５】
この特許明細書のなかで引用される参考文献または特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
本発明を添付の実施例のなかで例示する。以下の実施例は、他に詳細に記述されている場合を除き、当業者には周知かつ慣用的である標準的な技術を用いて行われる。これらの実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１４７】
実施例１−多糖コンジュゲートの調製
実施例１ａ−本発明による髄膜炎菌（meningococcal）ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ莢膜多糖コンジュゲートの調製
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１４８】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＡ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じて反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【０１４９】
１０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＡ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＡ比率０．７５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＡ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、このｐＨを維持しながら（温度を２５℃に保持して）２時間反応を進めた。
【０１５０】
ＰＳＡＡＨ溶液をその当初容量の４分の１に濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーション（diafilter）し、保持物（retentate）を濾過した。
【０１５１】
コンジュゲート化（カルボジイミド縮合）反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＡＡＨ溶液をＰＳＡＡＨの場合１０ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合１０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう希釈した。
【０１５２】
最終比率０．９ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）をＰＳＡＨ溶液（糖類２ｇ）に添加した。ｐＨを５．０に調整した。２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドを蠕動ポンプにより（６０分で）添加した。得られた溶液を撹拌しながら＋２５℃で６０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【０１５３】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約６６０ｍＬ）をカラムに充填した（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．３０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【０１５４】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＣ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じて反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【０１５５】
２０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＣ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＣ比率１．５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。活性化ｐＨで５Ｍ ＮａＣｌを添加して、最終濃度２ＭのＮａＣｌを達成した。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＣ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、（２５℃に維持して）２時間反応を進めた。
【０１５６】
ＰＳＣＡＨ溶液を最小限の１５０ｍＬに濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーションし、保持物を濾過した。
【０１５７】
コンジュゲート化反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＣＡＨ溶液（２ｇスケール）をＰＳＣＡＨの場合１５ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合２０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１５８】
２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドをＰＳＣＡＨ溶液に添加した。ｐＨを５．０に調整した。最終比率０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ ｐＨ ７．５中にて１６．７ｍｇ／ｍＬ）を蠕動ポンプにより（１０分で）添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【０１５９】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約４６０ｍＬ）をカラムに充填した（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．２０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【０１６０】
ＥＤＡＣを１０〜４５分間かけて添加する種々の実験を行った。いずれの場合にも良質のＭｅｎＣコンジュゲートが得られた。しかしながら、ＴＴキャリアをＭｅｎＣ−ＡＤＨ ＋ ＥＤＡＣ混合物に最後にゆっくりと添加した場合、これはゲル、つまり精製できないコンジュゲートをもたらした。
【０１６１】
ＥＤＡＣを一度に反応物の中に添加する実験も行ったが、コンジュゲートのＴＴ／ＰＳ最終比率（２．７／１）（ｗ／ｗ）は、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって得られたコンジュゲートの場合（３．３／１）よりも低かった；さらに、αＴＴおよびαＰＳ抗原性はともに、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって作製されたコンジュゲートに関して測定されたものよりも低かった。
【０１６２】
多糖の％誘導体化近似値に関する注記
ＭｅｎＣＡＨ：ＡＤＨでのＣＤＡＰ処理後、約３．４７％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復サブユニットあたり利用可能なヒドロキシル基は２つと推定される）。ＭｅｎＡの場合：約１１．５％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復単位あたり利用可能なヒドロキシル基は１つしかないと考えられる）。
【０１６３】
実施例１ｂ−肺炎球菌の莢膜ＰＳ ３多糖コンジュゲートの調製
１）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３−ＴＴＡＨ２０８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１０％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度３ｍｇ／ｍＬで２Ｍ ＮａＣｌに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を５μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【０１６４】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧（circuit pressure）、プランジャー補給圧（plunger alimentation pressure）に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することであった。
【０１６５】
サイズ低減は６０００±５００ ｐｓｉで行い、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、２．０±０．２ ｃｐの目標に達した時点で止めた。
【０１６６】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過した。
【０１６７】
ＴＴ誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＴＴをＮａＣｌ ０．２Ｍに希釈して、ＴＴ最終濃度２５ｍｇ／ｍＬを得た。０．２Ｍの最終濃度に達するように、ＡＤＨをＴＴ溶液に固体形態で添加した。完全なＡＤＨ溶解の後、溶液をＨＣｌでｐＨ ６．２＋／−０．１に設定した。
【０１６８】
その後、最終濃度０．０２Ｍに達するように、ＥＤＡＣをＴＴ／ＡＤＨ溶液に添加した。ｐＨをＨＣｌで６．２＋／−０．１に設定し、１時間の間ｐＨ調節下に保った。
【０１６９】
誘導体化ステップの後、ｐＨをＮａＯＨにより最大ｐＨ９．５まで上げて、反応を停止した。ダイアフィルトレーション（diafiltration）ステップの前に溶液を２時間の間ｐＨ調節下に置いた。
【０１７０】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＴＴＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１７１】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物（permeate）におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１７２】
０．２２μｍに対する濾過
ＴＴＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＴＴＡＨを−７０℃で保存した。
【０１７３】
ＰＳ３−ＴＴＡＨコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１７４】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴＡＨ／ＰＳ３当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１７５】
ＰＳ３ ５０ｍｇを２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴＡＨ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１７６】
このＰＳ３溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１７７】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴＡＨを１１分間（アリコート／分）で手動により添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１０９分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１７８】
２）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴ２１５
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１７９】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１８０】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＣＤＡＰ（０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、アセトニトリル／ＷＦＩ混合物中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にＰＳ溶液をｐＨ６．０に設定した。ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に増加させた。ｐＨを９．５に保持し、６０分の間、調節した。誘導体化の割合は２．４％（２．４ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）に相当した。これは公知の技術で測定することができる：ＡＤＨの推定の場合にはＴＮＢＳ；およびＰＳ定量化の場合にはＤＭＡＢまたはレゾルシノール（Monsigny et al (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530）。この場合、ＴＮＢＳ投与量は２２８μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５２５０μｇ／ｍＬであった。
【０１８１】
ＡＤＨのＭｗが１７４．２であり、ＰＳ３の反復単位のＭｗが３３８．２７である（１つのＣＯＯＨ基および４つのＯＨ基を有する）ことを考えれば、１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１５．５２μｍｏｌｅの反復単位、または１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／６２．０８μｍｏｌｅの反応性ヒドロキシル基が存在する。２．０９％のＰＳ３ヒドロキシル基がＡＤＨ修飾ヒドロキシル基であった。
【０１８２】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＣＤＡＰ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１８３】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１８４】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【０１８５】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１８６】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１８７】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１８８】
このＰＳ３ＡＨ溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１８９】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３ＡＨ溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴを蠕動ポンプにより１０分で添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１９０】
３）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１７
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１９１】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１９２】
ＰＳ３誘導体化
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９３】
ダイアフィルトレーション
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９４】
０．２２μｍに対する濾過
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１９５】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１９６】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１９７】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１９８】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を混合し、ＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１９９】
ＥＤＡＣをＴｒｉｓ １Ｍ ｐＨ ７．５緩衝液に溶解した。ＥＤＡＣ ４０μＬを毎分添加した（ＥＤＡＣ／ＰＳ比率（０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳ）に達するように１０分間）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０２００】
４）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０２０１】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０２０２】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＥＤＡＣ／ＰＳ比率０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣを固体形態で添加した。完全な溶解後、溶液のｐＨを５に設定した。その後、ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）を蠕動ポンプにより４４分で添加した（したがって過剰のＡＤＨが存在していたが、直接的な添加も問題がなかった）。ｐＨを５．０＋／−０．１に保持し、１２０分（４４秒＋７６秒）の間、調節した。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に上昇させることにより、反応を停止した。誘導体化の割合は３．７％（ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）に相当した。ＴＮＢＳ投与量は２２０μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５９０２μｇ／ｍＬであった。すなわち１．２６μｍｏｌｅのＡＤＨ／１７．４４μｍｏｌｅの反復単位（＝μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基）が存在する。したがって、７．２２％のＰＳ３カルボキシル基がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０２０３】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２３容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０２０４】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０２０５】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【０２０６】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０２０７】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３ＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０２０８】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０２０９】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を一緒に混合した。
【０２１０】
ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＥＤＡＣを１０分間で手動により添加した（等量のアリコートを毎分添加した）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０２１１】
結論：
コンジュゲート化ステップのなかでカルボジイミド化学反応を用いて、異なるコンジュゲートを作製した。反応溶液に添加される最後の成分は、ＴＴタンパク質またはＥＤＡＣ試薬のいずれかとすることができる。添加の時間は、得られるコンジュゲートに影響を与えることがある。
【０２１２】
ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５および２１７コンジュゲート：
両コンジュゲートを調製するため、同じ成分および条件を使用した。最後の成分を添加した方法は異なっていた。ＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートは、インビトロ（in-vitro）での判定基準に合った生成物をもたらした。この生成物はＥＤＡＣを１０分で添加することにより作製された。
【０２１３】
しかしながら、ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５コンジュゲートは、滅菌メンブレンに対して濾過することができなかった。このコンジュゲートの場合、反応媒体に添加された最後の成分はＴＴであった（１０分で）。
【０２１４】
ＴＴ／ＰＳ最終比率は両コンジュゲートでかなり異なっていた（０．９８／１に対して０．５０／１）。ＥＤＡＣがＰＳＡＨ（反応性アミノ基とカルボキシル基の両者を有する）に最初に添加される場合、これは多糖に存在するヒドラジンおよびカルボン酸基の分子内架橋結合をもたらしうるので、いっそう架橋結合されたコンジュゲートを生じさせることになり、１０分間でのＴＴの添加後の最終比率がずっと低くなるのかもしれない。
【０２１５】
この影響はＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートでは認められていない。ＴＴ取込みは、おそらくいっそう低い分子内架橋結合や、ＰＳ３ＡＨのヒドラジン基と該タンパク質のカルボン酸基との間のいっそう良好な分子間架橋結合のため、１０分間でのＥＤＡＣの添加によっていっそう功を奏した。
【０２１６】
２１８コンジュゲートの場合、ＰＳ３ ＥＤＡＣ誘導体化は（多糖エピトープの大部分を保全するため）多糖を部分的に誘導体化するだけなので、反応性アミノ基とカルボキシル基の両者が存在しており、それ故に最終のコンジュゲート化ステップにおけるＥＤＡＣの緩徐な添加が有益である理由も先と同様である。
【０２１７】
（しかしながら）ＴＴはＡＤＨ誘導体化され（かつアミノ基およびカルボキシル基を含む）、その一方でＰＳ３はその反復サブユニットの一部としてその天然の反応性−ＯＨ基および−ＣＯＯＨ基が残された２０８コンジュゲートの場合、最終のコンジュゲート化ステップにおける緩徐なＴＴ添加が有益であった。ＰＳ ３へのＥＤＡＣの添加は上記の架橋結合の影響がなく、誘導体化されたＴＴの緩徐な添加によってインビトロでの特性の良好なコンジュゲートが得られた。下記を参照されたい。
【０２１８】
インビトロでの特性決定：
【表２】
【表３】
【表４】
【０２１９】
実施例１ｃ−本発明のチフス菌（S. typhi）Ｖｉ多糖コンジュゲートの調製
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１５％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度７ｍｇ／ｍＬでＷＦＩに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を流速５０ｍＬ／分で１０μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【０２２０】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧、プランジャー補給圧に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することである。
【０２２１】
サイズ低減は１５０００±５００ ｐｓｉで達成し、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、５．０±０．３ ｃｐの目標に達した時点で止める。
【０２２２】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過する。濾過済のサイズ分類されたＰＳを−２０℃で保存する。
【０２２３】
多糖Ｖｉの誘導体化
サイズ分類されたＶｉ ＰＳ １．５ｇを撹拌しながらＥＰＩに２５℃で溶解した（５ｍｇ／ｍＬ）。このＰＳ溶液にＡＤＨ １３．３５ｇ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）を添加する。完全な溶解後、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ５．０±０．０５に調整した。ＥＤＡＣ（０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を固体形態で添加した。この溶液を２５℃で６０分間放置した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、２５℃で少なくとも３０分間放置した（最大２時間）。ＴＮＢＳ投与量（ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）により、誘導体化のレベルは４．５５％であると推定された。ＴＮＢＳ投与量は２００μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は４０３４μｇ／ｍＬであった；したがって０．０６９７μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反復単位（Ｍｗ２４５）であった。Ｖｉでの１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基、したがってＶｉのＣＯＯＨ基の７％がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０２２４】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳＶｉＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０２２５】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は３、５、１０および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０２２６】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＶｉＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。濾過したＰＳＶｉＡＨを最大４日間＋２／＋８℃で保存した。
【０２２７】
ＰＳＶｉＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０２２８】
０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳＶｉＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳＶｉＡＨ当初比率２．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳおよび０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０２２９】
ＰＳＶｉＡＨ １ｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た（ウロン酸投与量）。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０２３０】
最終比率２．５ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＴＴをＰＳＶｉＡＨ溶液に添加した。ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで５．０±０．０５に調整する。その後、０．２５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＶｉＡＨに達するように、ＥＤＡＣ溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５中にて７．５ ｍｇ／ｍＬ）を添加した（蠕動ポンプにより１０分で）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で５０分間インキュベートして、６０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。クロマトグラフィーステップの前に、コンジュゲートを４℃に移し、連続的にゆっくり撹拌しながら終夜放置した。
【０２３１】
精製
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに対する溶出の前に、１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターを用いてコンジュゲートを清澄化した。流速は１００ｍＬ／分に固定した。その後、コンジュゲートをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに注入し、回収プールはＫｄ値に基づいた。以下の判定基準をプール回収に用いた：２８０ｎｍのＯＤ＝０．０５から収集を開始し、Ｋｄ＝０．２２の時点で終了した。
【０２３２】
滅菌濾過
濾過の前に、バルクを室温に戻した。その後、コンジュゲートをＯｐｔｉｃａｐ ４’’滅菌用メンブレンに対して濾過した。流速は３０ｍＬ／分に固定した。
【０２３３】
分析
得られたコンジュゲートはＴＴ／ＰＳ最終比率（ｗ／ｗ）２．４４／１、遊離ＰＳ含有率３．７％およびαＰＳ／αＰＳ抗原性５８％であった。
【０２３４】
実施例１ｃ（ｉｉ）−本発明のチフス菌（S. typhi）Ｖｉ多糖コンジュゲートの他の調製方法
コンジュゲート化は実施例１ｃに記載された条件と異なる条件で行うことができると考えられる。要するに、実施例１ｃを行うが、以下の条件は変更する。
【表５】
【０２３５】
実施例１ｄ−その他の多糖コンジュゲートの調製
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Ｈｉｂ）ＰＲＰ多糖のＴＴとの共有結合は、Chuら（Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256）により開発されたカップリング化学反応によって行った。ＣＮＢｒを添加し、ｐＨ １０．５で６分間インキュベートすることにより、Ｈｉｂ ＰＲＰ多糖を活性化した。ｐＨをｐＨ ８．７５に下げ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、インキュベーションをさらに９０分間続けた。１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド縮合により、活性化されたＰＲＰを精製された破傷風トキソイドにカップリングした。最終比率０．６ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ 活性化ＰＲＰに達するように、活性化されたＰＲＰにＥＤＡＣを添加した。ｐＨを５．０に調整し、２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、精製された破傷風トキソイドを添加した。得られた溶液を穏やかに撹拌しながら３日間放置した。０．４５μｍのメンブレンを通した濾過の後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにてコンジュゲートを精製した。
【０２３６】
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲートを、ＭＡＬＬＳで測定したところおよそ１００〜２００ｋＤａのサイズ分類された多糖を用いて作出した（実施例２参照）。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０２３７】
活性化および直接的カップリングは、国際公開公報第９６／２９０９４号および国際公開公報第００／５６３６０号に記述されているように行った。手短に言えば、２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ５．５〜６．０中の濃度１０〜２０ｍｇ／ｍＬの多糖をＣＤＡＰ／多糖最終比率０．７５／１または１．５／１までＣＤＡＰ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、アセトニトリル／ＷＦＩ，５０／５０中にて新たに調製）と混合した。１．５分後に、ｐＨを水酸化ナトリウムによりｐＨ１０．０に上げた。３分後、ＭｅｎＷの場合１．５／１、ＭｅｎＹの場合１．２／１、ＭｅｎＡの場合１．５／１またはＭｅｎＣの場合１．５／１のタンパク質／多糖比率に達するように、破傷風トキソイドを添加した。反応を１〜２時間続けた。
【０２３８】
カップリングステップの後、グリシンをグリシン／ＰＳ（ｗ／ｗ）の最終比率７．５／１まで添加し、ｐＨをｐＨ９．０に調整した。この混合物を３０分間放置した。１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターによってコンジュゲートを清澄化し、次に１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭまたは５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５の溶出用緩衝液を用いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに充填した。臨床用ロット（Clinical lots）をＯｐｔｉｃａｐ ４滅菌用メンブレンに対して濾過した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質の平均比率が１：１〜１：５（ｗ／ｗ）であった。
【０２３９】
実施例２−ＭＡＬＬＳを用いた分子量の測定
サンプルが溶出されるＨＰＬＣサイズ排除カラムに検出器を連結した。一方では、レーザー光散乱検出器によって、高分子溶液により１６の角度で散乱された光強度を測定し、他方では、オンラインで配置された干渉屈折計によって、溶出されたサンプル量の測定を可能にした。これらの強度から、溶液中の高分子のサイズおよび形状を測定することができる。
【０２４０】
重量平均分子量（Ｍｗ）は、全ての、種の重量×その各種分子量、の総和÷全ての種の重量の総和、と定義される。
【０２４１】
ａ）重量平均分子量：−Ｍｗ−
【数１】
【０２４２】
ｂ）数平均分子量：−Ｍｎ−
【数２】
【０２４３】
ｃ）二乗平均平方根半径（Root mean square radius）：−Ｒｗ−およびＲ２ｗは以下により定義される二乗半径である：
【数３】
【０２４４】
（−ｍｉ−は散乱中心ｉの質量であり、−ｒｉ−は散乱中心ｉと高分子の重心との間の距離である）。
【０２４５】
ｄ）多分散性は比率−Ｍｗ／Ｍｎ−と定義される。
【０２４６】
髄膜炎菌（meningococcal）多糖を、併用で用いた２本のＨＰＬＣカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）に充填することによってＭＡＬＬＳで分析した。多糖２５μＬをカラムに充填し、濾過水０．７５ｍＬで溶出した。糖類は光散乱検出器（４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。
【０２４７】
全サンプルの分子量多分散性および回収率は、Ａｓｔｒａ ４．７２ソフトウェアにおいて多項式適合度１を用いＤｅｂｙｅ法によって計算した。
【０２４８】
実施例３−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡ中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨ（ＡＤＨ）スペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ４−任意のコンジュゲートにおいてスペーサーなしで破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０２４９】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０２５０】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−抗体力価＞４倍のワクチン接種前の抗体力価、と定義された。
【０２５１】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＡコンジュゲートでのスペーサーの使用によってＭｅｎＡに対する免疫応答の増大がもたらされた。応答者の割合は、ＡＨスペーサーを付加した場合、６６％から９０〜９５％に上昇した。これはＳＢＡ ＧＭＴでの４３３５から１００００の増大およびＧＭＣでの５から２０〜４０の増大に反映されていた。意外にも、応答者の割合の増大およびＳＢＡ ＧＭＴでの増大から分かるとおり、ＡＨスペーサーの使用によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大も起こった。スペーサーが導入された場合、増大は同様にＳＢＡ−ＧＭＴにおいてＭｅｎＹ（６７４２〜７１２２）に対しておよびＭｅｎＷ（４６２１〜５４１８）に対して認めることができた。
【表６】
【０２５２】
実施例４−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲート中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／２．５／２．５／２．５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ４−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０２５３】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０２５４】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−抗体力価＞４倍のワクチン接種前の抗体力価、と定義された。
【０２５５】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＣコンジュゲートへのＡＨスペーサーの導入によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大がもたらされた。これはＳＢＡ ＧＭＴでの１９４３から４３２９の増大および抗ＰＳＣ ＧＭＣでの７．６５から１３．１３の増大によって実証される。ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹに対する良好な免疫応答が維持されていた。
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）において、時間が５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、時間が１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、３０分間〜２時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボジイミドがＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）またはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートが、０．０１〜３ｍｇ／ｍｇ糖類、０．０５〜２ｍｇ／ｍｇ糖類または０．０９〜１ｍｇ／ｍｇ糖類、例えば０．０７〜０．２５ｍｇ／ｍｇ糖類または０．１〜０．２ｍｇ／ｍｇ糖類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類および／もしくはタンパク質キャリアが、アミノ基またはカルボキシル基を含むように誘導体化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、２つの反応性アミノ基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが、２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導体化が、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖類が、ＣＤＡＰ化学を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖類が、カルボジイミド縮合化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基を介して部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖類が、カルボジイミド化学反応を用いて部分的に誘導体化されており、任意で該部分的誘導体化ステップにおいて該カルボジイミドが、０.０１〜０.５、０.０１５〜０.１、０.０２〜０.０７５、または０.０２５〜０.０５ ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートをポンプを用いて一定速度で添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートを前記の時間にわたって段階的に添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アリコート「ａ」を４〜１００の段階「ｓ」において添加する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アリコートのａ／ｓを各段階において添加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖類が、ステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質キャリアと前記糖類との当初比率が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）において存在する塩、例えばＮａＣｌの濃度が、０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質キャリアが、ステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）において反応ｐＨがｐＨ４．５〜６．５、ｐＨ４．７〜６．０またはｐＨ５〜５．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の反応中にＮ−ヒドロキシスクシンイミドも存在し、かつステップ（ｂ）での反応ｐＨがｐＨ４．５〜７．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）での反応温度が４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃または２２〜２７℃に維持される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）においてアリコートがすべて添加された後に、反応がさらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間または１〜３時間、例えば１０〜１２０、１０〜８０、１０〜５０、２０〜４０、または２５〜３０分間維持される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
反応が完了した時点で、ｐＨが７．５〜９に調整される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
糖類−タンパク質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製する次なるステップ（ｃ）を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
糖類−タンパク質コンジュゲートを滅菌濾過する次なるステップ（ｄ）を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
有効用量の糖類−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化し、免疫原性組成物またはワクチンを製造する次なるステップ（ｅ）を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖類が細菌莢膜糖類であり、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖類の重量平均分子量が１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖類が天然の（native）多糖であるか、または×１０倍以下にサイズ分類されている（sized）（例えばマイクロ流動化により）、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖類が細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖であり、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来するものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質キャリアが１以上のＴヘルパーエピトープを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質キャリアが、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート。
【請求項４５】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４６】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における、請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンの使用。
【請求項４７】
有効用量の請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法。
【請求項４８】
前記疾患が、髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものである、請求項４６または４７に記載の使用または方法。
【請求項４９】
糖類がチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ莢膜糖類である、請求項１〜４３に記載の方法により取得することができる糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート。
【請求項５０】
請求項４９に記載のＶｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５１】
前記Ｖｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートが、ヒト用量あたり、０.５〜１５、１〜１０、２.０〜７.５または２.５〜５ μｇのＶｉ糖類を含む、請求項５０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５２】
Ｈｉｂ莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含む、請求項５０または５１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５３】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲートが、Ｖｉ糖類コンジュゲートの糖類用量よりも低い糖類用量で存在する、請求項５２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５４】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲートが、ヒト用量あたり、０.１〜９、１〜５、または２〜３ μgの糖類を含む、請求項５２または５３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５５】
前記Ｈｉｂ糖類が、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、プロテインＤ、ＯＭＰＣおよびＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択されるタンパク質キャリアにコンジュゲート化されている、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５６】
同一のタンパク質キャリアがＨｉｂ糖類コンジュゲートおよびＶｉ糖類コンジュゲート中に使用されている、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５７】
使用されている前記同一のタンパク質キャリアがＴＴである、請求項５６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５８】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率が、１:５〜５:１（ｗ／ｗ）である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５９】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率が、１:１〜１:４、１:２〜１:３.５または約１:３（ｗ／ｗ）である、請求項５８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６０】
前記Ｈｉｂ糖類がリンカーを介してタンパク質キャリアにコンジュゲート化されている、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６１】
前記リンカーが二官能性である、請求項６０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６２】
前記リンカーが２つの反応性アミノ基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６３】
前記リンカーが２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６４】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６５】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６６】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項６１または６２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６７】
前記Ｈｉｂ糖類が、ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰを用いてタンパク質キャリアまたはリンカーにコンジュゲート化されている、請求項５２〜６６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６８】
前記タンパク質キャリアが、カルボジイミド化学反応、任意でＥＤＡＣ化学反応を用いてＨｉｂ糖類またはリンカーにコンジュゲート化されている、請求項５２〜６７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６９】
ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチンをさらに含む、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７０】
ＤＴＰワクチンが、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムまたはその両方の混合物に吸着されている、請求項６９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７１】
Ｂ型肝炎ワクチンをさらに含む、請求項５０〜７０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７２】
前記Ｂ型肝炎ワクチンがＢ型肝炎表面抗原であり、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、請求項７１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７３】
Ａ型肝炎ワクチンをさらに含む、請求項５０〜７２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７４】
前記Ａ型肝炎ワクチンが不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物である、請求項７３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７５】
ポリオウイルスワクチンをさらに含む、請求項５０〜７４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７６】
前記ポリオウイルスワクチンが不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物であり、任意で１、２および３型を含む、請求項７５に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７７】
１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含み、ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである、請求項５０〜７６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７８】
マラリアワクチンをさらに含む、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７９】
前記マラリアワクチンが、任意に３Ｄ-ＭＰＬなどの脂質Ａ誘導体でアジュバント化されているＲＴＳ，Ｓである、請求項７８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８０】
前記ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートが共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項５２〜６８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８１】
前記ＶｉおよひＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートが、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項８０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８２】
１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含み、ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものであり、該髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートが、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートと共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項８１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８３】
前記凍結乾燥組成物が投与前に水性媒体により再構成される、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８４】
前記水性媒体が、凍結乾燥組成物中にまだ含まれていない請求項６９〜７９に記載のさらなる抗原を含む、請求項８３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８５】
リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはその両方の混合物を含む請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８６】
アルミニウム塩を含まない、請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８７】
アジュバント化されていない、請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８８】
ｐＨ７．０〜８．０に緩衝化されている、請求項５０〜８７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８９】
請求項１〜４３に記載の方法により糖類をコンジュゲート化するステップ、および得られた糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化するステップを含む、請求項５０〜８８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法。
【請求項９０】
百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、チフス菌（Salmonella typhi）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）により引き起こされる疾患に対する防御を宿主に付与するための２種の多価免疫原性組成物を含む同時または連続投与のためのワクチンキットであって、該キットが:
破傷風トキソイド（ＴＴ）、
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、および
全細胞または無細胞百日咳成分（ＰｗまたはＰａ）
を含む第１容器と、
請求項５２〜６８、８０または８１に記載の免疫原性組成物またはワクチン
を含む第２容器
とを含むものである、上記ワクチンキット。
【請求項９１】
前記第１容器が、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、Ｂ型肝炎表面抗原をさらに含む、請求項９０に記載のワクチンキット。
【請求項９２】
前記第１容器または第２容器が不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）をさらに含む、請求項９０または９１に記載のワクチンキット。
【請求項９３】
疾患の予防または治療のための医薬の製造における、請求項５０〜８８、９０〜９２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用。
【請求項９４】
有効用量の請求項５０〜８８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防もしくは治療方法。
【請求項９５】
前記疾患が、髄膜炎菌（N. meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）からなるリストより選択される１以上の細菌により引き起こされるものである、請求項９３または９４に記載の使用または方法。
【請求項１】
カルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）において、時間が５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、時間が１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、３０分間〜２時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボジイミドがＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）またはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートが、０．０１〜３ｍｇ／ｍｇ糖類、０．０５〜２ｍｇ／ｍｇ糖類または０．０９〜１ｍｇ／ｍｇ糖類、例えば０．０７〜０．２５ｍｇ／ｍｇ糖類または０．１〜０．２ｍｇ／ｍｇ糖類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類および／もしくはタンパク質キャリアが、アミノ基またはカルボキシル基を含むように誘導体化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、２つの反応性アミノ基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが、２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導体化が、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖類が、ＣＤＡＰ化学を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖類が、カルボジイミド縮合化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基を介して部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖類が、カルボジイミド化学反応を用いて部分的に誘導体化されており、任意で該部分的誘導体化ステップにおいて該カルボジイミドが、０.０１〜０.５、０.０１５〜０.１、０.０２〜０.０７５、または０.０２５〜０.０５ ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートをポンプを用いて一定速度で添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートを前記の時間にわたって段階的に添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アリコート「ａ」を４〜１００の段階「ｓ」において添加する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アリコートのａ／ｓを各段階において添加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖類が、ステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍｌで存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質キャリアと前記糖類との当初比率が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）において存在する塩、例えばＮａＣｌの濃度が、０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質キャリアが、ステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）において反応ｐＨがｐＨ４．５〜６．５、ｐＨ４．７〜６．０またはｐＨ５〜５．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の反応中にＮ−ヒドロキシスクシンイミドも存在し、かつステップ（ｂ）での反応ｐＨがｐＨ４．５〜７．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）での反応温度が４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃または２２〜２７℃に維持される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）においてアリコートがすべて添加された後に、反応がさらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間または１〜３時間、例えば１０〜１２０、１０〜８０、１０〜５０、２０〜４０、または２５〜３０分間維持される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
反応が完了した時点で、ｐＨが７．５〜９に調整される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
糖類−タンパク質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製する次なるステップ（ｃ）を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
糖類−タンパク質コンジュゲートを滅菌濾過する次なるステップ（ｄ）を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
有効用量の糖類−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化し、免疫原性組成物またはワクチンを製造する次なるステップ（ｅ）を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖類が細菌莢膜糖類であり、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖類の重量平均分子量が１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖類が天然の（native）多糖であるか、または×１０倍以下にサイズ分類されている（sized）（例えばマイクロ流動化により）、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖類が細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖であり、例えば髄膜炎菌（N. meningitidis）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来するものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質キャリアが１以上のＴヘルパーエピトープを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質キャリアが、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート。
【請求項４５】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４６】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における、請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンの使用。
【請求項４７】
有効用量の請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法。
【請求項４８】
前記疾患が、髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものである、請求項４６または４７に記載の使用または方法。
【請求項４９】
糖類がチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ莢膜糖類である、請求項１〜４３に記載の方法により取得することができる糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート。
【請求項５０】
請求項４９に記載のＶｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートおよび製薬上許容される賦形剤を含む免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５１】
前記Ｖｉ糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートが、ヒト用量あたり、０.５〜１５、１〜１０、２.０〜７.５または２.５〜５ μｇのＶｉ糖類を含む、請求項５０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５２】
Ｈｉｂ莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含む、請求項５０または５１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５３】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲートが、Ｖｉ糖類コンジュゲートの糖類用量よりも低い糖類用量で存在する、請求項５２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５４】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲートが、ヒト用量あたり、０.１〜９、１〜５、または２〜３ μgの糖類を含む、請求項５２または５３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５５】
前記Ｈｉｂ糖類が、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、プロテインＤ、ＯＭＰＣおよびＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択されるタンパク質キャリアにコンジュゲート化されている、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５６】
同一のタンパク質キャリアがＨｉｂ糖類コンジュゲートおよびＶｉ糖類コンジュゲート中に使用されている、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５７】
使用されている前記同一のタンパク質キャリアがＴＴである、請求項５６に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５８】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率が、１:５〜５:１（ｗ／ｗ）である、請求項５２〜５７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項５９】
前記Ｈｉｂ糖類コンジュゲート中のＨｉｂ糖類とタンパク質キャリアとの比率が、１:１〜１:４、１:２〜１:３.５または約１:３（ｗ／ｗ）である、請求項５８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６０】
前記Ｈｉｂ糖類がリンカーを介してタンパク質キャリアにコンジュゲート化されている、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６１】
前記リンカーが二官能性である、請求項６０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６２】
前記リンカーが２つの反応性アミノ基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６３】
前記リンカーが２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６４】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項６１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６５】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６６】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項６１または６２に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６７】
前記Ｈｉｂ糖類が、ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰを用いてタンパク質キャリアまたはリンカーにコンジュゲート化されている、請求項５２〜６６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６８】
前記タンパク質キャリアが、カルボジイミド化学反応、任意でＥＤＡＣ化学反応を用いてＨｉｂ糖類またはリンカーにコンジュゲート化されている、請求項５２〜６７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項６９】
ＤＴＰ（ＤＴＰａまたはＤＴＰｗ）ワクチンをさらに含む、請求項５０〜６８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７０】
ＤＴＰワクチンが、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムまたはその両方の混合物に吸着されている、請求項６９に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７１】
Ｂ型肝炎ワクチンをさらに含む、請求項５０〜７０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７２】
前記Ｂ型肝炎ワクチンがＢ型肝炎表面抗原であり、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、請求項７１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７３】
Ａ型肝炎ワクチンをさらに含む、請求項５０〜７２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７４】
前記Ａ型肝炎ワクチンが不活化Ａ型肝炎ウイルス調製物である、請求項７３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７５】
ポリオウイルスワクチンをさらに含む、請求項５０〜７４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７６】
前記ポリオウイルスワクチンが不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）調製物であり、任意で１、２および３型を含む、請求項７５に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７７】
１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含み、ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものである、請求項５０〜７６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７８】
マラリアワクチンをさらに含む、請求項５０〜７７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項７９】
前記マラリアワクチンが、任意に３Ｄ-ＭＰＬなどの脂質Ａ誘導体でアジュバント化されているＲＴＳ，Ｓである、請求項７８に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８０】
前記ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートが共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項５２〜６８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８１】
前記ＶｉおよひＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートが、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項８０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８２】
１以上の髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートをさらに含み、ここで、該莢膜糖類は、以下の髄膜炎菌（meningococcal）血清型：Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、ＡおよびＣ型、ＡおよびＷ１３５型、ＡおよびＹ型、ＣおよびＷ１３５型、ＣおよびＹ型、Ｗ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５型、ＡおよびＣおよびＹ型、ＡおよびＷ１３５およびＹ型、ＣおよびＷ１３５およびＹ型、ＡおよびＣおよびＷ１３５およびＹ型由来のものであり、該髄膜炎菌（meningococcal）莢膜糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートが、任意で安定化剤、例えばスクロースおよび／またはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で、ＶｉおよびＨｉｂ莢膜糖類コンジュゲートと共凍結乾燥（co-lyophilised）されている、請求項８１に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８３】
前記凍結乾燥組成物が投与前に水性媒体により再構成される、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８４】
前記水性媒体が、凍結乾燥組成物中にまだ含まれていない請求項６９〜７９に記載のさらなる抗原を含む、請求項８３に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８５】
リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはその両方の混合物を含む請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８６】
アルミニウム塩を含まない、請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８７】
アジュバント化されていない、請求項５０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８８】
ｐＨ７．０〜８．０に緩衝化されている、請求項５０〜８７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項８９】
請求項１〜４３に記載の方法により糖類をコンジュゲート化するステップ、および得られた糖類−タンパク質キャリアコンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化するステップを含む、請求項５０〜８８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法。
【請求項９０】
百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、チフス菌（Salmonella typhi）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）により引き起こされる疾患に対する防御を宿主に付与するための２種の多価免疫原性組成物を含む同時または連続投与のためのワクチンキットであって、該キットが:
破傷風トキソイド（ＴＴ）、
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、および
全細胞または無細胞百日咳成分（ＰｗまたはＰａ）
を含む第１容器と、
請求項５２〜６８、８０または８１に記載の免疫原性組成物またはワクチン
を含む第２容器
とを含むものである、上記ワクチンキット。
【請求項９１】
前記第１容器が、任意でリン酸アルミニウムに吸着されている、Ｂ型肝炎表面抗原をさらに含む、請求項９０に記載のワクチンキット。
【請求項９２】
前記第１容器または第２容器が不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）をさらに含む、請求項９０または９１に記載のワクチンキット。
【請求項９３】
疾患の予防または治療のための医薬の製造における、請求項５０〜８８、９０〜９２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用。
【請求項９４】
有効用量の請求項５０〜８８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防もしくは治療方法。
【請求項９５】
前記疾患が、髄膜炎菌（N. meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、およびジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）からなるリストより選択される１以上の細菌により引き起こされるものである、請求項９３または９４に記載の使用または方法。
【公表番号】特表２０１０−５１４８１８（Ｐ２０１０−５１４８１８Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４４０６（Ｐ２００９−５４４４０６）
【出願日】平成２０年１月２日（２００８．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５００２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８１０２２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２日（２００８．１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５００２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８１０２２
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
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