人工多能性幹細胞樹立効率改善剤
【課題】
人工多能性幹細胞（以下、iPS細胞という）樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤の提供。
【解決手段】
（１）メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有する人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
（２）体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させるiPS細胞の樹立効率改善方法。
（３）核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させるiPS細胞の製造方法。
（４）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有するiPS細胞の生存増強剤。
人工多能性幹細胞（以下、iPS細胞という）樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤の提供。
【解決手段】
（１）メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有する人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
（２）体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させるiPS細胞の樹立効率改善方法。
（３）核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させるiPS細胞の製造方法。
（４）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有するiPS細胞の生存増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞（以下、iPS細胞という）樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤に関するものである。
より詳細には、メシマコブの菌糸体由来物質を含有するiPS細胞の樹立効率改善剤、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させるiPS細胞の樹立効率改善方法、 核初期化物質とメシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させるiPS細胞の製造方法、及びメシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有するiPS細胞の生存増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。山中らは、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、マウスiPS細胞を樹立した（特許文献1および非特許文献1）。沖田らは、Nanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog-iPS細胞）を樹立することに成功した（非特許文献2）。同様の結果が他のグループによっても再現された（非特許文献3および4）。その後中川らは、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることを明らかにした（非特許文献5）。
【０００３】
さらに山中らは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、ヒトiPS細胞を樹立することに成功した（特許文献1および非特許文献6）。一方、トムソンらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（特許文献2および非特許文献7）。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
【０００４】
しかしiPS細胞の樹立効率は1%以下と低く、特にヒトiPS細胞に関しては、レトロウイルスを用いてOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子を導入した場合であっても、樹立効率は0.01%程度に留まっている（非特許文献6）。
【０００５】
近年、レトロウイルスよりも安全な核初期化遺伝子の導入法として、アデノウイルスベクター（非特許文献8）、プラスミド（非特許文献9）、piggy Bacトランスポゾン（非特許文献10および11）、あるいはエピゾーマルベクター（非特許文献12）を用いた導入や、初期化因子をタンパク質として導入する方法（非特許文献13および14）などが相次いで報告されている。しかしながら、いずれの導入法を用いた場合も、レトロウイルスよりもさらにiPS細胞の樹立効率は低く、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4因子をタンパク質として導入した場合のヒトiPS細胞の樹立効率は、0.001%程度と極めて低く（非特許文献14）、実用化の大きな障害となっている。そのため安全で効果の高いiPS細胞の樹立効率改善剤の開発が望まれている状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2007/069666 A1
【特許文献２】WO 2008/118820 A2
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
【非特許文献２】Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
【非特許文献３】Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
【非特許文献４】Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
【非特許文献５】Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
【非特許文献６】Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
【非特許文献７】Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
【非特許文献８】Stadtfeld, M. et al., Science, 322, 945-949 (2008)
【非特許文献９】Okita, K. et al., Science, 322, 949-953 (2008)
【非特許文献１０】Woltjen, K. et al., Nature, 458:766-771 (2009)
【非特許文献１１】Kaji, K. et al., Nature, 458:771-776 (2009)
【非特許文献１２】Yu, J. et al., Science, 324: 797-801 (2009)
【非特許文献１３】Zhou, H., et al., Cell Stem Cell, 4:381-384 (2009)
【非特許文献１４】Kim, D., et al., Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、iPS細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、iPS細胞、特にヒトiPS細胞の樹立効率を改善すべく、鋭意検討を行った結果、メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物（PL-EtOH）および熱水抽出物（PL-2C）が、ヒトiPS細胞の樹立効率を改善（向上）する効果を有することを見出した。特に、体細胞の核初期化工程において、メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物を培地に添加することにより、添加しない場合に比べて、ヒトiPS細胞の樹立効率が顕著に上昇することを見出した。また、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を培地に添加することにより、bFGF非存在下でもヒトiPS細胞の樹立効率を向上させる効果があること、及びフィーダー細胞非存在下での培養においても、ヒトiPS細胞の生存を増強できることを見出した。
iPS細胞の樹立効率改善剤については、今まで幾つかの報告がなされているが（例えばNat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)、Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))などを参照）、天然資源からiPS細胞の樹立効率改善効果を有する物質を見出したのは本発明が初めてである。
本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
請求項１：メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
請求項２：iPS細胞がヒト由来である請求項１記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
請求項３：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項１、又は請求項２記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
請求項４：体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
請求項５：体細胞がヒト由来である、請求項４記載の樹立効率改善方法。
請求項６：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項４、又は請求項５記載のiPS細胞樹立効率改善方法。
請求項７：核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の製造方法。
請求項８：iPS細胞がヒト由来である請求項７記載の製造方法。
請求項９：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項７、又は請求項８記載のiPS細胞の製造方法。
請求項１０：核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項７〜請求項９記載のiPS細胞の製造方法。
請求項１１：核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１２：核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１３： 核初期化物質がOct3/4, Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１４： メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
請求項１５： フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項１4記載のiPS細胞の生存増強剤。
請求項１６： iPS細胞がヒト由来である請求項１４、又は請求項１５記載のiPS細胞の生存増強剤。
【発明の効果】
【００１１】
（１）本願発明に係るメシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤により、iPS細胞の樹立効率を大幅に引き上げることができる。
（２）メシマコブの菌糸体は、均一の培養基で工業的に安定して生産することができるので、本願発明に使用するメシマコブの菌糸体由来物質（メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物、熱水抽出物等）も容易に、安定して得ることができる。
（３）メシマコブについては、近年抗腫瘍活性、抗アレルギー活性、抗酸化活性及びウイルスのワクチンに対するアジュバント作用など、人に対する有効性が報告されている。
又古くから伝承的に、メシマコブの煎じ液を疾病の予防及び改善を目的として飲用されていた経緯もあり、現在健康食品として、多量に販売されているものである。
したがって、従来の低分子化合物の樹立効率改善剤と比べて細胞へのダメージが少なく、より安全性の高い樹立効率改善剤であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メシマコブ菌糸体から熱水抽出物（ＰＬ−２Ｃ）を得るための抽出方法を示す図である。
【図２】メシマコブ菌糸体からエタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）を得るための抽出方法を示す図である。
【図３】ヒトiPS細胞樹立に対するメシマコブ菌糸体由来抽出物の効果を示した結果である。グラフ中、黒棒はトータルコロニー数を、また白棒はiPS細胞コロニー数を示す。
【図４】Aは、bFGF存在下、非存在下における、ヒトiPS細胞樹立に対するメシマコブ菌糸体由来抽出物の効果を示した結果である。グラフ中、黒棒はトータルコロニー数を、また白棒はiPS細胞コロニー数を示す。横軸の数字は表1の♯1〜♯14の各条件下での実験結果を示す。Ｂは、表１の♯1, 4, 7, 8, 11及び14の条件下で得られたヒトiPSコロニーをアルカリフォスファターゼ（ALP)で染色した結果を示す。
【図５】フィーダー細胞非存在下での培養における、ヒトiPS細胞の生存に対するPL-2Cの効果を示したiPSコロニーの写真である。右下のScale bar = 1000μm。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）メシマコブの菌糸体由来物質の調製
（イ）本願発明に用いたPhellinus linteus （メシマコブ）は、１９９８年１０月に宮崎県西諸県郡須木村で、子実体を採取し、株式会社アイ・ビー・アイ応用キノコ研究所で菌糸体化した上でＰＬ−０８株として保存していたものを使用した。この菌株は、子実体を農林水産省林野庁総合研究所森林生物部森林微生物科 腐朽病害研究室の阿部恭久博士の鑑定により、メシマコブ子実体に特有の黄褐色の剛毛体を持つこと、及び担子胞子の形態、からメシマコブと同定されたものを用いた。
【００１４】
（ロ）メシマコブ菌糸体成分の取得
（ａ）メシマコブ菌糸体の乾燥粉末の取得
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４を各０．０５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の液体培地に、メシマコブの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥してメシマコブの菌糸体の乾燥粉末（６０メッシュパス）を得た。
【００１５】
（ｂ）メシマコブの菌糸体の熱水抽出物（ＰＬ−２Ｃ）の取得
メシマコブの菌糸体の乾燥粉末２０ｇに、イオン交換水１４０ｍＬを加え、１０５℃で６０分、熱水抽出処理を行ない、遠心分離で不溶物を除去し、さらに段階的に熱水抽出液を吸引濾過（４μｍ濾紙、１μｍ濾紙）しメシマコブの菌糸体の熱水抽出物を得た。試験用サンプルの調製としては、固形分５％に調製し、０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルターで濾過し、滅菌済みサンプル（ＰＬ−２Ｃ）とした（図１参照）。
【００１６】
（ｃ）メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）の取得
前記（ロ）（ａ）のメシマコブの菌糸体の乾燥粉末５０ｇに、エタノール１Ｌを加え、１５℃下で攪拌抽出を２４時間行った（抽出一回目）。２０μｍ濾紙を用いた吸引濾過でメシマコブ菌糸体とエタノール抽出物に分け、再度、メシマコブ菌糸体にエタノールを加え１５℃下で攪拌抽出を２４時間行った（抽出二回目）。抽出終了後、段階的に２０μｍ、８μｍ、２．５μｍ濾紙を用いて吸引濾過を行い、一回目と二回目のエタノール抽出物を混合し、エバポレーターにて濃縮（４０℃以下）しエタノール抽出物を獲得した。
最終的なサンプル調製としては、エタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）：１．５ｇにエタノール１０ｍＬを加え溶解する。エタノールで十分に溶解させた溶液に０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水２０ｍＬを加え、さらに攪拌し、溶解させた溶液を試験サンプルとして−２０℃以下で保存した（図２参照）。
【００１７】
（２）メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物は、核初期化工程において、各々単独で用いることも、混合して用いることもできる。好ましくは各々単独で用いる。これらの抽出物は、体細胞の培養に適した培地中に存在させることもできれば、ES細胞の培養に適した培地中に存在させることもできる。ここで体細胞の培養に適した培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが例示される。また、上記でES細胞培の培養に適した培地としては、例えばマウスの場合、LIFを加えたES細胞用培地（DMEM (Nacarai tesque)に15%牛胎仔血清、2 mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン(Invitrogen)と50μg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を加えたもの）が例示される。またヒトの場合、市販の霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地が例示される。なお、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物は、bFGF非存在下でもヒトiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなったため、上記培地からbFGFを除いた培地を使用することができる。
【００１８】
メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物の培地中の濃度は、体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲であれば特に限定されない。具体的には、培地中における濃度が0.01%〜1%(v/v)の範囲、好ましくは0.05%〜0.5%(v/v)の範囲で適宜選択される。より好ましくは0.1%(v/v)程度である。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はない。
【００１９】
メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物は、該抽出物の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、核初期化物質(下記3.を参照）が遺伝子の場合は、当該核初期化遺伝子は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、樹立効率改善物質は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、本発明の抽出物を培地に添加することができる。
【００２０】
通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。なお、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を用いた場合は、フィーダー細胞非存在下での培養においても、ヒトiPS細胞の生存を増強し、iPS細胞の培養を可能とすることができるため、フィーダー細胞無しの培養条件も用いることができる。
【００２１】
（３） 体細胞ソース
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２２】
体細胞を採取するソースとなる哺乳動物は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２３】
（４）核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク質またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。核初期化物質がタンパク質またはそれをコードする核酸の場合、具体的には、たとえば、Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸を挙げることができる(WO2007/69666; Science, 2007, 318:1917-1920)。これらのファミリーメンバーおよびその組み合わせの具体例を以下に列挙する。なお、以下においてはタンパク質の名称のみ記載するが、これをコードする核酸も含まれる。
【００２４】
(a) Octファミリーメンバーからなる1種の核初期化物質；
(b) Octファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組み合わせ；
(c) Octファミリーメンバー及びKlfファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組合せ；
(d)Octファミリーメンバー及びNanogからなる2種の核初期化物質の組合せ；
(e) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組み合わせ；
(f) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組合せ。
(g) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる4種の核初期化物質の組み合わせ；並びに
(h) Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる4種の核初期化物質の組み合わせ。
より具体的には、以下の組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（またはKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
【００２５】
上記(1)-(24)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらにLin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28bなどを用いることもできる。
また、上記(1)-(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(24)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２６】
さらにまた、上記の核初期化物質に加えて、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、及びβ-cateninからなる群から選ばれる1種以上の核初期化物質を組み合わせてもよく、および／またはECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Mybl2、ECAT15-1、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の核初期化物質を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについてはWO2007/69666に具体的に説明されている。
これらの組み合わせの中で、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(またはL-Myc)、Lin28、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸から選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。特に好ましいのは、(1)Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-Myc、またはそれらをコードする核酸、(2)Oct3/4, Klf4, Sox2およびL-Myc、またはそれらをコードする核酸、あるいは(3)Oct3/4, Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である。
【００２７】
上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrgのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
【００２８】
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
なお、核初期化物質の遺伝子名は、ヒト由来の遺伝子の場合、学術論文では全て大文字（例えば「OCT3/4」）で記載するが、本明細書においては最初の一文字のみ大文字であっても（例えば「Oct3/4」）、マウスのみならず、ヒトやその他の動物種の場合も含むものとする。
【００２９】
核初期化物質としてタンパク質自体を用いる場合には、得られたｃDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク質を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク質をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターやプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００３０】
核初期化物質の体細胞への接触は、該物質がタンパク質である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【００３１】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化物質のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００３２】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
近年、マウスおよびヒトにおいて、核初期化物質(タンパク質）をポリアルギニンやTAT等のCPP(cell penetrating peptide)と共に導入してiPS細胞を樹立する方法が開発されており、これらの手法を用いることもできる(Cell Stem Cell, 4:381-(2009)、Cell Stem Cell,
doi: 10.1016/j.stem.2009.05.005-(2009))。
【００３３】
体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また該核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。好ましくは該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３４】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス（例、pMX）、レンチウイルス（例、pKP114）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、EBV、SV40、センダイウイルス等に由来する自律複製可能なエピゾーマルベクター、動物細胞発現用プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
【００３５】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばSRαプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスのLTR、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、EF1αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが用いられる。ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、CAGプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーターとβ-グロビン遺伝子のポリAシグナル部位を含む）を用いることができる。
【００３６】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。
【００３７】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターやウイルス由来の自律複製機構を有するエピゾーマルベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。また、ベクターとしてエピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載されている。
さらにトランスポゾンを用いることもでき、例えばpiggy Bacトランスポゾンを用いた具体的手段は、Nature, 458:766-771（2009）および Nature, 458:771-776（2009）に記載されている。
【００３８】
プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回又は4回)繰り返して行うことができる。
【００３９】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００４０】
（５）iPS細胞の樹立効率改善物質
本発明のメシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００４１】
なお、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40LT等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化因子として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク質である場合、(b) 該タンパク質をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
【００４２】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、iPS細胞の樹立効率改善物質が低分子化合物である場合には、核初期化遺伝子は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、樹立効率改善物質は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００４３】
マウスまたはヒトから分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。初期化遺伝子及びiPS細胞の樹立効率改善物質との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
【００４４】
（６）iPS細胞の候補コロニーの選択
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4およびSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００４５】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。これらの試験方法はいずれも周知である。
【００４６】
（７）iPS細胞の用途
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。また、患者本人でなくても、HLAの型が同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導し、そこから所望の細胞へ分化させ、これを患者への移植に用いることもできる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４７】
ヒトiPS細胞樹立に対するPL-2C、PL-EtOHの効果
ヒト歯髄幹細胞（J.Dent.Res., 87(7): 676-681 (2008)）に対してCell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。このSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を1 x 10５個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびc-MYCの4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から６日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った（3 x 10４個/ウェル、６ウェルプレート）。翌日から以下の3種類の培地で培養を行った。
（a)霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
(c)上記(a)に、さらにPL-EtOHを終濃度0.1%となるように添加した培地
2日に1回、上記の培地で培地交換を行いながら培養を続け、レトロウイルス感染後26日目に出現したトータルコロニーおよびヒトiPSコロニー（ES-likeコロニー）の数をカウントした。結果を図３に示す。図３に示されるように、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率の上昇が認められた。
以上のように、メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、iPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。
【実施例２】
【００４８】
ヒトiPS細胞樹立に対するbFGF存在下、非存在下でのPL-2C、PL-EtOHの効果
bFGF存在下、非存在下でのPL-2C、PL-EtOHの効果を検討した。
実施例１と同じSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を、1 x 10５個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYC1（以下単にL-MYCと称する）の4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から６日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った（3 x 10４個/ウェル、６ウェルプレート）。
翌日から以下の表1の♯1〜14の各培養条件下（霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地に対して、bFGF添加の有無、およびPL-2C、PL-EtOH添加の有無と濃度がそれぞれ異なる）で培養を行った。
【００４９】
【表１】
【００５０】
2日に1回、上記の培地で培地交換を行いながら培養を続け、レトロウイルス感染後25日目に出現したトータルコロニーおよびヒトiPSコロニー（ES-likeコロニー）の数をカウントした。結果を表1および図４に示す。図４Aは表1の結果をグラフ化したものであり、図４Bは♯1, 4, 7, 8, 11および14の条件下で得られたヒトiPSコロニーをアルカリフォスファターゼ（ALP)で染色した結果を示す。生じたコロニーはALP陽性であったため、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。
bFGFを培地に添加しない系においては、PL-EtOH添加によるiPSコロニー樹立効率上昇効果は全く認められなかった。
一方、PL-2C添加の場合は、bFGFを培地に添加しない系であってもiPSコロニーの樹立効率上昇効果が認められ、PL-2Cが終濃度0.1%の場合はPL-2Cを加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が8倍上昇した。
bFGFを培地に添加した場合は、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が9〜10倍上昇した（PL-EtOHの終濃度0.1%の場合）。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した（PL-2Cの終濃度0.1%の場合）。
【００５１】
以上より、以下のことが示された。
（1）メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、bFGF存在下でiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。特にPL-EtOHのほうがその効果は顕著であった。
（2）PL-2Cは、bFGF非存在下でもiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。PL-EtOHにはそのような効果が認められなかったことから、PL-2CにはbFGFそのもの、またはbFGFと同様の機能を有する因子が含まれている可能性が示唆された。
【実施例３】
【００５２】
フィーダー細胞非存在下での培養における、ヒトiPS細胞の生存に対するPL-2Cの効果
成人皮膚由来線維芽細胞（aHDF-Slc7a1）に対してOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYCの4遺伝子をレトロウイルスを用いて導入することにより樹立されたヒトiPS細胞（32R6、18継代目）（WO2009/057831）を、細胞解離剤であるAccutase（Invitrogen)を用いて剥離し、単一細胞化した。この細胞を、(1)マトリゲル（Becton, Dickinson and Company）、(2)CellStart (Invitrogen)、または(3)コラーゲンI（IWAKI)のいずれかをコートした６ウェルプレート上に、3.5 x 10５個/ウェルの密度で蒔いた。各細胞を、以下の(a)または(b)の条件下で培養した。
【００５３】
(a)霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
【００５４】
培養開始から10日目のヒトiPSコロニーの写真を図５に示す。(1)〜(3)のいずれのプレートを用いた場合においても、PL-2Cを添加することにより、添加しない場合に比べて、ヒトiPS細胞のコロニー数が顕著に増加していた。なおこのような効果はPL-EtOHは有していなかった。
以上のようにPL-2Cは、フィーダー細胞の無い条件下で、ヒトiPS細胞の生存を増強させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本願発明に係るメシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤によれば、iPS細胞の樹立効率を大幅に引き上げることができるので、医学分野（例：再生医療産業）における産業への利用が可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞（以下、iPS細胞という）樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤に関するものである。
より詳細には、メシマコブの菌糸体由来物質を含有するiPS細胞の樹立効率改善剤、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させるiPS細胞の樹立効率改善方法、 核初期化物質とメシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させるiPS細胞の製造方法、及びメシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有するiPS細胞の生存増強剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。山中らは、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、マウスiPS細胞を樹立した（特許文献1および非特許文献1）。沖田らは、Nanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog-iPS細胞）を樹立することに成功した（非特許文献2）。同様の結果が他のグループによっても再現された（非特許文献3および4）。その後中川らは、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることを明らかにした（非特許文献5）。
【０００３】
さらに山中らは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、ヒトiPS細胞を樹立することに成功した（特許文献1および非特許文献6）。一方、トムソンらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（特許文献2および非特許文献7）。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
【０００４】
しかしiPS細胞の樹立効率は1%以下と低く、特にヒトiPS細胞に関しては、レトロウイルスを用いてOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子を導入した場合であっても、樹立効率は0.01%程度に留まっている（非特許文献6）。
【０００５】
近年、レトロウイルスよりも安全な核初期化遺伝子の導入法として、アデノウイルスベクター（非特許文献8）、プラスミド（非特許文献9）、piggy Bacトランスポゾン（非特許文献10および11）、あるいはエピゾーマルベクター（非特許文献12）を用いた導入や、初期化因子をタンパク質として導入する方法（非特許文献13および14）などが相次いで報告されている。しかしながら、いずれの導入法を用いた場合も、レトロウイルスよりもさらにiPS細胞の樹立効率は低く、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4因子をタンパク質として導入した場合のヒトiPS細胞の樹立効率は、0.001%程度と極めて低く（非特許文献14）、実用化の大きな障害となっている。そのため安全で効果の高いiPS細胞の樹立効率改善剤の開発が望まれている状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2007/069666 A1
【特許文献２】WO 2008/118820 A2
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
【非特許文献２】Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
【非特許文献３】Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
【非特許文献４】Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
【非特許文献５】Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
【非特許文献６】Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
【非特許文献７】Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
【非特許文献８】Stadtfeld, M. et al., Science, 322, 945-949 (2008)
【非特許文献９】Okita, K. et al., Science, 322, 949-953 (2008)
【非特許文献１０】Woltjen, K. et al., Nature, 458:766-771 (2009)
【非特許文献１１】Kaji, K. et al., Nature, 458:771-776 (2009)
【非特許文献１２】Yu, J. et al., Science, 324: 797-801 (2009)
【非特許文献１３】Zhou, H., et al., Cell Stem Cell, 4:381-384 (2009)
【非特許文献１４】Kim, D., et al., Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、iPS細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、iPS細胞、特にヒトiPS細胞の樹立効率を改善すべく、鋭意検討を行った結果、メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物（PL-EtOH）および熱水抽出物（PL-2C）が、ヒトiPS細胞の樹立効率を改善（向上）する効果を有することを見出した。特に、体細胞の核初期化工程において、メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物を培地に添加することにより、添加しない場合に比べて、ヒトiPS細胞の樹立効率が顕著に上昇することを見出した。また、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を培地に添加することにより、bFGF非存在下でもヒトiPS細胞の樹立効率を向上させる効果があること、及びフィーダー細胞非存在下での培養においても、ヒトiPS細胞の生存を増強できることを見出した。
iPS細胞の樹立効率改善剤については、今まで幾つかの報告がなされているが（例えばNat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)、Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))などを参照）、天然資源からiPS細胞の樹立効率改善効果を有する物質を見出したのは本発明が初めてである。
本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
請求項１：メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
請求項２：iPS細胞がヒト由来である請求項１記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
請求項３：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項１、又は請求項２記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
請求項４：体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
請求項５：体細胞がヒト由来である、請求項４記載の樹立効率改善方法。
請求項６：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項４、又は請求項５記載のiPS細胞樹立効率改善方法。
請求項７：核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の製造方法。
請求項８：iPS細胞がヒト由来である請求項７記載の製造方法。
請求項９：メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項７、又は請求項８記載のiPS細胞の製造方法。
請求項１０：核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項７〜請求項９記載のiPS細胞の製造方法。
請求項１１：核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１２：核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１３： 核初期化物質がOct3/4, Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
請求項１４： メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
請求項１５： フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項１4記載のiPS細胞の生存増強剤。
請求項１６： iPS細胞がヒト由来である請求項１４、又は請求項１５記載のiPS細胞の生存増強剤。
【発明の効果】
【００１１】
（１）本願発明に係るメシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤により、iPS細胞の樹立効率を大幅に引き上げることができる。
（２）メシマコブの菌糸体は、均一の培養基で工業的に安定して生産することができるので、本願発明に使用するメシマコブの菌糸体由来物質（メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物、熱水抽出物等）も容易に、安定して得ることができる。
（３）メシマコブについては、近年抗腫瘍活性、抗アレルギー活性、抗酸化活性及びウイルスのワクチンに対するアジュバント作用など、人に対する有効性が報告されている。
又古くから伝承的に、メシマコブの煎じ液を疾病の予防及び改善を目的として飲用されていた経緯もあり、現在健康食品として、多量に販売されているものである。
したがって、従来の低分子化合物の樹立効率改善剤と比べて細胞へのダメージが少なく、より安全性の高い樹立効率改善剤であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メシマコブ菌糸体から熱水抽出物（ＰＬ−２Ｃ）を得るための抽出方法を示す図である。
【図２】メシマコブ菌糸体からエタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）を得るための抽出方法を示す図である。
【図３】ヒトiPS細胞樹立に対するメシマコブ菌糸体由来抽出物の効果を示した結果である。グラフ中、黒棒はトータルコロニー数を、また白棒はiPS細胞コロニー数を示す。
【図４】Aは、bFGF存在下、非存在下における、ヒトiPS細胞樹立に対するメシマコブ菌糸体由来抽出物の効果を示した結果である。グラフ中、黒棒はトータルコロニー数を、また白棒はiPS細胞コロニー数を示す。横軸の数字は表1の♯1〜♯14の各条件下での実験結果を示す。Ｂは、表１の♯1, 4, 7, 8, 11及び14の条件下で得られたヒトiPSコロニーをアルカリフォスファターゼ（ALP)で染色した結果を示す。
【図５】フィーダー細胞非存在下での培養における、ヒトiPS細胞の生存に対するPL-2Cの効果を示したiPSコロニーの写真である。右下のScale bar = 1000μm。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）メシマコブの菌糸体由来物質の調製
（イ）本願発明に用いたPhellinus linteus （メシマコブ）は、１９９８年１０月に宮崎県西諸県郡須木村で、子実体を採取し、株式会社アイ・ビー・アイ応用キノコ研究所で菌糸体化した上でＰＬ−０８株として保存していたものを使用した。この菌株は、子実体を農林水産省林野庁総合研究所森林生物部森林微生物科 腐朽病害研究室の阿部恭久博士の鑑定により、メシマコブ子実体に特有の黄褐色の剛毛体を持つこと、及び担子胞子の形態、からメシマコブと同定されたものを用いた。
【００１４】
（ロ）メシマコブ菌糸体成分の取得
（ａ）メシマコブ菌糸体の乾燥粉末の取得
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４を各０．０５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の液体培地に、メシマコブの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥してメシマコブの菌糸体の乾燥粉末（６０メッシュパス）を得た。
【００１５】
（ｂ）メシマコブの菌糸体の熱水抽出物（ＰＬ−２Ｃ）の取得
メシマコブの菌糸体の乾燥粉末２０ｇに、イオン交換水１４０ｍＬを加え、１０５℃で６０分、熱水抽出処理を行ない、遠心分離で不溶物を除去し、さらに段階的に熱水抽出液を吸引濾過（４μｍ濾紙、１μｍ濾紙）しメシマコブの菌糸体の熱水抽出物を得た。試験用サンプルの調製としては、固形分５％に調製し、０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルターで濾過し、滅菌済みサンプル（ＰＬ−２Ｃ）とした（図１参照）。
【００１６】
（ｃ）メシマコブの菌糸体のエタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）の取得
前記（ロ）（ａ）のメシマコブの菌糸体の乾燥粉末５０ｇに、エタノール１Ｌを加え、１５℃下で攪拌抽出を２４時間行った（抽出一回目）。２０μｍ濾紙を用いた吸引濾過でメシマコブ菌糸体とエタノール抽出物に分け、再度、メシマコブ菌糸体にエタノールを加え１５℃下で攪拌抽出を２４時間行った（抽出二回目）。抽出終了後、段階的に２０μｍ、８μｍ、２．５μｍ濾紙を用いて吸引濾過を行い、一回目と二回目のエタノール抽出物を混合し、エバポレーターにて濃縮（４０℃以下）しエタノール抽出物を獲得した。
最終的なサンプル調製としては、エタノール抽出物（ＰＬ−ＥｔＯＨ）：１．５ｇにエタノール１０ｍＬを加え溶解する。エタノールで十分に溶解させた溶液に０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水２０ｍＬを加え、さらに攪拌し、溶解させた溶液を試験サンプルとして−２０℃以下で保存した（図２参照）。
【００１７】
（２）メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物は、核初期化工程において、各々単独で用いることも、混合して用いることもできる。好ましくは各々単独で用いる。これらの抽出物は、体細胞の培養に適した培地中に存在させることもできれば、ES細胞の培養に適した培地中に存在させることもできる。ここで体細胞の培養に適した培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが例示される。また、上記でES細胞培の培養に適した培地としては、例えばマウスの場合、LIFを加えたES細胞用培地（DMEM (Nacarai tesque)に15%牛胎仔血清、2 mM L-グルタミン(Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen)、100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン(Invitrogen)と50μg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen)を加えたもの）が例示される。またヒトの場合、市販の霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地が例示される。なお、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物は、bFGF非存在下でもヒトiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなったため、上記培地からbFGFを除いた培地を使用することができる。
【００１８】
メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物の培地中の濃度は、体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲であれば特に限定されない。具体的には、培地中における濃度が0.01%〜1%(v/v)の範囲、好ましくは0.05%〜0.5%(v/v)の範囲で適宜選択される。より好ましくは0.1%(v/v)程度である。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はない。
【００１９】
メシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物は、該抽出物の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、核初期化物質(下記3.を参照）が遺伝子の場合は、当該核初期化遺伝子は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、樹立効率改善物質は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、本発明の抽出物を培地に添加することができる。
【００２０】
通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。なお、メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を用いた場合は、フィーダー細胞非存在下での培養においても、ヒトiPS細胞の生存を増強し、iPS細胞の培養を可能とすることができるため、フィーダー細胞無しの培養条件も用いることができる。
【００２１】
（３） 体細胞ソース
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２２】
体細胞を採取するソースとなる哺乳動物は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２３】
（４）核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク質またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。核初期化物質がタンパク質またはそれをコードする核酸の場合、具体的には、たとえば、Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸を挙げることができる(WO2007/69666; Science, 2007, 318:1917-1920)。これらのファミリーメンバーおよびその組み合わせの具体例を以下に列挙する。なお、以下においてはタンパク質の名称のみ記載するが、これをコードする核酸も含まれる。
【００２４】
(a) Octファミリーメンバーからなる1種の核初期化物質；
(b) Octファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組み合わせ；
(c) Octファミリーメンバー及びKlfファミリーメンバーからなる2種の核初期化物質の組合せ；
(d)Octファミリーメンバー及びNanogからなる2種の核初期化物質の組合せ；
(e) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組み合わせ；
(f) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる3種の核初期化物質の組合せ。
(g) Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー及びMycファミリーメンバーからなる4種の核初期化物質の組み合わせ；並びに
(h) Octファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanogからなる4種の核初期化物質の組み合わせ。
より具体的には、以下の組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（またはKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
【００２５】
上記(1)-(24)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらにLin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28bなどを用いることもできる。
また、上記(1)-(24)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(24)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２６】
さらにまた、上記の核初期化物質に加えて、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、及びβ-cateninからなる群から選ばれる1種以上の核初期化物質を組み合わせてもよく、および／またはECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Mybl2、ECAT15-1、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の核初期化物質を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについてはWO2007/69666に具体的に説明されている。
これらの組み合わせの中で、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(またはL-Myc)、Lin28、及びNanogからなる群から選ばれる1種以上のタンパク質またはそれをコードする核酸から選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。特に好ましいのは、(1)Oct3/4, Klf4, Sox2およびc-Myc、またはそれらをコードする核酸、(2)Oct3/4, Klf4, Sox2およびL-Myc、またはそれらをコードする核酸、あるいは(3)Oct3/4, Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である。
【００２７】
上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrgのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
【００２８】
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
なお、核初期化物質の遺伝子名は、ヒト由来の遺伝子の場合、学術論文では全て大文字（例えば「OCT3/4」）で記載するが、本明細書においては最初の一文字のみ大文字であっても（例えば「Oct3/4」）、マウスのみならず、ヒトやその他の動物種の場合も含むものとする。
【００２９】
核初期化物質としてタンパク質自体を用いる場合には、得られたｃDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク質を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク質をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターやプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００３０】
核初期化物質の体細胞への接触は、該物質がタンパク質である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【００３１】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化物質のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００３２】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
近年、マウスおよびヒトにおいて、核初期化物質(タンパク質）をポリアルギニンやTAT等のCPP(cell penetrating peptide)と共に導入してiPS細胞を樹立する方法が開発されており、これらの手法を用いることもできる(Cell Stem Cell, 4:381-(2009)、Cell Stem Cell,
doi: 10.1016/j.stem.2009.05.005-(2009))。
【００３３】
体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また該核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。好ましくは該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３４】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス（例、pMX）、レンチウイルス（例、pKP114）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、EBV、SV40、センダイウイルス等に由来する自律複製可能なエピゾーマルベクター、動物細胞発現用プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
【００３５】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばSRαプロモーター、SV40初期プロモーター、レトロウイルスのLTR、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、EF1αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが用いられる。ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、CAGプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーターとβ-グロビン遺伝子のポリAシグナル部位を含む）を用いることができる。
【００３６】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。また、アデノウイルスベクターを用いる場合については、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。
【００３７】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターやウイルス由来の自律複製機構を有するエピゾーマルベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。また、ベクターとしてエピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載されている。
さらにトランスポゾンを用いることもでき、例えばpiggy Bacトランスポゾンを用いた具体的手段は、Nature, 458:766-771（2009）および Nature, 458:771-776（2009）に記載されている。
【００３８】
プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回又は4回)繰り返して行うことができる。
【００３９】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００４０】
（５）iPS細胞の樹立効率改善物質
本発明のメシマコブ菌糸体のエタノール抽出物及び／又は熱水抽出物に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００４１】
なお、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40LT等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化因子として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク質である場合、(b) 該タンパク質をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
【００４２】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、iPS細胞の樹立効率改善物質が低分子化合物である場合には、核初期化遺伝子は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、樹立効率改善物質は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００４３】
マウスまたはヒトから分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。初期化遺伝子及びiPS細胞の樹立効率改善物質との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
【００４４】
（６）iPS細胞の候補コロニーの選択
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4およびSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００４５】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。これらの試験方法はいずれも周知である。
【００４６】
（７）iPS細胞の用途
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。また、患者本人でなくても、HLAの型が同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導し、そこから所望の細胞へ分化させ、これを患者への移植に用いることもできる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４７】
ヒトiPS細胞樹立に対するPL-2C、PL-EtOHの効果
ヒト歯髄幹細胞（J.Dent.Res., 87(7): 676-681 (2008)）に対してCell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。このSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を1 x 10５個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびc-MYCの4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から６日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った（3 x 10４個/ウェル、６ウェルプレート）。翌日から以下の3種類の培地で培養を行った。
（a)霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
(c)上記(a)に、さらにPL-EtOHを終濃度0.1%となるように添加した培地
2日に1回、上記の培地で培地交換を行いながら培養を続け、レトロウイルス感染後26日目に出現したトータルコロニーおよびヒトiPSコロニー（ES-likeコロニー）の数をカウントした。結果を図３に示す。図３に示されるように、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率の上昇が認められた。
以上のように、メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、iPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。
【実施例２】
【００４８】
ヒトiPS細胞樹立に対するbFGF存在下、非存在下でのPL-2C、PL-EtOHの効果
bFGF存在下、非存在下でのPL-2C、PL-EtOHの効果を検討した。
実施例１と同じSlc7a1遺伝子発現歯髄幹細胞を、1 x 10５個/wellの割合で6ウェルプレート上に蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来のOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYC1（以下単にL-MYCと称する）の4遺伝子をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から６日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った（3 x 10４個/ウェル、６ウェルプレート）。
翌日から以下の表1の♯1〜14の各培養条件下（霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地に対して、bFGF添加の有無、およびPL-2C、PL-EtOH添加の有無と濃度がそれぞれ異なる）で培養を行った。
【００４９】
【表１】
【００５０】
2日に1回、上記の培地で培地交換を行いながら培養を続け、レトロウイルス感染後25日目に出現したトータルコロニーおよびヒトiPSコロニー（ES-likeコロニー）の数をカウントした。結果を表1および図４に示す。図４Aは表1の結果をグラフ化したものであり、図４Bは♯1, 4, 7, 8, 11および14の条件下で得られたヒトiPSコロニーをアルカリフォスファターゼ（ALP)で染色した結果を示す。生じたコロニーはALP陽性であったため、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。
bFGFを培地に添加しない系においては、PL-EtOH添加によるiPSコロニー樹立効率上昇効果は全く認められなかった。
一方、PL-2C添加の場合は、bFGFを培地に添加しない系であってもiPSコロニーの樹立効率上昇効果が認められ、PL-2Cが終濃度0.1%の場合はPL-2Cを加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が8倍上昇した。
bFGFを培地に添加した場合は、PL-EtOHを培地に加えることにより、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が9〜10倍上昇した（PL-EtOHの終濃度0.1%の場合）。またPL-2Cを培地に加えた場合も、PL-EtOHほどではないが、加えない場合に比べてiPSコロニーの樹立効率が3〜4倍上昇した（PL-2Cの終濃度0.1%の場合）。
【００５１】
以上より、以下のことが示された。
（1）メシマコブ菌糸体由来抽出物であるPL-EtOHおよびPL-2Cは、bFGF存在下でiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。特にPL-EtOHのほうがその効果は顕著であった。
（2）PL-2Cは、bFGF非存在下でもiPS細胞の樹立効率を向上させる効果のあることが明らかとなった。PL-EtOHにはそのような効果が認められなかったことから、PL-2CにはbFGFそのもの、またはbFGFと同様の機能を有する因子が含まれている可能性が示唆された。
【実施例３】
【００５２】
フィーダー細胞非存在下での培養における、ヒトiPS細胞の生存に対するPL-2Cの効果
成人皮膚由来線維芽細胞（aHDF-Slc7a1）に対してOCT3/4, KLF4, SOX2、およびL-MYCの4遺伝子をレトロウイルスを用いて導入することにより樹立されたヒトiPS細胞（32R6、18継代目）（WO2009/057831）を、細胞解離剤であるAccutase（Invitrogen)を用いて剥離し、単一細胞化した。この細胞を、(1)マトリゲル（Becton, Dickinson and Company）、(2)CellStart (Invitrogen)、または(3)コラーゲンI（IWAKI)のいずれかをコートした６ウェルプレート上に、3.5 x 10５個/ウェルの密度で蒔いた。各細胞を、以下の(a)または(b)の条件下で培養した。
【００５３】
(a)霊長類ES細胞培養用培地 (ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）および50 U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシンを加えた培地
(b)上記(a)に、さらにPL-2Cを終濃度0.1%となるように添加した培地
【００５４】
培養開始から10日目のヒトiPSコロニーの写真を図５に示す。(1)〜(3)のいずれのプレートを用いた場合においても、PL-2Cを添加することにより、添加しない場合に比べて、ヒトiPS細胞のコロニー数が顕著に増加していた。なおこのような効果はPL-EtOHは有していなかった。
以上のようにPL-2Cは、フィーダー細胞の無い条件下で、ヒトiPS細胞の生存を増強させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本願発明に係るメシマコブの菌糸体由来物質を有効成分とする人工多能性幹細胞樹立効率改善剤、並びにこれを用いるiPS細胞の樹立効率改善方法、iPS細胞の製造方法、及びiPS細胞の生存増強剤によれば、iPS細胞の樹立効率を大幅に引き上げることができるので、医学分野（例：再生医療産業）における産業への利用が可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
【請求項２】
iPS細胞がヒト由来である請求項１記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
【請求項３】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項１、又は請求項２記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
【請求項４】
体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
【請求項５】
体細胞がヒト由来である、請求項４記載の樹立効率改善方法。
【請求項６】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項４、又は請求項５記載のiPS細胞樹立効率改善方法。
【請求項７】
核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の製造方法。
【請求項８】
iPS細胞がヒト由来である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項７、又は請求項８記載のiPS細胞の製造方法。
【請求項１０】
核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項７〜請求項９記載のiPS細胞の製造方法。
【請求項１１】
核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１３】
核初期化物質がOct3/4, Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１４】
メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
【請求項１５】
フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項１4記載のiPS細胞の生存増強剤。
【請求項１６】
iPS細胞がヒト由来である請求項１４、又は請求項１５記載のiPS細胞の生存増強剤。
【請求項１】
メシマコブ（Phellinus linteus)の菌糸体由来物質を含有することを特徴とする人工多能性幹細胞（以下iPS細胞）の樹立効率改善剤。
【請求項２】
iPS細胞がヒト由来である請求項１記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
【請求項３】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項１、又は請求項２記載のiPS細胞樹立効率改善剤。
【請求項４】
体細胞の核初期化工程において、メシマコブの菌糸体由来物質を培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の樹立効率改善方法。
【請求項５】
体細胞がヒト由来である、請求項４記載の樹立効率改善方法。
【請求項６】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項４、又は請求項５記載のiPS細胞樹立効率改善方法。
【請求項７】
核初期化物質と、メシマコブの菌糸体由来物質とを培地中に存在させることを特徴とするiPS細胞の製造方法。
【請求項８】
iPS細胞がヒト由来である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
メシマコブの菌糸体由来物質が、エタノール抽出物、又は／及び熱水抽出物である請求項７、又は請求項８記載のiPS細胞の製造方法。
【請求項１０】
核初期化物質がOctファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、Linファミリーメンバー、及びNanog、又はそれらをコードする核酸から選択される少なくとも1つを含む請求項７〜請求項９記載のiPS細胞の製造方法。
【請求項１１】
核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びc-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2及びL-Myc、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１３】
核初期化物質がOct3/4, Klf4及びSox2、又はそれらをコードする核酸である請求項７〜請求項９記載の製造方法。
【請求項１４】
メシマコブ菌糸体の熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするiPS細胞の生存増強剤。
【請求項１５】
フィーダー細胞非存在下での培養において用いられる請求項１4記載のiPS細胞の生存増強剤。
【請求項１６】
iPS細胞がヒト由来である請求項１４、又は請求項１５記載のiPS細胞の生存増強剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２８４０８８（Ｐ２０１０−２８４０８８Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３８７５２（Ｐ２００９−１３８７５２）
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５０１２９５６９３）株式会社アイ・ビー・アイ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１０日（２００９．６．１０）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５０１２９５６９３）株式会社アイ・ビー・アイ (6)
【Ｆターム（参考）】
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