二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した方法
【課題】高い特異性で鋳型依存的反応を行う二重特異性オリゴヌクレオチド、二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供する。
【解決手段】二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）による多様な方法、及び３つの異なるＴｍ部位を含む二重特異性オリゴヌクレオチド。高混成化特異性及びミスマッチ許容性を有する二重特異性オリゴヌクレオチドの特徴を強調する。
【解決手段】二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）による多様な方法、及び３つの異なるＴｍ部位を含む二重特異性オリゴヌクレオチド。高混成化特異性及びミスマッチ許容性を有する二重特異性オリゴヌクレオチドの特徴を強調する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異性オリゴヌクレオチド（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用した多様な方法及び二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。より詳細には、本発明は、二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）による多様な方法及び二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅は、分子生物学分野で利用される多様な方法において必須的な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｉ．ら（ＷＯ ８９／０６７００）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に混成化させた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は、転写増幅システムを含む（Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３（１９８９）；及びＧｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８８／１０３１５）。
【０００３】
重合酵素連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知された、最もよく利用される拡散増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）。ＰＣＲに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡ鋳型の反対側鎖にアニーリングされるようにデザインされる。ＤＮＡ重合酵素によりプライマーは伸長されて、その伸長生成物は、次の過程で他のプライマーのための鋳型鎖として作用する。ＰＣＲ増幅過程は、ＤＮＡ断片の指数的増加を招来し、増幅されたＤＮＡ断片の長さは、オリゴヌクレオチドプライマーの５’−末端により決定される。
【０００４】
核酸増幅、特に、ＰＣＲ増幅における成功は、一つのプライマーが自分のターゲット配列のみにアニーリングする特異性に依存するため、上記の分子間相互作用を最適化することが重要である。プライマーが、それの完全な相補体のみにアニーリングするか、あるいは一つまたはそれ以上のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）ヌクレオチド配列を有する配列にもアニーリングするかは、アニーリング温度により決定され得る。一般に、アニーリング温度が高いと、完全なマッチ（ｍａｔｃｈ）鋳型に対するプライマーの特定アニーリング可能性がさらに高くなって、これにより、ターゲット配列だけが増幅される可能性がさらに高くなる。逆に、低いアニーリング温度では、鋳型とプライマー間のより多いミスマッチが発生する可能性がある。このような現象の観点で、アニーリング温度を調節すると、鋳型とプライマー間の結合特異性を変化させることができる。例えば、もし産物がなかったとしたら、アニーリングするには温度が高すぎた可能性がある。もし、一つのプライマーだけが存在する対照群において、多様な長さの生成物が発生したなら、このような結果は、前記単一プライマーが鋳型の一つ以上の部位にアニーリングしたことを示す。このような場合、アニーリング温度を上げることが好ましい。
【０００５】
アニーリング温度だけではなく、プライマー長、ＧＣ量、及びＰＣＲ生成物の長さのようなプライマーサーチパラメーター（ｐｒｉｍｅｒ ｓｅａｒｃｈ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は、プライマーのアニーリング特異性のために考慮すべきである。もし、上述のパラメーターを満足するプライマーを利用したら、プライマーアニーリングは特定化されて、ターゲットＤＮＡ増幅においてプライマーのアニーリング特異性は非常に改善され、プライマーにより招来されるバックグラウンド問題と非特異性生成物の問題が解決される。よくデザインされたプライマーは、非特異的アニーリング及びバックグラウンド問題を解決するだけではなく、ＲＮＡ−ＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡｓまたはゲノム鋳型を区別できるようにする。
【０００６】
プライマーアニーリング特異性を改善して、所望の生成物の増幅を可能にするために、様々な方法が開発された。例えば、タッチダウンＰＣＲ（Ｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ ＰＣＲ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｐｒｉｍｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，４００８）、ホットスタートＰＣＲ（ＤＡｑｕｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｂｙ ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈｅａｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，３７４９）、ネスティッドＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ，（１９８７）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０）、及びブースターＰＣＲ（Ｒｕａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｐｈａｓｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｄｉｌｕｔｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｖｉａ ｂｏｏｓｔｅｒ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，５４０７）がある。
【０００７】
他の接近方式も報告されているが、これらは、多様なエンハンサー化合物を利用してＰＣＲの特異性を改善する。エンハンサー化合物には、効果的なアニーリング反応温度を増加させる化学物質、ＤＮＡ結合蛋白質、商業的に利用可能な反応物質などが含まれる。しかしながら、全てのＰＣＲにおいて成功が保障できる魔術的な添加剤はなく、アニーリング温度のような多様な条件下で、他の添加物をテストすることは、非常に退屈な作業である。たとえ上述の接近方式は、プライマーアニーリング特異性を改善するにある程度寄与するとしても、上述の方法は、ＰＣＲ増幅に利用されるプライマーから招来される問題点、例えば、非特異的生成物及び高いバックグラウンドに対する根本的な解決策にはならない。
【０００８】
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野において多様な応用と方法に広く利用されており、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、分別ディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、知られたあるいは知られていない遺伝子のクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、アービトラリープライミング（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｉｎｇ）ＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング、ＰＣＲ関与ゲノム分析（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ，（２０００）ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ）がある。
【０００９】
たとえ各方法毎に、改善された接近方法が次々と紹介されているが、上述のように核酸増幅、特に、ＰＣＲ増幅過程を含むあらゆる方法及び技術は、利用されるプライマーの非特異性から引き起こされる制限と問題点、例えば、偽陽結果（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）、再現可能性の悪化、及び高いバックグラウンド問題から完全に自由になったわけではない。
【００１０】
一方、ＤＮＡ混成化は、分子生物学では基本的な過程であって、イオン強度、塩基組成、核酸分子が結合する断片の長さ、ミスマッチ程度、及び変性剤の存在により影響を受ける。このようなＤＮＡ混成化を利用した技術は、特異的核酸塩基配列決定に非常に有用であって、臨床診断、遺伝子関連研究、及び法医学的分析においても、非常に価値がある。例えば、Ｗａｌｌａｎｃｅ及び共同研究者らは、単一塩基変化のような微妙な配列差も、短いオリゴマー（例えば、１４−ｍｅｒ）を利用して十分区別でき、これが、β−グロビン遺伝子において、点突然変異の分子的分析においてどのように適用されるかを提示した（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，８７９−８９４；及びＣｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ β−ｇｌｏｂｉｎ ａｌｌｅｌｅ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２７８−２８２）。
【００１１】
相補的な鎖を正確に同定するオリゴヌクレオチド混成化方法の強力な力にも拘わらず、この技術は未だに限界に直面している。オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）は、長い核酸のハイブリッドより非常に不安定であって、これは、低い融解温度で反映される。ハイブリッドの不安定性は、オリゴヌクレオチド混成化をデザインする時に考慮される最も重要な要素の一つである。完全にマッチされる相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と、ただ一つの塩基がミスマッチされる相補体との安定性の差は、Ｔｍｓ（二重体融解温度）において、約０．５℃の差が発生する程度に非常に小さい。オリゴマーが短いほど（より複雑な混合物において、相補的な鎖の同定を可能にする）、単一塩基ミスマッチが全体二重体の安定性に及ぼす影響がさらに大きくなる。しかしながら、このような短いオリゴヌクレオチドの短所は、これらが完全に相補的な配列に対しても弱く混成化されるということである。したがって、このような点を考慮し、混成化は、減少された厳格条件で実施されなければならなく、これは結局、混成化の特異性を大いに減少させる結果を招来する。
【００１２】
オリゴヌクレオチド混成化の特異性を改善するための様々な試みがあった。高敏感性混成化のために、ＤＮＡ塩基を化学的に変性する方法（Ａｚｈｉｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１４６０−１１４６２（１９９３））、及びミスマッチを区別する能力を改善するために、混成化を低い温度で長時間実施した後、洗浄する方法（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：５２７−５３４（１９９０））が提案された。最近は、人為的なミスマッチを利用し、ＤＮＡ混成化において、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の区別程度を増加できる他の方法が紹介された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：３３１−５（１９９７））。また、米国特許第６，０７７，６６８号、第６，３２９，１４４号、第６，１４０，０５４号、第６，３５０，５８０号、第６，３０９，８２４号、第６，３４２，３５５号、及び第６，２６８，１２８号を含む多数の米国特許は、混成化のためのプローブ及びそれの応用に関して開示している。開発されたそれぞれの方法において、改善された接近が次々と紹介されているが、オリゴヌクレオチド混成化を含む全ての方法及び技術は、非特異的オリゴヌクレオチド混成化による制限及び問題から完全に自由ではない。
【００１３】
さらに、スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）及び基質上にオリゴヌクレオチドを固定化すること、そして最適混成化条件の樹立失敗などのような人為的な要因は、混成化のネガティブデータに影響を与える可能性がある。特に、間違った結果の影響は、高速スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得られた結果において大きく現れる。スポッティング及び混成化に内在する人為的な要因は、オリゴヌクレオチド−基盤のＤＮＡマイクロアレイの大きい短所となる。
【００１４】
また、向上された速度、敏感性、及び効率を有するＤＮＡ配列分析技術の開発は、生物学研究においても非常に重要である。２０余年前に開発された伝統的なＤＮＡ配列化方法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７４：５４６３−５４６７）は、追加的な応用分野において、速度及び費用の側面で制限があった。そのため、様々な新しい技術が提案された。有望な三つの方法には、混成化によるシーケンシング（Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１３５：３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒａｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：１１４−１２８（１９８９）；Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ／１０９７７（１９８９））、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）と切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）に基づいたｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．，９７：１６６５−１６７０（２０００））、及びパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：８４−８９（１９９６）； Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５（１９９８））などがある。前記技術において、シーケンシングの成功可否は、絶対的にシーケンシングプライマーのターゲット核酸に対する混成化特異性に依存する。シーケンシングプライマーの混成化特異性を考慮すると、現在の方法等は、シーケンシング反応を行うために入れる鋳型核酸の長さにおいて制限がある。一般に、シーケンシングプライマーの特異的混成化後、伸長するためには、好ましくは数百塩基対より小さい核酸鋳型を使用してシーケンシング反応が行われる。
【００１５】
しかしながら、進歩された研究のためには、増加された速度、敏感性、大容量化されたＤＮＡシーケンシングが、核酸鋳型の大きさにより制限されてはいけない。このような観点で、シーケンシングプライマーが高い特異性でターゲット核酸と混成化されたら、核酸鋳型のポピュレーションから一つのターゲット核酸の直接的なシーケンシングが可能である。
【００１６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者は、プライマーまたはプローブとして使用された従来のオリゴヌクレオチド、そして核酸混成化過程が含まれた数々の方法の問題点と短所を除去するために、より高い特異性で鋳型依存的反応を行う二重特異性オリゴヌクレオチドを発明し、オリゴヌクレオチド混成化またはアニーリングを含む様々な方法において、これの優れた応用性を究明した。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、１つのＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅させる方法を提供することにある。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、同一な反応において、２つ以上のプライマー対を使用し、同時に２つ以上のターゲットヌクレオチド配列を増幅する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、一つのＤＮＡまたは核酸混合物において核酸分子をシーケンシングするための方法を提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、遺伝的多様性を有する核酸分子を、鋳型依存的伸長反応により検出する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的は、二重特異性オリゴヌクレオチド−固定マイクロアレイを使用し、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出する方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のまた他の目的は、鋳型依存的伸長反応により、核酸分子を製造するための二重特異性オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【００２５】
本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が、オリゴヌクレオチド構造を通じて二重に決定されるようにする方法を提供することにある。
【００２６】
本発明のまた他の目的は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善させるための方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、（ａ）二重特異性オリゴヌクレオチドを利用した多様な方法、及び（ｂ）前記方法に利用される二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。本発明の二重特異性オリゴヌクレオチド（以下、“ＤＳ ｏｌｉｇｏ”という）は、改善された特異性でプライマーまたはプローブがターゲット核酸にアニーリングされるようにして、核酸増幅（特に、ＰＣＲ）の特異性及び混成化反応を大いに改善できるようにする。
【００２９】
二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳ ｏｌｉｇｏ）
本発明の一様態によると、本発明は、下記の一般式１で示されて、鋳型依存的伸長反応により核酸分子を合成するための二重特異性オリゴヌクレオチドを提供する：
［式１］
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’
Ｘｐは、混成化される鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する５’−高Ｔｍ特異性部位を示して、Ｙｑは、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Ｚｒは、鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位を示して、ｐ、ｑ、及びｒは、ヌクレオチドの個数であり、Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであって、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記鋳型核酸に対するアニーリング特異性側面において、前記５’−高Ｔｍ特異性部位が３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして、前記オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の両方ともにより決定され、前記オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加される。
【００３０】
ＤＳオリゴヌクレオチド（以下、“ＤＳ ｏｌｉｇｏ”という）を言及しながら使用される用語“二重特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）”は、ＤＳオリゴヌクレオチドの特徴を表現するための造語であって、ターゲット配列に対するＤＳオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が、分離された二つの部位、即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されることを意味する。一般に、プライマーまたはプローブのアニーリング特異性は、その連続する全体配列により支配される。その反面、ＤＳ ｏｌｉｇｏのアニーリング特異性は、分割部位により分離された二つの部位（５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位）により二重に決定されて、前記三つの部位は、一つのオリゴヌクレオチド配列内に位置する。このような二重特異性は、ＤＳ ｏｌｉｇｏがプライマー及びプローブとしてさらに高い特異性を示すようにして、これは、従来技術に対して、本発明が新規性及び進歩性を有するようにする。
【００３１】
一方、本発明者は、ＷＯ０３／０５０３０３に開示のように、アニーリング特異性を増加させるために、既にＡＣＰ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ）を開発したことがあり、前記特許文献の教示内容は、本明細書に参照として取り込まれる。本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、以下のような側面において、ＡＣＰと明らかに異なる：（ｉ）ＤＳ ｏｌｉｇｏは、ターゲット配列と混成化されるように、二つの特異性部位を有するが、ＡＣＰは、一つの特異性部位を有して；（ｉｉ）ＤＳ ｏｌｉｇｏにおける三つの部位は、Ｔｍ側面で明確に区別される反面、ＡＣＰにおける部位は、そうではなく；（ｉｉｉ）ＤＳプライマーは、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位部位とでアニーリングが発生する時にのみ、鋳型に相補的な核酸分子を合成するために伸長される反面、ＡＣＰは、３’−末端部位にアニーリングが発生する場合にも伸長されて；（ｉｖ）したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏの伸長または混成化特異性は、二つの分割された部位、即ち５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されるが、ＡＣＰの場合は、ただ３’−末端部位のみにより支配される。したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏのターゲット配列に対するアニーリングまたは混成化特異性は、ＡＰＣより遥かに大きく、これは、ＤＳ ｏｌｉｇｏがＡＣＰに対して新規且つ進歩的であることを示す。
【００３２】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの格別な特徴は、一つのオリゴヌクレオチド分子内に、区分される特徴を有する三つの部位を有することである：５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位。
【００３３】
ＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型依存的伸長反応を含む多様な方法と分析に有用である。本明細書に使用された用語“鋳型依存的伸長反応（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）”は、ターゲット配列に混成化されたオリゴヌクレオチド分子を伸長する反応を意味し、これは、オリゴヌクレオチドの末端に連続的なヌクレオチドを結合してなり、この場合伸長された配列は、相補的な鋳型配列により決定される。
【００３４】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの混成化（アニーリング）特異性を説明する原理の代表的な例は、図１Ａに示されている。図１Ａを参照すると、ＤＳ ｏｌｉｇｏがより詳細に説明される。
【００３５】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位のみが鋳型にアニーリングされる場合、前記部位は、鋳型依存的伸長のためのプライミング位置として作用できず、結局伸長反応が発生しない。
【００３６】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位は、非ターゲット配列にアニーリングされる反面、より短い配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位は、非ターゲット配列にアニーリングしない。その理由は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位は、アニーリング側面で、分割部位により分離されるからである。即ち、３’−低Ｔｍ特異性部位は、５’−高Ｔｍ特異性部位とは相対的に独立的な方式でアニーリングに関与し、３’−低Ｔｍ特異性部位のアニーリングは、５’−高Ｔｍ特異性部位のアニーリングによる影響をより少ししか受けない。このような脈絡で、３’−低Ｔｍ特異性部位が非ターゲット配列にアニーリングする可能性は、非常に低い。
【００３７】
３’−低Ｔｍ特異性部位のみが非ターゲット位置に相補的な配列を有する場合は、特定の高い厳格条件、例えば、５’−高Ｔｍ特異性部位のアニーリングのための厳格条件ではアニーリングが起こらない。好ましい具現例によると、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高いアニーリング温度を有する厳格条件下で、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用して鋳型依存的伸長反応を実施することが有利である。
【００３８】
５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位が両方とも鋳型に実質的に相補的な配列を有する場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏはその鋳型にアニーリングされることができて、これにより、成功的な伸長反応が発生する。
【００３９】
理論に拘束されずに判断すると、分割部位は、３’−低Ｔｍ特異性部位を、アニーリング条件（例えば、温度及び配列相補性）にさらに敏感になるようにすると判断される。したがって、３’−低Ｔｍ特異性部位と非ターゲット配列との間に非特異的混成化が生じる可能性は、特定アニーリング（または厳格）条件下でさらに低くなる。５’−高Ｔｍ特異性部位だけではなく、３’−低Ｔｍ特異性部位がそのターゲット配列にアニーリングされる場合、３’−低Ｔｍ特異性部位の３’−末端は、ＤＮＡ重合酵素により伸長される位置を作る。
【００４０】
本明細書で使用する用語“オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”は、天然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的に混成化できて、天然的に存在するかあるいは人為的に合成されるものである。オリゴヌクレオチドは、混成化において、最大効率のために、好ましくは一本鎖である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ，ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドも含むことができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、骨格変形されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−５６８（１９９３））、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホルアミデードＤＮＡ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ＤＮＡ）、アミド−連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ−連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡ及びメチルホスホン酸ＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ（ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ＤＮＡ）、及び塩基変形を有するヌクレオチド例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−含み）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−）、イノシン及びジアミノプリンを含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用される用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして適合な温度とｐＨの条件で、合成の開始点として作用できる。増幅の最大効率のために、好ましくは、プライマーは一本鎖である。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。本発明のプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ，ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
【００４２】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分長くなければならない。プライマーの適合した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）により決定される。用語、“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸に、オリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはそれの一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。本発明の用語“混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）”は、相補的な一本鎖核酸から二本鎖核酸を形成することを意味する。用語“アニーリング”と“混成化”とは同じ意味で、本明細書で混用される。
【００４３】
本明細書で使用された用語“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、ターゲットヌクレオチド配列に実質的に部位を含む一本鎖核酸分子である。
【００４４】
本発明において、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを言及しながら使用する用語“部位（ｐｏｒｔｉｏｎ）”は、分割部位により分離されるヌクレオチド配列を意味する。用語“５’−高Ｔｍ特異性部位（５’−ｈｉｇｈ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）”または用語“３’−低Ｔｍ特異性部位（３’−ｌｏｗ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）”は、それぞれ本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−末端と３’−末端におけるヌクレオチド配列を意味し、これは、分割部位により分離される。ＤＳ ｏｌｉｇｏを言及しながら使用する用語“５’−高Ｔｍ特異性部位”は、３つの部位のうち、最も高いＴｍを有して、鋳型核酸の一位置に対し実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する部位を意味する。ＤＳ ｏｌｉｇｏと関連し、“３’−低Ｔｍ特異性部位”は、５’−高Ｔｍ特異性部位よりは低いＴｍを有するが、分割部位よりは高いＴｍを有して、鋳型核酸の一位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する部位を意味する。
【００４５】
本発明で使用する用語“Ｔｍ”は、核酸二本鎖分子の半分が一本鎖となる溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を意味する。ＤＳ ｏｌｉｇｏの部位を言及しながら使用される用語“高Ｔｍ”及び“低Ｔｍ”は、絶対Ｔｍ値ではなく、相対Ｔｍ値を意味する。即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより相対的に高いことが要求されるだけである。
【００４６】
前記５’−高Ｔｍ特異性部位 と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化される鋳型核酸の一位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有するようにデザインされる。ＤＳ ｏｌｉｇｏと関連して使用される用語“実質的に相補的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”は、オリゴヌクレオチドが十分相補的であるため、指定されたアニーリング条件または厳格条件下で、選択的に鋳型核酸配列に混成化され得て、アニーリングされたオリゴヌクレオチドが重合酵素により伸長され、鋳型に相補的なコピーを形成することができることを意味する。したがって、この用語は、“完全に相補的な”またはこれに係わる用語とは異なる意味を有する。ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ＤＳ ｏｌｉｇｏがプライマーまたはプローブとして作用できる範囲内で、鋳型に対し一つ以上のミスマッチを有することができる。最も好ましくは、ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位は、鋳型の一位置に対して完全に相補的な、即ち、ミスマッチのないヌクレオチド配列を有する。
【００４７】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの成功的な実施のために、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高くなければならない。好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、４０〜８０℃、より好ましくは、４０〜７５℃、さらに好ましくは、５０〜６８℃、最も好ましくは、５０〜６５℃である。好ましくは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍは、１０〜４０℃、より好ましくは、１５〜４０℃、最も好ましくは、２０〜３５℃である。好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより少なくとも３℃高く、より好ましくは、少なくとも１０℃、さらに好ましくは、少なくとも１５℃、最も好ましくは、少なくとも２０℃高い。
有利にするためには、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより５〜７０℃高く、好ましくは、１０〜７０℃、より好ましくは、１０〜６０℃、さらに好ましくは、１０〜５０℃、よりさらに好ましくは、１０〜４０℃、最も好ましくは、２０〜４０℃高い。
【００４８】
好ましい具現例によると、５’−高Ｔｍ特異性部位は、３’−低Ｔｍ特異性部位より長い。５’−高Ｔｍ特異性部位は、好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド長を有して、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは、２０〜２５ヌクレオチド長を有する。３’−低Ｔｍ特異性部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチド長を有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１２ヌクレオチド長を有する。
【００４９】
少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの利点と特徴を決定する一つの要素である。本明細書で使用される用語、“ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）”は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基に対し、区別なく天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる塩基を意味する。
【００５０】
縮退性プライマーにおいて不確実な位置のヌクレオチドがユニバーサル塩基により置換されることは、公知のことであり、前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン（Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，２６０５−２６０８； Ｓａｋａｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，４８６３−４８６７）、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９，４９２−４９３）及び５−ニトロインドール（Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４０３９−４０４３）を含み、前記塩基は、４種の従来の塩基と非特異的に塩基対を成すため、縮退性プライマーのデザインに係わる問題点を解決するに利用される。しかしながら、このようなユニバーサル塩基が、アニーリング（混成化）または増幅の間にバブル構造を生成し、その時、二つの反対隣接した配列を分離するようにオリゴヌクレオチド分子において一つの部位を形成し、結局、二つの分割特異性（アニーリング）部分を通じて、二重特異性により、ターゲット配列にプライマーまたはプローブのアニーリング特異性を増加させることができるという研究は、未だにない。
【００５１】
好ましい具現例によると、分割部位の前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記ユニバーサル塩基または非区別性塩基類似体は、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、または５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【００５２】
分割部位において、前記ユニバーサル塩基は、連続的な方式により含まれるか、またはｄＮＭＰｓのような他のヌクレオチドと共に間欠的に含まれる。好ましくは、前記分割部位は、ユニバーサル塩基、好ましくは、デオキシイノシンを有するヌクレオチドの連続配列を含む。
【００５３】
ＤＳ ｏｌｉｇｏにおいて、分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有することが必須的であって、これにより、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、分割部位は非塩基対バブル構造を形成し、鋳型核酸に対するアニーリング特異性側面で、５’−高Ｔｍ特異性部位は３’−低Ｔｍ特異性部位から分離され、結局前記オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定され、オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が非常に改善される。好ましくは、分割部位のＴｍは、３〜１５℃であり、より好ましくは、４〜１５℃であって、最も好ましくは、５〜１０℃である。
【００５４】
好ましい具現例によると、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間の分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基を含み、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基を、そして最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を含む。好ましい具現例によると、前記分割部位は、２〜１０個のユニバーサル塩基を含み、より好ましくは、３〜１０個のユニバーサル塩基を、さらに好ましくは、４〜８個のユニバーサル塩基を、最も好ましくは、５〜７個のユニバーサル塩基を含む。
【００５５】
より長い配列を有するプライマーまたはプローブが必要な場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏの利点は、最も著しい。例えば、従来技術によると、混成化配列として３５ｂｐ以上のヌクレオチド配列を有するプライマーは、非特異的増幅物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生成しやすい。その反面、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、長い配列を有する場合も、特異的増幅物のみを生成するが、その理由は、ＤＳ ｏｌｉｇｏが鋳型との相互作用（即ち、アニーリング）側面で、それぞれ分離された２つの混成化配列（即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位）を有するからである。例えば、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、ターゲット配列に相補的な３５〜４５ｂｐの混成化配列を含むことができる。このような観点から、本発明は、従来プライマーデザイン戦略では非実用的であるとみなされる、より長い配列を有するプライマーをデザインできるようにするということが分かる。
【００５６】
好ましい具現例によると、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド長、そして前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、３〜１５ヌクレオチド長を有する。
【００５７】
より好ましくは、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド長、及び前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、５〜１５ヌクレオチド長を有する。最も好ましくは、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、５〜７ヌクレオチド長、そして前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、６〜１０ヌクレオチド長を有する。実施例に説明された典型的且つ例示的なＤＳ ｏｌｉｇｏによると、５’−高Ｔｍ特異性部位は、約２０ヌクレオチド長であり、分割部位は、約５ヌクレオチド長であって、３’−低Ｔｍ特異性部位は、約８〜１０ヌクレオチド長である。
【００５８】
最も好ましい具現例において、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、次の一般式で示される：５’−Ｘｐ−（ｄＩ）ｑ−Ｚｒ−３’（Ｘｐ及びＺｒの定義及び特徴は、上述のようであり、ｄＩは、デオキシイノシンを、（ｄＩ）ｑは、ユニバーサル塩基を有するヌクレオチドの連続配列を含む分割部位を示し、ｑは、５〜７の整数である）。
【００５９】
面白いことは、ターゲット配列に対するミスマッチを許容（ｔｏｌｅｒａｔｅ）する厳格条件下で、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、ミスマッチ許容性を有するということである。
【００６０】
ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性を支配する原理に対する構造的代表例は、図１Ｂに示されている。５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とのいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で、５’−高Ｔｍ特異性部位では、１個以上、好ましくは１個〜３個の塩基ミスマッチが許容される。３’−低Ｔｍ特異性部位では、１個以上、好ましくは１個〜２個の塩基ミスマッチが、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とのいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で許容され得る。また、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位のいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位では１個以上、好ましくは、１個〜５個の塩基ミスマッチが許容され得る。
【００６１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏにミスマッチ許容性を付加するために、アニーリング条件、特にアニーリング温度が重要である。３’−低Ｔｍ特異性部位単独によってはアニーリングが発生しない条件でアニーリングが実施されて、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位がターゲット位置に対して一つ以上（しかし制限された数）のミスマッチ塩基を有する場合、全ての部位によるアニーリングが発生する。ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を有するヌクレオチド配列を増幅するか検出するために要求される。ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を示すターゲット配列にアニーリングできて、結局成功的な増幅と目的のヌクレオチドを検出できるようにする。即ち、もともとアニーリングと混成化の特異性を劇的に増加させるために開発されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、アニーリングまたは厳格条件が好適に調節される条件下で、ミスマッチ許容を要求する方法においても使用することができる。
【００６２】
本発明の他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性をオリゴヌクレオチドの構造により二重的に決定されるようにする方法を提供する：（ａ）ターゲット核酸配列を選択する段階、（ｂ）（ｉ）前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列と（ｉｉ）少なくとも二つのユニバーサル塩基を含む分割部位とを有するオリゴヌクレオチドの配列をデザインして、前記分割部位が前記混成化配列間に入り込み（ｉｎｔｅｒｖｅｎｅ）、前記オリゴヌクレオチドにおいて３つの部位を形成するようにする段階、そして（ｃ）前記分割部位の５’−方向側の部位は、分割部位の３’−方向側部位より高いＴｍを有して、前記分割部位が前記三つの部位のうち最も低いＴｍを有するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて前記分割部位の位置を決定する段階であって、これにより、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの５’−高Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、（ｉｉｉ）前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間の前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち最も低いＴｍを有して、互いに異なるＴｍ値を有する３つの区分された部位を有するオリゴヌクレオチドを提供して、上記の構成により、前記オリゴヌクレオチドのターゲット核酸に対するアニーリング特異性は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定される。
【００６３】
本方法は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を劇的に増加させて、ターゲット配列と混成化されるようにする新しい接近を提供する。また、本方法は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善するための方法として表現できる。さらに、本発明は、ターゲット配列に混成化されるオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善するために、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を使用する方法として表現できる。
【００６４】
本発明は、上述のＤＳ ｏｌｉｇｏを製造するために利用される。したがって、不要な重複記載を避けるために、共通内容は、その記載を省略するが、その共通内容は、本発明の方法の詳細な説明に取り込まれる。
【００６５】
プライマーやプローブをデザインするために、従来の大部分の方法は、ターゲット配列に混成化できる配列のみを使用する。また、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を増加させるために、従来は、温度とイオン濃度のような、増幅または混成化条件を調節した。
【００６６】
その反面、本発明の方法は、オリゴヌクレオチド自体に新しい特徴を導入することにより、アニーリング特異性を増加させる新しい戦略を提供する。オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が二重に決定できることと関連し、本明細書で使用される用語“オリゴヌクレオチド構造により（ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”は、アニーリング特異性が二重的に決定されるようにする新しい特徴をオリゴヌクレオチドに付与することにより、オリゴヌクレオチドの構造がオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性に大きく寄与することを意味する。
【００６７】
本発明の方法において、（ｉ）ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列及び（ｉｉ）少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有するオリゴヌクレオチドの配列をデザインすることが重要である。この段階において、前記オリゴヌクレオチドの構造輪郭は、５’−末端部位／分割部位／３’−末端部位として表れる。５’−末端及び３’−末端は、ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列を有して、分割部位がその間に入り込む（ｉｎｔｅｒｖｅｎｅ）。
【００６８】
本発明において最も重要な段階は、分割部位の５’−方向側の部位が分割部位の３’−方向側部位より高いＴｍを有して、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて前記分割部位の位置を決定する段階であって、これにより異なるＴｍ値を有する三つの区分された部位を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００６９】
本発明によりオリゴヌクレオチド内に挿入された新しい構造的特徴は、次のようである：（ｉ）オリゴヌクレオチド配列内の三つの区分された部位（５’−高Ｔｍ特異性部位、分割部位、及び３’−低Ｔｍ特異性部位）；（ｉｉ）三つの部位の互いに異なるＴｍ値；（ｉｉｉ）５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間に位置し、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位；（ｉｖ）分割部位によりアニーリング側面で分離され、アニーリング段階でターゲットと相互作用する２つの部位；（ｖ）５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位順のＴｍ値。このような構造的特徴は、本発明により最終的に提供されるオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重的に決定されるようにして、これは、ターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を大きく増加させる。
【００７０】
本発明の方法によりデザインされて製造されたオリゴヌクレオチドは、上述の三つの部位を有しないものに比べ、非常に高いアニーリング特異性を示す。
【００７１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの特徴と利点は、次のように説明できる：
（ａ）ＤＳ ｏｌｉｇｏの分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、これはＤＳ ｏｌｉｇｏにおいて最も低いＴｍを生成するようにして、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成するようにする。このような非塩基対バブル構造は、アニーリング特異性側面で５’−高Ｔｍ特異性部位が３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして；
（ｂ）５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、分割部位は、最も低いＴｍを有して、この特徴は、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが発生しない厳格条件を設定することを可能にして；
（ｃ）したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体的アニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されて；
（ｄ）結局、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体アニーリング特異性は、大いに増加される。
【００７２】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、多様な分野（ｉ）Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．方法（ＷＯ８９／０６７００）及びＤａｖｅｙ，Ｃ．ら（ＥＰ３２９，８２２）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９））、重合酵素リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ．，１：５−１６（１９９１）），ギャップ−ＬＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、復旧連鎖反応（ＥＰ４３９，１８２）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９））、及びＮＡＳＢＡ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３０，２３８）などのようなプライマー関連核酸増幅方法と、（ｉｉ）サイクルシーケンシング（Ｋｒｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：Ｓ１０７−Ｓ１１２）、及びパイロシーケンシング（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：８４−８９；及び（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５）などのようなプライマー伸長関連技術、及び（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用したターゲットヌクレオチド配列の探知のような混成化関連技術において、非常に有用である。
【００７３】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、多様な核酸増幅、シーケンシング及び混成化関連技術に適用できる。以下、ＤＳ ｏｌｉｇｏの応用性を立証する代表的な例を示す。
【００７４】
Ｉ．核酸分子の製造に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供する：
（ａ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位（５’−ｈｉｇｈ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）、３’−低Ｔｍ特異性部位（３’−ｌｏｗ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）、及び分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段階。
【００７５】
本発明の製造方法は、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを利用するため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００７６】
ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本発明の応用は、アニーリングと伸長段階を含む鋳型依存的伸長反応により、ターゲット配列に相補的な核酸配列を選択的に製造する、改善された方法を提供する。特に、ターゲット配列に相補的な核酸配列の製造は、アニーリング、伸長、及び変性過程を含む鋳型依存的伸長反応の過程を繰り返すことによりなされる。
【００７７】
本発明の方法は、鋳型核酸分子に相補的な核酸分子を製造するために使用できる。そのような分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。前記分子は、二本鎖または一本鎖の形態である。出発物質としての核酸が二本鎖である場合、二つの鎖を一本鎖に、または部分的な一本鎖形態にすることが好ましい。鎖を分離する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコキサル（ｇｌｙｃｏｘａｌ）処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質などを含むが、これに限定されるものではない。例えば、鎖分離は、８０〜１０５℃の温度で熱処理して達成できる。上述の処理を施すための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）から提供される。
【００７８】
ｍＲＮＡが出発物質として利用される場合、アニーリング段階を実施する前に逆転写段階が必要であり、逆転写段階の詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８））に開示されている。逆転写のために、ｍＲＮＡのポリＡテールに混成化できるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓからなっており、ｄＴプライマーがプライマーとして作用できる限り、その中の一つまたはそれ以上は、他のｄＮＭＰｓに代替できる。逆転写段階は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素をもって行える。ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、反応条件を注意して選択すれば、個別的なＲＮａｓｅ Ｈ切断段階を省略することができる。
【００７９】
本発明の方法は、鋳型核酸分子が特定配列または長さを有するように要求しない。特に、前記分子は、自然の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、化学的に合成されたまたは合成できる核酸分子を含む。したがって、前記核酸配列は、自然から発見されるかまたは発見されないものである。
【００８０】
本発明のために使用されるＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型の一部位に混成化またはアニーリングされて、二重鎖構造を形成する。このような二重鎖構造を形成するに好適なアニーリング条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に説明されている。
【００８１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の配列は、厳格な相補性を有する必要はなく、ただ配列に実質的に相補的であって安定的な二重鎖構造を形成できればよい。したがって、二重鎖構造を形成できる範囲内で、完全な相補性からの離脱が許容される。鋳型核酸の一位置に対するＤＳ ｏｌｉｇｏのアニーリングは、重合酵素による鋳型依存的重合反応のための前提条件である。ＤＳ ｏｌｉｇｏが相補的な核酸に塩基対を形成した要素（参照：Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））は、実質的にプライミング効率に影響を与える。ＤＳ ｏｌｉｇｏのヌクレオチド組成は、アニーリングが最適化される温度に影響を与え、結局プライミング効率に影響を及ぼすことになる。
【００８２】
アニーリング段階の間に、ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化部位または特異性決定位置（即ち、二重特異性決定位置）として重要な役割をするが、その反面、分割部位は、混成化位置としての役割をせず、鋳型と結合しない。
【００８３】
多様なＤＮＡ重合酵素が本発明の方法の伸長段階に使用でき、これは、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素、及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ重合酵素を含む。好ましくは、重合酵素は、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）を含む。重合反応を行う時、反応容器に、反応に必要な成分を過量に提供することが好ましい。増幅反応に必要な成分の過量は、増幅反応が成分の濃度に実質的に制限されない程度の量を意味する。Ｍｇ２＋のような助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを、所望の増幅程度が達成できる程度に反応混合物に提供することが望まれる。
【００８４】
本発明において、アニーリングまたは混成化は、ＤＳ ｏｌｉｇｏと鋳型核酸との間に特異的結合を可能にする厳格条件下で行われる。アニーリングのための厳格条件は、配列依存的であり、周囲環境的変数により多様である。本発明において、アニーリング段階は、一般に高い厳格条件下で実施される。しかしながら、もし本発明がミスマッチ許容を要求する方法に適用されたら、一つ以上（しかし、制限された数）のミスマッチにも拘らず５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型にアニーリングする厳格条件下でアニーリング段階を行うことが好ましい。そのようなミスマッチ許容は、遺伝的多様性を有する遺伝子の増幅または検出において、非常に有用である。厳格条件は、公知の基準から容易に決定できる。
【００８５】
アニーリング段階は、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高いアニーリング温度で実施し、３’−低Ｔｍ特異性部位のみによるアニーリングが発生しないようにすることが有利である。好ましくは、アニーリング温度は、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより少なくとも５℃、より好ましくは、少なくとも１０℃、さらに好ましくは、少なくとも１５℃、最も好ましくは、少なくとも２０℃高い。
【００８６】
好ましい具現例において、アニーリング温度は、４０〜７５℃、より好ましくは、４５〜７２℃、さらに好ましくは、５０〜６８℃、最も好ましくは、５５〜６５℃である。本発明に好適なアニーリング温度は、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍ値と３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍ値を独立的に考慮することにより決定できる。即ち、本発明のアニーリング温度は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の全体長さと全体ヌクレオチド組成により決定されるものではなく、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位の個別的長さとヌクレオチド組成により決定される。通常５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍ値のみを考慮してアニーリング温度を決定するようになり、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍ値より非常に高く、これが最適のものとなる。
【００８７】
アニーリング段階において、ミスマッチ許容が要求されたら、アニーリング温度を、上記で提示した温度より低くなるように調整することが好ましい。
【００８８】
本発明は、特定目的を達成するために、公知の他の過程と結合することができる。例えば、製造された産物の分離（または精製）は、伸長過程に後続できる。前記過程は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたは混成化により実施できる。また、本発明の増幅産物は、適合したクローニングベクターに挿入できる。また、本発明の製造産物は、発現ベクターを有する適合した宿主から発現できる。
【００８９】
ＩＩ．ターゲット核酸配列増幅に応用
本発明のまた他の様態によると、本発明は、プライマーとして一対の二重特異性オリゴヌクレオチドを使用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記増幅反応におけるアニーリングは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、ＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供する。
【００９０】
本発明の増幅方法は、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを利用するため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。 また、本方法は、アニーリングと伸長過程を含むため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。例えば、使用された ＤＳ ｏｌｉｇｏの組成と構造、及びアニーリングと伸長のための条件は、本方法と、上述の核酸分子を製造するための方法において、共通する。
【００９１】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本応用は、核酸増幅、好ましくは、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を実施することにより、一つの核酸または核酸混合物（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）からターゲット核酸配列を選択的に増幅する、改善された方法を提供することができる。
【００９２】
上述のように、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用して、二本鎖ＤＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅することは、図２に示されている。図２に示されたように、ＤＳ ｏｌｉｇｏの一対は、変性された二本鎖ＤＮＡ鋳型にアニーリングされる。
【００９３】
アニーリングの間に５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化部位または特異性決定位置（即ち、二重特異性決定位置）として重要な役割をするが、その反面、分割部位は、混成化位置としての役割をせず、鋳型と結合しない。この時、分割部位は、二末端部位、即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とを空間的に分離させて、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体特異性が二重的に決定されるように、ＤＳ ｏｌｉｇｏにおいてバブル構造を形成する。後続の反応の詳細内容は、上述の当業界に公知の従来プライマー関連核酸増幅と類似している。
【００９４】
核酸配列を増幅するための本方法は、公知の多様なプライマー関連核酸増幅により行うことができる。好ましくは、その方法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２、及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ工程、より好ましくは、ホットスタートＰＣＲ方法により行うことができる。
【００９５】
図３は、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用してｍＲＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅することを示す。最初の段階において、多様な生物試料から得られたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールに混成化可能なオリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を使用して逆転写される。逆転写の詳細なメカニズムは、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））から見つけることができる。後続の反応の詳細な内容は、上述の公知の従来プライマー関連核酸増幅と類似している。
【００９６】
ＩＩＩ．マルチプレックスＤＮＡ増幅に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、プライマーとして２つ以上の二重特異性オリゴヌクレオチド対を利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲットヌクレオチド配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、同一な反応において、２つ以上のプライマー対を同時に使用し、２つ以上のターゲットヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。
【００９７】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、同一な反応で一対以上のプライマーを使用して、一つ以上のターゲット配列を増幅する改善された方法を提供する。一般に、１０個以上のターゲット配列を同時に増幅させるようにマルチプレックスＰＣＲ条件を設計することは、非常に難しいが、その理由は、一つの特定部位（ｌｏｃｕｓ）であっても、非特異的副産物無しに増幅できるように、最適のＰＣＲ反応が要求されるためである。反応において完璧なＤＮＡ−ＤＮＡマッチが発生するようにするためには、十分高い温度でアニーリングがなされるようにする必要があるため、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、増幅の特異性を改善させるその機能のため、マルチプレックスＤＮＡ増幅の最適化に理想的である。本明細書で使用された“マルチプレックスＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）”は、一つの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）混合物において、マルチプレックスＤＮＡターゲットを同時に増幅することを意味する。
【００９８】
本発明の特定具現例において、マルチプレキシング工程は、前記ＤＳ ｏｌｉｇｏのプライマー対を使用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施する段階を含む増幅反応を実施する段階を含み、前記プライマーは、二重特異性オリゴヌクレオチドであって、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする。
【００９９】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、一つ以上のターゲットヌクレオチド配列及びプライマー対を使用することを除いては、上述の核酸配列の増幅方法にしたがって実施されるため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。例えば、使用されたＤＳ ｏｌｉｇｏの組成及び構造、そして増幅のための条件などは、上述の核酸分子の増幅方法と共通する。
【０１００】
好ましい具現例によると、アニーリング温度は、約４０〜７０℃であり、より好ましくは、４５〜６８℃、さらに好ましくは５０〜６５℃、及び最も好ましくは、５５〜６５℃である。
【０１０１】
好ましい具現例において、ターゲットヌクレオチド配列のそれぞれから増幅された産物は、後続する分析のために大きさが異なる。好ましい具現例によると、マルチプレックスターゲットヌクレオチド配列の増幅産物は、大きさ分別を通じて分析できる。大きさ分別比較は、公知の多様な方法、即ち、ポリアクリルアミドゲルマトリックスまたはアガロースゲルマトリックスを介した電気泳動及びヌクレオチドシーケンシングを通じて実施される。ヌクレオチドシーケンシングは、多様な製造会社から購入可能な自動化シーケンサーにて迅速に実施できる。
【０１０２】
後述の実施例で例示されたように、本発明のマルチプレキシングは、公知の従来マルチプレックス方法の非特異性の問題だけではなく、バックグラウンド問題を除去する。
【０１０３】
マルチプレックス増幅の利点は、数多い疾病または特異的ヌクレオチド配列変異（例えば、単一ヌクレオチド多形性または点突然変異）を、同じ反応で分析できるということにある。同時に分析できる分析物の数は、無制限である；しかしながら、上限は、約２０個であって、これは、分析のために要求される大きさの差異及び増幅された産物を分析できる方法などに依存するとして判断される。
【０１０４】
本発明の方法は、遺伝的及び伝染性疾病の診断、性決定、遺伝的連関分析、及び犯罪科学研究などに適用できる。
【０１０５】
ＩＶ．ＤＮＡシーケンシングに応用
上述の改善された特異性は、溶液相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）シーケンシング（特に、サイクリング）のプライマーとして、または固相シーケンシング（特に、オリゴヌクレオチドチップシーケンシング）のプローブとして、ＤＳ ｏｌｉｇｏが直接シーケンシング（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に使用されるようにする。
【０１０６】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、次の段階を含む、二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸分子をシーケンシングする方法を提供する：
（ａ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、シーケンシングする前記核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段であって；前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲット核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、製造反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）前記製造された相補的な核酸分子のヌクレオチド配列を決定する段階。
【０１０７】
一般に、ＤＮＡシーケンシングは、マクサム・ギルバートシーケンシング、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング、及びエキソヌクレアーゼ切断シーケンシングのような多様な方法により実施されてきた。本発明のシーケンシング方法は、熱サイクルシーケンシングだけではなく、パイロシーケンシングを改善する。
【０１０８】
本発明は、サンガージデオキシ方法の多様な変形された方法により実施できる。本発明の熱サイクルシーケンシングは、ＰＣＲ増幅された核酸鋳型に対し実施できる。また、本発明によると、熱サイクルシーケンシングは、シーケンシング前にＰＣＲ増幅されない核酸鋳型に対して実施できる。
【０１０９】
簡略に、サンガーシーケンシングは、ＤＮＡ重合酵素が２’，３’−ジデオキシヌクレオチドを核酸連鎖に挿入して連鎖反応を終結させることに基づく（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９７７） ＰＮＡＳ． ＵＳＡ ７４：５４６３）。サンガーにより発明された前記方法は、ジデオキシ連鎖終結方法を意味する。この方法の最も伝統的な過程において、シーケンシング対象のＤＮＡ切片は、Ｍ１３のような一本鎖ＤＮＡファージにクローニングされる。ＤＮＡ重合酵素Ｉのクレノウ断片により相補的鎖がプライミング合成される時、前記ファージＤＮＡは、鋳型として利用される。前記プライマーは、クローニングされたインサートの３’末端近くのＭ１３ベクター区域と特異的に混成化するために製造されたオリゴヌクレオチドである。四つのシーケンシング反応のそれぞれにおいて、４種のデオキシヌクレオチドの１種に対するジデオキシ類似体の十分な量が存在する下で、プライミング合成が実施されて、これにより、前記終結末端ヌクレオチドの挿入により無作為的に伸長反応が終結される。ジデオキシのデオキシ形態に対する相対的な濃度は、ゲル電気泳動を通じて分析できる、全ての可能な連鎖長さに該当する一連の終結反応がなされるように調節される。合成される連鎖で挿入される標識（ｔａｇ）は、電気泳動の各トラックにおいて、ＤＮＡパターンのオートラジオグラムイメージを得るために使用される。クローニングされた核酸鋳型において、デオキシヌクレオチドの配列は、四つのレーンでバンドのパターンを調査することにより決定される。
【０１１０】
サンガー方法の変形として、熱サイクルシーケンシング方法は、一般に核酸シーケンシングプライマー、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、一つ以上のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰｓ）、適切な緩衝液、熱安定ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｔａｑ重合酵素）、及びシーケンシングされる核酸鋳型を含む溶液の使用を含む。熱サイクルシーケンシングの詳細な内容は、米国特許第５，４３２，０６５号、第５，７２３，２９８号、５，７５６，２８５号、第５，８１７，７９７号、及び第５，８３１，０６５号から分かり、その内容は、本明細書に参照として取り込まれる。前記方法の工程は、通常、一般的なＰＣＲと類似した熱サイクリング条件下で実施される。
【０１１１】
核酸鋳型に対し、シーケンシング反応を実施して、次いで反応産物を分析して配列を決定する。相当な数の検出方法が公知された。このような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９３） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに説明されたように、一般に、ラジオヌクレオチド、蛍光、赤外線、及び化学発光ラベルなどを含む標識の検出を含む。
【０１１２】
ラベルは、プライマーまたはｄｄＮＴＰ、好ましくは、ｄｄＮＴＰで標識できる。最も好ましいラベルは、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン、３−（ε−カルボキシフェニル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３α、４α−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸誘導体、及び４，７−ジクロロロダミン染色剤などを含む蛍光物質である。
【０１１３】
好ましくは、アニーリング温度は、４０〜７０℃、より好ましくは、４５〜６８℃、及び最も好ましくは５０〜６５℃である。
【０１１４】
本方法は、後述の実施例に示されたように、ターゲット核酸分子の高い特異的シーケンシングを示す。より詳細には、マウス胎盤−特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１及びＰｓｘ２は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの独特の構造を有するようにデザインされたシーケンシングプライマーを使用して、分別的にシーケンシングできる。シーケンシングプライマーの全体配列が、３’−低Ｔｍ特異性部位において、ただ一つの塩基に差異があるということを考慮すれば、上述の分別的シーケンシングをより明確に把握することができる。
【０１１５】
驚くことに、本発明は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡポピュレーション内に含まれたターゲット核酸分子が、精製または分離無しにも、直接シーケンシングされるようにする。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡポピュレーション内にあるターゲット核酸分子を成功的に直接シーケンシングしたという報告は、未だにない。本発明のシーケンシング方法が、総ＲＮＡから得たｃＤＮＡポピュレーション内に含まれたターゲット核酸分子を直接的にシーケンシングするように適用される場合、本方法は、次の段階を含む：
（ａ）鋳型誘導の酵素的デオキシリボヌクレイン酸合成が発生するに十分な条件で、ｍＲＮＡｓのポピュレーションを、ｍＲＮＡのポリＡ末端に混成化されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーと接触させる段階；
（ｂ）オリゴヌクレオチドｄＴプライマーが混成化された前記ｍＲＮＡを逆転写する段階であって、前記オリゴヌクレオチドｄＴプライマーが混成化されたｍＲＮＡに相補的な第１次ｃＤＮＡ鎖を生成する段階；
（ｃ）二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、シーケンシングする第１次ｃＤＮＡ鎖に相補的な核酸分子を合成する段階であって；前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲット核酸分子にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記合成反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｄ）前記製造された第１次ｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列を決定する段階。
【０１１６】
Ｖ．遺伝的多様性を有した核酸分子の検出に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドの鋳型依存的伸長反応により、遺伝的多様性を有する核酸分子を検出する方法を提供する：
（ａ）二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じなく、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または前記３’−低Ｔｍ特異性部位がそのターゲット位置に対し１つ以上のミスマッチ塩基を有する場合に発生する条件でアニーリングが発生し、
（ｂ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型に相補的な前記核酸分子を製造する段階と、
（ｃ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記鋳型依存的伸長反応の発生有無を検出する段階。
【０１１７】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、前述した核酸配列を製造するための方法に従って実施されるため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【０１１８】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本応用は、アニーリングと伸長段階を含む鋳型依存的伸長反応により、遺伝的多様性を有した核酸配列を選択的に検出する改善された方法を提供することができる。特に、遺伝的多様性を有したターゲット核酸配列の検出は、アニーリング、伸長及び変性段階を含む鋳型依存的伸長反応の過程を繰り返すことによりなされる。
【０１１９】
本発明は、ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）に基づく。
【０１２０】
遺伝的多様性は、多様なゲノムで報告されている。このような現象は、関心対象の遺伝子またはゲノムを失敗なく検出するにおいて、妨害物とみなされてきた。本発明は、ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏを使用し、上記のような従来問題を解決する方法を提供する。一定な配列を有したＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を示す様々な配列にアニーリングできて、結局目的のヌクレオチド配列を成功的に増幅して検出できる。即ち、アニーリングと混成化特異性を急激に向上させる目的で、最初に発明されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、アニーリングまたは厳格条件が適切に調節される条件下でミスマッチ許容性を要求する方法にも使用できる。
【０１２１】
ミスマッチ許容性を示すＤＳ ｏｌｉｇｏを提供するために、得られる全てのヌクレオチド配列を整列して、把握された核酸分子の保存区域に基づいてＤＳ ｏｌｉｇｏをデザインすることが好ましい。
【０１２２】
本明細書で使用された用語“保存区域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）”は、多様なヌクレオチド配列間に非常に類似した、遺伝子のヌクレオチド配列または蛋白質のアミノ酸配列の断片を意味する。この用語は、“保存配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”と混用される。
【０１２３】
好ましい具現例において、保存区域内の最も保存された配列は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの３’−末端部位に位置して、最も低く保存された配列は、分割部位に位置する。５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位、好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位は、ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性のため、ターゲット位置に一つ以上、好ましくは、一つ乃至三つ、より好ましくは、一つまたは二つのミスマッチ塩基を有する。ＤＳ ｏｌｉｇｏにミスマッチ許容性を付加するために、アニーリング条件、特にアニーリング温度は、重要である。前記アニーリングは、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位が一つ以上のミスマッチ塩基を有する場合、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングは発生されないが全ての部位によるアニーリングが発生する条件下で実施される。
【０１２４】
好ましくは、アニーリング温度は、約４０〜７０℃、より好ましくは、４５〜６８℃、最も好ましくは、５０〜６５℃である。
【０１２５】
好ましい具現例によると、本発明は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）により実施される。
【０１２６】
本発明の検出段階は、多様な従来技術により実施できる。例えば、ゲル上で検出するに十分な産物を生成するように、本発明の方法が繰り返して実施される場合、鋳型依存伸長産物の検出は、従来のゲル電気泳動により容易に実施できる。分光学的測定、光化学的測定、生化学的測定、生電子的測定、免疫化学的測定、電子的測定、及び化学的測定により検出可能なラベルを含む場合、鋳型依存的伸長反応の発生有無を検出するために、適した測定が実施できる。
【０１２７】
遺伝的多様性は、ウイルスゲノムで最も頻繁に発見され、かつ発生する（Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４２， ３５３２； Ｔｅｒｓａ Ｃ．ら， （２００２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １８５， １６６０； Ｔａｋａｓｈｉ Ｅ．ら， （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４２， １２６； ａｎｄ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｒ．ら， （２００１） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ３２， １２２７）。従って、本発明により検出される遺伝的多様性を有した核酸分子は、遺伝的多様性を示すウイルスの核酸が好ましい。例えば、本発明が、遺伝的多様性を示すヒトメタニューモウイルスをＰＣＲにより検出するに適用される場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏ構造を有するようにデザインされた最も好ましいプライマーセットは、第３９配列（５’プライマー）及び第４０配列（３’プライマー）、または第３９配列及び第４１配列（３’プライマー）に記載されている。
【０１２８】
ＶＩ．マイクロアレイに固定されたＤＳ ｏｌｉｇｏを使用し、ターゲットヌクレオチド配列の検出に応用
本応用は、ＤＳ ｏｌｉｇｏ固定されたマイクロアレイ上で、鋳型依存的反応を繰り返し実施してターゲットヌクレオチド配列を検出する新規な方法である。
【０１２９】
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドの鋳型依存的伸長反応により、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出する方法を提供する：
（ａ）混成化、鋳型依存的伸長、及び変性過程を少なくとも１サイクル含む、基質上に固定されたプローブとしての二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長する段階であって、前記混成化は、二重特異性オリゴヌクレオチドを核酸試料に接触させることにより行われて、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）鋳型依存的伸長反応の発生有無を分析する段階。
【０１３０】
ＤＳ ｏｌｉｇｏ固定マイクロアレイを使用し、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出するための図示は、図４に示されている。
【０１３１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本方法は、最適化手順により決定される、適合した混成化条件下で実施できる。温度、成分の濃度、混成化及び洗浄時間、緩衝液成分及びこれらのｐＨ、及びイオン強度などの条件は、オリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ量、そしてターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子に依存する。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドが使用される場合、低い厳格条件が好ましい。混成化のための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認できる。
【０１３２】
ＤＳ ｏｌｉｇｏは、基質上に固定される。好ましい基質は、膜、フィルター、チップ、スライド、水、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、管（ｔｕｂｉｎｇ）、プレート、巨大分子、微細粒子、及び毛細管チューブのような、適合した固体または半固体支持体を含む。固定化は、化学反応または紫外線による共有結合によりなされる。本発明の具現例において、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、エポキシ化合物またはアルデヒドグループを含むように変形されたガラス表面またはポリリジンコーティングされた表面に結合される。また、ＤＳ ｏｌｉｇｏＤＳは、リンカー（例えば、エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）を通じて基質に結合される。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びこれの類似方法のような従来製造技術により、ＤＳ ｏｌｉｇｏはアレイまたは複数のアレイに製作され得る。
【０１３３】
本発明によると、伸長段階で使用されるｄＮＴＰｓは、好ましくはラベルされる。ラベリングのために、分光学的測定、光化学的測定、生化学的測定、生電子的測定、免疫化学的測定、電子的測定、及び化学的測定により検出可能な物質が使用される。例えば、ラベルには、Ｐ３２及びＳ３５のような放射能同位元素、化学発光化合物、蛍光マーカーと染料のような分光学的マーカー、そして磁気ラベルなどを含むが、これに限定されるものではない。例えば、染料には、キノリン染料、トリアリルメタン染料、フタレイン、アゾ染料、及びシアニン染料などを含むが、これに限定されるものではない。蛍光マーカーには、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ロダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、これに限定されるものではない。ラベリングは、公知の多様な方法により行われる。
【０１３４】
基質に、好ましくは固体支持体に固定されたプローブとしてのＤＳ ｏｌｉｇｏと核酸試料のターゲットヌクレオチド配列が混成化された後、ターゲットヌクレオチド配列と混成化されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型依存的段階において、ｄＮＴＰｓ、好ましくは、蛍光ラベルされたｄＮＴＰｓ及びＤＮＡ重合酵素を使用して伸長される。（ａ）段階を反復的に実施して、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全てまたは大部分がターゲットヌクレオチド配列と混成化されるようにして、より再現性のある混成化分析結果が得られるようにすることが好ましい。
【０１３５】
混成化の発生は、使用されたラベルタイプによって、公知の多様な方法により確認される。例えば、蛍光顕微鏡、好ましくは、コンフォーカル蛍光顕微鏡が蛍光ラベルを検出するために使用されて、このような装置により検出された信号の強度は、混成化程度に比例して増加する。一般に蛍光顕微鏡には、混成化強度の定量的な二次元イメージを形成するスキャニング装置が付着される。このような装置により検出される信号の強度は、混成化程度と鋳型依存的伸長の程度に比例する。
【発明の効果】
【０１３６】
本発明によると、高混成化特異性及びミスマッチ許容性を有する二重特異性オリゴヌクレオチドの特徴が強調されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】図１Ａは、鋳型依存的伸長反応において、本発明の二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドの原理を示す。図１Ａは、高い厳格条件下でＤＳオリゴヌクレオチドの高混成化特異性を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、鋳型依存的伸長反応において、本発明の二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドの原理を示す。図１Ｂは、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を示す。
【図２】本発明のＤＳオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、二本鎖ＤＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅する過程を示す。
【図３】本発明のＤＳオリゴヌクレオチドを使用し、ｍＲＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅する過程を示す。
【図４】オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上の二重特異性オリゴヌクレオチドを使用し、ターゲット核酸を選択的に決定する鋳型依存的伸長反応を示す。
【図５】サイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１ベータ及びＩＬ−１９をプライマーセット（ＩＬ−１ｂ−５’−０及びＩＬ−１ｂ−３’−０、レーン１；ＩＬ−１９−５’−０及びＩＬ−１９−３’−０、レーン３）と二重特異性オリゴヌクレオチド（ＩＬ−１ｂ−５’及びＩＬ−１ｂ−３’、レーン２；ＩＬ−１９−５’及びＩＬ−１９−３’、レーン４）を使用したＰＣＲ増幅の結果を示すアガロースゲル写真である。
【図６Ａ】二重特異性オリゴヌクレオチドのＰＣＲ特異性を証明するＤＥＧ１０遺伝子の３’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、完璧なマッチ配列を有するプライマーに対するものであり、レーン２〜４は、３’−低Ｔｍ特異性部位でそれぞれ３、２及び１個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものであり、レーン５〜７は、５’−高Ｔｍ特異性部位でそれぞれ５、３及び２個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものである。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図６Ｂ】ＰＣＲで二重特異性オリゴヌクレオチドのミスマッチ許容を証明するＤＥＧ１０遺伝子の３’−ＲＡＣＥ結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、完璧なマッチ配列を有する一つのプライマーに対するものであり、レーン２〜４は、３’−低Ｔｍ特異性部位でそれぞれ３、２及び１個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものであり、レーン５〜７は、５’−高Ｔｍ特異性部位でそれぞれ５、３及び２個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものである。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図７Ａ】マウス胎盤−特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１とＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥのための５’プライマーの配列を示す。Ｐｓｘ１−５’−４０及びＰｓｘ２−５’−４０は、従来プライマーであり、Ｐｓｘ１−５’−４１及びＰｓｘ２−５’−４１は、本発明によりデザインされたプライマーである。
【図７Ｂ】Ｐｓｘ１とＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥの結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーであるＰｓｘ１−５’−４１を使用したＰｓｘ１の３’−ＲＡＣＥであり；レーン２は、二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーであるＰｓｘ２−５’−４１を使用したＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥであり；レーン３は、従来プライマーであるＰｓｘ１−５’−４０を使用したＰｓｘ１の３’−ＲＡＣＥ；及びレーン４は、従来プライマーであるＰｓｘ２−５’−４０を使用したＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥ結果である。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図８】二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーのＰｓｘ１−５’−４１（Ｐｓｘ１場合）及びＰｓｘ２−５’−４１（Ｐｓｘ２場合）をシーケンシングプライマーとして使用し、マウス胎盤ｃＤＮＡプールでＰｓｘ１とＰｓｘ２遺伝子を直接サイクリングシーケンシングした結果を示す。
【図９】９セットのサイトカインファミリー遺伝子特異的二重特異性プライマーを使用したマルチプレックスＰＣＲ結果を示す。レーン１は、９個のサイトカイン遺伝子に対するマルチプレックスＰＣＲを；レーン２は、ＩＬ−３（２００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン３は、ＩＬ−１５（２５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン４は、ＩＬ−１８（３００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン５は、ＩＬ−２５（３５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン６は、ＩＬ−２（４００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン７は、ＩＬ−６（４５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン８は、ＩＬ−１９（５００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン９は、ＩＬ−１ベータ（５５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；及びレーン１０は、ＩＬ−１０（６００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲの結果を示す。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図１０】ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子を二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増幅した結果を示す。レーン１、ｈＭＰＶ５’−５８５及びｈＭＰＶ３’−６８９プライマーセットを使用したターゲットＰＣＲ；レーン２、ｈＭＰＶ５’−５８５及びｈＭＰＶ３’−１００７プライマーセットを使用したターゲットＰＣＲ；レーン３、ヒトベータ−アクチンプライマーを使用したターゲットＰＣＲ；レーン４、鋳型のないターゲットＰＣＲ；レーン５、鋳型のないターゲットＰＣＲ。
【発明を実施するための形態】
【０１３８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲ特異性
マウスサイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１９とＩＬ−１ベータのターゲットヌクレオチド配列を増幅するために、本発明により開発されたＤＳオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。ＤＳプライマーを利用したＩＬ−１９とＩＬ−１ベータのターゲットヌクレオチド配列の増幅過程と結果が記載されている。
【０１４０】
次の従来プライマー配列を選択して、これは、ＤＳオリゴヌクレオチドとＰＣＲ特異性を比較するために使用した：
実施例で使用されたＩＬ−１９特異的従来プライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’−０ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’（第１配列）；及び
ＩＬ１９−３’−０ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’（第２配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータ特異的従来プライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’−０ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（第３配列）；及び
ＩＬ１ｂ−３’−０ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（第４配列）。
【０１４１】
バックグラウンド及び非特異的産物生成のような、従来プライマー配列から引き起こされる主な問題点を、ＤＳオリゴヌクレオチドが解決できるかどうかを検証するために、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドを従来のプライマー配列に適用した。
【０１４２】
５’部位と３’部位との間にポリデオキシイノシン［ｐｏｌｙ（ｄＩ）］リンカーを有する分割部位を除いては、ＤＳプライマーは、従来プライマーと同一な配列を含む。ＤＳプライマーは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、且つ分割部位のＴｍが三つの部位のうち最も低いＴｍを有するようにデザインされる。
【０１４３】
実施例で使用されたＩＬ−１９に対するＤＳプライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’（第５配列）；及び
ＩＬ１９−３’ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＩＩＩＩＩＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’（第６配列）である。ここでＩは、デオキシイノシンである。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータに対するＤＳプライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＩＩＩＩＩＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（第７配列）；及び
ＩＬ１ｂ−３’ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＩＩＩＩＩＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（第８配列）である。ここでＩは、デオキシイノシンである。
【０１４４】
ＩＣＲマウスの胎盤組織から分離したゲノムＤＮＡ ２μｌ（５０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ ２μｌ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）、５’ＤＳまたは従来プライマー１μｌ（１０μＭ）、３’ＤＳまたは従来プライマー１μｌ（１０μＭ）、及びＴａｑ重合酵素０．５μｌ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）を含む２０μｌの最終容量でターゲットＰＣＲ増幅を実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間処理した。
【０１４５】
増幅された産物を２％アガロースゲルで電気泳動により分析し、ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して検出した。ＰＣＲ産物は、オートラジオグラフィー、またはシルバー染色のような非放射能検出法（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍ．９７，２３７−２４０；Ｋｏｃｉｏｋ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，２５−３３）、または蛍光標識オリゴヌクレオチドを利用した方法（Ｂａｕｅｒ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，４２７２−４２８０；Ｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１，２３１−２３６．；Ｌｕｅｈｒｓｅｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２，１６８−１７４；Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，２７４−２７９）、及びバイオチン化プライマーを利用した方法（Ｋｏｒｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，２３５−２４２；Ｔａｇｌｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６１．７５１−７５３；Ｒｏｓｏｋ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１，１１４−１２１）により変性ポリアクリルアミドゲル上で検出することができる。
【０１４６】
図５から分かるように、サイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１ｂとＩＬ−１９を、ＩＬ−１ｂ−５’とＩＬ−１ｂ−３’、そしてＩＬ−１９−５’とＩＬ−１９−３’の各プライマーセットを使用してターゲットＰＣＲ増幅した結果、それぞれＩＬ−１ベータ（レーン２）では５５０−ｂｐ、ＩＬ−１９（レーン４）の場合は５００−ｂｐと予想された大きさに該当する単一バンドを形成する。この後、クローンのクローニングと配列分析を通じて、そのバンドは、ＩＬ−１ベータとＩＬ−１９断片であることが確認できた。その反面、［Ｐｏｌｙ（ｄＩ）］を含まない従来プライマーセット（ＩＬ１９−５’−０とＩＬ１９−３’−０；ＩＬ１ｂ−５’−０とＩＬ１ｂ−３’−０）の場合は、非特異的産物が生成された（図５、レーン１とレーン３）。このような結果は、三つの異なるＴｍ部位（５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位）を有するようにデザインされたＤＳプライマーは、バックグラウンドと非特異的産物の生成のような、従来プライマー配列が誘発する問題点を克服し、ＰＣＲ特異性を大いに向上させることができることを示す。
【０１４７】
実施例２：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲ特異性の評価
本発明の二重特異性オリゴヌクレオチドは、その独特な構造により高い混成特異性及びミスマッチ許容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を示すことを特徴とし、これは、混成化厳格性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に依存する。ＤＳオリゴヌクレオチドの高い混成特異性は、５’−と３’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる高い厳格条件下でなされる。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容性は、制限されない一つ以上の塩基対ミスマッチが存在するにも拘らず、５’−と３’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる厳格条件下でなされる。
【０１４８】
マウス胎盤から発現されると確認された新しい遺伝子のＤＥＧ１０（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：４２４−４３４；ＸＭ＿１２９５６７）の３’−ＲＡＣＥ実験により、本発明により開発されたＤＳオリゴヌクレオチドの二重特異性を、混成特異性とミスマッチ許容性の観点で評価した。この評価のために、両側部位の幾つかのヌクレオチドを他のヌクレオチドで置換し、ターゲット鋳型配列にミスマッチされるようにした。
【０１４９】
実施例で使用された５’−ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマーは、次のようである：
ＤＥＧ１０−５’−１０８： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第９配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０３： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’（第１０配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０２： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＣＡＴＣ−３’（第１１配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０１： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＣＡＴＧ−３’（第１２配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１５８： ５’−ＴＧＴＡＣＴＴＡＴＧＣＧＴＡＴＣＧＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１３配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１３８： ５’−ＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１４配列）；及び
ＤＥＧ１０−５’−１２８： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１５配列）である。
ここで、置換されたヌクレオチドは、下線とボールド体で表示して、Ｉは、デオキシイノシンを示す。
【０１５０】
Ａ．高い厳格条件下におけるＰＣＲ特異性の増加
上記説明した通り、逆転写酵素により第１次ｃＤＮＡ鎖を合成するために、ＩＣＲマウスの１７．５−ｄｐｃ（Ｅ１７．５）胎盤組織から総ＲＮＡを分離及び利用した（Ｈｗａｎｇ，Ｉ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５：１１８０−１１８４）。総ＲＮＡを、次のように組成された反応容量２０μｌで、４２℃で１．５時間逆転写反応を実施した：総ＲＮＡ３μｌ、５×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）４μｌ、ｄＮＴＰｓ ５μｌ（それぞれ２ｍＭ）、１０μＭ ｃＤＮＡ合成プライマー２μｌ（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０−Ａｄａｐｔｅｒ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（４０ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び逆転写酵素１μｌ（２００ ｕｎｉｔｓ／μｌ， Ｐｒｏｍｅｇａ）。超精製されたＨ２Ｏ １８０μｌを入れて、第１次ｃＤＮＡ鎖を希釈した。ｃＤＮＡ合成プライマーのオリゴ（ｄＴ）１８ −ＡＣＰ１は、５’−ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＩＩＩＩＩ（Ｔ）１８−３’であり、ここで、Ｉはデオキシイノシンである。
【０１５１】
希釈した第１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）が含まれた１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマー（１０μＭ）１μｌ、オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥを実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６８℃で１分、及び７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２は、５’−ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＩＩＩＩＩ（Ｔ）１５−３’であり、ここで、Ｉはデオキシイノシンである。
【０１５２】
Ｂ．ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容
ＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥを実施するためのサンプルＤＳプライマー、鋳型及びＰＣＲ条件を実施例２Ａと同一にして、アニーリング温度は異ならせた。次の条件でＰＣＲ増幅を実施した：９４℃で５分、６０℃で３分、及び７２℃で３分の過程を１回実施；その後９４℃で４０秒、６５℃で１分、及び７２℃で４０秒の過程を２９回繰り返して実施、及び７２℃で７分間最終伸長サイクル。
【０１５３】
結果的に、図６Ａは、ＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥ実験で、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの高混成特異性を示す。５’−ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０８）は、ＤＥＧ１０ ３’−ＲＡＣＥで予想した６７７ｂｐ産物を生成させた（レーン１）。その反面、５’部位または３’部位でミスマッチ配列を有した他のプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０３，ＤＥＧ１０−５’−１０２，ＤＥＧ１０−５’−１０１，ＤＥＧ１０−５’−１５８，ＤＥＧ１０−５’−１３８及びＤＥＧ１０−５’−１２８）は、いかなる産物も生成しなかった：３’部位で３個（レーン２）、２個（レーン３）、または１個（レーン４）塩基のミスマッチ；５’部位で５個（レーン５）、３個（レーン６）、または２個（レーン７）塩基のミスマッチ。
【０１５４】
このような結果は、ＤＳプライマーの二重特異性が、高い厳格条件下で３’−末端だけではなく、５’−末端でミスマッチ塩基を区別することができることを証明する。
【０１５５】
一般に、鋳型に完璧に相補的であるべきプライマー部位は、３’−末端であるが、その理由は、この末端がＤＮＡ重合酵素により伸長される部位であって、正確なターゲット配列にアニーリングが発生するようにする最も重要な部位であるからである。その反面、プライマーの５’−末端は、ターゲット配列にアニーリングの特異性を決定するにそれほど重要ではなく、鋳型に相補的ではない制限酵素部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）とプロモーター配列のような追加配列を有するように変形され得る（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｌｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎ．Ｙ．．）。これとは対照的に、独特な構造に起因する二重特異性により現れるＤＳプライマーの格別な利点は、３’−末端だけではなく、５’−末端でミスマッチ塩基を区別することができるようにすることである。
【０１５６】
図６Ｂは、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容の一例をＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥで示したものである。５’−または３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが全くないか、幾つかあるとしても、ＤＳプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０８，ＤＥＧ１０−５’−１０１，ＤＥＧ１０−５’−１２８及びＤＥＧ１０−５’−１３８）は、ＤＥＧ１０ ３’−ＲＡＣＥの予想される６７７ｂｐ産物を依然として生成した（レーン１，４，６及び７）。その反面、５’または３’部位にさらに多いミスマッチヌクレオチドを有する他のプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０３，ＤＥＧ１０−５’−１０２，ＤＥＧ１０−５’−１５８）は、如何なる産物も生成しなかった（レーン２、３及び５）。前記結果は、ミスマッチ許容を要求する多様なヌクレオチド配列の増幅にＤＳプライマーが利用できることを示す。
【０１５７】
要するに、前記結果は、ＤＳプライマーの次のような原理を裏付ける：
１）アニーリングが５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との両側部分で発生する場合でのみ、ＤＳプライマーは、鋳型と相補的な核酸分子を合成するために伸長されて（レーン１）；しかしながら、
２）アニーリングが３’−低Ｔｍ特異性部位ではなく、ただ５’−高Ｔｍ特異性部位で発生する場合は、ＤＳプライマーは、鋳型に相補的な核酸分子を合成するために伸長されず（レーン２〜４）；そして、
３）３’−低Ｔｍ特異性部位の配列が鋳型と完璧にマッチされる場合でさえも、高い厳格条件下では、３’−低Ｔｍ特異性部位のみではアニーリングが発生しない（レーン５〜７）。アニーリング部位と関連し、ＤＳプライマーは、初期ＰＣＲ段階で３’−末端部位のみがアニーリングされる場合に伸長されるアニーリング調節プライマー（ＡＣＰ）と明らかに違う（Ｈｗａｎｇ，Ｉ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５：１１８０−１１８４）。
【０１５８】
実施例３：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用した単一塩基の区別
単一塩基区別に対するＤＳオリゴヌクレオチドの二重特異性を証明するために、マウス胎盤特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１とＰｓｘ２のｃＤＮＡｓを、従来のプライマーまたはＤＳプライマーのいずれか一つを使用して増幅した。２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓ間の全体配列相同性は、ヌクレオチド水準で９１％であった（Ｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｘ２，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｓｘ（ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｅ ２４１：１４９−１５５）。一つまたは二つの塩基差によりＰｓｘ１とＰｓｘ２が区別されるように、５’−プライマーをデザインした（図７Ａ）。しかし、３’−プライマーは、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓの保存された配列を有するようにデザインした。Ｐｓｘ１−とＰｓｘ２−特異的従来及びＤＳプライマー配列は次のようである：
Ｐｓｘ１−５’−１０： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴ−３’ （第１６配列）；
Ｐｓｘ２−５’−１０： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣ−３’ （第１７配列）；
Ｐｓｘ１−５’−１１： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＩＩＩＩＩＴＴＣＴＡＧＣＴ−３’ （第１８配列）；
Ｐｓｘ２−５’−１１： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＩＩＩＩＩＴＴＣＴＧＧＣＣ−３’ （第１９配列）；
Ｐｓｘ１−５’−４０： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡ−３’ （第２０配列）；
Ｐｓｘ２−５’−４０： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡ−３’ （第２１配列）；
Ｐｓｘ１−５’−４１： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＩＩＩＩＩＧＡＡＩＧＩＧＡ−３’ （第２２配列）；
Ｐｓｘ２−５’−４１： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＩＩＩＩＩＧＡＡＩＣＩＧＡ−３’ （第２３配列）；及び
Ｐｓｘ−３’−２： ５’−ＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＩＩＩＩＩＡＧＡＴＣＣＣＴ−３’ （第２４配列）、
ここで、Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的ヌクレオチドは、下線とボールド体で示した。
【０１５９】
Ａ．第１次ｃＤＮＡ鎖の合成
３’−ＲＡＣＥとＰｓｘ ｃＤＮＡのターゲットＰＣＲの出発物質として、実施例２で合成されたマウス胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖を使用した。
【０１６０】
Ｂ．Ｐｓｘ１−とＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーを利用したＰｓｘ１とＰｓｘ２の３’ＲＡＣＥ
希釈された１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝溶液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’−Ｐｓｘ１−と５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳまたは従来プライマー（１０μＭ）１μｌ 、オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＰｓｘ１及びＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥを行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１６１】
Ｃ．Ｐｓｘ１−及びＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーを使用したＰｓｘ１及びＰｓｘ２ターゲット核酸増幅
希釈された１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝溶液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’−Ｐｓｘ１−または５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳプライマーまたは従来プライマー（１０μＭ）１μｌ 、Ｐｓｘ−３’−２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＰｓｘ１及びＰｓｘ２のターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１６２】
結論的に、図７Ｂは、５’Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的プライマーが３’−ＲＡＣＥとターゲットＰＣＲの産物を生成することを示す。２つのＰｓｘ ｃＤＮＡは、３’−末端側で２９ｂｐが除去または添加され、お互い異なるため、３’−ＲＡＣＥにより２９ｂｐ差のある産物が増幅されることを予想することができる。Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーであるＰｓｘ１−５’−４１及びＰｓｘ２−５’−４１を使用したＰｓｘ１ ｃＤＮＡの３’−ＲＡＣＥは、それぞれ３１１ｂｐ（レーン１）と２８２ｂｐ（レーン２）と、予想の大きさと一致する単一バンドを生成した。３’−ＲＡＣＥにより生成された産物の配列分析を通じて、５’−Ｐｓｘ１−及び−Ｐｓｘ２−特異性プライマーは、それぞれＰｓｘ１とＰｓｘ２ ｃＤＮＡを増幅したことを確認した。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドの原理に従わない従来プライマー（Ｐｓｘ１−５’−４０とＰｓｘ２−５’−４０）は、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓを区別できなかった（レーン３とレーン４）。
【０１６３】
前記結果は、本発明によるＤＳプライマーが一つの単一塩基ミスマッチを区別することができることを示す。したがって、点突然変異を同定するかまたは単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）をゲノタイピングすることにおいて、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドが適用できる。
【０１６４】
実施例４：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したｃＤＮＡプールで、ターゲットｃＤＮＡの直接シーケンシング
新しいｃＤＮＡを同定して分離しようとする殆どの試みは、ｍＲＮＡ配列の一部分だけを代表するクローンを得るような結果を招来する。一応部分配列を確認したら、転写体の残りの部分は、典型的なｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅）のようなＰＣＲに基づいた方法によりしばしば得るようになり、その後、その得られたｃＤＮＡをシーケンシングするようになる。したがって、現在の全ての方法は、転写体の残りの部分に対する配列情報を得るための必須段階である。もしミッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）配列情報を、ターゲット細胞から得たｃＤＮＡポピュレーションから直接得れば、このような時間消費的な必須過程を完全に回避するようになり、かつ粗生物試料（ｃｒｕｄｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）からターゲットｃＤＮＡ配列を直接的に決定することができる。
【０１６５】
胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖プールを使用して、マウス胎盤特異的ホメオボックス遺伝子であるＰｓｘのｃＤＮＡを直接シーケンシングするために、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。胎盤ｃＤＮＡプールから胎盤特異的遺伝子ｃＤＮＡを直接シーケンシングする方法と結果をここに説明した。実施例３で利用されたものと同一な５’−Ｐｓｘ特異的ＤＳプライマーを使用した。これらのプライマーは、Ｐｓｘ １−５’−１１、Ｐｓｘ ２−５’−１１、Ｐｓｘ １−５’−４１及びＰｓｘ ２−５’−４１である。
【０１６６】
Ａ．第１次ｃＤＮＡ鎖の形成
Ｐｓｘ ｃＤＮＡｓを直接シーケンシングするために、鋳型として実施例２で合成されたマウス胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖を使用した。
【０１６７】
Ｂ．Ｐｓｘ特異的ＤＳプライマーを利用して、胎盤ｃＤＮＡプールでＰｓｘ ｃＤＮＡの直接シーケンシング
希釈した第１次ｃＤＮＡ鎖１３μｌ（１５０ｎｇ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ反応混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）２μｌ、５×シーケンス緩衝液（Ａｐｐｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２μｌ、及び５’−Ｐｓｘ１−または５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳプライマー（１μＭ）１．６μｌを含む最終容量２０μｌでサイクルシーケンシング反応を実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１０秒、５０〜６０℃で３分、及び６０〜６５℃で４分の過程を４０〜５０回繰り返した。シーケンシング産物を次のように精製した。１）３Ｍのアセト酸ナトリウム（ｐＨ４．６）２μｌと、新鮮で且つ冷たい１００％ＥｔＯＨ ５０μｌを添加、２）３０分間７５℃に維持、３）１３，０００ｇで１５〜３０分間遠心分離及び上清液の除去、４）７０％ＥｔＯＨ ２００μｌで洗浄、５）１３，０００ｇで１５〜３０分間遠心分離及び上清液を除去及び乾燥。シーケンシング産物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００遺伝分析器で分析する直前にＨｉＤｉホルムアミド１０μｌでペレットを再懸濁した。
【０１６８】
驚くことに、Ｐｓｘ ＤＳプライマーは、それらの特異的Ｐｓｘ ｃＤＮＡｓを正確にシーケンシングした。即ち、Ｐｓｘ１特異的ＤＳプライマー（Ｐｓｘ１−５’−４１）は、専らＰｓｘ１ ｃＤＮＡのみをシーケンシングして、Ｐｓｘ２特異的ＤＳプライマー（Ｐｓｘ２−５’−４１）は、専らＰｓｘ２ ｃＤＮＡのみをシーケンシングした（図８）。Ｐｓｘ２における２９ｂｐ欠損地域がブラックバーで表示された。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドの原理に従わない従来プライマー（Ｐｓｘ１−５’−４０及びＰｓｘ２−５’−４０）は、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓを区別できなかった。
【０１６９】
このような結果は、ＤＳプライマーがＰＣＲ増幅でのみならず、サイクルシーケンシングでも単一塩基ミスマッチを区別することができることを示す。
【０１７０】
実施例５：ＤＳオリゴヌクレオチドを利用したマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲにおいて、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、９個の異なるサイトカインファミリー遺伝子をＤＳプライマーで増幅した。ＤＳプライマーを利用したマルチプレックスＰＣＲ増幅の方法及び結果をここに説明した。各サイトカイン遺伝子の最も長いエキソン配列を利用して、５０ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）を生成するようにサイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマーをデザインした。
【０１７１】
実施例で使用されたＩＬ−３に対するＤＳプライマーは、次のようである（２００ｂｐ）：
ＩＬ３−５’ ５’−ＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＣＩＩＩＩＩＣＴＧＧＡＴＧＡ−３’ （第２５配列）；及び
ＩＬ３−３’ ５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＡＩＩＩＩＩＧＧＴＧＣＴＣＴ−３’ （第２６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１５に対するＤＳプライマーは、次のようである（２５０ｂｐ）：
ＩＬ１５−５’ ５’−ＡＴＧＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＩＩＩＩＩＡＴＧＴＧＡＧＧ−３’ （第２７配列）； 及び
ＩＬ１５−３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＴＩＩＩＩＩＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧ−３’ （第２８配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１８に対するＤＳプライマーは、次のようである（３００ｂｐ）：
ＩＬ１８−５’ ５’−ＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＩＩＩＩＩＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡ−３’ （第２９配列）； 及び
ＩＬ１８−３’ ５’−ＡＴＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＴＣＩＩＩＩＩＡＡＧＧＣＧＣＡ−３’ （第３０配列）。
実施例で使用されたＩＬ−２５に対するＤＳプライマーは、次のようである（３５０ｂｐ）：
ＩＬ２５−５’ ５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＩＩＩＩＩＣＡＡＧＧＣＧＧ−３’ （第３１配列） ； 及び
ＩＬ２５−３’ ５’−ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＴＩＩＩＩＩＧＴＧＧＴＣＣＴ−３’ （第３２配列）。
実施例で使用されたＩＬ−２に対するＤＳプライマーは、次のようである（４００ｂｐ）：
ＩＬ２−５’ ５’−ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＡＧＴＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧ−３’ （第３３配列）； 及び
ＩＬ２−３’ ５’−ＧＴＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＧＡＩＩＩＩＩＧＡＧＣＴＴＡＴＴＴ−３’ （第３４配列）。
実施例で使用されたＩＬ−６に対するＤＳプライマーは、次のようである（４５０ｂｐ）：
ＩＬ６−５’ ５’−ＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＡＴＡＡＩＩＩＩＩＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡ−３’ （第３５配列）； 及び
ＩＬ６−３’ ５’−ＡＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＩＩＩＩＩＴＧＧＣＴＡＧＧ−３’ （第３６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１９に対するＤＳプライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’ （第５配列）； 及び
ＩＬ１９−３’ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＩＩＩＩＩＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’ （第６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータに対するＤＳプライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＩＩＩＩＩＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’ （第７配列）； 及び
ＩＬ１ｂ−３’ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＩＩＩＩＩＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’ （第８配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１０に対するＤＳプライマーは、次のようである（６００ｂｐ）：
ＩＬ１０−５’ ５’−ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＩＩＩＩＩＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧ−３’ （第３７配列）； 及び
ＩＬ１０−３’ ５’−ＴＧＡＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＴＩＩＩＩＩＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’ （第３８配列）。
【０１７２】
Ａ．サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー１セットを利用したモノプレックス（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）ＰＣＲ
マウスゲノムＤＮＡ２μｌ（５０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的５’ＤＳプライマー（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌで、それぞれのサイトカインファミリー遺伝子に対する単一ターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１７３】
Ｂ．サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー９セットを利用したマルチプレックスＰＣＲ
サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー９セットを利用して単一のチューブでマルチプレックスＰＣＲ増幅を実施し：マウスゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的５’ＤＳプライマー（０．２〜５μＭ）１μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的３’ＤＳプライマー（０．２〜５μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量５０μｌで反応混合物を製造し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；ＰＣＲ条件は、９４℃で５分、５０℃で３分、及び７２℃で３分の過程を１回行った後；９４℃で４０秒、６０℃で１分、及び７２℃で４０秒の過程を２９回繰り返し、７２℃で５分間最終伸長サイクル。
【０１７４】
図９から分かるように、マルチプレックスＰＣＲ増幅は、９個の異なるサイトカイン遺伝子産物に対し、２００ｂｐから６００ｐｂまで、予想大きさと一致する多様なバンドを生成する（図４、レーン１）。各モノプレックスＰＣＲ増幅は、ＩＬ−３場合の２００ｂｐ（図４、レーン２）、ＩＬ−１５場合の２５０ｂｐ（図４、レーン３）、ＩＬ−１８場合の３００ｂｐ（図４、レーン４）、ＩＬ−２５の場合の３５０ｂｐ（図４、レーン５）、ＩＬ−２の場合の４００ｂｐ（図４、レーン６）、ＩＬ−６の場合の４５０ｂｐ（図４、レーン７）、ＩＬ−１９場合の５００ｂｐ（図４、レーン８）、ＩＬ−１ベータの場合の５５０ｂｐ（図４、レーン９）、及びＩＬ−１０場合の６００ｂｐ（図４、レーン１０）と、それぞれ予想大きさと一致する単一バンドを生成した。
【０１７５】
したがって、本発明により開発されたＤＳプライマーを、マルチプレックスＰＣＲに成功的に適用することができることが分かる。ＤＳオリゴヌクレオチドの独特な構造は、従来のマルチプレックスＰＣＲが有している一般的な問題、即ち、プライマー干渉及びダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成の問題を解決する。
【０１７６】
実施例６：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドのミスマッチ許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を利用したヒトメタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）の検出
ミスマッチ許容において、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、診断試料内のヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）を検出するために、ＤＳプライマーを利用した。ＤＳプライマーを利用してヒトメタニューモウイルスを検出する方法と結果をここに説明した。本実施例は、特定の一つのウイルスを検出するに本発明の適用が限定されるように解釈されてはならない。
【０１７７】
全てのｈＭＰＶ分離物の配列を整列して得た融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子の保存地域を基にして、ＤＳプライマーをデザインした（表１参照）。この分離物の遺伝的多様性を許容するために、プライマーを次の基準に従ってデザインした：（ａ）保存地域は、一つ以上のミスマッチ塩基対が存在するとしても、少なくとも３０ヌクレオチドとなるようにして（表１）；（ｂ）保存地域でミスマッチが最も比率で現れる配列は、好ましくはＤＳプライマーの分割部位に位置するようにして（例えば、ｈＭＰＶ ５’−５８５，ｈＭＰＶ ３’−６９８，及びｈＭＰＶ ３’−１００７）；（ｃ）そうでなければ、ミスマッチヌクレオチドを５’−末端部位に位置するようにして、この中、幾つかはデオキシイノシンのようなユニバーサル塩基で代替可能であり（例えば、ｈＭＰＶ ３’−６９８及びｈＭＰＶ ３’−１００７）；（ｄ）３’−末端部位でミスマッチされた一つまたは二つのヌクレオチドを縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）塩基やユニバーサル塩基で代替することができる（例えば、ｈＭＰＶ ３’−１００７）。
【０１７８】
【表１】
＊ｈＭＰＶ分離物間の遺伝的変異は、下線を引いたヌクレオチドで表示された。
【０１７９】
実施例で使用されたｈＭＰＶ Ｆ遺伝子に特異的なＤＳプライマーは、次のようである：
ｈＭＰＶ ５’−５８５ ５’−ＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＩＩＩＩＩＣＴＡＡＡＴＧＴＴＧ−３’ （第３９配列）；
ｈＭＰＶ ３’−６９８ ５’−ＡＡＣＡＴＣＡＩＴＴＴＴＡＴＩＴＧＴＣＣＴＧＣＡＩＩＩＩＩＴＧＧＣＡＴＧＴ−３’ （第４０配列）；及び
ｈＭＰＶ ３’−１００７ ５’−ＴＴＧＡＩＴＧＣＴＣＡＧＣＩＡＣＡＴＴＧＡＴＩＩＩＩＩＣＷＧＣＴＧＴＧＴＣ−３’ （第４１配列）。
ここで、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｉは、デオキシイノシンである。
【０１８０】
製造会社のプロトコールにしたがって、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ方法を利用し、ウイルス総ＲＮＡを抽出した（ＲＮＡｚｏｌ ＬＳ；Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ）。次のように組成された２０μｌの反応容量で、ウイルスＲＮＡを使用し、４２℃で１．５時間ｃＤＮＡを合成するように逆転写反応を行った：総ＲＮＡ５μｌ（約１００ｎｇ）、５×緩衝液４μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、ｄＮＴＰｓ（各５ｍＭ）５μｌ、１０μＭランダムヘキサデオキシヌクレオチド２μｌ、ＲＮＡａｓｅ阻害剤０．５μｌ（４０ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びモロニーマウス白血病（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）ウイルス逆転写酵素１μｌ（２００ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１８１】
第１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマー（ｈＭＰＶ ５’−５８５；１０μＭ）１μｌ、３’−ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマー（ｈＭＰＶ ３’−６９８またはｈＭＰＶ ３’−１００７；１０ μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでｈＭＰＶ Ｆ遺伝子のターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１８２】
図１０Ｂから分かるように、ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマーの各対（ｈＭＰＶ ５’−５８５及びｈＭＰＶ ３’−６９８、そしてｈＭＰＶ ５’−５８５及びｈＭＰＶ ３’−１００７）は、それぞれ予想大きさである１５０ｂｐと４５９ｂｐに相応する単一バンドを生成する（レーン１及びレーン２）。その後、産物の配列分析で、前記増幅産物は、ｈＭＰＶ融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子の部分配列であることを確認した。その反面、前記プライマーは、鋳型のないネガティブコントロールＰＣＲでは、如何なる産物も生成しなかった（レーン４及びレーン５）。ポジティブコントロールとして、ヒトベータアクチン特異的プライマーセットを使用した（レーン３）。
【０１８３】
このような結果は、呼吸器疾患を有した患者からｈＭＰＶｓを検出する時に、ＤＳプライマーが適用できることを示す。したがって、診断分野で直面する全ての状況に対し、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のプライマー、またはオリゴヌクレオチドチップではてプローブとして利用できることが分かる。
【０１８４】
実施例７：ＤＳオリゴ固定マイクロアレイ（Ｏｌｉｇｏ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を利用したターゲットヌクレオチドの検出
ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ））を利用して、標準プロトコールにしたがって、ターゲット核酸分子の一領域に相補的なＤＳオリゴを合成する。マイクロアレイのために、ガラススライドに、合成されたＤＳオリゴを固定する。その後、ＤＮＡ試料５０〜２００ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２５μｌ、蛍光標識されたｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する：９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、５０〜６５℃で１〜３分、及び６０〜７２℃で１〜４分の過程を１５〜５０回繰り返した後、７２℃で５分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたＤＳオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
【０１８５】
実施例８：ＤＳオリゴヌクレオチドを利用した単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）ゲノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ））を利用して、標準プロトコールにしたがって、３’−低Ｔｍ特異性部位の中央に多形性塩基（疑問位置）が位置したＤＳオリゴを合成する。マイクロアレイを行うために、合成されたオリゴヌクレオチドをガラススライドに固定する。その後、ＤＮＡ試料５０〜２００ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２５μｌ、蛍光標識されたｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する：９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、５０〜６５℃で１〜３分、及び６０〜７２℃で１〜４分の過程を１５〜５０回繰り返した後、７２℃で５分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたＤＳオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
【０１８６】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重特異性オリゴヌクレオチド（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用した多様な方法及び二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。より詳細には、本発明は、二重特異性オリゴヌクレオチドを使用した鋳型依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）による多様な方法及び二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅は、分子生物学分野で利用される多様な方法において必須的な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｉ．ら（ＷＯ ８９／０６７００）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に混成化させた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は、転写増幅システムを含む（Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３（１９８９）；及びＧｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８８／１０３１５）。
【０００３】
重合酵素連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知された、最もよく利用される拡散増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４）。ＰＣＲに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡ鋳型の反対側鎖にアニーリングされるようにデザインされる。ＤＮＡ重合酵素によりプライマーは伸長されて、その伸長生成物は、次の過程で他のプライマーのための鋳型鎖として作用する。ＰＣＲ増幅過程は、ＤＮＡ断片の指数的増加を招来し、増幅されたＤＮＡ断片の長さは、オリゴヌクレオチドプライマーの５’−末端により決定される。
【０００４】
核酸増幅、特に、ＰＣＲ増幅における成功は、一つのプライマーが自分のターゲット配列のみにアニーリングする特異性に依存するため、上記の分子間相互作用を最適化することが重要である。プライマーが、それの完全な相補体のみにアニーリングするか、あるいは一つまたはそれ以上のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）ヌクレオチド配列を有する配列にもアニーリングするかは、アニーリング温度により決定され得る。一般に、アニーリング温度が高いと、完全なマッチ（ｍａｔｃｈ）鋳型に対するプライマーの特定アニーリング可能性がさらに高くなって、これにより、ターゲット配列だけが増幅される可能性がさらに高くなる。逆に、低いアニーリング温度では、鋳型とプライマー間のより多いミスマッチが発生する可能性がある。このような現象の観点で、アニーリング温度を調節すると、鋳型とプライマー間の結合特異性を変化させることができる。例えば、もし産物がなかったとしたら、アニーリングするには温度が高すぎた可能性がある。もし、一つのプライマーだけが存在する対照群において、多様な長さの生成物が発生したなら、このような結果は、前記単一プライマーが鋳型の一つ以上の部位にアニーリングしたことを示す。このような場合、アニーリング温度を上げることが好ましい。
【０００５】
アニーリング温度だけではなく、プライマー長、ＧＣ量、及びＰＣＲ生成物の長さのようなプライマーサーチパラメーター（ｐｒｉｍｅｒ ｓｅａｒｃｈ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は、プライマーのアニーリング特異性のために考慮すべきである。もし、上述のパラメーターを満足するプライマーを利用したら、プライマーアニーリングは特定化されて、ターゲットＤＮＡ増幅においてプライマーのアニーリング特異性は非常に改善され、プライマーにより招来されるバックグラウンド問題と非特異性生成物の問題が解決される。よくデザインされたプライマーは、非特異的アニーリング及びバックグラウンド問題を解決するだけではなく、ＲＮＡ−ＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡｓまたはゲノム鋳型を区別できるようにする。
【０００６】
プライマーアニーリング特異性を改善して、所望の生成物の増幅を可能にするために、様々な方法が開発された。例えば、タッチダウンＰＣＲ（Ｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ ＰＣＲ ｔｏ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｐｒｉｍｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，４００８）、ホットスタートＰＣＲ（ＤＡｑｕｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｂｙ ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈｅａｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，３７４９）、ネスティッドＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ，（１９８７）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０）、及びブースターＰＣＲ（Ｒｕａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｐｈａｓｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｄｉｌｕｔｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｖｉａ ｂｏｏｓｔｅｒ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，５４０７）がある。
【０００７】
他の接近方式も報告されているが、これらは、多様なエンハンサー化合物を利用してＰＣＲの特異性を改善する。エンハンサー化合物には、効果的なアニーリング反応温度を増加させる化学物質、ＤＮＡ結合蛋白質、商業的に利用可能な反応物質などが含まれる。しかしながら、全てのＰＣＲにおいて成功が保障できる魔術的な添加剤はなく、アニーリング温度のような多様な条件下で、他の添加物をテストすることは、非常に退屈な作業である。たとえ上述の接近方式は、プライマーアニーリング特異性を改善するにある程度寄与するとしても、上述の方法は、ＰＣＲ増幅に利用されるプライマーから招来される問題点、例えば、非特異的生成物及び高いバックグラウンドに対する根本的な解決策にはならない。
【０００８】
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野において多様な応用と方法に広く利用されており、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、分別ディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、知られたあるいは知られていない遺伝子のクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、アービトラリープライミング（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｉｎｇ）ＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング、ＰＣＲ関与ゲノム分析（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ，（２０００）ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ）がある。
【０００９】
たとえ各方法毎に、改善された接近方法が次々と紹介されているが、上述のように核酸増幅、特に、ＰＣＲ増幅過程を含むあらゆる方法及び技術は、利用されるプライマーの非特異性から引き起こされる制限と問題点、例えば、偽陽結果（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）、再現可能性の悪化、及び高いバックグラウンド問題から完全に自由になったわけではない。
【００１０】
一方、ＤＮＡ混成化は、分子生物学では基本的な過程であって、イオン強度、塩基組成、核酸分子が結合する断片の長さ、ミスマッチ程度、及び変性剤の存在により影響を受ける。このようなＤＮＡ混成化を利用した技術は、特異的核酸塩基配列決定に非常に有用であって、臨床診断、遺伝子関連研究、及び法医学的分析においても、非常に価値がある。例えば、Ｗａｌｌａｎｃｅ及び共同研究者らは、単一塩基変化のような微妙な配列差も、短いオリゴマー（例えば、１４−ｍｅｒ）を利用して十分区別でき、これが、β−グロビン遺伝子において、点突然変異の分子的分析においてどのように適用されるかを提示した（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，８７９−８９４；及びＣｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ β−ｇｌｏｂｉｎ ａｌｌｅｌｅ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０，２７８−２８２）。
【００１１】
相補的な鎖を正確に同定するオリゴヌクレオチド混成化方法の強力な力にも拘わらず、この技術は未だに限界に直面している。オリゴヌクレオチドを含むハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）は、長い核酸のハイブリッドより非常に不安定であって、これは、低い融解温度で反映される。ハイブリッドの不安定性は、オリゴヌクレオチド混成化をデザインする時に考慮される最も重要な要素の一つである。完全にマッチされる相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と、ただ一つの塩基がミスマッチされる相補体との安定性の差は、Ｔｍｓ（二重体融解温度）において、約０．５℃の差が発生する程度に非常に小さい。オリゴマーが短いほど（より複雑な混合物において、相補的な鎖の同定を可能にする）、単一塩基ミスマッチが全体二重体の安定性に及ぼす影響がさらに大きくなる。しかしながら、このような短いオリゴヌクレオチドの短所は、これらが完全に相補的な配列に対しても弱く混成化されるということである。したがって、このような点を考慮し、混成化は、減少された厳格条件で実施されなければならなく、これは結局、混成化の特異性を大いに減少させる結果を招来する。
【００１２】
オリゴヌクレオチド混成化の特異性を改善するための様々な試みがあった。高敏感性混成化のために、ＤＮＡ塩基を化学的に変性する方法（Ａｚｈｉｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１４６０−１１４６２（１９９３））、及びミスマッチを区別する能力を改善するために、混成化を低い温度で長時間実施した後、洗浄する方法（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：５２７−５３４（１９９０））が提案された。最近は、人為的なミスマッチを利用し、ＤＮＡ混成化において、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の区別程度を増加できる他の方法が紹介された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：３３１−５（１９９７））。また、米国特許第６，０７７，６６８号、第６，３２９，１４４号、第６，１４０，０５４号、第６，３５０，５８０号、第６，３０９，８２４号、第６，３４２，３５５号、及び第６，２６８，１２８号を含む多数の米国特許は、混成化のためのプローブ及びそれの応用に関して開示している。開発されたそれぞれの方法において、改善された接近が次々と紹介されているが、オリゴヌクレオチド混成化を含む全ての方法及び技術は、非特異的オリゴヌクレオチド混成化による制限及び問題から完全に自由ではない。
【００１３】
さらに、スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）及び基質上にオリゴヌクレオチドを固定化すること、そして最適混成化条件の樹立失敗などのような人為的な要因は、混成化のネガティブデータに影響を与える可能性がある。特に、間違った結果の影響は、高速スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得られた結果において大きく現れる。スポッティング及び混成化に内在する人為的な要因は、オリゴヌクレオチド−基盤のＤＮＡマイクロアレイの大きい短所となる。
【００１４】
また、向上された速度、敏感性、及び効率を有するＤＮＡ配列分析技術の開発は、生物学研究においても非常に重要である。２０余年前に開発された伝統的なＤＮＡ配列化方法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７４：５４６３−５４６７）は、追加的な応用分野において、速度及び費用の側面で制限があった。そのため、様々な新しい技術が提案された。有望な三つの方法には、混成化によるシーケンシング（Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１３５：３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒａｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：１１４−１２８（１９８９）；Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ／１０９７７（１９８９））、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）と切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）に基づいたｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．，９７：１６６５−１６７０（２０００））、及びパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：８４−８９（１９９６）； Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５（１９９８））などがある。前記技術において、シーケンシングの成功可否は、絶対的にシーケンシングプライマーのターゲット核酸に対する混成化特異性に依存する。シーケンシングプライマーの混成化特異性を考慮すると、現在の方法等は、シーケンシング反応を行うために入れる鋳型核酸の長さにおいて制限がある。一般に、シーケンシングプライマーの特異的混成化後、伸長するためには、好ましくは数百塩基対より小さい核酸鋳型を使用してシーケンシング反応が行われる。
【００１５】
しかしながら、進歩された研究のためには、増加された速度、敏感性、大容量化されたＤＮＡシーケンシングが、核酸鋳型の大きさにより制限されてはいけない。このような観点で、シーケンシングプライマーが高い特異性でターゲット核酸と混成化されたら、核酸鋳型のポピュレーションから一つのターゲット核酸の直接的なシーケンシングが可能である。
【００１６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者は、プライマーまたはプローブとして使用された従来のオリゴヌクレオチド、そして核酸混成化過程が含まれた数々の方法の問題点と短所を除去するために、より高い特異性で鋳型依存的反応を行う二重特異性オリゴヌクレオチドを発明し、オリゴヌクレオチド混成化またはアニーリングを含む様々な方法において、これの優れた応用性を究明した。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、１つのＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅させる方法を提供することにある。
【００２０】
本発明のまた他の目的は、同一な反応において、２つ以上のプライマー対を使用し、同時に２つ以上のターゲットヌクレオチド配列を増幅する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、一つのＤＮＡまたは核酸混合物において核酸分子をシーケンシングするための方法を提供することにある。
【００２２】
本発明のまた他の目的は、遺伝的多様性を有する核酸分子を、鋳型依存的伸長反応により検出する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的は、二重特異性オリゴヌクレオチド−固定マイクロアレイを使用し、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出する方法を提供することにある。
【００２４】
本発明のまた他の目的は、鋳型依存的伸長反応により、核酸分子を製造するための二重特異性オリゴヌクレオチドを提供することにある。
【００２５】
本発明の他の目的は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が、オリゴヌクレオチド構造を通じて二重に決定されるようにする方法を提供することにある。
【００２６】
本発明のまた他の目的は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善させるための方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、（ａ）二重特異性オリゴヌクレオチドを利用した多様な方法、及び（ｂ）前記方法に利用される二重特異性オリゴヌクレオチドに関するものである。本発明の二重特異性オリゴヌクレオチド（以下、“ＤＳ ｏｌｉｇｏ”という）は、改善された特異性でプライマーまたはプローブがターゲット核酸にアニーリングされるようにして、核酸増幅（特に、ＰＣＲ）の特異性及び混成化反応を大いに改善できるようにする。
【００２９】
二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳ ｏｌｉｇｏ）
本発明の一様態によると、本発明は、下記の一般式１で示されて、鋳型依存的伸長反応により核酸分子を合成するための二重特異性オリゴヌクレオチドを提供する：
［式１］
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’
Ｘｐは、混成化される鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する５’−高Ｔｍ特異性部位を示して、Ｙｑは、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Ｚｒは、鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位を示して、ｐ、ｑ、及びｒは、ヌクレオチドの個数であり、Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであって、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記鋳型核酸に対するアニーリング特異性側面において、前記５’−高Ｔｍ特異性部位が３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして、前記オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の両方ともにより決定され、前記オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加される。
【００３０】
ＤＳオリゴヌクレオチド（以下、“ＤＳ ｏｌｉｇｏ”という）を言及しながら使用される用語“二重特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）”は、ＤＳオリゴヌクレオチドの特徴を表現するための造語であって、ターゲット配列に対するＤＳオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が、分離された二つの部位、即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されることを意味する。一般に、プライマーまたはプローブのアニーリング特異性は、その連続する全体配列により支配される。その反面、ＤＳ ｏｌｉｇｏのアニーリング特異性は、分割部位により分離された二つの部位（５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位）により二重に決定されて、前記三つの部位は、一つのオリゴヌクレオチド配列内に位置する。このような二重特異性は、ＤＳ ｏｌｉｇｏがプライマー及びプローブとしてさらに高い特異性を示すようにして、これは、従来技術に対して、本発明が新規性及び進歩性を有するようにする。
【００３１】
一方、本発明者は、ＷＯ０３／０５０３０３に開示のように、アニーリング特異性を増加させるために、既にＡＣＰ（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ）を開発したことがあり、前記特許文献の教示内容は、本明細書に参照として取り込まれる。本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、以下のような側面において、ＡＣＰと明らかに異なる：（ｉ）ＤＳ ｏｌｉｇｏは、ターゲット配列と混成化されるように、二つの特異性部位を有するが、ＡＣＰは、一つの特異性部位を有して；（ｉｉ）ＤＳ ｏｌｉｇｏにおける三つの部位は、Ｔｍ側面で明確に区別される反面、ＡＣＰにおける部位は、そうではなく；（ｉｉｉ）ＤＳプライマーは、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位部位とでアニーリングが発生する時にのみ、鋳型に相補的な核酸分子を合成するために伸長される反面、ＡＣＰは、３’−末端部位にアニーリングが発生する場合にも伸長されて；（ｉｖ）したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏの伸長または混成化特異性は、二つの分割された部位、即ち５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されるが、ＡＣＰの場合は、ただ３’−末端部位のみにより支配される。したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏのターゲット配列に対するアニーリングまたは混成化特異性は、ＡＰＣより遥かに大きく、これは、ＤＳ ｏｌｉｇｏがＡＣＰに対して新規且つ進歩的であることを示す。
【００３２】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの格別な特徴は、一つのオリゴヌクレオチド分子内に、区分される特徴を有する三つの部位を有することである：５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位。
【００３３】
ＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型依存的伸長反応を含む多様な方法と分析に有用である。本明細書に使用された用語“鋳型依存的伸長反応（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）”は、ターゲット配列に混成化されたオリゴヌクレオチド分子を伸長する反応を意味し、これは、オリゴヌクレオチドの末端に連続的なヌクレオチドを結合してなり、この場合伸長された配列は、相補的な鋳型配列により決定される。
【００３４】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの混成化（アニーリング）特異性を説明する原理の代表的な例は、図１Ａに示されている。図１Ａを参照すると、ＤＳ ｏｌｉｇｏがより詳細に説明される。
【００３５】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位のみが鋳型にアニーリングされる場合、前記部位は、鋳型依存的伸長のためのプライミング位置として作用できず、結局伸長反応が発生しない。
【００３６】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位は、非ターゲット配列にアニーリングされる反面、より短い配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位は、非ターゲット配列にアニーリングしない。その理由は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位は、アニーリング側面で、分割部位により分離されるからである。即ち、３’−低Ｔｍ特異性部位は、５’−高Ｔｍ特異性部位とは相対的に独立的な方式でアニーリングに関与し、３’−低Ｔｍ特異性部位のアニーリングは、５’−高Ｔｍ特異性部位のアニーリングによる影響をより少ししか受けない。このような脈絡で、３’−低Ｔｍ特異性部位が非ターゲット配列にアニーリングする可能性は、非常に低い。
【００３７】
３’−低Ｔｍ特異性部位のみが非ターゲット位置に相補的な配列を有する場合は、特定の高い厳格条件、例えば、５’−高Ｔｍ特異性部位のアニーリングのための厳格条件ではアニーリングが起こらない。好ましい具現例によると、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高いアニーリング温度を有する厳格条件下で、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用して鋳型依存的伸長反応を実施することが有利である。
【００３８】
５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位が両方とも鋳型に実質的に相補的な配列を有する場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏはその鋳型にアニーリングされることができて、これにより、成功的な伸長反応が発生する。
【００３９】
理論に拘束されずに判断すると、分割部位は、３’−低Ｔｍ特異性部位を、アニーリング条件（例えば、温度及び配列相補性）にさらに敏感になるようにすると判断される。したがって、３’−低Ｔｍ特異性部位と非ターゲット配列との間に非特異的混成化が生じる可能性は、特定アニーリング（または厳格）条件下でさらに低くなる。５’−高Ｔｍ特異性部位だけではなく、３’−低Ｔｍ特異性部位がそのターゲット配列にアニーリングされる場合、３’−低Ｔｍ特異性部位の３’−末端は、ＤＮＡ重合酵素により伸長される位置を作る。
【００４０】
本明細書で使用する用語“オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”は、天然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的に混成化できて、天然的に存在するかあるいは人為的に合成されるものである。オリゴヌクレオチドは、混成化において、最大効率のために、好ましくは一本鎖である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ，ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドも含むことができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、骨格変形されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−５６８（１９９３））、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホルアミデードＤＮＡ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ ＤＮＡ）、アミド−連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ−連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡ及びメチルホスホン酸ＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ（ａｎｈｙｄｒｏｈｅｘｉｔｏｌ ＤＮＡ）、及び塩基変形を有するヌクレオチド例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−含み）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−）、イノシン及びジアミノプリンを含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用される用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして適合な温度とｐＨの条件で、合成の開始点として作用できる。増幅の最大効率のために、好ましくは、プライマーは一本鎖である。好ましくは、プライマーは、デオキシリボヌクレオチドである。本発明のプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ，ｄＧＭＰ，ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
【００４２】
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分長くなければならない。プライマーの適合した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）により決定される。用語、“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸に、オリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはそれの一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。本発明の用語“混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）”は、相補的な一本鎖核酸から二本鎖核酸を形成することを意味する。用語“アニーリング”と“混成化”とは同じ意味で、本明細書で混用される。
【００４３】
本明細書で使用された用語“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、ターゲットヌクレオチド配列に実質的に部位を含む一本鎖核酸分子である。
【００４４】
本発明において、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを言及しながら使用する用語“部位（ｐｏｒｔｉｏｎ）”は、分割部位により分離されるヌクレオチド配列を意味する。用語“５’−高Ｔｍ特異性部位（５’−ｈｉｇｈ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）”または用語“３’−低Ｔｍ特異性部位（３’−ｌｏｗ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）”は、それぞれ本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−末端と３’−末端におけるヌクレオチド配列を意味し、これは、分割部位により分離される。ＤＳ ｏｌｉｇｏを言及しながら使用する用語“５’−高Ｔｍ特異性部位”は、３つの部位のうち、最も高いＴｍを有して、鋳型核酸の一位置に対し実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する部位を意味する。ＤＳ ｏｌｉｇｏと関連し、“３’−低Ｔｍ特異性部位”は、５’−高Ｔｍ特異性部位よりは低いＴｍを有するが、分割部位よりは高いＴｍを有して、鋳型核酸の一位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有する部位を意味する。
【００４５】
本発明で使用する用語“Ｔｍ”は、核酸二本鎖分子の半分が一本鎖となる溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を意味する。ＤＳ ｏｌｉｇｏの部位を言及しながら使用される用語“高Ｔｍ”及び“低Ｔｍ”は、絶対Ｔｍ値ではなく、相対Ｔｍ値を意味する。即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより相対的に高いことが要求されるだけである。
【００４６】
前記５’−高Ｔｍ特異性部位 と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化される鋳型核酸の一位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有するようにデザインされる。ＤＳ ｏｌｉｇｏと関連して使用される用語“実質的に相補的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”は、オリゴヌクレオチドが十分相補的であるため、指定されたアニーリング条件または厳格条件下で、選択的に鋳型核酸配列に混成化され得て、アニーリングされたオリゴヌクレオチドが重合酵素により伸長され、鋳型に相補的なコピーを形成することができることを意味する。したがって、この用語は、“完全に相補的な”またはこれに係わる用語とは異なる意味を有する。ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ＤＳ ｏｌｉｇｏがプライマーまたはプローブとして作用できる範囲内で、鋳型に対し一つ以上のミスマッチを有することができる。最も好ましくは、ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位は、鋳型の一位置に対して完全に相補的な、即ち、ミスマッチのないヌクレオチド配列を有する。
【００４７】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの成功的な実施のために、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高くなければならない。好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、４０〜８０℃、より好ましくは、４０〜７５℃、さらに好ましくは、５０〜６８℃、最も好ましくは、５０〜６５℃である。好ましくは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍは、１０〜４０℃、より好ましくは、１５〜４０℃、最も好ましくは、２０〜３５℃である。好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより少なくとも３℃高く、より好ましくは、少なくとも１０℃、さらに好ましくは、少なくとも１５℃、最も好ましくは、少なくとも２０℃高い。
有利にするためには、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより５〜７０℃高く、好ましくは、１０〜７０℃、より好ましくは、１０〜６０℃、さらに好ましくは、１０〜５０℃、よりさらに好ましくは、１０〜４０℃、最も好ましくは、２０〜４０℃高い。
【００４８】
好ましい具現例によると、５’−高Ｔｍ特異性部位は、３’−低Ｔｍ特異性部位より長い。５’−高Ｔｍ特異性部位は、好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド長を有して、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは、２０〜２５ヌクレオチド長を有する。３’−低Ｔｍ特異性部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチド長を有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１２ヌクレオチド長を有する。
【００４９】
少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの利点と特徴を決定する一つの要素である。本明細書で使用される用語、“ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）”は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基に対し、区別なく天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる塩基を意味する。
【００５０】
縮退性プライマーにおいて不確実な位置のヌクレオチドがユニバーサル塩基により置換されることは、公知のことであり、前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン（Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，２６０５−２６０８； Ｓａｋａｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，４８６３−４８６７）、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９，４９２−４９３）及び５−ニトロインドール（Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４０３９−４０４３）を含み、前記塩基は、４種の従来の塩基と非特異的に塩基対を成すため、縮退性プライマーのデザインに係わる問題点を解決するに利用される。しかしながら、このようなユニバーサル塩基が、アニーリング（混成化）または増幅の間にバブル構造を生成し、その時、二つの反対隣接した配列を分離するようにオリゴヌクレオチド分子において一つの部位を形成し、結局、二つの分割特異性（アニーリング）部分を通じて、二重特異性により、ターゲット配列にプライマーまたはプローブのアニーリング特異性を増加させることができるという研究は、未だにない。
【００５１】
好ましい具現例によると、分割部位の前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、前記ユニバーサル塩基または非区別性塩基類似体は、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、または５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【００５２】
分割部位において、前記ユニバーサル塩基は、連続的な方式により含まれるか、またはｄＮＭＰｓのような他のヌクレオチドと共に間欠的に含まれる。好ましくは、前記分割部位は、ユニバーサル塩基、好ましくは、デオキシイノシンを有するヌクレオチドの連続配列を含む。
【００５３】
ＤＳ ｏｌｉｇｏにおいて、分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有することが必須的であって、これにより、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、分割部位は非塩基対バブル構造を形成し、鋳型核酸に対するアニーリング特異性側面で、５’−高Ｔｍ特異性部位は３’−低Ｔｍ特異性部位から分離され、結局前記オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定され、オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が非常に改善される。好ましくは、分割部位のＴｍは、３〜１５℃であり、より好ましくは、４〜１５℃であって、最も好ましくは、５〜１０℃である。
【００５４】
好ましい具現例によると、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間の分割部位は、少なくとも３個のユニバーサル塩基を含み、より好ましくは、少なくとも４個のユニバーサル塩基を、そして最も好ましくは、少なくとも５個のユニバーサル塩基を含む。好ましい具現例によると、前記分割部位は、２〜１０個のユニバーサル塩基を含み、より好ましくは、３〜１０個のユニバーサル塩基を、さらに好ましくは、４〜８個のユニバーサル塩基を、最も好ましくは、５〜７個のユニバーサル塩基を含む。
【００５５】
より長い配列を有するプライマーまたはプローブが必要な場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏの利点は、最も著しい。例えば、従来技術によると、混成化配列として３５ｂｐ以上のヌクレオチド配列を有するプライマーは、非特異的増幅物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生成しやすい。その反面、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、長い配列を有する場合も、特異的増幅物のみを生成するが、その理由は、ＤＳ ｏｌｉｇｏが鋳型との相互作用（即ち、アニーリング）側面で、それぞれ分離された２つの混成化配列（即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位）を有するからである。例えば、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、ターゲット配列に相補的な３５〜４５ｂｐの混成化配列を含むことができる。このような観点から、本発明は、従来プライマーデザイン戦略では非実用的であるとみなされる、より長い配列を有するプライマーをデザインできるようにするということが分かる。
【００５６】
好ましい具現例によると、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド長、そして前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、３〜１５ヌクレオチド長を有する。
【００５７】
より好ましくは、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド長、及び前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、５〜１５ヌクレオチド長を有する。最も好ましくは、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、１５〜２５ヌクレオチド長、前記分割部位は、５〜７ヌクレオチド長、そして前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、６〜１０ヌクレオチド長を有する。実施例に説明された典型的且つ例示的なＤＳ ｏｌｉｇｏによると、５’−高Ｔｍ特異性部位は、約２０ヌクレオチド長であり、分割部位は、約５ヌクレオチド長であって、３’−低Ｔｍ特異性部位は、約８〜１０ヌクレオチド長である。
【００５８】
最も好ましい具現例において、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、次の一般式で示される：５’−Ｘｐ−（ｄＩ）ｑ−Ｚｒ−３’（Ｘｐ及びＺｒの定義及び特徴は、上述のようであり、ｄＩは、デオキシイノシンを、（ｄＩ）ｑは、ユニバーサル塩基を有するヌクレオチドの連続配列を含む分割部位を示し、ｑは、５〜７の整数である）。
【００５９】
面白いことは、ターゲット配列に対するミスマッチを許容（ｔｏｌｅｒａｔｅ）する厳格条件下で、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、ミスマッチ許容性を有するということである。
【００６０】
ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性を支配する原理に対する構造的代表例は、図１Ｂに示されている。５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とのいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で、５’−高Ｔｍ特異性部位では、１個以上、好ましくは１個〜３個の塩基ミスマッチが許容される。３’−低Ｔｍ特異性部位では、１個以上、好ましくは１個〜２個の塩基ミスマッチが、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とのいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で許容され得る。また、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位のいずれも鋳型にアニーリングされる条件下で、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位では１個以上、好ましくは、１個〜５個の塩基ミスマッチが許容され得る。
【００６１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏにミスマッチ許容性を付加するために、アニーリング条件、特にアニーリング温度が重要である。３’−低Ｔｍ特異性部位単独によってはアニーリングが発生しない条件でアニーリングが実施されて、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位がターゲット位置に対して一つ以上（しかし制限された数）のミスマッチ塩基を有する場合、全ての部位によるアニーリングが発生する。ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を有するヌクレオチド配列を増幅するか検出するために要求される。ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を示すターゲット配列にアニーリングできて、結局成功的な増幅と目的のヌクレオチドを検出できるようにする。即ち、もともとアニーリングと混成化の特異性を劇的に増加させるために開発されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、アニーリングまたは厳格条件が好適に調節される条件下で、ミスマッチ許容を要求する方法においても使用することができる。
【００６２】
本発明の他の様態によると、本発明は、以下の段階を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性をオリゴヌクレオチドの構造により二重的に決定されるようにする方法を提供する：（ａ）ターゲット核酸配列を選択する段階、（ｂ）（ｉ）前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列と（ｉｉ）少なくとも二つのユニバーサル塩基を含む分割部位とを有するオリゴヌクレオチドの配列をデザインして、前記分割部位が前記混成化配列間に入り込み（ｉｎｔｅｒｖｅｎｅ）、前記オリゴヌクレオチドにおいて３つの部位を形成するようにする段階、そして（ｃ）前記分割部位の５’−方向側の部位は、分割部位の３’−方向側部位より高いＴｍを有して、前記分割部位が前記三つの部位のうち最も低いＴｍを有するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて前記分割部位の位置を決定する段階であって、これにより、（ｉ）前記オリゴヌクレオチドの５’−高Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有し、（ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドの３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、（ｉｉｉ）前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間の前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち最も低いＴｍを有して、互いに異なるＴｍ値を有する３つの区分された部位を有するオリゴヌクレオチドを提供して、上記の構成により、前記オリゴヌクレオチドのターゲット核酸に対するアニーリング特異性は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定される。
【００６３】
本方法は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を劇的に増加させて、ターゲット配列と混成化されるようにする新しい接近を提供する。また、本方法は、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善するための方法として表現できる。さらに、本発明は、ターゲット配列に混成化されるオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を改善するために、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を使用する方法として表現できる。
【００６４】
本発明は、上述のＤＳ ｏｌｉｇｏを製造するために利用される。したがって、不要な重複記載を避けるために、共通内容は、その記載を省略するが、その共通内容は、本発明の方法の詳細な説明に取り込まれる。
【００６５】
プライマーやプローブをデザインするために、従来の大部分の方法は、ターゲット配列に混成化できる配列のみを使用する。また、オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を増加させるために、従来は、温度とイオン濃度のような、増幅または混成化条件を調節した。
【００６６】
その反面、本発明の方法は、オリゴヌクレオチド自体に新しい特徴を導入することにより、アニーリング特異性を増加させる新しい戦略を提供する。オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が二重に決定できることと関連し、本明細書で使用される用語“オリゴヌクレオチド構造により（ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”は、アニーリング特異性が二重的に決定されるようにする新しい特徴をオリゴヌクレオチドに付与することにより、オリゴヌクレオチドの構造がオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性に大きく寄与することを意味する。
【００６７】
本発明の方法において、（ｉ）ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列及び（ｉｉ）少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位を有するオリゴヌクレオチドの配列をデザインすることが重要である。この段階において、前記オリゴヌクレオチドの構造輪郭は、５’−末端部位／分割部位／３’−末端部位として表れる。５’−末端及び３’−末端は、ターゲット核酸に実質的に相補的な混成化配列を有して、分割部位がその間に入り込む（ｉｎｔｅｒｖｅｎｅ）。
【００６８】
本発明において最も重要な段階は、分割部位の５’−方向側の部位が分割部位の３’−方向側部位より高いＴｍを有して、前記分割部位は、前記三つの部位のうち、最も低いＴｍを有するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて前記分割部位の位置を決定する段階であって、これにより異なるＴｍ値を有する三つの区分された部位を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００６９】
本発明によりオリゴヌクレオチド内に挿入された新しい構造的特徴は、次のようである：（ｉ）オリゴヌクレオチド配列内の三つの区分された部位（５’−高Ｔｍ特異性部位、分割部位、及び３’−低Ｔｍ特異性部位）；（ｉｉ）三つの部位の互いに異なるＴｍ値；（ｉｉｉ）５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との間に位置し、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含む分割部位；（ｉｖ）分割部位によりアニーリング側面で分離され、アニーリング段階でターゲットと相互作用する２つの部位；（ｖ）５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位順のＴｍ値。このような構造的特徴は、本発明により最終的に提供されるオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性が５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重的に決定されるようにして、これは、ターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドのアニーリング特異性を大きく増加させる。
【００７０】
本発明の方法によりデザインされて製造されたオリゴヌクレオチドは、上述の三つの部位を有しないものに比べ、非常に高いアニーリング特異性を示す。
【００７１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの特徴と利点は、次のように説明できる：
（ａ）ＤＳ ｏｌｉｇｏの分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、これはＤＳ ｏｌｉｇｏにおいて最も低いＴｍを生成するようにして、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成するようにする。このような非塩基対バブル構造は、アニーリング特異性側面で５’−高Ｔｍ特異性部位が３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして；
（ｂ）５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、分割部位は、最も低いＴｍを有して、この特徴は、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが発生しない厳格条件を設定することを可能にして；
（ｃ）したがって、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体的アニーリング特異性は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位により二重に決定されて；
（ｄ）結局、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体アニーリング特異性は、大いに増加される。
【００７２】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、多様な分野（ｉ）Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．方法（ＷＯ８９／０６７００）及びＤａｖｅｙ，Ｃ．ら（ＥＰ３２９，８２２）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９））、重合酵素リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ．，１：５−１６（１９９１）），ギャップ−ＬＣＲ（ＷＯ９０／０１０６９）、復旧連鎖反応（ＥＰ４３９，１８２）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９））、及びＮＡＳＢＡ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１３０，２３８）などのようなプライマー関連核酸増幅方法と、（ｉｉ）サイクルシーケンシング（Ｋｒｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：Ｓ１０７−Ｓ１１２）、及びパイロシーケンシング（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：８４−８９；及び（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−３６５）などのようなプライマー伸長関連技術、及び（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用したターゲットヌクレオチド配列の探知のような混成化関連技術において、非常に有用である。
【００７３】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、多様な核酸増幅、シーケンシング及び混成化関連技術に適用できる。以下、ＤＳ ｏｌｉｇｏの応用性を立証する代表的な例を示す。
【００７４】
Ｉ．核酸分子の製造に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて鋳型依存的伸長反応により核酸分子を製造する方法を提供する：
（ａ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位（５’−ｈｉｇｈ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）、３’−低Ｔｍ特異性部位（３’−ｌｏｗ Ｔｍ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｏｒｔｉｏｎ）、及び分割部位（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段階。
【００７５】
本発明の製造方法は、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを利用するため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００７６】
ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本発明の応用は、アニーリングと伸長段階を含む鋳型依存的伸長反応により、ターゲット配列に相補的な核酸配列を選択的に製造する、改善された方法を提供する。特に、ターゲット配列に相補的な核酸配列の製造は、アニーリング、伸長、及び変性過程を含む鋳型依存的伸長反応の過程を繰り返すことによりなされる。
【００７７】
本発明の方法は、鋳型核酸分子に相補的な核酸分子を製造するために使用できる。そのような分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。前記分子は、二本鎖または一本鎖の形態である。出発物質としての核酸が二本鎖である場合、二つの鎖を一本鎖に、または部分的な一本鎖形態にすることが好ましい。鎖を分離する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコキサル（ｇｌｙｃｏｘａｌ）処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質などを含むが、これに限定されるものではない。例えば、鎖分離は、８０〜１０５℃の温度で熱処理して達成できる。上述の処理を施すための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）から提供される。
【００７８】
ｍＲＮＡが出発物質として利用される場合、アニーリング段階を実施する前に逆転写段階が必要であり、逆転写段階の詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８））に開示されている。逆転写のために、ｍＲＮＡのポリＡテールに混成化できるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰｓからなっており、ｄＴプライマーがプライマーとして作用できる限り、その中の一つまたはそれ以上は、他のｄＮＭＰｓに代替できる。逆転写段階は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素をもって行える。ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を利用する場合、反応条件を注意して選択すれば、個別的なＲＮａｓｅ Ｈ切断段階を省略することができる。
【００７９】
本発明の方法は、鋳型核酸分子が特定配列または長さを有するように要求しない。特に、前記分子は、自然の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、化学的に合成されたまたは合成できる核酸分子を含む。したがって、前記核酸配列は、自然から発見されるかまたは発見されないものである。
【００８０】
本発明のために使用されるＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型の一部位に混成化またはアニーリングされて、二重鎖構造を形成する。このような二重鎖構造を形成するに好適なアニーリング条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に説明されている。
【００８１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の配列は、厳格な相補性を有する必要はなく、ただ配列に実質的に相補的であって安定的な二重鎖構造を形成できればよい。したがって、二重鎖構造を形成できる範囲内で、完全な相補性からの離脱が許容される。鋳型核酸の一位置に対するＤＳ ｏｌｉｇｏのアニーリングは、重合酵素による鋳型依存的重合反応のための前提条件である。ＤＳ ｏｌｉｇｏが相補的な核酸に塩基対を形成した要素（参照：Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））は、実質的にプライミング効率に影響を与える。ＤＳ ｏｌｉｇｏのヌクレオチド組成は、アニーリングが最適化される温度に影響を与え、結局プライミング効率に影響を及ぼすことになる。
【００８２】
アニーリング段階の間に、ＤＳ ｏｌｉｇｏの５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化部位または特異性決定位置（即ち、二重特異性決定位置）として重要な役割をするが、その反面、分割部位は、混成化位置としての役割をせず、鋳型と結合しない。
【００８３】
多様なＤＮＡ重合酵素が本発明の方法の伸長段階に使用でき、これは、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素、及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ重合酵素を含む。好ましくは、重合酵素は、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ），Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ，Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）を含む。重合反応を行う時、反応容器に、反応に必要な成分を過量に提供することが好ましい。増幅反応に必要な成分の過量は、増幅反応が成分の濃度に実質的に制限されない程度の量を意味する。Ｍｇ２＋のような助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを、所望の増幅程度が達成できる程度に反応混合物に提供することが望まれる。
【００８４】
本発明において、アニーリングまたは混成化は、ＤＳ ｏｌｉｇｏと鋳型核酸との間に特異的結合を可能にする厳格条件下で行われる。アニーリングのための厳格条件は、配列依存的であり、周囲環境的変数により多様である。本発明において、アニーリング段階は、一般に高い厳格条件下で実施される。しかしながら、もし本発明がミスマッチ許容を要求する方法に適用されたら、一つ以上（しかし、制限された数）のミスマッチにも拘らず５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が鋳型にアニーリングする厳格条件下でアニーリング段階を行うことが好ましい。そのようなミスマッチ許容は、遺伝的多様性を有する遺伝子の増幅または検出において、非常に有用である。厳格条件は、公知の基準から容易に決定できる。
【００８５】
アニーリング段階は、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高いアニーリング温度で実施し、３’−低Ｔｍ特異性部位のみによるアニーリングが発生しないようにすることが有利である。好ましくは、アニーリング温度は、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより少なくとも５℃、より好ましくは、少なくとも１０℃、さらに好ましくは、少なくとも１５℃、最も好ましくは、少なくとも２０℃高い。
【００８６】
好ましい具現例において、アニーリング温度は、４０〜７５℃、より好ましくは、４５〜７２℃、さらに好ましくは、５０〜６８℃、最も好ましくは、５５〜６５℃である。本発明に好適なアニーリング温度は、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍ値と３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍ値を独立的に考慮することにより決定できる。即ち、本発明のアニーリング温度は、５’−高Ｔｍ特異性部位及び３’−低Ｔｍ特異性部位の全体長さと全体ヌクレオチド組成により決定されるものではなく、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位の個別的長さとヌクレオチド組成により決定される。通常５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍ値のみを考慮してアニーリング温度を決定するようになり、３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍ値より非常に高く、これが最適のものとなる。
【００８７】
アニーリング段階において、ミスマッチ許容が要求されたら、アニーリング温度を、上記で提示した温度より低くなるように調整することが好ましい。
【００８８】
本発明は、特定目的を達成するために、公知の他の過程と結合することができる。例えば、製造された産物の分離（または精製）は、伸長過程に後続できる。前記過程は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたは混成化により実施できる。また、本発明の増幅産物は、適合したクローニングベクターに挿入できる。また、本発明の製造産物は、発現ベクターを有する適合した宿主から発現できる。
【００８９】
ＩＩ．ターゲット核酸配列増幅に応用
本発明のまた他の様態によると、本発明は、プライマーとして一対の二重特異性オリゴヌクレオチドを使用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記増幅反応におけるアニーリングは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、ＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供する。
【００９０】
本発明の増幅方法は、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを利用するため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。 また、本方法は、アニーリングと伸長過程を含むため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。例えば、使用された ＤＳ ｏｌｉｇｏの組成と構造、及びアニーリングと伸長のための条件は、本方法と、上述の核酸分子を製造するための方法において、共通する。
【００９１】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本応用は、核酸増幅、好ましくは、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を実施することにより、一つの核酸または核酸混合物（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）からターゲット核酸配列を選択的に増幅する、改善された方法を提供することができる。
【００９２】
上述のように、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用して、二本鎖ＤＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅することは、図２に示されている。図２に示されたように、ＤＳ ｏｌｉｇｏの一対は、変性された二本鎖ＤＮＡ鋳型にアニーリングされる。
【００９３】
アニーリングの間に５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位は、混成化部位または特異性決定位置（即ち、二重特異性決定位置）として重要な役割をするが、その反面、分割部位は、混成化位置としての役割をせず、鋳型と結合しない。この時、分割部位は、二末端部位、即ち、５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位とを空間的に分離させて、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全体特異性が二重的に決定されるように、ＤＳ ｏｌｉｇｏにおいてバブル構造を形成する。後続の反応の詳細内容は、上述の当業界に公知の従来プライマー関連核酸増幅と類似している。
【００９４】
核酸配列を増幅するための本方法は、公知の多様なプライマー関連核酸増幅により行うことができる。好ましくは、その方法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２、及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ工程、より好ましくは、ホットスタートＰＣＲ方法により行うことができる。
【００９５】
図３は、ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用してｍＲＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅することを示す。最初の段階において、多様な生物試料から得られたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテールに混成化可能なオリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を使用して逆転写される。逆転写の詳細なメカニズムは、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５））から見つけることができる。後続の反応の詳細な内容は、上述の公知の従来プライマー関連核酸増幅と類似している。
【００９６】
ＩＩＩ．マルチプレックスＤＮＡ増幅に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、プライマーとして２つ以上の二重特異性オリゴヌクレオチド対を利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲットヌクレオチド配列を増幅させる段階を含み、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする、同一な反応において、２つ以上のプライマー対を同時に使用し、２つ以上のターゲットヌクレオチド配列を増幅する方法を提供する。
【００９７】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、同一な反応で一対以上のプライマーを使用して、一つ以上のターゲット配列を増幅する改善された方法を提供する。一般に、１０個以上のターゲット配列を同時に増幅させるようにマルチプレックスＰＣＲ条件を設計することは、非常に難しいが、その理由は、一つの特定部位（ｌｏｃｕｓ）であっても、非特異的副産物無しに増幅できるように、最適のＰＣＲ反応が要求されるためである。反応において完璧なＤＮＡ−ＤＮＡマッチが発生するようにするためには、十分高い温度でアニーリングがなされるようにする必要があるため、本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏは、増幅の特異性を改善させるその機能のため、マルチプレックスＤＮＡ増幅の最適化に理想的である。本明細書で使用された“マルチプレックスＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）”は、一つの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）混合物において、マルチプレックスＤＮＡターゲットを同時に増幅することを意味する。
【００９８】
本発明の特定具現例において、マルチプレキシング工程は、前記ＤＳ ｏｌｉｇｏのプライマー対を使用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施する段階を含む増幅反応を実施する段階を含み、前記プライマーは、二重特異性オリゴヌクレオチドであって、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されることを特徴とする。
【００９９】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、一つ以上のターゲットヌクレオチド配列及びプライマー対を使用することを除いては、上述の核酸配列の増幅方法にしたがって実施されるため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。例えば、使用されたＤＳ ｏｌｉｇｏの組成及び構造、そして増幅のための条件などは、上述の核酸分子の増幅方法と共通する。
【０１００】
好ましい具現例によると、アニーリング温度は、約４０〜７０℃であり、より好ましくは、４５〜６８℃、さらに好ましくは５０〜６５℃、及び最も好ましくは、５５〜６５℃である。
【０１０１】
好ましい具現例において、ターゲットヌクレオチド配列のそれぞれから増幅された産物は、後続する分析のために大きさが異なる。好ましい具現例によると、マルチプレックスターゲットヌクレオチド配列の増幅産物は、大きさ分別を通じて分析できる。大きさ分別比較は、公知の多様な方法、即ち、ポリアクリルアミドゲルマトリックスまたはアガロースゲルマトリックスを介した電気泳動及びヌクレオチドシーケンシングを通じて実施される。ヌクレオチドシーケンシングは、多様な製造会社から購入可能な自動化シーケンサーにて迅速に実施できる。
【０１０２】
後述の実施例で例示されたように、本発明のマルチプレキシングは、公知の従来マルチプレックス方法の非特異性の問題だけではなく、バックグラウンド問題を除去する。
【０１０３】
マルチプレックス増幅の利点は、数多い疾病または特異的ヌクレオチド配列変異（例えば、単一ヌクレオチド多形性または点突然変異）を、同じ反応で分析できるということにある。同時に分析できる分析物の数は、無制限である；しかしながら、上限は、約２０個であって、これは、分析のために要求される大きさの差異及び増幅された産物を分析できる方法などに依存するとして判断される。
【０１０４】
本発明の方法は、遺伝的及び伝染性疾病の診断、性決定、遺伝的連関分析、及び犯罪科学研究などに適用できる。
【０１０５】
ＩＶ．ＤＮＡシーケンシングに応用
上述の改善された特異性は、溶液相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）シーケンシング（特に、サイクリング）のプライマーとして、または固相シーケンシング（特に、オリゴヌクレオチドチップシーケンシング）のプローブとして、ＤＳ ｏｌｉｇｏが直接シーケンシング（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に使用されるようにする。
【０１０６】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、次の段階を含む、二重特異性オリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物においてターゲット核酸分子をシーケンシングする方法を提供する：
（ａ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、シーケンシングする前記核酸分子に相補的な核酸分子を製造する段であって；前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲット核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、製造反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）前記製造された相補的な核酸分子のヌクレオチド配列を決定する段階。
【０１０７】
一般に、ＤＮＡシーケンシングは、マクサム・ギルバートシーケンシング、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング、及びエキソヌクレアーゼ切断シーケンシングのような多様な方法により実施されてきた。本発明のシーケンシング方法は、熱サイクルシーケンシングだけではなく、パイロシーケンシングを改善する。
【０１０８】
本発明は、サンガージデオキシ方法の多様な変形された方法により実施できる。本発明の熱サイクルシーケンシングは、ＰＣＲ増幅された核酸鋳型に対し実施できる。また、本発明によると、熱サイクルシーケンシングは、シーケンシング前にＰＣＲ増幅されない核酸鋳型に対して実施できる。
【０１０９】
簡略に、サンガーシーケンシングは、ＤＮＡ重合酵素が２’，３’−ジデオキシヌクレオチドを核酸連鎖に挿入して連鎖反応を終結させることに基づく（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９７７） ＰＮＡＳ． ＵＳＡ ７４：５４６３）。サンガーにより発明された前記方法は、ジデオキシ連鎖終結方法を意味する。この方法の最も伝統的な過程において、シーケンシング対象のＤＮＡ切片は、Ｍ１３のような一本鎖ＤＮＡファージにクローニングされる。ＤＮＡ重合酵素Ｉのクレノウ断片により相補的鎖がプライミング合成される時、前記ファージＤＮＡは、鋳型として利用される。前記プライマーは、クローニングされたインサートの３’末端近くのＭ１３ベクター区域と特異的に混成化するために製造されたオリゴヌクレオチドである。四つのシーケンシング反応のそれぞれにおいて、４種のデオキシヌクレオチドの１種に対するジデオキシ類似体の十分な量が存在する下で、プライミング合成が実施されて、これにより、前記終結末端ヌクレオチドの挿入により無作為的に伸長反応が終結される。ジデオキシのデオキシ形態に対する相対的な濃度は、ゲル電気泳動を通じて分析できる、全ての可能な連鎖長さに該当する一連の終結反応がなされるように調節される。合成される連鎖で挿入される標識（ｔａｇ）は、電気泳動の各トラックにおいて、ＤＮＡパターンのオートラジオグラムイメージを得るために使用される。クローニングされた核酸鋳型において、デオキシヌクレオチドの配列は、四つのレーンでバンドのパターンを調査することにより決定される。
【０１１０】
サンガー方法の変形として、熱サイクルシーケンシング方法は、一般に核酸シーケンシングプライマー、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、一つ以上のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰｓ）、適切な緩衝液、熱安定ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｔａｑ重合酵素）、及びシーケンシングされる核酸鋳型を含む溶液の使用を含む。熱サイクルシーケンシングの詳細な内容は、米国特許第５，４３２，０６５号、第５，７２３，２９８号、５，７５６，２８５号、第５，８１７，７９７号、及び第５，８３１，０６５号から分かり、その内容は、本明細書に参照として取り込まれる。前記方法の工程は、通常、一般的なＰＣＲと類似した熱サイクリング条件下で実施される。
【０１１１】
核酸鋳型に対し、シーケンシング反応を実施して、次いで反応産物を分析して配列を決定する。相当な数の検出方法が公知された。このような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （１９９３） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに説明されたように、一般に、ラジオヌクレオチド、蛍光、赤外線、及び化学発光ラベルなどを含む標識の検出を含む。
【０１１２】
ラベルは、プライマーまたはｄｄＮＴＰ、好ましくは、ｄｄＮＴＰで標識できる。最も好ましいラベルは、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン、３−（ε−カルボキシフェニル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン、６−カルボキシ−Ｘ−ロダミン、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３α、４α−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸誘導体、及び４，７−ジクロロロダミン染色剤などを含む蛍光物質である。
【０１１３】
好ましくは、アニーリング温度は、４０〜７０℃、より好ましくは、４５〜６８℃、及び最も好ましくは５０〜６５℃である。
【０１１４】
本方法は、後述の実施例に示されたように、ターゲット核酸分子の高い特異的シーケンシングを示す。より詳細には、マウス胎盤−特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１及びＰｓｘ２は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの独特の構造を有するようにデザインされたシーケンシングプライマーを使用して、分別的にシーケンシングできる。シーケンシングプライマーの全体配列が、３’−低Ｔｍ特異性部位において、ただ一つの塩基に差異があるということを考慮すれば、上述の分別的シーケンシングをより明確に把握することができる。
【０１１５】
驚くことに、本発明は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡポピュレーション内に含まれたターゲット核酸分子が、精製または分離無しにも、直接シーケンシングされるようにする。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡポピュレーション内にあるターゲット核酸分子を成功的に直接シーケンシングしたという報告は、未だにない。本発明のシーケンシング方法が、総ＲＮＡから得たｃＤＮＡポピュレーション内に含まれたターゲット核酸分子を直接的にシーケンシングするように適用される場合、本方法は、次の段階を含む：
（ａ）鋳型誘導の酵素的デオキシリボヌクレイン酸合成が発生するに十分な条件で、ｍＲＮＡｓのポピュレーションを、ｍＲＮＡのポリＡ末端に混成化されるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーと接触させる段階；
（ｂ）オリゴヌクレオチドｄＴプライマーが混成化された前記ｍＲＮＡを逆転写する段階であって、前記オリゴヌクレオチドｄＴプライマーが混成化されたｍＲＮＡに相補的な第１次ｃＤＮＡ鎖を生成する段階；
（ｃ）二重特異性オリゴヌクレオチドをシーケンシングプライマーとして利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、シーケンシングする第１次ｃＤＮＡ鎖に相補的な核酸分子を合成する段階であって；前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸分子の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲット核酸分子にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記合成反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｄ）前記製造された第１次ｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列を決定する段階。
【０１１６】
Ｖ．遺伝的多様性を有した核酸分子の検出に応用
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドの鋳型依存的伸長反応により、遺伝的多様性を有する核酸分子を検出する方法を提供する：
（ａ）二重特異性オリゴヌクレオチドを鋳型核酸分子にアニーリングさせる段階であって、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記鋳型核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、前記アニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じなく、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または前記３’−低Ｔｍ特異性部位がそのターゲット位置に対し１つ以上のミスマッチ塩基を有する場合に発生する条件でアニーリングが発生し、
（ｂ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長して前記鋳型に相補的な前記核酸分子を製造する段階と、
（ｃ）前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記鋳型依存的伸長反応の発生有無を検出する段階。
【０１１７】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用した本応用は、前述した核酸配列を製造するための方法に従って実施されるため、不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【０１１８】
本発明のＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本応用は、アニーリングと伸長段階を含む鋳型依存的伸長反応により、遺伝的多様性を有した核酸配列を選択的に検出する改善された方法を提供することができる。特に、遺伝的多様性を有したターゲット核酸配列の検出は、アニーリング、伸長及び変性段階を含む鋳型依存的伸長反応の過程を繰り返すことによりなされる。
【０１１９】
本発明は、ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）に基づく。
【０１２０】
遺伝的多様性は、多様なゲノムで報告されている。このような現象は、関心対象の遺伝子またはゲノムを失敗なく検出するにおいて、妨害物とみなされてきた。本発明は、ミスマッチ許容性を有するＤＳ ｏｌｉｇｏを使用し、上記のような従来問題を解決する方法を提供する。一定な配列を有したＤＳ ｏｌｉｇｏは、遺伝的多様性を示す様々な配列にアニーリングできて、結局目的のヌクレオチド配列を成功的に増幅して検出できる。即ち、アニーリングと混成化特異性を急激に向上させる目的で、最初に発明されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、アニーリングまたは厳格条件が適切に調節される条件下でミスマッチ許容性を要求する方法にも使用できる。
【０１２１】
ミスマッチ許容性を示すＤＳ ｏｌｉｇｏを提供するために、得られる全てのヌクレオチド配列を整列して、把握された核酸分子の保存区域に基づいてＤＳ ｏｌｉｇｏをデザインすることが好ましい。
【０１２２】
本明細書で使用された用語“保存区域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）”は、多様なヌクレオチド配列間に非常に類似した、遺伝子のヌクレオチド配列または蛋白質のアミノ酸配列の断片を意味する。この用語は、“保存配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”と混用される。
【０１２３】
好ましい具現例において、保存区域内の最も保存された配列は、ＤＳ ｏｌｉｇｏの３’−末端部位に位置して、最も低く保存された配列は、分割部位に位置する。５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位、好ましくは、５’−高Ｔｍ特異性部位は、ＤＳ ｏｌｉｇｏのミスマッチ許容性のため、ターゲット位置に一つ以上、好ましくは、一つ乃至三つ、より好ましくは、一つまたは二つのミスマッチ塩基を有する。ＤＳ ｏｌｉｇｏにミスマッチ許容性を付加するために、アニーリング条件、特にアニーリング温度は、重要である。前記アニーリングは、５’−高Ｔｍ特異性部位及び／または３’−低Ｔｍ特異性部位が一つ以上のミスマッチ塩基を有する場合、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングは発生されないが全ての部位によるアニーリングが発生する条件下で実施される。
【０１２４】
好ましくは、アニーリング温度は、約４０〜７０℃、より好ましくは、４５〜６８℃、最も好ましくは、５０〜６５℃である。
【０１２５】
好ましい具現例によると、本発明は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）により実施される。
【０１２６】
本発明の検出段階は、多様な従来技術により実施できる。例えば、ゲル上で検出するに十分な産物を生成するように、本発明の方法が繰り返して実施される場合、鋳型依存伸長産物の検出は、従来のゲル電気泳動により容易に実施できる。分光学的測定、光化学的測定、生化学的測定、生電子的測定、免疫化学的測定、電子的測定、及び化学的測定により検出可能なラベルを含む場合、鋳型依存的伸長反応の発生有無を検出するために、適した測定が実施できる。
【０１２７】
遺伝的多様性は、ウイルスゲノムで最も頻繁に発見され、かつ発生する（Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４２， ３５３２； Ｔｅｒｓａ Ｃ．ら， （２００２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， １８５， １６６０； Ｔａｋａｓｈｉ Ｅ．ら， （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ４２， １２６； ａｎｄ Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｒ．ら， （２００１） Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ３２， １２２７）。従って、本発明により検出される遺伝的多様性を有した核酸分子は、遺伝的多様性を示すウイルスの核酸が好ましい。例えば、本発明が、遺伝的多様性を示すヒトメタニューモウイルスをＰＣＲにより検出するに適用される場合、ＤＳ ｏｌｉｇｏ構造を有するようにデザインされた最も好ましいプライマーセットは、第３９配列（５’プライマー）及び第４０配列（３’プライマー）、または第３９配列及び第４１配列（３’プライマー）に記載されている。
【０１２８】
ＶＩ．マイクロアレイに固定されたＤＳ ｏｌｉｇｏを使用し、ターゲットヌクレオチド配列の検出に応用
本応用は、ＤＳ ｏｌｉｇｏ固定されたマイクロアレイ上で、鋳型依存的反応を繰り返し実施してターゲットヌクレオチド配列を検出する新規な方法である。
【０１２９】
本発明の他の様態によると、本発明は、次の段階を含む二重特異性オリゴヌクレオチドの鋳型依存的伸長反応により、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出する方法を提供する：
（ａ）混成化、鋳型依存的伸長、及び変性過程を少なくとも１サイクル含む、基質上に固定されたプローブとしての二重特異性オリゴヌクレオチドを伸長する段階であって、前記混成化は、二重特異性オリゴヌクレオチドを核酸試料に接触させることにより行われて、前記二重特異性オリゴヌクレオチドは、５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位の、３つの部位を含み、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、混成化される前記ターゲットヌクレオチド配列の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記分割部位は、少なくとも２つのユニバーサル塩基を含み、前記３’−低Ｔｍ特異性部位は、前記ターゲット核酸の１位置に対し、実質的に相補的な混成化ヌクレオチド配列を有して、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位が前記ターゲットヌクレオチド配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対バブル構造を形成し、増幅反応におけるアニーリングは、３’−低Ｔｍ特異性部位単独によるアニーリングが生じない条件下で実施されて、
（ｂ）鋳型依存的伸長反応の発生有無を分析する段階。
【０１３０】
ＤＳ ｏｌｉｇｏ固定マイクロアレイを使用し、核酸試料においてターゲットヌクレオチド配列を検出するための図示は、図４に示されている。
【０１３１】
ＤＳ ｏｌｉｇｏを使用する本方法は、最適化手順により決定される、適合した混成化条件下で実施できる。温度、成分の濃度、混成化及び洗浄時間、緩衝液成分及びこれらのｐＨ、及びイオン強度などの条件は、オリゴヌクレオチドの長さ及びＧＣ量、そしてターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子に依存する。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドが使用される場合、低い厳格条件が好ましい。混成化のための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認できる。
【０１３２】
ＤＳ ｏｌｉｇｏは、基質上に固定される。好ましい基質は、膜、フィルター、チップ、スライド、水、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、管（ｔｕｂｉｎｇ）、プレート、巨大分子、微細粒子、及び毛細管チューブのような、適合した固体または半固体支持体を含む。固定化は、化学反応または紫外線による共有結合によりなされる。本発明の具現例において、ＤＳ ｏｌｉｇｏは、エポキシ化合物またはアルデヒドグループを含むように変形されたガラス表面またはポリリジンコーティングされた表面に結合される。また、ＤＳ ｏｌｉｇｏＤＳは、リンカー（例えば、エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）を通じて基質に結合される。フォトリソグラフィー、インクゼッティング、機械的マイクロスポッティング及びこれの類似方法のような従来製造技術により、ＤＳ ｏｌｉｇｏはアレイまたは複数のアレイに製作され得る。
【０１３３】
本発明によると、伸長段階で使用されるｄＮＴＰｓは、好ましくはラベルされる。ラベリングのために、分光学的測定、光化学的測定、生化学的測定、生電子的測定、免疫化学的測定、電子的測定、及び化学的測定により検出可能な物質が使用される。例えば、ラベルには、Ｐ３２及びＳ３５のような放射能同位元素、化学発光化合物、蛍光マーカーと染料のような分光学的マーカー、そして磁気ラベルなどを含むが、これに限定されるものではない。例えば、染料には、キノリン染料、トリアリルメタン染料、フタレイン、アゾ染料、及びシアニン染料などを含むが、これに限定されるものではない。蛍光マーカーには、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ロダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、これに限定されるものではない。ラベリングは、公知の多様な方法により行われる。
【０１３４】
基質に、好ましくは固体支持体に固定されたプローブとしてのＤＳ ｏｌｉｇｏと核酸試料のターゲットヌクレオチド配列が混成化された後、ターゲットヌクレオチド配列と混成化されたＤＳ ｏｌｉｇｏは、鋳型依存的段階において、ｄＮＴＰｓ、好ましくは、蛍光ラベルされたｄＮＴＰｓ及びＤＮＡ重合酵素を使用して伸長される。（ａ）段階を反復的に実施して、ＤＳ ｏｌｉｇｏの全てまたは大部分がターゲットヌクレオチド配列と混成化されるようにして、より再現性のある混成化分析結果が得られるようにすることが好ましい。
【０１３５】
混成化の発生は、使用されたラベルタイプによって、公知の多様な方法により確認される。例えば、蛍光顕微鏡、好ましくは、コンフォーカル蛍光顕微鏡が蛍光ラベルを検出するために使用されて、このような装置により検出された信号の強度は、混成化程度に比例して増加する。一般に蛍光顕微鏡には、混成化強度の定量的な二次元イメージを形成するスキャニング装置が付着される。このような装置により検出される信号の強度は、混成化程度と鋳型依存的伸長の程度に比例する。
【発明の効果】
【０１３６】
本発明によると、高混成化特異性及びミスマッチ許容性を有する二重特異性オリゴヌクレオチドの特徴が強調されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１Ａ】図１Ａは、鋳型依存的伸長反応において、本発明の二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドの原理を示す。図１Ａは、高い厳格条件下でＤＳオリゴヌクレオチドの高混成化特異性を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、鋳型依存的伸長反応において、本発明の二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドの原理を示す。図１Ｂは、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を示す。
【図２】本発明のＤＳオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、二本鎖ＤＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅する過程を示す。
【図３】本発明のＤＳオリゴヌクレオチドを使用し、ｍＲＮＡのターゲット核酸を選択的に増幅する過程を示す。
【図４】オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上の二重特異性オリゴヌクレオチドを使用し、ターゲット核酸を選択的に決定する鋳型依存的伸長反応を示す。
【図５】サイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１ベータ及びＩＬ−１９をプライマーセット（ＩＬ−１ｂ−５’−０及びＩＬ−１ｂ−３’−０、レーン１；ＩＬ−１９−５’−０及びＩＬ−１９−３’−０、レーン３）と二重特異性オリゴヌクレオチド（ＩＬ−１ｂ−５’及びＩＬ−１ｂ−３’、レーン２；ＩＬ−１９−５’及びＩＬ−１９−３’、レーン４）を使用したＰＣＲ増幅の結果を示すアガロースゲル写真である。
【図６Ａ】二重特異性オリゴヌクレオチドのＰＣＲ特異性を証明するＤＥＧ１０遺伝子の３’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、完璧なマッチ配列を有するプライマーに対するものであり、レーン２〜４は、３’−低Ｔｍ特異性部位でそれぞれ３、２及び１個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものであり、レーン５〜７は、５’−高Ｔｍ特異性部位でそれぞれ５、３及び２個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものである。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図６Ｂ】ＰＣＲで二重特異性オリゴヌクレオチドのミスマッチ許容を証明するＤＥＧ１０遺伝子の３’−ＲＡＣＥ結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、完璧なマッチ配列を有する一つのプライマーに対するものであり、レーン２〜４は、３’−低Ｔｍ特異性部位でそれぞれ３、２及び１個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものであり、レーン５〜７は、５’−高Ｔｍ特異性部位でそれぞれ５、３及び２個の塩基ミスマッチを有するプライマーに対するものである。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図７Ａ】マウス胎盤−特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１とＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥのための５’プライマーの配列を示す。Ｐｓｘ１−５’−４０及びＰｓｘ２−５’−４０は、従来プライマーであり、Ｐｓｘ１−５’−４１及びＰｓｘ２−５’−４１は、本発明によりデザインされたプライマーである。
【図７Ｂ】Ｐｓｘ１とＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥの結果を示すアガロースゲル写真である。レーン１は、二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーであるＰｓｘ１−５’−４１を使用したＰｓｘ１の３’−ＲＡＣＥであり；レーン２は、二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーであるＰｓｘ２−５’−４１を使用したＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥであり；レーン３は、従来プライマーであるＰｓｘ１−５’−４０を使用したＰｓｘ１の３’−ＲＡＣＥ；及びレーン４は、従来プライマーであるＰｓｘ２−５’−４０を使用したＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥ結果である。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図８】二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーのＰｓｘ１−５’−４１（Ｐｓｘ１場合）及びＰｓｘ２−５’−４１（Ｐｓｘ２場合）をシーケンシングプライマーとして使用し、マウス胎盤ｃＤＮＡプールでＰｓｘ１とＰｓｘ２遺伝子を直接サイクリングシーケンシングした結果を示す。
【図９】９セットのサイトカインファミリー遺伝子特異的二重特異性プライマーを使用したマルチプレックスＰＣＲ結果を示す。レーン１は、９個のサイトカイン遺伝子に対するマルチプレックスＰＣＲを；レーン２は、ＩＬ−３（２００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン３は、ＩＬ−１５（２５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン４は、ＩＬ−１８（３００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン５は、ＩＬ−２５（３５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン６は、ＩＬ−２（４００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン７は、ＩＬ−６（４５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン８は、ＩＬ−１９（５００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；レーン９は、ＩＬ−１ベータ（５５０ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲを；及びレーン１０は、ＩＬ−１０（６００ｂｐ）に対するモノプレックスＰＣＲの結果を示す。Ｍは、Ｆｏｒｅｖｅｒ １００−ｂｐ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｒにより生成された１００−ｂｐ大きさのマーカーである。
【図１０】ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子を二重特異性オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増幅した結果を示す。レーン１、ｈＭＰＶ５’−５８５及びｈＭＰＶ３’−６８９プライマーセットを使用したターゲットＰＣＲ；レーン２、ｈＭＰＶ５’−５８５及びｈＭＰＶ３’−１００７プライマーセットを使用したターゲットＰＣＲ；レーン３、ヒトベータ−アクチンプライマーを使用したターゲットＰＣＲ；レーン４、鋳型のないターゲットＰＣＲ；レーン５、鋳型のないターゲットＰＣＲ。
【発明を実施するための形態】
【０１３８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲ特異性
マウスサイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１９とＩＬ−１ベータのターゲットヌクレオチド配列を増幅するために、本発明により開発されたＤＳオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用した。ＤＳプライマーを利用したＩＬ−１９とＩＬ−１ベータのターゲットヌクレオチド配列の増幅過程と結果が記載されている。
【０１４０】
次の従来プライマー配列を選択して、これは、ＤＳオリゴヌクレオチドとＰＣＲ特異性を比較するために使用した：
実施例で使用されたＩＬ−１９特異的従来プライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’−０ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’（第１配列）；及び
ＩＬ１９−３’−０ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’（第２配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータ特異的従来プライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’−０ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（第３配列）；及び
ＩＬ１ｂ−３’−０ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（第４配列）。
【０１４１】
バックグラウンド及び非特異的産物生成のような、従来プライマー配列から引き起こされる主な問題点を、ＤＳオリゴヌクレオチドが解決できるかどうかを検証するために、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドを従来のプライマー配列に適用した。
【０１４２】
５’部位と３’部位との間にポリデオキシイノシン［ｐｏｌｙ（ｄＩ）］リンカーを有する分割部位を除いては、ＤＳプライマーは、従来プライマーと同一な配列を含む。ＤＳプライマーは、５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、且つ分割部位のＴｍが三つの部位のうち最も低いＴｍを有するようにデザインされる。
【０１４３】
実施例で使用されたＩＬ−１９に対するＤＳプライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’（第５配列）；及び
ＩＬ１９−３’ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＩＩＩＩＩＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’（第６配列）である。ここでＩは、デオキシイノシンである。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータに対するＤＳプライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＩＩＩＩＩＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（第７配列）；及び
ＩＬ１ｂ−３’ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＩＩＩＩＩＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（第８配列）である。ここでＩは、デオキシイノシンである。
【０１４４】
ＩＣＲマウスの胎盤組織から分離したゲノムＤＮＡ ２μｌ（５０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ ２μｌ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）、５’ＤＳまたは従来プライマー１μｌ（１０μＭ）、３’ＤＳまたは従来プライマー１μｌ（１０μＭ）、及びＴａｑ重合酵素０．５μｌ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）を含む２０μｌの最終容量でターゲットＰＣＲ増幅を実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０℃で１分、及び７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間処理した。
【０１４５】
増幅された産物を２％アガロースゲルで電気泳動により分析し、ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して検出した。ＰＣＲ産物は、オートラジオグラフィー、またはシルバー染色のような非放射能検出法（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍ．９７，２３７−２４０；Ｋｏｃｉｏｋ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，２５−３３）、または蛍光標識オリゴヌクレオチドを利用した方法（Ｂａｕｅｒ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，４２７２−４２８０；Ｉｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５１，２３１−２３６．；Ｌｕｅｈｒｓｅｎ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２，１６８−１７４；Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，２７４−２７９）、及びバイオチン化プライマーを利用した方法（Ｋｏｒｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，２３５−２４２；Ｔａｇｌｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６１．７５１−７５３；Ｒｏｓｏｋ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１，１１４−１２１）により変性ポリアクリルアミドゲル上で検出することができる。
【０１４６】
図５から分かるように、サイトカインファミリー遺伝子であるＩＬ−１ｂとＩＬ−１９を、ＩＬ−１ｂ−５’とＩＬ−１ｂ−３’、そしてＩＬ−１９−５’とＩＬ−１９−３’の各プライマーセットを使用してターゲットＰＣＲ増幅した結果、それぞれＩＬ−１ベータ（レーン２）では５５０−ｂｐ、ＩＬ−１９（レーン４）の場合は５００−ｂｐと予想された大きさに該当する単一バンドを形成する。この後、クローンのクローニングと配列分析を通じて、そのバンドは、ＩＬ−１ベータとＩＬ−１９断片であることが確認できた。その反面、［Ｐｏｌｙ（ｄＩ）］を含まない従来プライマーセット（ＩＬ１９−５’−０とＩＬ１９−３’−０；ＩＬ１ｂ−５’−０とＩＬ１ｂ−３’−０）の場合は、非特異的産物が生成された（図５、レーン１とレーン３）。このような結果は、三つの異なるＴｍ部位（５’−高Ｔｍ特異性部位、３’−低Ｔｍ特異性部位、及び分割部位）を有するようにデザインされたＤＳプライマーは、バックグラウンドと非特異的産物の生成のような、従来プライマー配列が誘発する問題点を克服し、ＰＣＲ特異性を大いに向上させることができることを示す。
【０１４７】
実施例２：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲ特異性の評価
本発明の二重特異性オリゴヌクレオチドは、その独特な構造により高い混成特異性及びミスマッチ許容性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を示すことを特徴とし、これは、混成化厳格性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に依存する。ＤＳオリゴヌクレオチドの高い混成特異性は、５’−と３’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる高い厳格条件下でなされる。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容性は、制限されない一つ以上の塩基対ミスマッチが存在するにも拘らず、５’−と３’−部位のいずれも鋳型にアニーリングされる厳格条件下でなされる。
【０１４８】
マウス胎盤から発現されると確認された新しい遺伝子のＤＥＧ１０（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｎ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：４２４−４３４；ＸＭ＿１２９５６７）の３’−ＲＡＣＥ実験により、本発明により開発されたＤＳオリゴヌクレオチドの二重特異性を、混成特異性とミスマッチ許容性の観点で評価した。この評価のために、両側部位の幾つかのヌクレオチドを他のヌクレオチドで置換し、ターゲット鋳型配列にミスマッチされるようにした。
【０１４９】
実施例で使用された５’−ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマーは、次のようである：
ＤＥＧ１０−５’−１０８： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第９配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０３： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’（第１０配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０２： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＣＡＴＣ−３’（第１１配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１０１： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＣＡＴＧ−３’（第１２配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１５８： ５’−ＴＧＴＡＣＴＴＡＴＧＣＧＴＡＴＣＧＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１３配列）；
ＤＥＧ１０−５’−１３８： ５’−ＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１４配列）；及び
ＤＥＧ１０−５’−１２８： ５’−ＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＣＩＩＩＩＩＣＴＣＣＧＡＴＧ−３’（第１５配列）である。
ここで、置換されたヌクレオチドは、下線とボールド体で表示して、Ｉは、デオキシイノシンを示す。
【０１５０】
Ａ．高い厳格条件下におけるＰＣＲ特異性の増加
上記説明した通り、逆転写酵素により第１次ｃＤＮＡ鎖を合成するために、ＩＣＲマウスの１７．５−ｄｐｃ（Ｅ１７．５）胎盤組織から総ＲＮＡを分離及び利用した（Ｈｗａｎｇ，Ｉ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５：１１８０−１１８４）。総ＲＮＡを、次のように組成された反応容量２０μｌで、４２℃で１．５時間逆転写反応を実施した：総ＲＮＡ３μｌ、５×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）４μｌ、ｄＮＴＰｓ ５μｌ（それぞれ２ｍＭ）、１０μＭ ｃＤＮＡ合成プライマー２μｌ（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０−Ａｄａｐｔｅｒ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（４０ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び逆転写酵素１μｌ（２００ ｕｎｉｔｓ／μｌ， Ｐｒｏｍｅｇａ）。超精製されたＨ２Ｏ １８０μｌを入れて、第１次ｃＤＮＡ鎖を希釈した。ｃＤＮＡ合成プライマーのオリゴ（ｄＴ）１８ −ＡＣＰ１は、５’−ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＩＩＩＩＩ（Ｔ）１８−３’であり、ここで、Ｉはデオキシイノシンである。
【０１５１】
希釈した第１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）が含まれた１０×ＰＣＲ緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマー（１０μＭ）１μｌ、オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥを実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６８℃で１分、及び７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２は、５’−ＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＴＩＩＩＩＩ（Ｔ）１５−３’であり、ここで、Ｉはデオキシイノシンである。
【０１５２】
Ｂ．ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容
ＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥを実施するためのサンプルＤＳプライマー、鋳型及びＰＣＲ条件を実施例２Ａと同一にして、アニーリング温度は異ならせた。次の条件でＰＣＲ増幅を実施した：９４℃で５分、６０℃で３分、及び７２℃で３分の過程を１回実施；その後９４℃で４０秒、６５℃で１分、及び７２℃で４０秒の過程を２９回繰り返して実施、及び７２℃で７分間最終伸長サイクル。
【０１５３】
結果的に、図６Ａは、ＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥ実験で、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの高混成特異性を示す。５’−ＤＥＧ１０−特異的ＤＳプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０８）は、ＤＥＧ１０ ３’−ＲＡＣＥで予想した６７７ｂｐ産物を生成させた（レーン１）。その反面、５’部位または３’部位でミスマッチ配列を有した他のプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０３，ＤＥＧ１０−５’−１０２，ＤＥＧ１０−５’−１０１，ＤＥＧ１０−５’−１５８，ＤＥＧ１０−５’−１３８及びＤＥＧ１０−５’−１２８）は、いかなる産物も生成しなかった：３’部位で３個（レーン２）、２個（レーン３）、または１個（レーン４）塩基のミスマッチ；５’部位で５個（レーン５）、３個（レーン６）、または２個（レーン７）塩基のミスマッチ。
【０１５４】
このような結果は、ＤＳプライマーの二重特異性が、高い厳格条件下で３’−末端だけではなく、５’−末端でミスマッチ塩基を区別することができることを証明する。
【０１５５】
一般に、鋳型に完璧に相補的であるべきプライマー部位は、３’−末端であるが、その理由は、この末端がＤＮＡ重合酵素により伸長される部位であって、正確なターゲット配列にアニーリングが発生するようにする最も重要な部位であるからである。その反面、プライマーの５’−末端は、ターゲット配列にアニーリングの特異性を決定するにそれほど重要ではなく、鋳型に相補的ではない制限酵素部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）とプロモーター配列のような追加配列を有するように変形され得る（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｌｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．（２０００）ＰＣＲ．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎ．Ｙ．．）。これとは対照的に、独特な構造に起因する二重特異性により現れるＤＳプライマーの格別な利点は、３’−末端だけではなく、５’−末端でミスマッチ塩基を区別することができるようにすることである。
【０１５６】
図６Ｂは、ＤＳオリゴヌクレオチドのミスマッチ許容の一例をＤＥＧ１０の３’−ＲＡＣＥで示したものである。５’−または３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが全くないか、幾つかあるとしても、ＤＳプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０８，ＤＥＧ１０−５’−１０１，ＤＥＧ１０−５’−１２８及びＤＥＧ１０−５’−１３８）は、ＤＥＧ１０ ３’−ＲＡＣＥの予想される６７７ｂｐ産物を依然として生成した（レーン１，４，６及び７）。その反面、５’または３’部位にさらに多いミスマッチヌクレオチドを有する他のプライマー（ＤＥＧ１０−５’−１０３，ＤＥＧ１０−５’−１０２，ＤＥＧ１０−５’−１５８）は、如何なる産物も生成しなかった（レーン２、３及び５）。前記結果は、ミスマッチ許容を要求する多様なヌクレオチド配列の増幅にＤＳプライマーが利用できることを示す。
【０１５７】
要するに、前記結果は、ＤＳプライマーの次のような原理を裏付ける：
１）アニーリングが５’−高Ｔｍ特異性部位と３’−低Ｔｍ特異性部位との両側部分で発生する場合でのみ、ＤＳプライマーは、鋳型と相補的な核酸分子を合成するために伸長されて（レーン１）；しかしながら、
２）アニーリングが３’−低Ｔｍ特異性部位ではなく、ただ５’−高Ｔｍ特異性部位で発生する場合は、ＤＳプライマーは、鋳型に相補的な核酸分子を合成するために伸長されず（レーン２〜４）；そして、
３）３’−低Ｔｍ特異性部位の配列が鋳型と完璧にマッチされる場合でさえも、高い厳格条件下では、３’−低Ｔｍ特異性部位のみではアニーリングが発生しない（レーン５〜７）。アニーリング部位と関連し、ＤＳプライマーは、初期ＰＣＲ段階で３’−末端部位のみがアニーリングされる場合に伸長されるアニーリング調節プライマー（ＡＣＰ）と明らかに違う（Ｈｗａｎｇ，Ｉ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｉｍｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５：１１８０−１１８４）。
【０１５８】
実施例３：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用した単一塩基の区別
単一塩基区別に対するＤＳオリゴヌクレオチドの二重特異性を証明するために、マウス胎盤特異的ホメオボックスファミリー遺伝子であるＰｓｘ１とＰｓｘ２のｃＤＮＡｓを、従来のプライマーまたはＤＳプライマーのいずれか一つを使用して増幅した。２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓ間の全体配列相同性は、ヌクレオチド水準で９１％であった（Ｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｘ２，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｓｘ（ｐｌａｃｅｎｔａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｅ ２４１：１４９−１５５）。一つまたは二つの塩基差によりＰｓｘ１とＰｓｘ２が区別されるように、５’−プライマーをデザインした（図７Ａ）。しかし、３’−プライマーは、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓの保存された配列を有するようにデザインした。Ｐｓｘ１−とＰｓｘ２−特異的従来及びＤＳプライマー配列は次のようである：
Ｐｓｘ１−５’−１０： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴ−３’ （第１６配列）；
Ｐｓｘ２−５’−１０： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣ−３’ （第１７配列）；
Ｐｓｘ１−５’−１１： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＩＩＩＩＩＴＴＣＴＡＧＣＴ−３’ （第１８配列）；
Ｐｓｘ２−５’−１１： ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＩＩＩＩＩＴＴＣＴＧＧＣＣ−３’ （第１９配列）；
Ｐｓｘ１−５’−４０： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡ−３’ （第２０配列）；
Ｐｓｘ２−５’−４０： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡ−３’ （第２１配列）；
Ｐｓｘ１−５’−４１： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＩＩＩＩＩＧＡＡＩＧＩＧＡ−３’ （第２２配列）；
Ｐｓｘ２−５’−４１： ５’−ＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＩＩＩＩＩＧＡＡＩＣＩＧＡ−３’ （第２３配列）；及び
Ｐｓｘ−３’−２： ５’−ＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＩＩＩＩＩＡＧＡＴＣＣＣＴ−３’ （第２４配列）、
ここで、Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的ヌクレオチドは、下線とボールド体で示した。
【０１５９】
Ａ．第１次ｃＤＮＡ鎖の合成
３’−ＲＡＣＥとＰｓｘ ｃＤＮＡのターゲットＰＣＲの出発物質として、実施例２で合成されたマウス胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖を使用した。
【０１６０】
Ｂ．Ｐｓｘ１−とＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーを利用したＰｓｘ１とＰｓｘ２の３’ＲＡＣＥ
希釈された１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝溶液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’−Ｐｓｘ１−と５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳまたは従来プライマー（１０μＭ）１μｌ 、オリゴ（ｄＴ）１５−ＡＣＰ２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＰｓｘ１及びＰｓｘ２の３’−ＲＡＣＥを行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１６１】
Ｃ．Ｐｓｘ１−及びＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーを使用したＰｓｘ１及びＰｓｘ２ターゲット核酸増幅
希釈された１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝溶液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’−Ｐｓｘ１−または５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳプライマーまたは従来プライマー（１０μＭ）１μｌ 、Ｐｓｘ−３’−２（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでＰｓｘ１及びＰｓｘ２のターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１６２】
結論的に、図７Ｂは、５’Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的プライマーが３’−ＲＡＣＥとターゲットＰＣＲの産物を生成することを示す。２つのＰｓｘ ｃＤＮＡは、３’−末端側で２９ｂｐが除去または添加され、お互い異なるため、３’−ＲＡＣＥにより２９ｂｐ差のある産物が増幅されることを予想することができる。Ｐｓｘ１−またはＰｓｘ２−特異的ＤＳプライマーであるＰｓｘ１−５’−４１及びＰｓｘ２−５’−４１を使用したＰｓｘ１ ｃＤＮＡの３’−ＲＡＣＥは、それぞれ３１１ｂｐ（レーン１）と２８２ｂｐ（レーン２）と、予想の大きさと一致する単一バンドを生成した。３’−ＲＡＣＥにより生成された産物の配列分析を通じて、５’−Ｐｓｘ１−及び−Ｐｓｘ２−特異性プライマーは、それぞれＰｓｘ１とＰｓｘ２ ｃＤＮＡを増幅したことを確認した。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドの原理に従わない従来プライマー（Ｐｓｘ１−５’−４０とＰｓｘ２−５’−４０）は、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓを区別できなかった（レーン３とレーン４）。
【０１６３】
前記結果は、本発明によるＤＳプライマーが一つの単一塩基ミスマッチを区別することができることを示す。したがって、点突然変異を同定するかまたは単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）をゲノタイピングすることにおいて、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドが適用できる。
【０１６４】
実施例４：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドを利用したｃＤＮＡプールで、ターゲットｃＤＮＡの直接シーケンシング
新しいｃＤＮＡを同定して分離しようとする殆どの試みは、ｍＲＮＡ配列の一部分だけを代表するクローンを得るような結果を招来する。一応部分配列を確認したら、転写体の残りの部分は、典型的なｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅）のようなＰＣＲに基づいた方法によりしばしば得るようになり、その後、その得られたｃＤＮＡをシーケンシングするようになる。したがって、現在の全ての方法は、転写体の残りの部分に対する配列情報を得るための必須段階である。もしミッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）配列情報を、ターゲット細胞から得たｃＤＮＡポピュレーションから直接得れば、このような時間消費的な必須過程を完全に回避するようになり、かつ粗生物試料（ｃｒｕｄｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）からターゲットｃＤＮＡ配列を直接的に決定することができる。
【０１６５】
胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖プールを使用して、マウス胎盤特異的ホメオボックス遺伝子であるＰｓｘのｃＤＮＡを直接シーケンシングするために、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。胎盤ｃＤＮＡプールから胎盤特異的遺伝子ｃＤＮＡを直接シーケンシングする方法と結果をここに説明した。実施例３で利用されたものと同一な５’−Ｐｓｘ特異的ＤＳプライマーを使用した。これらのプライマーは、Ｐｓｘ １−５’−１１、Ｐｓｘ ２−５’−１１、Ｐｓｘ １−５’−４１及びＰｓｘ ２−５’−４１である。
【０１６６】
Ａ．第１次ｃＤＮＡ鎖の形成
Ｐｓｘ ｃＤＮＡｓを直接シーケンシングするために、鋳型として実施例２で合成されたマウス胎盤の第１次ｃＤＮＡ鎖を使用した。
【０１６７】
Ｂ．Ｐｓｘ特異的ＤＳプライマーを利用して、胎盤ｃＤＮＡプールでＰｓｘ ｃＤＮＡの直接シーケンシング
希釈した第１次ｃＤＮＡ鎖１３μｌ（１５０ｎｇ）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ反応混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）２μｌ、５×シーケンス緩衝液（Ａｐｐｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２μｌ、及び５’−Ｐｓｘ１−または５’−Ｐｓｘ２−特異的ＤＳプライマー（１μＭ）１．６μｌを含む最終容量２０μｌでサイクルシーケンシング反応を実施し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１０秒、５０〜６０℃で３分、及び６０〜６５℃で４分の過程を４０〜５０回繰り返した。シーケンシング産物を次のように精製した。１）３Ｍのアセト酸ナトリウム（ｐＨ４．６）２μｌと、新鮮で且つ冷たい１００％ＥｔＯＨ ５０μｌを添加、２）３０分間７５℃に維持、３）１３，０００ｇで１５〜３０分間遠心分離及び上清液の除去、４）７０％ＥｔＯＨ ２００μｌで洗浄、５）１３，０００ｇで１５〜３０分間遠心分離及び上清液を除去及び乾燥。シーケンシング産物をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００遺伝分析器で分析する直前にＨｉＤｉホルムアミド１０μｌでペレットを再懸濁した。
【０１６８】
驚くことに、Ｐｓｘ ＤＳプライマーは、それらの特異的Ｐｓｘ ｃＤＮＡｓを正確にシーケンシングした。即ち、Ｐｓｘ１特異的ＤＳプライマー（Ｐｓｘ１−５’−４１）は、専らＰｓｘ１ ｃＤＮＡのみをシーケンシングして、Ｐｓｘ２特異的ＤＳプライマー（Ｐｓｘ２−５’−４１）は、専らＰｓｘ２ ｃＤＮＡのみをシーケンシングした（図８）。Ｐｓｘ２における２９ｂｐ欠損地域がブラックバーで表示された。その反面、ＤＳオリゴヌクレオチドの原理に従わない従来プライマー（Ｐｓｘ１−５’−４０及びＰｓｘ２−５’−４０）は、２つのＰｓｘ ｃＤＮＡｓを区別できなかった。
【０１６９】
このような結果は、ＤＳプライマーがＰＣＲ増幅でのみならず、サイクルシーケンシングでも単一塩基ミスマッチを区別することができることを示す。
【０１７０】
実施例５：ＤＳオリゴヌクレオチドを利用したマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ
マルチプレックスＰＣＲにおいて、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、９個の異なるサイトカインファミリー遺伝子をＤＳプライマーで増幅した。ＤＳプライマーを利用したマルチプレックスＰＣＲ増幅の方法及び結果をここに説明した。各サイトカイン遺伝子の最も長いエキソン配列を利用して、５０ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）を生成するようにサイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマーをデザインした。
【０１７１】
実施例で使用されたＩＬ−３に対するＤＳプライマーは、次のようである（２００ｂｐ）：
ＩＬ３−５’ ５’−ＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＣＩＩＩＩＩＣＴＧＧＡＴＧＡ−３’ （第２５配列）；及び
ＩＬ３−３’ ５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＡＩＩＩＩＩＧＧＴＧＣＴＣＴ−３’ （第２６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１５に対するＤＳプライマーは、次のようである（２５０ｂｐ）：
ＩＬ１５−５’ ５’−ＡＴＧＴＡＧＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＩＩＩＩＩＡＴＧＴＧＡＧＧ−３’ （第２７配列）； 及び
ＩＬ１５−３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＴＩＩＩＩＩＣＣＴＴＧＴＴＡＧＧ−３’ （第２８配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１８に対するＤＳプライマーは、次のようである（３００ｂｐ）：
ＩＬ１８−５’ ５’−ＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＩＩＩＩＩＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡ−３’ （第２９配列）； 及び
ＩＬ１８−３’ ５’−ＡＴＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＴＣＩＩＩＩＩＡＡＧＧＣＧＣＡ−３’ （第３０配列）。
実施例で使用されたＩＬ−２５に対するＤＳプライマーは、次のようである（３５０ｂｐ）：
ＩＬ２５−５’ ５’−ＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＩＩＩＩＩＣＡＡＧＧＣＧＧ−３’ （第３１配列） ； 及び
ＩＬ２５−３’ ５’−ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＴＩＩＩＩＩＧＴＧＧＴＣＣＴ−３’ （第３２配列）。
実施例で使用されたＩＬ−２に対するＤＳプライマーは、次のようである（４００ｂｐ）：
ＩＬ２−５’ ５’−ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＴＧＡＧＴＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧ−３’ （第３３配列）； 及び
ＩＬ２−３’ ５’−ＧＴＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＧＡＩＩＩＩＩＧＡＧＣＴＴＡＴＴＴ−３’ （第３４配列）。
実施例で使用されたＩＬ−６に対するＤＳプライマーは、次のようである（４５０ｂｐ）：
ＩＬ６−５’ ５’−ＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＡＴＡＡＩＩＩＩＩＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡ−３’ （第３５配列）； 及び
ＩＬ６−３’ ５’−ＡＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＩＩＩＩＩＴＧＧＣＴＡＧＧ−３’ （第３６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１９に対するＤＳプライマーは、次のようである（５００ｂｐ）：
ＩＬ１９−５’ ５’−ＧＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＩＩＩＩＩＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴ−３’ （第５配列）； 及び
ＩＬ１９−３’ ５’−ＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＩＩＩＩＩＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧ−３’ （第６配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１ベータに対するＤＳプライマーは、次のようである（５５０ｂｐ）：
ＩＬ１ｂ−５’ ５’−ＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＩＩＩＩＩＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’ （第７配列）； 及び
ＩＬ１ｂ−３’ ５’−ＡＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＩＩＩＩＩＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’ （第８配列）。
実施例で使用されたＩＬ−１０に対するＤＳプライマーは、次のようである（６００ｂｐ）：
ＩＬ１０−５’ ５’−ＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＩＩＩＩＩＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧ−３’ （第３７配列）； 及び
ＩＬ１０−３’ ５’−ＴＧＡＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＴＩＩＩＩＩＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’ （第３８配列）。
【０１７２】
Ａ．サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー１セットを利用したモノプレックス（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）ＰＣＲ
マウスゲノムＤＮＡ２μｌ（５０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的５’ＤＳプライマー（１０μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌで、それぞれのサイトカインファミリー遺伝子に対する単一ターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１７３】
Ｂ．サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー９セットを利用したマルチプレックスＰＣＲ
サイトカインファミリー遺伝子特異的ＤＳプライマー９セットを利用して単一のチューブでマルチプレックスＰＣＲ増幅を実施し：マウスゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的５’ＤＳプライマー（０．２〜５μＭ）１μｌ、各サイトカインファミリー遺伝子特異的３’ＤＳプライマー（０．２〜５μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ； Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量５０μｌで反応混合物を製造し；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；ＰＣＲ条件は、９４℃で５分、５０℃で３分、及び７２℃で３分の過程を１回行った後；９４℃で４０秒、６０℃で１分、及び７２℃で４０秒の過程を２９回繰り返し、７２℃で５分間最終伸長サイクル。
【０１７４】
図９から分かるように、マルチプレックスＰＣＲ増幅は、９個の異なるサイトカイン遺伝子産物に対し、２００ｂｐから６００ｐｂまで、予想大きさと一致する多様なバンドを生成する（図４、レーン１）。各モノプレックスＰＣＲ増幅は、ＩＬ−３場合の２００ｂｐ（図４、レーン２）、ＩＬ−１５場合の２５０ｂｐ（図４、レーン３）、ＩＬ−１８場合の３００ｂｐ（図４、レーン４）、ＩＬ−２５の場合の３５０ｂｐ（図４、レーン５）、ＩＬ−２の場合の４００ｂｐ（図４、レーン６）、ＩＬ−６の場合の４５０ｂｐ（図４、レーン７）、ＩＬ−１９場合の５００ｂｐ（図４、レーン８）、ＩＬ−１ベータの場合の５５０ｂｐ（図４、レーン９）、及びＩＬ−１０場合の６００ｂｐ（図４、レーン１０）と、それぞれ予想大きさと一致する単一バンドを生成した。
【０１７５】
したがって、本発明により開発されたＤＳプライマーを、マルチプレックスＰＣＲに成功的に適用することができることが分かる。ＤＳオリゴヌクレオチドの独特な構造は、従来のマルチプレックスＰＣＲが有している一般的な問題、即ち、プライマー干渉及びダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成の問題を解決する。
【０１７６】
実施例６：二重特異性（ＤＳ）オリゴヌクレオチドのミスマッチ許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を利用したヒトメタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）の検出
ミスマッチ許容において、ＤＳオリゴヌクレオチドプライマーの応用を証明するために、診断試料内のヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）を検出するために、ＤＳプライマーを利用した。ＤＳプライマーを利用してヒトメタニューモウイルスを検出する方法と結果をここに説明した。本実施例は、特定の一つのウイルスを検出するに本発明の適用が限定されるように解釈されてはならない。
【０１７７】
全てのｈＭＰＶ分離物の配列を整列して得た融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子の保存地域を基にして、ＤＳプライマーをデザインした（表１参照）。この分離物の遺伝的多様性を許容するために、プライマーを次の基準に従ってデザインした：（ａ）保存地域は、一つ以上のミスマッチ塩基対が存在するとしても、少なくとも３０ヌクレオチドとなるようにして（表１）；（ｂ）保存地域でミスマッチが最も比率で現れる配列は、好ましくはＤＳプライマーの分割部位に位置するようにして（例えば、ｈＭＰＶ ５’−５８５，ｈＭＰＶ ３’−６９８，及びｈＭＰＶ ３’−１００７）；（ｃ）そうでなければ、ミスマッチヌクレオチドを５’−末端部位に位置するようにして、この中、幾つかはデオキシイノシンのようなユニバーサル塩基で代替可能であり（例えば、ｈＭＰＶ ３’−６９８及びｈＭＰＶ ３’−１００７）；（ｄ）３’−末端部位でミスマッチされた一つまたは二つのヌクレオチドを縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）塩基やユニバーサル塩基で代替することができる（例えば、ｈＭＰＶ ３’−１００７）。
【０１７８】
【表１】
＊ｈＭＰＶ分離物間の遺伝的変異は、下線を引いたヌクレオチドで表示された。
【０１７９】
実施例で使用されたｈＭＰＶ Ｆ遺伝子に特異的なＤＳプライマーは、次のようである：
ｈＭＰＶ ５’−５８５ ５’−ＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＩＩＩＩＩＣＴＡＡＡＴＧＴＴＧ−３’ （第３９配列）；
ｈＭＰＶ ３’−６９８ ５’−ＡＡＣＡＴＣＡＩＴＴＴＴＡＴＩＴＧＴＣＣＴＧＣＡＩＩＩＩＩＴＧＧＣＡＴＧＴ−３’ （第４０配列）；及び
ｈＭＰＶ ３’−１００７ ５’−ＴＴＧＡＩＴＧＣＴＣＡＧＣＩＡＣＡＴＴＧＡＴＩＩＩＩＩＣＷＧＣＴＧＴＧＴＣ−３’ （第４１配列）。
ここで、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｉは、デオキシイノシンである。
【０１８０】
製造会社のプロトコールにしたがって、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ方法を利用し、ウイルス総ＲＮＡを抽出した（ＲＮＡｚｏｌ ＬＳ；Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ）。次のように組成された２０μｌの反応容量で、ウイルスＲＮＡを使用し、４２℃で１．５時間ｃＤＮＡを合成するように逆転写反応を行った：総ＲＮＡ５μｌ（約１００ｎｇ）、５×緩衝液４μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、ｄＮＴＰｓ（各５ｍＭ）５μｌ、１０μＭランダムヘキサデオキシヌクレオチド２μｌ、ＲＮＡａｓｅ阻害剤０．５μｌ（４０ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びモロニーマウス白血病（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）ウイルス逆転写酵素１μｌ（２００ｕｎｉｔｓ／μｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１８１】
第１次ｃＤＮＡ鎖２μｌ（３０ｎｇ）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）２μｌ、５’ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマー（ｈＭＰＶ ５’−５８５；１０μＭ）１μｌ、３’−ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマー（ｈＭＰＶ ３’−６９８またはｈＭＰＶ ３’−１００７；１０ μＭ）１μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ）０．５μｌを含む最終容量２０μｌでｈＭＰＶ Ｆ遺伝子のターゲットＰＣＲ増幅を行って；反応混合物を含むチューブを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置して；サンプルを９４℃で５分間変性させて、９４℃で１分、６０〜６５℃で１分、７２℃で１分の過程を３０回繰り返した後、７２℃で７分間恒温処理した。
【０１８２】
図１０Ｂから分かるように、ｈＭＰＶ−特異的ＤＳプライマーの各対（ｈＭＰＶ ５’−５８５及びｈＭＰＶ ３’−６９８、そしてｈＭＰＶ ５’−５８５及びｈＭＰＶ ３’−１００７）は、それぞれ予想大きさである１５０ｂｐと４５９ｂｐに相応する単一バンドを生成する（レーン１及びレーン２）。その後、産物の配列分析で、前記増幅産物は、ｈＭＰＶ融合糖蛋白質（Ｆ）遺伝子の部分配列であることを確認した。その反面、前記プライマーは、鋳型のないネガティブコントロールＰＣＲでは、如何なる産物も生成しなかった（レーン４及びレーン５）。ポジティブコントロールとして、ヒトベータアクチン特異的プライマーセットを使用した（レーン３）。
【０１８３】
このような結果は、呼吸器疾患を有した患者からｈＭＰＶｓを検出する時に、ＤＳプライマーが適用できることを示す。したがって、診断分野で直面する全ての状況に対し、本発明のＤＳオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のプライマー、またはオリゴヌクレオチドチップではてプローブとして利用できることが分かる。
【０１８４】
実施例７：ＤＳオリゴ固定マイクロアレイ（Ｏｌｉｇｏ−Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を利用したターゲットヌクレオチドの検出
ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ））を利用して、標準プロトコールにしたがって、ターゲット核酸分子の一領域に相補的なＤＳオリゴを合成する。マイクロアレイのために、ガラススライドに、合成されたＤＳオリゴを固定する。その後、ＤＮＡ試料５０〜２００ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２５μｌ、蛍光標識されたｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する：９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、５０〜６５℃で１〜３分、及び６０〜７２℃で１〜４分の過程を１５〜５０回繰り返した後、７２℃で５分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたＤＳオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
【０１８５】
実施例８：ＤＳオリゴヌクレオチドを利用した単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）ゲノタイピング（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ））を利用して、標準プロトコールにしたがって、３’−低Ｔｍ特異性部位の中央に多形性塩基（疑問位置）が位置したＤＳオリゴを合成する。マイクロアレイを行うために、合成されたオリゴヌクレオチドをガラススライドに固定する。その後、ＤＮＡ試料５０〜２００ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２５μｌ、蛍光標識されたｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ２ｍＭ）５μｌ、及びＴａｑ重合酵素（５ｕｎｉｔ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌを含む鋳型依存性伸長反応混合物をマイクロアレイに添加して、その後、マイクロアレイを、予熱された（９４℃）熱サイクラーに載置する。鋳型依存性伸長反応は、次の熱サイクルに従って実施する：９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、５０〜６５℃で１〜３分、及び６０〜７２℃で１〜４分の過程を１５〜５０回繰り返した後、７２℃で５分間伸長。鋳型依存性伸長反応後、伸長されたＤＳオリゴを洗浄し、マイクロアレイスキャナーで得た蛍光イメージを通じてオリゴを検出した後、そのイメージ分析を行う。
【０１８６】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で示されアニーリング特異性を増加させる２つの二重特異性オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含むことを特徴とする、ＤＮＡ又は核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
［式１］
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’
Ｘｐは、アニーリングされる鋳型核酸配列の１位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する５’−高Ｔｍ特異性部位を示し、Ｙｑは、少なくとも３つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Ｚｒは、前記鋳型核酸配列の１位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位を示し、ｐ、ｑ、及びｒは、ヌクレオチドの個数であり、前記ｐは１５乃至４０の整数であり、前記ｑは少なくとも３の整数であり、ｒは３乃至１５の整数であり、Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、前記３’−低Ｔｍ特異性部位より長さが長く、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と前記３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対構造を形成し、前記鋳型核酸配列に対するアニーリング特異性の観点において、前記５’−高Ｔｍ特異性部位が前記３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして、前記二重特異性オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び前記３’−低Ｔｍ特異性部位の両方ともにより決定され、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加され、
前記増幅させる段階中のアニーリングが、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のみでアニーリングが起こらない条件下で行われ、前記増幅させる段階の１サイクル目及び２サイクル目が、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記５’−高Ｔｍ特異性部位と前記３’−低Ｔｍ特異性部位の前記ターゲット核酸配列へのアニーリングを引き起こす。
【請求項２】
アニーリングが、４５℃〜６８℃の温度で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分割部位の前記ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、又は５−ニトロインドールである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ユニバーサル塩基が、デオキシイノシンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
３’−低Ｔｍ特異性部位は、アニーリングされる鋳型核酸の前記位置に対し、完璧に相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｐが、１５乃至２５の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｑが、３乃至１０の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｐが、１５乃至２５の整数であり、ｑが、３乃至１０の整数であり、ｒが、３乃至１５の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが、４０℃〜８０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍが、１０℃〜４０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
分割部位のＴｍが、３℃〜１５℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット核酸配列が、２以上のターゲット核酸配列を含み、プライマーセットが、２以上のプライマーセットを含み、マルチプレックス増幅に用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項１】
下記一般式１で示されアニーリング特異性を増加させる２つの二重特異性オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを利用し、プライマーアニーリング、プライマー伸長、及び変性過程を、少なくとも２サイクル実施し、ターゲット核酸配列を増幅させる段階を含むことを特徴とする、ＤＮＡ又は核酸混合物においてターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
［式１］
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’
Ｘｐは、アニーリングされる鋳型核酸配列の１位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する５’−高Ｔｍ特異性部位を示し、Ｙｑは、少なくとも３つのユニバーサル塩基を含む分割部位を示し、Ｚｒは、前記鋳型核酸配列の１位置に対し、相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する３’−低Ｔｍ特異性部位を示し、ｐ、ｑ、及びｒは、ヌクレオチドの個数であり、前記ｐは１５乃至４０の整数であり、前記ｑは少なくとも３の整数であり、ｒは３乃至１５の整数であり、Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、前記５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍは、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍより高く、前記分割部位は、３つの部位のうち、最も低いＴｍを有し、前記５’−高Ｔｍ特異性部位は、前記３’−低Ｔｍ特異性部位より長さが長く、前記分割部位は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位と前記３’−低Ｔｍ特異性部位が前記鋳型核酸配列にアニーリングされる条件下で、非塩基対構造を形成し、前記鋳型核酸配列に対するアニーリング特異性の観点において、前記５’−高Ｔｍ特異性部位が前記３’−低Ｔｍ特異性部位から分離されるようにして、前記二重特異性オリゴヌクレオチドのアニーリング特異性は、前記５’−高Ｔｍ特異性部位及び前記３’−低Ｔｍ特異性部位の両方ともにより決定され、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの全体アニーリング特異性が増加され、
前記増幅させる段階中のアニーリングが、前記３’−低Ｔｍ特異性部位のみでアニーリングが起こらない条件下で行われ、前記増幅させる段階の１サイクル目及び２サイクル目が、前記二重特異性オリゴヌクレオチドの前記５’−高Ｔｍ特異性部位と前記３’−低Ｔｍ特異性部位の前記ターゲット核酸配列へのアニーリングを引き起こす。
【請求項２】
アニーリングが、４５℃〜６８℃の温度で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分割部位の前記ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ユニバーサル塩基が、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、又は５−ニトロインドールである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ユニバーサル塩基が、デオキシイノシンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
３’−低Ｔｍ特異性部位は、アニーリングされる鋳型核酸の前記位置に対し、完璧に相補的にアニーリングするヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｐが、１５乃至２５の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｑが、３乃至１０の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｐが、１５乃至２５の整数であり、ｑが、３乃至１０の整数であり、ｒが、３乃至１５の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
５’−高Ｔｍ特異性部位のＴｍが、４０℃〜８０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
３’−低Ｔｍ特異性部位のＴｍが、１０℃〜４０℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
分割部位のＴｍが、３℃〜１５℃である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット核酸配列が、２以上のターゲット核酸配列を含み、プライマーセットが、２以上のプライマーセットを含み、マルチプレックス増幅に用いられる請求項１に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−６５６５５（Ｐ２０１２−６５６５５Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２２９４１（Ｐ２０１１−２２２９４１）
【出願日】平成２３年１０月７日（２０１１．１０．７）
【分割の表示】特願２００７−５５７９３７（Ｐ２００７−５５７９３７）の分割
【原出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（５０７２９２９５５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月７日（２０１１．１０．７）
【分割の表示】特願２００７−５５７９３７（Ｐ２００７−５５７９３７）の分割
【原出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（５０７２９２９５５）
【Ｆターム（参考）】
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