下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
【課題】下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の判別を、より迅速且つ正確に行うために用いることが可能な、精製ＬＰＳ、固相、方法及びキット等を提供する。
【解決手段】リポ多糖が固着された固相を提供する。また、複数種類のリポ多糖が、同一固相上に個別に固着されている固相を提供する。下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法を提供する。
工程１：請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相に固着されたリポ多糖に、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記リポ多糖と上記血清中に含まれる抗リポ多糖抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【解決手段】リポ多糖が固着された固相を提供する。また、複数種類のリポ多糖が、同一固相上に個別に固着されている固相を提供する。下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法を提供する。
工程１：請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相に固着されたリポ多糖に、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記リポ多糖と上記血清中に含まれる抗リポ多糖抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別に用いることができる固相、方法及びキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に、本明細書において用いる略号を示す。
ＬＰＳ：リポ多糖
下痢原性大腸菌感染症は、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌、腸管侵入性大腸菌等の大腸菌の感染により発症する感染症として知られており、下痢、水溶性便、血便、溶血性尿毒症症候群（以下、「ＨＵＳ」と略記する）、急性腸炎、腹痛、発熱、嘔吐等の症状が現れることがあることから問題となっている。
【０００３】
一方、上記のような大腸菌の細菌外膜は、それぞれその血清型によって異なる構造を有するＬＰＳによって構成されており、一般に上記のような大腸菌がヒト等の動物に感染すると、当該動物の血清中に上記ＬＰＳに対して特異的な抗体が産生されることが一般に知られている。
【０００４】
従来より、上記のようなメカニズムにより血清中に産生される抗体を、免疫学的測定方法により検出することにより、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別する方法等が知られていた。
【０００５】
特許文献１には、標的生物由来の異なるポリペプチドが各位置に配置されているアレイが開示されている。そして標的生物の一例として、下痢原性大腸菌が挙げられている。しかし、ＬＰＳが配置されているアレイについては開示も示唆もない。
【０００６】
下痢原性大腸菌感染症においては、極めて迅速且つ正確に感染した大腸菌の血清型を判別することが望ましいため、より効率的で確実性の高い下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別することが可能な方法が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５１５７５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の判別を、より迅速且つ正確に行うために用いることが可能な、精製ＬＰＳ、固相、方法及びキット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＬＰＳを固着させた固相を用いることにより、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の判別を効率的で迅速に、且つ高い正確度で行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、下記のものを提供する。
（１）ＬＰＳが固着された固相（以下、「本発明固相」という）。
（２）複数種類のＬＰＳが、同一固相上に個別に固着されていることを特徴とする、上記（１）に記載の固相。
（３）ＬＰＳが、下記の群から選択されるＯ血清型により分類される、１又は２以上の大腸菌に由来するものである、上記（１）又は（２）に記載の固相；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
（４）下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法（以下、「本発明判別方法」という）。
工程１：本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
（５）判別される大腸菌の血清型がＯ血清型である、上記（４）に記載の判別方法。
（６）工程２における抗体が抗ＩｇＭ抗体である、上記（４）又は（５）に記載の判別方法。
（７）本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キット（以下、「本発明キット」という）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明判別方法によれば、非常に高い精度で下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別することができる。また本発明固相を用いることにより、本発明判別方法を行うことができる。また本発明判別キットを用いることにより、本発明判別方法をより効率的且つ簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明固相
本発明固相は、ＬＰＳが固着された固相である。
【００１３】
上記においてＬＰＳは、例えば大腸菌に例示されるグラム陰性菌から、熱フェノール法等の公知の方法により抽出することにより入手することができる。なお、本発明においてＬＰＳの由来は特に限定されないが、大腸菌であることが好ましい。また大腸菌のなかでも、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌及び腸管凝集性大腸菌、腸管侵入性大腸菌から選択される大腸菌であることがより好ましく、血清型がＯ血清型である大腸菌であることもより好ましく、なかでも下記の群より選択される１又は２以上の大腸菌であることが好ましい；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
【００１４】
また、本発明固相におけるＬＰＳは、その精製度等によって限定されるものではないが、後述する本発明精製ＬＰＳであることが好ましい。
【００１５】
なお本明細書においては、大腸菌に由来するＬＰＳを、Ｅｃ−ＬＰＳと略記する。
【００１６】
本発明固相において、ＬＰＳを固着させる固相としては、例えばプレート、メンブレン、ビーズ等の担体を用いることができる。
【００１７】
また本発明固相において、ＬＰＳを固相に固着させる方法については特に限定されないが、ＬＰＳを固着させる固相としてメンブレンを用いる場合、例えばＬＰＳをメンブレンにドットし（後述する実施例１及び図１を参照されたい）、適宜緩衝液等を用いてＬＰＳをメンブレン上に固定し、乾燥する方法等が例示される。
【００１８】
本発明固相において、固相に固着させるＬＰＳの種類は単数種類であってもよく、複数種類であってもよい。しかし、例えば本発明固相を後述する本発明判別方法において用いる場合、下痢原性大腸菌感染症が疑われる患者の血清中に存在するか、存在する可能性がある抗ＬＰＳ抗体が有する、異なる種類の血清型を有する複数の大腸菌由来のＬＰＳに対する反応の特異性を、迅速且つ効率的に確認することが望ましいく、このような場合においては、同一固相上に複数種類のＬＰＳを個別に固着させることが好ましい。ここで、複数種類とは、２種類以上である限りにおいて特に限定されないが、３種類以上であることが好ましく、５種類以上であることがより好ましく、１０種類以上であることが最も好ましい。
【００１９】
なお、上記において、同一固相上に複数種類のＬＰＳを「個別に」固着させるとの状態としては、複数種類のＬＰＳが接触又は混合しない状態であれば特に限定されない。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２０】
本発明固相は、これを用いる方法によって限定されるものではないが、例えば後述する本発明判別方法の工程１における固相として、又は後述する本発明判別キットの構成成分として用いることができる。
＜２＞本発明判別方法
本発明判別方法は、下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法である。
工程１：本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【００２１】
上記において、「本発明固相」及び「ＬＰＳ」なる用語、ＬＰＳを本発明固相に固着させる方法については、上記＜１＞本発明固相におけるこれらの説明を参照されたい。
【００２２】
工程１においては、本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる。
【００２３】
一般に、ヒト等の動物が下痢原性大腸菌に感染すると、下痢、水溶性便、血便、ＨＵＳ、急性腸炎、腹痛、発熱、嘔吐等の症状が現れることが知られている。上記において「下痢原性大腸菌感染症が疑われる」状態の例としては、例えば上記に例示した症状の内、１又は２以上の症状が現れた状態が例示されるが、本発明判別方法においては、上記のような症状が無い場合であっても、何らかの理由により下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別を要する状態にある場合であれば、「下痢原性大腸菌感染症が疑われる」状態であると解されるものとする。また、上記の「動物」としては、例えばヒト、イヌ及びネコ等の哺乳動物が例示される。上記における「血清」は、このような動物から採取した血液を材料として用い、公知の方法により調製することにより得ることができる。
【００２４】
また、本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させる方法は、本発明固相に固着されたＬＰＳと、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体との間で結合反応が惹起され得る方法であれば特に限定されないが、例えばＬＰＳが固着された本発明固相表面に下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を添加し、好ましくは５分〜１時間、より好ましくは３０分程度インキュベートすることにより接触させることができる。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２５】
工程２においては、工程１において形成させた結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する。
【００２６】
上記において、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体としては、例えば抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＤ抗体及び抗ＩｇＥ抗体等の抗体が例示されるが、なかでも、より高い特異性で抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る、すなわち、血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体の種類を正確に判別することにつながるといった観点から、抗ＩｇＭ抗体が好ましい。さらに、抗ＩｇＭ抗体と、抗ＩｇＭ抗体以外の抗体（例えば抗ＩｇＡ抗体及び／又は抗ＩｇＧ抗体）を組み合わせて用いれば、より確実な判別を期待することができることからより好ましい。
【００２７】
また、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体は、例えばペルオキシダーゼ等の酵素等によって標識されていることが好ましい。このような抗体は、公知の方法により調製又は入手することができる。
【００２８】
上記において、工程１において形成させた結合体に、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体を接触させる方法は、工程１において形成させた結合体と、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体との間で免疫反応が惹起され得る方法である限りにおいて特に限定されないが、例えば工程１を行った後の固相表面に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を含む溶液を添加し、好ましくは５分〜１時間、より好ましくは３０分程度インキュベートすることにより接触させることができる。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２９】
工程２においては、工程１において形成させた結合体と、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体との間で惹起される上記のような免疫反応に基づいて、上記結合体を検出する。ここでこのような免疫反応においては、例えば上述した工程１において形成される結合体の濃度の増加に応じて、検出されるシグナルが増強され場合、反応が惹起されていると判断することができる。
【００３０】
工程２における検出の方法については特に限定されないが、例えばＥＩＡ法及びＥＬＩＳＡ法等のエンザイムイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ法）及びラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等の標識イムノアッセイ、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、ラテックス凝集反応法、レーザーイムノアッセイ等の非標識イムノアッセイ法等に例示される公知の方法を適宜採用することができる。
【００３１】
本発明判別方法においては、工程２における検出において、特定のＯ血清型を有する大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において検出されるシグナルが、他のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において検出されるシグナルに比べてより強い場合、感染した大腸菌は、より強いシグナルが検出された上記の特定のＯ血清型を有する大腸菌である可能性が高いと判断することができる。さらに、このような判断においては、上述したように、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体を複数種類用いて各検出結果を得て、例えばこの複数の検出結果の内で最も強いシグナルが検出された部分を確認する等して各検出結果を総合的に判断することにより、感染した大腸菌の血清型として最も可能性が高いものを判断することが望ましい。
＜３＞本発明判別キット
本発明判別キットは、本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キットである。
【００３２】
上記において、「本発明固相」、「抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体」、「下痢原性大腸菌感染症」、「大腸菌の血清型の判別」に関する説明については、上記＜２＞本発明判別方法を参照されたい。
【００３３】
本発明判別キットは、本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体の他に、例えば、免疫学的測定において用いる反応バッファー、洗浄液及び発色試薬等をその他の構成成分として含んでいてもよい。
【００３４】
本発明判別キットを用いることにより、本発明判別方法をより効率的且つ簡便に行うことができる。なお、本発明判別キットを用いる具体的方法については、上記＜２＞本発明判別方法及び後述する実施例１を参照されたい。
＜４＞本発明精製ＬＰＳ
本発明精製ＬＰＳは、添付図面の図２のいずれかのレーンに示されるＳＤＳゲル電気泳動特性によって特徴付けられる、精製ＬＰＳである。
【００３５】
本発明精製ＬＰＳは、非常に純度が高いことをひとつの特徴としている。このような精製ＬＰＳは、例えば後述する実施例１記載の方法により大腸菌からＬＰＳを抽出することにより得ることができる。
【００３６】
なお、本発明精製ＬＰＳは、その使用方法によって限定されるものではないが、例えば、上記＜１＞本発明固相におけるＬＰＳ、又は上記＜２＞本発明判別方法の工程１におけるＬＰＳとして、好適に用いることができる。より具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００３８】
（１）Ｅｃ−ＬＰＳ固着化メンブレンの作製
後述する表４に掲載した血清型を有する各大腸菌５８種を、それぞれ３７℃、約１５〜２０時間、Ｇｍｅｉｎｅｒ培地にて培養した。培養した大腸菌を集菌し、蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥した。乾燥菌体を４５％フェノール水溶液に溶解し、６８℃、２０分間加熱攪拌した後、室温まで冷却した。溶液を２５００rpm、２０分間遠心して水画分を除き、フェノール画分に等量の蒸留水を加えて再度抽出を行った。得られた水画分を集めて透析チューブに入れ、毎日水を交換しながら３日間透析を行った。透析後、内容物を凍結乾燥して粗ＬＰＳを得た。この粗ＬＰＳを１０mg/mlの濃度で蒸留水に溶解し、１０万xg、３時間で超遠心した。沈殿物に蒸留水適量を加えて溶解し、再度超遠心を行い、沈殿物を凍結乾燥して精製ＬＰＳを得た。
【００３９】
上記の精製ＬＰＳを、１０μｇ/mlとなる様に0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し、そのうち５０μｌをＰＶＤＦメンブレン（日本ミリポア社製）にスポットした。このメンブレンを、５％ ＴｗｅｅｎＸ２０−リン酸緩衝化生理食塩水（以下、「リン酸緩衝化生理食塩水」を「ＰＢＳ」、「５％ ＴｗｅｅｎＸ２０−リン酸緩衝化生理食塩水」を「洗浄液」と略記する）で２回洗浄した後、３％ スキムミルク（Difco社製）−ＰＢＳをメンブレンにマウントした。室温で３０分静置した後、これを再度洗浄液で洗浄し、乾燥、保存した。
【００４０】
なお、固相に対してＥｃ−ＬＰＳをスポットするステップを図１に、上記において抽出したＥｃ−ＬＰＳを、常法によりＳＤＳゲル電気泳動し、糖質に特異的なＨｉｔｃｈｃｏｃｋ銀染色を行った結果を図２に示す。また、上記のＥｃ−ＬＰＳと市販の抗血清との反応性を、ウェスタンブロット法により確認した結果を図３に、ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を表１に示す。また、上記のＥｃ−ＬＰＳと患者血清との反応性を、ウェスタンブロット法により確認した結果を図４に、ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を表２に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表中、＋は反応が確認されたことを、−は反応が確認されなかったことを示す。また+の数が多い程、強い反応が確認されたことを示す（以下の表２においても同様）。
【００４３】
【表２】
【００４４】
なお、表中の血清番号１、２−１及び２−２、３−１〜３−３、４−１及び４−２、５−１及び５−２、６−１及び６−２は、それぞれ表３における患者No.１、２、３、４、５、６より採取した血清であることを示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
＊１ 採血から本実施例を行うに至るまでの日数を示す。
＊２ 便より分離した大腸菌の同定により判別した血清型を示す。
（２）下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別
上記（１）で作製したＥｃ−ＬＰＳ固着化メンブレン上のＬＰＳを固着させた部分に、ヒト血清 約３０μｌを３％スキムミルク−ＰＢＳ ３ｍｌに希釈したものをマウントし、室温で３０分間静置した。これを洗浄液で２回洗浄した後、ペロキシダーゼラベル二次抗体（抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、それぞれDako社製。）６μｌを３％スキムミルクーＰＢＳに希釈したものをマウントし、室温で３０分間静置した。これを洗浄液で４回洗浄した後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いて発色させた後、再度洗浄液で４回洗浄を行い、乾燥させた。以上のようにして、各血清中の抗ＬＰＳ抗体を検出した。
【００４７】
検出結果を示す写真の一部を図５及び図６に示す。なお、上記の血清の由来である患者のデータについては表３を参照されたい。また、図５及び図６中の各スポットに固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
検出結果を基にして血清型の判別を行った結果を表３の血清型＊３に示す。以下に、判別に至るまでの詳細を具体的に示す。
【００５０】
図５及び図６から明らかなように、血清No.３、５、６、７については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、さらに血清No.７については、加えて抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５７である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において非常に強いシグナルが検出されたことから、上記の各血清の由来である患者（患者No. ３、５、６、７）に感染した大腸菌の血清型がＯ１５７である可能性が高いことが判別された。
【００５１】
また、血清No.９については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ２６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出され、さらに上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ２６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.９に感染した大腸菌の血清型がＯ２６である可能性が高いことが判別された。
【００５２】
また、血清No.１１については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１１に感染した大腸菌の血清型がＯ１５０である可能性が高いことが判別された。
【００５３】
また、血清No.１２及び２１については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１３６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出されたことから、患者No.１２及び２１に感染した大腸菌の血清型がＯ１３６である可能性が高いことが判別された。
【００５４】
また、血清No.１５については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１２１である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出されたことから、患者No.１５に感染した大腸菌の血清型がＯ１２１である可能性が高いことが判別された。
【００５５】
また、血清No.１８については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５３である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出され、また上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１５３である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、さらに抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、比較的に弱いシグナルではあるが、上記部分に対して高い特異性を有するシグナルが検出されたたことから（上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されなかった）、患者No.１８に感染した大腸菌の血清型がＯ１５３である可能性が高いことが判別された。
【００５６】
また、血清No.２０については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出されたことから、患者No.２０に感染した大腸菌の血清型がＯ１５０である可能性が高いことが判別された。
【００５７】
また、血清No.１３については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ２５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において、比較的に弱いシグナルではあるが、上記部分に対して高い特異性を有するシグナルが検出されたたことから（上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されなかった）、患者No.１３に感染した大腸菌の血清型がＯ２５である可能性が高いことが判別された。
【００５８】
また、血清No.１６については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１６に感染した大腸菌の血清型がＯ１６６である可能性が高いことが判別された。
【００５９】
また、血清No.１７については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１１５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１１５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１７に感染した大腸菌の血清型がＯ１１５である可能性が高いことが判別された。
【００６０】
また、血清No.１９については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合、及び抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出されたことから、患者No.１９に感染した大腸菌の血清型がＯ１６６である可能性が高いことが判別された。
【００６１】
なお、血清No.７、９については、表３に示したように、便より分離した大腸菌の同定により判別した血清型と、本実施例の方法により判別した血清型が一致することを確認した。これは本発明判別方法の正確性が高いことを裏付けている。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】固相に対してＥｃ−ＬＰＳをドットするステップを示す図である。
【図２】抽出したＥｃ−ＬＰＳを常法によりＳＤＳゲル電気泳動し、糖質に特異的なＨｉｔｃｈｃｏｃｋ銀染色を行った結果を示す。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図３】抽出したＥｃ−ＬＰＳのウェスタンブロット法による市販の抗血清との反応性を示す図である。図中、anti-O26、anti-O55、anti-O86、anti-O103、anti-111、anti-119、anti-128、anti-142、anti-157は、用いた市販の抗血清の種類を示す。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図４】抽出したＥｃ−ＬＰＳのウェスタンブロット法による患者血清との反応性を示す図である。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図５】血清型の判別結果を示す。図の上部に記載した、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡは、用いた２次抗体がそれぞれ、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体であることを示す。なお、行番号と列番号によって特定される各部分に固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型は表４に示したので参照されたい。
【図６】血清型の判別結果を示す。図の上部に記載した、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡは、用いた２次抗体がそれぞれ、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体であることを示す。なお、行番号と列番号によって特定される各部分に固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型は表４に示したので参照されたい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別に用いることができる固相、方法及びキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に、本明細書において用いる略号を示す。
ＬＰＳ：リポ多糖
下痢原性大腸菌感染症は、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌、腸管侵入性大腸菌等の大腸菌の感染により発症する感染症として知られており、下痢、水溶性便、血便、溶血性尿毒症症候群（以下、「ＨＵＳ」と略記する）、急性腸炎、腹痛、発熱、嘔吐等の症状が現れることがあることから問題となっている。
【０００３】
一方、上記のような大腸菌の細菌外膜は、それぞれその血清型によって異なる構造を有するＬＰＳによって構成されており、一般に上記のような大腸菌がヒト等の動物に感染すると、当該動物の血清中に上記ＬＰＳに対して特異的な抗体が産生されることが一般に知られている。
【０００４】
従来より、上記のようなメカニズムにより血清中に産生される抗体を、免疫学的測定方法により検出することにより、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別する方法等が知られていた。
【０００５】
特許文献１には、標的生物由来の異なるポリペプチドが各位置に配置されているアレイが開示されている。そして標的生物の一例として、下痢原性大腸菌が挙げられている。しかし、ＬＰＳが配置されているアレイについては開示も示唆もない。
【０００６】
下痢原性大腸菌感染症においては、極めて迅速且つ正確に感染した大腸菌の血清型を判別することが望ましいため、より効率的で確実性の高い下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別することが可能な方法が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５１５７５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の判別を、より迅速且つ正確に行うために用いることが可能な、精製ＬＰＳ、固相、方法及びキット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＬＰＳを固着させた固相を用いることにより、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の判別を効率的で迅速に、且つ高い正確度で行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、下記のものを提供する。
（１）ＬＰＳが固着された固相（以下、「本発明固相」という）。
（２）複数種類のＬＰＳが、同一固相上に個別に固着されていることを特徴とする、上記（１）に記載の固相。
（３）ＬＰＳが、下記の群から選択されるＯ血清型により分類される、１又は２以上の大腸菌に由来するものである、上記（１）又は（２）に記載の固相；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
（４）下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法（以下、「本発明判別方法」という）。
工程１：本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
（５）判別される大腸菌の血清型がＯ血清型である、上記（４）に記載の判別方法。
（６）工程２における抗体が抗ＩｇＭ抗体である、上記（４）又は（５）に記載の判別方法。
（７）本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キット（以下、「本発明キット」という）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明判別方法によれば、非常に高い精度で下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型を判別することができる。また本発明固相を用いることにより、本発明判別方法を行うことができる。また本発明判別キットを用いることにより、本発明判別方法をより効率的且つ簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明固相
本発明固相は、ＬＰＳが固着された固相である。
【００１３】
上記においてＬＰＳは、例えば大腸菌に例示されるグラム陰性菌から、熱フェノール法等の公知の方法により抽出することにより入手することができる。なお、本発明においてＬＰＳの由来は特に限定されないが、大腸菌であることが好ましい。また大腸菌のなかでも、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌及び腸管凝集性大腸菌、腸管侵入性大腸菌から選択される大腸菌であることがより好ましく、血清型がＯ血清型である大腸菌であることもより好ましく、なかでも下記の群より選択される１又は２以上の大腸菌であることが好ましい；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
【００１４】
また、本発明固相におけるＬＰＳは、その精製度等によって限定されるものではないが、後述する本発明精製ＬＰＳであることが好ましい。
【００１５】
なお本明細書においては、大腸菌に由来するＬＰＳを、Ｅｃ−ＬＰＳと略記する。
【００１６】
本発明固相において、ＬＰＳを固着させる固相としては、例えばプレート、メンブレン、ビーズ等の担体を用いることができる。
【００１７】
また本発明固相において、ＬＰＳを固相に固着させる方法については特に限定されないが、ＬＰＳを固着させる固相としてメンブレンを用いる場合、例えばＬＰＳをメンブレンにドットし（後述する実施例１及び図１を参照されたい）、適宜緩衝液等を用いてＬＰＳをメンブレン上に固定し、乾燥する方法等が例示される。
【００１８】
本発明固相において、固相に固着させるＬＰＳの種類は単数種類であってもよく、複数種類であってもよい。しかし、例えば本発明固相を後述する本発明判別方法において用いる場合、下痢原性大腸菌感染症が疑われる患者の血清中に存在するか、存在する可能性がある抗ＬＰＳ抗体が有する、異なる種類の血清型を有する複数の大腸菌由来のＬＰＳに対する反応の特異性を、迅速且つ効率的に確認することが望ましいく、このような場合においては、同一固相上に複数種類のＬＰＳを個別に固着させることが好ましい。ここで、複数種類とは、２種類以上である限りにおいて特に限定されないが、３種類以上であることが好ましく、５種類以上であることがより好ましく、１０種類以上であることが最も好ましい。
【００１９】
なお、上記において、同一固相上に複数種類のＬＰＳを「個別に」固着させるとの状態としては、複数種類のＬＰＳが接触又は混合しない状態であれば特に限定されない。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２０】
本発明固相は、これを用いる方法によって限定されるものではないが、例えば後述する本発明判別方法の工程１における固相として、又は後述する本発明判別キットの構成成分として用いることができる。
＜２＞本発明判別方法
本発明判別方法は、下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法である。
工程１：本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【００２１】
上記において、「本発明固相」及び「ＬＰＳ」なる用語、ＬＰＳを本発明固相に固着させる方法については、上記＜１＞本発明固相におけるこれらの説明を参照されたい。
【００２２】
工程１においては、本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記ＬＰＳと上記血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体とからなる結合体を形成させる。
【００２３】
一般に、ヒト等の動物が下痢原性大腸菌に感染すると、下痢、水溶性便、血便、ＨＵＳ、急性腸炎、腹痛、発熱、嘔吐等の症状が現れることが知られている。上記において「下痢原性大腸菌感染症が疑われる」状態の例としては、例えば上記に例示した症状の内、１又は２以上の症状が現れた状態が例示されるが、本発明判別方法においては、上記のような症状が無い場合であっても、何らかの理由により下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別を要する状態にある場合であれば、「下痢原性大腸菌感染症が疑われる」状態であると解されるものとする。また、上記の「動物」としては、例えばヒト、イヌ及びネコ等の哺乳動物が例示される。上記における「血清」は、このような動物から採取した血液を材料として用い、公知の方法により調製することにより得ることができる。
【００２４】
また、本発明固相に固着されたＬＰＳに、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させる方法は、本発明固相に固着されたＬＰＳと、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体との間で結合反応が惹起され得る方法であれば特に限定されないが、例えばＬＰＳが固着された本発明固相表面に下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を添加し、好ましくは５分〜１時間、より好ましくは３０分程度インキュベートすることにより接触させることができる。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２５】
工程２においては、工程１において形成させた結合体に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する。
【００２６】
上記において、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体としては、例えば抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＤ抗体及び抗ＩｇＥ抗体等の抗体が例示されるが、なかでも、より高い特異性で抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る、すなわち、血清中に含まれる抗ＬＰＳ抗体の種類を正確に判別することにつながるといった観点から、抗ＩｇＭ抗体が好ましい。さらに、抗ＩｇＭ抗体と、抗ＩｇＭ抗体以外の抗体（例えば抗ＩｇＡ抗体及び／又は抗ＩｇＧ抗体）を組み合わせて用いれば、より確実な判別を期待することができることからより好ましい。
【００２７】
また、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体は、例えばペルオキシダーゼ等の酵素等によって標識されていることが好ましい。このような抗体は、公知の方法により調製又は入手することができる。
【００２８】
上記において、工程１において形成させた結合体に、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体を接触させる方法は、工程１において形成させた結合体と、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体との間で免疫反応が惹起され得る方法である限りにおいて特に限定されないが、例えば工程１を行った後の固相表面に、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を含む溶液を添加し、好ましくは５分〜１時間、より好ましくは３０分程度インキュベートすることにより接触させることができる。具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００２９】
工程２においては、工程１において形成させた結合体と、抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体との間で惹起される上記のような免疫反応に基づいて、上記結合体を検出する。ここでこのような免疫反応においては、例えば上述した工程１において形成される結合体の濃度の増加に応じて、検出されるシグナルが増強され場合、反応が惹起されていると判断することができる。
【００３０】
工程２における検出の方法については特に限定されないが、例えばＥＩＡ法及びＥＬＩＳＡ法等のエンザイムイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ法）及びラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等の標識イムノアッセイ、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、ラテックス凝集反応法、レーザーイムノアッセイ等の非標識イムノアッセイ法等に例示される公知の方法を適宜採用することができる。
【００３１】
本発明判別方法においては、工程２における検出において、特定のＯ血清型を有する大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において検出されるシグナルが、他のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において検出されるシグナルに比べてより強い場合、感染した大腸菌は、より強いシグナルが検出された上記の特定のＯ血清型を有する大腸菌である可能性が高いと判断することができる。さらに、このような判断においては、上述したように、抗ＬＰＳ抗体に対して結合し得る抗体を複数種類用いて各検出結果を得て、例えばこの複数の検出結果の内で最も強いシグナルが検出された部分を確認する等して各検出結果を総合的に判断することにより、感染した大腸菌の血清型として最も可能性が高いものを判断することが望ましい。
＜３＞本発明判別キット
本発明判別キットは、本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キットである。
【００３２】
上記において、「本発明固相」、「抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体」、「下痢原性大腸菌感染症」、「大腸菌の血清型の判別」に関する説明については、上記＜２＞本発明判別方法を参照されたい。
【００３３】
本発明判別キットは、本発明固相及び抗ＬＰＳ抗体に結合し得る抗体の他に、例えば、免疫学的測定において用いる反応バッファー、洗浄液及び発色試薬等をその他の構成成分として含んでいてもよい。
【００３４】
本発明判別キットを用いることにより、本発明判別方法をより効率的且つ簡便に行うことができる。なお、本発明判別キットを用いる具体的方法については、上記＜２＞本発明判別方法及び後述する実施例１を参照されたい。
＜４＞本発明精製ＬＰＳ
本発明精製ＬＰＳは、添付図面の図２のいずれかのレーンに示されるＳＤＳゲル電気泳動特性によって特徴付けられる、精製ＬＰＳである。
【００３５】
本発明精製ＬＰＳは、非常に純度が高いことをひとつの特徴としている。このような精製ＬＰＳは、例えば後述する実施例１記載の方法により大腸菌からＬＰＳを抽出することにより得ることができる。
【００３６】
なお、本発明精製ＬＰＳは、その使用方法によって限定されるものではないが、例えば、上記＜１＞本発明固相におけるＬＰＳ、又は上記＜２＞本発明判別方法の工程１におけるＬＰＳとして、好適に用いることができる。より具体的には後述する実施例１を参照されたい。
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００３８】
（１）Ｅｃ−ＬＰＳ固着化メンブレンの作製
後述する表４に掲載した血清型を有する各大腸菌５８種を、それぞれ３７℃、約１５〜２０時間、Ｇｍｅｉｎｅｒ培地にて培養した。培養した大腸菌を集菌し、蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥した。乾燥菌体を４５％フェノール水溶液に溶解し、６８℃、２０分間加熱攪拌した後、室温まで冷却した。溶液を２５００rpm、２０分間遠心して水画分を除き、フェノール画分に等量の蒸留水を加えて再度抽出を行った。得られた水画分を集めて透析チューブに入れ、毎日水を交換しながら３日間透析を行った。透析後、内容物を凍結乾燥して粗ＬＰＳを得た。この粗ＬＰＳを１０mg/mlの濃度で蒸留水に溶解し、１０万xg、３時間で超遠心した。沈殿物に蒸留水適量を加えて溶解し、再度超遠心を行い、沈殿物を凍結乾燥して精製ＬＰＳを得た。
【００３９】
上記の精製ＬＰＳを、１０μｇ/mlとなる様に0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に溶解し、そのうち５０μｌをＰＶＤＦメンブレン（日本ミリポア社製）にスポットした。このメンブレンを、５％ ＴｗｅｅｎＸ２０−リン酸緩衝化生理食塩水（以下、「リン酸緩衝化生理食塩水」を「ＰＢＳ」、「５％ ＴｗｅｅｎＸ２０−リン酸緩衝化生理食塩水」を「洗浄液」と略記する）で２回洗浄した後、３％ スキムミルク（Difco社製）−ＰＢＳをメンブレンにマウントした。室温で３０分静置した後、これを再度洗浄液で洗浄し、乾燥、保存した。
【００４０】
なお、固相に対してＥｃ−ＬＰＳをスポットするステップを図１に、上記において抽出したＥｃ−ＬＰＳを、常法によりＳＤＳゲル電気泳動し、糖質に特異的なＨｉｔｃｈｃｏｃｋ銀染色を行った結果を図２に示す。また、上記のＥｃ−ＬＰＳと市販の抗血清との反応性を、ウェスタンブロット法により確認した結果を図３に、ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を表１に示す。また、上記のＥｃ−ＬＰＳと患者血清との反応性を、ウェスタンブロット法により確認した結果を図４に、ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を表２に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
表中、＋は反応が確認されたことを、−は反応が確認されなかったことを示す。また+の数が多い程、強い反応が確認されたことを示す（以下の表２においても同様）。
【００４３】
【表２】
【００４４】
なお、表中の血清番号１、２−１及び２−２、３−１〜３−３、４−１及び４−２、５−１及び５−２、６−１及び６−２は、それぞれ表３における患者No.１、２、３、４、５、６より採取した血清であることを示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
＊１ 採血から本実施例を行うに至るまでの日数を示す。
＊２ 便より分離した大腸菌の同定により判別した血清型を示す。
（２）下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別
上記（１）で作製したＥｃ−ＬＰＳ固着化メンブレン上のＬＰＳを固着させた部分に、ヒト血清 約３０μｌを３％スキムミルク−ＰＢＳ ３ｍｌに希釈したものをマウントし、室温で３０分間静置した。これを洗浄液で２回洗浄した後、ペロキシダーゼラベル二次抗体（抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、それぞれDako社製。）６μｌを３％スキムミルクーＰＢＳに希釈したものをマウントし、室温で３０分間静置した。これを洗浄液で４回洗浄した後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を用いて発色させた後、再度洗浄液で４回洗浄を行い、乾燥させた。以上のようにして、各血清中の抗ＬＰＳ抗体を検出した。
【００４７】
検出結果を示す写真の一部を図５及び図６に示す。なお、上記の血清の由来である患者のデータについては表３を参照されたい。また、図５及び図６中の各スポットに固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型を表４に示す。
【００４８】
【表４】
【００４９】
検出結果を基にして血清型の判別を行った結果を表３の血清型＊３に示す。以下に、判別に至るまでの詳細を具体的に示す。
【００５０】
図５及び図６から明らかなように、血清No.３、５、６、７については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、さらに血清No.７については、加えて抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５７である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において非常に強いシグナルが検出されたことから、上記の各血清の由来である患者（患者No. ３、５、６、７）に感染した大腸菌の血清型がＯ１５７である可能性が高いことが判別された。
【００５１】
また、血清No.９については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ２６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出され、さらに上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ２６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.９に感染した大腸菌の血清型がＯ２６である可能性が高いことが判別された。
【００５２】
また、血清No.１１については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１１に感染した大腸菌の血清型がＯ１５０である可能性が高いことが判別された。
【００５３】
また、血清No.１２及び２１については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１３６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出されたことから、患者No.１２及び２１に感染した大腸菌の血清型がＯ１３６である可能性が高いことが判別された。
【００５４】
また、血清No.１５については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１２１である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出されたことから、患者No.１５に感染した大腸菌の血清型がＯ１２１である可能性が高いことが判別された。
【００５５】
また、血清No.１８については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５３である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出され、また上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においては比較的に微弱なシグナルしか検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１５３である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、さらに抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、比較的に弱いシグナルではあるが、上記部分に対して高い特異性を有するシグナルが検出されたたことから（上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されなかった）、患者No.１８に感染した大腸菌の血清型がＯ１５３である可能性が高いことが判別された。
【００５６】
また、血清No.２０については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１５０である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出されたことから、患者No.２０に感染した大腸菌の血清型がＯ１５０である可能性が高いことが判別された。
【００５７】
また、血清No.１３については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ２５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において、比較的に弱いシグナルではあるが、上記部分に対して高い特異性を有するシグナルが検出されたたことから（上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されなかった）、患者No.１３に感染した大腸菌の血清型がＯ２５である可能性が高いことが判別された。
【００５８】
また、血清No.１６については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１６に感染した大腸菌の血清型がＯ１６６である可能性が高いことが判別された。
【００５９】
また、血清No.１７については、特に抗ＩｇＧ抗体を２次抗体として用いた場合と、抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１１５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において比較的に強いシグナルが検出され、さらに特に抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合においては、上記以外のＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてはほとんどシグナルが検出されず、すなわちこの場合においては高い特異性で血清型がＯ１１５である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分においてシグナルが検出されたことから、患者No.１７に感染した大腸菌の血清型がＯ１１５である可能性が高いことが判別された。
【００６０】
また、血清No.１９については、特に抗ＩｇＭ抗体を２次抗体として用いた場合、及び抗ＩｇＡ抗体を２次抗体として用いた場合において、血清型がＯ１６６である大腸菌に由来するＥｃ−ＬＰＳを固着させた部分において強いシグナルが検出されたことから、患者No.１９に感染した大腸菌の血清型がＯ１６６である可能性が高いことが判別された。
【００６１】
なお、血清No.７、９については、表３に示したように、便より分離した大腸菌の同定により判別した血清型と、本実施例の方法により判別した血清型が一致することを確認した。これは本発明判別方法の正確性が高いことを裏付けている。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】固相に対してＥｃ−ＬＰＳをドットするステップを示す図である。
【図２】抽出したＥｃ−ＬＰＳを常法によりＳＤＳゲル電気泳動し、糖質に特異的なＨｉｔｃｈｃｏｃｋ銀染色を行った結果を示す。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図３】抽出したＥｃ−ＬＰＳのウェスタンブロット法による市販の抗血清との反応性を示す図である。図中、anti-O26、anti-O55、anti-O86、anti-O103、anti-111、anti-119、anti-128、anti-142、anti-157は、用いた市販の抗血清の種類を示す。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図４】抽出したＥｃ−ＬＰＳのウェスタンブロット法による患者血清との反応性を示す図である。各レーンの上部に示した数字は、各Ｅｃ−ＬＰＳのＯ血清型の番号を示す。
【図５】血清型の判別結果を示す。図の上部に記載した、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡは、用いた２次抗体がそれぞれ、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体であることを示す。なお、行番号と列番号によって特定される各部分に固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型は表４に示したので参照されたい。
【図６】血清型の判別結果を示す。図の上部に記載した、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡは、用いた２次抗体がそれぞれ、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体であることを示す。なお、行番号と列番号によって特定される各部分に固着されたＥｃ−ＬＰＳの由来の大腸菌の血清型は表４に示したので参照されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ多糖が固着された固相。
【請求項２】
複数種類のリポ多糖が、同一固相上に個別に固着されていることを特徴とする、請求項１に記載の固相。
【請求項３】
リポ多糖が、下記の群から選択されるＯ血清型により分類される、１又は２以上の大腸菌に由来するものである、請求項１又は２に記載の固相；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
【請求項４】
下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法。
工程１：請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相に固着されたリポ多糖に、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記リポ多糖と上記血清中に含まれる抗リポ多糖抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【請求項５】
判別される大腸菌の血清型がＯ血清型である、請求項４に記載の判別方法。
【請求項６】
工程２における抗体が抗ＩｇＭ抗体である、請求項４又は５に記載の判別方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相及び抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キット。
【請求項１】
リポ多糖が固着された固相。
【請求項２】
複数種類のリポ多糖が、同一固相上に個別に固着されていることを特徴とする、請求項１に記載の固相。
【請求項３】
リポ多糖が、下記の群から選択されるＯ血清型により分類される、１又は２以上の大腸菌に由来するものである、請求項１又は２に記載の固相；
Ｏ1、Ｏ25、Ｏ26、Ｏ63、Ｏ113、Ｏ125、、Ｏ125ac、Ｏ144、Ｏ153、Ｏ168、Ｏ3、Ｏ77、Ｏ114、Ｏ126、Ｏ145、Ｏ157、Ｏ169、Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ115、Ｏ127、Ｏ146、Ｏ158、Ｏ8、Ｏ28、Ｏ86、Ｏ117、Ｏ128、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ11、Ｏ29、Ｏ91、Ｏ119、Ｏ131、Ｏ149、Ｏ164、Ｏ15、Ｏ32、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ136、Ｏ150、Ｏ18、Ｏ44、Ｏ111、Ｏ111ab、Ｏ123、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ166、Ｏ20、Ｏ55、Ｏ112、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ167、Ｏ165。
【請求項４】
下記工程を少なくとも含むことを特徴とする、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別方法。
工程１：請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相に固着されたリポ多糖に、下痢原性大腸菌感染症が疑われる動物由来の血清を接触させ、上記リポ多糖と上記血清中に含まれる抗リポ多糖抗体とからなる結合体を形成させる工程。
工程２：上記結合体に、抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を接触させ、上記結合体を検出する工程。
【請求項５】
判別される大腸菌の血清型がＯ血清型である、請求項４に記載の判別方法。
【請求項６】
工程２における抗体が抗ＩｇＭ抗体である、請求項４又は５に記載の判別方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相及び抗リポ多糖抗体に結合し得る抗体を少なくとも構成成分として含む、下痢原性大腸菌感染症における大腸菌の血清型の判別キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−２５６２１４（Ｐ２００７−２５６２１４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８４２８６（Ｐ２００６−８４２８６）
【出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第１１回 日本エンドトキシン研究会 プログラム・講演抄録集」，平成１７年１１月１５日，日本エンドトキシン研究会 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｉｅｔｙｉｎｆｏ．ｊｐ／ｉｎｆｅｃｔ／ａｂｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｑｓ＝％９３Ｖ％９６％ＥＣ 平成１８年１月２３日掲載 「感染症学雑誌」第８０巻臨時増刊号，平成１８年３月２０日，社団法人日本感染症学会
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２４日（２００６．３．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 「第１１回 日本エンドトキシン研究会 プログラム・講演抄録集」，平成１７年１１月１５日，日本エンドトキシン研究会 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｉｅｔｙｉｎｆｏ．ｊｐ／ｉｎｆｅｃｔ／ａｂｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｑｓ＝％９３Ｖ％９６％ＥＣ 平成１８年１月２３日掲載 「感染症学雑誌」第８０巻臨時増刊号，平成１８年３月２０日，社団法人日本感染症学会
【出願人】（５０４４０９５４３）国立大学法人秋田大学 (210)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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