一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法
【課題】 高い精度でｓｉＲＮＡの濃度を測定することが可能な、簡便かつ安価なｓｉＲＮＡの濃度測定方法を提供すること。
【解決手段】 ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【解決手段】 ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法に関する。本発明の方法は、薬剤として使用されるｓｉＲＮＡの薬物動態を調べる際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡの濃度を測定する方法として、以下の方法が知られている。
【０００３】
１）アガロースゲル電気泳動法（AGE）（非特許文献１）
本手法では、細胞から抽出された核酸をAGEにより分離し、バンドの濃度として目的のsiRNA濃度を検出する。しかし本手法は、その定量性に大いに問題がある。また、検出に関しても、ａ）siRNAを蛍光ラベルして細胞に導入し、AGE後の蛍光量で測定する手法と、ｂ）ノーザンブロット法で検出する手法の2手法があるが、ａ）ではsiRNAに蛍光を導入する必要があり、蛍光標識siRNAの生体内での挙動が本来のものと違う可能性が高く、またｂ）では操作が煩雑であることに加え、定量性がさらに低下するという問題がある。
【０００４】
２）定量的PCR（QPCR）（非特許文献２）
本手法では、核酸抽出物を鋳型として、定量的PCRを行う。対象のsiRNAは20mer前後と短く、PCRプライマーの作成に困難を伴う。配列によってはプライマー設計が不可能な場合もある。また、PCRによる増幅操作が入っているため、本来の生体内濃度を正確に反映していない可能性が消し去れない。また、典型的なQPCR法であるTaqMan法では、プローブにはクエンチング反応を用いるために二種の蛍光物質を用いる必要があり、またプローブと短いRNA鎖との結合を高めるためのMGB（Minor Groove Binder）などが必要であり、高価であるだけでなく、プローブ設計にも技術的限界がある。
【非特許文献１】Biomaterials 28（2007）1434〜1442
【非特許文献２】Nucleic Acid Research Vol.133 No.18 (2005) e151
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ｓｉＲＮＡを標識することなく、高い精度でｓｉＲＮＡの濃度を測定することが可能であり、かつ必要なサンプルが極微量ですむ、簡便かつ安価なｓｉＲＮＡの濃度測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、以下の手段を提供する。
【０００７】
［１］ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【０００８】
［２］前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜10 nMである、上記［１］に記載の方法。
【０００９】
［３］前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜2 nMである、上記［２］に記載の方法。
【００１０】
［４］前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯ（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-polarization）であり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、上記［１］に記載の方法。
【００１１】
［５］前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯであり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、上記［２］または［３］に記載の方法。
【００１２】
［６］前記第一の工程が、
（１）被検溶液を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、上記［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
【００１３】
［７］前記第一の工程が、
（１）被検溶液を９５℃で５分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）９５℃から出発して、以下の（i）〜（v）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i)一秒あたり０．１℃の温度低下による計５℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５分の静置、
（iii）前記（i）で低下させた温度から一秒あたり０．１℃の温度低下による計１０℃の温度低下、
（iv）前記（iii）で低下させた温度で１０分の静置、
（v）前記（iii）と（iv）の７サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を２０℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、上記［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
【００１４】
［８］前記蛍光標識プローブＤＮＡが、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成る、上記［１］〜［７］の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ｓｉＲＮＡを標識することなく、高い精度でｓｉＲＮＡの濃度を測定することが可能な、簡便かつ安価なｓｉＲＮＡの濃度測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法は、以下の工程を含む：
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程；
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程；および
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程。
【００１７】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉ（RNA interference）で使用される任意のsmall interfering RNAであり、破壊したい標的遺伝子の塩基配列に基いて設計される、一般的には19〜23塩基、より一般的には21〜23塩基の二本鎖ＲＮＡである。なお、ｓｉＲＮＡは、後述の実施例に記載されるとおり、センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端に、RISC（RNA-induced silencing complex）への取り込み効率上昇のためにデオキシリボヌクレオチド（たとえばデオキシチミジン５’リン酸（dT））が二塩基付加されていてもよい。なお、ここで付加されるデオキシヌクレオチド（以下、オーバーハングともいう）は、dTに限定されず、任意の他の塩基のものであってもよい。また、siRNAの両鎖の３’末端に２塩基のオーバーハングを有しておらず、siRNAの両末端が平滑なものも本発明の範囲に包含される。
【００１９】
本発明において投与される「ｓｉＲＮＡ」は、特定の配列からなる１種類のｓｉＲＮＡが好ましいが、種々の配列から構成されるｓｉＲＮＡの混合物であってもよい。
【００２０】
本発明において「ｓｉＲＮＡを投与した生体試料」は、ｓｉＲＮＡが投与された生物に由来する任意の生体試料であり、たとえば、１〜10ｎMの濃度のsiRNAが、培地中への添加、生体への注射などにより投与された、哺乳動物（とりわけヒト）の培養細胞、血液、肝臓や腎臓などの組織；植物の培養細胞、組織；線虫や昆虫などが挙げられる。本発明で投与されるsiRNAの濃度の上限は、好ましくは10 nMである。
【００２１】
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料からの核酸抽出物の調製は、当該技術分野で公知の手法に従って、たとえば後述の実施例に記載されるとおり行うことが可能である。薬剤としてのｓｉＲＮＡの薬物動態を調べる際には、ｓｉＲＮＡ投与から所定時間（たとえば1分〜120時間）経過後の生体試料から、核酸抽出物の調製を行う。
【００２２】
一方、本発明において「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、投与された二本鎖ｓｉＲＮＡの一方の鎖に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡである。「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖に相補的な配列を含むものであってもよい。ここで「相補的な配列」とは、相補的でない塩基を含んでいない配列、すなわちミスマッチ配列を含んでいない配列を意味する。「蛍光標識プローブDNA」は、投与された二本鎖siRNAの一方の鎖に相補的な配列を含む。また、siRNAに多用される３’末端のオーバーハング配列に相補的な配列を５’端および/または３’端に含んでいてもよく、たとえば後述の実施例においては、プローブの３’端に二個の塩基（TT）が付加されている。あるいは、「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、その５’端および/または３’端に塩基が付加されておらず、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成るものであってもよい。蛍光標識は、TAMRA、Rhodamine Green、Alexaなど任意の蛍光物質を、プローブＤＮＡの任意の位置に付与することにより為される。
【００２３】
本発明において「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、特定の配列からなる１種類のプローブＤＮＡであり、種々の配列から構成されるプローブＤＮＡの混合物を意図しない。このように、本発明において、「ｓｉＲＮＡ」および「蛍光標識プローブＤＮＡ」ともに、特定の配列からなる１種類のものを使用した場合（すなわち、種々の配列から構成される混合物を使用しなかった場合）、測定対象となる一本鎖ｓｉＲＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリッドは、１分子種のみ形成される。この短鎖ＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッドは、立体構造に可変性が少なく、溶液中の挙動の同一性が高いため、一分子蛍光分析で測定するのに適しているという利点を有する。
【００２４】
本発明の方法において「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、好ましくは0.5〜10 nMであり、より好ましくは0.5 nM〜2 nMである。本発明では、「蛍光標識プローブＤＮＡ」を一本鎖のｓｉＲＮＡとハイブリダイズさせて、二本鎖を形成し、この蛍光を発する二本鎖を一分子蛍光分析で捉える。このため、ｓｉＲＮＡの濃度を高い精度で測定するためには、一本鎖のｓｉＲＮＡを、プローブＤＮＡとのハイブリダイズにより二本鎖に変換することが必要であり、このためには、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、測定すべきｓｉＲＮＡの濃度より高くしておくことが望ましいと考えられる。上述のとおり、投与されるｓｉＲＮＡの濃度の上限は好ましくは10 nMであるため、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は10 nMより高く設定することが望ましいと考えられる。しかし、本発明では、後述の実施例で実証されるとおり、100 nMまでのｓｉＲＮＡの濃度を測定するには、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、0.5〜10 nMで十分であり、更に0.5 nM〜2 nMが望ましいという結果が得られている（実施例の例１参照）。
【００２５】
ｓｉＲＮＡを含む核酸抽出物と蛍光標識プローブＤＮＡとを反応させる条件は、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離し、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを起こすことが可能な反応条件である。
【００２６】
具体的には、適切な反応溶液中、たとえば１００ｍM NaClを含むTEバッファー中に、ｓｉＲＮＡを含む核酸抽出物を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させることができる。ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させる反応を行う際に、反応溶液中に「蛍光標識プローブＤＮＡ」が予め含まれていてもよい。
【００２７】
その後、95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液（一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡを含む）の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせることができる。
【００２８】
このように、被検溶液の温度を制御しながら段階的に低下させることは、被検溶液を室温に放置して温度を低下させるより、一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの機会を増大させることができるため、望ましい。
【００２９】
ハイブリダイゼーションの反応を終えた被検溶液に対し、公知の手法に従って一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する。たとえば、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）を用いて、ＦＣＳ（蛍光相関分光法：Fluorescence Correlation Spectroscopy）、ＦＩＤＡ（蛍光強度分布解析Fluorescence Intensity Distribution Analysis）、またはＦＩＤＡ−ＰＯ（蛍光偏光解析法：FIDA-polarization）の何れかの計測を行い、それぞれの計測から並進拡散時間、一分子あたりの蛍光強度、または蛍光偏光度の分析値を取得することができる。
【００３０】
ここで得られた分析値は、既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡ基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、ｓｉＲＮＡの濃度の値に変換される。
【００３１】
一分子蛍光分析のなかでもＦＩＤＡ−ＰＯが、ｓｉＲＮＡの濃度を高い精度で測定するのに特に適していることが本発明で見出されている（後述の実施例の例１参照）。図３に示されるとおり、ＦＩＤＡ−ＰＯにより得られる分析値は、ｓｉＲＮＡの濃度に依存的であり、とりわけ精度が高く、本発明の方法ではＦＩＤＡ−ＰＯの使用が特に好ましい。
【００３２】
以下に、本発明のｓｉＲＮＡ濃度測定方法の利点を記す。
【００３３】
・測定の際に核酸抽出物と蛍光標識プローブＤＮＡを混合し、所定の反応（２本鎖の解離とハイブリダイゼーション）を行うだけなので簡便である。
【００３４】
・一分子蛍光分析を利用する本発明の方法は、フルオートで行うことが可能であり、共焦点光学系を用いるためにサンプルボリュームは微量であり、その結果サンプルの絶対量が少量で測定が可能であり、短時間の測定が可能である。
【００３５】
・ダイナミックレンジが３桁であり、かつ投与されるｓｉＲＮＡの濃度の好ましい上限（10 nM）が、ダイナミックレンジ内に納まっている。
【００３６】
・測定対象物のｓｉＲＮＡを蛍光標識したり、ＰＣＲで増幅したり化学的操作を行わないため、原理的に再現性や精度が高い。
【００３７】
・測定に際し、蛍光標識オリゴヌクレオチドを微量用いるだけなので安価な測定方法である。
【００３８】
・多色蛍光標識を行えば、同時に多検体のデータを得ることができる。
【実施例】
【００３９】
例１
＜目的＞in vitroでsiRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
＜方法＞
以下の２本鎖siRNA（配列番号１および２）を測定対象として使用し、以下の蛍光標識１本鎖DNA（配列番号３）をプローブとして使用した。２本鎖siRNAと蛍光標識１本鎖DNAを100 mM NaCl を含むTEバッファ中で混合した。それぞれの濃度の組み合わせを表１に示す。
【００４０】
siRNAセンス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（配列番号１）
siRNAアンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（配列番号２）
蛍光標識DNA
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（配列番号３）。
【表１】
【００４１】
混合溶液に以下のような温度変化を与えて、２本鎖siRNAの１本鎖への解離とハイブリダイゼーションを行なった。温度変化はMJ Research社のPTC-200を用いて行なった。
【００４２】
95℃5分
↓0.1℃/秒
90℃5分
↓0.1℃/秒
80℃10分
↓0.1℃/秒
70℃10分
↓0.1℃/秒
60℃10分
↓0.1℃/秒
50℃10分
↓0.1℃/秒
40℃10分
↓0.1℃/秒
30℃10分
↓0.1℃/秒
20℃ ∞。
【００４３】
反応後、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）でFCS、FIDA、FIDA-PO計測を行った。反応条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。ビームスキャナは使用しなかった。
【００４４】
＜結果＞
FCS、FIDA、FIDA-PO計測の結果を、それぞれ図１、２、３に示す。なお、図１〜３は、対数グラフであるため、siRNAが0 nMの場合のデータを、グラフ上0.001 nMとしてプロットした。
【００４５】
計測の結果、全ての計測メソッドで濃度依存的な計測値変化を検出することができた。どのメソッドでも0.1nM〜50nMの範囲がとりわけ定量に向いている範囲であった。検量線として、最も感度が高かったのは、FIDA-POであった。プローブ濃度に関しては0.5nMの一番薄いものが低濃度のsiRNAでも検出しやすいように見えた。
【００４６】
例２
＜目的＞培養細胞からの核酸抽出物で、siRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
＜方法＞
(１)培養細胞に対するsiRNAのtransfectionと抽出
培養細胞 A549（ヒト肺がん由来）に対して20nM(25pmol)もしくは40nM(50pmol)のsiRNA(GL3)を導入後、24時間、48時間、72時間後ごとに細胞を回収した。回収した細胞はグアニジン-βMEに溶解後、シュレッダーを使いDNAを短鎖化、更に水飽和フェノール抽出をすることで、タンパク質とDNAを除去し、エタノール添加により沈殿を形成させた。同時にネガティブコントロールとして未処理の培養細胞からも抽出を行い、エタノール沈殿を形成させた。
【００４７】
(２)エタノール沈殿からの再溶解とMF20による定量
エタノール沈殿を15000rpm、30分の遠心処理をした。エタノールを除去後、再度70%エタノールで沈殿を洗浄した。室温で数時間置いて風乾させた後、30μlのRNase-free水に再溶解した。再溶解した溶液中に含まれるsiRNAを蛍光標識1本鎖DNAとハイブリダイゼーションさせて、並進拡散時間や蛍光偏光度の変化を測定した。同時にsiRNAを蛍光標識１本鎖DNAとハイブリダイゼーションさせて検量線を作成し、再溶解した抽出液中のsiRNAの検量を行なった。
【００４８】
細胞への導入および検量線の作成に用いたsiRNA、および蛍光標識１本鎖DNAを以下に記す。
【００４９】
siRNAセンス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（配列番号１）
siRNAアンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（配列番号２）
蛍光標識DNA
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（配列番号３）。
【００５０】
検量線作成用には、以下のような濃度系列のsiRNAを含む溶液を準備した。
【表２】
【００５１】
再溶解した溶液中のsiRNAの検出には、混合溶液30μlに対して6μlの再溶解した溶液が含まれるように混合した。どちらの反応系でもハイブリダイゼーション用のバッファは100mM NaCl/TEである。温度変化はMJ Research社のPTC-200を用いて行なった。
【００５２】
95℃5分
↓0.1℃/秒
90℃5分
↓0.1℃/秒
80℃10分
↓0.1℃/秒
70℃10分
↓0.1℃/秒
60℃10分
↓0.1℃/秒
50℃10分
↓0.1℃/秒
40℃10分
↓0.1℃/秒
30℃10分
↓0.1℃/秒
20℃ ∞。
【００５３】
反応後に一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）でFIDA-PO計測を行った。反応条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。ビームスキャナは使用しなかった。
【００５４】
＜結果＞
表３は、検量線用に作成したsiRNAの濃度と各計測値の関係を示す。なお、対数グラフ作成の都合上、siRNA濃度0 nMの点は、0.001 nMと表記した。
【表３】
【００５５】
例１の結果と同様に計測した濃度の範囲内で、siRNAの濃度増加依存的に蛍光偏光度が増加していることが分かる。
【００５６】
この計測データを元に、検量線を作成した。検量線は以下のように作成した。
【００５７】
１．ハイブリダイゼーションの反応を次のような平衡反応であると仮定した。
【数１】
【００５８】
２．Kd値、bottom値、top値を定数として、以下の式が成立すると考えフィッティングを行なった。
【数２】
【００５９】
図４は、フィッティング結果を示す。図４において、各点は計測値を示し、曲線は、フィッティングによって得られた検量線を示す。図４に示したように計測値をフィッティング曲線に近似させることができた。Kd = 5.27±1.48nMであった。この曲線を検量線として、再溶解した抽出液中のsiRNAの濃度を計算した。
【００６０】
図５は、再溶解した抽出液を用いてFIDA-PO計測を行った時の結果を示す。siRNA処理した全てのサンプルで未処理（NT）の抽出物に対して、蛍光偏光度の増加が検出された。蛍光偏光度の増加は20nM、40nMのどちらでも処理後24時間と48時間の方が72時間よりも高い値を示した。
【００６１】
次に計測サンプルに対して、検量線を元に濃度計算を行った。以下の表４に示したようにsiRNAの濃度が計算された。未処理のサンプルよりもsiRNAをtransfectionしたサンプルで高い濃度として計算された。siRNAをtransfectionしたサンプルでは、1nM〜10nMの間の値を示した。
【表４】
【００６２】
例３
＜目的＞特異的な対象siRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
(１)試験管内のサンプルを用いた定量実験
＜方法＞
実験に用いたsiRNA（GL3およびNS）、および各siRNAの濃度を測定するための蛍光標識１本鎖DNAを以下に示す。
【００６３】
siRNA（GL3）センス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（GL3）（配列番号１）
siRNA（GL3）アンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（GL3）（配列番号２）
蛍光標識DNA（GL3用）
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（GL3）（配列番号３）
siRNA（NS）センス鎖
5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'（NS）（配列番号４）
siRNA（NS）アンチセンス鎖
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'（NS）（配列番号５）
蛍光標識DNA（NS用）
5'-TAMRA-AATTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3'（NS）（配列番号６）。
【００６４】
GL3とNSの2種類のsiRNAに対してそれぞれに相補的な配列を持つ蛍光標識１本鎖DNAプローブを用いて、試験管内で定量可能かどうかを検討した。また、プローブとsiRNAの配列が異なる組み合わせを用いて（GL3プローブとNS siRNAの組合せ、およびNSプローブとGL3 siRNAの組合せを用いて）特異性を検証した。プローブの配列、siRNAの配列は上述の通りである。2nMのプローブと幾つかの濃度系列のsiRNAを100mM NaCl を含むTEバッファ中（ハイブリダイゼーション用バッファ）で混合した。混合後、MJ Research社のPTC-200を用いて温度変化を与えた。温度変化と時間は例１および２と同様である。その後、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）を用いてFIDA-PO計測を行った。計測条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。以後の実験でも全て同様の温度変化と計測条件を採用している。
【００６５】
＜結果＞
図６に示したようにそれぞれのプローブに対して同じ配列を持つsiRNAを混合した時には、siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しているのが分かる。それに対して、プローブと異なる配列のsiRNAを混合した時には蛍光偏光度が変化していなかった。すなわち、GL3プローブに対してGL3 siRNAを混合した時には、GL3 siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しているのが分かる。それに対して、GL3プローブに対してNS siRNAを混合した時には蛍光偏光度は変化していない。同様にNSプローブに対してNS siRNAを混合した時にはNS siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しており、GL3 siRNAを混合した時には蛍光偏光度は変化していない。このことから両方のプローブ共に特異的にそれぞれのsiRNAを検出できることが分かった。
【００６６】
(２)培養細胞に対するsiRNAの導入と抽出
＜方法＞
培養細胞 A549（ヒト肺がん由来）に対して40nM(25pmol)のsiRNA(GL3もしくはNS)を導入（コントロールとして未処理（NT）サンプルもあり）後、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間後ごとに細胞を回収した。回収した細胞はグアニジン-βMEに溶解後、シュレッダーを使いDNAを短鎖化（比較実験としてシュレッダーを使っていないサンプルもあり）、さらに水飽和フェノール抽出をすることで、タンパク質とDNAを除去し、エタノール添加により沈殿を形成させた。
【００６７】
サンプルの種類を、以下の表５に示す。
【表５】
【００６８】
各サンプル中のsiRNA濃度を、上記GL3プローブ（配列番号３）およびNSプローブ（配列番号６）のそれぞれを用いて、上述のとおり測定した。
【００６９】
＜結果＞
図７は、siRNA抽出液に対しFIDA-PO計測を行った結果を示す。図７（ａ）は、GL3プローブを用いて行った測定の結果を示し、図７（ｂ）は、NSプローブを用いて行った測定の結果を示す。図７に示されるとおり、GL3 siRNAを投与した細胞サンプルでは、GL3プローブを用いてGL3 siRNAの存在が検出され、NS siRNAを投与した細胞サンプルでは、NSプローブを用いてNS siRNAの存在が検出された。これら計測結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、図７（ａ）の測定結果に対するsiRNAの濃度計算結果であり、図８（ｂ）は、図７（ｂ）の測定結果に対するsiRNAの濃度計算結果である。図８に示したように、細胞内のsiRNAの濃度が計算された。
【００７０】
シュレッダーの有無によるsiRNA量や総核酸量にはほとんど差がなかった。このことからどちらの実験ステップでもsiRNAの定量には問題がないと考えられる。
【００７１】
例４
＜目的＞測定範囲の上限値の検討
＜方法＞
例１の図３、例２の表３、および例３の図６に示される結果から、siRNAの添加濃度に応じて蛍光偏光度が増加していることが分かる。しかしながら、最大添加量でも値が飽和しているかどうかは不明である。蛍光偏光度の最大値を知ることは検量線作成の上でも注意をする必要がある。ここで確認のために、200nM（図６での最大添加濃度）以上の添加量で蛍光偏光度がどのように変化するかを調べた。
【００７２】
＜結果＞
図９に示したように、それぞれの蛍光標識DNAプローブに対して同じ配列を持つsiRNAを添加した場合、siRNAの濃度が100nM以上では蛍光偏光度に大きな増加は見られなかった。このことから例１の図３、例２の表３、および例３の図６に示される結果では、最大添加量である100nM〜200nMにおいて蛍光偏光度の値が飽和していたことが分かった。
【００７３】
例５
これまでの検討では、１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングにより検量線を作成した。そこで対数グラフを元にした線形フィッティングと前回のフィッティングを同時に行ない比較した。１対１結合のみを考慮にいれた反応式と添加濃度と並進拡散時間（もしくは蛍光偏光度）の関係式は以下の通りである。
【数３】
【００７４】
比較に使ったデータは、例３の図６（ａ）のグラフを作成したときのデータである。線形フィッティングではsiRNAの添加濃度が0.05nM〜200nMの範囲内のもののみを考慮にいれた。
【００７５】
図１０（ａ）のグラフは、１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングの結果、作成した検量線を示し、図１０（ｂ）のグラフは、線形フィッティングの結果、作成した検量線を示す。定量に使う検量線は対数グラフを線形フィッティングすることでも精度良く行なえることが分かった。線形フィッティングは、フィッティング自体がExcelで行なうことができ簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】種々の濃度のsiRNAを用いてFCS計測を行った結果を示すグラフ。
【図２】種々の濃度のsiRNAを用いてFIDA計測を行った結果を示すグラフ。
【図３】種々の濃度のsiRNAを用いてFIDA-PO計測を行った結果を示すグラフ。
【図４】FIDA-PO計測データを基に作成した検量線を示すグラフ。
【図５】siRNAを投与した細胞サンプルについてFIDA-PO計測を行った結果を示すグラフ。
【図６】蛍光標識プローブDNA（GL3用）を用いてGL3 siRNAまたはNS siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および蛍光標識プローブDNA（NS用）を用いてNS siRNAまたはGL3 siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図７】蛍光標識プローブDNA（GL3用）を用いて細胞サンプル中のsiRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および蛍光標識プローブDNA（NS用）を用いて細胞サンプル中のsiRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図８】図７（ａ）の測定結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った結果を示すグラフ（ａ）、および図７（ｂ）の測定結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った結果を示すグラフ（ｂ）。
【図９】０〜2000 nMの濃度のGL3 siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および０〜2000 nMの濃度のNS siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図１０】１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングの結作成した検量線を示すグラフ（ａ）、および線形フィッティングの結果作成した検量線を示すグラフ（ｂ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法に関する。本発明の方法は、薬剤として使用されるｓｉＲＮＡの薬物動態を調べる際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡの濃度を測定する方法として、以下の方法が知られている。
【０００３】
１）アガロースゲル電気泳動法（AGE）（非特許文献１）
本手法では、細胞から抽出された核酸をAGEにより分離し、バンドの濃度として目的のsiRNA濃度を検出する。しかし本手法は、その定量性に大いに問題がある。また、検出に関しても、ａ）siRNAを蛍光ラベルして細胞に導入し、AGE後の蛍光量で測定する手法と、ｂ）ノーザンブロット法で検出する手法の2手法があるが、ａ）ではsiRNAに蛍光を導入する必要があり、蛍光標識siRNAの生体内での挙動が本来のものと違う可能性が高く、またｂ）では操作が煩雑であることに加え、定量性がさらに低下するという問題がある。
【０００４】
２）定量的PCR（QPCR）（非特許文献２）
本手法では、核酸抽出物を鋳型として、定量的PCRを行う。対象のsiRNAは20mer前後と短く、PCRプライマーの作成に困難を伴う。配列によってはプライマー設計が不可能な場合もある。また、PCRによる増幅操作が入っているため、本来の生体内濃度を正確に反映していない可能性が消し去れない。また、典型的なQPCR法であるTaqMan法では、プローブにはクエンチング反応を用いるために二種の蛍光物質を用いる必要があり、またプローブと短いRNA鎖との結合を高めるためのMGB（Minor Groove Binder）などが必要であり、高価であるだけでなく、プローブ設計にも技術的限界がある。
【非特許文献１】Biomaterials 28（2007）1434〜1442
【非特許文献２】Nucleic Acid Research Vol.133 No.18 (2005) e151
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ｓｉＲＮＡを標識することなく、高い精度でｓｉＲＮＡの濃度を測定することが可能であり、かつ必要なサンプルが極微量ですむ、簡便かつ安価なｓｉＲＮＡの濃度測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、以下の手段を提供する。
【０００７】
［１］ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【０００８】
［２］前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜10 nMである、上記［１］に記載の方法。
【０００９】
［３］前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜2 nMである、上記［２］に記載の方法。
【００１０】
［４］前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯ（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-polarization）であり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、上記［１］に記載の方法。
【００１１】
［５］前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯであり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、上記［２］または［３］に記載の方法。
【００１２】
［６］前記第一の工程が、
（１）被検溶液を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、上記［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
【００１３】
［７］前記第一の工程が、
（１）被検溶液を９５℃で５分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）９５℃から出発して、以下の（i）〜（v）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i)一秒あたり０．１℃の温度低下による計５℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５分の静置、
（iii）前記（i）で低下させた温度から一秒あたり０．１℃の温度低下による計１０℃の温度低下、
（iv）前記（iii）で低下させた温度で１０分の静置、
（v）前記（iii）と（iv）の７サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を２０℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、上記［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
【００１４】
［８］前記蛍光標識プローブＤＮＡが、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成る、上記［１］〜［７］の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ｓｉＲＮＡを標識することなく、高い精度でｓｉＲＮＡの濃度を測定することが可能な、簡便かつ安価なｓｉＲＮＡの濃度測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法は、以下の工程を含む：
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程；
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程；および
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程。
【００１７】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉ（RNA interference）で使用される任意のsmall interfering RNAであり、破壊したい標的遺伝子の塩基配列に基いて設計される、一般的には19〜23塩基、より一般的には21〜23塩基の二本鎖ＲＮＡである。なお、ｓｉＲＮＡは、後述の実施例に記載されるとおり、センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端に、RISC（RNA-induced silencing complex）への取り込み効率上昇のためにデオキシリボヌクレオチド（たとえばデオキシチミジン５’リン酸（dT））が二塩基付加されていてもよい。なお、ここで付加されるデオキシヌクレオチド（以下、オーバーハングともいう）は、dTに限定されず、任意の他の塩基のものであってもよい。また、siRNAの両鎖の３’末端に２塩基のオーバーハングを有しておらず、siRNAの両末端が平滑なものも本発明の範囲に包含される。
【００１９】
本発明において投与される「ｓｉＲＮＡ」は、特定の配列からなる１種類のｓｉＲＮＡが好ましいが、種々の配列から構成されるｓｉＲＮＡの混合物であってもよい。
【００２０】
本発明において「ｓｉＲＮＡを投与した生体試料」は、ｓｉＲＮＡが投与された生物に由来する任意の生体試料であり、たとえば、１〜10ｎMの濃度のsiRNAが、培地中への添加、生体への注射などにより投与された、哺乳動物（とりわけヒト）の培養細胞、血液、肝臓や腎臓などの組織；植物の培養細胞、組織；線虫や昆虫などが挙げられる。本発明で投与されるsiRNAの濃度の上限は、好ましくは10 nMである。
【００２１】
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料からの核酸抽出物の調製は、当該技術分野で公知の手法に従って、たとえば後述の実施例に記載されるとおり行うことが可能である。薬剤としてのｓｉＲＮＡの薬物動態を調べる際には、ｓｉＲＮＡ投与から所定時間（たとえば1分〜120時間）経過後の生体試料から、核酸抽出物の調製を行う。
【００２２】
一方、本発明において「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、投与された二本鎖ｓｉＲＮＡの一方の鎖に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡである。「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれの鎖に相補的な配列を含むものであってもよい。ここで「相補的な配列」とは、相補的でない塩基を含んでいない配列、すなわちミスマッチ配列を含んでいない配列を意味する。「蛍光標識プローブDNA」は、投与された二本鎖siRNAの一方の鎖に相補的な配列を含む。また、siRNAに多用される３’末端のオーバーハング配列に相補的な配列を５’端および/または３’端に含んでいてもよく、たとえば後述の実施例においては、プローブの３’端に二個の塩基（TT）が付加されている。あるいは、「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、その５’端および/または３’端に塩基が付加されておらず、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成るものであってもよい。蛍光標識は、TAMRA、Rhodamine Green、Alexaなど任意の蛍光物質を、プローブＤＮＡの任意の位置に付与することにより為される。
【００２３】
本発明において「蛍光標識プローブＤＮＡ」は、特定の配列からなる１種類のプローブＤＮＡであり、種々の配列から構成されるプローブＤＮＡの混合物を意図しない。このように、本発明において、「ｓｉＲＮＡ」および「蛍光標識プローブＤＮＡ」ともに、特定の配列からなる１種類のものを使用した場合（すなわち、種々の配列から構成される混合物を使用しなかった場合）、測定対象となる一本鎖ｓｉＲＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリッドは、１分子種のみ形成される。この短鎖ＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッドは、立体構造に可変性が少なく、溶液中の挙動の同一性が高いため、一分子蛍光分析で測定するのに適しているという利点を有する。
【００２４】
本発明の方法において「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、好ましくは0.5〜10 nMであり、より好ましくは0.5 nM〜2 nMである。本発明では、「蛍光標識プローブＤＮＡ」を一本鎖のｓｉＲＮＡとハイブリダイズさせて、二本鎖を形成し、この蛍光を発する二本鎖を一分子蛍光分析で捉える。このため、ｓｉＲＮＡの濃度を高い精度で測定するためには、一本鎖のｓｉＲＮＡを、プローブＤＮＡとのハイブリダイズにより二本鎖に変換することが必要であり、このためには、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、測定すべきｓｉＲＮＡの濃度より高くしておくことが望ましいと考えられる。上述のとおり、投与されるｓｉＲＮＡの濃度の上限は好ましくは10 nMであるため、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は10 nMより高く設定することが望ましいと考えられる。しかし、本発明では、後述の実施例で実証されるとおり、100 nMまでのｓｉＲＮＡの濃度を測定するには、「蛍光標識プローブＤＮＡ」の濃度は、0.5〜10 nMで十分であり、更に0.5 nM〜2 nMが望ましいという結果が得られている（実施例の例１参照）。
【００２５】
ｓｉＲＮＡを含む核酸抽出物と蛍光標識プローブＤＮＡとを反応させる条件は、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離し、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを起こすことが可能な反応条件である。
【００２６】
具体的には、適切な反応溶液中、たとえば１００ｍM NaClを含むTEバッファー中に、ｓｉＲＮＡを含む核酸抽出物を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させることができる。ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させる反応を行う際に、反応溶液中に「蛍光標識プローブＤＮＡ」が予め含まれていてもよい。
【００２７】
その後、95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液（一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡを含む）の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせることができる。
【００２８】
このように、被検溶液の温度を制御しながら段階的に低下させることは、被検溶液を室温に放置して温度を低下させるより、一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションの機会を増大させることができるため、望ましい。
【００２９】
ハイブリダイゼーションの反応を終えた被検溶液に対し、公知の手法に従って一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する。たとえば、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）を用いて、ＦＣＳ（蛍光相関分光法：Fluorescence Correlation Spectroscopy）、ＦＩＤＡ（蛍光強度分布解析Fluorescence Intensity Distribution Analysis）、またはＦＩＤＡ−ＰＯ（蛍光偏光解析法：FIDA-polarization）の何れかの計測を行い、それぞれの計測から並進拡散時間、一分子あたりの蛍光強度、または蛍光偏光度の分析値を取得することができる。
【００３０】
ここで得られた分析値は、既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡ基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、ｓｉＲＮＡの濃度の値に変換される。
【００３１】
一分子蛍光分析のなかでもＦＩＤＡ−ＰＯが、ｓｉＲＮＡの濃度を高い精度で測定するのに特に適していることが本発明で見出されている（後述の実施例の例１参照）。図３に示されるとおり、ＦＩＤＡ−ＰＯにより得られる分析値は、ｓｉＲＮＡの濃度に依存的であり、とりわけ精度が高く、本発明の方法ではＦＩＤＡ−ＰＯの使用が特に好ましい。
【００３２】
以下に、本発明のｓｉＲＮＡ濃度測定方法の利点を記す。
【００３３】
・測定の際に核酸抽出物と蛍光標識プローブＤＮＡを混合し、所定の反応（２本鎖の解離とハイブリダイゼーション）を行うだけなので簡便である。
【００３４】
・一分子蛍光分析を利用する本発明の方法は、フルオートで行うことが可能であり、共焦点光学系を用いるためにサンプルボリュームは微量であり、その結果サンプルの絶対量が少量で測定が可能であり、短時間の測定が可能である。
【００３５】
・ダイナミックレンジが３桁であり、かつ投与されるｓｉＲＮＡの濃度の好ましい上限（10 nM）が、ダイナミックレンジ内に納まっている。
【００３６】
・測定対象物のｓｉＲＮＡを蛍光標識したり、ＰＣＲで増幅したり化学的操作を行わないため、原理的に再現性や精度が高い。
【００３７】
・測定に際し、蛍光標識オリゴヌクレオチドを微量用いるだけなので安価な測定方法である。
【００３８】
・多色蛍光標識を行えば、同時に多検体のデータを得ることができる。
【実施例】
【００３９】
例１
＜目的＞in vitroでsiRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
＜方法＞
以下の２本鎖siRNA（配列番号１および２）を測定対象として使用し、以下の蛍光標識１本鎖DNA（配列番号３）をプローブとして使用した。２本鎖siRNAと蛍光標識１本鎖DNAを100 mM NaCl を含むTEバッファ中で混合した。それぞれの濃度の組み合わせを表１に示す。
【００４０】
siRNAセンス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（配列番号１）
siRNAアンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（配列番号２）
蛍光標識DNA
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（配列番号３）。
【表１】
【００４１】
混合溶液に以下のような温度変化を与えて、２本鎖siRNAの１本鎖への解離とハイブリダイゼーションを行なった。温度変化はMJ Research社のPTC-200を用いて行なった。
【００４２】
95℃5分
↓0.1℃/秒
90℃5分
↓0.1℃/秒
80℃10分
↓0.1℃/秒
70℃10分
↓0.1℃/秒
60℃10分
↓0.1℃/秒
50℃10分
↓0.1℃/秒
40℃10分
↓0.1℃/秒
30℃10分
↓0.1℃/秒
20℃ ∞。
【００４３】
反応後、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）でFCS、FIDA、FIDA-PO計測を行った。反応条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。ビームスキャナは使用しなかった。
【００４４】
＜結果＞
FCS、FIDA、FIDA-PO計測の結果を、それぞれ図１、２、３に示す。なお、図１〜３は、対数グラフであるため、siRNAが0 nMの場合のデータを、グラフ上0.001 nMとしてプロットした。
【００４５】
計測の結果、全ての計測メソッドで濃度依存的な計測値変化を検出することができた。どのメソッドでも0.1nM〜50nMの範囲がとりわけ定量に向いている範囲であった。検量線として、最も感度が高かったのは、FIDA-POであった。プローブ濃度に関しては0.5nMの一番薄いものが低濃度のsiRNAでも検出しやすいように見えた。
【００４６】
例２
＜目的＞培養細胞からの核酸抽出物で、siRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
＜方法＞
(１)培養細胞に対するsiRNAのtransfectionと抽出
培養細胞 A549（ヒト肺がん由来）に対して20nM(25pmol)もしくは40nM(50pmol)のsiRNA(GL3)を導入後、24時間、48時間、72時間後ごとに細胞を回収した。回収した細胞はグアニジン-βMEに溶解後、シュレッダーを使いDNAを短鎖化、更に水飽和フェノール抽出をすることで、タンパク質とDNAを除去し、エタノール添加により沈殿を形成させた。同時にネガティブコントロールとして未処理の培養細胞からも抽出を行い、エタノール沈殿を形成させた。
【００４７】
(２)エタノール沈殿からの再溶解とMF20による定量
エタノール沈殿を15000rpm、30分の遠心処理をした。エタノールを除去後、再度70%エタノールで沈殿を洗浄した。室温で数時間置いて風乾させた後、30μlのRNase-free水に再溶解した。再溶解した溶液中に含まれるsiRNAを蛍光標識1本鎖DNAとハイブリダイゼーションさせて、並進拡散時間や蛍光偏光度の変化を測定した。同時にsiRNAを蛍光標識１本鎖DNAとハイブリダイゼーションさせて検量線を作成し、再溶解した抽出液中のsiRNAの検量を行なった。
【００４８】
細胞への導入および検量線の作成に用いたsiRNA、および蛍光標識１本鎖DNAを以下に記す。
【００４９】
siRNAセンス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（配列番号１）
siRNAアンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（配列番号２）
蛍光標識DNA
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（配列番号３）。
【００５０】
検量線作成用には、以下のような濃度系列のsiRNAを含む溶液を準備した。
【表２】
【００５１】
再溶解した溶液中のsiRNAの検出には、混合溶液30μlに対して6μlの再溶解した溶液が含まれるように混合した。どちらの反応系でもハイブリダイゼーション用のバッファは100mM NaCl/TEである。温度変化はMJ Research社のPTC-200を用いて行なった。
【００５２】
95℃5分
↓0.1℃/秒
90℃5分
↓0.1℃/秒
80℃10分
↓0.1℃/秒
70℃10分
↓0.1℃/秒
60℃10分
↓0.1℃/秒
50℃10分
↓0.1℃/秒
40℃10分
↓0.1℃/秒
30℃10分
↓0.1℃/秒
20℃ ∞。
【００５３】
反応後に一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）でFIDA-PO計測を行った。反応条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。ビームスキャナは使用しなかった。
【００５４】
＜結果＞
表３は、検量線用に作成したsiRNAの濃度と各計測値の関係を示す。なお、対数グラフ作成の都合上、siRNA濃度0 nMの点は、0.001 nMと表記した。
【表３】
【００５５】
例１の結果と同様に計測した濃度の範囲内で、siRNAの濃度増加依存的に蛍光偏光度が増加していることが分かる。
【００５６】
この計測データを元に、検量線を作成した。検量線は以下のように作成した。
【００５７】
１．ハイブリダイゼーションの反応を次のような平衡反応であると仮定した。
【数１】
【００５８】
２．Kd値、bottom値、top値を定数として、以下の式が成立すると考えフィッティングを行なった。
【数２】
【００５９】
図４は、フィッティング結果を示す。図４において、各点は計測値を示し、曲線は、フィッティングによって得られた検量線を示す。図４に示したように計測値をフィッティング曲線に近似させることができた。Kd = 5.27±1.48nMであった。この曲線を検量線として、再溶解した抽出液中のsiRNAの濃度を計算した。
【００６０】
図５は、再溶解した抽出液を用いてFIDA-PO計測を行った時の結果を示す。siRNA処理した全てのサンプルで未処理（NT）の抽出物に対して、蛍光偏光度の増加が検出された。蛍光偏光度の増加は20nM、40nMのどちらでも処理後24時間と48時間の方が72時間よりも高い値を示した。
【００６１】
次に計測サンプルに対して、検量線を元に濃度計算を行った。以下の表４に示したようにsiRNAの濃度が計算された。未処理のサンプルよりもsiRNAをtransfectionしたサンプルで高い濃度として計算された。siRNAをtransfectionしたサンプルでは、1nM〜10nMの間の値を示した。
【表４】
【００６２】
例３
＜目的＞特異的な対象siRNAの濃度測定が可能かどうかの検討
(１)試験管内のサンプルを用いた定量実験
＜方法＞
実験に用いたsiRNA（GL3およびNS）、および各siRNAの濃度を測定するための蛍光標識１本鎖DNAを以下に示す。
【００６３】
siRNA（GL3）センス鎖
5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'（GL3）（配列番号１）
siRNA（GL3）アンチセンス鎖
5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3'（GL3）（配列番号２）
蛍光標識DNA（GL3用）
5'-TAMRA-AACTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'（GL3）（配列番号３）
siRNA（NS）センス鎖
5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'（NS）（配列番号４）
siRNA（NS）アンチセンス鎖
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'（NS）（配列番号５）
蛍光標識DNA（NS用）
5'-TAMRA-AATTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3'（NS）（配列番号６）。
【００６４】
GL3とNSの2種類のsiRNAに対してそれぞれに相補的な配列を持つ蛍光標識１本鎖DNAプローブを用いて、試験管内で定量可能かどうかを検討した。また、プローブとsiRNAの配列が異なる組み合わせを用いて（GL3プローブとNS siRNAの組合せ、およびNSプローブとGL3 siRNAの組合せを用いて）特異性を検証した。プローブの配列、siRNAの配列は上述の通りである。2nMのプローブと幾つかの濃度系列のsiRNAを100mM NaCl を含むTEバッファ中（ハイブリダイゼーション用バッファ）で混合した。混合後、MJ Research社のPTC-200を用いて温度変化を与えた。温度変化と時間は例１および２と同様である。その後、一分子蛍光分析システムMF20（オリンパス）を用いてFIDA-PO計測を行った。計測条件は全て543nm、100μWで15秒5回である。以後の実験でも全て同様の温度変化と計測条件を採用している。
【００６５】
＜結果＞
図６に示したようにそれぞれのプローブに対して同じ配列を持つsiRNAを混合した時には、siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しているのが分かる。それに対して、プローブと異なる配列のsiRNAを混合した時には蛍光偏光度が変化していなかった。すなわち、GL3プローブに対してGL3 siRNAを混合した時には、GL3 siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しているのが分かる。それに対して、GL3プローブに対してNS siRNAを混合した時には蛍光偏光度は変化していない。同様にNSプローブに対してNS siRNAを混合した時にはNS siRNAの添加濃度依存的に蛍光偏光度が増加しており、GL3 siRNAを混合した時には蛍光偏光度は変化していない。このことから両方のプローブ共に特異的にそれぞれのsiRNAを検出できることが分かった。
【００６６】
(２)培養細胞に対するsiRNAの導入と抽出
＜方法＞
培養細胞 A549（ヒト肺がん由来）に対して40nM(25pmol)のsiRNA(GL3もしくはNS)を導入（コントロールとして未処理（NT）サンプルもあり）後、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間後ごとに細胞を回収した。回収した細胞はグアニジン-βMEに溶解後、シュレッダーを使いDNAを短鎖化（比較実験としてシュレッダーを使っていないサンプルもあり）、さらに水飽和フェノール抽出をすることで、タンパク質とDNAを除去し、エタノール添加により沈殿を形成させた。
【００６７】
サンプルの種類を、以下の表５に示す。
【表５】
【００６８】
各サンプル中のsiRNA濃度を、上記GL3プローブ（配列番号３）およびNSプローブ（配列番号６）のそれぞれを用いて、上述のとおり測定した。
【００６９】
＜結果＞
図７は、siRNA抽出液に対しFIDA-PO計測を行った結果を示す。図７（ａ）は、GL3プローブを用いて行った測定の結果を示し、図７（ｂ）は、NSプローブを用いて行った測定の結果を示す。図７に示されるとおり、GL3 siRNAを投与した細胞サンプルでは、GL3プローブを用いてGL3 siRNAの存在が検出され、NS siRNAを投与した細胞サンプルでは、NSプローブを用いてNS siRNAの存在が検出された。これら計測結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、図７（ａ）の測定結果に対するsiRNAの濃度計算結果であり、図８（ｂ）は、図７（ｂ）の測定結果に対するsiRNAの濃度計算結果である。図８に示したように、細胞内のsiRNAの濃度が計算された。
【００７０】
シュレッダーの有無によるsiRNA量や総核酸量にはほとんど差がなかった。このことからどちらの実験ステップでもsiRNAの定量には問題がないと考えられる。
【００７１】
例４
＜目的＞測定範囲の上限値の検討
＜方法＞
例１の図３、例２の表３、および例３の図６に示される結果から、siRNAの添加濃度に応じて蛍光偏光度が増加していることが分かる。しかしながら、最大添加量でも値が飽和しているかどうかは不明である。蛍光偏光度の最大値を知ることは検量線作成の上でも注意をする必要がある。ここで確認のために、200nM（図６での最大添加濃度）以上の添加量で蛍光偏光度がどのように変化するかを調べた。
【００７２】
＜結果＞
図９に示したように、それぞれの蛍光標識DNAプローブに対して同じ配列を持つsiRNAを添加した場合、siRNAの濃度が100nM以上では蛍光偏光度に大きな増加は見られなかった。このことから例１の図３、例２の表３、および例３の図６に示される結果では、最大添加量である100nM〜200nMにおいて蛍光偏光度の値が飽和していたことが分かった。
【００７３】
例５
これまでの検討では、１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングにより検量線を作成した。そこで対数グラフを元にした線形フィッティングと前回のフィッティングを同時に行ない比較した。１対１結合のみを考慮にいれた反応式と添加濃度と並進拡散時間（もしくは蛍光偏光度）の関係式は以下の通りである。
【数３】
【００７４】
比較に使ったデータは、例３の図６（ａ）のグラフを作成したときのデータである。線形フィッティングではsiRNAの添加濃度が0.05nM〜200nMの範囲内のもののみを考慮にいれた。
【００７５】
図１０（ａ）のグラフは、１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングの結果、作成した検量線を示し、図１０（ｂ）のグラフは、線形フィッティングの結果、作成した検量線を示す。定量に使う検量線は対数グラフを線形フィッティングすることでも精度良く行なえることが分かった。線形フィッティングは、フィッティング自体がExcelで行なうことができ簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】種々の濃度のsiRNAを用いてFCS計測を行った結果を示すグラフ。
【図２】種々の濃度のsiRNAを用いてFIDA計測を行った結果を示すグラフ。
【図３】種々の濃度のsiRNAを用いてFIDA-PO計測を行った結果を示すグラフ。
【図４】FIDA-PO計測データを基に作成した検量線を示すグラフ。
【図５】siRNAを投与した細胞サンプルについてFIDA-PO計測を行った結果を示すグラフ。
【図６】蛍光標識プローブDNA（GL3用）を用いてGL3 siRNAまたはNS siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および蛍光標識プローブDNA（NS用）を用いてNS siRNAまたはGL3 siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図７】蛍光標識プローブDNA（GL3用）を用いて細胞サンプル中のsiRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および蛍光標識プローブDNA（NS用）を用いて細胞サンプル中のsiRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図８】図７（ａ）の測定結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った結果を示すグラフ（ａ）、および図７（ｂ）の測定結果に対して、検量線を元にsiRNAの濃度計算を行った結果を示すグラフ（ｂ）。
【図９】０〜2000 nMの濃度のGL3 siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ａ）、および０〜2000 nMの濃度のNS siRNAの蛍光偏光度を測定した結果を示すグラフ（ｂ）。
【図１０】１対１結合のみを考慮に入れたフィッティングの結作成した検量線を示すグラフ（ａ）、および線形フィッティングの結果作成した検量線を示すグラフ（ｂ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【請求項２】
前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜10 nMである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜2 nMである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯ（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-polarization）であり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯであり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の工程が、
（１）被検溶液を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の工程が、
（１）被検溶液を９５℃で５分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）９５℃から出発して、以下の（i）〜（v）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i)一秒あたり０．１℃の温度低下による計５℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５分の静置、
（iii）前記（i）で低下させた温度から一秒あたり０．１℃の温度低下による計１０℃の温度低下、
（iv）前記（iii）で低下させた温度で１０分の静置、
（v）前記（iii）と（iv）の７サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を２０℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光標識プローブＤＮＡが、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成る、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１】
ｓｉＲＮＡを投与した生体試料から調製された核酸抽出物を含む被検溶液において、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させ、その後、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡに、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列を含む蛍光標識プローブＤＮＡをハイブリダイズさせる第一の工程と、
第一の工程後の被検溶液に対して一分子蛍光分析を行い、分析値を取得する第二の工程と、
既知の種々の濃度のｓｉＲＮＡを含む基準溶液を用いて作成された検量線に基いて、第二の工程で取得した分析値からｓｉＲＮＡの濃度を算出する第三の工程と
を含む、一分子蛍光分析によるｓｉＲＮＡの濃度測定方法。
【請求項２】
前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜10 nMである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光標識プローブＤＮＡの濃度が0.5〜2 nMである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯ（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-polarization）であり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一分子蛍光分析がＦＩＤＡ−ＰＯであり、前記分析値が蛍光偏光度の値である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の工程が、
（１）被検溶液を95〜100℃で２〜10分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）95〜100℃から出発して、以下の（i）〜（iii）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i）一秒あたり0.05〜0.2℃の温度低下による計５〜10℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５〜10分の静置、
（iii）前記（i）と（ii）の７〜19サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を4〜25℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の工程が、
（１）被検溶液を９５℃で５分の条件に置くことにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖を解離させること、その後
（２）９５℃から出発して、以下の（i）〜（v）により被検溶液の温度を段階的に低下させ：
（i)一秒あたり０．１℃の温度低下による計５℃の温度低下、
（ii)前記（i）で低下させた温度で５分の静置、
（iii）前記（i）で低下させた温度から一秒あたり０．１℃の温度低下による計１０℃の温度低下、
（iv）前記（iii）で低下させた温度で１０分の静置、
（v）前記（iii）と（iv）の７サイクルの繰返し、
最終的に被検溶液を２０℃にすることより、解離した一本鎖のｓｉＲＮＡと蛍光標識プローブＤＮＡとをハイブリダイズさせること
により行われる、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光標識プローブＤＮＡが、ｓｉＲＮＡの二本鎖の一方の鎖に相補的な配列から成る、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−２５６０１１（Ｐ２０１０−２５６０１１Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１８７７０（Ｐ２００７−２１８７７０）
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２４日（２００７．８．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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