ワクチン
本発明は、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、および水中油型エマルジョンを含むアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染に対するワクチン、ならびにＳＡＲＳの予防におけるこれらのワクチンの使用に関する。本発明は、かかるワクチンの生成方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
コロナウイルスは、構造タンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳを含む少なくとも１８個のウイルスタンパク質をコードする、プラスセンスの、非分節型（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスの主要抗原であるＳ（スパイク）タンパク質は、ウイルスエンベロープの表面から出現する刺の形態で存在する膜糖タンパク質（２００〜２２０ｋＤａ）である。宿主細胞の受容体へのウイルスの付着および、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合の誘導を担う。Ｓタンパク質は２つのドメインを有する：Ｓ１は、受容体結合に関与すると考えられている；Ｓ２は、ウイルスと標的細胞との膜融合を媒介すると考えられている（Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｌａｉ,１９９６）。Ｓタンパク質は、非共有結合のホモ三量体（オリゴマー）を形成することができ、それによって受容体結合およびウイルス感染を媒介することができる。
【０００３】
２００３年３月に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の症例と関連して、新規のコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶまたはＳＡＲＳウイルス）が単離された。ウルバーニ（Ｕｒｂａｎｉ）分離株（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＡＹ２７４１１９．３ ａｎｄ Ａ.ＭＡＲＲＡ ｅｔ ａl.,Ｓｃｉｅｎｃｅ,Ｍａｙ１,２００３,３００,１３９９−１４０４）およびトロント分離株（Ｔｏｒ２,Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＡＹ２７８７４１ ａｎｄ Ａ.ＲＯＴＡ ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ,２００３,３００,１３９４−１３９９）のゲノム配列を含めて、新規のコロナウイルスのゲノム配列が得られた。
【０００４】
ＳＡＲＳ関連コロナウイルスの別の株も同定され、これはＴｏｒ２およびウルバーニ分離株と見分けられる。このコロナウイルス株は、ＳＡＲＳを患う患者の気管支肺胞洗浄から採取された試料に由来し、０３１５８９という番号で登録され、ハノイ（ベトナム）フランス病院で収集された（国際特許公開第２００５／０５６７８１号、および同第２００５／０５６５８４号）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、および水中油型エマルジョンアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、本発明の免疫原性組成物を生成する方法も提供し、その方法は、免疫原性Ｓポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を水中油型エマルジョンアジュバントと混合するステップを含む。
【０００６】
本発明は、さらに以下を提供する：
薬剤として使用するための本発明の免疫原性組成物；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための本発明の免疫原性組成物；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物の使用；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療する方法であって、この方法は、本発明の有効量の免疫原性組成物を、それを必要とする個人に投与するステップを含む；ならびに、
ワクチンとして使用するための本発明の免疫原性組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。アジュバントなし（ｎｏ ａｄｊ.）で、または５０μｇのミョウバンもしくは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）に付随して、２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、３週間の間隔をあけて、２回筋肉内注射することにより、若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）を免疫した。２つの対照グループを、それぞれのアジュバント単独で免疫した。各注射（ＩＳ１およびＩＳ２、それぞれ）の３週間後に血清を採取し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的抗体反応を測定した。各マウスの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。この実験の検出限界を点線で表す。
【図２】Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）を上記のように免疫した。最後の注射の３週間後に採取した血清の中和抗体力価を、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載されたように測定した。各マウスの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。この実験の検出限界を点線で表す。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｓｓｏｌタンパク質によって誘導された免疫反応型の、アジュバントを用いた調節を示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプの力価を、最後の免疫の３週間後に採取したマウスの血清において測定した。各マウスについて測定した力価を点で示す。対照グループについては、力価を各グループの血清の混合物において測定し、ひし形で示す。この実験の検出限界を点線で示す。
【図４】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。各注射の３週間後（それぞれ、ＩＳ１およびＩＳ２）および２回目の注射の３ヶ月後（ＩＳ２ｂｉｓ）に血清を採取し、図１に記載の抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的抗体反応を測定した。各ハムスターの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図５】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。最後の注射の３か月後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図６】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の３ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶをハムスターの鼻腔内に抗原投与した。接種４日後、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図６）およびＵＲＴ（図７）に対する値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図７】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の３ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶをハムスターの鼻腔内に抗原投与した。接種４日後、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図６）およびＵＲＴ（図７）に対する値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図８】０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で事前に免疫した抗原投与ハムスターの肺の病理組織学的解析の結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。
【図９】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図１０】２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶアイソタイプ抗体の力価を示す。
【図１１】０．２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和抗体の力価を示す。
【図１２】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫７日後に得たＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１３】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１４】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た脾細胞からのサイトカイン分泌（ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ）を示す。
【図１５】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図１６】２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶアイソタイプ抗体の力価を示す。
【図１７】０．２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清を用いて測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和抗体の力価を示す。
【図１８】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫７日後に得たＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１９】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た脾細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図２０】異なる用量の、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫１４日後に得た脾細胞からのサイトカイン分泌（ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ）を示す。
【図２１】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。最後の注射の８カ月後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２２】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の８ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの値を、肺（図２２）およびＵＲＴ（図２３）について黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２３】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の８ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの値を、肺（図２２）およびＵＲＴ（図２３）について黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２４】２μｇのＳｓｏｌタンパク質で事前に免疫した抗原接種ハムスターの肺の病理組織学的解析結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。
【図２５】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の２週間後に血清を採取し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的な抗体反応を、図１に記載したように抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡにより測定した。各ハムスターの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２６】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の２週間後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２７】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の３週間後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図２７）およびＵＲＴ（図２８）について値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２８】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の３週間後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図２７）およびＵＲＴ（図２８）について値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２９】０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質の単回注射で事前に免疫した抗原接種ハムスターの肺の病理組織学的解析結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、０〜５の目盛りで示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患の予防または治療に有用な免疫原性組成物を提供する。本明細書で使用する「免疫原性組成物」という用語は、任意で、アジュバントで適切に製剤化される時、ヒトなどの個体において免疫反応を引き起こすことができる免疫原性成分を含む組成物をいう。従って、一実施形態において、本発明は、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、および水中油型エマルジョンアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。本発明の別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物はワクチンであり、すなわちこの免疫原性組成物はＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染に対する防御免疫反応を引き起こすことができる。
【０００９】
本発明の免疫原性組成物は、その断片および変異体を含む、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチドを含む。この免疫原性Ｓポリペプチドは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染に対して、防御免疫反応を引き起こすことができるエピトープ、例えば、中和抗体の産生を引き起こすことができるおよび／または細胞性免疫反応を刺激することができるエピトープを有するＳタンパク質の任意の部分を含み得る。
【００１０】
典型的なＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質は、１，２５５個のアミノ酸を有し（例えば、配列番号１参照）、１３個のアミノ酸のシグナル配列、１２〜６７２番目のアミノ酸に存在するＳ１ドメイン、および６７３〜１１９２番目のアミノ酸に存在するＳ２ドメインを有する。このタンパク質は、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）、細胞外ドメイン（１４〜１１９５番目のアミノ酸）、膜貫通ドメイン（１１９６〜１２１８番目のアミノ酸）および細胞内ドメイン（１２１９〜１２５５番目のアミノ酸）からなる。このＳタンパク質配列は、ヒト集団においてＳＡＲＳを起こしたことが知られるＳＡＲＳ−ＣｏＶ株、例えば、Ｔｏｒ２、ウルバーニもしくは番号０３１５８９株を含む任意のＳＡＲＳ−ＣｏＶ株、または、例えば、ヒト集団には未だ侵入したことがなく、ジャコウネコもしくはコウモリなどの動物集団において循環している株である任意の他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ株に由来し得る。
【００１１】
一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、全長Ｓタンパク質の一部または断片である。本明細書に記載のように、免疫原性Ｓポリペプチドは、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御免疫反応を引き起こす全長Ｓタンパク質または野生型Ｓタンパク質それぞれの中に含まれる少なくとも１つのエピトープを有する、Ｓタンパク質の断片または（本明細書記載の全長Ｓタンパク質またはＳ断片の変異体であり得る）Ｓタンパク質変異体を含む。
【００１２】
一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、Ｓタンパク質の全細胞外ドメイン（外部ドメイン）、例えば、１〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含んでもよい。従って、免疫原性Ｓポリペプチドは、その細胞質内および膜貫通ドメインが除去されたＳ糖タンパク質からなってもよい。任意で、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）が除去されてもよい。一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、そのＣ末端に、セリン−グリシンリンカー（ＳＧ）およびオクタペプチドＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を結合したＳタンパク質の細胞外ドメインからなる。特に、免疫原性Ｓポリペプチドは、Ｃ末端にＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫ配列を融合させたＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｓタンパク質の１４〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含んでもよい。さらなる実施形態において、Ｓポリペプチドは、配列番号２の配列からなるまたはそれを含んでもよい。
【００１３】
免疫反応を刺激する、誘導する、または引き起こすエピトープを含むＳタンパク質断片は、配列番号１の８〜１５０個の任意の数のアミノ酸（例えば、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０個などのアミノ酸）に及ぶ連続したアミノ酸の配列を含んでもよい。
【００１４】
他の実施形態において、コロナウイルスのＳポリペプチド変異体は、配列番号１で示される全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有する。かかるＳポリペプチドの変異体および断片は、少なくとも１つのＳタンパク質特異的な生物活性または機能を保持し得る。例えば、（１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する防御免疫反応、例えば、中和反応および／または細胞性免疫反応を引き起こす能力；（２）受容体結合によるウイルス感染を媒介する能力；ならびに（３）ウイルス粒子および宿主細胞間の膜融合を媒介する能力である。
【００１５】
Ｓポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。保存的置換の例として、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａなどの１つの脂肪族アミノ酸と別の脂肪族アミノ酸との置換、またはＬｙｓとＡｒｇ間、ＧｌｕとＡｓｐ間、もしくはＧｌｎとＡｓｎ間などの１つの極性残基と別の極性残基との置換が挙げられる。類似のアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換でもあり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が含まれる。プロリンは、分類することが難しいと考えられるが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＡｌａ）と性質を共有する。特定の状況において、グルタミンのグルタミン酸への置換またはアスパラギンのアスパラギン酸への置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点において、類似の置換と考えられ得る。
【００１６】
本明細書で開示されるコロナウイルス免疫原配列内のアミノ酸の保存的置換および類似の置換は、本明細書記載の方法および当分野で実施される方法に従って容易に行われ得、例えば、体液性反応（すなわち、野生型（つまり変異体ではない）免疫原と特異的に結合する、および／または野生型（つまり変異体ではない）免疫原と特異的に結合する抗体に結合する抗体に結合し、これと同じ生物活性を有する抗体を生じさせる反応）を含み得る免疫反応を誘導するもしくは引き起こす能力などの、類似の物理的特性および機能活性または生物活性を保持する変異体を提供する。Ｓタンパク質免疫原の変異体は、例えば、細胞受容体と結合するおよび感染を媒介する能力を保持する。
【００１７】
本明細書で使用される「パーセント同一性」または「％同一性」は、コンピューターに実行させるアルゴリズムを用いて、対象のポリペプチド、ペプチド、またはその変異体の配列全体を、試験配列と比較することによって得られるパーセンテージの値である。本明細書記載の変異体免疫原を、点変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、付加、欠失などの１つまたは複数の様々な変異を含むように作ることができる、つまりこれらの変異体は、糖鎖付加およびアルキル化を含む特定の化学的置換などによる修飾の結果であり得る。
【００１８】
本明細書記載のＳタンパク質免疫原、その断片および変異体は、免疫反応、例えば、体液性反応および／もしくは細胞性免疫反応であり得る防御免疫反応を引き起こすまたは誘導するエピトープを含む。防御免疫反応は、以下の少なくとも１つによって表され得る：コロナウイルスによる宿主の感染を防ぐこと；感染を変更するまたは制限すること；感染からの宿主の回復を助ける、改善する、高める、または刺激すること；ならびに、ＳＡＲＳコロナウイルスによる次の感染を防ぐまたは制限する免疫学的記憶を生み出すこと。ＳＡＲＳ ＣｏＶ感染の症例において、例えば、肺および上気道におけるウイルス量、肺の炎症および病変のスコア、肺におけるウイルス抗原量のスコア、血清中和抗体の存在、ＰＢＭＣ、脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応、ならびに脾臓からのサイトカイン分泌によって、防御免疫反応を評価することができる。感染を中和する、ウイルスおよび／もしくは感染細胞を溶解する、宿主細胞によるウイルスの除去を促進する（例えば、食作用を促進する）、かつ／またはウイルス抗原物質と結合するおよびウイルス抗原物質の除去を促進する抗体の産生を、体液性反応は含み得る。体液性反応は、特異的粘膜ＩｇＡ反応を引き起こすまたは誘導することを含む粘膜反応も含み得る。
【００１９】
本明細書記載のＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳポリペプチド、断片または変異体による、対象または宿主（ヒトまたはヒトではない動物）における免疫反応の誘導は、本明細書記載の方法および当分野で通常実施される方法によって測定ならびに特徴づけられ得る。これらの方法には、例えばウサギ、マウス、フェレット、ジャコウネコ、アフリカミドリザル、またはアカゲザルのモデルを用いた動物免疫試験などのインビボアッセイ、ならびにウエスタン免疫ブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、およびそれらの組み合わせなどを含む抗体検出および抗体解析の免疫化学法などの多数のインビトロアッセイの任意の１つが含まれる。
【００２０】
免疫反応を解析するおよび特徴づけるために使用され得る他の方法および技術には、中和アッセイ（プラーク減少アッセイ、または細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定するアッセイ、または当業者によって実施される任意の他の中和アッセイ）が含まれる。当分野で知られるこれらのならびに他のアッセイおよび方法を、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御性体液免疫反応または細胞性免疫反応を引き起こす、少なくとも１つのエピトープを有するＳタンパク質免疫原およびその変異体を同定するおよび特徴づけるために使用することができる。様々なアッセイにおいて得られた結果の統計的優位性を、関連分野の技術者によって通常実施される方法に従って、計算および理解することができる。
【００２１】
コロナウイルスＳタンパク質免疫原（全長タンパク質、その変異体、またはその断片）、ならびにかかる免疫原をコードする対応する核酸を単離型で提供し、特定の実施形態において、精製して均一にする。本明細書で使用される「単離する」という用語は、核酸またはポリペプチドを、その最初の環境または天然環境から除去することを意味する。
【００２２】
ＳＡＲＳコロナウイルスＳタンパク質免疫原ならびにその断片および変異体を、合成でまたは組換えで産生することができる。コロナウイルスに対する免疫反応を誘導するエピトープを含むコロナウイルスタンパク質断片を、自動化された手順による合成を含む標準的な化学的手法によって合成することができる。あるいは、Ｓタンパク質免疫原を、組換えで産生することができる。例えば、Ｓタンパク質免疫原を、核酸発現構築物の中のプロモーターなどの発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドから発現させることができる。例えば、Ｓタンパク質免疫原は、配列番号３または４のＤＮＡ配列によってコードされ得る。ＳＡＲＳコロナウイルスＳポリペプチドおよびその断片または変異体を、哺乳類細胞、酵母、細菌、昆虫もしくは他の細胞において、適切な発現制御配列の制御下で発現させることができる。無細胞翻訳系も使用して、ＲＮＡを含む核酸および発現構築物を用いて、かかるコロナウイルスタンパク質を産生することができる。原核生物および真核生物の宿主と共に使用する適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者によって通常使用されており、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,ＮＹ,（１９８９）および第３版（２００１）に記載されており、本明細書で開示されるプラスミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター、ウイルスベクター、および染色体複製開始点を含むベクターを含み得る。
【００２３】
当業者が理解するように、コロナウイルスＳポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子コードの縮重により、本明細書で提示される配列とは異なり得る。コロナウイルスポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列は、ホモログまたは株変異体もしくは他の変異体をコードする配列を含む。変異体は、天然の多型に由来してもよく、例えば、アミノ酸変異を導入するための組換え法により、または化学合成により合成されてもよく、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失などにより野生型ポリペプチドとは異なってもよい。
【００２４】
アジュバントＴＨ１およびＴＨ２免疫反応
免疫反応は、（それぞれ、従来、防御のための抗体によっておよび防御のための細胞エフェクター機構によって特徴づけられる）体液性または細胞性免疫反応の２つの極端なカテゴリーに、広範に分けることができる。反応のこれらのカテゴリーは、ＴＨ１型反応（細胞性反応）およびＴＨ２型免疫反応（体液性反応）と呼ばれてきた。
【００２５】
極端なＴＨ１型免疫反応は、抗原特異的な、ハプロタイプ限定細胞毒性Ｔリンパ球反応、およびナチュラルキラー細胞反応が生じることによって特徴づけられ得る。マウスにおけるＴＨ１型反応は、大抵、ＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＧ２ｂサブタイプの抗体産生によって特徴づけられ、ヒトにおけるこれらのＴＨ１型反応はＩｇＧ１型抗体に相当する。ＴＨ２型免疫反応は、マウスにおいて、ＩｇＧ１を含む様々な免疫グロブリンアイソタイプの産生によって特徴づけられる。
【００２６】
これらの２つの型の免疫反応の発達の背後にある立役者はサイトカインであると考えることができる。高レベルのＴＨ１型サイトカインは、所望の抗原に対する細胞性免疫反応の誘導を助ける傾向にあり、高レベルのＴＨ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応の誘導を助ける傾向にある。
【００２７】
ＴＨ１型およびＴＨ２型免疫反応の差異は絶対的ではなく、これらの２つの極端な分類の間で、連続的な形態をとることができる。実際には、個体は、主にＴＨ１または主にＴＨ２として説明される免疫反応を支持する。しかし、大抵、マウスＣＤ４＋ｖｅ Ｔ細胞クローンについて、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ,Ｔ.Ｒ.ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ,Ｒ.Ｌ.（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,７,ｐ１４５−１７３）によって記載される観点から、サイトカインのファミリーを考慮することは都合がよい。従来、ＴＨ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γサイトカイン産生と関連する。大抵、ＴＨ１型免疫反応の誘導と直接関連する他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２は、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、ＴＨ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）の分泌と関連する。
【００２８】
特定のワクチンアジュバントは、特に、ＴＨ１型またはＴＨ２型いずれかのサイトカイン反応の刺激に適することが知られている。従来、ワクチン接種または感染後の免疫反応のＴＨ１：ＴＨ２バランスの指標として、抗原を用いた再刺激後の、インビトロでのＴリンパ球によるＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカイン産生の直接測定、および／または抗原特異的抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ１：ＩｇＧ２ｂ比の（少なくともマウスにおける）測定が含まれる。
【００２９】
従って、ＴＨ１型アジュバントは、インビトロで抗原を用いて再刺激した時、単離したＴ細胞集団を刺激し、高レベルのＴＨ１型サイトカインを産生するアジュバントであり、ＴＨ１型アイソタイプと関連する抗原特異的免疫グロブリン反応を誘導する。
【００３０】
水中油型エマルジョンアジュバント
本発明の免疫原性組成物は、水中油型エマルジョンアジュバントを含む。水中油型エマルジョンそれ自体は、当分野で周知であり、アジュバント組成物として有用であることが示唆された（欧州特許第３９９８４３号；国際特許公開第９５／１７２１０号）。
【００３１】
任意の水中油型組成物がヒトへの投与に適するために、エマルジョン系の油相は、代謝可能な油を含まねばならない。「代謝可能」という用語の意味は当分野で周知であり、「代謝により変換されることが可能である」と定義され得る（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ,Ｗ.Ｂ.Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ,２５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））。油は任意の植物性油、魚油、動物性油または合成油であってもよく、レシピエントに対して無毒であり、代謝により変換され得るものである。ナッツ類、種子類、および穀物類は、植物性油の一般的な供給源である。合成油も本発明の一部であり、例えば、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含み得る。
【００３２】
適切な代謝可能な油はスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）であり、これは、サメ肝臓油において大量に存在し、オリーブ油、小麦胚芽油、ぬか油および酵母においては低量で存在する不飽和油である。スクアレンがコレステロールの生合成における中間体であるという事実によって、スクアレンは代謝可能な油である。好ましくは、代謝可能な油は、免疫原性組成物の全容積の０．５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量で存在する。
【００３３】
水中油型エマルジョンアジュバントは、乳化剤をさらに含む。乳化剤は、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））であってもよい。乳化剤は、好ましくは、免疫原性組成物の全容積の０．１２５〜４％（ｖ／ｖ）の量で、アジュバント組成物中に存在する。
【００３４】
本発明の水中油型エマルジョンは、任意でさらにトコール（ｔｏｃｏｌ）を含む。トコールは当分野で周知であり、欧州特許第０３８２２７１号に記載されている。適切なトコールは、α−トコフェロールまたは（ビタミンＥコハク酸エステルとしても知られる）α−トコフェロールコハク酸エステルなどのα−トコフェロールの誘導体である。トコールは、好ましくは、免疫原性組成物の全容積の０．２５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量で、アジュバント組成物中に存在する。
【００３５】
水中油型エマルジョンにおいて、油と乳化剤は、水性担体の中に存在するべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。
【００３６】
本発明の一実施形態において、水中油型エマルジョンアジュバントには、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））およびα−トコフェロールが含まれる。一般的に、水中油型エマルジョンアジュバントは、免疫原性組成物の全容積のうちスクアレン２〜１０％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート０．３〜３％、およびα−トコフェロール２〜１０％を含み、国際特許公開第９５／１７２１０号に記載の手順に従って製造されてもよい。スクアレン：α−トコフェロールの比は、それがより安定なエマルジョンを提供するように、１以下であってもよい。水中油型エマルジョンには、例えば、免疫原性組成物の全容積の１％のレベルで、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）および／またはレシチンが含まれてもよい。
【００３７】
水中油型エマルジョンの製造方法は当業者に周知である。一般に、この方法は、（任意でトコールを含む）油相をＰＢＳ/ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、ホモジナイザーを用いて均質化するステップを含む。この混合物を、注射針に２回通過させるステップを含む方法は、少量の液体を均質化するのに適する。同様に、当業者が、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体機、最大入力圧力６バール（約８５０バールの出力圧力）において２分間、最大５０回通過）を用いた乳化工程を行い、少量または大量のエマルジョンを製造することができる。必要とされる直径の油滴を有する調製品ができるまで、生じるエマルジョンの測定を含む通常の実験によって、この作業を行うことができる。
【００３８】
本発明の水中油型エマルジョン系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有してもよい。好ましくは、油滴サイズは、直径が、１２０〜７５０ｎｍの範囲、例えば、１２０〜６００ｎｍのサイズである。水中油型エマルジョンは、強度（intensity）に基づいて少なくとも７０％が５００ｎｍ未満の直径である、強度に基づいて少なくとも８０％が３００ｎｍ未満の直径である、または強度に基づいて少なくとも９０％が１２０〜２００ｎｍの範囲の直径である油滴を含んでもよい。
【００３９】
本発明によると、油滴サイズ（すなわち、直径）は強度で与えられる。強度に基づく油滴サイズの直径の測定には、数種類の方法がある。強度を、定寸装置を用いて、好ましくは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４０００またはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳなどの動的光散乱法によって測定する。第１に考えられる方法は、動的光散乱法（ＰＣＳ−光子相関分光法）によるｚ平均直径ＺＡＤを測定することである；この方法は、多分散性指数（ＰＤＩ）をさらに与え、ＺＡＤおよびＰＤＩの両方を、キュムラントアルゴリズムを用いて計算する。これらの値は、粒子屈折率の知識を必要としない。第２の手段では、ＣｏｎｔｉｎもしくはＮＮＬＳのいずれかの別のアルゴリズム、または自動「Ｍａｌｖｅｒｎ」アルゴリズム（定寸装置によってもたらされるデフォルトアルゴリズム）を用いて、全粒径分布を測定することにより、油滴の直径を計算する。ほとんど常に、複合組成物の粒子屈折率は分からないので、強度分布のみ、必要であれば、この分布から得られる強度平均値を考慮に入れる。
【００４０】
ワクチンの製剤化および投与
各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質量は、標準的なワクチンにおいて重度の、有害な副作用のない、免疫防御反応を誘導する量として選択する。かかる量は、使用する特定の免疫原ならびに用いるアジュバントの種類および量に応じて変化する。特定のワクチンの最適量を、対象における抗体力価および他の反応の観察を含む標準試験によって確かめてもよい。一般に、各用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、例えば、１〜２００μｇ、または１０〜１００μｇを含むことが期待される。一般的な用量は、１０〜５０μｇのタンパク質、例えば、１５〜２５μｇのタンパク質、好ましくは、約２０μｇのタンパク質を含む。あるいは、例えば、大流行の状況では、「用量−節約」法を用いてもよい。これは、効果的なアジュバントの存在により、低用量の抗原を用いて同じ防御作用をもたらすことが可能であるという研究結果に基づく。従って、各ヒト用量は、非常に低い量のタンパク質、例えば、１用量につき０．１〜１０μｇのタンパク質、または０．５〜５μｇのタンパク質、または１〜３μｇのタンパク質、好ましくは２μｇのタンパク質を含んでもよい。「ヒト用量」という用語は、ヒトへの使用に適する量である用量を意味する。一般的に、これは０．３〜１．５ｍｌである。一実施形態において、ヒト用量は０．５ｍｌである。
【００４１】
最初のワクチン接種後、一般的に、対象は、２〜４週間の間隔をあけて、例えば、３週間の間隔をあけて、追加免疫を受け、感染のリスクが存在する限り、任意で、追加免疫を繰り返し受ける。本発明の具体的な実施形態において、単回投与ワクチン接種が計画され、それによって、アジュバントと組み合わせたＳタンパク質の１用量は、最初のワクチン接種後にいかなる追加免疫をも必要とせず、ＳＡＲＳ ＣｏＶに対する防御をもたらすのに十分である。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物は、経口経路、局所経路、皮下経路、粘膜（一般的に、膣内）経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、舌下経路、皮内経路などの任意の様々な経路および坐薬によってもたらされてもよい。
【００４３】
免疫付与は、予防的または治療的であり得る。本明細書記載の本発明は、主に、ＳＡＲＳに対する予防ワクチンに関係するが、それに限らない。
【００４４】
本発明で使用する適切な医薬的に許容可能な担体または賦形剤は、当分野で周知であり、例えば、水または緩衝液を含む。ワクチン調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｖｏｌ.６１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ,ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ,Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９９５. Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ,ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ,Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ,Ｍａｒｙｌａｎｄ,Ｕ.Ｓ.Ａ.１９７８に記載されている。
【００４５】
本発明の免疫原性組成物は、上記で明らかにされた特定の成分を含む。本発明のさらなる態様において、免疫原性組成物は、前記成分から本質的になる、または前記成分からなる。
【００４６】
本発明を説明するのに役立つ以下の実施例に関して、本発明をこれから記載する。
【実施例１】
【００４７】
可溶型ＳＡＲＳ ＣｏＶ−Ｓタンパク質の発現
哺乳類細胞のＳタンパク質の細胞外ドメインを精製するために、細胞質内ドメインおよび膜貫通ドメインを除去したスパイク糖タンパク質を発現することができる遺伝子を構築した。このポリペプチドをＳｓｏｌと呼び、Ｓタンパク質の細胞外ドメイン全体（１〜１１９３番目のアミノ酸）を含む。Ｃ末端にはセリン−グリシンリンカーおよびオクタペプチドＦＬＡＧを結合させた。膜アンカードメインを除去したので、このＳｓｏｌポリペプチドは培地中に分泌される。
【００４８】
Ｓｓｏｌポリペプチドの構成的発現
ＴＲＩＰレンチウイルスベクターを用いて、安定で、構成的な方法で、Ｓｓｏｌタンパク質を発現する細胞株を樹立した。これらのベクターを、ｐＴＲＩＰプラスミドベクター、ｐ８．７パッケージングプラスミドおよびｐＨＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇプラスミドの共トランスフェクションにより産生する（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ.,１９９４；Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ.,２０００；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ.,１９９７）。
【００４９】
Ｓｓｏｌタンパク質発現のためのＴＲＩＰベクターを構築するために、ＣＭＶｉ/ｅプロモーター、ｐＣＩプラスミドのキメライントロン、ＳｓｏｌのＯＲＦおよび２つのウイルス排出エレメントＣＴＥまたはＷＰＲＥのうちの１つを含む発現カセットを、ＥＦ１プロモーターおよびＧＦＰのＯＲＦの代わりに、ｐＴＲＩＰ−ＥＦ１−ＥＧＦＰプラスミドに移した。このように、産生したこれらのプラスミドをｐＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥおよびｐＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＷＰＲＥと呼び、これらを用いて、それぞれ、ＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥおよびＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＷＰＲＥのレンチウイルスべクターストックを作った。これらのベクターを用いて、２４時間の間隔をあけた、一連の５回の連続形質導入サイクルに従って、ＦＲｈＫ−４細胞に形質導入した。形質導入した細胞を、限界希釈法によりクローン化し、得られたこれらの細胞クローンを、Ｓｓｏｌポリペプチドの顕著な分泌に応じて選択した。これを行うために、様々なクローンの固定数の細胞を３５ｍｍ培養皿に蒔き、７２時間後に、上清におけるＳｓｏｌタンパク質の存在を、ウエスタンブロットにより解析した。
【００５０】
期待されるサイズ（約１８０ｋＤａ）のタンパク質を、全クローンの上清において検出し、形質導入手順の効率を確認した。しかし、Ｓｓｏｌタンパク質を産生するために用いたＴＲＩＰベクターとは無関係に、発現レベルがクローンごとに異なった。ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３細胞クローンが、培養７２時間後に回収した上清において、最高濃度のＳｓｏｌタンパク質を得ることを可能にした。このクローンを、第２の一連の５回の形質導入サイクルにかけ、第２世代のクローンを得るために選択工程を繰り返した。最も産生力のある第２世代のクローン（ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０）を増幅して使用し、大量の上清を産生した。その後、様々な（濃度）範囲の精製Ｓｓｏｌをタンパク質マーカーとして用いる捕捉ＥＬＩＳＡ試験を用いて、Ｓｓｏｌタンパク質が、５〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０クローンの上清に分泌されることを判断することができた。Ｓｓｏｌタンパク質を産生する最適条件を、実験的に、細胞密度パラメーター、血清濃度、培養温度および分泌継続時間を検討して決定した。
【００５１】
組換えＳｓｏｌタンパク質の産生および精製
Ｓｓｏｌタンパク質の大規模産生について、ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０クローンの１．５〜２．１０８のサブコンフルエントな細胞のロットを、０．５％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭに基づく１リットルの培地の中で、３５℃で、４日間培養した。分泌されたＳｓｏｌタンパク質を含む上清を、限外濾過装置により濃縮し、抗ＦＬＡＧ抗体カラムの親和性クロマトグラフィにより精製した。カラムに固定した物質を、非変性条件下で、ＦＬＡＧペプチドとの競合により溶出し、その後、ゲル濾過により分離し、ＦＬＡＧペプチドおよび低分子量混入物を除去した。
【００５２】
精製物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硝酸銀染色で解析した。Ｓｓｏｌポリペプチドの期待されるサイズ（１８０〜２００ｋＤａ）を有する、糖タンパク質に特徴的な、強く拡散したバンドが現れた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、Ｓタンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析により、この精製タンパク質がＳタンパク質の細胞外ドメインと明確に一致することを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｒｕｂｙ ＳＹＰＲＯ染色後に、この精製タンパク質の精製度を調べた。蛍光シグナルの定量化は、ゲル濾過から溶出したタンパク質の９０％以上が、Ｓｓｏｌタンパク質に由来することを示した。次に、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を用いて、キットの助けをかりて、この精製Ｓｓｏｌタンパク質を定量化した。３つの独立した産生の解析後、１リットルの培養上清につき１．３〜２．５ｍｇのＳｓｏｌタンパク質を得ることができた。全段階（濃縮、親和性精製およびゲル濾過）を含めて、全精製収率は、２６〜５３％の範囲である。その後、精製Ｓｓｏｌタンパク質を、Ｎ末端配列解析、質量分析および分析用超遠心分離によりさらに特徴づけた。その結果、精製Ｓｓｏｌタンパク質は、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）は欠損しているが、Ｓタンパク質の細胞外ドメイン全体と一致する１８２ｋＤａの可溶性単量体であると結論づけた。
【００５３】
水中油型アジュバントの調製
後の実施例で用いる水中油型エマルジョンは、２種類の油（α−トコフェロールおよびスクアレン）で作られる有機相、ならびに、乳化剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の水相でできている。特に記載されない限り、後の実施例で用いる水中油型エマルジョンアジュバント製剤を、以下の水中油型エマルジョン成分（最終濃度）を含むように作った：２．５％スクアレン（ｖ／ｖ）、２．５％α−トコフェロール（ｖ／ｖ）、０．９％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｖ／ｖ）、国際特許公開第９５／１７２１０号参照。このエマルジョンを、後の実施例でＧＳＫ２と名付け、以下のように２倍濃縮物として調製した。
【００５４】
エマルジョンは、疎水性成分（α−トコフェロールおよびスクアレン）を含む油相と、水溶性成分（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよびＰＢＳｍｏｄ（改良型）、ｐＨ６．８）を含む水相とを、強く撹拌しながら混合して作製する。撹拌の間、油相（全容積の１／１０）を水相（全容積の９／１０）に移行させ、この混合物を、１５分間、常温で撹拌する。その後、生じた混合物を、マイクロフルイダイザー（１５０００ ＰＳＩ−８サイクル）の相互作用チャンバー内で、せん断力、衝撃力およびキャビテーション力にかけることにより、サブミクロンの油滴（１００〜２００ｎｍの間に分布）を作製する。生じたｐＨは、６．８±０．１の間である。その後、このエマルジョンを、０．２２μｍの膜に通す濾過により滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを、Ｃｕｐａｃ容器の中で、２〜８℃で冷蔵保存する。滅菌不活性ガス（窒素またはアルゴン）を、少なくとも１５秒間、エマルジョン最終バルク容器の死容積に勢いよく流し入れる。
【００５５】
マウスモデルにおけるアジュバントワクチン試験
アジュバントなしで、または５０μｇのミョウバンもしくは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと共に、２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）の筋肉組織に、３週間の間隔をあけて２回注射した。これらのアジュバントの用量は、従来、小型げっ歯類に対して使用された量であり、ヒト医学において使用される用量の１／１０に相当する。２グループのマウスがこの研究の対照として関係し、各々、アジュバントの一方のみで免疫した。これらのマウスの血清を、各注射の３週間後に採取し、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡ、血清中和解析およびアイソタイプ解析により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの特異的体液性反応を調べた。
【００５６】
ＥＬＩＳＡ（図１）により、対照グループの血清の抗体力価は、常に、検出限界以下（１．７ｌｏｇ１０）であった。１回のみの注射後、アジュバントなしでまたはミョウバンアジュバントと共にタンパク質によって誘導した抗体反応は弱く（それぞれの平均力価は、１．９±０．２ｌｏｇ１０および２．１±０．３ｌｏｇ１０）、以前に得られた結果を裏付けた。逆に、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）とタンパク質により誘導した抗体力価は、最初の注射から非常に高くなる（３．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。２回の注射後、タンパク質で免疫した全グループにおける力価の顕著な増加が観察される。最も弱い反応で最も異種的な反応が、アジュバントを用いなかった時に観察される（３．９±０．５ｌｏｇ１０の平均力価）。ミョウバンを免疫原調製品に加えると、抗体反応を改善することができる（４．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．０１）。最初の注射後に観察された結果によると、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）は、２回の注射後にＳｓｏｌタンパク質の免疫原性を顕著に改善し、得られた抗体力価（５．２±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）は、ミョウバンアジュバントとタンパク質によって誘導された力価よりも有意に高い（ｐ＜１０‐４）。
【００５７】
様々な免疫原による体液性反応の質を、２回目の注射の３週間後に採取した血清を用いて調べた。中和抗体力価（図２）は、ＥＬＩＳＡによる解析の時に観察された階層に従う。アジュバントなしでタンパク質を用いた時に、最も弱い力価が得られる（２．３±０．４ｌｏｇ１０の平均力価）。中和反応は、ミョウバンを加えることによって有意に改善する（３．１±０．３ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０，００１）。同様に、タンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、非常に高い中和抗体力価を得ることができ（３．７±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）、ミョウバンアジュバントとタンパク質によって誘導される力価より有意に４倍高い（ｐ＜０．００２）。
【００５８】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗原に対する特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのアイソタイプ力価を、最後の注射の３週間後に採取した血清において、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡにより、各グループについて調べた（図３）。アジュバントのないタンパク質での免疫またはミョウバンアジュバントとタンパク質での免疫は、ほぼ全くＩｇＧ１のみ誘導する。Ｓｓｏｌタンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、ミョウバンが存在する時よりもさらに高いＩｇＧ１力価（平均力価５．４±０．２ｌｏｇ１０）を誘導することができ、ＩｇＧ２ａ力価も高レベルになる（平均力価２．１±０．６に対して２．８±０．７；ｐ＜０．０５）。ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の平均比は、ＧＳＫ２アジュバントの存在下で８４０であり、ミョウバンの存在下で１６００を超える。これらの結果は、アジュバントなしでまたはミョウバンと共にタンパク質によって誘導される免疫反応が、主に２型であることを示す。Ｓｓｏｌタンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、ＴＨ−２型免疫反応が有利に働くが、弱くはあるが異種のＴＨ−１型免疫反応も誘導できる。
【実施例２】
【００５９】
ハムスターモデルにおけるアジュバントワクチン試験
５０μｇのミョウバンまたは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと共に、２μｇまたは０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、シリアゴールデンハムスター（１グループにつき６匹）の筋肉組織に、３週間の間隔をあけて２回注射した。これらのアジュバントの用量は、従来、小型げっ歯類に対して使用され、ヒト医学において使用される用量の１／１０に相当する。２グループのハムスターがこの実験の対照として関係し、各々、アジュバントの一方のみで免疫した。ＳＡＲＳに対する有望なワクチンを構成する、５０μｇのミョウバンと２μｇ（Ｓと同等）の精製した、β−プロピオラクトン不活性化ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス粒子（ＢＰＬ−ＳＣｏＶ）を、別のグループのハムスターに注射した。これらのハムスターの血清を、各注射の３週間後（それぞれ、ＩＳ１およびＩＳ２）および２回目の注射の３ヶ月後（ＩＳ２ｂｉｓ）に採取し、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡおよび血清中和解析により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの特異的体液性反応を調べた。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ（図４）により、対照グループの血清の抗体力価は、常に、検出限界以下（１．７ｌｏｇ１０）であった。２μｇのＳｓｏｌ用量において、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）は、１回（ＩＳ１）および２回（ＩＳ２）の注射後に、Ｓｓｏｌタンパク質の免疫原性を顕著に改善し、得られた抗体力価（４．２±０．３ｌｏｇ１０および５．０±０．１ｌｏｇ１０の平均力価）は、ミョウバンアジュバントとタンパク質により誘導された力価よりも、それぞれ０．６ｌｏｇ１０および０．７ｌｏｇ１０高い（ｐ＜１０‐３）。
【００６１】
０．２μｇのＳｓｏｌの１回のみの注射後、ミョウバンアジュバントを用いた時に観察された反応は弱く、検出限界に近い（１．８±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。逆に、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）とタンパク質によって誘導される抗体力価は、最初の注射から高くなり（３．９±０．５ｌｏｇ１０の平均力価）、ミョウバン存在下の２μｇのＳｓｏｌの単回注射後に達した力価より、より異種的ではあるが高いレベルに達する。２回の注射後、タンパク質で免疫した両グループの力価の顕著な増加が観察される。最も弱い反応であり最も異種的な反応が、ミョウバンアジュバントを用いた時に観察される（２．６±０．７ｌｏｇ１０の平均力価）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を免疫原調製品に加えると、抗体反応を強力に改善させることができる（４．８±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜１０‐４）。
【００６２】
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と０．２μｇおよび２μｇのＳｓｏｌの２回目の注射後、全免疫ハムスターにおいて、比較的高い力価反応が得られた（５．０±０．１ｌｏｇ１０に対する４．８±０．２ｌｏｇ１０力価）。これは、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いると、ＳＡＲＳに対する用量−節約ワクチン戦略が可能になることを示す。
【００６３】
０．２μｇのＳｓｏｌまたは２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される体液性免疫反応の質を、２回目の注射の３ヶ月後に採取した血清を用いて試験した。中和抗体力価（図５）は、ＥＬＩＳＡによる解析の時に観察された階層に従う。ミョウバンとタンパク質を用いて得られた力価は、検出限界以下であった（１．３ｌｏｇ１０）。中和反応は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えることによって非常に改善する（２．７±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜１０‐７）。この反応は、２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される反応と明確に同じであった（２．５±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。
【００６４】
Ｓｓｏｌ免疫ハムスターの抗原投与感染（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）
免疫３か月後に、選択したグループのハムスターに、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶを鼻腔内接種により抗原投与し、４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図６）および上気道（ＵＲＴ）、すなわち咽頭と気管（図７）において、ウイルス量の値を調べた。各模擬ワクチン接種動物の肺において、ウイルスの強力な一貫した複製が観察された（７．５±０．１ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。さらに、模擬ワクチン接種ハムスターの上気道において、ウイルス複製が示された（５．０±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物の肺（４．１±１．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ）およびＵＲＴ（２．５±０．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ）の両方において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ量を検出できた。明確な対照として、この動物モデルにおける強力なウイルス複製にも関わらず、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／臓器＜２．１）。Ｓｓｏｌとミョウバンで免疫したハムスターと比較して、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したハムスターの肺におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ複製の減少が１０２倍を上回るという証拠を、これらのデータは示す。Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で達成されたこの高レベルの防御は、不活化ウイルス粒子とミョウバンで免疫したハムスターにおいて観察されたレベルに匹敵する。
【００６５】
興味深いことに、抗原投与時、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌによる単回投与は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と０．２μｇのＳｓｏｌによる２回投与（４．４±０．１ｌｏｇ１０ ｐｆｕ）と同じくらい高い抗ＳＡＲＳ抗体のＥＬＩＳＡ力価（４．２±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕ）を誘導した（図４）。この後者のワクチン接種計画が、ＳＡＲＳ抗原投与に対して免疫ハムスターを保護する（図６および図７）という事実を考慮すると、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌによる単回投与も、防御反応を誘導すると予想することができる。これは、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いると、ＳＡＲＳに対する単回投与ワクチン戦略が可能になることを示す。
【００６６】
抗原投与ハムスターの肺の病理組織学的解析
抗原投与後、０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学解析を行った。図８は、肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。模擬ワクチン投与動物では、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察された（スコア＝３．１±０．６）。従って、ウイルス抗原を、これらの肺胞炎の病巣の中、ならびに気管および気管支肺胞の上皮にも検出した（スコア＝３．９±０．４）。損傷のスコア（２．６±１．０）およびウイルス抗原量（３．３±１．２）の双方は、ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物の肺においても高かった。明確な対照として、上気道（咽頭−気管、データ示さず）および肺（図８）の気道部分の大規模ＩＨＣスクリーニングにもかかわらず、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のワクチン接種ハムスターにおいて、肺における肺胞炎または肺炎の特異的損傷は検出されず（スコア＝０．５±０．０）、ウイルス抗原はいずれの動物においても検出されなかった。
【００６７】
これらのデータは、上気道および下気道における検出可能なウイルス抗原がないこと、ならびに肺炎がないことによって示されるように、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でワクチン接種したハムスターは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗原投与から完全に保護されることを裏付ける。
【００６８】
Ｓｓｏｌ免疫ハムスターの抗原投与感染の長期防御
２μｇのＳｓｏｌで２回免疫したハムスターのグループに対して、長期防御を試験した。２回目の注射の８カ月後、ミョウバン添加（平均力価１．８±０．４ｌｏｇ１０）と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により、中和抗体反応は改善された（２．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．００５）（図２１）。この反応は、２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される反応（２．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）と明らかに類似していた。
【００６９】
その後、これらのハムスターに、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶを鼻腔内接種によって抗原投与し、４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図２２）および上気道（ＵＲＴ）（図２３）において、ウイルス量の値を調べた。上記の結果と一致して、模擬ワクチン接種動物の肺およびＵＲＴの両方において、ウイルスの強力な複製が観察された（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、７．７±０．２ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび５．１±０．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ量は、５匹中２匹の肺およびＵＲＴの両方において検出でき、高いウイルス量（４．８ｌｏｇ１０ｐｆｕ）が１匹の動物のＵＲＴにおいて観察された。明確な対照として、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／臓器＜２．１）。Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で達成されたこの高レベルの防御は、不活化ウイルス粒子とミョウバンで免疫したハムスターにおいて観察されたレベルに匹敵する。
【００７０】
さらに、抗原投与および安楽死後、これらのハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行った（図２４）。上記のように、模擬ワクチン投与動物において、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察され（スコア＝５．４±０．９）、ウイルス抗原が検出された（スコア５．１±０．４）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌでワクチン接種した動物の肺において、損傷のスコアは有意に減少し（０．９±０．５、ｐ＜１０‐４）、ウイルス抗原量は検出されなかったが、ミョウバンと２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物においては、損傷スコアの中程度の減少が観察され（スコア＝２．６±０．８）、ウイルス抗原は５匹中２匹において検出可能であった（スコア＝０．５±０．６）。
【００７１】
結局、これらのデータは、Ｓｓｏｌタンパク質と水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）による長期防御の可能性の証拠を示す。
【００７２】
Ｓｓｏｌの単回投与を用いた抗原投与感染からのハムスターの防御
５０μｇのミョウバンまたは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと０．２μｇの用量のＳｓｏｌを筋肉組織に注射して、Ｓｓｏｌの単回投与による免疫後の防御を試験した。注射２週間後、ＥＬＩＳＡ抗体反応（図２５）は、ミョウバンの添加（平均力価２.０±０．４ｌｏｇ１０）と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により非常に改善した（平均ＥＬＩＳＡ力価３．３±０．３ｌｏｇ１０；ｐ＜０．００１）。中和抗体力価（図２６）は、ＥＬＩＳＡ解析によって観察された階層に従う。ミョウバンとタンパク質を用いて得られた力価は、各動物について、検出限界以下（１．３ｌｏｇ１０）であった。中和反応は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により改善し、免疫ハムスターの６匹中３匹が、検出可能な抗体反応を示した（１．５±０．３ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．１）。
【００７３】
免疫の３週間後に、これらのハムスターに１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶの鼻腔内接種によって抗原投与し、その４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図２７）および上気道（ＵＲＴ）（図２８）において、ウイルス量の値を調べた。上記の結果と一致して、模擬ワクチン接種動物の肺およびＵＲＴの両方において、ウイルスの強力な複製が観察された（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、７．３±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび４．８±０．５ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した後、中程度〜高いＳＡＲＳ−ＣｏＶ量が、６匹中５匹の肺およびＵＲＴの両方において検出可能であった（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、４．９±１．８ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび３．０±１．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。明確な対照として、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／肺＜２．１およびｌｏｇ１０ｐｆｕ／ＵＲＴ＜１．８）。
【００７４】
さらに、抗原投与ならびに安楽死後、これらのハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行った（図２９）。上記のように、模擬ワクチン投与動物において、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察され（スコア＝１．９±０．３）、ウイルス抗原が検出された（スコア２．４±０．３）。０．２μｇのＳｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でワクチン接種した動物の肺において、損傷のスコアは有意に減少し（１．０±０．０、ｐ＜１０‐４）、ウイルス抗原量は検出されなかったが、ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌでワクチン接種した動物において、損傷のスコアの減少は観察されず（スコア＝２．２±０．９）、ウイルス抗原は６匹の各々において検出可能であった（スコア＝２．６±０．８）。
【００７５】
結局、これらのデータは、Ｓｓｏｌタンパク質および水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の単回低用量注射によって誘導される高レベルの防御の可能性の証拠を示す。
【実施例３】
【００７６】
Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する体液性免疫反応
６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスをオランダのＨａｒｌａｎ社から入手した。０日および２１日目に、アジュバントなしで（「ｐｌａｉｎ」）、５０μｇのミョウバンでアジュバント化した、または水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と共に、２、０．２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、マウス（１グループにつき２３匹）に筋肉内注射した。追加の３グループのマウスを対照として含め、各々、ＰＢＳ、ミョウバンまたはＧＳＫ２アジュバント単独で免疫した。
【００７７】
非アジュバント化Ｓｓｏｌ抗原の調製
以下の順番に従って、製剤を用時調製した：注射用の水にＳｓｏｌ抗原を加え（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、常温で５分間、軌道振盪台上で混合し、（最終濃度が１５０ｍＭに達するように）１５００ｍＭのＮａＣｌを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。製剤化の終了後１時間以内に注射を行った。
【００７８】
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌの調製
以下の順番に従って、ワクチン調製品を作製した：注射用の水に水酸化アルミニウムを加え（１０００μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように）Ｓｓｏｌ抗原を加え、常温で３０分間、軌道振盪台上で混合し、（最終濃度が１５０ｍＭに達するように）１５００ｍＭのＮａＣｌを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。このワクチンを、最初の試験の第１の免疫の６日前に調製し、注射まで４℃で保存した。
【００７９】
ＧＳＫ２ａｄｊアジュバント化Ｓｓｏｌの調製
以下の順番に従って、製剤を用時調製した：注射用の水に１０倍濃縮のリン酸緩衝生理食塩水を加え、Ｓｓｏｌ抗原を加え（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、常温で５分間、軌道振盪台上で混合し、２倍濃縮のＧＳＫ２アジュバントを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。製剤化の終了後２時間以内に注射を行った。
【００８０】
体液性反応の解析
免疫１４日後（３５日の時点）にそれぞれのマウス（１グループ８匹）の血液試料から調製した血清において、体液性反応を調べた。抗原としてＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染させたＶｅｒｏＥ６細胞または陰性対照として感染させていないＶｅｒｏＥ６細胞の溶解物を用いた間接ＥＬＩＳＡ法により、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的抗体の存在の検出およびアイソタイプ解析を行った。ペルオキシダーゼに結合させたポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＮＡ９３１Ｖ,Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、続いて、ＴＭＢおよびＨ２Ｏ２（ＫＰＬ）を加えて明らかにした後、ＯＤ０．５を与える血清の希釈の逆数として、力価を計算した。アイソタイプの解析のために、マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体に特異的なポリクローナル血清を用いた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【００８１】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体
用量依存的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体反応が、アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下でＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された（図９）。非アジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、アジュバントの存在下、Ｓｓｏｌで免疫したマウスにおいて、抗体反応が有意に高いことが判明した。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、この反応は有意に高かった（ｐ＜１０‐４）；水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下で最も低用量のＳｓｏｌ（０．０２μｇ）で誘導された抗体力価は、ミョウバンの存在下で最も高い用量のＳｓｏｌ（２μｇ）で誘導された抗体力価より優れていることが判明した（ｐ＝０．０８）。
【００８２】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体のアイソタイプ解析
２μｇの用量のＳｓｏｌで免疫した「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、および水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したグループ（１グループ８匹）から調製した血清において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のアイソタイプ解析をＥＬＩＳＡにより行った。結果を図１０に示す。
【００８３】
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質のいずれかで免疫したマウスにおいて、この反応は、ＩｇＧ１アイソタイプに強く傾いていることが判明し、一方で非常に低レベルのＩｇＧ２ａ抗体が検出された。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいては、高い力価（５．３±０．１ｌｏｇ１０力価）のＩｇＧ１抗体が得られた。興味深いことに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＩｇＧ２ａ抗体の力価（４．０±０．８ｌｏｇ１０力価）は、１匹を除いて有意に増加した（ｐ＜１０‐５）。
【００８４】
中和抗体
１ウェルにつき１００ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ−ＣｏＶを用いて、ＦＲｈＫ−４細胞における標準的な血清中和アッセイにより、中和抗体の存在を調べた。熱で不活化した（５６℃、３０分間）血清の、１：２０の希釈からの２倍の段階希釈物を用いて、二重に（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）試験した。ＲｅｅｄおよびＭｕｎｓｃｈ（Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ １９３８：２７：４９３−９７）の方法に従って、ウェルの５０％（４ウェルのうち２ウェル）のウイルス感染力を中和する希釈の逆数として、中和力価を決定した。
【００８５】
アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した個々のマウス（１グループにつき８匹）の免疫１４日後に調製した血清を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを中和する抗体の存在について解析した。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、０．５μｇのＳタンパク質と同等の用量の不活化した全ウイルス調製品で免疫したマウスの血清を比較のために含めた。結果を図１１に示す。
【００８６】
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和抗体力価（３．４±０．１ｌｏｇ１０力価）は、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスの力価（２．８±０．３ｌｏｇ１０力価、ｐ＜０．００１）よりも０．６ｌｏｇ１０高かったが、非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和力価は、８匹中６匹について検出できなかった（＜１．３ｌｏｇ１０）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、中和抗体力価は、０．５μｇのＳと同等の全ウイルス抗原（３．６±０．２ｌｏｇ１０力価）と比べて、０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で同程度だった。
【００８７】
Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する細胞性免疫反応
ＢＡＬＢ／ｃマウスの「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、およびＧＳＫ２ａｄｊアジュバント化グループの細胞性免疫反応を、以下の表Ａにまとめたように調べた。
【表１】
【００８８】
１グループにつき１５匹のマウスのＰＢＭＣおよび脾臓において、細胞性反応を測定した。免疫７日後にＰＢＭＣを採取し、免疫１４日後に脾臓を摘出した。３匹のマウスの５つのプールにおいてＰＢＭＣを調べ、１グループにつき２匹のマウスの４つのプールにおいて脾臓を調べた。
【００８９】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
溶解緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた赤血球細胞の溶解後、ＰＢＭＣのインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて、最終濃度１０７細胞／ｍｌ（９６ウェルマイクロプレート）で行い、その後、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（共に１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。抗原再刺激ステップの後、ブレフェルジン（１μｇ／ｍｌ）の存在下、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、サイトカイン分泌を阻害した。
【００９０】
脾臓をマウスから摘出し、ＲＰＭＩ＋Ａｄｄ培地に貯蔵した（２匹／１グループの４つのプール）。ＲＰＭＩ＋Ａｄｄで希釈したＰＢＬ懸濁液を、５％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ中で１０７細胞／ｍｌに調整した。脾臓細胞のインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて行い、その後、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（共に１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。抗原再刺激ステップの後、ブレフェルジン（１μｇ／ｍｌ）の存在下、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、サイトカイン分泌を阻害した。
【００９１】
４℃で一晩保存した後、細胞染色を以下のとおりに行った：細胞懸濁液を洗浄し、２％Ｆｃブロッキング試薬（１／５０；２．４Ｇ２）を含む５０μｌのＰＢＳ１％ＦＣＳに再懸濁した。４℃での１０分間のインキュベーション後、抗ＣＤ４−ＰＥ（１／５０）と抗ＣＤ８ａ ｐｅｒＣｐ（１／５０）の５０μｌの混合物を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ１％ＦＣＳで洗浄した後、２００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｋｉｔ ＢＤ）に再懸濁することにより細胞を透過処理し、４℃で２０分間インキュベートした。
【００９２】
その後、細胞をＰｅｒｍ Ｗａｓｈ（Ｋｉｔ ＢＤ）で洗浄し、Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈで希釈した５０μｌの抗ＩＦＮγ−ＡＰＣ（１／５０）＋抗ＩＬ−２ＦＩＴＣ（１／５０）で再懸濁した。４℃での２時間のインキュベーション後、細胞をＰｅｒｍ Ｗａｓｈで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを加えたＰＢＳ１％ＦＣＳに再懸濁した。試料の解析をＦＡＣＳにより行った。生きている細胞をゲーティングし（ＦＳＣ／ＳＳＣ）、約２０，０００イベント（リンパ球ＣＤ４）について（データ）取得を行った。ＣＤ４＋のゲート集団におけるＩＦＮγ＋またはＩＬ２＋のパーセンテージを計算した。
【００９３】
サイトカイン分泌（ＣＢＡ）量
再刺激の上清のサイトカイン量も、免疫１４日後の脾臓のＰＢＭＣにおいて計算した。脾臓をマウスから摘出し、ＲＰＭＩ＋Ａｄｄ培地に貯蔵した（２匹／１グループの４つのプール）。ＰＢＭＣ懸濁液を、５％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ中で１０７細胞／ｍｌに調整した。ＰＢＭＣのインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて行い、その後、３７℃で７２時間インキュベートした。上清を回収し、ＩＦＮγ、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の検出のためのＣＢＡ（サイトカインビーズアッセイ）−ｆｌｅｘ（ＢＤ ｋｉｔ）による試験まで−７０℃で保存した。
【００９４】
異なる蛍光強度を有するビーズ集団を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１３タンパク質に特異的な捕捉抗体でコーティングした。ビーズ集団を混合し、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を形成させ、ＢＤ社のＦＡＣＳ（商標）フローサイトメーターのＦＬ３チャネルで解像した。サイトカイン捕捉ビーズをＰＥ結合検出抗体と混合し、その後、組換え標準物質または試験試料とインキュベートし、サンドイッチ複合体を形成させた。フローサイトメーターを用いて試料データを取得後、試料の結果のグラフおよび表を作成した。
【００９５】
マウスサイトカイン標準物質を再構成し、アッセイ希釈剤を用いて段階希釈により希釈した。マウスサイトカイン捕捉ビーズ懸濁液を貯蔵、混合し、各アッセイ試験管に移した（５０μｌ／試験管）。標準希釈物および試験試料を適切な試料用試験管に加え（５０μｌ／試験管）、５０μｌのＰＥ検出試薬を加えた。全試料および標準物質を、常温で２時間、暗室の中でインキュベートした。インキュベーション後、全反応試験管を、１ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、２００×ｇで、５分間、遠心分離した。（上清を）取り除いた後、標準物質および試料を３００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。標準物質および試料のデータを、サイトメーターの設定のためのＢＤ社のＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェア、および試料を解析するためのＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロ−サイトメーターで読み取り、ＢＤ社のＣＢＡソフトウェアを用いて次の解析（標準曲線を用いた試料濃度の計算）を行った。
【００９６】
ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、各抗原用量で、有意に高い（ｐ＜０．０５）ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された（図１２）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは非アジュバント化抗原は、アジュバント単独またはＰＢＳでの免疫により達成される反応と類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質２μｇ、０．２μｇまたは０．０２μｇを用いてマウスを免疫した後、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された（図１２）。
【００９７】
脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、各抗原用量で、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された（図１３）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは非アジュバント化抗原は、アジュバント単独またはＰＢＳでの免疫により達成される反応と類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質２μｇ、０．２μｇまたは０．０２μｇを用いてマウスを免疫した後、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された（図１３）。
【００９８】
脾細胞からのサイトカイン分泌
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、より高レベルのＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γサイトカインが誘導された（図１４）。両方のアジュバント（ミョウバンおよびＧＳＫ２アジュバント）は、混合したＴｈ１型（ＩＦＮ−γ）ならびにＴｈ２型（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）サイトカインプロファイルをもたらした。
【実施例４】
【００９９】
Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する体液性免疫反応
ＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施例３で記載した手順と同じ実験手順を、オランダのＨａｒｌａｎ社から入手した６〜８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行った。アイソタイプの解析のために、マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体に特異的なポリクローナル血清を用いた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０１００】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体
用量依存的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体反応が、アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下でＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された（図１５）。各抗原用量において、非アジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、アジュバントの存在下、Ｓｓｏｌで免疫したマウスにおいて、抗体反応が有意に（０．３−１．９ｌｏｇ１０)高いことが判明した。２μｇおよび０．２μｇの抗原用量において、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、この反応は有意に（０．８−０．９ｌｏｇ１０）高かった（ｐ＜０．００５）。ミョウバンアジュバント化（ｐ＝０．０９、および差＝０．２ｌｏｇ１０）またはｐｌａｉｎ（ｐ＝０．０２ Ｓｓｏｌ、および差＝０．３ｌｏｇ１０）のＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化した０．０２μｇのＳｓｏｌでマウスを免疫した後に、より高い抗体反応の傾向が観察された。
【０１０１】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体のアイソタイプ解析
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質のいずれかで免疫したマウスにおいては、反応がＩｇＧ１アイソタイプに強く傾いていることが判明したが、ＩｇＧ２ｂ抗体が全く検出されなかったか、または非常に低レベルのＩｇＧ２ｂ抗体が検出された（図１６）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスでは、高い力価（５．０±０．２ｌｏｇ１０力価）のＩｇＧ１抗体が得られた。珍しいことに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された力価と比較して、ＩｇＧ２ｂ抗体の力価（３．７±０．５ｌｏｇ１０力価）は、異種的ではあるが有意に増加した（１．７±０．０４ｌｏｇ１０力価、ｐ＜１０‐６）。
【０１０２】
中和抗体
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和抗体力価（２．４±０．５ｌｏｇ１０力価）は、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスの力価（１．８±０．４ｌｏｇ１０力価、ｐ＝０．０２）よりも有意に高かったが、非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和力価は、検出限界以下に落ちた（図１７）。
【０１０３】
Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する細胞性免疫反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、および水中油型エマルジョン（ＧＳＫ２ａｄｊ）でアジュバント化したグループの細胞性免疫反応を、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施例３で記載したように調べた。しかし、脾臓摘出の技術的問題により、Ｐｌａｉｎ製剤（非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質）またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおける脾臓の細胞性反応は入手できなかった。
【０１０４】
ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、用量に関わらず、弱い頻度のＣＤ４＋Ｔ細胞（反応）が得られた（図１８）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質（３種類の用量全て）または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質（０．２μｇおよび０．０２μｇ）で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質によって、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された。２μｇの非アジュバント化ＳｓｏｌとＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質との間で、類似のしかし弱い頻度（反応）が観察された（図１８）。
【０１０５】
脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質でマウスを免疫した後に、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応の傾向が観察された（図１９）。ＧＳＫ２アジュバント単独で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質でマウスを免疫した後に、有意に高い（ｐ＜０．０５）ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した、０．２μｇまたは０．０２μｇの用量のＳｓｏｌが、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した（図１９）。
【０１０６】
脾細胞からのサイトカイン分泌
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、ＩＬ−５およびＩＬ−１３サイトカインのより高い産生の傾向が観察された（図２０）。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質がいかなる用量であろうと、類似のレベルのＩＦＮ−γサイトカインが観察された（図２０）。
【０１０７】
実施例３および４の結果の概略および結論
これらのデータは、概して、アジュバントがない場合またはミョウバン存在下のいずれかにおけるＳｓｏｌタンパク質での免疫と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いたＳｓｏｌタンパク質のアジュバント化が、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において、より高レベルの抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ ＥＬＩＳＡ抗体反応および中和抗体反応を誘導したことを示した。さらに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質での免疫と比較して、ＧＳＫ２アジュバントを用いたＳｓｏｌタンパク質のアジュバント化が、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのそれぞれにおけるＴｈ１型およびＴｈ２型サイトカインのより高い産生ならびにＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂの産生の増加によって示されるように、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質は、混合したＴｈ１／Ｔｈ２様反応プロファイルをもたらした。
配列番号１
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ＃０３１５８９株のＳタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２
Ｓｓｏｌアミノ酸配列
１〜１３番目のアミノ酸はシグナルペプチドに相当し、成熟タンパク質から切断される（下線）。Ｓｅｒ−ＧｌｙリンカーおよびＦＬＡＧペプチド配列を太字で示す。
配列番号３
Ｓタンパク質をコードし、ｐＣＩ−Ｓ−ＷＰＲＥの中のようにＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１カセット内に挿入されるＤＮＡ配列。ＡＴＧおよびＴＡＡコドンに下線をし、余分な配列（ＢａｍＨ１、Ｘｈｏ１、コザック配列）を太字で示す。
配列番号４
Ｓｓｏｌポリペプチドをコードし、ＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１カセットに挿入されるＤＮＡ
−ＡＴＧおよびＴＡＡコドンに下線をする
−余分な配列（ＢａｍＨ１、Ｘｈｏ１、コザック配列）を太字で示す。
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー配列を網掛けで示す。
−ＦＬＡＧペプチド配列を□で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）感染に対するワクチン、ならびにＳＡＲＳの予防におけるこれらのワクチンの使用に関する。本発明は、かかるワクチンの生成方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
コロナウイルスは、構造タンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳを含む少なくとも１８個のウイルスタンパク質をコードする、プラスセンスの、非分節型（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスの主要抗原であるＳ（スパイク）タンパク質は、ウイルスエンベロープの表面から出現する刺の形態で存在する膜糖タンパク質（２００〜２２０ｋＤａ）である。宿主細胞の受容体へのウイルスの付着および、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合の誘導を担う。Ｓタンパク質は２つのドメインを有する：Ｓ１は、受容体結合に関与すると考えられている；Ｓ２は、ウイルスと標的細胞との膜融合を媒介すると考えられている（Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｌａｉ,１９９６）。Ｓタンパク質は、非共有結合のホモ三量体（オリゴマー）を形成することができ、それによって受容体結合およびウイルス感染を媒介することができる。
【０００３】
２００３年３月に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の症例と関連して、新規のコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶまたはＳＡＲＳウイルス）が単離された。ウルバーニ（Ｕｒｂａｎｉ）分離株（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＡＹ２７４１１９．３ ａｎｄ Ａ.ＭＡＲＲＡ ｅｔ ａl.,Ｓｃｉｅｎｃｅ,Ｍａｙ１,２００３,３００,１３９９−１４０４）およびトロント分離株（Ｔｏｒ２,Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.ＡＹ２７８７４１ ａｎｄ Ａ.ＲＯＴＡ ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ,２００３,３００,１３９４−１３９９）のゲノム配列を含めて、新規のコロナウイルスのゲノム配列が得られた。
【０００４】
ＳＡＲＳ関連コロナウイルスの別の株も同定され、これはＴｏｒ２およびウルバーニ分離株と見分けられる。このコロナウイルス株は、ＳＡＲＳを患う患者の気管支肺胞洗浄から採取された試料に由来し、０３１５８９という番号で登録され、ハノイ（ベトナム）フランス病院で収集された（国際特許公開第２００５／０５６７８１号、および同第２００５／０５６５８４号）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、および水中油型エマルジョンアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、本発明の免疫原性組成物を生成する方法も提供し、その方法は、免疫原性Ｓポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を水中油型エマルジョンアジュバントと混合するステップを含む。
【０００６】
本発明は、さらに以下を提供する：
薬剤として使用するための本発明の免疫原性組成物；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための本発明の免疫原性組成物；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物の使用；
重症急性呼吸器症候群もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療する方法であって、この方法は、本発明の有効量の免疫原性組成物を、それを必要とする個人に投与するステップを含む；ならびに、
ワクチンとして使用するための本発明の免疫原性組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。アジュバントなし（ｎｏ ａｄｊ.）で、または５０μｇのミョウバンもしくは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）に付随して、２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、３週間の間隔をあけて、２回筋肉内注射することにより、若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）を免疫した。２つの対照グループを、それぞれのアジュバント単独で免疫した。各注射（ＩＳ１およびＩＳ２、それぞれ）の３週間後に血清を採取し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的抗体反応を測定した。各マウスの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。この実験の検出限界を点線で表す。
【図２】Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）を上記のように免疫した。最後の注射の３週間後に採取した血清の中和抗体力価を、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載されたように測定した。各マウスの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。この実験の検出限界を点線で表す。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、Ｓｓｏｌタンパク質によって誘導された免疫反応型の、アジュバントを用いた調節を示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプの力価を、最後の免疫の３週間後に採取したマウスの血清において測定した。各マウスについて測定した力価を点で示す。対照グループについては、力価を各グループの血清の混合物において測定し、ひし形で示す。この実験の検出限界を点線で示す。
【図４】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。各注射の３週間後（それぞれ、ＩＳ１およびＩＳ２）および２回目の注射の３ヶ月後（ＩＳ２ｂｉｓ）に血清を採取し、図１に記載の抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的抗体反応を測定した。各ハムスターの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図５】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。最後の注射の３か月後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図６】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の３ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶをハムスターの鼻腔内に抗原投与した。接種４日後、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図６）およびＵＲＴ（図７）に対する値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図７】シリアゴールデンハムスターにおける、Ｓｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の３ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶをハムスターの鼻腔内に抗原投与した。接種４日後、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図６）およびＵＲＴ（図７）に対する値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図８】０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で事前に免疫した抗原投与ハムスターの肺の病理組織学的解析の結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。
【図９】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図１０】２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶアイソタイプ抗体の力価を示す。
【図１１】０．２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和抗体の力価を示す。
【図１２】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫７日後に得たＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１３】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１４】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから免疫１４日後に得た脾細胞からのサイトカイン分泌（ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ）を示す。
【図１５】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的ＩｇＧ抗体の力価を示す。
【図１６】２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清における、間接ＥＬＩＳＡ法により測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶアイソタイプ抗体の力価を示す。
【図１７】０．２μｇの、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た血清を用いて測定したＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和抗体の力価を示す。
【図１８】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫７日後に得たＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図１９】異なる用量の、Ｓｓｏｌ単独、またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスから免疫１４日後に得た脾細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す。
【図２０】異なる用量の、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２ａｄｊ）化Ｓｓｏｌで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫１４日後に得た脾細胞からのサイトカイン分泌（ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ）を示す。
【図２１】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。最後の注射の８カ月後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２２】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の８ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの値を、肺（図２２）およびＵＲＴ（図２３）について黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２３】シリアゴールデンハムスターにおける、２μｇのＳｓｏｌポリペプチドによって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。２回目の注射の８ヶ月後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの値を、肺（図２２）およびＵＲＴ（図２３）について黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２４】２μｇのＳｓｏｌタンパク質で事前に免疫した抗原接種ハムスターの肺の病理組織学的解析結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。
【図２５】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の２週間後に血清を採取し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ天然抗原に対する特異的な抗体反応を、図１に記載したように抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡにより測定した。各ハムスターの力価を黒い点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２６】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される中和体液性反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の２週間後に採取した血清の中和抗体力価を、図２に記載したように測定した。各ハムスターの力価を点で表し、それらの平均を水平な線で表す。
【図２７】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の３週間後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図２７）およびＵＲＴ（図２８）について値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２８】シリアゴールデンハムスターにおける、０．２μｇのＳｓｏｌポリペプチドの単回注射によって誘導される防御免疫反応に対するアジュバントの効果を示す。注射の３週間後に、１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶで、ハムスターの鼻腔内に抗原接種した。接種４日後に、ハムスターを安楽死させた。肺と上気道（ＵＲＴ、すなわち咽頭と気管）のホモジェネートを調製し、Ｃａｌｌｅｎｄｒｅｔら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ,２００７,３６３：２８８−３０２）に記載の、ベロ細胞におけるプラークアッセイにより、感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する力価を測定した。それぞれのハムスターの、肺（図２７）およびＵＲＴ（図２８）について値を黒丸で表し、平均を水平な線で表す。これらのアッセイの検出限界を点線で示す。
【図２９】０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質の単回注射で事前に免疫した抗原接種ハムスターの肺の病理組織学的解析結果を示す。肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、０〜５の目盛りで示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）もしくは他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患の予防または治療に有用な免疫原性組成物を提供する。本明細書で使用する「免疫原性組成物」という用語は、任意で、アジュバントで適切に製剤化される時、ヒトなどの個体において免疫反応を引き起こすことができる免疫原性成分を含む組成物をいう。従って、一実施形態において、本発明は、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体、および水中油型エマルジョンアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。本発明の別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物はワクチンであり、すなわちこの免疫原性組成物はＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染に対する防御免疫反応を引き起こすことができる。
【０００９】
本発明の免疫原性組成物は、その断片および変異体を含む、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチドを含む。この免疫原性Ｓポリペプチドは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染に対して、防御免疫反応を引き起こすことができるエピトープ、例えば、中和抗体の産生を引き起こすことができるおよび／または細胞性免疫反応を刺激することができるエピトープを有するＳタンパク質の任意の部分を含み得る。
【００１０】
典型的なＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質は、１，２５５個のアミノ酸を有し（例えば、配列番号１参照）、１３個のアミノ酸のシグナル配列、１２〜６７２番目のアミノ酸に存在するＳ１ドメイン、および６７３〜１１９２番目のアミノ酸に存在するＳ２ドメインを有する。このタンパク質は、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）、細胞外ドメイン（１４〜１１９５番目のアミノ酸）、膜貫通ドメイン（１１９６〜１２１８番目のアミノ酸）および細胞内ドメイン（１２１９〜１２５５番目のアミノ酸）からなる。このＳタンパク質配列は、ヒト集団においてＳＡＲＳを起こしたことが知られるＳＡＲＳ−ＣｏＶ株、例えば、Ｔｏｒ２、ウルバーニもしくは番号０３１５８９株を含む任意のＳＡＲＳ−ＣｏＶ株、または、例えば、ヒト集団には未だ侵入したことがなく、ジャコウネコもしくはコウモリなどの動物集団において循環している株である任意の他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ株に由来し得る。
【００１１】
一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、全長Ｓタンパク質の一部または断片である。本明細書に記載のように、免疫原性Ｓポリペプチドは、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御免疫反応を引き起こす全長Ｓタンパク質または野生型Ｓタンパク質それぞれの中に含まれる少なくとも１つのエピトープを有する、Ｓタンパク質の断片または（本明細書記載の全長Ｓタンパク質またはＳ断片の変異体であり得る）Ｓタンパク質変異体を含む。
【００１２】
一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、Ｓタンパク質の全細胞外ドメイン（外部ドメイン）、例えば、１〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含んでもよい。従って、免疫原性Ｓポリペプチドは、その細胞質内および膜貫通ドメインが除去されたＳ糖タンパク質からなってもよい。任意で、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）が除去されてもよい。一実施形態において、免疫原性Ｓポリペプチドは、そのＣ末端に、セリン−グリシンリンカー（ＳＧ）およびオクタペプチドＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を結合したＳタンパク質の細胞外ドメインからなる。特に、免疫原性Ｓポリペプチドは、Ｃ末端にＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫ配列を融合させたＳＡＲＳ−ＣｏＶ Ｓタンパク質の１４〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含んでもよい。さらなる実施形態において、Ｓポリペプチドは、配列番号２の配列からなるまたはそれを含んでもよい。
【００１３】
免疫反応を刺激する、誘導する、または引き起こすエピトープを含むＳタンパク質断片は、配列番号１の８〜１５０個の任意の数のアミノ酸（例えば、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０個などのアミノ酸）に及ぶ連続したアミノ酸の配列を含んでもよい。
【００１４】
他の実施形態において、コロナウイルスのＳポリペプチド変異体は、配列番号１で示される全長Ｓタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）を有する。かかるＳポリペプチドの変異体および断片は、少なくとも１つのＳタンパク質特異的な生物活性または機能を保持し得る。例えば、（１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する防御免疫反応、例えば、中和反応および／または細胞性免疫反応を引き起こす能力；（２）受容体結合によるウイルス感染を媒介する能力；ならびに（３）ウイルス粒子および宿主細胞間の膜融合を媒介する能力である。
【００１５】
Ｓポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。保存的置換の例として、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａなどの１つの脂肪族アミノ酸と別の脂肪族アミノ酸との置換、またはＬｙｓとＡｒｇ間、ＧｌｕとＡｓｐ間、もしくはＧｌｎとＡｓｎ間などの１つの極性残基と別の極性残基との置換が挙げられる。類似のアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される置換でもあり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；β分枝状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が含まれる。プロリンは、分類することが難しいと考えられるが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、およびＡｌａ）と性質を共有する。特定の状況において、グルタミンのグルタミン酸への置換またはアスパラギンのアスパラギン酸への置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点において、類似の置換と考えられ得る。
【００１６】
本明細書で開示されるコロナウイルス免疫原配列内のアミノ酸の保存的置換および類似の置換は、本明細書記載の方法および当分野で実施される方法に従って容易に行われ得、例えば、体液性反応（すなわち、野生型（つまり変異体ではない）免疫原と特異的に結合する、および／または野生型（つまり変異体ではない）免疫原と特異的に結合する抗体に結合する抗体に結合し、これと同じ生物活性を有する抗体を生じさせる反応）を含み得る免疫反応を誘導するもしくは引き起こす能力などの、類似の物理的特性および機能活性または生物活性を保持する変異体を提供する。Ｓタンパク質免疫原の変異体は、例えば、細胞受容体と結合するおよび感染を媒介する能力を保持する。
【００１７】
本明細書で使用される「パーセント同一性」または「％同一性」は、コンピューターに実行させるアルゴリズムを用いて、対象のポリペプチド、ペプチド、またはその変異体の配列全体を、試験配列と比較することによって得られるパーセンテージの値である。本明細書記載の変異体免疫原を、点変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、付加、欠失などの１つまたは複数の様々な変異を含むように作ることができる、つまりこれらの変異体は、糖鎖付加およびアルキル化を含む特定の化学的置換などによる修飾の結果であり得る。
【００１８】
本明細書記載のＳタンパク質免疫原、その断片および変異体は、免疫反応、例えば、体液性反応および／もしくは細胞性免疫反応であり得る防御免疫反応を引き起こすまたは誘導するエピトープを含む。防御免疫反応は、以下の少なくとも１つによって表され得る：コロナウイルスによる宿主の感染を防ぐこと；感染を変更するまたは制限すること；感染からの宿主の回復を助ける、改善する、高める、または刺激すること；ならびに、ＳＡＲＳコロナウイルスによる次の感染を防ぐまたは制限する免疫学的記憶を生み出すこと。ＳＡＲＳ ＣｏＶ感染の症例において、例えば、肺および上気道におけるウイルス量、肺の炎症および病変のスコア、肺におけるウイルス抗原量のスコア、血清中和抗体の存在、ＰＢＭＣ、脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応、ならびに脾臓からのサイトカイン分泌によって、防御免疫反応を評価することができる。感染を中和する、ウイルスおよび／もしくは感染細胞を溶解する、宿主細胞によるウイルスの除去を促進する（例えば、食作用を促進する）、かつ／またはウイルス抗原物質と結合するおよびウイルス抗原物質の除去を促進する抗体の産生を、体液性反応は含み得る。体液性反応は、特異的粘膜ＩｇＡ反応を引き起こすまたは誘導することを含む粘膜反応も含み得る。
【００１９】
本明細書記載のＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳポリペプチド、断片または変異体による、対象または宿主（ヒトまたはヒトではない動物）における免疫反応の誘導は、本明細書記載の方法および当分野で通常実施される方法によって測定ならびに特徴づけられ得る。これらの方法には、例えばウサギ、マウス、フェレット、ジャコウネコ、アフリカミドリザル、またはアカゲザルのモデルを用いた動物免疫試験などのインビボアッセイ、ならびにウエスタン免疫ブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、およびそれらの組み合わせなどを含む抗体検出および抗体解析の免疫化学法などの多数のインビトロアッセイの任意の１つが含まれる。
【００２０】
免疫反応を解析するおよび特徴づけるために使用され得る他の方法および技術には、中和アッセイ（プラーク減少アッセイ、または細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定するアッセイ、または当業者によって実施される任意の他の中和アッセイ）が含まれる。当分野で知られるこれらのならびに他のアッセイおよび方法を、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する防御性体液免疫反応または細胞性免疫反応を引き起こす、少なくとも１つのエピトープを有するＳタンパク質免疫原およびその変異体を同定するおよび特徴づけるために使用することができる。様々なアッセイにおいて得られた結果の統計的優位性を、関連分野の技術者によって通常実施される方法に従って、計算および理解することができる。
【００２１】
コロナウイルスＳタンパク質免疫原（全長タンパク質、その変異体、またはその断片）、ならびにかかる免疫原をコードする対応する核酸を単離型で提供し、特定の実施形態において、精製して均一にする。本明細書で使用される「単離する」という用語は、核酸またはポリペプチドを、その最初の環境または天然環境から除去することを意味する。
【００２２】
ＳＡＲＳコロナウイルスＳタンパク質免疫原ならびにその断片および変異体を、合成でまたは組換えで産生することができる。コロナウイルスに対する免疫反応を誘導するエピトープを含むコロナウイルスタンパク質断片を、自動化された手順による合成を含む標準的な化学的手法によって合成することができる。あるいは、Ｓタンパク質免疫原を、組換えで産生することができる。例えば、Ｓタンパク質免疫原を、核酸発現構築物の中のプロモーターなどの発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドから発現させることができる。例えば、Ｓタンパク質免疫原は、配列番号３または４のＤＮＡ配列によってコードされ得る。ＳＡＲＳコロナウイルスＳポリペプチドおよびその断片または変異体を、哺乳類細胞、酵母、細菌、昆虫もしくは他の細胞において、適切な発現制御配列の制御下で発現させることができる。無細胞翻訳系も使用して、ＲＮＡを含む核酸および発現構築物を用いて、かかるコロナウイルスタンパク質を産生することができる。原核生物および真核生物の宿主と共に使用する適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者によって通常使用されており、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,ＮＹ,（１９８９）および第３版（２００１）に記載されており、本明細書で開示されるプラスミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター、ウイルスベクター、および染色体複製開始点を含むベクターを含み得る。
【００２３】
当業者が理解するように、コロナウイルスＳポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子コードの縮重により、本明細書で提示される配列とは異なり得る。コロナウイルスポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列は、ホモログまたは株変異体もしくは他の変異体をコードする配列を含む。変異体は、天然の多型に由来してもよく、例えば、アミノ酸変異を導入するための組換え法により、または化学合成により合成されてもよく、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失などにより野生型ポリペプチドとは異なってもよい。
【００２４】
アジュバントＴＨ１およびＴＨ２免疫反応
免疫反応は、（それぞれ、従来、防御のための抗体によっておよび防御のための細胞エフェクター機構によって特徴づけられる）体液性または細胞性免疫反応の２つの極端なカテゴリーに、広範に分けることができる。反応のこれらのカテゴリーは、ＴＨ１型反応（細胞性反応）およびＴＨ２型免疫反応（体液性反応）と呼ばれてきた。
【００２５】
極端なＴＨ１型免疫反応は、抗原特異的な、ハプロタイプ限定細胞毒性Ｔリンパ球反応、およびナチュラルキラー細胞反応が生じることによって特徴づけられ得る。マウスにおけるＴＨ１型反応は、大抵、ＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＧ２ｂサブタイプの抗体産生によって特徴づけられ、ヒトにおけるこれらのＴＨ１型反応はＩｇＧ１型抗体に相当する。ＴＨ２型免疫反応は、マウスにおいて、ＩｇＧ１を含む様々な免疫グロブリンアイソタイプの産生によって特徴づけられる。
【００２６】
これらの２つの型の免疫反応の発達の背後にある立役者はサイトカインであると考えることができる。高レベルのＴＨ１型サイトカインは、所望の抗原に対する細胞性免疫反応の誘導を助ける傾向にあり、高レベルのＴＨ２型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応の誘導を助ける傾向にある。
【００２７】
ＴＨ１型およびＴＨ２型免疫反応の差異は絶対的ではなく、これらの２つの極端な分類の間で、連続的な形態をとることができる。実際には、個体は、主にＴＨ１または主にＴＨ２として説明される免疫反応を支持する。しかし、大抵、マウスＣＤ４＋ｖｅ Ｔ細胞クローンについて、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ,Ｔ.Ｒ.ａｎｄ Ｃｏｆｆｍａｎ,Ｒ.Ｌ.（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,７,ｐ１４５−１７３）によって記載される観点から、サイトカインのファミリーを考慮することは都合がよい。従来、ＴＨ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γサイトカイン産生と関連する。大抵、ＴＨ１型免疫反応の誘導と直接関連する他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２は、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、ＴＨ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）の分泌と関連する。
【００２８】
特定のワクチンアジュバントは、特に、ＴＨ１型またはＴＨ２型いずれかのサイトカイン反応の刺激に適することが知られている。従来、ワクチン接種または感染後の免疫反応のＴＨ１：ＴＨ２バランスの指標として、抗原を用いた再刺激後の、インビトロでのＴリンパ球によるＴＨ１サイトカインまたはＴＨ２サイトカイン産生の直接測定、および／または抗原特異的抗体反応のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ１：ＩｇＧ２ｂ比の（少なくともマウスにおける）測定が含まれる。
【００２９】
従って、ＴＨ１型アジュバントは、インビトロで抗原を用いて再刺激した時、単離したＴ細胞集団を刺激し、高レベルのＴＨ１型サイトカインを産生するアジュバントであり、ＴＨ１型アイソタイプと関連する抗原特異的免疫グロブリン反応を誘導する。
【００３０】
水中油型エマルジョンアジュバント
本発明の免疫原性組成物は、水中油型エマルジョンアジュバントを含む。水中油型エマルジョンそれ自体は、当分野で周知であり、アジュバント組成物として有用であることが示唆された（欧州特許第３９９８４３号；国際特許公開第９５／１７２１０号）。
【００３１】
任意の水中油型組成物がヒトへの投与に適するために、エマルジョン系の油相は、代謝可能な油を含まねばならない。「代謝可能」という用語の意味は当分野で周知であり、「代謝により変換されることが可能である」と定義され得る（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ,Ｗ.Ｂ.Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ,２５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））。油は任意の植物性油、魚油、動物性油または合成油であってもよく、レシピエントに対して無毒であり、代謝により変換され得るものである。ナッツ類、種子類、および穀物類は、植物性油の一般的な供給源である。合成油も本発明の一部であり、例えば、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含み得る。
【００３２】
適切な代謝可能な油はスクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）であり、これは、サメ肝臓油において大量に存在し、オリーブ油、小麦胚芽油、ぬか油および酵母においては低量で存在する不飽和油である。スクアレンがコレステロールの生合成における中間体であるという事実によって、スクアレンは代謝可能な油である。好ましくは、代謝可能な油は、免疫原性組成物の全容積の０．５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量で存在する。
【００３３】
水中油型エマルジョンアジュバントは、乳化剤をさらに含む。乳化剤は、好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））であってもよい。乳化剤は、好ましくは、免疫原性組成物の全容積の０．１２５〜４％（ｖ／ｖ）の量で、アジュバント組成物中に存在する。
【００３４】
本発明の水中油型エマルジョンは、任意でさらにトコール（ｔｏｃｏｌ）を含む。トコールは当分野で周知であり、欧州特許第０３８２２７１号に記載されている。適切なトコールは、α−トコフェロールまたは（ビタミンＥコハク酸エステルとしても知られる）α−トコフェロールコハク酸エステルなどのα−トコフェロールの誘導体である。トコールは、好ましくは、免疫原性組成物の全容積の０．２５％〜１０％（ｖ／ｖ）の量で、アジュバント組成物中に存在する。
【００３５】
水中油型エマルジョンにおいて、油と乳化剤は、水性担体の中に存在するべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。
【００３６】
本発明の一実施形態において、水中油型エマルジョンアジュバントには、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））およびα−トコフェロールが含まれる。一般的に、水中油型エマルジョンアジュバントは、免疫原性組成物の全容積のうちスクアレン２〜１０％、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート０．３〜３％、およびα−トコフェロール２〜１０％を含み、国際特許公開第９５／１７２１０号に記載の手順に従って製造されてもよい。スクアレン：α−トコフェロールの比は、それがより安定なエマルジョンを提供するように、１以下であってもよい。水中油型エマルジョンには、例えば、免疫原性組成物の全容積の１％のレベルで、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）および／またはレシチンが含まれてもよい。
【００３７】
水中油型エマルジョンの製造方法は当業者に周知である。一般に、この方法は、（任意でトコールを含む）油相をＰＢＳ/ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、ホモジナイザーを用いて均質化するステップを含む。この混合物を、注射針に２回通過させるステップを含む方法は、少量の液体を均質化するのに適する。同様に、当業者が、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（Ｍ１１０Ｓマイクロ流体機、最大入力圧力６バール（約８５０バールの出力圧力）において２分間、最大５０回通過）を用いた乳化工程を行い、少量または大量のエマルジョンを製造することができる。必要とされる直径の油滴を有する調製品ができるまで、生じるエマルジョンの測定を含む通常の実験によって、この作業を行うことができる。
【００３８】
本発明の水中油型エマルジョン系は、サブミクロン範囲の小さな油滴サイズを有してもよい。好ましくは、油滴サイズは、直径が、１２０〜７５０ｎｍの範囲、例えば、１２０〜６００ｎｍのサイズである。水中油型エマルジョンは、強度（intensity）に基づいて少なくとも７０％が５００ｎｍ未満の直径である、強度に基づいて少なくとも８０％が３００ｎｍ未満の直径である、または強度に基づいて少なくとも９０％が１２０〜２００ｎｍの範囲の直径である油滴を含んでもよい。
【００３９】
本発明によると、油滴サイズ（すなわち、直径）は強度で与えられる。強度に基づく油滴サイズの直径の測定には、数種類の方法がある。強度を、定寸装置を用いて、好ましくは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４０００またはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳなどの動的光散乱法によって測定する。第１に考えられる方法は、動的光散乱法（ＰＣＳ−光子相関分光法）によるｚ平均直径ＺＡＤを測定することである；この方法は、多分散性指数（ＰＤＩ）をさらに与え、ＺＡＤおよびＰＤＩの両方を、キュムラントアルゴリズムを用いて計算する。これらの値は、粒子屈折率の知識を必要としない。第２の手段では、ＣｏｎｔｉｎもしくはＮＮＬＳのいずれかの別のアルゴリズム、または自動「Ｍａｌｖｅｒｎ」アルゴリズム（定寸装置によってもたらされるデフォルトアルゴリズム）を用いて、全粒径分布を測定することにより、油滴の直径を計算する。ほとんど常に、複合組成物の粒子屈折率は分からないので、強度分布のみ、必要であれば、この分布から得られる強度平均値を考慮に入れる。
【００４０】
ワクチンの製剤化および投与
各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質量は、標準的なワクチンにおいて重度の、有害な副作用のない、免疫防御反応を誘導する量として選択する。かかる量は、使用する特定の免疫原ならびに用いるアジュバントの種類および量に応じて変化する。特定のワクチンの最適量を、対象における抗体力価および他の反応の観察を含む標準試験によって確かめてもよい。一般に、各用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、例えば、１〜２００μｇ、または１０〜１００μｇを含むことが期待される。一般的な用量は、１０〜５０μｇのタンパク質、例えば、１５〜２５μｇのタンパク質、好ましくは、約２０μｇのタンパク質を含む。あるいは、例えば、大流行の状況では、「用量−節約」法を用いてもよい。これは、効果的なアジュバントの存在により、低用量の抗原を用いて同じ防御作用をもたらすことが可能であるという研究結果に基づく。従って、各ヒト用量は、非常に低い量のタンパク質、例えば、１用量につき０．１〜１０μｇのタンパク質、または０．５〜５μｇのタンパク質、または１〜３μｇのタンパク質、好ましくは２μｇのタンパク質を含んでもよい。「ヒト用量」という用語は、ヒトへの使用に適する量である用量を意味する。一般的に、これは０．３〜１．５ｍｌである。一実施形態において、ヒト用量は０．５ｍｌである。
【００４１】
最初のワクチン接種後、一般的に、対象は、２〜４週間の間隔をあけて、例えば、３週間の間隔をあけて、追加免疫を受け、感染のリスクが存在する限り、任意で、追加免疫を繰り返し受ける。本発明の具体的な実施形態において、単回投与ワクチン接種が計画され、それによって、アジュバントと組み合わせたＳタンパク質の１用量は、最初のワクチン接種後にいかなる追加免疫をも必要とせず、ＳＡＲＳ ＣｏＶに対する防御をもたらすのに十分である。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物は、経口経路、局所経路、皮下経路、粘膜（一般的に、膣内）経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、舌下経路、皮内経路などの任意の様々な経路および坐薬によってもたらされてもよい。
【００４３】
免疫付与は、予防的または治療的であり得る。本明細書記載の本発明は、主に、ＳＡＲＳに対する予防ワクチンに関係するが、それに限らない。
【００４４】
本発明で使用する適切な医薬的に許容可能な担体または賦形剤は、当分野で周知であり、例えば、水または緩衝液を含む。ワクチン調製は、一般に、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｖｏｌ.６１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ,ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ,Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９９５. Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ,ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ,Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ,Ｍａｒｙｌａｎｄ,Ｕ.Ｓ.Ａ.１９７８に記載されている。
【００４５】
本発明の免疫原性組成物は、上記で明らかにされた特定の成分を含む。本発明のさらなる態様において、免疫原性組成物は、前記成分から本質的になる、または前記成分からなる。
【００４６】
本発明を説明するのに役立つ以下の実施例に関して、本発明をこれから記載する。
【実施例１】
【００４７】
可溶型ＳＡＲＳ ＣｏＶ−Ｓタンパク質の発現
哺乳類細胞のＳタンパク質の細胞外ドメインを精製するために、細胞質内ドメインおよび膜貫通ドメインを除去したスパイク糖タンパク質を発現することができる遺伝子を構築した。このポリペプチドをＳｓｏｌと呼び、Ｓタンパク質の細胞外ドメイン全体（１〜１１９３番目のアミノ酸）を含む。Ｃ末端にはセリン−グリシンリンカーおよびオクタペプチドＦＬＡＧを結合させた。膜アンカードメインを除去したので、このＳｓｏｌポリペプチドは培地中に分泌される。
【００４８】
Ｓｓｏｌポリペプチドの構成的発現
ＴＲＩＰレンチウイルスベクターを用いて、安定で、構成的な方法で、Ｓｓｏｌタンパク質を発現する細胞株を樹立した。これらのベクターを、ｐＴＲＩＰプラスミドベクター、ｐ８．７パッケージングプラスミドおよびｐＨＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇプラスミドの共トランスフェクションにより産生する（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ.,１９９４；Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ.,２０００；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ.,１９９７）。
【００４９】
Ｓｓｏｌタンパク質発現のためのＴＲＩＰベクターを構築するために、ＣＭＶｉ/ｅプロモーター、ｐＣＩプラスミドのキメライントロン、ＳｓｏｌのＯＲＦおよび２つのウイルス排出エレメントＣＴＥまたはＷＰＲＥのうちの１つを含む発現カセットを、ＥＦ１プロモーターおよびＧＦＰのＯＲＦの代わりに、ｐＴＲＩＰ−ＥＦ１−ＥＧＦＰプラスミドに移した。このように、産生したこれらのプラスミドをｐＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥおよびｐＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＷＰＲＥと呼び、これらを用いて、それぞれ、ＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥおよびＴＲＩＰ−Ｓｓｏｌ−ＷＰＲＥのレンチウイルスべクターストックを作った。これらのベクターを用いて、２４時間の間隔をあけた、一連の５回の連続形質導入サイクルに従って、ＦＲｈＫ−４細胞に形質導入した。形質導入した細胞を、限界希釈法によりクローン化し、得られたこれらの細胞クローンを、Ｓｓｏｌポリペプチドの顕著な分泌に応じて選択した。これを行うために、様々なクローンの固定数の細胞を３５ｍｍ培養皿に蒔き、７２時間後に、上清におけるＳｓｏｌタンパク質の存在を、ウエスタンブロットにより解析した。
【００５０】
期待されるサイズ（約１８０ｋＤａ）のタンパク質を、全クローンの上清において検出し、形質導入手順の効率を確認した。しかし、Ｓｓｏｌタンパク質を産生するために用いたＴＲＩＰベクターとは無関係に、発現レベルがクローンごとに異なった。ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３細胞クローンが、培養７２時間後に回収した上清において、最高濃度のＳｓｏｌタンパク質を得ることを可能にした。このクローンを、第２の一連の５回の形質導入サイクルにかけ、第２世代のクローンを得るために選択工程を繰り返した。最も産生力のある第２世代のクローン（ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０）を増幅して使用し、大量の上清を産生した。その後、様々な（濃度）範囲の精製Ｓｓｏｌをタンパク質マーカーとして用いる捕捉ＥＬＩＳＡ試験を用いて、Ｓｓｏｌタンパク質が、５〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０クローンの上清に分泌されることを判断することができた。Ｓｓｏｌタンパク質を産生する最適条件を、実験的に、細胞密度パラメーター、血清濃度、培養温度および分泌継続時間を検討して決定した。
【００５１】
組換えＳｓｏｌタンパク質の産生および精製
Ｓｓｏｌタンパク質の大規模産生について、ＦＲｈＫ−４−Ｓｓｏｌ−ＣＴＥ＃３０クローンの１．５〜２．１０８のサブコンフルエントな細胞のロットを、０．５％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭに基づく１リットルの培地の中で、３５℃で、４日間培養した。分泌されたＳｓｏｌタンパク質を含む上清を、限外濾過装置により濃縮し、抗ＦＬＡＧ抗体カラムの親和性クロマトグラフィにより精製した。カラムに固定した物質を、非変性条件下で、ＦＬＡＧペプチドとの競合により溶出し、その後、ゲル濾過により分離し、ＦＬＡＧペプチドおよび低分子量混入物を除去した。
【００５２】
精製物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硝酸銀染色で解析した。Ｓｓｏｌポリペプチドの期待されるサイズ（１８０〜２００ｋＤａ）を有する、糖タンパク質に特徴的な、強く拡散したバンドが現れた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、Ｓタンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析により、この精製タンパク質がＳタンパク質の細胞外ドメインと明確に一致することを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｒｕｂｙ ＳＹＰＲＯ染色後に、この精製タンパク質の精製度を調べた。蛍光シグナルの定量化は、ゲル濾過から溶出したタンパク質の９０％以上が、Ｓｓｏｌタンパク質に由来することを示した。次に、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）を用いて、キットの助けをかりて、この精製Ｓｓｏｌタンパク質を定量化した。３つの独立した産生の解析後、１リットルの培養上清につき１．３〜２．５ｍｇのＳｓｏｌタンパク質を得ることができた。全段階（濃縮、親和性精製およびゲル濾過）を含めて、全精製収率は、２６〜５３％の範囲である。その後、精製Ｓｓｏｌタンパク質を、Ｎ末端配列解析、質量分析および分析用超遠心分離によりさらに特徴づけた。その結果、精製Ｓｓｏｌタンパク質は、シグナルペプチド（１〜１３番目のアミノ酸）は欠損しているが、Ｓタンパク質の細胞外ドメイン全体と一致する１８２ｋＤａの可溶性単量体であると結論づけた。
【００５３】
水中油型アジュバントの調製
後の実施例で用いる水中油型エマルジョンは、２種類の油（α−トコフェロールおよびスクアレン）で作られる有機相、ならびに、乳化剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の水相でできている。特に記載されない限り、後の実施例で用いる水中油型エマルジョンアジュバント製剤を、以下の水中油型エマルジョン成分（最終濃度）を含むように作った：２．５％スクアレン（ｖ／ｖ）、２．５％α−トコフェロール（ｖ／ｖ）、０．９％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｖ／ｖ）、国際特許公開第９５／１７２１０号参照。このエマルジョンを、後の実施例でＧＳＫ２と名付け、以下のように２倍濃縮物として調製した。
【００５４】
エマルジョンは、疎水性成分（α−トコフェロールおよびスクアレン）を含む油相と、水溶性成分（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよびＰＢＳｍｏｄ（改良型）、ｐＨ６．８）を含む水相とを、強く撹拌しながら混合して作製する。撹拌の間、油相（全容積の１／１０）を水相（全容積の９／１０）に移行させ、この混合物を、１５分間、常温で撹拌する。その後、生じた混合物を、マイクロフルイダイザー（１５０００ ＰＳＩ−８サイクル）の相互作用チャンバー内で、せん断力、衝撃力およびキャビテーション力にかけることにより、サブミクロンの油滴（１００〜２００ｎｍの間に分布）を作製する。生じたｐＨは、６．８±０．１の間である。その後、このエマルジョンを、０．２２μｍの膜に通す濾過により滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを、Ｃｕｐａｃ容器の中で、２〜８℃で冷蔵保存する。滅菌不活性ガス（窒素またはアルゴン）を、少なくとも１５秒間、エマルジョン最終バルク容器の死容積に勢いよく流し入れる。
【００５５】
マウスモデルにおけるアジュバントワクチン試験
アジュバントなしで、または５０μｇのミョウバンもしくは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと共に、２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、若い成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループにつき８匹）の筋肉組織に、３週間の間隔をあけて２回注射した。これらのアジュバントの用量は、従来、小型げっ歯類に対して使用された量であり、ヒト医学において使用される用量の１／１０に相当する。２グループのマウスがこの研究の対照として関係し、各々、アジュバントの一方のみで免疫した。これらのマウスの血清を、各注射の３週間後に採取し、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡ、血清中和解析およびアイソタイプ解析により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの特異的体液性反応を調べた。
【００５６】
ＥＬＩＳＡ（図１）により、対照グループの血清の抗体力価は、常に、検出限界以下（１．７ｌｏｇ１０）であった。１回のみの注射後、アジュバントなしでまたはミョウバンアジュバントと共にタンパク質によって誘導した抗体反応は弱く（それぞれの平均力価は、１．９±０．２ｌｏｇ１０および２．１±０．３ｌｏｇ１０）、以前に得られた結果を裏付けた。逆に、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）とタンパク質により誘導した抗体力価は、最初の注射から非常に高くなる（３．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。２回の注射後、タンパク質で免疫した全グループにおける力価の顕著な増加が観察される。最も弱い反応で最も異種的な反応が、アジュバントを用いなかった時に観察される（３．９±０．５ｌｏｇ１０の平均力価）。ミョウバンを免疫原調製品に加えると、抗体反応を改善することができる（４．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．０１）。最初の注射後に観察された結果によると、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）は、２回の注射後にＳｓｏｌタンパク質の免疫原性を顕著に改善し、得られた抗体力価（５．２±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）は、ミョウバンアジュバントとタンパク質によって誘導された力価よりも有意に高い（ｐ＜１０‐４）。
【００５７】
様々な免疫原による体液性反応の質を、２回目の注射の３週間後に採取した血清を用いて調べた。中和抗体力価（図２）は、ＥＬＩＳＡによる解析の時に観察された階層に従う。アジュバントなしでタンパク質を用いた時に、最も弱い力価が得られる（２．３±０．４ｌｏｇ１０の平均力価）。中和反応は、ミョウバンを加えることによって有意に改善する（３．１±０．３ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０，００１）。同様に、タンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、非常に高い中和抗体力価を得ることができ（３．７±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）、ミョウバンアジュバントとタンパク質によって誘導される力価より有意に４倍高い（ｐ＜０．００２）。
【００５８】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗原に対する特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのアイソタイプ力価を、最後の注射の３週間後に採取した血清において、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡにより、各グループについて調べた（図３）。アジュバントのないタンパク質での免疫またはミョウバンアジュバントとタンパク質での免疫は、ほぼ全くＩｇＧ１のみ誘導する。Ｓｓｏｌタンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、ミョウバンが存在する時よりもさらに高いＩｇＧ１力価（平均力価５．４±０．２ｌｏｇ１０）を誘導することができ、ＩｇＧ２ａ力価も高レベルになる（平均力価２．１±０．６に対して２．８±０．７；ｐ＜０．０５）。ＩｇＧ２ａに対するＩｇＧ１の平均比は、ＧＳＫ２アジュバントの存在下で８４０であり、ミョウバンの存在下で１６００を超える。これらの結果は、アジュバントなしでまたはミョウバンと共にタンパク質によって誘導される免疫反応が、主に２型であることを示す。Ｓｓｏｌタンパク質に水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えると、ＴＨ−２型免疫反応が有利に働くが、弱くはあるが異種のＴＨ−１型免疫反応も誘導できる。
【実施例２】
【００５９】
ハムスターモデルにおけるアジュバントワクチン試験
５０μｇのミョウバンまたは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと共に、２μｇまたは０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、シリアゴールデンハムスター（１グループにつき６匹）の筋肉組織に、３週間の間隔をあけて２回注射した。これらのアジュバントの用量は、従来、小型げっ歯類に対して使用され、ヒト医学において使用される用量の１／１０に相当する。２グループのハムスターがこの実験の対照として関係し、各々、アジュバントの一方のみで免疫した。ＳＡＲＳに対する有望なワクチンを構成する、５０μｇのミョウバンと２μｇ（Ｓと同等）の精製した、β−プロピオラクトン不活性化ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス粒子（ＢＰＬ−ＳＣｏＶ）を、別のグループのハムスターに注射した。これらのハムスターの血清を、各注射の３週間後（それぞれ、ＩＳ１およびＩＳ２）および２回目の注射の３ヶ月後（ＩＳ２ｂｉｓ）に採取し、抗ＳＡＲＳ ＥＬＩＳＡおよび血清中和解析により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの特異的体液性反応を調べた。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ（図４）により、対照グループの血清の抗体力価は、常に、検出限界以下（１．７ｌｏｇ１０）であった。２μｇのＳｓｏｌ用量において、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）は、１回（ＩＳ１）および２回（ＩＳ２）の注射後に、Ｓｓｏｌタンパク質の免疫原性を顕著に改善し、得られた抗体力価（４．２±０．３ｌｏｇ１０および５．０±０．１ｌｏｇ１０の平均力価）は、ミョウバンアジュバントとタンパク質により誘導された力価よりも、それぞれ０．６ｌｏｇ１０および０．７ｌｏｇ１０高い（ｐ＜１０‐３）。
【００６１】
０．２μｇのＳｓｏｌの１回のみの注射後、ミョウバンアジュバントを用いた時に観察された反応は弱く、検出限界に近い（１．８±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。逆に、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）とタンパク質によって誘導される抗体力価は、最初の注射から高くなり（３．９±０．５ｌｏｇ１０の平均力価）、ミョウバン存在下の２μｇのＳｓｏｌの単回注射後に達した力価より、より異種的ではあるが高いレベルに達する。２回の注射後、タンパク質で免疫した両グループの力価の顕著な増加が観察される。最も弱い反応であり最も異種的な反応が、ミョウバンアジュバントを用いた時に観察される（２．６±０．７ｌｏｇ１０の平均力価）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を免疫原調製品に加えると、抗体反応を強力に改善させることができる（４．８±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜１０‐４）。
【００６２】
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と０．２μｇおよび２μｇのＳｓｏｌの２回目の注射後、全免疫ハムスターにおいて、比較的高い力価反応が得られた（５．０±０．１ｌｏｇ１０に対する４．８±０．２ｌｏｇ１０力価）。これは、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いると、ＳＡＲＳに対する用量−節約ワクチン戦略が可能になることを示す。
【００６３】
０．２μｇのＳｓｏｌまたは２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される体液性免疫反応の質を、２回目の注射の３ヶ月後に採取した血清を用いて試験した。中和抗体力価（図５）は、ＥＬＩＳＡによる解析の時に観察された階層に従う。ミョウバンとタンパク質を用いて得られた力価は、検出限界以下であった（１．３ｌｏｇ１０）。中和反応は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を加えることによって非常に改善する（２．７±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜１０‐７）。この反応は、２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される反応と明確に同じであった（２．５±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）。
【００６４】
Ｓｓｏｌ免疫ハムスターの抗原投与感染（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）
免疫３か月後に、選択したグループのハムスターに、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶを鼻腔内接種により抗原投与し、４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図６）および上気道（ＵＲＴ）、すなわち咽頭と気管（図７）において、ウイルス量の値を調べた。各模擬ワクチン接種動物の肺において、ウイルスの強力な一貫した複製が観察された（７．５±０．１ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。さらに、模擬ワクチン接種ハムスターの上気道において、ウイルス複製が示された（５．０±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物の肺（４．１±１．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ）およびＵＲＴ（２．５±０．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ）の両方において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ量を検出できた。明確な対照として、この動物モデルにおける強力なウイルス複製にも関わらず、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／臓器＜２．１）。Ｓｓｏｌとミョウバンで免疫したハムスターと比較して、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したハムスターの肺におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ複製の減少が１０２倍を上回るという証拠を、これらのデータは示す。Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で達成されたこの高レベルの防御は、不活化ウイルス粒子とミョウバンで免疫したハムスターにおいて観察されたレベルに匹敵する。
【００６５】
興味深いことに、抗原投与時、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌによる単回投与は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と０．２μｇのＳｓｏｌによる２回投与（４．４±０．１ｌｏｇ１０ ｐｆｕ）と同じくらい高い抗ＳＡＲＳ抗体のＥＬＩＳＡ力価（４．２±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕ）を誘導した（図４）。この後者のワクチン接種計画が、ＳＡＲＳ抗原投与に対して免疫ハムスターを保護する（図６および図７）という事実を考慮すると、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌによる単回投与も、防御反応を誘導すると予想することができる。これは、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いると、ＳＡＲＳに対する単回投与ワクチン戦略が可能になることを示す。
【００６６】
抗原投与ハムスターの肺の病理組織学的解析
抗原投与後、０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学解析を行った。図８は、肺の炎症および病変（ＨＥ）のスコアならびにウイルス抗原量（ＩＨＣ）のスコアを、１〜１０の目盛りで示す。模擬ワクチン投与動物では、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察された（スコア＝３．１±０．６）。従って、ウイルス抗原を、これらの肺胞炎の病巣の中、ならびに気管および気管支肺胞の上皮にも検出した（スコア＝３．９±０．４）。損傷のスコア（２．６±１．０）およびウイルス抗原量（３．３±１．２）の双方は、ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物の肺においても高かった。明確な対照として、上気道（咽頭−気管、データ示さず）および肺（図８）の気道部分の大規模ＩＨＣスクリーニングにもかかわらず、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のワクチン接種ハムスターにおいて、肺における肺胞炎または肺炎の特異的損傷は検出されず（スコア＝０．５±０．０）、ウイルス抗原はいずれの動物においても検出されなかった。
【００６７】
これらのデータは、上気道および下気道における検出可能なウイルス抗原がないこと、ならびに肺炎がないことによって示されるように、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でワクチン接種したハムスターは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗原投与から完全に保護されることを裏付ける。
【００６８】
Ｓｓｏｌ免疫ハムスターの抗原投与感染の長期防御
２μｇのＳｓｏｌで２回免疫したハムスターのグループに対して、長期防御を試験した。２回目の注射の８カ月後、ミョウバン添加（平均力価１．８±０．４ｌｏｇ１０）と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により、中和抗体反応は改善された（２．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．００５）（図２１）。この反応は、２μｇ（Ｓと同等）の不活化ウイルス粒子によって誘導される反応（２．６±０．２ｌｏｇ１０の平均力価）と明らかに類似していた。
【００６９】
その後、これらのハムスターに、１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶを鼻腔内接種によって抗原投与し、４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図２２）および上気道（ＵＲＴ）（図２３）において、ウイルス量の値を調べた。上記の結果と一致して、模擬ワクチン接種動物の肺およびＵＲＴの両方において、ウイルスの強力な複製が観察された（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、７．７±０．２ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび５．１±０．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ量は、５匹中２匹の肺およびＵＲＴの両方において検出でき、高いウイルス量（４．８ｌｏｇ１０ｐｆｕ）が１匹の動物のＵＲＴにおいて観察された。明確な対照として、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／臓器＜２．１）。Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で達成されたこの高レベルの防御は、不活化ウイルス粒子とミョウバンで免疫したハムスターにおいて観察されたレベルに匹敵する。
【００７０】
さらに、抗原投与および安楽死後、これらのハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行った（図２４）。上記のように、模擬ワクチン投与動物において、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察され（スコア＝５．４±０．９）、ウイルス抗原が検出された（スコア５．１±０．４）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と２μｇのＳｓｏｌでワクチン接種した動物の肺において、損傷のスコアは有意に減少し（０．９±０．５、ｐ＜１０‐４）、ウイルス抗原量は検出されなかったが、ミョウバンと２μｇのＳｓｏｌで免疫した動物においては、損傷スコアの中程度の減少が観察され（スコア＝２．６±０．８）、ウイルス抗原は５匹中２匹において検出可能であった（スコア＝０．５±０．６）。
【００７１】
結局、これらのデータは、Ｓｓｏｌタンパク質と水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）による長期防御の可能性の証拠を示す。
【００７２】
Ｓｓｏｌの単回投与を用いた抗原投与感染からのハムスターの防御
５０μｇのミョウバンまたは５０μＬの水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）のいずれかと０．２μｇの用量のＳｓｏｌを筋肉組織に注射して、Ｓｓｏｌの単回投与による免疫後の防御を試験した。注射２週間後、ＥＬＩＳＡ抗体反応（図２５）は、ミョウバンの添加（平均力価２.０±０．４ｌｏｇ１０）と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により非常に改善した（平均ＥＬＩＳＡ力価３．３±０．３ｌｏｇ１０；ｐ＜０．００１）。中和抗体力価（図２６）は、ＥＬＩＳＡ解析によって観察された階層に従う。ミョウバンとタンパク質を用いて得られた力価は、各動物について、検出限界以下（１．３ｌｏｇ１０）であった。中和反応は、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の添加により改善し、免疫ハムスターの６匹中３匹が、検出可能な抗体反応を示した（１．５±０．３ｌｏｇ１０の平均力価；ｐ＜０．１）。
【００７３】
免疫の３週間後に、これらのハムスターに１０５ｐｆｕのＳＡＲＳ−ＣｏＶの鼻腔内接種によって抗原投与し、その４日後に安楽死させ、ウイルス複製を調べた。各動物の肺（図２７）および上気道（ＵＲＴ）（図２８）において、ウイルス量の値を調べた。上記の結果と一致して、模擬ワクチン接種動物の肺およびＵＲＴの両方において、ウイルスの強力な複製が観察された（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、７．３±０．３ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび４．８±０．５ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した後、中程度〜高いＳＡＲＳ−ＣｏＶ量が、６匹中５匹の肺およびＵＲＴの両方において検出可能であった（肺およびＵＲＴにおいて、それぞれ、４．９±１．８ｌｏｇ１０ｐｆｕおよび３．０±１．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ）。明確な対照として、Ｓｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）で免疫したいずれのハムスターにおいても、感染性ウイルスは検出できなかった（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／肺＜２．１およびｌｏｇ１０ｐｆｕ／ＵＲＴ＜１．８）。
【００７４】
さらに、抗原投与ならびに安楽死後、これらのハムスターの肺に対して、ヘマルン−エオシン染色（ＨＥ）を用いる病理組織学検査および抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を行った（図２９）。上記のように、模擬ワクチン投与動物において、急性ウイルス性肺炎の特徴的病変として、滲出性肺胞炎のびまん性病変、肺実質のびまん性凝縮およびびまん性肺胞損傷が観察され（スコア＝１．９±０．３）、ウイルス抗原が検出された（スコア２．４±０．３）。０．２μｇのＳｓｏｌと水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でワクチン接種した動物の肺において、損傷のスコアは有意に減少し（１．０±０．０、ｐ＜１０‐４）、ウイルス抗原量は検出されなかったが、ミョウバンと０．２μｇのＳｓｏｌでワクチン接種した動物において、損傷のスコアの減少は観察されず（スコア＝２．２±０．９）、ウイルス抗原は６匹の各々において検出可能であった（スコア＝２．６±０．８）。
【００７５】
結局、これらのデータは、Ｓｓｏｌタンパク質および水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の単回低用量注射によって誘導される高レベルの防御の可能性の証拠を示す。
【実施例３】
【００７６】
Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する体液性免疫反応
６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスをオランダのＨａｒｌａｎ社から入手した。０日および２１日目に、アジュバントなしで（「ｐｌａｉｎ」）、５０μｇのミョウバンでアジュバント化した、または水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）と共に、２、０．２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質を、マウス（１グループにつき２３匹）に筋肉内注射した。追加の３グループのマウスを対照として含め、各々、ＰＢＳ、ミョウバンまたはＧＳＫ２アジュバント単独で免疫した。
【００７７】
非アジュバント化Ｓｓｏｌ抗原の調製
以下の順番に従って、製剤を用時調製した：注射用の水にＳｓｏｌ抗原を加え（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、常温で５分間、軌道振盪台上で混合し、（最終濃度が１５０ｍＭに達するように）１５００ｍＭのＮａＣｌを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。製剤化の終了後１時間以内に注射を行った。
【００７８】
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌの調製
以下の順番に従って、ワクチン調製品を作製した：注射用の水に水酸化アルミニウムを加え（１０００μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように）Ｓｓｏｌ抗原を加え、常温で３０分間、軌道振盪台上で混合し、（最終濃度が１５０ｍＭに達するように）１５００ｍＭのＮａＣｌを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。このワクチンを、最初の試験の第１の免疫の６日前に調製し、注射まで４℃で保存した。
【００７９】
ＧＳＫ２ａｄｊアジュバント化Ｓｓｏｌの調製
以下の順番に従って、製剤を用時調製した：注射用の水に１０倍濃縮のリン酸緩衝生理食塩水を加え、Ｓｓｏｌ抗原を加え（４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの最終濃度に達するように量を加える）、常温で５分間、軌道振盪台上で混合し、２倍濃縮のＧＳＫ２アジュバントを加え、常温で５分間、軌道振盪台上で混合する。製剤化の終了後２時間以内に注射を行った。
【００８０】
体液性反応の解析
免疫１４日後（３５日の時点）にそれぞれのマウス（１グループ８匹）の血液試料から調製した血清において、体液性反応を調べた。抗原としてＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染させたＶｅｒｏＥ６細胞または陰性対照として感染させていないＶｅｒｏＥ６細胞の溶解物を用いた間接ＥＬＩＳＡ法により、抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的抗体の存在の検出およびアイソタイプ解析を行った。ペルオキシダーゼに結合させたポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＮＡ９３１Ｖ,Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、続いて、ＴＭＢおよびＨ２Ｏ２（ＫＰＬ）を加えて明らかにした後、ＯＤ０．５を与える血清の希釈の逆数として、力価を計算した。アイソタイプの解析のために、マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体に特異的なポリクローナル血清を用いた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【００８１】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体
用量依存的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体反応が、アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下でＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された（図９）。非アジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、アジュバントの存在下、Ｓｓｏｌで免疫したマウスにおいて、抗体反応が有意に高いことが判明した。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、この反応は有意に高かった（ｐ＜１０‐４）；水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下で最も低用量のＳｓｏｌ（０．０２μｇ）で誘導された抗体力価は、ミョウバンの存在下で最も高い用量のＳｓｏｌ（２μｇ）で誘導された抗体力価より優れていることが判明した（ｐ＝０．０８）。
【００８２】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体のアイソタイプ解析
２μｇの用量のＳｓｏｌで免疫した「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、および水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したグループ（１グループ８匹）から調製した血清において、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のアイソタイプ解析をＥＬＩＳＡにより行った。結果を図１０に示す。
【００８３】
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質のいずれかで免疫したマウスにおいて、この反応は、ＩｇＧ１アイソタイプに強く傾いていることが判明し、一方で非常に低レベルのＩｇＧ２ａ抗体が検出された。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいては、高い力価（５．３±０．１ｌｏｇ１０力価）のＩｇＧ１抗体が得られた。興味深いことに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＩｇＧ２ａ抗体の力価（４．０±０．８ｌｏｇ１０力価）は、１匹を除いて有意に増加した（ｐ＜１０‐５）。
【００８４】
中和抗体
１ウェルにつき１００ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ−ＣｏＶを用いて、ＦＲｈＫ−４細胞における標準的な血清中和アッセイにより、中和抗体の存在を調べた。熱で不活化した（５６℃、３０分間）血清の、１：２０の希釈からの２倍の段階希釈物を用いて、二重に（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）試験した。ＲｅｅｄおよびＭｕｎｓｃｈ（Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ １９３８：２７：４９３−９７）の方法に従って、ウェルの５０％（４ウェルのうち２ウェル）のウイルス感染力を中和する希釈の逆数として、中和力価を決定した。
【００８５】
アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、０．２μｇのＳｓｏｌで免疫した個々のマウス（１グループにつき８匹）の免疫１４日後に調製した血清を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを中和する抗体の存在について解析した。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、０．５μｇのＳタンパク質と同等の用量の不活化した全ウイルス調製品で免疫したマウスの血清を比較のために含めた。結果を図１１に示す。
【００８６】
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和抗体力価（３．４±０．１ｌｏｇ１０力価）は、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスの力価（２．８±０．３ｌｏｇ１０力価、ｐ＜０．００１）よりも０．６ｌｏｇ１０高かったが、非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和力価は、８匹中６匹について検出できなかった（＜１．３ｌｏｇ１０）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下、中和抗体力価は、０．５μｇのＳと同等の全ウイルス抗原（３．６±０．２ｌｏｇ１０力価）と比べて、０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で同程度だった。
【００８７】
Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する細胞性免疫反応
ＢＡＬＢ／ｃマウスの「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、およびＧＳＫ２ａｄｊアジュバント化グループの細胞性免疫反応を、以下の表Ａにまとめたように調べた。
【表１】
【００８８】
１グループにつき１５匹のマウスのＰＢＭＣおよび脾臓において、細胞性反応を測定した。免疫７日後にＰＢＭＣを採取し、免疫１４日後に脾臓を摘出した。３匹のマウスの５つのプールにおいてＰＢＭＣを調べ、１グループにつき２匹のマウスの４つのプールにおいて脾臓を調べた。
【００８９】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
溶解緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた赤血球細胞の溶解後、ＰＢＭＣのインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて、最終濃度１０７細胞／ｍｌ（９６ウェルマイクロプレート）で行い、その後、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（共に１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。抗原再刺激ステップの後、ブレフェルジン（１μｇ／ｍｌ）の存在下、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、サイトカイン分泌を阻害した。
【００９０】
脾臓をマウスから摘出し、ＲＰＭＩ＋Ａｄｄ培地に貯蔵した（２匹／１グループの４つのプール）。ＲＰＭＩ＋Ａｄｄで希釈したＰＢＬ懸濁液を、５％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ中で１０７細胞／ｍｌに調整した。脾臓細胞のインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて行い、その後、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（共に１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で２時間インキュベートした。抗原再刺激ステップの後、ブレフェルジン（１μｇ／ｍｌ）の存在下、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、サイトカイン分泌を阻害した。
【００９１】
４℃で一晩保存した後、細胞染色を以下のとおりに行った：細胞懸濁液を洗浄し、２％Ｆｃブロッキング試薬（１／５０；２．４Ｇ２）を含む５０μｌのＰＢＳ１％ＦＣＳに再懸濁した。４℃での１０分間のインキュベーション後、抗ＣＤ４−ＰＥ（１／５０）と抗ＣＤ８ａ ｐｅｒＣｐ（１／５０）の５０μｌの混合物を加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ１％ＦＣＳで洗浄した後、２００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｋｉｔ ＢＤ）に再懸濁することにより細胞を透過処理し、４℃で２０分間インキュベートした。
【００９２】
その後、細胞をＰｅｒｍ Ｗａｓｈ（Ｋｉｔ ＢＤ）で洗浄し、Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈで希釈した５０μｌの抗ＩＦＮγ−ＡＰＣ（１／５０）＋抗ＩＬ−２ＦＩＴＣ（１／５０）で再懸濁した。４℃での２時間のインキュベーション後、細胞をＰｅｒｍ Ｗａｓｈで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを加えたＰＢＳ１％ＦＣＳに再懸濁した。試料の解析をＦＡＣＳにより行った。生きている細胞をゲーティングし（ＦＳＣ／ＳＳＣ）、約２０，０００イベント（リンパ球ＣＤ４）について（データ）取得を行った。ＣＤ４＋のゲート集団におけるＩＦＮγ＋またはＩＬ２＋のパーセンテージを計算した。
【００９３】
サイトカイン分泌（ＣＢＡ）量
再刺激の上清のサイトカイン量も、免疫１４日後の脾臓のＰＢＭＣにおいて計算した。脾臓をマウスから摘出し、ＲＰＭＩ＋Ａｄｄ培地に貯蔵した（２匹／１グループの４つのプール）。ＰＢＭＣ懸濁液を、５％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ中で１０７細胞／ｍｌに調整した。ＰＢＭＣのインビトロ抗原刺激を、最終濃度１μｇ／ｍｌのＳｓｏｌを用いて行い、その後、３７℃で７２時間インキュベートした。上清を回収し、ＩＦＮγ、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の検出のためのＣＢＡ（サイトカインビーズアッセイ）−ｆｌｅｘ（ＢＤ ｋｉｔ）による試験まで−７０℃で保存した。
【００９４】
異なる蛍光強度を有するビーズ集団を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１３タンパク質に特異的な捕捉抗体でコーティングした。ビーズ集団を混合し、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を形成させ、ＢＤ社のＦＡＣＳ（商標）フローサイトメーターのＦＬ３チャネルで解像した。サイトカイン捕捉ビーズをＰＥ結合検出抗体と混合し、その後、組換え標準物質または試験試料とインキュベートし、サンドイッチ複合体を形成させた。フローサイトメーターを用いて試料データを取得後、試料の結果のグラフおよび表を作成した。
【００９５】
マウスサイトカイン標準物質を再構成し、アッセイ希釈剤を用いて段階希釈により希釈した。マウスサイトカイン捕捉ビーズ懸濁液を貯蔵、混合し、各アッセイ試験管に移した（５０μｌ／試験管）。標準希釈物および試験試料を適切な試料用試験管に加え（５０μｌ／試験管）、５０μｌのＰＥ検出試薬を加えた。全試料および標準物質を、常温で２時間、暗室の中でインキュベートした。インキュベーション後、全反応試験管を、１ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、２００×ｇで、５分間、遠心分離した。（上清を）取り除いた後、標準物質および試料を３００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。標準物質および試料のデータを、サイトメーターの設定のためのＢＤ社のＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェア、および試料を解析するためのＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロ−サイトメーターで読み取り、ＢＤ社のＣＢＡソフトウェアを用いて次の解析（標準曲線を用いた試料濃度の計算）を行った。
【００９６】
ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、各抗原用量で、有意に高い（ｐ＜０．０５）ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された（図１２）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは非アジュバント化抗原は、アジュバント単独またはＰＢＳでの免疫により達成される反応と類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質２μｇ、０．２μｇまたは０．０２μｇを用いてマウスを免疫した後、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された（図１２）。
【００９７】
脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、各抗原用量で、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された（図１３）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌまたは非アジュバント化抗原は、アジュバント単独またはＰＢＳでの免疫により達成される反応と類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質２μｇ、０．２μｇまたは０．０２μｇを用いてマウスを免疫した後、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された（図１３）。
【００９８】
脾細胞からのサイトカイン分泌
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、より高レベルのＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γサイトカインが誘導された（図１４）。両方のアジュバント（ミョウバンおよびＧＳＫ２アジュバント）は、混合したＴｈ１型（ＩＦＮ−γ）ならびにＴｈ２型（ＩＬ−５およびＩＬ−１３）サイトカインプロファイルをもたらした。
【実施例４】
【００９９】
Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する体液性免疫反応
ＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施例３で記載した手順と同じ実験手順を、オランダのＨａｒｌａｎ社から入手した６〜８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行った。アイソタイプの解析のために、マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体に特異的なポリクローナル血清を用いた（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０１００】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体
用量依存的な抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体反応が、アジュバントなしで、またはミョウバンもしくは水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）の存在下でＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された（図１５）。各抗原用量において、非アジュバント化Ｓｓｏｌで免疫したマウスと比較して、アジュバントの存在下、Ｓｓｏｌで免疫したマウスにおいて、抗体反応が有意に（０．３−１．９ｌｏｇ１０)高いことが判明した。２μｇおよび０．２μｇの抗原用量において、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、この反応は有意に（０．８−０．９ｌｏｇ１０）高かった（ｐ＜０．００５）。ミョウバンアジュバント化（ｐ＝０．０９、および差＝０．２ｌｏｇ１０）またはｐｌａｉｎ（ｐ＝０．０２ Ｓｓｏｌ、および差＝０．３ｌｏｇ１０）のＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化した０．０２μｇのＳｓｏｌでマウスを免疫した後に、より高い抗体反応の傾向が観察された。
【０１０１】
抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ抗体のアイソタイプ解析
非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質のいずれかで免疫したマウスにおいては、反応がＩｇＧ１アイソタイプに強く傾いていることが判明したが、ＩｇＧ２ｂ抗体が全く検出されなかったか、または非常に低レベルのＩｇＧ２ｂ抗体が検出された（図１６）。水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスでは、高い力価（５．０±０．２ｌｏｇ１０力価）のＩｇＧ１抗体が得られた。珍しいことに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて観察された力価と比較して、ＩｇＧ２ｂ抗体の力価（３．７±０．５ｌｏｇ１０力価）は、異種的ではあるが有意に増加した（１．７±０．０４ｌｏｇ１０力価、ｐ＜１０‐６）。
【０１０２】
中和抗体
水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）でアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和抗体力価（２．４±０．５ｌｏｇ１０力価）は、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスの力価（１．８±０．４ｌｏｇ１０力価、ｐ＝０．０２）よりも有意に高かったが、非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、中和力価は、検出限界以下に落ちた（図１７）。
【０１０３】
Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質に対する細胞性免疫反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの「Ｐｌａｉｎ」グループ、ミョウバンアジュバント化グループ、および水中油型エマルジョン（ＧＳＫ２ａｄｊ）でアジュバント化したグループの細胞性免疫反応を、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施例３で記載したように調べた。しかし、脾臓摘出の技術的問題により、Ｐｌａｉｎ製剤（非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質）またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおける脾臓の細胞性反応は入手できなかった。
【０１０４】
ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質またはミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、用量に関わらず、弱い頻度のＣＤ４＋Ｔ細胞（反応）が得られた（図１８）。ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質（３種類の用量全て）または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質（０．２μｇおよび０．０２μｇ）で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質によって、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応が誘導された。２μｇの非アジュバント化ＳｓｏｌとＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質との間で、類似のしかし弱い頻度（反応）が観察された（図１８）。
【０１０５】
脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞反応
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質でマウスを免疫した後に、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応の傾向が観察された（図１９）。ＧＳＫ２アジュバント単独で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質でマウスを免疫した後に、有意に高い（ｐ＜０．０５）ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が観察された。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した、０．２μｇまたは０．０２μｇの用量のＳｓｏｌが、類似のレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した（図１９）。
【０１０６】
脾細胞からのサイトカイン分泌
ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した２または０．０２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスと比較して、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化した０．２μｇのＳｓｏｌタンパク質で免疫したマウスにおいて、ＩＬ−５およびＩＬ−１３サイトカインのより高い産生の傾向が観察された（図２０）。ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質がいかなる用量であろうと、類似のレベルのＩＦＮ−γサイトカインが観察された（図２０）。
【０１０７】
実施例３および４の結果の概略および結論
これらのデータは、概して、アジュバントがない場合またはミョウバン存在下のいずれかにおけるＳｓｏｌタンパク質での免疫と比較して、水中油型エマルジョンアジュバント（ＧＳＫ２アジュバント）を用いたＳｓｏｌタンパク質のアジュバント化が、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において、より高レベルの抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ ＥＬＩＳＡ抗体反応および中和抗体反応を誘導したことを示した。さらに、ミョウバンアジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質または非アジュバント化Ｓｓｏｌタンパク質での免疫と比較して、ＧＳＫ２アジュバントを用いたＳｓｏｌタンパク質のアジュバント化が、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスのそれぞれにおけるＴｈ１型およびＴｈ２型サイトカインのより高い産生ならびにＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂの産生の増加によって示されるように、ＧＳＫ２アジュバントでアジュバント化したＳｓｏｌタンパク質は、混合したＴｈ１／Ｔｈ２様反応プロファイルをもたらした。
配列番号１
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ＃０３１５８９株のＳタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２
Ｓｓｏｌアミノ酸配列
１〜１３番目のアミノ酸はシグナルペプチドに相当し、成熟タンパク質から切断される（下線）。Ｓｅｒ−ＧｌｙリンカーおよびＦＬＡＧペプチド配列を太字で示す。
配列番号３
Ｓタンパク質をコードし、ｐＣＩ−Ｓ−ＷＰＲＥの中のようにＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１カセット内に挿入されるＤＮＡ配列。ＡＴＧおよびＴＡＡコドンに下線をし、余分な配列（ＢａｍＨ１、Ｘｈｏ１、コザック配列）を太字で示す。
配列番号４
Ｓｓｏｌポリペプチドをコードし、ＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１カセットに挿入されるＤＮＡ
−ＡＴＧおよびＴＡＡコドンに下線をする
−余分な配列（ＢａｍＨ１、Ｘｈｏ１、コザック配列）を太字で示す。
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー配列を網掛けで示す。
−ＦＬＡＧペプチド配列を□で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体；ならびに
（ｂ）代謝可能な油および乳化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバント
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記Ｓポリペプチドが、Ｓタンパク質の細胞外ドメインからなるまたはそれを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｓポリペプチドが、Ｃ末端にＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫ配列を結合している、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の１４〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｓポリペプチドが、配列番号２の配列からなるまたはそれを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｓポリペプチドが、ヒトの１用量につき１〜５μｇの量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記代謝可能な油がスクアレンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記乳化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記水中油型エマルジョンアジュバントがさらにトコール（ｔｏｃｏｌ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記トコールがα−トコフェロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水中油型エマルジョンアジュバントがスクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））およびα−トコフェロールを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を産生する方法であって、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を、水中油型エマルジョンアジュバントと混合するステップを含む、上記方法。
【請求項１２】
薬剤として使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の有効量の免疫原性組成物を、それを必要としている個体に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１６】
前記組成物が、単回投与ワクチン接種計画において投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンとして使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１】
（ａ）免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体；ならびに
（ｂ）代謝可能な油および乳化剤を含む水中油型エマルジョンアジュバント
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記Ｓポリペプチドが、Ｓタンパク質の細胞外ドメインからなるまたはそれを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｓポリペプチドが、Ｃ末端にＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫ配列を結合している、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質の１４〜１１９３番目のアミノ酸からなるまたはそれを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｓポリペプチドが、配列番号２の配列からなるまたはそれを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｓポリペプチドが、ヒトの１用量につき１〜５μｇの量で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記代謝可能な油がスクアレンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記乳化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記水中油型エマルジョンアジュバントがさらにトコール（ｔｏｃｏｌ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記トコールがα−トコフェロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水中油型エマルジョンアジュバントがスクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））およびα−トコフェロールを含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を産生する方法であって、免疫原性ＳＡＲＳコロナウイルスＳ（スパイク）ポリペプチド、またはその断片もしくは変異体を、水中油型エマルジョンアジュバントと混合するステップを含む、上記方法。
【請求項１２】
薬剤として使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
重症急性呼吸器症候群または他のＳＡＲＳ−ＣｏＶ関連疾患を予防または治療する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の有効量の免疫原性組成物を、それを必要としている個体に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項１６】
前記組成物が、単回投与ワクチン接種計画において投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ワクチンとして使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【公表番号】特表２０１２−５１０４４９（Ｐ２０１２−５１０４４９Ａ）
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３８００２（Ｐ２０１１−５３８００２）
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６０８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３６８５
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６０８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３６８５
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
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