低分子化合物を検出するための方法およびバイオチップ
本発明は、低分子化合物の検出のための方法およびその特異的バイオチップを開示する。本発明のバイオチップは、固相支持体、およびその固相支持体に固定されたキャリア結合低分子化合物を備える。本発明はまた、本発明のバイオチップを使用した低分子化合物の検出のための方法およびキットを提供する。本発明は、低分子化合物を検出するためのバイオチップを提供し、このバイオチップは、固相支持体およびキャリアと低分子化合物との結合体を備える。ここで、上記結合体は、上記固相支持体の表面に固定されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、化合物を検出する方法および化合物を検出するためのデバイスに関する。より詳細には、本発明は、低分子化合物を検出する方法および低分子化合物を検出するためのバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
バイオチップ技術は、９０年代半ば以降の科学および技術における最も重要な進歩の１つである。これは、生物学、電子工学、物理学、化学、およびコンピュータサイエンスにまたがる技術である。バイオチップ技術は、一般的に、以下の手順を包含する：第一に、バイオチップは、生物学的分子（例えば、核酸フラグメント、ペプチド、時には細胞および組織でさえも）を、固相支持体（例えば、スライドガラス、シリカスライド、ヒドロゲルおよび膜）上に、ある順序で固定することによって作製され；作製されたバイオチップは、サンプル中の標的分子と反応させられ；最後に、このバイオチップのシグナル強度が、スキャナのような特別な装置を介して効率的に分析され、サンプル中の標的分子の濃度を分析する。固定された分子の差異に基づいて、バイオチップは、以下に分類され得る：遺伝子マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ、および組織マイクロアレイ。近年開発されたラボ−オン−チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）もまた、バイオチップ技術の重要な部門である。
【０００３】
低分子検出のために現在使用される２つの主な方法は、物理的分析および免疫学的分析である。物理的分析としては、主にスペクトル法、クロマトグラフィー、およびこれらの方法の組み合わせが挙げられる。クロマトグラフィー検出は、最も使用されている（例えば、ＨＰＬＣ、ＧＣおよびＴＬＣ）。免疫学的方法としては、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡが挙げられ、中でも特にＥＬＩＳＡが最も使用されている。
【０００４】
クロマトグラフィー分離系は、分離される成分、液相および固定相を主に含む。分離の原理は、２つの相における各成分の分配係数の差異に基づく。２つの相がお互いに対して動く場合、上記成分は、流体相の動きに従って２つの相の間で繰り返し分布することによって分離される。クロマトグラフィー分離は、高効率性、良好な選択性、ならびに正確な定性分析および定量分析という利点を有する。しかしクロマトグラフィー分離は、複雑なサンプル分離、高価な装置、および長時間の検出期間のようないくつかの欠点もまた有する。
【０００５】
低分子の免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、免疫学、分析化学、および合成化学の組み合わせ技術の一種である。低分子の検出のためにＥＬＩＳＡを使用する２つの方法が存在する。１つの方法は、抗体を固定して、酵素連結低分子によって検出が完了する方法である。他の方法は、キャリア連結低分子を固定して、酵素連結抗体によって検出が完了する方法である。ＥＬＩＳＡは、高感受性、低検出コスト、および短時間の検出期間という利点を有する。しかし、その欠点は、単一標的検出であることである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、低分子化合物を検出するための方法およびバイオチップを提供する。
【０００７】
本発明は、低分子化合物を検出するためのバイオチップを提供し、このバイオチップは、固相支持体およびキャリアと低分子化合物との結合体を備える。ここで、上記結合体は、上記固相支持体の表面に固定されている。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、１〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、以下からなる群より選択される獣医学用薬物である：エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキサゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｙｌｉｎｅ）、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、およびクロピドール。いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、以下からなる群より選択される禁止物質である：アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシン。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記キャリアは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ｏｖａｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）からなる群より選択されるルタンパク質である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、複数の結合体が固相支持体に固定されて、２次元アレイを形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、固相支持体の表面に固定された１つ以上のコントロールをさらに備え、このコントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、固相支持体の表面に固定された、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロール備える。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記固相支持体は、セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される。
【００１３】
本発明はまた、低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）検出されるべき低分子化合物をキャリアに連結させて、結合体を形成する工程；ｂ）この結合体を、固相支持体の化学的に修飾された表面にスポットする工程；およびｃ）スポットされた固相支持体を乾燥させる工程。
【００１４】
本発明はまた、サンプル中の低分子化合物を検出するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）本明細書において記載されるバイオチップを、サンプル、および上記低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、この結合分子の上記低分子化合物への特異的結合に適切な条件下で、インキュベートする工程；ｂ）上記バイオチップの表面に固定された結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合を検出する工程であって、それによって該サンプル中の上記低分子化合物の存在または非存在または量が検出される、工程。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）の前にブロッキング溶液中でインキュベートされる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、上記サンプルと上記結合分子との混合物とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、最初に上記サンプルとともにインキュベートされ、次いで上記結合分子とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、最初に上記結合分子とともにインキュベートされ、次いで上記サンプルとともにインキュベートされる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合と、上記バイオチップの表面に固定されたコントロールへの上記結合分子の結合とを比較する工程をさらに包含する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体またはポリマーである。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、標識に連結され、そして上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合が、上記バイオチップにおける上記標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される。前記標識は、以下：蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性標識、および発光標識からなる群より選択され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記バイオチップを上記結合分子に特異的に結合する二次抗体とともにインキュベートする工程をさらに包含し、そして上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合が、上記二次抗体の結合を検出することによって検出される。いくつかの実施形態において、上記二次抗体は標識に連結され、そして上記二次抗体の上記結合分子への結合が、上記バイオチップにおける上記標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、残存獣医学用薬物を検出するため、または禁止物質の乱用を検出するために使用される。
【００２１】
本発明はまた、本明細書において記載される検出方法のいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、このキットは、本明細書において記載されるバイオチップおよび上記低分子化合物に特異的に結合する結合分子を備える。このキットは、本明細書において記載される低分子化合物の検出の用途のための使用説明書をさらに備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、バイオチップを使用して低分子化合物を検出するための方法を提供する。本発明は、バイオチップ技術および免疫学的分析の両方の利点を有する。例えば、複数サンプル検出が、１つのバイオチップ上で同時に行われ得る。バイオチップ技術によって、１サイクルのみの検出で多くの標的が同時に分析され得る。この結果は、より信頼できる。検出サイクルの全ての工程はまた、バイオチップにおけるコントロールによって効率的に制御されて、結果の信頼性を強化し得る。少量の分子が必要とされる。約１０μＬのサンプルは、１検出サイクルに十分であり得る。したがって、本発明は、バイオチップ技術に起因するハイスループットおよび大量の情報、ならびに免疫学的分析に起因する単純な操作、迅速な検出、高感度および低コストのような、多くの利点を提供する。本発明のバイオチップおよび方法を通じて、サンプル中の多くの低分子化合物は、同時に、定性的、半定量的、または定量的に検出され得る。本発明の化合物の分子量は、１〜１０，０００ダルトンであり得る。
【００２３】
開示を明らかにするため（限定の目的でなく）、発明の詳細な説明は、以下に続く小節に分けられる。
【００２４】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において引用される全ての特許、出願、出願公開および他の刊行物は、その全体が参考として援用される。この節に示される定義が、本明細書において参考として援用される特許、出願、出願公開および他の刊行物に示される定義に反するか、または他の点で一致しない場合、この節に示される定義が、本明細書において参考として援用される定義に優先する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」とは、本発明の方法、キット、およびチップによってアッセイされ得る標的低分子化合物を含み得る任意のものをいう。サンプルは、生物学的サンプル（例えば、生物学的流体または生物学的組織）であり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織としては、細胞（通常、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルス構造の構造物質の１つを形成するそれらの細胞内物質と一緒になった特定の種類の細胞）の凝集体（結合組織、上皮組織、筋組織、および神経組織を含む）が挙げられる。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈、個々の細胞が挙げられる。生物学的組織は、細胞懸濁物サンプルを得るために処理され得る。サンプルはまた、インビトロで調製される細胞の混合物であり得る。サンプルはまた、培養された細胞懸濁物であり得る。生物学的サンプルの場合、サンプルは、もとのサンプルの種々の処理または調製後に得られる粗製サンプルまたは処理されたサンプルであり得る。例えば、種々の細胞分離法（例えば、磁気活性細胞分類法（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ））が適用されて、血液のような体液サンプルから標的細胞を分離または濃縮し得る。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「チップ」、「バイオチップ」、または「マイクロアレイチップ」とは、複数の、１次元、二次元、または３次元の、微小構造または微小規模の構造（その上に、特定の処理（例えば、物理的プロセス、化学的プロセス、生物学的プロセス、生物物理学的プロセス、または生化学的プロセスなど）が行われ得る）を備える固体基材をいう。上記微小構造または微小規模の構造（例えば、チャネルおよびウェル）は、チップ上における物理的反応もしくはプロセス、生物物理学的反応もしくはプロセス、生物学的反応もしくはプロセス、生化学的反応もしくはプロセス、化学的反応もしくはプロセスを促進する為に、上記基材に組み込まれ得るか、上記基材上に作製され得るか、または別の方法で上記基材に取り付けられ得る。チップは、１次元においては薄くあり得、そして他の次元では種々の形状（例えば、長方形、円形、楕円形、または不規則な形状）を有し得る。チップの、その上でプロセスが行われ得る主要な表面のサイズは、かなり多様であり得る（例えば、約１ｍｍ２〜約０．２５ｍ２）。好ましくは、チップのサイズは、約４ｍｍ２〜約２５ｃｍ２であり、約１ｍｍ〜約５ｃｍの特性寸法を有する。チップ表面は、平面であっても平面でなくとも良い。非平面表面を有するチップは、その表面上に作製されたチャネルもしくはウェルを備え得る。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「抗体」（交換可能に複数形で使用される）は、標的（例えば、低分子化合物、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である（この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して結合し得る）。本明細書において使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および、特異性に必要な抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構成もまた包含する。抗体は、任意のクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（もしくはそれらのサブクラス））を包含し、そして抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。
【００２９】
（低分子化合物を検出するためのバイオチップ）
本発明は、固相支持体およびキャリアと低分子化合物との結合体を備える、低分子化合物を検出するためのバイオチップを提供する。ここで、この結合体は、固相支持体の表面上に固定される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、バイオチップは、固相支持体および１つのタイプの結合体を備える。いくつかの実施形態では、バイオチップは、固相支持体および複数の異なる結合体を備える。
【００３１】
本発明はまた、低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法を提供する。この方法は：
ａ）検出されるべき低分子化合物をキャリアと連結し結合体を形成する工程；
ｂ）この結合体を固相支持体の化学修飾された表面上にスポットする工程；および
ｃ）このスポットされた固相支持体を乾燥させる工程
を包含する。
【００３２】
キャリアと結合体化され得、そして結合分子と特異的に結合する任意の低分子化合物は、本発明の方法およびバイオチップを用いて検出され得る。本発明の低分子化合物は、約１〜約１０，０００ダルトン、約１００〜約５，０００ダルトン、約２００〜約２，０００ダルトンの範囲の分子量を有し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、低分子化合物は、獣医学用薬物である。例示的な獣医学用薬物としては、エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキシアゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、クロピドールが挙げられるが、これらに限定されない。これら獣医学薬物のうちの任意の１つ以上は、キャリアと結合体化され得、そしてこの結合体の任意の組み合わせが、バイオチップの固相支持体上に固定され得る。
【００３４】
本明細書中に記載されるバイオチップを用いて検出され得るその他の低分子化合物としては、興奮薬、麻酔薬、同化薬、およびペプチドホルモンが挙げられる。いくつかの実施形態では、低分子化合物は、禁止物質である。例示的な禁止物質としては、アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシン、アミネプチン、アミフェナゾール、ブロマンタン、カフェイン、カルフェドン、コカイン、エフェドリン、フェンカンファミン、メソカルブ、ペンチルエンテトラゾール、ピプラドール、サルブタモール、サルメテロール、テルブタリン、デキストロモラミド、ジアモルフィン（ヘロイン）、メタドン、モルヒネ、ペンタゾシン、ペチジン、ロステネジオン、クロステボール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、フルオキシメステロン、メタンジエノン、ナンドロロン、オキサンドロロン、スタノゾロール、テストステロンエクテンブテロット（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｃｔｅｎｂｕｔｅｒｏｔ）、フェノテロール、サルブタモール、サルメテロール、およびテルブタリンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの禁止物質うちの任意の１つ以上は、キャリアと結合体化され得、そしてこの結合体の任意の組み合わせが、バイオチップの固相支持体上に固定され得る。
【００３５】
低分子化合物は、バイオチップ上で固定される前に、キャリアと結合体化される。低分子化合物は、当該分野で公知の任意の方法でキャリアと結合され得るかまたは連結され得る。いくつかの実施形態では、低分子化合物は、１つ以上の架橋剤を用いて、低分子化合物およびキャリア上の官能基を介してキャリアと架橋され得る。低分子および／またはキャリア上の官能基は、特定の架橋剤と反応するために改変され得る。使用され得る架橋剤としては、ジシクロヘキシルカルボジ−イミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド（ＮＨＳ）、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ホモ二官能性イミドエステル、ジスクシニミジルエステル、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシニミジル））、および二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の方法がまた、使用され得る。いくつかの実施形態では、低分子化合物およびキャリアは、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用を介して連結される。例えば、低分子化合物は、ビオチン化され得、そしてキャリアタンパク質は、ストレプトアビジン分子と連結される。当該分野で公知のその他の方法が、低分子化合物とキャリアとを結合体化させるために使用され得る。
【００３６】
低分子化合物は、バイオチップ上で固定される前に、キャリアと結合体化される。キャリアは、低分子化合物を固相支持体上に固定し、そしてこの低分子化合物を結合分子に対して提示するのに有用である任意の分子であり得る。例示的なキャリアとしては、タンパク質、ポリペプチド、ポリマー、核酸が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、血清アルブミン（ＳＡ）（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）、アミノ酸ポリマー、免疫グロブリンが、キャリアとして使用され得る。
【００３７】
結合体は、当該分野で公知の任意の方法を用いてバイオチップの表面上に固定され得る。バイオチップの表面は、例えば、アルデヒド基で修飾されたスライドガラスのように、化学修飾され得る。実施例３は、アルデヒド活性化スライドガラス上に結合体を固定する方法を記載する。結合体は、当該分野で公知の任意の技術（例えば、自動化スポット装置）を用いて表面上にスポットされ得る。スポットした後、バイオチップは、結合体をバイオチップの表面上に固定させるために乾燥され得る。
【００３８】
バイオチップはまた、結合体と同じ表面上に固定された１つ以上のコントロールを有し得る。例示的なコントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールである。
【００３９】
低分子化合物とキャリアとの１つ以上の結合体は、バイオチップ上に固定され、２次元アレイ（例えば、９×９アレイ、１２×１２アレイ、および１５×１５アレイ）を形成し得る。１つ以上のアレイは、バイオチップ上に配置され得、そして１つ以上のサンプルが、１枚のバイオチップを用いて試験され得る。
【００４０】
試験に使用されるサンプル容量は、約１ｍｌ未満、約０．５ｍｌ未満、約０．２５ｍｌ、約０．ｌｍｌ未満、約０．０５ｍｌ未満、および約０．０１ｍｌ未満のうちの何れかであり得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、バイオチップの固相支持体は、セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される表面を含む。
【００４２】
（低分子化合物を検出するための方法）
本発明は、競合イムノアッセイを使用する。本発明は、サンプル中の低分子化合物を検出するための方法を提供する。この方法は：
ａ）本明細書中で記載されたバイオチップをサンプルおよび低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、この結合分子が、低分子化合物に特異的に結合する条件下で、インキュベートする、工程；
ｂ）バイオチップの表面上に固定された結合体中で、低分子化合物との結合分子の結合を検出する工程であって、ここでサンプル中の低分子化合物の存在または非存在または量が、検出される、工程
を包含する。
【００４３】
バイオチップはまず、非特異的結合をブロッキングする（例えば、バイオチップ上のスポットされなかった領域をブロッキングする）ためのブロッキング溶液中でインキュベートされ得る。イムノアッセイに使用される任意のブロッキング溶液が、使用され得る。例えば、血清またはＢＳＡ含有のｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が使用され得る。ブロッキングした後、バイオチップは、次の工程の前に、洗浄され得る。
【００４４】
バイオチップは、試験されるべきサンプルと結合分子との混合物とともにインキュベートされ得る。バイオチップはまた、まずサンプルとともにインキュベートされ、そしてその後、結合分子とともにインキュベートされ得るか、または、まず結合分子とともにインキュベートされ、そしてその後、サンプルとともにインキュベートされ得る。
【００４５】
低分子化合物と特異的に結合する任意の結合分子には、例えば、抗体、ポリペプチド、およびポリマーが使用され得る。本明細書に使用されるように、エピトープまたは低分子化合物と特異的に結合する結合分子とは、当該分野において十分に理解された用語であり、このような特異的結合を決定するための方法もまた、当該分野において周知である。分子は、その分子が、代替物質の場合と比べて、より頻繁に、より迅速に、より長い持続期間および／またはより高い親和性で特定の物質と反応するかまたは結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する場合、「特異的結合」を示すといわれる。異なる分子が同じかまたは類似するエピトープを有し得るので、結合分子は、１つより多くの化合物と交差反応し得る。本明細書中で使用される特異的結合としては、エピトープまたは構造的に関連する化合物との特異的結合が挙げられる。１つより多くの構造的に関連する低分子と交差反応する結合分子は、これらの低分子を検出するために使用され得、そしてこのような結合分子のバイオチップとの結合は、結合分子と交差反応するこれらの低分子のうちの何れかの存在および／または量を示し得る。
インキュベーションの後、バイオチップは、結合の検出の前に、洗浄され得る。
バイオチップ上に固定された結合体における結合分子と低分子との結合は、当該分野で公知の任意の方法を用いて検出され得る。いくつかの実施形態では、結合分子（例えば、抗体およびポリマー）は、標識（例えば、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性同位体標識、および発光標識）に連結される。結合分子とバイオチップとの結合は、バイオチップ上の標識の存在または非存在、および／または量を検出することによって検出される。標識を検出するための当該分野で公知の任意の標識および方法が、使用され得る。これは、競合イムノアッセイの設計であるので、シグナルの欠如またはそのより低いレベルは、試験されたサンプル中の低分子化合物の存在およびより多くのその量を示す。
【００４６】
結合分子とバイオチップとの結合はまた、標識と連結される二次結合分子を用いて検出され得る。当該分野で公知かつ本明細書中で記載される任意の標識が、使用され得る。結合分子およびサンプルとともにインキュベートした後、バイオチップはさらに、結合分子に特異的に結合する二次結合分子とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、結合分子は、抗体である。
（低分子化合物を検出するためのキット）
本発明はまた、サンプル中で低分子化合物を検出するためのキットを提供する。このキットは、１つ以上の本明細書中で記載されるバイオチップ、および低分子化合物に特異的に結合する１つ以上の結合分子を備える。このキットは、１つ以上の容器を備え得、そしてさらに、本明細書中で記載される方法のうちのいずれかに従う使用についての使用説明書を備え得る。
【００４７】
キット中に提供される使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）は、代表的には、ラベル上または添付文書（例えば、キットに含まれるペーパーシート）に書かれた指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）であるが、機械が読み取り可能な命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（例えば、磁気ディスクまたは光記憶ディスク上の実行される命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ））もまた、容認可能である。ラベルまたは添付文書は、バイオチップおよび結合分子が、低分子化合物（例えば、獣医学用薬物、または禁止物質）を検出するために使用されることを示す。
【００４８】
本発明のキットは、適切なパッケージ中にある。適切なパッケージとしては、バイアル、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、瓶（ｊａｒ）、可撓性パッケージ（例えば、シールされたマイラー袋またはプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、必要に応じて、さらなるコンポーネント（例えば、ブロッキング溶液および洗浄溶液、コントロールサンプル、緩衝液ならびに解釈用の情報検出）
【実施例】
【００４９】
（実施例１：残存獣医学用薬物の検出のためのバイオチップの調製）
バイオチップを、以下に記載されるように４工程で調製した。
【００５０】
（工程１）
スポット溶液を、ＢＳＡ連結エンロフロキサシリン、ＯＶＡ連結スルファジミジン、ＯＶＡ連結ストレプトマイシン、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールの各々を、１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でスポット緩衝液（４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ）中に溶解することによって、調製した。次いで各スポット溶液を、バイオチップ上にスポットするための３８４穴プレートへと移した。
【００５１】
３つの獣医学用薬物を、以下に記載されるようにキャリアタンパク質と結合体化した。
エンロフロキサシンとＢＳＡとの結合体化：１）１２００ｍｇの塩酸エンロフロキサシンを、１．０ｍｌの純水に加えた。この溶液のｐＨを２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨ６．０に調節した。この溶液を、４℃で３０分間、インキュベートした。次いで、ジシクロヘキシルカルボジ−イミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシニミド（ＮＨＳ）の溶液（両者ともにＳｉｇｍａから）を加え、そして３０分間、反応させた。２）１．０ｇのＢＳＡを、０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、混合した。次いで、このＢＳＡ溶液を、工程１）で調製した溶液にゆっくりと加え、そしてこの混合溶液を、４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製したＢＳＡとエンロフロキサシンとの溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間、透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。透析した結合体溶液を、−２０℃で保存した。
【００５２】
スルファジミジンとオボアルブミン（ＯＶＡ）との結合体化：１）５００ｍｇのスルファジミジンを、５００μｌのＤＭＦに加えた。次いで、５０％のグルタルアルデヒド溶液を、活性化のために加え、そして溶液を４℃で５０分間、インキュベートした。Ｎａ２ＣＯ３（０．２Ｍ）溶液を加えて、ｐＨを８〜９の範囲に調節し、そしてもう１時間、反応させた。２）１．０ｇのＯＶＡを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、０．２ｍｏｌ／Ｌまで溶解し、次いで、ＯＶＡ溶液を、工程１）で調製した溶液に加え、次いで、４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製した溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間、透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。透析した結合体溶液を、−２０℃で保存した。
【００５３】
ストレプトマイシンとＯＶＡとの結合体化：１）５００ｍｇの硫酸ストレプトマイシンを、０．５ｍｌの純水に加えた。次いで、２．０ｇのカルボキシメチルヒドロキシルアミンを、ストレプトマイシン溶液に加え、そしてこの溶液を室温で３時間インキュベートした。 Ｎａ２ＳＯ４溶液（１Ｍ）を上記溶液に加え、そしてさらに１時間、反応させた。溶液のｐＨを確認した後（これは、ｐＨ７．５であった）、６００ｍｇのＤＣＣをこの溶液に加え、そして４℃で２時間インキュベートした。２）１．０ｇのＯＶＡを０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に加えた。次いで、ＯＶＡ溶液を、工程１）で調製した溶液中に加え、そしてこの混合溶液を４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製した結合体を含有する溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。この結合体溶液を、−２０℃で保存した。
（工程２）
上記スポット溶液を、自動化スポット装置によって、化学修飾されたガラスチップ上になんらかの順番で分配した。各チップは、１０個のアレイ（５列×２行）を含み、そして各アレイは、３６個のサンプルスポット（６列×６行）を含んだ。この場合、２つのスポット間の間隔は、４００μｍであった。各アレイは、隔離された反応チャンバーであった。
（工程３）
スポットした後、チップを真空装置を用いて乾燥した。
【００５４】
（工程４）
乾燥した後すぐに、チップを真空包装してそして４℃で保存した。
【００５５】
上記のように調製されるチップは、定性分析、半定性分析および定量分析において、エンロフロキサシン、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）、およびストレプトマイシンを検出するために使用され得る。
【００５６】
（実施例２：バイオチップによる残存獣医学用薬物の検出）
残存エンフロキサシン、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）、またはストレプトマイシンを含有するサンプルを、以下に記載するように試験した。
１．ブロッキング：実施例１に記載されるように調製しバイオチップを、１０％のヤギ血清で３７℃にて３０分間、ブロッキングした。
２．浄化および乾燥：次いで、バイオチップを、ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で洗浄カセット内にて５分間、攪拌しながら洗浄し、次いでチップを乾燥させるために、１０００ｒｐｍで１分間、遠心した。
【００５７】
３．一次抗体反応：試験されるべきサンプルを、エンロフロキサシンに特異的に結合する抗体、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）に特異的に結合する抗体、およびストレプトマイシンに特異的に結合する抗体（抗ストレプトマイシン抗体は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．から入手した）と、各抗体が１ｍｇ／ｍｌ濃度の状態で、混合した。２０μｌのサンプルと抗体との混合物を、反応液に加え、そして３７℃で３０分間、反応させた。
【００５８】
４．２次抗体反応：チップを、工程２に記載されるように洗浄しそして乾燥した。次いで、蛍光標識された２０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧを、１μｇ／ｍｌの濃度にて反応チャンバーに加えた。このチップを、３７℃で３０分間、インキュベートした。
【００５９】
５．チップスキャンおよびデータ分析：次いで、チップを、工程２に記載されるように洗浄しそして乾燥した。次いで、このチップをスキャンし、そしてそのデータを分析した。結果は、図１〜４に示される。競合イムノアッセイを使用したので、より低いシグナルスポットは、試験されたサンプル中に存在する残存獣医学用薬物のより高いレベルを示す。
【００６０】
本発明の低分子化合物を検出するための検出システムの感度は、技術的目標および中国政府に許可された最大残存レベル（ＭＲＬ）を満たす。感度および直線範囲を、以下の表１中のＭＲＬと比較した。
【００６１】
【表１】
本明細書中に記載されるシステムの感度がＭＲＬよりもずっと高いので、このシステムを用いる場合、試験されるべきサンプルが希釈され得る。
【００６２】
図１〜４の残存獣医学用薬物の濃度は、以下の表２に示される。
【００６３】
【表２】
（実施例３．バイオチップによる禁止物資の検出）
（サンプル収集）
尿サンプルを、収集してそして−２０℃で保存した。ポジティブコントロール尿サンプルおよびネガティブコントロール尿サンプルもまた、収集した。サンプル収集の詳細は、Ｄｕら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３６８−３７５（２００５）に記載される。
【００６４】
（チップ基材の調製）
アルデヒド基で化学修飾されたスライドガラスを、所定の位置にてＢＳＡ結合体化分子と共有結合する基材として使用した。このスライドを、１００ｇ／Ｌのクロム酸で６時間浄化し、その後、脱イオン水でリンスした。次いで、スライドを２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液中に浸漬し、そして４ｍｏｌ／Ｌの塩酸中に各３０分間浸漬して、その後、脱イオン水でリンスし、次いで、窒素流のもとで乾燥させた。浄化したスライドを、エタノール中の３−グリシドキシプロピトリメトキシレン（ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（４０ｍＬ／Ｌ）を用いて８時間、シラン処理した。ガラス表面を、トルエン、アセトン、および脱イオン水で洗浄し、この後で、このスライドを、４ｍｏｌ／Ｌの塩酸中に再度３０分間浸漬し、そして５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＩＯ４中に１時間浸し、調製プロセスを完了した。アルデヒド活性化スライドの接触角を、品質を制御する目的のための接触角システム（Ｍｏｄｅｌ ＯＣＡ；ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ）の使用によって測定した。スライドを乾燥箱内で室温にて最大３ヶ月間保存した。
【００６５】
（チップのプリント）
ＢＳＡ結合体化薬物１０個の９×９アレイを、各スライド上にプリントした。ペプチドホルモンの場合、このペプチドを直接プリントした。各スライドにおいて、１サンプルは、種々の分析物のために１個の９×９アレイ上で試験され得、そして１０サンプルまでが、１枚のチップ上で並行して分析され得る。ステルスマイクロスポットピン（Ｍｏｄｅｌ ＳＭＰ３；ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を備える接触プリントロボット（ＰｉｘＳｙｓ ５５００；Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、アルデヒド活性化スライド上でチップをプリントするために使用した。各々のプリントされたタンパク質（薬物−ＢＳＡ）の濃度は、４００ｍＬ／Ｌのグリセロールまたはタンパク質プリント緩衝液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中で５００ｍｇ／Ｌであった。薬物−ＢＳＡ結合体を、加湿チャンバー内で６時間、チップ上で反応させた。次いでこのスライドを、１ヶ月までの期間、室温で保存した。
【００６６】
（イムノアッセイ手順）
競合イムノアッセイ設計を、チップ上の１６種のＷＡＤＡ禁止物質を試験するために使用した。成形ポリエステルフレームを、基材に取り付け、チップ表面上の１０個のアレイに仕切った（図５Ａ）。このチップは、１６個の異なる薬物−ＢＳＡ結合体および１１個のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールから構成され、９×９のアレイを形成した。各材料を、３連でプリントした（図５Ｂおよび図５Ｃ）。チップを、ブロッキング溶液（ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１対１０の希釈ヒツジ血清）中に３０分間室温で浸し、そして次いで、ｐＨ７．４の０．５ｍＬ／ＬのＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ Ａ）で３回リンスした。次いで、抗薬物マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．およびＡｖｉｖａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られた）および薬物を含有する尿サンプルの混合物を、チップの表面を覆うポリエステルフレームによって形成されたグリッド状の反応チャンバーに適用した。次いで、このチップを加湿チャンバー内で３０分間３７℃に維持した。次いで、このチップをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ Ａで３回リンスし、そして２次抗体（Ｃｙ３標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ）をチップに適用しそして３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、このチップを再度洗浄し、そしてレーザー共焦点スキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または電荷結合素子ベースのスキャナー（ＥｃｏＳｃａｎ−１００；ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の使用によって、Ｃｙ３標識化２次抗体の結合の存在についてスキャンした。アナログの蛍光シグナルを、データ分析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．０；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってデジタルシグナルへと変換した。チップから得られた結果を、後に、中国ドーピング制御センター（ＣＤＣＣ）にあるガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によって得られた結果と比較した。
【００６７】
（チップ上で検出された禁止物質）
アンフェタミンについてネガティブなサンプルを用いて得られたチップの画像の一例が、図６に示される。アンフェタミン−ＢＳＡ結合体を、アルデヒド活性化チップ上に３連で配列した（図６の囲んだ領域）。予想されるように、各薬物についての３つの試験スポットは、その薬物についてネガティブなサンプル中の抗薬物抗体に結合し、そして次いで、蛍光シグナルを発するＣｙ３標識化二次抗体に結合した。いずれの場合にも、マウスＩｇＧコントロールスポットの全て（上の列および下の列の９つのスポット、ならびに２つの中央グループの３つのスポット）は、このアッセイにおいて使用されたヤギ抗マウス結合体と固定されたマウスＩｇＧコントロールとの反応から予測されるように、ポジティブであった。
【００６８】
（チップ上の蛍光シグナルに対する異なるマトリックスの影響）
種々のサンプルおよび溶液（例えば、尿、水、またはＰＢＳ）の蛍光シグナルに対する潜在的影響を、評価した。種々の溶液は、特定の試験された物質についてのシグナルに対して劇的に影響し得ることが見出された。溶液がＰＢＳから尿に変更されたときのステロイドについての有意なシグナルの減少に注目した。これは、対応する抗体といくつかの内因性ステロイド干渉物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）との結合に起因し得る。大抵の外因性薬物は、ＰＢＳ対ブランク尿の匹敵する比率（通常は、１．５０未満）を有した。しかし、特定の分析物（例えば、アンフェタミン）は、例外的に高い約２．５０の比率を生じた。このアッセイを９６ウェルプレート上で繰り返し、そしてアンフェタミンを含有する全ての外因性分析物は、１．１３〜１．１８の低いＰＢＳ対ブランク尿の比率を有した。これは、ヒトの尿中の非ドーピング物質が、アンフェタミンとその抗体との相互作用を干渉したかもしれないことを示唆する。
（限界値およびカットオフ値の検出）
原則として、対応する位置の蛍光シグナルは、試験物質がサンプル中に存在する場合、減少する。直線的に測定の範囲内で、蛍光シグナルにおける減少は、サンプル中の薬物に比例した。従って、この方法は、サンプル中の基質の存在の定性判定および定量判定の両方に使用され得る。バイオチップの使用によって測定されたアンフェタミンについての較正曲線は、図７に示される。その他の９個の禁止物質についての較正曲線は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｃｈｅｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｖｏｌ５１／ｉｓｓｕｅ２にて利用可能である。検出限界は、分析物がチップによって検出され得る最も低い濃度として規定される。この濃度は、ネガティブコントロールの平均より３ＳＤ低く、そしてモルヒネについては０．２μｇ／Ｌの範囲に及び、メタドンについては１９μｇ／Ｌまでの範囲に及ぶ、シグナルと対応する。１０個の薬物についての検出限界およびカットオフ値（５０％の阻害濃度）が、以下の表３に要約される。
【００６９】
【表３】
（アッセイ精度）
精度研究において、中国ドーピング制御センター（ＣＤＣＣ）のドーピング制御分析によって確認された２００のブランク尿を含む、標準サンプルは、異なるバッチのチップを使用して、５人の技術者によって繰り返し分析された（ｎ＝３００）。全ての分析についてのバッチ間のＣＶは、１６％であり、そしてバッチ内のＣＶは、１３％であった。各薬物について、Ｄｕら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３６８〜３７５（２００５）の表４を参照のこと。
【００７０】
（定性分析）
代表的なスクリーニング手順において、１４１人の中国人の体操選手から収集した尿を、定性分析のために禁止物質について試験した。８つの検体の中で、５つの検体は、モルヒネに対してポジディブを示し、１つは、ジヒドロコデイン対してポジティブを示し、１つは、ペチジンに対してポジティブ、そして１つは、試験された物質に対してネガティブを示した。ジヒドロコデインおよびペチジンを含有するサンプルについての抗モルヒネ抗体との交差反応を、検出した。平均（ＳＤ）モルヒネシグナルは、０．４２９（０．１２）であり、そして臨界値（有意検定において使用され、これは、帰無仮説が棄却されるために上回らなければならない検定統計量である値である）は、０．２３２（Ｐ＜０．０５）であった。これは、１．７μｇ／Ｌのモルヒネと等価である。このサンプルは、測定されたシグナルが臨界値より下であった場合、モルヒネに対してポジティブである。全てのポジティブサンプルを、ＣＤＣＣにあるガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によって確認した。
【００７１】
（定量分析）
多数のサンプルについての定性的なスクリーニングツールとして役立つだけでなく、チップはまた、定量分析にも使用され得る。４人のメタンフェタミン薬物乱用者からのサンプルからの６回の反復試験を、チップおよびＧＳ−ＭＳ方法を用いて実施した。チップおよびＧＣ−ＭＳの結果についての相関係数（ｒ２）は、０．９９１であった。これは、尿中のメタンフェタミンを定量化するためのこれらの２つの方法によって得られた結果が匹敵することを示す。
【００７２】
上記の実施例は、例示目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。上記の多くの変更が可能である。上記の実施列に対する改変および変更は当業者にとって明らかであるので、本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ネガティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、残存スルファジミジン、残存ストレプトマイシンおよび残存エンロフロキサシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図２】図２は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、残存エンロフロキサシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存スルファジミジンおよび残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図３】図３は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、ここで、残存スルファジミジンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存エンロフロキサシンおよび残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図４】図４は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、ここで、残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存エンロフロキサシンおよび残存スルファジミジンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図５】図５は、アレイの代表的外観および配置を示す。Ａ：スライドガラスおよび各アレイ上の反応チャンバーを構成するポリエステルを示す模式図。Ｂ：アレイ上の薬物の配置（各薬物／物質は、３連でプリントされている）。Ｃ：９×９アレイの１つの画像。ＰＣＰ、フェンシクリジン；ＴＣＡ、三環系抗うつ薬；ｈＣＧ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；ＬＨ、黄体化ホルモン。
【図６】図６は、チップ上のアンフェタミンについての分析の結果を示す。灰色のボックスは、抗体の、その対応物への予測される結合を示す。
【図７】図７は、バイオチップによって測定されたアンフェタミンについての検量線を示すグラフである検量線は、薬物を含まない尿に添加された種々の濃度（０〜１０２４μｇ／Ｌ）の各物質を使用することによって作成された。ＦＬＵ、蛍光。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、化合物を検出する方法および化合物を検出するためのデバイスに関する。より詳細には、本発明は、低分子化合物を検出する方法および低分子化合物を検出するためのバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
バイオチップ技術は、９０年代半ば以降の科学および技術における最も重要な進歩の１つである。これは、生物学、電子工学、物理学、化学、およびコンピュータサイエンスにまたがる技術である。バイオチップ技術は、一般的に、以下の手順を包含する：第一に、バイオチップは、生物学的分子（例えば、核酸フラグメント、ペプチド、時には細胞および組織でさえも）を、固相支持体（例えば、スライドガラス、シリカスライド、ヒドロゲルおよび膜）上に、ある順序で固定することによって作製され；作製されたバイオチップは、サンプル中の標的分子と反応させられ；最後に、このバイオチップのシグナル強度が、スキャナのような特別な装置を介して効率的に分析され、サンプル中の標的分子の濃度を分析する。固定された分子の差異に基づいて、バイオチップは、以下に分類され得る：遺伝子マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ、および組織マイクロアレイ。近年開発されたラボ−オン−チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）もまた、バイオチップ技術の重要な部門である。
【０００３】
低分子検出のために現在使用される２つの主な方法は、物理的分析および免疫学的分析である。物理的分析としては、主にスペクトル法、クロマトグラフィー、およびこれらの方法の組み合わせが挙げられる。クロマトグラフィー検出は、最も使用されている（例えば、ＨＰＬＣ、ＧＣおよびＴＬＣ）。免疫学的方法としては、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡが挙げられ、中でも特にＥＬＩＳＡが最も使用されている。
【０００４】
クロマトグラフィー分離系は、分離される成分、液相および固定相を主に含む。分離の原理は、２つの相における各成分の分配係数の差異に基づく。２つの相がお互いに対して動く場合、上記成分は、流体相の動きに従って２つの相の間で繰り返し分布することによって分離される。クロマトグラフィー分離は、高効率性、良好な選択性、ならびに正確な定性分析および定量分析という利点を有する。しかしクロマトグラフィー分離は、複雑なサンプル分離、高価な装置、および長時間の検出期間のようないくつかの欠点もまた有する。
【０００５】
低分子の免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、免疫学、分析化学、および合成化学の組み合わせ技術の一種である。低分子の検出のためにＥＬＩＳＡを使用する２つの方法が存在する。１つの方法は、抗体を固定して、酵素連結低分子によって検出が完了する方法である。他の方法は、キャリア連結低分子を固定して、酵素連結抗体によって検出が完了する方法である。ＥＬＩＳＡは、高感受性、低検出コスト、および短時間の検出期間という利点を有する。しかし、その欠点は、単一標的検出であることである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、低分子化合物を検出するための方法およびバイオチップを提供する。
【０００７】
本発明は、低分子化合物を検出するためのバイオチップを提供し、このバイオチップは、固相支持体およびキャリアと低分子化合物との結合体を備える。ここで、上記結合体は、上記固相支持体の表面に固定されている。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、１〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、以下からなる群より選択される獣医学用薬物である：エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキサゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｙｌｉｎｅ）、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、およびクロピドール。いくつかの実施形態において、上記低分子化合物は、以下からなる群より選択される禁止物質である：アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシン。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記キャリアは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ｏｖａｂｕｍｉｎ）（ＯＶＡ）からなる群より選択されるルタンパク質である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、複数の結合体が固相支持体に固定されて、２次元アレイを形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、固相支持体の表面に固定された１つ以上のコントロールをさらに備え、このコントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、固相支持体の表面に固定された、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロール備える。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記固相支持体は、セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される。
【００１３】
本発明はまた、低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）検出されるべき低分子化合物をキャリアに連結させて、結合体を形成する工程；ｂ）この結合体を、固相支持体の化学的に修飾された表面にスポットする工程；およびｃ）スポットされた固相支持体を乾燥させる工程。
【００１４】
本発明はまた、サンプル中の低分子化合物を検出するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）本明細書において記載されるバイオチップを、サンプル、および上記低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、この結合分子の上記低分子化合物への特異的結合に適切な条件下で、インキュベートする工程；ｂ）上記バイオチップの表面に固定された結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合を検出する工程であって、それによって該サンプル中の上記低分子化合物の存在または非存在または量が検出される、工程。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）の前にブロッキング溶液中でインキュベートされる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、上記サンプルと上記結合分子との混合物とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、最初に上記サンプルとともにインキュベートされ、次いで上記結合分子とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記バイオチップは、工程ａ）において、最初に上記結合分子とともにインキュベートされ、次いで上記サンプルとともにインキュベートされる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合と、上記バイオチップの表面に固定されたコントロールへの上記結合分子の結合とを比較する工程をさらに包含する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記結合分子は、抗体またはポリマーである。いくつかの実施形態において、上記結合分子は、標識に連結され、そして上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合が、上記バイオチップにおける上記標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される。前記標識は、以下：蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性標識、および発光標識からなる群より選択され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記バイオチップを上記結合分子に特異的に結合する二次抗体とともにインキュベートする工程をさらに包含し、そして上記バイオチップの表面に固定された上記結合体における上記低分子化合物への上記結合分子の結合が、上記二次抗体の結合を検出することによって検出される。いくつかの実施形態において、上記二次抗体は標識に連結され、そして上記二次抗体の上記結合分子への結合が、上記バイオチップにおける上記標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、残存獣医学用薬物を検出するため、または禁止物質の乱用を検出するために使用される。
【００２１】
本発明はまた、本明細書において記載される検出方法のいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、このキットは、本明細書において記載されるバイオチップおよび上記低分子化合物に特異的に結合する結合分子を備える。このキットは、本明細書において記載される低分子化合物の検出の用途のための使用説明書をさらに備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、バイオチップを使用して低分子化合物を検出するための方法を提供する。本発明は、バイオチップ技術および免疫学的分析の両方の利点を有する。例えば、複数サンプル検出が、１つのバイオチップ上で同時に行われ得る。バイオチップ技術によって、１サイクルのみの検出で多くの標的が同時に分析され得る。この結果は、より信頼できる。検出サイクルの全ての工程はまた、バイオチップにおけるコントロールによって効率的に制御されて、結果の信頼性を強化し得る。少量の分子が必要とされる。約１０μＬのサンプルは、１検出サイクルに十分であり得る。したがって、本発明は、バイオチップ技術に起因するハイスループットおよび大量の情報、ならびに免疫学的分析に起因する単純な操作、迅速な検出、高感度および低コストのような、多くの利点を提供する。本発明のバイオチップおよび方法を通じて、サンプル中の多くの低分子化合物は、同時に、定性的、半定量的、または定量的に検出され得る。本発明の化合物の分子量は、１〜１０，０００ダルトンであり得る。
【００２３】
開示を明らかにするため（限定の目的でなく）、発明の詳細な説明は、以下に続く小節に分けられる。
【００２４】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において引用される全ての特許、出願、出願公開および他の刊行物は、その全体が参考として援用される。この節に示される定義が、本明細書において参考として援用される特許、出願、出願公開および他の刊行物に示される定義に反するか、または他の点で一致しない場合、この節に示される定義が、本明細書において参考として援用される定義に優先する。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」とは、本発明の方法、キット、およびチップによってアッセイされ得る標的低分子化合物を含み得る任意のものをいう。サンプルは、生物学的サンプル（例えば、生物学的流体または生物学的組織）であり得る。生物学的流体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生物学的組織としては、細胞（通常、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルス構造の構造物質の１つを形成するそれらの細胞内物質と一緒になった特定の種類の細胞）の凝集体（結合組織、上皮組織、筋組織、および神経組織を含む）が挙げられる。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈、個々の細胞が挙げられる。生物学的組織は、細胞懸濁物サンプルを得るために処理され得る。サンプルはまた、インビトロで調製される細胞の混合物であり得る。サンプルはまた、培養された細胞懸濁物であり得る。生物学的サンプルの場合、サンプルは、もとのサンプルの種々の処理または調製後に得られる粗製サンプルまたは処理されたサンプルであり得る。例えば、種々の細胞分離法（例えば、磁気活性細胞分類法（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ））が適用されて、血液のような体液サンプルから標的細胞を分離または濃縮し得る。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「チップ」、「バイオチップ」、または「マイクロアレイチップ」とは、複数の、１次元、二次元、または３次元の、微小構造または微小規模の構造（その上に、特定の処理（例えば、物理的プロセス、化学的プロセス、生物学的プロセス、生物物理学的プロセス、または生化学的プロセスなど）が行われ得る）を備える固体基材をいう。上記微小構造または微小規模の構造（例えば、チャネルおよびウェル）は、チップ上における物理的反応もしくはプロセス、生物物理学的反応もしくはプロセス、生物学的反応もしくはプロセス、生化学的反応もしくはプロセス、化学的反応もしくはプロセスを促進する為に、上記基材に組み込まれ得るか、上記基材上に作製され得るか、または別の方法で上記基材に取り付けられ得る。チップは、１次元においては薄くあり得、そして他の次元では種々の形状（例えば、長方形、円形、楕円形、または不規則な形状）を有し得る。チップの、その上でプロセスが行われ得る主要な表面のサイズは、かなり多様であり得る（例えば、約１ｍｍ２〜約０．２５ｍ２）。好ましくは、チップのサイズは、約４ｍｍ２〜約２５ｃｍ２であり、約１ｍｍ〜約５ｃｍの特性寸法を有する。チップ表面は、平面であっても平面でなくとも良い。非平面表面を有するチップは、その表面上に作製されたチャネルもしくはウェルを備え得る。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「抗体」（交換可能に複数形で使用される）は、標的（例えば、低分子化合物、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である（この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して結合し得る）。本明細書において使用される場合、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、それらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、および、特異性に必要な抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構成もまた包含する。抗体は、任意のクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（もしくはそれらのサブクラス））を包含し、そして抗体は、任意の特定のクラスである必要はない。
【００２９】
（低分子化合物を検出するためのバイオチップ）
本発明は、固相支持体およびキャリアと低分子化合物との結合体を備える、低分子化合物を検出するためのバイオチップを提供する。ここで、この結合体は、固相支持体の表面上に固定される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、バイオチップは、固相支持体および１つのタイプの結合体を備える。いくつかの実施形態では、バイオチップは、固相支持体および複数の異なる結合体を備える。
【００３１】
本発明はまた、低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法を提供する。この方法は：
ａ）検出されるべき低分子化合物をキャリアと連結し結合体を形成する工程；
ｂ）この結合体を固相支持体の化学修飾された表面上にスポットする工程；および
ｃ）このスポットされた固相支持体を乾燥させる工程
を包含する。
【００３２】
キャリアと結合体化され得、そして結合分子と特異的に結合する任意の低分子化合物は、本発明の方法およびバイオチップを用いて検出され得る。本発明の低分子化合物は、約１〜約１０，０００ダルトン、約１００〜約５，０００ダルトン、約２００〜約２，０００ダルトンの範囲の分子量を有し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、低分子化合物は、獣医学用薬物である。例示的な獣医学用薬物としては、エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキシアゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、クロピドールが挙げられるが、これらに限定されない。これら獣医学薬物のうちの任意の１つ以上は、キャリアと結合体化され得、そしてこの結合体の任意の組み合わせが、バイオチップの固相支持体上に固定され得る。
【００３４】
本明細書中に記載されるバイオチップを用いて検出され得るその他の低分子化合物としては、興奮薬、麻酔薬、同化薬、およびペプチドホルモンが挙げられる。いくつかの実施形態では、低分子化合物は、禁止物質である。例示的な禁止物質としては、アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシン、アミネプチン、アミフェナゾール、ブロマンタン、カフェイン、カルフェドン、コカイン、エフェドリン、フェンカンファミン、メソカルブ、ペンチルエンテトラゾール、ピプラドール、サルブタモール、サルメテロール、テルブタリン、デキストロモラミド、ジアモルフィン（ヘロイン）、メタドン、モルヒネ、ペンタゾシン、ペチジン、ロステネジオン、クロステボール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、フルオキシメステロン、メタンジエノン、ナンドロロン、オキサンドロロン、スタノゾロール、テストステロンエクテンブテロット（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｃｔｅｎｂｕｔｅｒｏｔ）、フェノテロール、サルブタモール、サルメテロール、およびテルブタリンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの禁止物質うちの任意の１つ以上は、キャリアと結合体化され得、そしてこの結合体の任意の組み合わせが、バイオチップの固相支持体上に固定され得る。
【００３５】
低分子化合物は、バイオチップ上で固定される前に、キャリアと結合体化される。低分子化合物は、当該分野で公知の任意の方法でキャリアと結合され得るかまたは連結され得る。いくつかの実施形態では、低分子化合物は、１つ以上の架橋剤を用いて、低分子化合物およびキャリア上の官能基を介してキャリアと架橋され得る。低分子および／またはキャリア上の官能基は、特定の架橋剤と反応するために改変され得る。使用され得る架橋剤としては、ジシクロヘキシルカルボジ−イミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド（ＮＨＳ）、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ホモ二官能性イミドエステル、ジスクシニミジルエステル、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシニミジル））、および二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の方法がまた、使用され得る。いくつかの実施形態では、低分子化合物およびキャリアは、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジン相互作用を介して連結される。例えば、低分子化合物は、ビオチン化され得、そしてキャリアタンパク質は、ストレプトアビジン分子と連結される。当該分野で公知のその他の方法が、低分子化合物とキャリアとを結合体化させるために使用され得る。
【００３６】
低分子化合物は、バイオチップ上で固定される前に、キャリアと結合体化される。キャリアは、低分子化合物を固相支持体上に固定し、そしてこの低分子化合物を結合分子に対して提示するのに有用である任意の分子であり得る。例示的なキャリアとしては、タンパク質、ポリペプチド、ポリマー、核酸が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、血清アルブミン（ＳＡ）（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）、アミノ酸ポリマー、免疫グロブリンが、キャリアとして使用され得る。
【００３７】
結合体は、当該分野で公知の任意の方法を用いてバイオチップの表面上に固定され得る。バイオチップの表面は、例えば、アルデヒド基で修飾されたスライドガラスのように、化学修飾され得る。実施例３は、アルデヒド活性化スライドガラス上に結合体を固定する方法を記載する。結合体は、当該分野で公知の任意の技術（例えば、自動化スポット装置）を用いて表面上にスポットされ得る。スポットした後、バイオチップは、結合体をバイオチップの表面上に固定させるために乾燥され得る。
【００３８】
バイオチップはまた、結合体と同じ表面上に固定された１つ以上のコントロールを有し得る。例示的なコントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールである。
【００３９】
低分子化合物とキャリアとの１つ以上の結合体は、バイオチップ上に固定され、２次元アレイ（例えば、９×９アレイ、１２×１２アレイ、および１５×１５アレイ）を形成し得る。１つ以上のアレイは、バイオチップ上に配置され得、そして１つ以上のサンプルが、１枚のバイオチップを用いて試験され得る。
【００４０】
試験に使用されるサンプル容量は、約１ｍｌ未満、約０．５ｍｌ未満、約０．２５ｍｌ、約０．ｌｍｌ未満、約０．０５ｍｌ未満、および約０．０１ｍｌ未満のうちの何れかであり得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、バイオチップの固相支持体は、セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される表面を含む。
【００４２】
（低分子化合物を検出するための方法）
本発明は、競合イムノアッセイを使用する。本発明は、サンプル中の低分子化合物を検出するための方法を提供する。この方法は：
ａ）本明細書中で記載されたバイオチップをサンプルおよび低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、この結合分子が、低分子化合物に特異的に結合する条件下で、インキュベートする、工程；
ｂ）バイオチップの表面上に固定された結合体中で、低分子化合物との結合分子の結合を検出する工程であって、ここでサンプル中の低分子化合物の存在または非存在または量が、検出される、工程
を包含する。
【００４３】
バイオチップはまず、非特異的結合をブロッキングする（例えば、バイオチップ上のスポットされなかった領域をブロッキングする）ためのブロッキング溶液中でインキュベートされ得る。イムノアッセイに使用される任意のブロッキング溶液が、使用され得る。例えば、血清またはＢＳＡ含有のｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が使用され得る。ブロッキングした後、バイオチップは、次の工程の前に、洗浄され得る。
【００４４】
バイオチップは、試験されるべきサンプルと結合分子との混合物とともにインキュベートされ得る。バイオチップはまた、まずサンプルとともにインキュベートされ、そしてその後、結合分子とともにインキュベートされ得るか、または、まず結合分子とともにインキュベートされ、そしてその後、サンプルとともにインキュベートされ得る。
【００４５】
低分子化合物と特異的に結合する任意の結合分子には、例えば、抗体、ポリペプチド、およびポリマーが使用され得る。本明細書に使用されるように、エピトープまたは低分子化合物と特異的に結合する結合分子とは、当該分野において十分に理解された用語であり、このような特異的結合を決定するための方法もまた、当該分野において周知である。分子は、その分子が、代替物質の場合と比べて、より頻繁に、より迅速に、より長い持続期間および／またはより高い親和性で特定の物質と反応するかまたは結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）する場合、「特異的結合」を示すといわれる。異なる分子が同じかまたは類似するエピトープを有し得るので、結合分子は、１つより多くの化合物と交差反応し得る。本明細書中で使用される特異的結合としては、エピトープまたは構造的に関連する化合物との特異的結合が挙げられる。１つより多くの構造的に関連する低分子と交差反応する結合分子は、これらの低分子を検出するために使用され得、そしてこのような結合分子のバイオチップとの結合は、結合分子と交差反応するこれらの低分子のうちの何れかの存在および／または量を示し得る。
インキュベーションの後、バイオチップは、結合の検出の前に、洗浄され得る。
バイオチップ上に固定された結合体における結合分子と低分子との結合は、当該分野で公知の任意の方法を用いて検出され得る。いくつかの実施形態では、結合分子（例えば、抗体およびポリマー）は、標識（例えば、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性同位体標識、および発光標識）に連結される。結合分子とバイオチップとの結合は、バイオチップ上の標識の存在または非存在、および／または量を検出することによって検出される。標識を検出するための当該分野で公知の任意の標識および方法が、使用され得る。これは、競合イムノアッセイの設計であるので、シグナルの欠如またはそのより低いレベルは、試験されたサンプル中の低分子化合物の存在およびより多くのその量を示す。
【００４６】
結合分子とバイオチップとの結合はまた、標識と連結される二次結合分子を用いて検出され得る。当該分野で公知かつ本明細書中で記載される任意の標識が、使用され得る。結合分子およびサンプルとともにインキュベートした後、バイオチップはさらに、結合分子に特異的に結合する二次結合分子とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、結合分子は、抗体である。
（低分子化合物を検出するためのキット）
本発明はまた、サンプル中で低分子化合物を検出するためのキットを提供する。このキットは、１つ以上の本明細書中で記載されるバイオチップ、および低分子化合物に特異的に結合する１つ以上の結合分子を備える。このキットは、１つ以上の容器を備え得、そしてさらに、本明細書中で記載される方法のうちのいずれかに従う使用についての使用説明書を備え得る。
【００４７】
キット中に提供される使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）は、代表的には、ラベル上または添付文書（例えば、キットに含まれるペーパーシート）に書かれた指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）であるが、機械が読み取り可能な命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（例えば、磁気ディスクまたは光記憶ディスク上の実行される命令（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ））もまた、容認可能である。ラベルまたは添付文書は、バイオチップおよび結合分子が、低分子化合物（例えば、獣医学用薬物、または禁止物質）を検出するために使用されることを示す。
【００４８】
本発明のキットは、適切なパッケージ中にある。適切なパッケージとしては、バイアル、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、瓶（ｊａｒ）、可撓性パッケージ（例えば、シールされたマイラー袋またはプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、必要に応じて、さらなるコンポーネント（例えば、ブロッキング溶液および洗浄溶液、コントロールサンプル、緩衝液ならびに解釈用の情報検出）
【実施例】
【００４９】
（実施例１：残存獣医学用薬物の検出のためのバイオチップの調製）
バイオチップを、以下に記載されるように４工程で調製した。
【００５０】
（工程１）
スポット溶液を、ＢＳＡ連結エンロフロキサシリン、ＯＶＡ連結スルファジミジン、ＯＶＡ連結ストレプトマイシン、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールの各々を、１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でスポット緩衝液（４０％グリセロール、６０％ＰＢＳ）中に溶解することによって、調製した。次いで各スポット溶液を、バイオチップ上にスポットするための３８４穴プレートへと移した。
【００５１】
３つの獣医学用薬物を、以下に記載されるようにキャリアタンパク質と結合体化した。
エンロフロキサシンとＢＳＡとの結合体化：１）１２００ｍｇの塩酸エンロフロキサシンを、１．０ｍｌの純水に加えた。この溶液のｐＨを２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨ６．０に調節した。この溶液を、４℃で３０分間、インキュベートした。次いで、ジシクロヘキシルカルボジ−イミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシニミド（ＮＨＳ）の溶液（両者ともにＳｉｇｍａから）を加え、そして３０分間、反応させた。２）１．０ｇのＢＳＡを、０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、混合した。次いで、このＢＳＡ溶液を、工程１）で調製した溶液にゆっくりと加え、そしてこの混合溶液を、４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製したＢＳＡとエンロフロキサシンとの溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間、透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。透析した結合体溶液を、−２０℃で保存した。
【００５２】
スルファジミジンとオボアルブミン（ＯＶＡ）との結合体化：１）５００ｍｇのスルファジミジンを、５００μｌのＤＭＦに加えた。次いで、５０％のグルタルアルデヒド溶液を、活性化のために加え、そして溶液を４℃で５０分間、インキュベートした。Ｎａ２ＣＯ３（０．２Ｍ）溶液を加えて、ｐＨを８〜９の範囲に調節し、そしてもう１時間、反応させた。２）１．０ｇのＯＶＡを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、０．２ｍｏｌ／Ｌまで溶解し、次いで、ＯＶＡ溶液を、工程１）で調製した溶液に加え、次いで、４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製した溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間、透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。透析した結合体溶液を、−２０℃で保存した。
【００５３】
ストレプトマイシンとＯＶＡとの結合体化：１）５００ｍｇの硫酸ストレプトマイシンを、０．５ｍｌの純水に加えた。次いで、２．０ｇのカルボキシメチルヒドロキシルアミンを、ストレプトマイシン溶液に加え、そしてこの溶液を室温で３時間インキュベートした。 Ｎａ２ＳＯ４溶液（１Ｍ）を上記溶液に加え、そしてさらに１時間、反応させた。溶液のｐＨを確認した後（これは、ｐＨ７．５であった）、６００ｍｇのＤＣＣをこの溶液に加え、そして４℃で２時間インキュベートした。２）１．０ｇのＯＶＡを０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に加えた。次いで、ＯＶＡ溶液を、工程１）で調製した溶液中に加え、そしてこの混合溶液を４℃で一晩インキュベートして、結合体を形成した。３）工程２）で調製した結合体を含有する溶液を、リン酸緩衝液に対して５日間透析した。リン酸緩衝液を、少なくとも１２回は交換した。この結合体溶液を、−２０℃で保存した。
（工程２）
上記スポット溶液を、自動化スポット装置によって、化学修飾されたガラスチップ上になんらかの順番で分配した。各チップは、１０個のアレイ（５列×２行）を含み、そして各アレイは、３６個のサンプルスポット（６列×６行）を含んだ。この場合、２つのスポット間の間隔は、４００μｍであった。各アレイは、隔離された反応チャンバーであった。
（工程３）
スポットした後、チップを真空装置を用いて乾燥した。
【００５４】
（工程４）
乾燥した後すぐに、チップを真空包装してそして４℃で保存した。
【００５５】
上記のように調製されるチップは、定性分析、半定性分析および定量分析において、エンロフロキサシン、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）、およびストレプトマイシンを検出するために使用され得る。
【００５６】
（実施例２：バイオチップによる残存獣医学用薬物の検出）
残存エンフロキサシン、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）、またはストレプトマイシンを含有するサンプルを、以下に記載するように試験した。
１．ブロッキング：実施例１に記載されるように調製しバイオチップを、１０％のヤギ血清で３７℃にて３０分間、ブロッキングした。
２．浄化および乾燥：次いで、バイオチップを、ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で洗浄カセット内にて５分間、攪拌しながら洗浄し、次いでチップを乾燥させるために、１０００ｒｐｍで１分間、遠心した。
【００５７】
３．一次抗体反応：試験されるべきサンプルを、エンロフロキサシンに特異的に結合する抗体、スルファジミジン（ｓｕｌｆｉｍｉｄｉｎｅ）に特異的に結合する抗体、およびストレプトマイシンに特異的に結合する抗体（抗ストレプトマイシン抗体は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｇｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．から入手した）と、各抗体が１ｍｇ／ｍｌ濃度の状態で、混合した。２０μｌのサンプルと抗体との混合物を、反応液に加え、そして３７℃で３０分間、反応させた。
【００５８】
４．２次抗体反応：チップを、工程２に記載されるように洗浄しそして乾燥した。次いで、蛍光標識された２０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧを、１μｇ／ｍｌの濃度にて反応チャンバーに加えた。このチップを、３７℃で３０分間、インキュベートした。
【００５９】
５．チップスキャンおよびデータ分析：次いで、チップを、工程２に記載されるように洗浄しそして乾燥した。次いで、このチップをスキャンし、そしてそのデータを分析した。結果は、図１〜４に示される。競合イムノアッセイを使用したので、より低いシグナルスポットは、試験されたサンプル中に存在する残存獣医学用薬物のより高いレベルを示す。
【００６０】
本発明の低分子化合物を検出するための検出システムの感度は、技術的目標および中国政府に許可された最大残存レベル（ＭＲＬ）を満たす。感度および直線範囲を、以下の表１中のＭＲＬと比較した。
【００６１】
【表１】
本明細書中に記載されるシステムの感度がＭＲＬよりもずっと高いので、このシステムを用いる場合、試験されるべきサンプルが希釈され得る。
【００６２】
図１〜４の残存獣医学用薬物の濃度は、以下の表２に示される。
【００６３】
【表２】
（実施例３．バイオチップによる禁止物資の検出）
（サンプル収集）
尿サンプルを、収集してそして−２０℃で保存した。ポジティブコントロール尿サンプルおよびネガティブコントロール尿サンプルもまた、収集した。サンプル収集の詳細は、Ｄｕら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３６８−３７５（２００５）に記載される。
【００６４】
（チップ基材の調製）
アルデヒド基で化学修飾されたスライドガラスを、所定の位置にてＢＳＡ結合体化分子と共有結合する基材として使用した。このスライドを、１００ｇ／Ｌのクロム酸で６時間浄化し、その後、脱イオン水でリンスした。次いで、スライドを２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液中に浸漬し、そして４ｍｏｌ／Ｌの塩酸中に各３０分間浸漬して、その後、脱イオン水でリンスし、次いで、窒素流のもとで乾燥させた。浄化したスライドを、エタノール中の３−グリシドキシプロピトリメトキシレン（ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）（４０ｍＬ／Ｌ）を用いて８時間、シラン処理した。ガラス表面を、トルエン、アセトン、および脱イオン水で洗浄し、この後で、このスライドを、４ｍｏｌ／Ｌの塩酸中に再度３０分間浸漬し、そして５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＩＯ４中に１時間浸し、調製プロセスを完了した。アルデヒド活性化スライドの接触角を、品質を制御する目的のための接触角システム（Ｍｏｄｅｌ ＯＣＡ；ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ）の使用によって測定した。スライドを乾燥箱内で室温にて最大３ヶ月間保存した。
【００６５】
（チップのプリント）
ＢＳＡ結合体化薬物１０個の９×９アレイを、各スライド上にプリントした。ペプチドホルモンの場合、このペプチドを直接プリントした。各スライドにおいて、１サンプルは、種々の分析物のために１個の９×９アレイ上で試験され得、そして１０サンプルまでが、１枚のチップ上で並行して分析され得る。ステルスマイクロスポットピン（Ｍｏｄｅｌ ＳＭＰ３；ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を備える接触プリントロボット（ＰｉｘＳｙｓ ５５００；Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、アルデヒド活性化スライド上でチップをプリントするために使用した。各々のプリントされたタンパク質（薬物−ＢＳＡ）の濃度は、４００ｍＬ／Ｌのグリセロールまたはタンパク質プリント緩衝液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中で５００ｍｇ／Ｌであった。薬物−ＢＳＡ結合体を、加湿チャンバー内で６時間、チップ上で反応させた。次いでこのスライドを、１ヶ月までの期間、室温で保存した。
【００６６】
（イムノアッセイ手順）
競合イムノアッセイ設計を、チップ上の１６種のＷＡＤＡ禁止物質を試験するために使用した。成形ポリエステルフレームを、基材に取り付け、チップ表面上の１０個のアレイに仕切った（図５Ａ）。このチップは、１６個の異なる薬物−ＢＳＡ結合体および１１個のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールから構成され、９×９のアレイを形成した。各材料を、３連でプリントした（図５Ｂおよび図５Ｃ）。チップを、ブロッキング溶液（ｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１対１０の希釈ヒツジ血清）中に３０分間室温で浸し、そして次いで、ｐＨ７．４の０．５ｍＬ／ＬのＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ Ａ）で３回リンスした。次いで、抗薬物マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．およびＡｖｉｖａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られた）および薬物を含有する尿サンプルの混合物を、チップの表面を覆うポリエステルフレームによって形成されたグリッド状の反応チャンバーに適用した。次いで、このチップを加湿チャンバー内で３０分間３７℃に維持した。次いで、このチップをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ Ａで３回リンスし、そして２次抗体（Ｃｙ３標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ）をチップに適用しそして３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、このチップを再度洗浄し、そしてレーザー共焦点スキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または電荷結合素子ベースのスキャナー（ＥｃｏＳｃａｎ−１００；ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の使用によって、Ｃｙ３標識化２次抗体の結合の存在についてスキャンした。アナログの蛍光シグナルを、データ分析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．０；Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってデジタルシグナルへと変換した。チップから得られた結果を、後に、中国ドーピング制御センター（ＣＤＣＣ）にあるガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によって得られた結果と比較した。
【００６７】
（チップ上で検出された禁止物質）
アンフェタミンについてネガティブなサンプルを用いて得られたチップの画像の一例が、図６に示される。アンフェタミン−ＢＳＡ結合体を、アルデヒド活性化チップ上に３連で配列した（図６の囲んだ領域）。予想されるように、各薬物についての３つの試験スポットは、その薬物についてネガティブなサンプル中の抗薬物抗体に結合し、そして次いで、蛍光シグナルを発するＣｙ３標識化二次抗体に結合した。いずれの場合にも、マウスＩｇＧコントロールスポットの全て（上の列および下の列の９つのスポット、ならびに２つの中央グループの３つのスポット）は、このアッセイにおいて使用されたヤギ抗マウス結合体と固定されたマウスＩｇＧコントロールとの反応から予測されるように、ポジティブであった。
【００６８】
（チップ上の蛍光シグナルに対する異なるマトリックスの影響）
種々のサンプルおよび溶液（例えば、尿、水、またはＰＢＳ）の蛍光シグナルに対する潜在的影響を、評価した。種々の溶液は、特定の試験された物質についてのシグナルに対して劇的に影響し得ることが見出された。溶液がＰＢＳから尿に変更されたときのステロイドについての有意なシグナルの減少に注目した。これは、対応する抗体といくつかの内因性ステロイド干渉物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）との結合に起因し得る。大抵の外因性薬物は、ＰＢＳ対ブランク尿の匹敵する比率（通常は、１．５０未満）を有した。しかし、特定の分析物（例えば、アンフェタミン）は、例外的に高い約２．５０の比率を生じた。このアッセイを９６ウェルプレート上で繰り返し、そしてアンフェタミンを含有する全ての外因性分析物は、１．１３〜１．１８の低いＰＢＳ対ブランク尿の比率を有した。これは、ヒトの尿中の非ドーピング物質が、アンフェタミンとその抗体との相互作用を干渉したかもしれないことを示唆する。
（限界値およびカットオフ値の検出）
原則として、対応する位置の蛍光シグナルは、試験物質がサンプル中に存在する場合、減少する。直線的に測定の範囲内で、蛍光シグナルにおける減少は、サンプル中の薬物に比例した。従って、この方法は、サンプル中の基質の存在の定性判定および定量判定の両方に使用され得る。バイオチップの使用によって測定されたアンフェタミンについての較正曲線は、図７に示される。その他の９個の禁止物質についての較正曲線は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｃｈｅｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｖｏｌ５１／ｉｓｓｕｅ２にて利用可能である。検出限界は、分析物がチップによって検出され得る最も低い濃度として規定される。この濃度は、ネガティブコントロールの平均より３ＳＤ低く、そしてモルヒネについては０．２μｇ／Ｌの範囲に及び、メタドンについては１９μｇ／Ｌまでの範囲に及ぶ、シグナルと対応する。１０個の薬物についての検出限界およびカットオフ値（５０％の阻害濃度）が、以下の表３に要約される。
【００６９】
【表３】
（アッセイ精度）
精度研究において、中国ドーピング制御センター（ＣＤＣＣ）のドーピング制御分析によって確認された２００のブランク尿を含む、標準サンプルは、異なるバッチのチップを使用して、５人の技術者によって繰り返し分析された（ｎ＝３００）。全ての分析についてのバッチ間のＣＶは、１６％であり、そしてバッチ内のＣＶは、１３％であった。各薬物について、Ｄｕら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３６８〜３７５（２００５）の表４を参照のこと。
【００７０】
（定性分析）
代表的なスクリーニング手順において、１４１人の中国人の体操選手から収集した尿を、定性分析のために禁止物質について試験した。８つの検体の中で、５つの検体は、モルヒネに対してポジディブを示し、１つは、ジヒドロコデイン対してポジティブを示し、１つは、ペチジンに対してポジティブ、そして１つは、試験された物質に対してネガティブを示した。ジヒドロコデインおよびペチジンを含有するサンプルについての抗モルヒネ抗体との交差反応を、検出した。平均（ＳＤ）モルヒネシグナルは、０．４２９（０．１２）であり、そして臨界値（有意検定において使用され、これは、帰無仮説が棄却されるために上回らなければならない検定統計量である値である）は、０．２３２（Ｐ＜０．０５）であった。これは、１．７μｇ／Ｌのモルヒネと等価である。このサンプルは、測定されたシグナルが臨界値より下であった場合、モルヒネに対してポジティブである。全てのポジティブサンプルを、ＣＤＣＣにあるガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によって確認した。
【００７１】
（定量分析）
多数のサンプルについての定性的なスクリーニングツールとして役立つだけでなく、チップはまた、定量分析にも使用され得る。４人のメタンフェタミン薬物乱用者からのサンプルからの６回の反復試験を、チップおよびＧＳ−ＭＳ方法を用いて実施した。チップおよびＧＣ−ＭＳの結果についての相関係数（ｒ２）は、０．９９１であった。これは、尿中のメタンフェタミンを定量化するためのこれらの２つの方法によって得られた結果が匹敵することを示す。
【００７２】
上記の実施例は、例示目的のみのために含まれ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。上記の多くの変更が可能である。上記の実施列に対する改変および変更は当業者にとって明らかであるので、本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ネガティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、残存スルファジミジン、残存ストレプトマイシンおよび残存エンロフロキサシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図２】図２は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、残存エンロフロキサシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存スルファジミジンおよび残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図３】図３は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、ここで、残存スルファジミジンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存エンロフロキサシンおよび残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図４】図４は、ポジティブサンプルと反応したバイオチップを示す。ここで、ここで、残存ストレプトマイシンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも高かったが、残存エンロフロキサシンおよび残存スルファジミジンは、最大残存限度（ＭＲＬ）よりも低かった。全てのポジティブな薬物は、白色の枠で標識されておリ、他のスポットは、ネガティブ薬物および結果の信頼性を向上させ得るコントロールである。
【図５】図５は、アレイの代表的外観および配置を示す。Ａ：スライドガラスおよび各アレイ上の反応チャンバーを構成するポリエステルを示す模式図。Ｂ：アレイ上の薬物の配置（各薬物／物質は、３連でプリントされている）。Ｃ：９×９アレイの１つの画像。ＰＣＰ、フェンシクリジン；ＴＣＡ、三環系抗うつ薬；ｈＣＧ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；ＬＨ、黄体化ホルモン。
【図６】図６は、チップ上のアンフェタミンについての分析の結果を示す。灰色のボックスは、抗体の、その対応物への予測される結合を示す。
【図７】図７は、バイオチップによって測定されたアンフェタミンについての検量線を示すグラフである検量線は、薬物を含まない尿に添加された種々の濃度（０〜１０２４μｇ／Ｌ）の各物質を使用することによって作成された。ＦＬＵ、蛍光。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子化合物を検出するためのバイオチップであって、該バイオチップは、固相支持体、およびキャリアと低分子化合物との結合体を備え、該結合体は、該固相支持体の表面に固定されている、バイオチップ。
【請求項２】
前記低分子化合物が、１〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
複数の結合体が前記固相支持体に固定されている、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記低分子化合物が、以下：エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキサゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、およびクロピドール、からなる群より選択される獣医学用薬物である、バイオチップ。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記低分子化合物が、以下：アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシンからなる群より選択される禁止物質である、バイオチップ。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記キャリアが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）からなる群より選択されるタンパク質である、バイオチップ。
【請求項７】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体の表面に固定されたコントロールをさらに備え、該コントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される、バイオチップ。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体の表面に固定された、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールをさらに備える、バイオチップ。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体が、以下：セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される、バイオチップ。
【請求項１０】
低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法であって、該方法は、以下：
検出されるべき低分子化合物をキャリアに連結させて、結合体を形成する工程；
該結合体を、固相支持体の化学的に修飾された表面にスポットする工程；および
スポットされた固相支持体を乾燥させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
サンプル中の低分子化合物を検出するための方法であって、該方法は以下：
請求項１に記載のバイオチップを、サンプル、および該低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、該結合分子の該低分子化合物への特異的結合に適切な条件下で、インキュベートする工程；
該バイオチップの表面に固定された結合体における該低分子化合物への該結合分子の結合を検出する工程であって、該サンプル中の該低分子化合物の存在または非存在または量が検出される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記バイオチップが、工程ａ）の前にブロッキング溶液中でインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオチップが、工程ａ）において、前記サンプルと前記結合分子との混合物とともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオチップが、工程ａ）において、最初に前記サンプルとともにインキュベートされ、次いで前記結合分子とともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオチップが、工程ａ）において、最初に前記結合分子とともにインキュベートされ、次いで前記サンプルとともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への前記結合分子の結合と、該バイオチップの表面に固定されたコントロールへの該結合分子の結合とを比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記コントロールが、以下：ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記結合分子が、抗体またはポリマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法であって、前記結合分子が標識に連結され、そして前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への該結合分子の結合が、該バイオチップにおける該標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記標識が、以下：蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性標識、および発光標識からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載の方法であって、該方法が、前記バイオチップを前記結合分子に特異的に結合する二次抗体とともにインキュベートする工程をさらに包含し、そして前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への該結合分子の結合が、該二次抗体の結合を検出することによって検出される、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記二次抗体が標識に連結され、そして該二次抗体の前記結合分子への結合が、前記バイオチップにおける該標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される、方法。
【請求項２３】
前記方法が、家畜動物中の残存獣医学用薬物を検出するために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ドーピング薬物試験のために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中の低分子化合物を検出するためのキットであって、該キットは、バイオチップおよび該低分子化合物に特異的に結合する結合分子を備え、該バイオチップは、固相支持体および低分子化合物とキャリアとの結合体を備え、該結合体は、該固相支持体の表面に固定されている、キット。
【請求項１】
低分子化合物を検出するためのバイオチップであって、該バイオチップは、固相支持体、およびキャリアと低分子化合物との結合体を備え、該結合体は、該固相支持体の表面に固定されている、バイオチップ。
【請求項２】
前記低分子化合物が、１〜１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
複数の結合体が前記固相支持体に固定されている、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項４】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記低分子化合物が、以下：エンロフロキサシン、フラントイン、フラシリン、フラゾリドン、シプロフロキサシン、スルファジミジン、スルファメトキシジアジン、スルファメタジン、スルファジモキシナム、スルファメトキサゾール、スルファメラジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモノメトキシン、スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファチアゾール、クロルテトラサイクリン、クレンブテロール、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ノルフロキサシン、ジフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ジゴキシン、アフラトキシン類、カナマイシン、メルカプトエタノール、ペニシリン類、ゲンタマイシン、バンコマイシン、ネオマイシン、サリノマイシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、カルバドックス、およびクロピドール、からなる群より選択される獣医学用薬物である、バイオチップ。
【請求項５】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記低分子化合物が、以下：アンフェタミン、ベンゾイルエクゴニン、フェンシクリジン、テオフィリン、バルビツレートメタドン、ベンゾジゼピン、モルヒネ、三環系抗うつ薬、ゲンタマイシン、ジゴキシン、エストラジオール、トブラマイシンからなる群より選択される禁止物質である、バイオチップ。
【請求項６】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記キャリアが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、およびオボアルブミン（ＯＶＡ）からなる群より選択されるタンパク質である、バイオチップ。
【請求項７】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体の表面に固定されたコントロールをさらに備え、該コントロールは、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される、バイオチップ。
【請求項８】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体の表面に固定された、ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールをさらに備える、バイオチップ。
【請求項９】
請求項１に記載のバイオチップであって、前記固相支持体が、以下：セラミック、ガラス、シリカ、石英、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、ニトロセルロース、および金属からなる群より選択される、バイオチップ。
【請求項１０】
低分子化合物を検出するためのバイオチップを作製する方法であって、該方法は、以下：
検出されるべき低分子化合物をキャリアに連結させて、結合体を形成する工程；
該結合体を、固相支持体の化学的に修飾された表面にスポットする工程；および
スポットされた固相支持体を乾燥させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
サンプル中の低分子化合物を検出するための方法であって、該方法は以下：
請求項１に記載のバイオチップを、サンプル、および該低分子化合物に特異的に結合する結合分子とともに、該結合分子の該低分子化合物への特異的結合に適切な条件下で、インキュベートする工程；
該バイオチップの表面に固定された結合体における該低分子化合物への該結合分子の結合を検出する工程であって、該サンプル中の該低分子化合物の存在または非存在または量が検出される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記バイオチップが、工程ａ）の前にブロッキング溶液中でインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオチップが、工程ａ）において、前記サンプルと前記結合分子との混合物とともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオチップが、工程ａ）において、最初に前記サンプルとともにインキュベートされ、次いで前記結合分子とともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオチップが、工程ａ）において、最初に前記結合分子とともにインキュベートされ、次いで前記サンプルとともにインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への前記結合分子の結合と、該バイオチップの表面に固定されたコントロールへの該結合分子の結合とを比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記コントロールが、以下：ブランクコントロール、ネガティブコントロール、サンプル調製コントロール、固定コントロール、およびデータ正規化コントロールからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
前記結合分子が、抗体またはポリマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法であって、前記結合分子が標識に連結され、そして前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への該結合分子の結合が、該バイオチップにおける該標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記標識が、以下：蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、放射性標識、および発光標識からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載の方法であって、該方法が、前記バイオチップを前記結合分子に特異的に結合する二次抗体とともにインキュベートする工程をさらに包含し、そして前記バイオチップの表面に固定された前記結合体における前記低分子化合物への該結合分子の結合が、該二次抗体の結合を検出することによって検出される、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記二次抗体が標識に連結され、そして該二次抗体の前記結合分子への結合が、前記バイオチップにおける該標識の存在または非存在または量を検出することによって検出される、方法。
【請求項２３】
前記方法が、家畜動物中の残存獣医学用薬物を検出するために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ドーピング薬物試験のために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中の低分子化合物を検出するためのキットであって、該キットは、バイオチップおよび該低分子化合物に特異的に結合する結合分子を備え、該バイオチップは、固相支持体および低分子化合物とキャリアとの結合体を備え、該結合体は、該固相支持体の表面に固定されている、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５３０９２５（Ｐ２００７−５３０９２５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４２３９（Ｐ２００７−５０４２３９）
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００３８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３４１９
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０４２７８２６０）キャピタルバイオ コーポレーション (10)
【出願人】（５０３０１２２０３）ツィンフア ユニバーシティ (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２８日（２００５．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００３８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３４１９
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０４２７８２６０）キャピタルバイオ コーポレーション (10)
【出願人】（５０３０１２２０３）ツィンフア ユニバーシティ (10)
【Ｆターム（参考）】
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