伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株およびワクチン
本発明は、ウイルス中和エピトープ６７（変異体−Ｅ ＩＢＤＶに特異的）を付加的に含む古典的ＩＢＤＶの変異株を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株及びこのような古典的ＩＢＤＶの変異株を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）は、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの成員である。このファミリーのウイルスは、非常に類似したゲノム構成と類似した複製サイクルを有する。これらのウイルスのゲノムは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグメント（Ａ及びＢ）から成る。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解によって切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を形成する、ポリタンパク質をコードする。ＶＰ２とＶＰ３はビリオンの主要構造タンパク質である。ＶＰ２は、ビルナウイルスの主要宿主防護免疫源であり、ウイルス中和抗体の誘導を招く免疫原性領域を含む。
【０００３】
ＩＢＤＶに関しては、２つの血清型、血清型１と２が存在する。これら２つの血清型は、ウイルス中和（ＶＮ）試験によって識別できる。血清型１のウイルスはニワトリに対して病原性であることが示されているが、血清型２のＩＢＤＶはシチメンチョウにおいて亜急性疾患を引き起こすだけである。ガンボロ病とも呼ばれる伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）は、ファブリキウス嚢の細胞に選択的親和性を有し、リンパ組織をこの主要標的とする、ニワトリにおける急性高度伝染性ウイルス感染である。感受性のある群れでの罹病率は高く、急速な体重減少と中等度から高度の死亡率を伴う。この疾患から回復するヒナは、ニワトリの防御機構にとって不可欠であるファブリキウス嚢の破壊の故に免疫欠損を有し得る。ＩＢＤウイルスは、３週齢より若いニワトリにおいて重症の免疫抑制を引き起こし、３ヶ月齢までのヒナにおいて嚢病変を誘導する。
【０００４】
長年にわたってこの疾患は、弱毒化生ＩＢＤＶワクチンで初回免疫されたニワトリに不活性化ワクチンを適用することにより、種畜の群れにおいて高いレベルの抗体を誘導することによって予防することができた。これはＩＢＤによって生じる経済的損失を最小限に抑えてきた。ワクチン接種された種畜に由来するニワトリの母体抗体はＩＢＤＶによる早期感染を予防し、免疫抑制に関連する問題を低減する。加えて、弱毒化生ワクチンはまた、母体抗体が低下した後の商業用ニワトリの群れにおいても成功裏に使用されてきた。
【０００５】
歴史的に、ＩＢＤウイルスは、「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知の１つの型だけから成った。しかし１９８０年代半ばに、古典的ＩＢＤＶに基づくワクチンを接種された群れにおいて、特に米国で、急性感染が認められた。この疾患は、異なる免疫原性構造を有するＩＢＤウイルスによって引き起こされたことが認められた。これらの新しいウイルスはおそらく遺伝的浮動の結果として出現したと考えられる。古典的ＩＢＤＶワクチン株は適切な交叉防御を誘導することができなかったので、これらのいわゆる「変異体」ＩＢＤＶ株の出現により、新しいＩＢＤワクチン接種プログラムの設計が必要となった。これまでに特定された血清型１ ＩＢＤＶの最も重要な変異体サブタイプは、デラウエア（Ｄｅｌａｗａｒｅ）−Ｅ、ＧＬＳ、ＲＳ／５９３及びＤＳ３２６変異体である。これらの変異体株は、ウイルス中和試験、モノクローナル抗体のパネル又はＲＴ−ＰＣＲによって特定し、古典的株から識別することができる。
【０００６】
デラウエア変異体−Ｅは、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．２０ｔｈ Ｎａｔｌ．Ｍｅｅｔ．ｏｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｏｎｄｅｍｎａｔｉｏｎｓ；Ｏｃｅａｎ Ｃｉｔｙ，ＭＤ，ＵＳＡ，９４−１０１，１９８５）及びＳｎｙｄｅｒら（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３２，５３５−５３９，１９８５）によって報告された。ＧＬＳウイルスは１９８７年に米国において単離され、ＤＳ３２６（ＧＬＳ様）は１９８８年に米国において単離された（Ｓｎｙｄｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２７，８９−１０１，１９９２及びｖａｎ Ｌｏｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）。ＲＳ／５９３株（変異体−Ｅ様）も１９９３年に米国で単離された（Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，６５−７０，１９９４）。
【０００７】
ウイルス中和モノクローナル抗体（ｍｏａｂ）のパネルは、様々なＩＢＤＶタイプを特定するために抗原捕獲酵素免疫測定法（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）において当技術分野で一般的に使用される。既存のＩＢＤＶ株とこれらのｍｏａｂの反応性パターンを以下の表１に要約する。
【０００８】
【表１】
【０００９】
ＶＮ ｍｏａｂ Ｒ６３及びＢ６９は古典的ＩＢＤＶ株を高い力価まで中和し、ｍｏａｂ Ｂ６９は古典的株に特異的に結合する。ｍｏａｂ ＢＫ９はデラウエア変異体−Ｅ株にユニークに結合する。ｍｏａｂ ５７による陽性反応は、古典的及びデラウエア変異体株からＧＬＳ及びＤＳ３２６株を分離するために使用できる。これらや他のｍｏａｂは一般に、市販されているｍｏａｂのパネルの反応パターンを決定することによってＩＢＤＶ（変異体）株同士を識別する分野において使用される。ｍｏａｂを分泌するハイブリドーマも、以下のアクセッション番号：Ｒ６３（ＨＢ−９４９０）、８（ＨＢ−１０１７４）、Ｂ２９（ＨＢ−９７４６）、ＢＫ−９（ＨＢ−１０１５７）、６７−（ＨＢ−１１１２２）、５７（ＨＢ−１０１５６）、Ｂ６９（ＨＢ−９４３７）及び１７９（ＨＢ−１０１５８）の下にＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）より市販されている。変異体ＩＢＤＶ株及びハイブリドーマはまた、以下のアクセッション番号：ＤＳ３２６（Ｉ−９１０）、ＧＬＳ（Ｉ−７９２及びＩ−７９３）及びｍｏａｂ１０（Ｉ−２８１２）の下にｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅより市販されている。
【００１０】
ＩＢＤＶ株間の抗原変異にとっての、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質内の幾つかの領域及び明確にされたアミノ酸の重要性が提案されているが（Ｖａｋｈａｒｉａら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１，２６５−２７３，１９９４及びＳｎｙｄｅｒら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３８，７０１−７０７，１９９４）、ＩＢＤＶ中和エピトープの形成にとっての全てのアミノ酸の存在の必然性はまだ決定されていない。Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９，１３１−１３７，１９９７において、Ｖａｋｈａｒｉａらは、アミノ酸、プロリンが変異体Ｅ ＩＢＤＶに存在すると報告した。国際公開公報第ＷＯ９５／２６１９６号においてＶａｋｈａｒｉａらは、ｍｏａｂ ６７と変異体Ｅ ＶＰ２タンパク質の結合に関するアミノ酸２８６（Ｉｌｅ）、３１８（Ａｓｐ）及び３２３（Ｇｌｕ）の関与を示唆した。加えて、古典的及び変異体ＶＰ２ ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質間の多数のアミノ酸配列相違を開示している。２２２（Ｐｒｏ）、２４９（Ｇｌｎ）及び２５４（Ｇｌｙ）位のアミノ酸は、ＧＬＳ ＶＰ２タンパク質におけるＢ６９エピトープの形成に関連するとみなされた。
【００１１】
欧州特許第１１７０３０２号（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｎ．Ｖ．）は、古典的ＩＢＤＶ株に対して改善された免疫原性を有する変異体Ｅ ＩＢＤＶ変異株の作製を開示している。このＩＢＤＶ変異株は、変異体Ｅ ＶＰ２コード領域内のアミノ酸２５３（ＧｌｎからＨｉｓ）、２８４（ＡｌａからＴｈｒ）及び２５４（ＳｅｒからＧｌｙ）、２７０（ＡｌａからＴｈｒ）についてのコドンに変異を導入することによって得られた。これらの変異体Ｅ ＩＢＤＶの変異株のいずれも、ｍｏａｂ Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、変異体Ｅのウイルス中和エピトープも同時に発現する古典的ＩＢＤＶの変異株の作製を可能にする情報は、この中では開示されていない。このような変異株は、野外（ｆｉｅｌｄ）で古典的及び変異体ＩＢＤＶ株によって引き起こされる疾患に対する防御を誘導するためのワクチンにおいて非常に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、ウイルスによって発現されるＶＰ２タンパク質が変異体ＩＢＤＶに典型的なウイルス中和エピトープ６７を含むようにＶＰ２コード領域に変異を導入することにより、古典的ＩＢＤＶに基づいて新しいＩＢＤＶ変異株を構築した。発明者は、古典的ＶＰ２タンパク質に関して、ｍｏａｂとの反応性が約１００アミノ酸離れて位置するアミノ酸配列によって影響されることを発見した。さらに、２８６（Ｉｌｅ）、３１８（Ａｓｐ）及び３２３（Ｇｌｕ）が６７エピトープの存在に影響を及ぼすというＶａｋｈａｒｉａらによって為された仮定は正しくない。実際に発明者は、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質に関する６７エピトープの出現が、２２２位のプロリンのセリン又はトレオニンへの置換及び３１８−３２２位の一定のアミノ酸配列の存在に依存することを認めた。３１８−３２３位の、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質において天然で存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の存在下での、２２２位のプロリンのセリン又はトレオニンへの置換は、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質における６７エピトープの出現を導く。
【００１４】
従って、本発明は、ＶＰ２タンパク質が、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌される、ｍｏａｂ ６７にも結合することを特徴とする、モノクローナル抗体（ｍｏａｂ） Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株を提供する。
【００１５】
ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質は、５１２アミノ酸から成り、アミノ酸１−５１２位のポリタンパク質上に位置する。ＶＰ２コード領域（を含む完全なセグメントＡ）のヌクレオチド配列及び多くの古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２タンパク質の対応するアミノ酸配列が決定されている（米国特許第５，８７１，７４４号、Ｄ７８については欧州特許第８８７，４１２号；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＢａｎｋ）。
【００１６】
古典的ＩＢＤＶ株に特異的なｍｏａｂ Ｂ６９を含む、ウイルス中和特性を示す全ての公知のｍｏａｂは、専らＶＰ２タンパク質に対して惹起され、立体配座依存性エピトープを認識する。多くの古典的ＶＰ２アミノ酸配列と変異体ＶＰ２アミノ酸配列、特に変異体Ｅ及びＧＬＳのＶＰ２アミノ酸配列の比較が、Ｖａｋｈａｒｉａら（１９９４、前出）及びＨｅｉｎｅら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１８３５−１８４３，１９９１）の中で開示されている。ウイルス株の間での生物学的変異は存在するが、古典的タイプのＩＢＤＶ株の中で、ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は強力に保存されている。古典的ＶＰ２アミノ酸配列の間でのアミノ酸相同性は、このタンパク質の完全長にわたって９８％−９９．４％の間で変化する（ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２アミノ酸配列との比較に基づく）。ＶＰ２の可変領域の大部分を含む、ＶＰ２タンパク質内の中心領域が特定された。この領域はアミノ酸２０６−３５０位に位置し（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１，１３０３−１３１２，１９８７）、この領域内の古典的ＶＰ２アミノ酸配列の間でのアミノ酸相同性は９５．９％−９７．９％の間で変動する（ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２アミノ酸配列との比較に基づく）。この中心領域内で、２１２−２２４位と３１４−３２６位に、異なる型のＩＢＤＶ株の間でのアミノ酸変化の大部分が起こる、２つの超可変領域が特定されている（Ｖａｋｈａｒｉａら、１９９４、前出）。これにもかかわらず、大部分の古典的ＩＢＤＶ株は、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２におけるのと同一の、領域２００−２３０のアミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（配列番号１９）を含む。ここでは配列をＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）で解析する。
【００１７】
従って、古典的ＩＢＤＶをここでは、ｍｏａｂ Ｂ６９に結合することができるＶＰ２タンパク質を発現するＶＰ２コード領域を含む単離ＩＢＤＶと定義する。
【００１８】
より特定すると、古典的ＩＢＤＶは、Ｄ７８株のものと同じである２００−２３０位のＶＰ２アミノ酸配列（配列番号１９）を含む単離ＩＢＤＶと定義する。
【００１９】
ＩＢＤＶとｍｏａｂの反応は、Ｓｙｎｄｅｒら（１９９２、前出）及びｖａｎ ｄｅｒＭａｒｅｌら（Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｒｔｚｌ．Ｗｓｃｈｒ．９７，８１−８３，１９９０）によって述べられているように、このために当技術分野で一般的に使用されるＡＣ−ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【００２０】
また、ｍｏａｂとＩＢＤＶの反応はまた、実施例１で述べる免疫蛍光アッセイによっても測定できる。
【００２１】
本発明に従った好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、ｍｏａｂ Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７に加えて、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｒ６３と結合するＶＰ２タンパク質を発現する。
【００２２】
本発明は、初めて、古典的ＶＰ２タンパク質に関していずれのアミノ酸残基が、（ｉ）ｍｏａｂ Ｒ６３（古典的及び変異体Ｅ）と結合する中和エピトープの形成、（ｉｉ）ｍｏａｂ ６７（変異体Ｅ）と結合する中和エピトープの付加的な形成及び（ｉｉｉ）ｍｏａｂ５７（ＧＬＳ）と結合する中和エピトープの付加的な形成、のために必要で及び十分であるかを特定する。
【００２３】
発明者は、古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内に変異を導入することによって上記で定義したような多くのＩＢＤＶ変異株を作製した（実施例１）。得られた結果は、同一エピトープが異なるアミノ酸配列によって折りたたまれ得るが、他のアミノ酸配列は変異体エピトープを生成することができないことを明らかにする。従って、特異的エピトープについて特異的コード能力が存在する。６７、５７及びＲ６３エピトープの適切な折りたたみのために必要な関連アミノ酸配列の要約を表２に示す（それぞれ、配列番号１−５、６−９及び１０−１８）。表２で提供する情報は、当業者が、ウイルス中和エピトープＢ６９に加えて、変異体Ｅ ＩＢＤＶ株に特異的なウイルス中和エピトープ６７も同時に含むＶＰ２タンパク質を発現することができる古典的ＩＢＤＶの変異株を生成することを可能にする。
【００２４】
【表２】
【００２５】
従って、特に好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、ｍｏａｂ Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７と結合し、及び古典的ＶＰ２コード領域が、
（ｉ）セリン又はトレオニンをコードする２２２位のアミノ酸についてのコドン、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位の、配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含むように、古典的ＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む変異株である。
【００２６】
表２に示す３１８−３２３位のアミノ酸配列は、２２２位のアミノ酸（プロリン）がセリン又はトレオニンに変化している場合にのみ６７エピトープの正しい折りたたみを生じさせることが認められ、前記エピトープの正しい折りたたみが１００位離れて位置するアミノ酸によって影響されることを示唆した。
【００２７】
３３０位のアミノ酸は決定的に重要ではないが、有用なＩＢＤＶ変異株は、この位置にアミノ酸、アルギニン又はセリンをコードするコドンをさらに含む。
【００２８】
上記で定義した古典的ＩＢＤＶの変異株のさらなる有利な特性は、このような変異株が、Ｒ６３ウイルス中和エピトープの正しい折りたたみのために必要なアミノ酸配列を有するＶＰ２タンパク質も同時に発現することである。配列番号１４−１５及び１７−１８のいずれかに示す３１８−３２３位のアミノ酸配列（２２２位のセリン又はトレオニンに加えて）を有するＶＰ２タンパク質を発現するＩＢＤＶは、エピトープＲ６３を提示するが、エピトープ６７は提示できないことが表２及び実施例１で明らかにされる。
【００２９】
発明者によって為されたさらなる意外な観察は、古典的ＩＢＤＶ株の３１８−３２３位のＶＰ２コード領域内のアミノ酸の置換が、このような変異株の増殖特性の低下をもたらすということである。このような変異株は、ニワトリについての弱毒化表現型を示し、改善された安全性特性を有するワクチン候補物として、特にインオボ経路で投与されるワクチンにおいて、好都合に使用できる。従って、本発明はまた、古典的ＶＰ２コード領域が、天然アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１）とは異なる３１８−３２３位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むように、古典的ＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む古典的ＩＢＤＶの変異株を提供する。好ましくは、これらの古典的ＩＢＤＶの変異株は、場合により上記で定義した２２２位及び／又は３３０位のアミノ酸と共に、配列番号２−９及び１１−１８のいずれかに示すこれらの位置のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株は、フィールドから単離し得る又はワクチンにおいて使用される何らかの古典的ＩＢＤＶ株に由来するＶＰ２コード領域内に必要な変異を導入することによって作製できる。適切なＩＢＤＶ株は、Ｄ７８、ＰＢＧ９８、２２８Ｅ及び８９−０３（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．）などの、市販のワクチン中に存在する周知のＩＢＤＶ株を含む。ＩＢＤＶ株Ｄ７８（米国特許第４，５３０，８３１号）はまた、アクセッション番号ＶＲ−２０４１の下にＡＴＣＣからも入手可能である。ＶＰ２コード領域を含む、菌株Ｄ７８の完全なセグメントＡのヌクレオチド配列、及び対応する（ポリ）タンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第５，８７１，７４４号及び欧州特許出願第８８７，４１２号に開示されている。
【００３１】
特に、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む古典的ＩＢＤＶの変異株が提供される。
【００３２】
本発明に従ったさらなる好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、上述したような変異した古典的ＶＰ２コード領域を含む、古典的ＩＢＤＶ株のセグメントＡの完全な遺伝子骨格を含む。特に、上記で定義したような古典的ＩＢＤＶの変異株は、ＩＢＤＶ株Ｄ７８に由来する。
【００３３】
しかし、本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株はまた、変異体Ｅ又はＧＬＳ株などの変異体ＩＢＤＶ株の遺伝子骨格に基づき得る。このような「キメラ」古典的ＩＢＤＶの変異株では、変異体ＩＢＤＶ株のセグメントＡの遺伝子骨格上のＶＰ２コード配列が、古典的ＩＢＤＶの変異株の新しい変異体エピトープの原因となる所望変異を付加的に含む、対応する適切な古典的ＶＰ２コード配列によって置き換えられている。
【００３４】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株の作製は、最近確立されたＩＢＤＶについての感染性ｃＲＮＡ系（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１１１３１−１１１３６，１９９６）によって実施できる。この逆遺伝学的システムは、ＩＢＤＶのＲＮＡゲノムに変異を導入する可能性を提供する。この逆遺伝学的システムにおける最も重要な工程は、ＩＢＤＶのセグメントＡ及びＢの両方の５’及び３’末端のヌクレオチドを含む、これらのセグメントの完全長ｃＤＮＡクローンを提供することである。クローニング工程の後、セグメントＡ及びＢの完全長配列を、Ｔ７、ＳＰ６又はＴ３ポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合することができるプロモーターに作動可能に連結する。Ｔ７プロモーターが好ましい。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、それぞれセグメントＡ及びＢの完全長ｃＤＮＡクローンからウイルスｃＲＮＡを転写することができる。このｃＲＮＡは、ウイルスの複製及び生存ウイルスの単離を誘導することができる。この手順は、天然に生じるあらゆるＩＢＤＶに関して実施できる。
【００３５】
逆遺伝学的システムは、Ｄ７８（Ｙａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２６４７−２６５７、１９９８）、菌株ＨＫ４６（Ｌｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，２８５４−２８６２，１９９９）、ＣＥＦ ９４（Ｂｏｏｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６５，３３０−３４１，１９９９）及びＵＫ６６１（ｖａｎ Ｌｏｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３，１２１−１２９，２００２）などの様々なＩＢＤＶ株に関して記述されている。
【００３６】
所望変異は、この目的のために当技術分野で一般的に公知の方法によってＩＢＤＶゲノムに導入することができる。特に、部位指定変異誘発によって変異が導入される。ＩＢＤＶゲノムに変異を導入するための方法をここで述べるが、当技術分野でも一般的に使用される（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ，１９９６，前出；Ｙａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２６４７−２６５４，１９９８；Ｍｕｎｄｔら、１９９９，前出；欧州特許出願第１１７０３０２号；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｗｉｌｅｙ Ｎ． Ｙ．，１９９５年版、ｐ．８．５．１．−８．５．９．及びＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４より、３７６−３８２，１９８７）。
【００３７】
アミノ酸位置を示すためにここで使用する数字は、当技術分野で一般的に使用されるようなＩＢＤＶポリタンパク質内のアミノ酸の番号付けを表わす。ヌクレオチド位置を示す数字は、ＭｕｎｄｔとＭｕｌｌｅｒ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４３７−４４３，１９９５；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ８４０３４）によって記述されているＩＢＤＶゲノムのセグメントＡの完全なヌクレオチド配列に基づく。
【００３８】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株のセグメントＢは、いかなるＩＢＤＶ株由来であってもよく、好ましくは古典的ＩＢＤＶ株、最も好ましくは菌株Ｄ７８又はＰ２に由来し得る（米国特許第５，８７１，７４４号及び欧州特許出願第８８７４１２号）。
【００３９】
実施例で示すように、本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株は、これまで古典的ＩＢＤＶ株に関しては認められなかった免疫原性構造を示す。新しい古典的ＩＢＤＶの変異株は、古典的及び変異体ＩＢＤＶ株の両方による感染から生じる疾患状態に対して家禽を有効に保護することができる新しいタイプのＩＢＤＶワクチンの基礎を構成し得る。従って、本発明のもう１つの局面は、ワクチンが、医薬適合性の担体又は希釈剤と共に、上記で定義した古典的ＩＢＤＶの変異株を含むことを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチンである。
【００４０】
古典的ＩＢＤＶの変異株は、生弱毒化又は不活性化ウイルスとしてワクチンに組み込むことができる。
【００４１】
本発明に従ったワクチンは、例えば市販の生及び不活性化ＩＢＤＶワクチンに関して一般的に使用されるような、従来の方法によって製造することができる。簡単に述べると、感受性のある基質に本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株を接種し、ウイルスが所望感染力価に複製するまで増殖させ、次にＩＢＤＶ含有物質を採取して、場合により不活性化し、医薬適合性の担体又は希釈剤と混合する。
【００４２】
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又はニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬ）などの一次（鳥類）細胞培養、ＶＥＲＯ細胞系又はＢＧＭ−７０細胞系などの哺乳動物細胞系、若しくはＱＴ−３５、ＱＭ−７又はＬＭＨなどの鳥類細胞系を含む、ＩＢＤＶの複製を支持することができるあらゆる基質が、本発明に従ったワクチンを製造するために使用できる。通常は、細胞の接種後、ウイルスを３−１４日間増殖させ、次に細胞培養上清を採取して、所望する場合は細胞デブリを除去するためにろ過又は遠心分離する。
【００４３】
古典的ＩＢＤＶの変異株はまた、孵化鶏卵中で増殖させることもできる。
【００４４】
所望する場合、古典的ＩＢＤＶの弱毒化は、細胞培養における、例えば初代細胞培養又は上記の確立された細胞系における、ウイルスの標準連続継代によって実施できる（Ｂａｙｙａｒｉら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４０，５１６−５３２，１９９６；Ｔｓａｉら、Ａｖｉａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，４１５−４２２，１９９２）。
【００４５】
また、古典的ＩＢＤＶは、感染ニワトリにおいてインビボで増殖させることができ、次にこれらの感染動物からファブリキウス嚢を単離して、これを希釈剤と混合し、この混合物を均質化する。このようにして増殖させたＩＢＤＶは、一般に不活性化ワクチンの基剤を形成する。
【００４６】
生ウイルスを含む本発明に従ったワクチンは、懸濁液の形態又は凍結乾燥形態で製造及び販売することができ、このような組成物に関して慣例的に使用される、医薬適合性の担体又は希釈剤を付加的に含む。担体は、安定剤、防腐剤及び緩衝剤を含む。適切な安定剤は、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタミン酸塩又はグルコース）、タンパク質（乾燥乳清、アルブミン又はカゼイン）又はこれらの分解産物である。適切な緩衝剤は、例えばアルカリ金属リン酸塩である。適切な防腐剤は、チメロサール、マーシオレート及びゲンタマイシンである。希釈剤は、水、水性緩衝液（緩衝食塩水など）、アルコール及びポリオル（グリセロールなど）を含む。
【００４７】
所望する場合、本発明の従った生ワクチンはアジュバントを含み得る。アジュバント活性を有する適切な化合物及び組成物の例は、以下で述べるものと同じである。
【００４８】
本発明に従った生ワクチンの、例えば筋肉内、皮下又はインオボ経路の、注射による投与が可能であるが、前記ワクチンは、好ましくはＩＢＤＶワクチン接種のために一般的に使用される安価な集団適用経路によって投与される。ＩＢＤＶワクチン接種に関して、この経路は飲料水、噴霧及びエーロゾルワクチン接種を含む。
【００４９】
また、本発明は、不活性化（死滅）形態の変異体ＩＢＤＶを含むワクチンを提供する。不活性化ＩＢＤＶワクチンの利点は、長期間にわたって高いレベルの防御抗体が得られることである。
【００５０】
増殖工程後に採取したウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの繁殖を排除することである。一般にこれは、当技術分野で周知の化学的又は物理的手段によって達成できる。
【００５１】
不活性化変異体ＩＢＤＶを含むワクチンは、例えばこの目的に適する前述した医薬適合性の担体又は希釈剤の１又はそれ以上を含む。
【００５２】
好ましくは、本発明に従った不活性化ワクチンは、アジュバント活性を有する１又はそれ以上の化合物を含む。このための適切な化合物又は組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標）などの鉱物油若しくはビタミンＥアセテートなどの植物油に基づく水中油型又は油中水型乳剤、及びサポニンを含む。
【００５３】
本発明に従ったワクチンは、有効成分として古典的ＩＢＤＶの変異株の有効量、すなわちビルレントウイルスによる攻撃誘発に対してワクチン接種した鳥において免疫を誘導する免疫ＩＢＤＶ物質の量を含有する。免疫は、ここでは非ワクチン接種群と比較してワクチン接種後の鳥の個体群における有意に高いレベルの防御の誘導と定義される。
【００５４】
典型的には、本発明に従った生ワクチンは、各動物当り１００−１０９ＴＣＩＤ５０の用量、好ましくは各動物当り１０３−１０６ＴＣＩＤ５０の範囲の用量で投与することができる。不活性化ワクチンは、各動物当り１０６−１０１０ＴＣＩＤ５０の抗原当量を含み得る。
【００５５】
不活性化ワクチンは通常非経口的に、例えば筋肉内又は皮下経路で、投与される。
【００５６】
本発明に従ったＩＢＤＶワクチンはニワトリにおいて有効に使用し得るが、シチメンチョウ、ホロホロ鳥及びヤマウズラ（ｐａｒｔｒｉｄｇｅｓ）などの他の家禽も前記ワクチンで成功裏にワクチン接種し得る。ニワトリは、ブロイラー、若齢メンドリ、繁殖用系統（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｏｃｋ）及び産卵用系統を含む。
【００５７】
本発明に従った生又は不活性化ワクチンを接種される動物の年齢は、従来の生又は不活性化ＩＢＤＶワクチンを接種される動物の場合と同じである。例えばブロイラー（母体由来抗体−ＭＤＡなし）は１日齢又はインオボでワクチン接種し得るが、高レベルのＭＤＡを有するブロイラーは、好ましくは２−３週齢でワクチン接種する。低レベルのＭＤＡを有する産卵用系統又は繁殖用系統は、１−１０日齢でワクチン接種し、次に６−１２及び１６−２０週齢で不活性化ワクチンによるブースター免疫を実施し得る。
【００５８】
本発明はまた、前述した古典的ＩＢＤＶの変異株に加えて、家禽に病原性の他の病原体の１又はそれ以上のワクチン成分を含む混合ワクチンを包含する。
【００５９】
好ましくは、混合ワクチンは、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、軟卵症候群（ＥＤＳ）ウイルス、シチメンチョウの鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）又はレオウイルスの１又はそれ以上のワクチン株を付加的に含む。
【００６０】
（実施例）
【実施例１】
【００６１】
古典的ＩＢＤＶの変異株の作製及びモノクローナル抗体反応性の測定
実験材料及び方法
変異セグメントＡの作製
部位指定変異誘発実験のためにｐＤ７８Ａ（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ、前出、１９９６；欧州特許第８８７４１２号）を使用した。このために、ｐＤ７８ＡをＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断し、フラグメントを含むセグメントＡを、適切に切断したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ＋に連結して、ｐＳＫ＋−Ｄ７８Ａを得た。一本鎖ＤＮＡの作製後、表３に示すオリゴヌクレオチドを使用してＫｕｎｋｅｌら（前出、１９８７）に従って部位指定実験を実施した。オリゴヌクレオチドＭｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ６、Ｍｕｔ７、Ｍｕｔ８、Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１を使用して、それぞれ変異プラスミドｐＭｕｔ１、ｐＭｕｔ２、ｐＭｕｔ３、ｐＭｕｔ４、ｐＭｕｔ５、ｐＭｕｔ６、ｐＭｕｔ７、ｐＭｕｔ８、ｐＭｕｔ９、ｐＭｕｔ１０、及びｐＭｕｔ１１を生成した。この１１個の変異プラスミドを使用して一本鎖ＤＮＡを作製し、部位指定変異誘発実験においてｐＳＫ＋−Ｄ７８Ａの一本鎖ＤＮＡと共に使用した。これらの実験は、１つの実験において１個（Ｐ２２２Ｓ又はＲ３３９Ｓ）又は２個のオリゴヌクレオチド（Ｐ２２２Ｓ及びＲ３３９Ｓ）で実施し、塩基トリプレットの１個又は２個の置換を得た。得られた変異誘発プラスミド（表４に示す）を塩基配列決定し、さらなる実験のために使用した。
【００６２】
ｃＲＮＡのトランスフェクション、免疫蛍光アッセイ及び生成したウイルスの継代
インビトロ転写のために、ｐＤ７８Ａを含むプラスミド及び変異誘発プラスミドをＢｓｒＧ Ｉで切断して線状にした。Ｐｓｔ Ｉを使用してｐＰ２Ｂ（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ、前出、１９９６；欧州特許第８８７４１２号）を線状にした。線状ＤＮＡのさらなる処理、転写及びＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのトランスフェクションを、Ｍｕｎｄｔ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２０６７−２０７６，１９９９）が述べたように実施した。免疫蛍光アッセイのために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＢＨＫ２１細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にアセトン／メタノール（５０％／５０％）で５分間固定し、乾燥した。固定した細胞を、それぞれリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈したモノクローナル抗体６７、Ｂ６９、５７、Ｒ６３及びウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，４３７−４４３，１９９５）と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗った。細胞を、今度はＰＢＳ希釈したＤＴＡＦ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はＤＴＡＦ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３０分間インキュベートし、次にＰＢＳを用いて３回洗浄し、蒸留水で１回洗浄した。空気乾燥後、細胞を、９０％グリセロールと共にＰＢＳを含む２．５％１．４．−ジアゾビシクロ（２．２．２．）−オクタン（ＤＡＢＣＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に封入した。油浸蛍光顕微鏡を用いて蛍光を視覚化した。生成したウイルスの継代のために、６穴組織培養プレートで増殖させたＢＨＫ２１細胞を、２４穴組織培養プレートでのトランスフェクション実験と平行してトランスフェクトし、２４−４８時間インキュベートした。少なくとも１時間の−７０℃での凍結／解凍後、得られた上清を６４００×ｇで１０分間遠心分離し、ＣＰＥが目に見えるまで２５ｃｍ２組織培養フラスコで増殖させたＱＭ細胞に継代接種した。前述したように上清を入手し、アリコートに分けて、−７０℃で保存した。生育能及びｍｍＡｂとの反応性の存在の分析のために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＱＭ細胞を１つのアリコートに感染させ、２４時間インキュベートした。免疫蛍光アッセイを前述したように実施した。
【００６３】
生成したウイルスの細胞培養での増殖分析
増殖を観測するために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＣＥＣを、３７℃で１時間、１のＭＯＩで選択したＩＢＤＶに感染させた。次に、接種物を除去し、細胞を培地で洗って、培地１ｍｌを添加した。この直後（０時間目）、及び３７℃で８、１２、１６、２４及び３６時間のインキュベーション後に、別々に上清を採取し、−７０℃で保存した。９６穴組織培養プレートで増殖させたＱＭ細胞（ウズラ筋細胞）を用いたＴＣＩＤ５０の定量によってウイルス力価を得た。このために上清を解凍し、ｌｏｇ１０段階で力価測定した。各々１００μｌの適切な希釈液を組織培養プレートの４つの穴にピペットで分注し、次にＱＭ細胞懸濁液１００μｌ（１０６細胞／ｍｌ）を添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。５日後、ＣＰＥを含むウエルを陽性として計数し、Ｓｐａｅｒｍａｎ（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．，２，２２７−２４２，１９０８）及びＫａｒｂｅｒ（Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．，１６２，４８０−４８７，１９３１）に従ってＴＣＩＤ５０を定量した。３つの独立した実験の平均値及び標準偏差を計算した。
【００６４】
実験結果
ＶＰ２の可変領域内のアミノ酸の置換がモノクローナル抗体の反応性に及ぼす影響
菌株Ｄ７８の配列内の２２２位（プロリン）、３１８位（グリシン）、３２１位（アラニン）及び３２３位（アスパラギン酸）に位置するアミノ酸を、種々の組合せで、それぞれアミノ酸、セリン、トレオニン（Ｐ２２２Ｓ、Ｐ２２２Ｔ）、アスパラギン酸、アスパラギン（Ｇ３１８Ｄ、Ｇ３１８Ｎ）、グルタミン酸（Ａ３２１Ｅ）、及びグルタミン酸（Ｄ３２３Ｅ）に置き換えた（表４参照）。２２２位のプロリンのセリンへの置換は、３１８−３２３位のアミノ酸のアミノ酸配列が以下の組合せである場合、ｍｏａｂ ６７の付加的な反応性をもたらした：ＧＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＥ、ＧＧＱＡＧＥ、ＮＧＱＡＧＥ。３１８−３２３位のアミノ酸配列の残りの組合せ（ＤＧＱＥＧＤ、ＤＧＱＥＧＥ、ＧＧＱＥＧＤ、ＧＧＱＥＧＥ、ＮＧＱＡＧＤ、ＮＧＱＥＧＤ、ＮＧＱＥＧＥ）は、２２２位のプロリンをセリンに置き換えた場合でも、ｍｏａｂ ６７によって特徴付けられるエピトープの折りたたみを妨げると思われる。３２１位のアミノ酸をアラニンからグルタミン酸に置き換えた後、アミノ酸２２２（プロリン）、３１８（グリシン）及び３２３（アスパラギン酸）とは無関係に、ｍｏａｂ ５７の結合が検出された。しかし、３３０位のアルギニンのセリンへの置換は５７エピトープの存在に影響を及ぼした。ここでは、実施した置換（Ｒ３３０Ｓ）をそれぞれＤＧＱＥＧＤ、ＮＧＱＥＧＤ及びＮＧＱＥＧＥの組合せの存在下で実施した場合、コトランスフェクション実験後にｍｏａｂ ５７との反応性は検出されなかった。これに対し、ＧＧＱＥＧＤの組合せの存在下では、Ｒ３３０Ｓの置換はｍｏａｂ ５７との反応性に影響を及ぼさなかった。実施した実験において、５７エピトープが存在する場合はＲ６３エピトープが存在しなかったので、ｍｏａｂ ５７とＲ６３の反応性の存在は互いを除外した。さらにＶＰ２領域内に位置する３１８−３２３位のアミノ酸からの組合せＧＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＥ、ＧＧＱＡＧＥ、ＮＧＱＡＧＤ、及びＮＧＱＡＧＥをコードするプラスミドの使用後に、アミノ酸２２２（プロリン）又はアミノ酸３３０（アルギニン）を置換したかどうかとは無関係に、コトランスフェクション実験後にｍｏａｂ Ｒ６３との反応性が記録された。ポリタンパク質遺伝子の３１８−３２３位のアミノ酸配列ＤＧＱＥＧＥ又はＧＧＱＥＧＥをコードするプラスミドのｃＲＮＡの翻訳されたタンパク質は、ｍｏａｂ ６９とだけ反応した。ここでもやはり、アミノ酸２２２及び／又は３３０の置換は反応性に影響を及ぼさないと思われる。全てのトランスフェクション実験後、細胞を凍結／解凍し、得られた上清を継代した。各々の場合に成育可能なウイルスが生成され、実施した変異誘発アミノ酸はウイルスの細胞培養の生存能及び感染性に影響を及ぼさなかったことを指示した。
【００６５】
細胞培養における増殖の分析
アミノ酸置換が変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、幾つかの変異ＩＢＤＶ（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１）を分析した。このために、使用したｍｏａｂのパネルと同じ反応性パターンを含む生成ＩＢＤＶを選択した。図に示すように、ウイルスの増殖は幾つかの領域内のアミノ酸の置換によって影響を受けた。プロリンからセリンへのアミノ酸２２２の置換は、細胞培養における増殖に影響を示さなかった。これに対し、アミノ酸３１８−３２３の領域内の置換は、検討した変異株の増殖に影響を及ぼした。これらの変異株は、検討した全ての時点でより低い力価に増殖し、アミノ酸３１８−３２３の領域が細胞培養における増殖にとって重要であることを指示した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【実施例２】
【００６８】
古典的ＩＢＤＶの変異株の抗原特性
実験材料及び方法
中和アッセイによる変異株ウイルスの特性決定
生成されたウイルスがモノクローナル抗体によって中和されるかどうかを調べるために、基本的に記述されているように（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１，５３３−５４０，２０００）中和アッセイを実施した。簡単に述べると、７５０ＴＣＩＤ５０／１００μｌを含むウイルス溶液１００μｌを、各々の列の最初の穴を除いて、９６穴組織培養プレートの各々の穴にピペットで分注した。次に、種々のｍｏａｂ（６７、Ｂ６９、５７、Ｒ６３）又はポリクローナルウサギ抗ＩＢＤＶ血清１００μｌを各々の列の空である最初の穴にピペットで分注した。次に、抗体を含む穴に１５００ＴＣＩＤ５０／１００μｌを含むウイルス懸濁液１００μｌを添加した。ウイルスと血清を混合した後、１００μｌ／穴を連続的に移すことによって連続希釈液を作製した。室温で１時間のインキュベーション後、ＱＭ細胞（１０６細胞／ｍｌ）１００μｌを各々の穴に加え、３７℃でインキュベートした。６日後に、穴をＣＰＥの存在に関して採点した。血清試料についてのＶＮ試験のエンドポイントを、ＣＰＥが目に見えない、ｌｏｇ２で表わされる、最高希釈の逆数と決定した。
【００６９】
実験結果
中和アッセイにおける抗原特性
生成された変異株が適切なモノクローナル抗体によって中和され得るかどうかを調べるために、中和アッセイを実施した。このアッセイのために、１個のアミノ酸置換に基づく異なるｍＡｂパターン（Ｄ７８、ＰＳ−Ｄ７８；Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ１；Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｍｕｔ２）又は同じパターンであるが異なるアミノ酸配列（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、；ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２；Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１）のいずれかを示すウイルスの対を選択した。この結果は、ほとんどの場合に（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ１１）蛍光アッセイにおけるのと同じパターンで中和が起こることを示した（表５）。１つの例外は、蛍光アッセイでは陽性であったが、ｍＡｂ ５７によって中和されなかったＭｕｔ１１であり、エピトープは存在するがこの中和特性を喪失していることを指示した。
【００７０】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＩＢＤＶ変異株の細胞培養における増殖キイネティックを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株及びこのような古典的ＩＢＤＶの変異株を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）は、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの成員である。このファミリーのウイルスは、非常に類似したゲノム構成と類似した複製サイクルを有する。これらのウイルスのゲノムは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグメント（Ａ及びＢ）から成る。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解によって切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を形成する、ポリタンパク質をコードする。ＶＰ２とＶＰ３はビリオンの主要構造タンパク質である。ＶＰ２は、ビルナウイルスの主要宿主防護免疫源であり、ウイルス中和抗体の誘導を招く免疫原性領域を含む。
【０００３】
ＩＢＤＶに関しては、２つの血清型、血清型１と２が存在する。これら２つの血清型は、ウイルス中和（ＶＮ）試験によって識別できる。血清型１のウイルスはニワトリに対して病原性であることが示されているが、血清型２のＩＢＤＶはシチメンチョウにおいて亜急性疾患を引き起こすだけである。ガンボロ病とも呼ばれる伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）は、ファブリキウス嚢の細胞に選択的親和性を有し、リンパ組織をこの主要標的とする、ニワトリにおける急性高度伝染性ウイルス感染である。感受性のある群れでの罹病率は高く、急速な体重減少と中等度から高度の死亡率を伴う。この疾患から回復するヒナは、ニワトリの防御機構にとって不可欠であるファブリキウス嚢の破壊の故に免疫欠損を有し得る。ＩＢＤウイルスは、３週齢より若いニワトリにおいて重症の免疫抑制を引き起こし、３ヶ月齢までのヒナにおいて嚢病変を誘導する。
【０００４】
長年にわたってこの疾患は、弱毒化生ＩＢＤＶワクチンで初回免疫されたニワトリに不活性化ワクチンを適用することにより、種畜の群れにおいて高いレベルの抗体を誘導することによって予防することができた。これはＩＢＤによって生じる経済的損失を最小限に抑えてきた。ワクチン接種された種畜に由来するニワトリの母体抗体はＩＢＤＶによる早期感染を予防し、免疫抑制に関連する問題を低減する。加えて、弱毒化生ワクチンはまた、母体抗体が低下した後の商業用ニワトリの群れにおいても成功裏に使用されてきた。
【０００５】
歴史的に、ＩＢＤウイルスは、「古典的」ＩＢＤウイルスとして公知の１つの型だけから成った。しかし１９８０年代半ばに、古典的ＩＢＤＶに基づくワクチンを接種された群れにおいて、特に米国で、急性感染が認められた。この疾患は、異なる免疫原性構造を有するＩＢＤウイルスによって引き起こされたことが認められた。これらの新しいウイルスはおそらく遺伝的浮動の結果として出現したと考えられる。古典的ＩＢＤＶワクチン株は適切な交叉防御を誘導することができなかったので、これらのいわゆる「変異体」ＩＢＤＶ株の出現により、新しいＩＢＤワクチン接種プログラムの設計が必要となった。これまでに特定された血清型１ ＩＢＤＶの最も重要な変異体サブタイプは、デラウエア（Ｄｅｌａｗａｒｅ）−Ｅ、ＧＬＳ、ＲＳ／５９３及びＤＳ３２６変異体である。これらの変異体株は、ウイルス中和試験、モノクローナル抗体のパネル又はＲＴ−ＰＣＲによって特定し、古典的株から識別することができる。
【０００６】
デラウエア変異体−Ｅは、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．２０ｔｈ Ｎａｔｌ．Ｍｅｅｔ．ｏｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃｏｎｄｅｍｎａｔｉｏｎｓ；Ｏｃｅａｎ Ｃｉｔｙ，ＭＤ，ＵＳＡ，９４−１０１，１９８５）及びＳｎｙｄｅｒら（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３２，５３５−５３９，１９８５）によって報告された。ＧＬＳウイルスは１９８７年に米国において単離され、ＤＳ３２６（ＧＬＳ様）は１９８８年に米国において単離された（Ｓｎｙｄｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２７，８９−１０１，１９９２及びｖａｎ Ｌｏｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）。ＲＳ／５９３株（変異体−Ｅ様）も１９９３年に米国で単離された（Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，６５−７０，１９９４）。
【０００７】
ウイルス中和モノクローナル抗体（ｍｏａｂ）のパネルは、様々なＩＢＤＶタイプを特定するために抗原捕獲酵素免疫測定法（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）において当技術分野で一般的に使用される。既存のＩＢＤＶ株とこれらのｍｏａｂの反応性パターンを以下の表１に要約する。
【０００８】
【表１】
【０００９】
ＶＮ ｍｏａｂ Ｒ６３及びＢ６９は古典的ＩＢＤＶ株を高い力価まで中和し、ｍｏａｂ Ｂ６９は古典的株に特異的に結合する。ｍｏａｂ ＢＫ９はデラウエア変異体−Ｅ株にユニークに結合する。ｍｏａｂ ５７による陽性反応は、古典的及びデラウエア変異体株からＧＬＳ及びＤＳ３２６株を分離するために使用できる。これらや他のｍｏａｂは一般に、市販されているｍｏａｂのパネルの反応パターンを決定することによってＩＢＤＶ（変異体）株同士を識別する分野において使用される。ｍｏａｂを分泌するハイブリドーマも、以下のアクセッション番号：Ｒ６３（ＨＢ−９４９０）、８（ＨＢ−１０１７４）、Ｂ２９（ＨＢ−９７４６）、ＢＫ−９（ＨＢ−１０１５７）、６７−（ＨＢ−１１１２２）、５７（ＨＢ−１０１５６）、Ｂ６９（ＨＢ−９４３７）及び１７９（ＨＢ−１０１５８）の下にＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）より市販されている。変異体ＩＢＤＶ株及びハイブリドーマはまた、以下のアクセッション番号：ＤＳ３２６（Ｉ−９１０）、ＧＬＳ（Ｉ−７９２及びＩ−７９３）及びｍｏａｂ１０（Ｉ−２８１２）の下にｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅより市販されている。
【００１０】
ＩＢＤＶ株間の抗原変異にとっての、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質内の幾つかの領域及び明確にされたアミノ酸の重要性が提案されているが（Ｖａｋｈａｒｉａら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１，２６５−２７３，１９９４及びＳｎｙｄｅｒら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３８，７０１−７０７，１９９４）、ＩＢＤＶ中和エピトープの形成にとっての全てのアミノ酸の存在の必然性はまだ決定されていない。Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９，１３１−１３７，１９９７において、Ｖａｋｈａｒｉａらは、アミノ酸、プロリンが変異体Ｅ ＩＢＤＶに存在すると報告した。国際公開公報第ＷＯ９５／２６１９６号においてＶａｋｈａｒｉａらは、ｍｏａｂ ６７と変異体Ｅ ＶＰ２タンパク質の結合に関するアミノ酸２８６（Ｉｌｅ）、３１８（Ａｓｐ）及び３２３（Ｇｌｕ）の関与を示唆した。加えて、古典的及び変異体ＶＰ２ ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質間の多数のアミノ酸配列相違を開示している。２２２（Ｐｒｏ）、２４９（Ｇｌｎ）及び２５４（Ｇｌｙ）位のアミノ酸は、ＧＬＳ ＶＰ２タンパク質におけるＢ６９エピトープの形成に関連するとみなされた。
【００１１】
欧州特許第１１７０３０２号（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｎ．Ｖ．）は、古典的ＩＢＤＶ株に対して改善された免疫原性を有する変異体Ｅ ＩＢＤＶ変異株の作製を開示している。このＩＢＤＶ変異株は、変異体Ｅ ＶＰ２コード領域内のアミノ酸２５３（ＧｌｎからＨｉｓ）、２８４（ＡｌａからＴｈｒ）及び２５４（ＳｅｒからＧｌｙ）、２７０（ＡｌａからＴｈｒ）についてのコドンに変異を導入することによって得られた。これらの変異体Ｅ ＩＢＤＶの変異株のいずれも、ｍｏａｂ Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、変異体Ｅのウイルス中和エピトープも同時に発現する古典的ＩＢＤＶの変異株の作製を可能にする情報は、この中では開示されていない。このような変異株は、野外（ｆｉｅｌｄ）で古典的及び変異体ＩＢＤＶ株によって引き起こされる疾患に対する防御を誘導するためのワクチンにおいて非常に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、ウイルスによって発現されるＶＰ２タンパク質が変異体ＩＢＤＶに典型的なウイルス中和エピトープ６７を含むようにＶＰ２コード領域に変異を導入することにより、古典的ＩＢＤＶに基づいて新しいＩＢＤＶ変異株を構築した。発明者は、古典的ＶＰ２タンパク質に関して、ｍｏａｂとの反応性が約１００アミノ酸離れて位置するアミノ酸配列によって影響されることを発見した。さらに、２８６（Ｉｌｅ）、３１８（Ａｓｐ）及び３２３（Ｇｌｕ）が６７エピトープの存在に影響を及ぼすというＶａｋｈａｒｉａらによって為された仮定は正しくない。実際に発明者は、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質に関する６７エピトープの出現が、２２２位のプロリンのセリン又はトレオニンへの置換及び３１８−３２２位の一定のアミノ酸配列の存在に依存することを認めた。３１８−３２３位の、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質において天然で存在するアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の存在下での、２２２位のプロリンのセリン又はトレオニンへの置換は、古典的ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質における６７エピトープの出現を導く。
【００１４】
従って、本発明は、ＶＰ２タンパク質が、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌される、ｍｏａｂ ６７にも結合することを特徴とする、モノクローナル抗体（ｍｏａｂ） Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株を提供する。
【００１５】
ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質は、５１２アミノ酸から成り、アミノ酸１−５１２位のポリタンパク質上に位置する。ＶＰ２コード領域（を含む完全なセグメントＡ）のヌクレオチド配列及び多くの古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２タンパク質の対応するアミノ酸配列が決定されている（米国特許第５，８７１，７４４号、Ｄ７８については欧州特許第８８７，４１２号；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＢａｎｋ）。
【００１６】
古典的ＩＢＤＶ株に特異的なｍｏａｂ Ｂ６９を含む、ウイルス中和特性を示す全ての公知のｍｏａｂは、専らＶＰ２タンパク質に対して惹起され、立体配座依存性エピトープを認識する。多くの古典的ＶＰ２アミノ酸配列と変異体ＶＰ２アミノ酸配列、特に変異体Ｅ及びＧＬＳのＶＰ２アミノ酸配列の比較が、Ｖａｋｈａｒｉａら（１９９４、前出）及びＨｅｉｎｅら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１８３５−１８４３，１９９１）の中で開示されている。ウイルス株の間での生物学的変異は存在するが、古典的タイプのＩＢＤＶ株の中で、ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は強力に保存されている。古典的ＶＰ２アミノ酸配列の間でのアミノ酸相同性は、このタンパク質の完全長にわたって９８％−９９．４％の間で変化する（ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２アミノ酸配列との比較に基づく）。ＶＰ２の可変領域の大部分を含む、ＶＰ２タンパク質内の中心領域が特定された。この領域はアミノ酸２０６−３５０位に位置し（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１，１３０３−１３１２，１９８７）、この領域内の古典的ＶＰ２アミノ酸配列の間でのアミノ酸相同性は９５．９％−９７．９％の間で変動する（ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２アミノ酸配列との比較に基づく）。この中心領域内で、２１２−２２４位と３１４−３２６位に、異なる型のＩＢＤＶ株の間でのアミノ酸変化の大部分が起こる、２つの超可変領域が特定されている（Ｖａｋｈａｒｉａら、１９９４、前出）。これにもかかわらず、大部分の古典的ＩＢＤＶ株は、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２におけるのと同一の、領域２００−２３０のアミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−ｌｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（配列番号１９）を含む。ここでは配列をＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）で解析する。
【００１７】
従って、古典的ＩＢＤＶをここでは、ｍｏａｂ Ｂ６９に結合することができるＶＰ２タンパク質を発現するＶＰ２コード領域を含む単離ＩＢＤＶと定義する。
【００１８】
より特定すると、古典的ＩＢＤＶは、Ｄ７８株のものと同じである２００−２３０位のＶＰ２アミノ酸配列（配列番号１９）を含む単離ＩＢＤＶと定義する。
【００１９】
ＩＢＤＶとｍｏａｂの反応は、Ｓｙｎｄｅｒら（１９９２、前出）及びｖａｎ ｄｅｒＭａｒｅｌら（Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｒｔｚｌ．Ｗｓｃｈｒ．９７，８１−８３，１９９０）によって述べられているように、このために当技術分野で一般的に使用されるＡＣ−ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【００２０】
また、ｍｏａｂとＩＢＤＶの反応はまた、実施例１で述べる免疫蛍光アッセイによっても測定できる。
【００２１】
本発明に従った好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、ｍｏａｂ Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７に加えて、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｒ６３と結合するＶＰ２タンパク質を発現する。
【００２２】
本発明は、初めて、古典的ＶＰ２タンパク質に関していずれのアミノ酸残基が、（ｉ）ｍｏａｂ Ｒ６３（古典的及び変異体Ｅ）と結合する中和エピトープの形成、（ｉｉ）ｍｏａｂ ６７（変異体Ｅ）と結合する中和エピトープの付加的な形成及び（ｉｉｉ）ｍｏａｂ５７（ＧＬＳ）と結合する中和エピトープの付加的な形成、のために必要で及び十分であるかを特定する。
【００２３】
発明者は、古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内に変異を導入することによって上記で定義したような多くのＩＢＤＶ変異株を作製した（実施例１）。得られた結果は、同一エピトープが異なるアミノ酸配列によって折りたたまれ得るが、他のアミノ酸配列は変異体エピトープを生成することができないことを明らかにする。従って、特異的エピトープについて特異的コード能力が存在する。６７、５７及びＲ６３エピトープの適切な折りたたみのために必要な関連アミノ酸配列の要約を表２に示す（それぞれ、配列番号１−５、６−９及び１０−１８）。表２で提供する情報は、当業者が、ウイルス中和エピトープＢ６９に加えて、変異体Ｅ ＩＢＤＶ株に特異的なウイルス中和エピトープ６７も同時に含むＶＰ２タンパク質を発現することができる古典的ＩＢＤＶの変異株を生成することを可能にする。
【００２４】
【表２】
【００２５】
従って、特に好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、ｍｏａｂ Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７と結合し、及び古典的ＶＰ２コード領域が、
（ｉ）セリン又はトレオニンをコードする２２２位のアミノ酸についてのコドン、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位の、配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含むように、古典的ＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む変異株である。
【００２６】
表２に示す３１８−３２３位のアミノ酸配列は、２２２位のアミノ酸（プロリン）がセリン又はトレオニンに変化している場合にのみ６７エピトープの正しい折りたたみを生じさせることが認められ、前記エピトープの正しい折りたたみが１００位離れて位置するアミノ酸によって影響されることを示唆した。
【００２７】
３３０位のアミノ酸は決定的に重要ではないが、有用なＩＢＤＶ変異株は、この位置にアミノ酸、アルギニン又はセリンをコードするコドンをさらに含む。
【００２８】
上記で定義した古典的ＩＢＤＶの変異株のさらなる有利な特性は、このような変異株が、Ｒ６３ウイルス中和エピトープの正しい折りたたみのために必要なアミノ酸配列を有するＶＰ２タンパク質も同時に発現することである。配列番号１４−１５及び１７−１８のいずれかに示す３１８−３２３位のアミノ酸配列（２２２位のセリン又はトレオニンに加えて）を有するＶＰ２タンパク質を発現するＩＢＤＶは、エピトープＲ６３を提示するが、エピトープ６７は提示できないことが表２及び実施例１で明らかにされる。
【００２９】
発明者によって為されたさらなる意外な観察は、古典的ＩＢＤＶ株の３１８−３２３位のＶＰ２コード領域内のアミノ酸の置換が、このような変異株の増殖特性の低下をもたらすということである。このような変異株は、ニワトリについての弱毒化表現型を示し、改善された安全性特性を有するワクチン候補物として、特にインオボ経路で投与されるワクチンにおいて、好都合に使用できる。従って、本発明はまた、古典的ＶＰ２コード領域が、天然アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１）とは異なる３１８−３２３位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むように、古典的ＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む古典的ＩＢＤＶの変異株を提供する。好ましくは、これらの古典的ＩＢＤＶの変異株は、場合により上記で定義した２２２位及び／又は３３０位のアミノ酸と共に、配列番号２−９及び１１−１８のいずれかに示すこれらの位置のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株は、フィールドから単離し得る又はワクチンにおいて使用される何らかの古典的ＩＢＤＶ株に由来するＶＰ２コード領域内に必要な変異を導入することによって作製できる。適切なＩＢＤＶ株は、Ｄ７８、ＰＢＧ９８、２２８Ｅ及び８９−０３（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．）などの、市販のワクチン中に存在する周知のＩＢＤＶ株を含む。ＩＢＤＶ株Ｄ７８（米国特許第４，５３０，８３１号）はまた、アクセッション番号ＶＲ−２０４１の下にＡＴＣＣからも入手可能である。ＶＰ２コード領域を含む、菌株Ｄ７８の完全なセグメントＡのヌクレオチド配列、及び対応する（ポリ）タンパク質のアミノ酸配列は、米国特許第５，８７１，７４４号及び欧州特許出願第８８７，４１２号に開示されている。
【００３１】
特に、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含む古典的ＩＢＤＶの変異株が提供される。
【００３２】
本発明に従ったさらなる好ましい古典的ＩＢＤＶの変異株は、上述したような変異した古典的ＶＰ２コード領域を含む、古典的ＩＢＤＶ株のセグメントＡの完全な遺伝子骨格を含む。特に、上記で定義したような古典的ＩＢＤＶの変異株は、ＩＢＤＶ株Ｄ７８に由来する。
【００３３】
しかし、本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株はまた、変異体Ｅ又はＧＬＳ株などの変異体ＩＢＤＶ株の遺伝子骨格に基づき得る。このような「キメラ」古典的ＩＢＤＶの変異株では、変異体ＩＢＤＶ株のセグメントＡの遺伝子骨格上のＶＰ２コード配列が、古典的ＩＢＤＶの変異株の新しい変異体エピトープの原因となる所望変異を付加的に含む、対応する適切な古典的ＶＰ２コード配列によって置き換えられている。
【００３４】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株の作製は、最近確立されたＩＢＤＶについての感染性ｃＲＮＡ系（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１１１３１−１１１３６，１９９６）によって実施できる。この逆遺伝学的システムは、ＩＢＤＶのＲＮＡゲノムに変異を導入する可能性を提供する。この逆遺伝学的システムにおける最も重要な工程は、ＩＢＤＶのセグメントＡ及びＢの両方の５’及び３’末端のヌクレオチドを含む、これらのセグメントの完全長ｃＤＮＡクローンを提供することである。クローニング工程の後、セグメントＡ及びＢの完全長配列を、Ｔ７、ＳＰ６又はＴ３ポリメラーゼなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合することができるプロモーターに作動可能に連結する。Ｔ７プロモーターが好ましい。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、それぞれセグメントＡ及びＢの完全長ｃＤＮＡクローンからウイルスｃＲＮＡを転写することができる。このｃＲＮＡは、ウイルスの複製及び生存ウイルスの単離を誘導することができる。この手順は、天然に生じるあらゆるＩＢＤＶに関して実施できる。
【００３５】
逆遺伝学的システムは、Ｄ７８（Ｙａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２６４７−２６５７、１９９８）、菌株ＨＫ４６（Ｌｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，２８５４−２８６２，１９９９）、ＣＥＦ ９４（Ｂｏｏｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６５，３３０−３４１，１９９９）及びＵＫ６６１（ｖａｎ Ｌｏｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３，１２１−１２９，２００２）などの様々なＩＢＤＶ株に関して記述されている。
【００３６】
所望変異は、この目的のために当技術分野で一般的に公知の方法によってＩＢＤＶゲノムに導入することができる。特に、部位指定変異誘発によって変異が導入される。ＩＢＤＶゲノムに変異を導入するための方法をここで述べるが、当技術分野でも一般的に使用される（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ，１９９６，前出；Ｙａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２６４７−２６５４，１９９８；Ｍｕｎｄｔら、１９９９，前出；欧州特許出願第１１７０３０２号；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｗｉｌｅｙ Ｎ． Ｙ．，１９９５年版、ｐ．８．５．１．−８．５．９．及びＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４より、３７６−３８２，１９８７）。
【００３７】
アミノ酸位置を示すためにここで使用する数字は、当技術分野で一般的に使用されるようなＩＢＤＶポリタンパク質内のアミノ酸の番号付けを表わす。ヌクレオチド位置を示す数字は、ＭｕｎｄｔとＭｕｌｌｅｒ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４３７−４４３，１９９５；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ８４０３４）によって記述されているＩＢＤＶゲノムのセグメントＡの完全なヌクレオチド配列に基づく。
【００３８】
本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株のセグメントＢは、いかなるＩＢＤＶ株由来であってもよく、好ましくは古典的ＩＢＤＶ株、最も好ましくは菌株Ｄ７８又はＰ２に由来し得る（米国特許第５，８７１，７４４号及び欧州特許出願第８８７４１２号）。
【００３９】
実施例で示すように、本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株は、これまで古典的ＩＢＤＶ株に関しては認められなかった免疫原性構造を示す。新しい古典的ＩＢＤＶの変異株は、古典的及び変異体ＩＢＤＶ株の両方による感染から生じる疾患状態に対して家禽を有効に保護することができる新しいタイプのＩＢＤＶワクチンの基礎を構成し得る。従って、本発明のもう１つの局面は、ワクチンが、医薬適合性の担体又は希釈剤と共に、上記で定義した古典的ＩＢＤＶの変異株を含むことを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチンである。
【００４０】
古典的ＩＢＤＶの変異株は、生弱毒化又は不活性化ウイルスとしてワクチンに組み込むことができる。
【００４１】
本発明に従ったワクチンは、例えば市販の生及び不活性化ＩＢＤＶワクチンに関して一般的に使用されるような、従来の方法によって製造することができる。簡単に述べると、感受性のある基質に本発明に従った古典的ＩＢＤＶの変異株を接種し、ウイルスが所望感染力価に複製するまで増殖させ、次にＩＢＤＶ含有物質を採取して、場合により不活性化し、医薬適合性の担体又は希釈剤と混合する。
【００４２】
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又はニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬ）などの一次（鳥類）細胞培養、ＶＥＲＯ細胞系又はＢＧＭ−７０細胞系などの哺乳動物細胞系、若しくはＱＴ−３５、ＱＭ−７又はＬＭＨなどの鳥類細胞系を含む、ＩＢＤＶの複製を支持することができるあらゆる基質が、本発明に従ったワクチンを製造するために使用できる。通常は、細胞の接種後、ウイルスを３−１４日間増殖させ、次に細胞培養上清を採取して、所望する場合は細胞デブリを除去するためにろ過又は遠心分離する。
【００４３】
古典的ＩＢＤＶの変異株はまた、孵化鶏卵中で増殖させることもできる。
【００４４】
所望する場合、古典的ＩＢＤＶの弱毒化は、細胞培養における、例えば初代細胞培養又は上記の確立された細胞系における、ウイルスの標準連続継代によって実施できる（Ｂａｙｙａｒｉら、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４０，５１６−５３２，１９９６；Ｔｓａｉら、Ａｖｉａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，４１５−４２２，１９９２）。
【００４５】
また、古典的ＩＢＤＶは、感染ニワトリにおいてインビボで増殖させることができ、次にこれらの感染動物からファブリキウス嚢を単離して、これを希釈剤と混合し、この混合物を均質化する。このようにして増殖させたＩＢＤＶは、一般に不活性化ワクチンの基剤を形成する。
【００４６】
生ウイルスを含む本発明に従ったワクチンは、懸濁液の形態又は凍結乾燥形態で製造及び販売することができ、このような組成物に関して慣例的に使用される、医薬適合性の担体又は希釈剤を付加的に含む。担体は、安定剤、防腐剤及び緩衝剤を含む。適切な安定剤は、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタミン酸塩又はグルコース）、タンパク質（乾燥乳清、アルブミン又はカゼイン）又はこれらの分解産物である。適切な緩衝剤は、例えばアルカリ金属リン酸塩である。適切な防腐剤は、チメロサール、マーシオレート及びゲンタマイシンである。希釈剤は、水、水性緩衝液（緩衝食塩水など）、アルコール及びポリオル（グリセロールなど）を含む。
【００４７】
所望する場合、本発明の従った生ワクチンはアジュバントを含み得る。アジュバント活性を有する適切な化合物及び組成物の例は、以下で述べるものと同じである。
【００４８】
本発明に従った生ワクチンの、例えば筋肉内、皮下又はインオボ経路の、注射による投与が可能であるが、前記ワクチンは、好ましくはＩＢＤＶワクチン接種のために一般的に使用される安価な集団適用経路によって投与される。ＩＢＤＶワクチン接種に関して、この経路は飲料水、噴霧及びエーロゾルワクチン接種を含む。
【００４９】
また、本発明は、不活性化（死滅）形態の変異体ＩＢＤＶを含むワクチンを提供する。不活性化ＩＢＤＶワクチンの利点は、長期間にわたって高いレベルの防御抗体が得られることである。
【００５０】
増殖工程後に採取したウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの繁殖を排除することである。一般にこれは、当技術分野で周知の化学的又は物理的手段によって達成できる。
【００５１】
不活性化変異体ＩＢＤＶを含むワクチンは、例えばこの目的に適する前述した医薬適合性の担体又は希釈剤の１又はそれ以上を含む。
【００５２】
好ましくは、本発明に従った不活性化ワクチンは、アジュバント活性を有する１又はそれ以上の化合物を含む。このための適切な化合物又は組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標）などの鉱物油若しくはビタミンＥアセテートなどの植物油に基づく水中油型又は油中水型乳剤、及びサポニンを含む。
【００５３】
本発明に従ったワクチンは、有効成分として古典的ＩＢＤＶの変異株の有効量、すなわちビルレントウイルスによる攻撃誘発に対してワクチン接種した鳥において免疫を誘導する免疫ＩＢＤＶ物質の量を含有する。免疫は、ここでは非ワクチン接種群と比較してワクチン接種後の鳥の個体群における有意に高いレベルの防御の誘導と定義される。
【００５４】
典型的には、本発明に従った生ワクチンは、各動物当り１００−１０９ＴＣＩＤ５０の用量、好ましくは各動物当り１０３−１０６ＴＣＩＤ５０の範囲の用量で投与することができる。不活性化ワクチンは、各動物当り１０６−１０１０ＴＣＩＤ５０の抗原当量を含み得る。
【００５５】
不活性化ワクチンは通常非経口的に、例えば筋肉内又は皮下経路で、投与される。
【００５６】
本発明に従ったＩＢＤＶワクチンはニワトリにおいて有効に使用し得るが、シチメンチョウ、ホロホロ鳥及びヤマウズラ（ｐａｒｔｒｉｄｇｅｓ）などの他の家禽も前記ワクチンで成功裏にワクチン接種し得る。ニワトリは、ブロイラー、若齢メンドリ、繁殖用系統（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｏｃｋ）及び産卵用系統を含む。
【００５７】
本発明に従った生又は不活性化ワクチンを接種される動物の年齢は、従来の生又は不活性化ＩＢＤＶワクチンを接種される動物の場合と同じである。例えばブロイラー（母体由来抗体−ＭＤＡなし）は１日齢又はインオボでワクチン接種し得るが、高レベルのＭＤＡを有するブロイラーは、好ましくは２−３週齢でワクチン接種する。低レベルのＭＤＡを有する産卵用系統又は繁殖用系統は、１−１０日齢でワクチン接種し、次に６−１２及び１６−２０週齢で不活性化ワクチンによるブースター免疫を実施し得る。
【００５８】
本発明はまた、前述した古典的ＩＢＤＶの変異株に加えて、家禽に病原性の他の病原体の１又はそれ以上のワクチン成分を含む混合ワクチンを包含する。
【００５９】
好ましくは、混合ワクチンは、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、軟卵症候群（ＥＤＳ）ウイルス、シチメンチョウの鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）又はレオウイルスの１又はそれ以上のワクチン株を付加的に含む。
【００６０】
（実施例）
【実施例１】
【００６１】
古典的ＩＢＤＶの変異株の作製及びモノクローナル抗体反応性の測定
実験材料及び方法
変異セグメントＡの作製
部位指定変異誘発実験のためにｐＤ７８Ａ（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ、前出、１９９６；欧州特許第８８７４１２号）を使用した。このために、ｐＤ７８ＡをＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断し、フラグメントを含むセグメントＡを、適切に切断したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ＋に連結して、ｐＳＫ＋−Ｄ７８Ａを得た。一本鎖ＤＮＡの作製後、表３に示すオリゴヌクレオチドを使用してＫｕｎｋｅｌら（前出、１９８７）に従って部位指定実験を実施した。オリゴヌクレオチドＭｕｔ１、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ６、Ｍｕｔ７、Ｍｕｔ８、Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１を使用して、それぞれ変異プラスミドｐＭｕｔ１、ｐＭｕｔ２、ｐＭｕｔ３、ｐＭｕｔ４、ｐＭｕｔ５、ｐＭｕｔ６、ｐＭｕｔ７、ｐＭｕｔ８、ｐＭｕｔ９、ｐＭｕｔ１０、及びｐＭｕｔ１１を生成した。この１１個の変異プラスミドを使用して一本鎖ＤＮＡを作製し、部位指定変異誘発実験においてｐＳＫ＋−Ｄ７８Ａの一本鎖ＤＮＡと共に使用した。これらの実験は、１つの実験において１個（Ｐ２２２Ｓ又はＲ３３９Ｓ）又は２個のオリゴヌクレオチド（Ｐ２２２Ｓ及びＲ３３９Ｓ）で実施し、塩基トリプレットの１個又は２個の置換を得た。得られた変異誘発プラスミド（表４に示す）を塩基配列決定し、さらなる実験のために使用した。
【００６２】
ｃＲＮＡのトランスフェクション、免疫蛍光アッセイ及び生成したウイルスの継代
インビトロ転写のために、ｐＤ７８Ａを含むプラスミド及び変異誘発プラスミドをＢｓｒＧ Ｉで切断して線状にした。Ｐｓｔ Ｉを使用してｐＰ２Ｂ（ＭｕｎｄｔとＶａｋｈａｒｉａ、前出、１９９６；欧州特許第８８７４１２号）を線状にした。線状ＤＮＡのさらなる処理、転写及びＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのトランスフェクションを、Ｍｕｎｄｔ（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２０６７−２０７６，１９９９）が述べたように実施した。免疫蛍光アッセイのために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＢＨＫ２１細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にアセトン／メタノール（５０％／５０％）で５分間固定し、乾燥した。固定した細胞を、それぞれリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈したモノクローナル抗体６７、Ｂ６９、５７、Ｒ６３及びウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６，４３７−４４３，１９９５）と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗った。細胞を、今度はＰＢＳ希釈したＤＴＡＦ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はＤＴＡＦ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３０分間インキュベートし、次にＰＢＳを用いて３回洗浄し、蒸留水で１回洗浄した。空気乾燥後、細胞を、９０％グリセロールと共にＰＢＳを含む２．５％１．４．−ジアゾビシクロ（２．２．２．）−オクタン（ＤＡＢＣＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に封入した。油浸蛍光顕微鏡を用いて蛍光を視覚化した。生成したウイルスの継代のために、６穴組織培養プレートで増殖させたＢＨＫ２１細胞を、２４穴組織培養プレートでのトランスフェクション実験と平行してトランスフェクトし、２４−４８時間インキュベートした。少なくとも１時間の−７０℃での凍結／解凍後、得られた上清を６４００×ｇで１０分間遠心分離し、ＣＰＥが目に見えるまで２５ｃｍ２組織培養フラスコで増殖させたＱＭ細胞に継代接種した。前述したように上清を入手し、アリコートに分けて、−７０℃で保存した。生育能及びｍｍＡｂとの反応性の存在の分析のために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＱＭ細胞を１つのアリコートに感染させ、２４時間インキュベートした。免疫蛍光アッセイを前述したように実施した。
【００６３】
生成したウイルスの細胞培養での増殖分析
増殖を観測するために、２４穴組織培養プレートで増殖させたＣＥＣを、３７℃で１時間、１のＭＯＩで選択したＩＢＤＶに感染させた。次に、接種物を除去し、細胞を培地で洗って、培地１ｍｌを添加した。この直後（０時間目）、及び３７℃で８、１２、１６、２４及び３６時間のインキュベーション後に、別々に上清を採取し、−７０℃で保存した。９６穴組織培養プレートで増殖させたＱＭ細胞（ウズラ筋細胞）を用いたＴＣＩＤ５０の定量によってウイルス力価を得た。このために上清を解凍し、ｌｏｇ１０段階で力価測定した。各々１００μｌの適切な希釈液を組織培養プレートの４つの穴にピペットで分注し、次にＱＭ細胞懸濁液１００μｌ（１０６細胞／ｍｌ）を添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。５日後、ＣＰＥを含むウエルを陽性として計数し、Ｓｐａｅｒｍａｎ（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．，２，２２７−２４２，１９０８）及びＫａｒｂｅｒ（Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．Ｐｈａｒｍａｋ．，１６２，４８０−４８７，１９３１）に従ってＴＣＩＤ５０を定量した。３つの独立した実験の平均値及び標準偏差を計算した。
【００６４】
実験結果
ＶＰ２の可変領域内のアミノ酸の置換がモノクローナル抗体の反応性に及ぼす影響
菌株Ｄ７８の配列内の２２２位（プロリン）、３１８位（グリシン）、３２１位（アラニン）及び３２３位（アスパラギン酸）に位置するアミノ酸を、種々の組合せで、それぞれアミノ酸、セリン、トレオニン（Ｐ２２２Ｓ、Ｐ２２２Ｔ）、アスパラギン酸、アスパラギン（Ｇ３１８Ｄ、Ｇ３１８Ｎ）、グルタミン酸（Ａ３２１Ｅ）、及びグルタミン酸（Ｄ３２３Ｅ）に置き換えた（表４参照）。２２２位のプロリンのセリンへの置換は、３１８−３２３位のアミノ酸のアミノ酸配列が以下の組合せである場合、ｍｏａｂ ６７の付加的な反応性をもたらした：ＧＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＥ、ＧＧＱＡＧＥ、ＮＧＱＡＧＥ。３１８−３２３位のアミノ酸配列の残りの組合せ（ＤＧＱＥＧＤ、ＤＧＱＥＧＥ、ＧＧＱＥＧＤ、ＧＧＱＥＧＥ、ＮＧＱＡＧＤ、ＮＧＱＥＧＤ、ＮＧＱＥＧＥ）は、２２２位のプロリンをセリンに置き換えた場合でも、ｍｏａｂ ６７によって特徴付けられるエピトープの折りたたみを妨げると思われる。３２１位のアミノ酸をアラニンからグルタミン酸に置き換えた後、アミノ酸２２２（プロリン）、３１８（グリシン）及び３２３（アスパラギン酸）とは無関係に、ｍｏａｂ ５７の結合が検出された。しかし、３３０位のアルギニンのセリンへの置換は５７エピトープの存在に影響を及ぼした。ここでは、実施した置換（Ｒ３３０Ｓ）をそれぞれＤＧＱＥＧＤ、ＮＧＱＥＧＤ及びＮＧＱＥＧＥの組合せの存在下で実施した場合、コトランスフェクション実験後にｍｏａｂ ５７との反応性は検出されなかった。これに対し、ＧＧＱＥＧＤの組合せの存在下では、Ｒ３３０Ｓの置換はｍｏａｂ ５７との反応性に影響を及ぼさなかった。実施した実験において、５７エピトープが存在する場合はＲ６３エピトープが存在しなかったので、ｍｏａｂ ５７とＲ６３の反応性の存在は互いを除外した。さらにＶＰ２領域内に位置する３１８−３２３位のアミノ酸からの組合せＧＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＤ、ＤＧＱＡＧＥ、ＧＧＱＡＧＥ、ＮＧＱＡＧＤ、及びＮＧＱＡＧＥをコードするプラスミドの使用後に、アミノ酸２２２（プロリン）又はアミノ酸３３０（アルギニン）を置換したかどうかとは無関係に、コトランスフェクション実験後にｍｏａｂ Ｒ６３との反応性が記録された。ポリタンパク質遺伝子の３１８−３２３位のアミノ酸配列ＤＧＱＥＧＥ又はＧＧＱＥＧＥをコードするプラスミドのｃＲＮＡの翻訳されたタンパク質は、ｍｏａｂ ６９とだけ反応した。ここでもやはり、アミノ酸２２２及び／又は３３０の置換は反応性に影響を及ぼさないと思われる。全てのトランスフェクション実験後、細胞を凍結／解凍し、得られた上清を継代した。各々の場合に成育可能なウイルスが生成され、実施した変異誘発アミノ酸はウイルスの細胞培養の生存能及び感染性に影響を及ぼさなかったことを指示した。
【００６５】
細胞培養における増殖の分析
アミノ酸置換が変異ウイルスの増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、幾つかの変異ＩＢＤＶ（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１）を分析した。このために、使用したｍｏａｂのパネルと同じ反応性パターンを含む生成ＩＢＤＶを選択した。図に示すように、ウイルスの増殖は幾つかの領域内のアミノ酸の置換によって影響を受けた。プロリンからセリンへのアミノ酸２２２の置換は、細胞培養における増殖に影響を示さなかった。これに対し、アミノ酸３１８−３２３の領域内の置換は、検討した変異株の増殖に影響を及ぼした。これらの変異株は、検討した全ての時点でより低い力価に増殖し、アミノ酸３１８−３２３の領域が細胞培養における増殖にとって重要であることを指示した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【実施例２】
【００６８】
古典的ＩＢＤＶの変異株の抗原特性
実験材料及び方法
中和アッセイによる変異株ウイルスの特性決定
生成されたウイルスがモノクローナル抗体によって中和されるかどうかを調べるために、基本的に記述されているように（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１，５３３−５４０，２０００）中和アッセイを実施した。簡単に述べると、７５０ＴＣＩＤ５０／１００μｌを含むウイルス溶液１００μｌを、各々の列の最初の穴を除いて、９６穴組織培養プレートの各々の穴にピペットで分注した。次に、種々のｍｏａｂ（６７、Ｂ６９、５７、Ｒ６３）又はポリクローナルウサギ抗ＩＢＤＶ血清１００μｌを各々の列の空である最初の穴にピペットで分注した。次に、抗体を含む穴に１５００ＴＣＩＤ５０／１００μｌを含むウイルス懸濁液１００μｌを添加した。ウイルスと血清を混合した後、１００μｌ／穴を連続的に移すことによって連続希釈液を作製した。室温で１時間のインキュベーション後、ＱＭ細胞（１０６細胞／ｍｌ）１００μｌを各々の穴に加え、３７℃でインキュベートした。６日後に、穴をＣＰＥの存在に関して採点した。血清試料についてのＶＮ試験のエンドポイントを、ＣＰＥが目に見えない、ｌｏｇ２で表わされる、最高希釈の逆数と決定した。
【００６９】
実験結果
中和アッセイにおける抗原特性
生成された変異株が適切なモノクローナル抗体によって中和され得るかどうかを調べるために、中和アッセイを実施した。このアッセイのために、１個のアミノ酸置換に基づく異なるｍＡｂパターン（Ｄ７８、ＰＳ−Ｄ７８；Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ１；Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｍｕｔ２）又は同じパターンであるが異なるアミノ酸配列（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、；ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２；Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１）のいずれかを示すウイルスの対を選択した。この結果は、ほとんどの場合に（Ｄ７８、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、ＰＳ−Ｄ７８、ＰＳ−Ｍｕｔ１、ＰＳ−Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ１１）蛍光アッセイにおけるのと同じパターンで中和が起こることを示した（表５）。１つの例外は、蛍光アッセイでは陽性であったが、ｍＡｂ ５７によって中和されなかったＭｕｔ１１であり、エピトープは存在するがこの中和特性を喪失していることを指示した。
【００７０】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＩＢＤＶ変異株の細胞培養における増殖キイネティックを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体（ｍｏａｂ）Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株であって、ＶＰ２タンパク質が、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌されるｍｏａｂ ６７にも結合することを特徴とする、前記変異株。
【請求項２】
前記ＶＰ２タンパク質が、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｂ６９、ｍｏａｂ ６７及びｍｏａｂ Ｒ６３と結合することを特徴とする、請求項１に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項３】
前記変異株が、古典的ＶＰ２コード領域内に、
コード領域が
（ｉ）セリン又はトレオニンをコードする２２２位のアミノ酸についてのコドン、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位の、配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含むように、１又はそれ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項４】
前記コード領域が、アルギニン又はセリンをコードする３３０位のアミノ酸についてのコドンを含むことを特徴とする、請求項３に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項５】
前記変異株が、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項６】
前記変異株が、古典的ＩＢＤＶの、好ましくはＩＢＤＶ株Ｄ７８の、ゲノムセグメントＡを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項７】
ワクチンが、医薬適合性の担体又は希釈剤と共に、請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株を含むことを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチン。
【請求項８】
古典的ＩＢＤＶの変異株が生菌形態であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンが、家禽に感染性である他の病原体の１又はそれ以上のワクチン成分をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンがアジュバントを含むことを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
前記古典的ＩＢＤＶの変異株を細胞培養中で増殖させ、次に細胞培養から採集することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株の作製のための方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株を医薬適合性の担体又は希釈剤と混合することを特徴とする、請求項７から１０のいずれかに記載のワクチンの製造のための方法。
【請求項１３】
（ｉ）２２２位のアミノ酸についてのコドンがセリン又はトレオニンをコードする、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする
ように、１又はそれ以上の変異を古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内に導入することを特徴とする、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌される、モノクローナル抗体（ｍｏａｂ） Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株の作製のための方法。
【請求項１４】
前記変異を、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内の２２２位のアミノ酸についてのコドンに導入することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＶＰ２タンパク質が、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｒ６３にも結合することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＶＰ２コード領域が、アルギニン又はセリンをコードする３３０位のアミノ酸についてのコドンを含むことを特徴とする、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
１又はそれ以上の変異をＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域に導入することを特徴とする、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
１又はそれ以上の変異を古典的ＩＢＤＶの、好ましくはＩＢＤＶ株Ｄ７８の、ゲノムセグメントＡに導入することを特徴とする、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１３から１８のいずれかに述べる方法に従って作製される古典的ＩＢＤＶの変異株を医薬適合性の担体又は希釈剤と混合することを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチンの製造のための方法。
【請求項１】
モノクローナル抗体（ｍｏａｂ）Ｂ６９と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株であって、ＶＰ２タンパク質が、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌されるｍｏａｂ ６７にも結合することを特徴とする、前記変異株。
【請求項２】
前記ＶＰ２タンパク質が、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｂ６９、ｍｏａｂ ６７及びｍｏａｂ Ｒ６３と結合することを特徴とする、請求項１に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項３】
前記変異株が、古典的ＶＰ２コード領域内に、
コード領域が
（ｉ）セリン又はトレオニンをコードする２２２位のアミノ酸についてのコドン、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位の、配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含むように、１又はそれ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項４】
前記コード領域が、アルギニン又はセリンをコードする３３０位のアミノ酸についてのコドンを含むことを特徴とする、請求項３に記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項５】
前記変異株が、ＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域内に１又はそれ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項６】
前記変異株が、古典的ＩＢＤＶの、好ましくはＩＢＤＶ株Ｄ７８の、ゲノムセグメントＡを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株。
【請求項７】
ワクチンが、医薬適合性の担体又は希釈剤と共に、請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株を含むことを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチン。
【請求項８】
古典的ＩＢＤＶの変異株が生菌形態であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンが、家禽に感染性である他の病原体の１又はそれ以上のワクチン成分をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンがアジュバントを含むことを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
前記古典的ＩＢＤＶの変異株を細胞培養中で増殖させ、次に細胞培養から採集することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株の作製のための方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載の古典的ＩＢＤＶの変異株を医薬適合性の担体又は希釈剤と混合することを特徴とする、請求項７から１０のいずれかに記載のワクチンの製造のための方法。
【請求項１３】
（ｉ）２２２位のアミノ酸についてのコドンがセリン又はトレオニンをコードする、及び
（ｉｉ）３１８−３２３位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１−５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする
ように、１又はそれ以上の変異を古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内に導入することを特徴とする、それぞれＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４３７及びＨＢ−１１１２２によって分泌される、モノクローナル抗体（ｍｏａｂ） Ｂ６９及びｍｏａｂ ６７と結合するＶＰ２タンパク質を発現する古典的伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）の変異株の作製のための方法。
【請求項１４】
前記変異を、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２コード領域内の２２２位のアミノ酸についてのコドンに導入することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＶＰ２タンパク質が、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡに寄託されているハイブリドーマ細胞系統ＨＢ−９４９０によって分泌される、ｍｏａｂ Ｒ６３にも結合することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＶＰ２コード領域が、アルギニン又はセリンをコードする３３０位のアミノ酸についてのコドンを含むことを特徴とする、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
１又はそれ以上の変異をＩＢＤＶ株Ｄ７８のＶＰ２コード領域に導入することを特徴とする、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
１又はそれ以上の変異を古典的ＩＢＤＶの、好ましくはＩＢＤＶ株Ｄ７８の、ゲノムセグメントＡに導入することを特徴とする、請求項１３から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１３から１８のいずれかに述べる方法に従って作製される古典的ＩＢＤＶの変異株を医薬適合性の担体又は希釈剤と混合することを特徴とする、ＩＢＤＶ感染によって引き起こされる疾患に対する家禽の保護において使用するためのワクチンの製造のための方法。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５２４０４６（Ｐ２００６−５２４０４６Ａ）
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５４８７（Ｐ２００６−５０５４８７）
【出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６３４
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（３９４０１０９８６）アクゾ・ノベル・エヌ・ベー (31)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２４日（２００４．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０５０３６０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６３４
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（３９４０１０９８６）アクゾ・ノベル・エヌ・ベー (31)
【Ｆターム（参考）】
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