本発明は、基礎研究、臨床研究において使用するため、および臨床検出アッセイ法を開発するための核酸検出アッセイ法を開発および最適化する方法およびルーチンを提供する。特に本発明は、多重増幅反応で使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計する方法を提供する。本発明はまた、多重増幅反応を最適化する方法を提供する。本発明はまた、組み合わせ標的およびシグナル生成アッセイの方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応（invasive cleavage assay reaction）を含む一段階反応において、存在する場合に標的核酸が検出されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
試料が未精製体液である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリメラーゼ連鎖反応が20サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応が15サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応が12サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
一段階反応が、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が哺乳動物ゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が病原体に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が植物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
体液が血液を含む、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸が蛍光によって検出される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
試薬が逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および緩衝液を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
緩衝液の塩化カリウム濃度が0 mMである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、標的核酸の存在下で侵入型切断構造を生じるように構成されたオリゴヌクレオチド、ならびに一段階反応において該標的核酸の逆転写および検出可能な増幅を可能にする緩衝液を含む、試料中の標的核酸を検出するためのキット。
【請求項１５】
5'ヌクレアーゼがFEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項14記載のキット。
【請求項１６】
緩衝液の塩化カリウム濃度が0 mMである、請求項14記載のキット。
【請求項１７】
増幅プライマーをさらに含む、請求項14記載のキット。
【請求項１８】
逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載のキット。
【請求項１９】
標的核酸の存在下で逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチド、ならびに逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断反応を行うための試薬を含む、試料中の標的核酸を検出するためのキット。
【請求項２０】
以下の段階を含む、標的核酸を多重検出する方法：a) マイクロ流体カード中に逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ試薬を提供する段階であって、該試薬が標的核酸を逆転写、増幅、および検出するように構成されている段階；b) 該標的核酸を含むと疑われる試料を遠心力を用いて該試薬に曝露する段階；ならびにc) 該標的核酸の有無を検出する段階。
【請求項２１】
曝露する段階が20サイクル以下のポリメラーゼ連鎖反応を行う段階を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試薬が逆転写酵素、ポリメラーゼ、および5'ヌクレアーゼを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
5'ヌクレアーゼがFEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
逆転写酵素活性およびFEN-1エンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を含む酵素組成物を含むキット。
【請求項２５】
逆転写酵素を含む、請求項24記載のキット。
【請求項２６】
FEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項24記載のキット。
【請求項２７】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項24記載のキット。
【請求項２８】
逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応において、標的核酸が定量されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸配列を定量する方法。
【請求項２９】
定量により、試料中の細胞核酸配列の量に対する標的核酸配列の量が決定する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
アッセイ試薬が、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む、請求項28記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１１Ｄ】

【図１１Ｅ】

【図１１Ｆ】

【図１１Ｇ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【図１２Ｅ】

【図１２Ｆ】

【図１２Ｇ】

【公表番号】特表２００８−５１８６２１（Ｐ２００８−５１８６２１Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４００７２（Ｐ２００７−５４００７２）
【出願日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９９７７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５０４９９
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
２．ＷＩＮＤＯＷＳ
【出願人】（５００２２８７９１）サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Ｆターム（参考）】