体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法
本発明は、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法に関する。本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンもしくは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体に結合させて体内持続性を維持することで血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質もしくは生理活性ペプチドより、著しく増加して体内安定性に優れる。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、タンパク質またはペプチド薬物の持続性製剤の開発に有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法に関することである。
【背景技術】
【０００２】
既存のタンパク質およびペプチド医薬品は、一般化学合成医薬が提供していない治療効果を示し、優れた効能を発揮することにより、医薬治療剤分野で重要な領域を占めている。例えば、遺伝子組み換えのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、recombinant human growth hormone）は成長ホルモン欠乏症の効果的な治療剤として唯一に使われており、遺伝子組み換えの赤血球促進因子（ＥＰＯ、recombinant human erythropoietin）は腎臓異常による貧血患者の赤血球濃度を上昇させる薬として使われており、遺伝子の組み換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、recombinant granulocyte colony stimulating hormone）は化学的治療を受ける癌患者の白血球を増加させる唯一の薬として使われている。この他にも、人体に存在する様々な種類のサイトカイン(cytokine)、ホルモン、ペプチドなどが、代替治療剤のない場合に唯一の治療剤として広範囲に使われている。
【０００３】
ところが、これらのタンパク質またはペプチド治療剤は、体内で優れた治療効果を発揮するが、一般的に血液内の加水分解酵素によって分解されて注射後に治療効果が直ちに消失してしまうか、或いは腎臓または肝を通じて容易に体内で除去されるため、短い半減期を持っている。よって、これらのタンパク質またはペプチド治療剤は、体内で一定の血中濃度および力価を維持するためには頻繁に注射を行わなければならないという脆弱点を持っている。タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の頻繁な注射は注射の恐怖心や注射時の通症など患者の薬物順応度を減少させ、長期間の治療を要する場合には制限的に使用されるため治療効果も低下するという欠点がある。
【０００４】
したがって、タンパク質／ペプチド薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長らく維持するための研究が引き続き行われてきた。
【０００５】
このような研究の一例として、タンパク質またはペプチドを体内で自然分解させるポリマーを用いて封入した後、皮下または筋肉を注射し、体内で徐々に放出させる徐放型(sustained release)治療剤が開発された(M. Chasin & R. Langer, et al., Biodegradable polymer as drug delivery system, Marcel Dekker (1990); J. Heller, et al., Adv. Drug Del Rev., 10, 163 (1993))。生体内で分解されるポリマーとしてはＰＬＧＡ(poly(lactic-co-glycolic acid))が最も多く使用され、前記徐放型治療剤の代表的な例としてはＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤(agonist)のペプチドを徐放性ペプチドとして製造した製品があり、この製品は１ヶ月または３ヶ月以上体内でペプチドを放出することもある。また、このような研究は分子量の大きいタンパク質にも適用された。その一例として、米国登録特許第６，５００，４４８号には生分解性高分子と金属イオンを通してヒト成長ホルモンの徐放性微細粒子を製造する技術について記載されている。韓国登録特許第１０−０２３６７７１号および同第１０−０３２９３３６号には組み換えヒト成長ホルモンを体内で分解させるヒアルロン酸を用いたタンパク質薬物の徐放性微細粒子剤形について記載されている。
【０００６】
しかし、生体分解性ポリマーを用いた徐放型治療剤は、アミノ酸の数が少ない分子量を有するペプチドではある程度成功を得たが、分子量の大きいタンパク質治療剤の場合は成功が制限的であった。その理由は、徐放出性封入体を作る過程でタンパク質の変性が容易に起こってアミノ酸の変形がタンパク質の力価を低下させるとともに、人体で望まない免疫反応を引き起こすためである。また、一般的にタンパク質またはペプチド徐放出性封入体の微細粒子の場合、粒子サイズが大きいため、人体に注射するときに注射針の太い注射器を使用しなければならないという欠点があり、製造過程における低い生産収率が経済性の側面で問題となることもある。
【０００７】
上記のような問題点を克服するために、タンパク質またはペプチドの腎臓透過を遅延させるための方法が研究された。一般的に、分子量６０，０００ダルトン以下のタンパク質は、体内で腎臓の濾過体に濾されずそのまま通過する。よって、これより少ない分子量を有するペプチドまたはタンパク質治療剤の大きさを増加させて体内残留時間を増加させることで注射回数を減らそうとする方法が研究された。このような方法によれば、生理活性のあるタンパク質／ペプチドは体内で徐々に放出(sustained release)される形態ではなく、持続性(long-acting)の作用を果たすことができるものと考えられる。
【０００８】
注射回数を減らす方法の中でも最も普遍的に用いられる方法としては、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」という）のように溶解度の高い高分子物質を、タンパク質または薬理活性を持つペプチドの表面に付着させる方法がある。ＰＥＧはタンパク質またはペプチドのアミン基を有するアミノ酸に非特異的に付着し、ＰＥＧの付着されたタンパク質は溶解度が増加し、水溶液の状態で流体力学的体積(hydrodynamic volume)が増加して人体への注射の際に体内に長らく止まるという効果がある(Sada et al., J. Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991)。
【０００９】
最近では、インターフェロンαにＰＥＧを付着させて注射回数を減らそうとする方法が商用化された。また、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ等は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）にＰＥＧを付着させ、週１回注射しても、週３回注射する顆粒球コロニー刺激因子と同一の薬効立証した(Kinstler et al., Pharm Res 12, 1883-1888, 1995)。前記ＰＥＧ−ＧＣＳＦは「Ｎｅｕｌａｓｔ」という商品名で許可を受けて使用されている。
【００１０】
しかし、タンパク質にＰＥＧが付着すると、ＰＥＧのタンパク質の表面にＰＥＧが非特異的に化学結合を成すため、ＰＥＧの付着したタンパク質の部分が受容体との結合を妨害してタンパク質の生体内力価が著しく低下するという問題がある。また、生理活性を起こす部位に非特異的に付着したＰＥＧ−タンパク質を精製過程で分離して生体内の活性低下を最小化するように結合したＰＥＧ−タンパク質を得なければならないという煩わしさがある。この過程で求めるのＰＥＧ−タンパク質結合体を得るためには生産収率が著しく低下するため経済性が低く、特定タンパク質の場合、水溶液状態における安定性が低い場合には、ＰＥＧを付着させようとする試みが失敗することもあった。
【００１１】
また、糖鎖工学(glycoengineering)を用いて注射回数を減らそうとする方法が開発されて商用化された。Ｅｌｌｉｏｔ等は、赤血球促進因子（ＥＰＯ）のアミノ酸を置換する方法を用いて糖鎖を追加する方法について報告した(Nat Biotechnol 21, 414-421, 2003;米国登録特許第７,２１７,６８９号)。糖鎖工学的方法が適用された赤血球促進因子は、「Ａｒａｎｅｓｐ」という商品名で許可を受けて市販されており、糖鎖、シアル酸(sialic acid)および分子量の増加により血流への吸収および代謝と排泄が遅延する効果を持つものとして知られている。ところが、この技術は、生理活性物質の糖鎖付着または追加によって活性低下が誘発するおそれがあり、体内安定性の持続有無が様々なタンパク質に対して検証されておらず、生理活性タンパク質にさらに付着する糖鎖の位置が非常に制限的で、低分子ペプチドには適用させることが容易でないなど、その使用が非常に制限的である。
【００１２】
遺伝工学的な方法が発達して以来、生理活性を持つタンパク質を、大きい分子量を有する他のタンパク質と融合してタンパク質の大きさを増加させる方法が研究された(Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-95, 2009)。例えば、生理活性を持つタンパク質の遺伝子とヒトアルブミン(human albumin)遺伝子との融合後、酵母細胞で発現させた融合タンパク質が知られている（国際出願公開ＷＯ９３／１５１９９号およびＷＯ９３／１５２００号）。前記アルブミンと生理活性タンパク質との融合に関する例としては、顆粒球刺激因子(Halpern et al., Pharm Res 19, 1720-1729, 2002)、ヒト成長ホルモン(Osborn et al., Eur J Pharmacol 456, 149-158, 2002)、グルカゴン様ペプチド−１(Baggio et al., Diabetes 53, 2492-2500, 2004)、インターフェロンα(Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther 303, 540-548, 2002)などが知られている。
【００１３】
遺伝子組み換え方法を用いた融合タンパク質の他の例としてはトランスフェリン(transferrin)融合タンパク質が知られている。例えば、米国登録特許第７，１７６，２７８号では、天然型トランスフェリンおよび糖化しないトランスフェリン変異体とグルカゴン様ペプチド−１などの融合体(fusion molecule)を作って体内半減期を増加させようとした。
【００１４】
一方、免疫グロブリン(Immunoglobulin、Ｉｇ)のＦｃ部分を特定のタンパク質と融合させて体内半減期を増加させる方法が開発された（米国登録特許第５，１１６，９６４号および同第５，６０５，６９０号）。ＴＮＦ−α受容体断片をＩｇＧ１のＦｃ部分と結合させた遺伝子を動物細胞（chinese hamster ovary、ＣＨＯ）で発現させた物質（商品名：Ｅｎｂｒｅｌ）は、関節リウマチ治療剤であって、米国ＦＤＡの許可を受けて現在治療剤として使われている。また、Ｗａｎｇ（Qinghua Wang：ＷＯ２００７／０１２１８８）は、体内半減期の短い生理活性ペプチドＧＬＰ−１（ｔ１／２＜２分）またはエキセンディン−４をＩｇのＦｃ部分と融合体(fusion molecule)を作って体内半減期を増加させようとした。
【００１５】
このように、免疫グロブリンＦｃは、融合タンパク質のキャリアとして多く用いられているが、ＩｇＧ Ｆｃが有する抗体依存性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity、ＡＤＣＣ)または補体依存性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ)効果はそのまま維持する。よって、生理活性物質とＦｃとを融合した物質を人体に投与する場合、単純な体内半減期を維持させようとする目的の他にも複雑な免疫反応に露出されるうえ、長期反復投与の際に所望しない抗体を生成させることもある。従って、Ｆｃの融合された前記の方法は使用が制限的になるしかない。
【００１６】
また、韓国登録特許第１０−０７２５３１５号には、免疫グロブリン断片を用いたタンパク質結合体およびその製造方法、すなわち生理活性を有するタンパク質とＦｃ部分をＰＥＧで連結させて体内半減期を増加させる方法について記載されている。前記の方法の場合、生理活性タンパク質−ＰＥＧ−Ｆｃの構造を持つ「タンパク質結合体」は、薬物動力学調査において構造が変形していない生理活性タンパク質よりさらに長い体内半減期を持つことを示した。ところが、前記の「タンパク質結合体」も２つの生理活性タンパク質とＦｃをＰＥＧに化学反応によって連結させるという点で、ＰＥＧ融合タンパク質の製造の際に発生しうる問題が常存する。
【００１７】
免疫グロブリンを用いた他の例としては、ＩｇＧ抗体全体分子と低分子化合物を化学的に連結させてペプチド薬物の体内安定性を増加させようとした(Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5396-5400, 2003, Doppalapudi et al., Bioorg & Med Chem 17, 501-506, 2007)。ところが、「ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ」と命名されたこの技術は、生理活性タンパク質などの分子量が大きいタンパク質には使用することができず、また、前記Ｆｃ融合タンパク質とＰＥＧタンパク質の製造の際に発生する問題点によりその使用が制限的である。
【００１８】
上述のように、生理活性タンパク質治療剤またはペプチド治療剤に高分子を融合させる様々な方法が試みられてきたが、これらの方法は、特定の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドと結合させる場合、体内持続時間が医薬用として開発するのには適せず、製造過程で収率が著しく低くて経済性が欠如してしまい、長期間使用の際に体内で不要な免疫反応を引き起こしてタンパク質またはペプチド結合過程で使用される化学物質残基が体内注入の際に毒性を引き起こすなど様々な理由により全ての生理活性タンパク質または生理活性ペプチドに適用することができないという欠点がある。したがって、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドの体内活性減少を最小化しながら血中半減期を延長させることが可能な新規のタンパク質またはペプチド融合体に対する開発の必要性が要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドの体内活性減少を最小化しながら血中半減期を延長させることが可能なタンパク質またはペプチド融合体について研究したところ、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンもしくはアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて新規なタンパク質またはペプチド融合体を製造し、前記のタンパク質またはペプチド融合体が体内持続性を維持することにより血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質もしくはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法を提供しようとする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態グラフを示す図である。
【図２】本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態グラフを示す図である。
【図３】本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態グラフを示す図である。
【図４】本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態グラフを示す図である。
【図５】本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性（脳下垂体が除去されたラットの重量増加）分析結果を示す図である。
【図６】本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性（白血球数の増加）分析結果を示す図である。
【図７】本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の腹腔内糖負荷検査結果を示す図である。
【図８】本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］が糖尿モデルマウスにおける血糖減少への影響を示す図である。
【図９】本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性分析結果を示す図である。
【図１０】本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性分析結果を示す図である。
【図１１】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のトリプシン活性抑制を示す図である。
【図１２】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のヒト好中球エラスターゼ活性抑制を示す図である。
【図１３】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動遂行結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンと結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体を提供する。
【００２３】
また、本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体を提供する。
【００２４】
また、本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法を提供する。
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させることを特徴とする。
【００２６】
本発明において、「タンパク質融合(fusion protein/fusion polypeptide)」は、一つ以上の生理活性を有するタンパク質をアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端またはＣ末端に結合させた新規の分子構成を持つタンパク質融合体を意味する。また、「ペプチド融合体(fusion peptide)」は、一つ以上の生理活性を有する低分子量のペプチドをアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端またはＣ末端に結合させた新規の分子構成を持つペプチド融合体を意味する。
【００２７】
前記の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドは、直接またはアミノ酸で構成されたリンカーを用いて、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体に結合できる。
【００２８】
前記の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドとアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体は、遺伝子組み換え技術を用いて結合させることが好ましいが、当業界における公知の架橋剤を用いてアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に結合させることができる。
【００２９】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質(biological response modifier)およびその受容体、サイトカイン類およびその受容体、酵素類、抗体類、抗体断片類などを含むことができる。具体的には、前記生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄなどを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンおよびその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)およびその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片などを含むが、これに限定されない。
【００３１】
前記のアルファ−１アンチトリプシンは分子量約５０，０００ダルトンの哺乳類の血液内に存在するタンパク質の中の一つであって、血液内濃度は約２ｍｇ／ｍＬに達する主血液タンパク質の中の一つであり(Robin W.C. et al., Nature 298, 329-334, 1982)、アルファ−１プロテアーゼ抑制剤(alpha-1 protease inhibitor)とも呼ばれる。このタンパク質は、タンパク質分解酵素との試験の際に様々な種類のタンパク質分解酵素を抑制する。
【００３２】
しかし、現在知られている疾患に関連した生体内の主な機能は好中球エラスターゼ(neutrophil elastase)の抑制剤として知られている(Beatty et al., J Biol Chem 255, 3931-3934, 1980)。アルファ−１アンチトリプシンが欠乏すると、肺の機能が低下し、深刻な遺伝的疾患を引き起こすこともある。よって、血液内から抽出したアルファ−１アンチトリプシンは、ＦＤＡの許可を経て、プロラスチン(Prolastin)という商品名で肺気腫(emphysema)の治療剤として販売されている。プロラスチンは、通常、６０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間の隔で静脈注射によって人体に投与され、人体における安全性および有害性が立証されたタンパク質である。また、アルファ−１アンチトリプシンの体内の半減期は約５〜６日程度であると知られている(Weweres, MD, et al., N. Engl J med 316, 1055-1062, 1987)。従って、人体に過量投与しても安定性などが既に立証されたアルファ−１アンチトリプシンを、生成活性を持つタンパク質またはペプチドと融合して、体内半減期の増加した持続性物質に作ろうとする論理的根拠が提供される。アルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤としての役目や構造などは既によく知られている(Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998)。アルファ−１アンチトリプシンのＰ１（Ｎ末端から３５８番目の位置）アミノ酸はメチオニン基であるが、このタンパク質はトリプシン、キモトリプシン(chymotrpsin)、トロンビンおよびエラスターゼなどの様々なプロテアーゼなどの活性を阻害するものと知られている。また、アルファ−１アンチトリプシンは、自然界に１００余種以上の対立遺伝子(allele)が存在していて表現型(phenotype)はＩＥＦ(isoelectric focusing)の類型によってＡ-Ｚに区分する(Stoller et al., The Lancet, 365, 2225 - 2236, 2005)。これらの中で最も多いＭ対立遺伝子は、正常型でアミノ酸配列変異によってさらにＭ１（Ｖａｌ２１３）、Ｍ１（Ａｌａ２１３）、Ｍ２、Ｍ３のように様々な亜型(subtype)に区分される。よって、本発明に使用されたアルファ−１アンチトリプシンは自然界に存在する特定の亜型であり、他の亜型に対しても同一の効果を得ることができる。
【００３３】
前記のアルファ−１アンチトリプシン変異体は、一つ以上のアミノ酸を変異させて特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagenesis)方法を用いて製造される。例えば、アルファ−１アンチトリプシン変異体における一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする。また、アルファ−１アンチトリプシン変異体における一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含む。前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異したり或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを含む。または、前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したものを含む。すなわち、アルファ−１アンチトリプシン変異体は、アルファ−１アンチトリプシン変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）］、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）］、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）］を含む。
【００３４】
前記のアルファ−１アンチトリプシン変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、Ｎ末端からＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン（Ａｓｎ）」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸の置換による免疫原性の可能性を最小化することができる。
【００３５】
前記のアルファ−１アンチトリプシン二重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させ、３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸の置換による免疫原性の可能性を最小化することができる。
【００３６】
前記のアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体２は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸置換による免疫原性の可能性を最小化することができ、遊離システインによる二重体形成などを除去することができる。
【００３７】
前記アルファ−１アンチトリプシン三重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させ、２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させ、３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸置換による免疫原性の可能性を最小化することができ、遊離システインによる二重体形成などを除去することができる。
【００３８】
本発明のタンパク質またはペプチド融合体は、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］（配列番号１）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］（配列番号２）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］（配列番号３）、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］（配列番号４）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号５）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号６）、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］（配列番号７）を含む。
【００３９】
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシ融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の血中半減期（ｔ１／２）は固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。
【００４０】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］を注射した、脳下垂体の除去されたラットの場合、体重増加を示し、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］を注射したラットの場合、白血球の数が増加する。また、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］を投与した群は、エキセンディン−４を投与した群より血糖減少効果に優れるうえ、２４時間後にも血糖が低く維持されて血糖減少の効果が長らく持続される。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は効果的に生体内活性が長らく維持されることが分かる。
【００４１】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ]、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性（ＥＣ５０）は、アルファ１−アンチトリプシンおよびアルファ−１アンチトリプシン変異体の種類に関係なく、大きい差なしに類似である。
【００４２】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性およびヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が優位に現れるがヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性およびヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が低く現れる。よって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することにより体内半減期が増加することはアルファ−１アンチトリプシの固有性質によるものではないことが分かる。
【００４３】
上述したように、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、体内持続性を維持することにより血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体はタンパク質またはペプチド薬物の持続性製剤の開発に有用に使用できる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００４５】
実施例１：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体の製造［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］
１．発現ベクターｐＳＮＡＴの製造
ヒト成長ホルモンをアルファ−１アンチトリプシンのＣ末端に融合させて発現するために、アルファ−１アンチトリプシンのみを発現するベクターｐＳＮＡＴを製造した。具体的には、Ｃ末端にヒト成長ホルモンを挿入するためにアルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）を２つのプライマー「ＡＬＴ２１」（配列番号８）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅した。この際、使用されたプライマーＡＬＴ３０は融合されたタンパク質の活性を維持するために柔軟性を極大化するためのリンカーを含んでいる。前記の増幅されたニュークレオチドを末端に存在する２つの制限酵素「ＸｈｏI」と「ＢａｍＨI」で切断し、母ベクターｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）に結合してクローニングした。これをｐＳＮＡＴと命名した。
２．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシンベクターの製造［Ｔ１０９ｗｔ、α１ＡＴ／ｈＧＨ］
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をエンコードするＩＯＨ４５７３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターを母体として、２つのプライマーＤＨ２２（配列番号１０）とＡＬＴ１２（配列番号１１）を用いてＰＣＲでヒト成長ホルモンを増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを末端に存在する２つの制限酵素ＢａｍＨIとＮｏｔIで切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴに結合して発現ベクターＴ１０９ｗｔ（(配列番号１)を製造した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０２ｗｔ）の発現
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて、前記２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）の発現を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％ＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)と抗生剤を含むＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Media)に５％ＣＯ２と３７℃の条件で培養して維持した。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を導入する１日前、１００ｍｍの培養皿に細胞を１×１０６濃度で接種して培養した後、ＦＢＳと抗生剤のない８００μＬのＤＭＥＭと５μｇのヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を混合して常温で１分間維持した後、２０μｇのＰＥＩ(Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc(Cat. No:23966, MW〜25000))と混合して１０〜１５分間常温で放置した。この際、１日前に培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培養液６ｍＬのＤＭＥＭを添加した。１０〜１５分後、常温に放置したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）をこの培養皿に添加した。翌ＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳのないＩＭＤＭ（Ｃａｔ. Ｎｏ１２２００−０２８、Ｇｉｂｃｏ）(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培地を添加してタンパク質の発現を確認した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）の精製
前記３によってチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）で発現したＴ１０９ｗｔタンパク質を下記のとおり精製した。具体的には、細胞培養液で分泌されたヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を精製するために、培養液を遠心分離して細胞を除去した後、上澄み液のみを取った。細胞上澄み液を平衡緩衝溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で希釈し、平衡緩衝溶液で平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入した後、平衡緩衝溶液で十分に洗浄してから塩の濃度を増加（０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）させて溶出した。溶出された前記のタンパク質溶液に塩を加えて、平衡化されているフェニル−セファロース(Phenyl-Sepharose)（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入した後、平衡緩衝溶液で十分に洗浄し、塩の濃度を減少（２〜０Ｍ ＮＡＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ６．８）させて溶出した。前記の溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を用いて濃縮し、高純度で精製されたＴ１０９ｗｔタンパク質を得た。
【００４６】
実施例２：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体の製造［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］
１．アルファ−１アンチトリプシン変異体の製造（ｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクター
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシンの活性を減少させるために、アルファ−１アンチトリプシン変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）をＰＣＲで増幅し、ｙＴ＆ＡベクターにクローニングしてｐＤＨＴ３ベクターを製造した。その後、２つのプライマーＡＬＴ１（配列番号１２）およびＡＬＴ２（配列番号１３）と変異体生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ II Ｃａｔ Ｎｏ．２００５２３−５）を用いて、アルファ−１アンチトリプシン活性に影響を与える、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮの製造
ヒト成長ホルモンを、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン変異体のＣ末端にヒト成長ホルモンを挿入するために、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３Ｎを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＥｃｏＲV」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮと命名した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ１０９、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］
前記の実施例１の２と同一の方法で増幅されたヒト成長ホルモンヌクレオチドを、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮに結合し、発現ベクターＴ１０９（配列番号２）を製造した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の発現を確認した。
５．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）を精製した。
【００４７】
実施例３：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体の製造［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］
１．アルファ−１アンチトリプシン二重変異体の製造（ｐＤＨＴ３ＮＴクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシン変異体の糖化の均質性のために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ８２（配列番号１５）およびＡＬＴ８３（配列番号１６）と変異体生成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＥＺＣｈａｎｇｅ Ｃａｔ Ｎｏ．ＥＭ０２０）を用いて３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＴクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＴの製造
ヒト成長ホルモンを、糖化の均質性を有しながら活性が減少したアルファ−１アンチトリプシン二重変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＴベクターを製造した。
具体的には、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体のＣ末端にヒト成長ホルモンを挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＴを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＥｃｏＲV」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＴと命名した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ１０９Ｔ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］
前記実施例１の２と同一の方法で増幅されたヒト成長ホルモンヌクレオチドを、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＴに結合し、発現ベクターＴ１０９Ｔ（配列番号３）を製造した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の発現を確認した。
５．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）を精製した。
【００４８】
実施例４：ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の製造［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］
１．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ５０２、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］
ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）をエンコードするＭＨＳ１０１０−９８０５１９１３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマー ＡＬＴ４５（配列番号１７）およびＡＬＴ４９（配列番号１８）を用いてＰＣＲでヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を増幅した。前記の増幅したニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮに結合して発現ベクターＴ５０２（配列番号４）を製造した。
２．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の発現を確認した。
３．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）を精製した。
【００４９】
実施例５：顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体の製造［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］
１．アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２の製造（ｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシンの固有な活性を減少させながら、アルファ−１アンチトリプシンのシステインによる二重体形成などのタンパク質変性の可能性を除去するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ５２（配列番号１９）およびＡＬＴ８３（配列番号２０）と変異体生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅII Ｃａｔ Ｎｏ．２００５２３−５）を用いて、アルファ−１アンチトリプシンに存在する２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＳの製造
顆粒球刺激因子を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＳベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のＣ末端に顆粒球刺激因子を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＳを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＢｓｔＥII」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＳと命名した。
３．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２ベクターの製造［Ｔ６０２Ｓ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］
顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をエンコードするＩＨＳ１３８０−９７６５２３４３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマーＡＬＴ５６（配列番号２１）とＡＬＴ７（配列番号２２）を用いてＰＣＲで顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＳに結合して発現ベクターＴ６０２Ｓ（配列番号５）を製造した。
４．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の発現を確認した。
５．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法で顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）を精製した。
【００５０】
実施例６：顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体の製造［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］
１．アルファ−１アンチトリプシン三重変異体の製造（ｐＤＨＴ３ＮＳＴクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシン二重変異体の糖化均質性のために、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導しアルファ−１アンチトリプシンのシステインによる二重体形成などのタンパク質変性の可能性を除去するために、２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させたアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ８２（配列番号１５）およびＡＬＴ８３（配列番号１６）と変異体生成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＥＺｃｈａｎｇｅ Ｃａｔ Ｎｏ．ＥＭ０２０）を用いて３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＳＴクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＳＴの製造
顆粒球刺激因子を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン三重変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＳＴベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体のＣ末端に顆粒球刺激因子を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＳＴを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＢｓｔＥII」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＳＴと命名した。
３．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異体ベクターの製造［Ｔ６０２ＳＴ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］
顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をエンコードするＩＨＳ１３８０−９７６５２３４３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマーＡＬＴ５６（配列番号２１）とＡＬＴ５７（配列番号２２）を用いてＰＣＲで顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＳＴに結合して発現ベクターＴ６０２ＳＴ（配列番号６）を製造した。
４．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の発現を確認した。
５．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法で顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）を精製した。
【００５１】
実施例７：エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の製造［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］
１．発現ベクターｐＳＣＡＴの製造
エキセンディン−４をアルファ−１アンチトリプシンのＮ末端に融合させて発現するために、ｐＳＣＡＴベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンのＮ末端にエキセンディン−４を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）を２つのプライマーＡＬＴ２１（配列番号８）とＡＬＴ５（配列番号２３）を用いてＰＣＲで増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素ＸｈｏIとＮｏｔIで切断し、母ベクターｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）に結合してクローニングした。これをｐＳＣＡＴと命名した。
２．発現ベクターｐＳＣＡＴＮの製造
エキセンディン−４を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端に融合させて発現するために、ｐＳＣＡＴＮベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端にエキセネィン−４を挿入するために、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３Ｎを２つの制限酵素ＥｃｏＲVとＮｏｔIを用いてｐＳＣＡＴとクローニングした。これをｐＳＣＡＴＮと命名した。
３．エキセンディン−４の製造
エキセンディン−４をエンコードするポリヌクレオチドを製造するために、ＤＨ１５（ｓｅｎｓｅ ｃｏｄｏｎ、配列番号２４）とＤＨ１６（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｃｏｄｏｎ、配列番号２５）を用いてＰＣＲで増幅した。
４．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ３０４、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］
エキセンディン−４をエンコードするポリヌクレオチドは、前記３で製造されたものを鋳型として、２つのプライマーＡＬＴ４４（配列番号２６）とＡＬＴ４１（配列番号２７）を用いてＰＣＲで増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素ＸｈｏIとＢａｍＨIで切断し、ＸｈｏIとＢａｍＨI切断部を持っているｐＳＣＡＴＮに結合してエキセンディン−４とアルファ−１アンチトリプシン変異体ベクター（Ｔ３０４、配列番号７）を製造した。
５．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の発現を確認した。
６．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）を精製した。
【００５２】
実験例１：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の酵素免疫分析法
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の分析のために、下記のとおり酵素免疫分析法を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／α−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の酵素免疫分析法
ヒト成長ホルモンに対するモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド）をリン酸塩緩衝溶液に１〜５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して１００μＬを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に分注した後、常温で１５〜１８時間放置した。ウェルプレートに付着せずに残っている抗体を除去した後、１％牛血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液２５０μＬを分注して常温で２時間放置させ、洗浄溶液（０．０５％ツイン２０、リン酸塩緩衝溶液）で３回洗浄した後、溶液を除去した。試料は１％牛血清アルブミンの溶解されたリン酸塩緩衝液で希釈し、９６ウェルプレートに添加して常温で２時間反応させた。９６ウェルプレートを洗浄溶液で５回洗浄した後、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を用いて接合させたヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体を希釈溶液で希釈して９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。次いで、プレートを常温で２時間反応させた後、洗浄溶液で５回洗浄し、しかる後に、ストレプタビジン−ＨＲＰ溶液を加えて常温で３０分間反応させた。洗浄溶液で５回洗浄し、ＴＭＢ（３，３'，５，５'−テトラメチルベンジディン）と過酸化水素水発色溶液１００μＬを各ウェルに添加した後、暗所で３０分間反応させた。１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに添加して反応を終了させ、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、米国）で４５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料の定量値は標準物質に対する標準曲線を作成した後、回帰分析によって求めた。
２．ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の酵素免疫分析法
ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の酵素免疫分析法は、Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ（オーストリア）社のＨｕｍａｎ ＩＦＮ−α Ｍａｔｃｈｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡの抗体を使用した。１０μｇ／ｍＬのＩＦＮ−α抗体を前記１の方法によってコートおよび遮断し、試料は希釈の後に常温で２時間シェーキングして反応させ、Ａｎｔｉ−ＩＦＮ−α−ＨＲＰ接合体は５０μＬを用いて常温で２時間シェーキングして反応させた。以後の過程は前記１の方法によって行った。
３．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の酵素免疫分析法
前記１でヒト成長ホルモン抗体の代わりに顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対するモノクローナル抗体（ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）をリン酸塩緩衝溶液に１〜５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して使用し、ヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体の代わりに顆粒球刺激因子ポリクローナル抗体−ビオチン接合体（ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用したものを除外しては、前記１の方法によって行った。
４．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の酵素免疫分析法
エキセンディン−４の場合、前記１でヒト成長ホルモンの代わりにエキセンディン−４に対するポリクローナル抗体（ペプトロン、韓国）をリン酸塩緩衝溶液に５〜１０μｇ／ｍＬの濃度で希釈して使用し、ヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体の代わにエキセンディン−４モノクローナル抗体−ビオチン接合体を使用したものを除外しては、前記１と同様の過程を行った。
エキセンディン−４／α−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の場合、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）をＦｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、米国）と混ぜてラットに注射して抗血清を生成させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、米国）を用いて精製した。前記の精製された抗体をリン酸緩衝溶液に１０〜２０μＬ／ｍＬの濃度で希釈して９６ウェルプレートにコートし、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を用いて接合させたエキセンディン−４／アルファ−１のアンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）ポリクローナル抗体−ビオチン接合体を用いて前記１の方法によって行った。試料反応と接合体反応はプレートをシェーキングして行った。
【００５３】
実験例２：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の薬物動態実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の薬物動態を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。ヒト成長ホルモン投与群には３匹を割り当て、残りの融合体投与群にはそれぞれ５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例１〜３で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］をそれぞれラットｋｇ当たり７２０μｇの投与量で皮下注射した。希釈液はリン酸塩緩衝溶液を使用した。０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群では、ヒト成長ホルモンＳｃｉｔｒｏｐｉｎ（ＳｃｉＧｅｎ、シンガフォル）をラットｋｇ当たり２００μｇの投与量で皮下注射し、希釈液としてリン酸塩緩衝溶液を使用し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態グラフは図１に示した。
図１に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．３時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は８時間であった。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．４時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２時間であった。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が４．９時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２．８時間であった。これに対し、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、血中半減期（ｔ１／２）が０．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１時間であった。よって、本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］は、ヒト成長ホルモンに比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
２．ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。各群当たり５匹ずつ割り当てた。一つの実験群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例４で製造したヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］をラットｋｇ当たり２００μｇの投与量で皮下注射し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４、３０、４８、７２、９６時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群として、ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α、インターマックスアルファ、ＬＧ生命科学）を用いてラットｋｇ当たり６０μｇの投与量で皮下注射し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態グラフは図２に示した。
図２に示すように、本発明のヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］は、血中半減期（ｔ１／２）が１８．５時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２時間であった。ヒトインターフェロンαは、血中半減期（ｔ１／２）が３．４時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１．４時間であった。よって、本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］は、ヒトインターフェロンαに比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
３．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。顆粒球刺激因子投与群には３匹を割り当て、残りの融合体投与群にはそれぞれ５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例５〜６で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（ＰＰ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をそれぞれラットｋｇ当たり３４０μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群では、顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｃｉｎ、第一薬品（株））を用いてラットｋｇ当たり１００μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１８、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態グラフは図３に示した。
図３に示すように、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．１時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１３．６時間であった。顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、血中半減期（ｔ１／２）が４．５時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１６時間であった。これに対し、顆粒球刺激因子は、血中半減期（ｔ１／２）が１．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１．８時間であった。よって、本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、顆粒球刺激因子に比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
４．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。各群当たり５匹ずつ割り当てた。一つの実験群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］をラットｋｇ当たり５２０μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８、７２時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群としては、エキセンディン−４を用いてラットｋｇ当たり４０μｇの投与量で皮下注射し、０、１０、２０、３０、４０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０分の後にヘパリンの処理されたチューブに採血して遠心分離を行った後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態グラフは図４に示した。
図４に示すように、本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、血中半減期（ｔ１／２）が１９．１時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１０．４時間であったが、これに対し、エキセンディン−４は、血中半減期（ｔ１／２）が０．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は０．４時間であった。よって、本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、エキセンディン−４に比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
【００５４】
実験例３：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性
実験動物として脳下垂体の除去されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。実験群を３つの群に分け、各群当たり７匹ずつ割り当てた。各群の脳下垂体の除去されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をラット当たり１８μｇ、ヒト成長ホルモン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＬＧ生命科学）をラット当たり５μｇ、対照群としてリン酸塩緩衝溶液を用いて毎日皮下注射した。注射の後、ラットの重量を毎日測定した。
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性（脳下垂体が除去されたラットの重量増加）分析結果は図５に示した。
図５に示すように、リン酸塩緩衝溶液を注射した脳下垂体の除去されたラットの場合、体重増加が殆ど起こっていないがしかし、ヒト成長ホルモンとヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］を注射した脳下垂体の除去されたラットの場合は、７日目にそれぞれ約１０．２％と９．４％の体重増加を示した。したがって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、ヒト成長ホルモンと同様に、脳下垂体の除去されたラットで効果的に生体内活性を示すことが分かる。
２．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。実験群を５つの群に分け、各群当たり５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例５で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（ＰＰ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］をラットｋｇ当たり３４０μｇと１７００μｇ、前記の実施例６で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をラットｋｇ当たり１７００μｇ、および顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｃｉｎ、第一薬品（株））をラットｋｇ当たり１００μｇの投与量で皮下注射し、実験の３日前、１日、２日、３日、４日、５日目に尾静脈から採血してＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｎｔｒａ１２０）を用いて白血球数を測定した。
本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性（白血球数の増加）分析結果は図６に示した。
図６に示すように、顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ投与群では、白血球数の増加が注射後１日目に最高値に到達した後、２日目からは基底状態に止まったが、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］のラットｋｇ当たり３４０μｍ投与群では白血球数の増加が注射後２日目に最高値に到達した後、３日目から減少した。顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をそれぞれラットｋｇ当たり１７００μｇ投与群では、白血球数の増加が注射後３日目まで維持されてから４日目から減少した。よって、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、顆粒球刺激因子に比べて生体内活性をさらに長らく維持するということを確認することができた。
３．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の生体内活性
本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の生体内活性を確認するために、下記のとおり腹腔内糖負荷検査および糖尿モデルのマウスにおける血糖減少実験を行った。
３−１．腹腔内の糖負荷検査
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに４週間高脂肪の飼料を食餌させて肥満を誘導した。実験開始の１５時間前に絶食させた状態で腹腔内の糖負荷検査を行った。具体的には、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］とエキセンディン−４をそれぞれ１０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量でマウスの腹腔内に単回投与した。試験物質投与の後それぞれ３０分、１２時間、２４時間が経過した後、ブドウ糖を１．５ｇ／５ｍＬ／ｋｇ腹腔投与し、０、１０、２０、３０、６０、９０、１２０分に血糖計（ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）を用いて血糖を測定した。
本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の腹腔内の糖負荷検査結果は図７に示した。
図７に示すように、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の投与群はエキセンディン−４の投与群より血糖減少の効果が長らく持続されて血糖減少効果に優れることを確認した。
３−２．糖尿モデルのマウスにおける血糖減少実験
実験動物として９週齢のｄｂ／ｄｂマウスを使用した。実験群を３つの群に分けて各群当たり６匹ずつ割り当てた。９週齢のｄｂ／ｄｂマウスに飼料制限を加えていない状態で、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］とエキセンディン−４をそれぞれ１００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で各実験群のマウスに皮下注射し、試験物質投与０、１、３、６、２４、４３、４８、５２時間経過の後に血糖計（ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）を用いて血糖を測定した。
本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］が糖尿モデルのマウスにおいて血糖減少に及ぼす影響を示す結果は図８に示した。
図８に示すように、エキセンディン−４投与群は２４時間以後の血糖が対照群と類似であったが、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］投与群は２４時間後にも血糖が低く維持されて血糖減少の効果が長らく持続された。
【００５５】
実験例４：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の細胞内活性実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性
マウスリンパ腫細胞（ＮＢ２ ｃｅｌｌ）は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＨＳ(Horse serum)、１０％ＦＢＳ、２−メルカプトエタノールと抗生剤を含む培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。実験に使用するＮＢ２細胞を使用する２４時間前に、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＨＳが入っている培地に入れて培養した。培養２４時間後、ＮＢ２細胞を１×ＤＰＢＳ(Dulbecco's Phosphate buffered Saline)で１回洗浄した。その後、５％ＨＳ組成のＲＰＭＩ１６４０培地に細胞数が２×１０４／１００μＬ／ｗｅｌｌ状態になるように準備して９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）にそれぞれ１００μＬずつ分注し、濃度別に希釈した試料をウェルに２０μＬずつ接種させ、５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養させた。次いで、ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を９６ウェルプレートにウェル当たり２０μＬずつ入れて５％ＣＯ２、３７℃の培養器で３時間反応させた後、１０％ＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)を２０μＬずつ加えて反応を終了した。吸光度はＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、米国）を用いて４９０ｎｍで測定した。ＭＴＳ検索法で得られた吸光度の値で５０％の細胞が生き残るようにした薬物の濃度をＥＣ５０(50% effective concentration)に決定した。
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性の分析結果は表１および図９に示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１および図９に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］のＥＣ５０値は、大きい差異がないため、お互い類似であった。よって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性ＥＣ５０はアルファ−１アンチトリプシンのアミノ酸変異に関係なくお互い類似であるということを確認することができた。
２．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性
マウス骨髄亜細胞（Ｍｕｒｉｎｅ ｍｙｅｌｏｂｌｓａｔｉｃ ＮＦＳ−６０細胞）は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳ ｍｏｕｓｅＩＬ−３と抗生剤を含む培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後、マウス骨髄亜細胞を用いて前記１の方法と同様に行って吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＭＴＳ検索法で得られた吸光度の値で５０％の細胞を生き残るようにした薬物の濃度をＥＣ５０に決定した。
本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性の分析結果は表２および図１０に示した。
【００５８】
【表２】
【００５９】
表２および図１０に示すように、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］のＥＣ５０値は、大きい差異がないため、お互い類似であった。よって、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性ＥＣ５０は、アルファ−１アンチトリプシンのアミノ酸変異に関係なくお互い類似であることを確認することができた。
【００６０】
実験例５：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体のトリプシン活性の抑制比較実験
本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のトリプシン活性の抑制効果を確認するために、下記のとおり実験を行った。
前記の実施例１で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］と前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をそれぞれトリプシンと混ぜた。この際、トリプシンと融合体の濃度は１０ｎＭであり、１時間常温で反応させた後、基質であるＮ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ、米国）を０．２ｍＭとなるように加えて４０５ｎｍで吸光度の変化を測定した。トリプシンの酵素ｕｎｉｔは１分当たり吸光度０．００１を変化させる基質濃度に設定し、酵素活性はｕｎｉｔｓ／ｍｇトリプシンで計算した。対照群としてはトリプシンを使用した。
結果は図１１に示した。
図１１に示すように、トリプシンとアルファ−１アンチトリプシンのＫａ(association constant)値を計算した結果、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］のＫａ値は約７．５×１０８Ｍ−１であり、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のＫａ値は約８．０×１０６Ｍ−１であった。前述したように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性が優れ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性が低く現れることにより、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することによって体内半減期が増加することがアルファ−１アンチトリプシンの固有性質によるものではないことが分かった。
【００６１】
実験例６：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体のヒト好中球エラスターゼ活性の抑制比較実験
本発明に係る天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］とヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のヒト好中球エラスターゼ活性の抑制効果を確認するために、下記のとおり実験を行った。
前記の実施例１で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］と前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をそれぞれヒト好中球エラスターゼと混ぜた。この際、エラスターゼと融合体の濃度は４０ｎＭであり、１時間常温で反応させた後、基質であるＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ｐＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，米国）を１ｍＭとなるように加えて４０５ｎｍで吸光度の変化を測定した。ヒト好中球エラスターゼの酵素ｕｎｉｔは１分当たり吸光度０．００１を変化させる基質濃度に設定し、酵素活性はｕｎｉｔｓ／ｍｇトリプシンで計算した。
結果は図１２に示した。
図１２に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］は、ヒト好中球エラスターゼをほぼ１００％抑制させ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ」のＫａ値は約１．４×１０７Ｍ−１であった。前述したように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が優れ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が低く現れることにより、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することによって体内半減期が増加することはアルファ−１アンチトリプシンの固有性質によるものではないことが分かった。
【００６２】
実験例７：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の電気泳動実験
本発明に係る天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の糖化部位の追加による分子量の変化を調べるために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験を行った。
結果は図１３に示した。
図１３に示すように、糖化部位の追加のない天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］に比べて糖化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ）が追加されたヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、タンパク質染色帯が分子量の高い方にさらに広がって現れ、追加糖化の部位がＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのアミノ酸の配列を有するヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の場合は、分子量の増加をさらに明確に確認することができた。よって、本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］とヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］から糖化部位の追加による分子量の変化を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、体内持続性を維持することによって血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、タンパク質またはペプチド薬物の持続性製剤の開発に有用に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法に関することである。
【背景技術】
【０００２】
既存のタンパク質およびペプチド医薬品は、一般化学合成医薬が提供していない治療効果を示し、優れた効能を発揮することにより、医薬治療剤分野で重要な領域を占めている。例えば、遺伝子組み換えのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、recombinant human growth hormone）は成長ホルモン欠乏症の効果的な治療剤として唯一に使われており、遺伝子組み換えの赤血球促進因子（ＥＰＯ、recombinant human erythropoietin）は腎臓異常による貧血患者の赤血球濃度を上昇させる薬として使われており、遺伝子の組み換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、recombinant granulocyte colony stimulating hormone）は化学的治療を受ける癌患者の白血球を増加させる唯一の薬として使われている。この他にも、人体に存在する様々な種類のサイトカイン(cytokine)、ホルモン、ペプチドなどが、代替治療剤のない場合に唯一の治療剤として広範囲に使われている。
【０００３】
ところが、これらのタンパク質またはペプチド治療剤は、体内で優れた治療効果を発揮するが、一般的に血液内の加水分解酵素によって分解されて注射後に治療効果が直ちに消失してしまうか、或いは腎臓または肝を通じて容易に体内で除去されるため、短い半減期を持っている。よって、これらのタンパク質またはペプチド治療剤は、体内で一定の血中濃度および力価を維持するためには頻繁に注射を行わなければならないという脆弱点を持っている。タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の頻繁な注射は注射の恐怖心や注射時の通症など患者の薬物順応度を減少させ、長期間の治療を要する場合には制限的に使用されるため治療効果も低下するという欠点がある。
【０００４】
したがって、タンパク質／ペプチド薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長らく維持するための研究が引き続き行われてきた。
【０００５】
このような研究の一例として、タンパク質またはペプチドを体内で自然分解させるポリマーを用いて封入した後、皮下または筋肉を注射し、体内で徐々に放出させる徐放型(sustained release)治療剤が開発された(M. Chasin & R. Langer, et al., Biodegradable polymer as drug delivery system, Marcel Dekker (1990); J. Heller, et al., Adv. Drug Del Rev., 10, 163 (1993))。生体内で分解されるポリマーとしてはＰＬＧＡ(poly(lactic-co-glycolic acid))が最も多く使用され、前記徐放型治療剤の代表的な例としてはＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤(agonist)のペプチドを徐放性ペプチドとして製造した製品があり、この製品は１ヶ月または３ヶ月以上体内でペプチドを放出することもある。また、このような研究は分子量の大きいタンパク質にも適用された。その一例として、米国登録特許第６，５００，４４８号には生分解性高分子と金属イオンを通してヒト成長ホルモンの徐放性微細粒子を製造する技術について記載されている。韓国登録特許第１０−０２３６７７１号および同第１０−０３２９３３６号には組み換えヒト成長ホルモンを体内で分解させるヒアルロン酸を用いたタンパク質薬物の徐放性微細粒子剤形について記載されている。
【０００６】
しかし、生体分解性ポリマーを用いた徐放型治療剤は、アミノ酸の数が少ない分子量を有するペプチドではある程度成功を得たが、分子量の大きいタンパク質治療剤の場合は成功が制限的であった。その理由は、徐放出性封入体を作る過程でタンパク質の変性が容易に起こってアミノ酸の変形がタンパク質の力価を低下させるとともに、人体で望まない免疫反応を引き起こすためである。また、一般的にタンパク質またはペプチド徐放出性封入体の微細粒子の場合、粒子サイズが大きいため、人体に注射するときに注射針の太い注射器を使用しなければならないという欠点があり、製造過程における低い生産収率が経済性の側面で問題となることもある。
【０００７】
上記のような問題点を克服するために、タンパク質またはペプチドの腎臓透過を遅延させるための方法が研究された。一般的に、分子量６０，０００ダルトン以下のタンパク質は、体内で腎臓の濾過体に濾されずそのまま通過する。よって、これより少ない分子量を有するペプチドまたはタンパク質治療剤の大きさを増加させて体内残留時間を増加させることで注射回数を減らそうとする方法が研究された。このような方法によれば、生理活性のあるタンパク質／ペプチドは体内で徐々に放出(sustained release)される形態ではなく、持続性(long-acting)の作用を果たすことができるものと考えられる。
【０００８】
注射回数を減らす方法の中でも最も普遍的に用いられる方法としては、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、以下「ＰＥＧ」という）のように溶解度の高い高分子物質を、タンパク質または薬理活性を持つペプチドの表面に付着させる方法がある。ＰＥＧはタンパク質またはペプチドのアミン基を有するアミノ酸に非特異的に付着し、ＰＥＧの付着されたタンパク質は溶解度が増加し、水溶液の状態で流体力学的体積(hydrodynamic volume)が増加して人体への注射の際に体内に長らく止まるという効果がある(Sada et al., J. Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991)。
【０００９】
最近では、インターフェロンαにＰＥＧを付着させて注射回数を減らそうとする方法が商用化された。また、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ等は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）にＰＥＧを付着させ、週１回注射しても、週３回注射する顆粒球コロニー刺激因子と同一の薬効立証した(Kinstler et al., Pharm Res 12, 1883-1888, 1995)。前記ＰＥＧ−ＧＣＳＦは「Ｎｅｕｌａｓｔ」という商品名で許可を受けて使用されている。
【００１０】
しかし、タンパク質にＰＥＧが付着すると、ＰＥＧのタンパク質の表面にＰＥＧが非特異的に化学結合を成すため、ＰＥＧの付着したタンパク質の部分が受容体との結合を妨害してタンパク質の生体内力価が著しく低下するという問題がある。また、生理活性を起こす部位に非特異的に付着したＰＥＧ−タンパク質を精製過程で分離して生体内の活性低下を最小化するように結合したＰＥＧ−タンパク質を得なければならないという煩わしさがある。この過程で求めるのＰＥＧ−タンパク質結合体を得るためには生産収率が著しく低下するため経済性が低く、特定タンパク質の場合、水溶液状態における安定性が低い場合には、ＰＥＧを付着させようとする試みが失敗することもあった。
【００１１】
また、糖鎖工学(glycoengineering)を用いて注射回数を減らそうとする方法が開発されて商用化された。Ｅｌｌｉｏｔ等は、赤血球促進因子（ＥＰＯ）のアミノ酸を置換する方法を用いて糖鎖を追加する方法について報告した(Nat Biotechnol 21, 414-421, 2003;米国登録特許第７,２１７,６８９号)。糖鎖工学的方法が適用された赤血球促進因子は、「Ａｒａｎｅｓｐ」という商品名で許可を受けて市販されており、糖鎖、シアル酸(sialic acid)および分子量の増加により血流への吸収および代謝と排泄が遅延する効果を持つものとして知られている。ところが、この技術は、生理活性物質の糖鎖付着または追加によって活性低下が誘発するおそれがあり、体内安定性の持続有無が様々なタンパク質に対して検証されておらず、生理活性タンパク質にさらに付着する糖鎖の位置が非常に制限的で、低分子ペプチドには適用させることが容易でないなど、その使用が非常に制限的である。
【００１２】
遺伝工学的な方法が発達して以来、生理活性を持つタンパク質を、大きい分子量を有する他のタンパク質と融合してタンパク質の大きさを増加させる方法が研究された(Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-95, 2009)。例えば、生理活性を持つタンパク質の遺伝子とヒトアルブミン(human albumin)遺伝子との融合後、酵母細胞で発現させた融合タンパク質が知られている（国際出願公開ＷＯ９３／１５１９９号およびＷＯ９３／１５２００号）。前記アルブミンと生理活性タンパク質との融合に関する例としては、顆粒球刺激因子(Halpern et al., Pharm Res 19, 1720-1729, 2002)、ヒト成長ホルモン(Osborn et al., Eur J Pharmacol 456, 149-158, 2002)、グルカゴン様ペプチド−１(Baggio et al., Diabetes 53, 2492-2500, 2004)、インターフェロンα(Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther 303, 540-548, 2002)などが知られている。
【００１３】
遺伝子組み換え方法を用いた融合タンパク質の他の例としてはトランスフェリン(transferrin)融合タンパク質が知られている。例えば、米国登録特許第７，１７６，２７８号では、天然型トランスフェリンおよび糖化しないトランスフェリン変異体とグルカゴン様ペプチド−１などの融合体(fusion molecule)を作って体内半減期を増加させようとした。
【００１４】
一方、免疫グロブリン(Immunoglobulin、Ｉｇ)のＦｃ部分を特定のタンパク質と融合させて体内半減期を増加させる方法が開発された（米国登録特許第５，１１６，９６４号および同第５，６０５，６９０号）。ＴＮＦ−α受容体断片をＩｇＧ１のＦｃ部分と結合させた遺伝子を動物細胞（chinese hamster ovary、ＣＨＯ）で発現させた物質（商品名：Ｅｎｂｒｅｌ）は、関節リウマチ治療剤であって、米国ＦＤＡの許可を受けて現在治療剤として使われている。また、Ｗａｎｇ（Qinghua Wang：ＷＯ２００７／０１２１８８）は、体内半減期の短い生理活性ペプチドＧＬＰ−１（ｔ１／２＜２分）またはエキセンディン−４をＩｇのＦｃ部分と融合体(fusion molecule)を作って体内半減期を増加させようとした。
【００１５】
このように、免疫グロブリンＦｃは、融合タンパク質のキャリアとして多く用いられているが、ＩｇＧ Ｆｃが有する抗体依存性細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity、ＡＤＣＣ)または補体依存性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ)効果はそのまま維持する。よって、生理活性物質とＦｃとを融合した物質を人体に投与する場合、単純な体内半減期を維持させようとする目的の他にも複雑な免疫反応に露出されるうえ、長期反復投与の際に所望しない抗体を生成させることもある。従って、Ｆｃの融合された前記の方法は使用が制限的になるしかない。
【００１６】
また、韓国登録特許第１０−０７２５３１５号には、免疫グロブリン断片を用いたタンパク質結合体およびその製造方法、すなわち生理活性を有するタンパク質とＦｃ部分をＰＥＧで連結させて体内半減期を増加させる方法について記載されている。前記の方法の場合、生理活性タンパク質−ＰＥＧ−Ｆｃの構造を持つ「タンパク質結合体」は、薬物動力学調査において構造が変形していない生理活性タンパク質よりさらに長い体内半減期を持つことを示した。ところが、前記の「タンパク質結合体」も２つの生理活性タンパク質とＦｃをＰＥＧに化学反応によって連結させるという点で、ＰＥＧ融合タンパク質の製造の際に発生しうる問題が常存する。
【００１７】
免疫グロブリンを用いた他の例としては、ＩｇＧ抗体全体分子と低分子化合物を化学的に連結させてペプチド薬物の体内安定性を増加させようとした(Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5396-5400, 2003, Doppalapudi et al., Bioorg & Med Chem 17, 501-506, 2007)。ところが、「ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ」と命名されたこの技術は、生理活性タンパク質などの分子量が大きいタンパク質には使用することができず、また、前記Ｆｃ融合タンパク質とＰＥＧタンパク質の製造の際に発生する問題点によりその使用が制限的である。
【００１８】
上述のように、生理活性タンパク質治療剤またはペプチド治療剤に高分子を融合させる様々な方法が試みられてきたが、これらの方法は、特定の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドと結合させる場合、体内持続時間が医薬用として開発するのには適せず、製造過程で収率が著しく低くて経済性が欠如してしまい、長期間使用の際に体内で不要な免疫反応を引き起こしてタンパク質またはペプチド結合過程で使用される化学物質残基が体内注入の際に毒性を引き起こすなど様々な理由により全ての生理活性タンパク質または生理活性ペプチドに適用することができないという欠点がある。したがって、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドの体内活性減少を最小化しながら血中半減期を延長させることが可能な新規のタンパク質またはペプチド融合体に対する開発の必要性が要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドの体内活性減少を最小化しながら血中半減期を延長させることが可能なタンパク質またはペプチド融合体について研究したところ、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンもしくはアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて新規なタンパク質またはペプチド融合体を製造し、前記のタンパク質またはペプチド融合体が体内持続性を維持することにより血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質もしくはペプチド融合体、およびこれを用いて体内半減期を増加させる方法を提供しようとする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態グラフを示す図である。
【図２】本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態グラフを示す図である。
【図３】本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態グラフを示す図である。
【図４】本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態グラフを示す図である。
【図５】本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性（脳下垂体が除去されたラットの重量増加）分析結果を示す図である。
【図６】本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性（白血球数の増加）分析結果を示す図である。
【図７】本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の腹腔内糖負荷検査結果を示す図である。
【図８】本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］が糖尿モデルマウスにおける血糖減少への影響を示す図である。
【図９】本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性分析結果を示す図である。
【図１０】本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性分析結果を示す図である。
【図１１】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のトリプシン活性抑制を示す図である。
【図１２】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のヒト好中球エラスターゼ活性抑制を示す図である。
【図１３】本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動遂行結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンと結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体を提供する。
【００２３】
また、本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体を提供する。
【００２４】
また、本発明は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させて、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法を提供する。
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させることを特徴とする。
【００２６】
本発明において、「タンパク質融合(fusion protein/fusion polypeptide)」は、一つ以上の生理活性を有するタンパク質をアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端またはＣ末端に結合させた新規の分子構成を持つタンパク質融合体を意味する。また、「ペプチド融合体(fusion peptide)」は、一つ以上の生理活性を有する低分子量のペプチドをアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端またはＣ末端に結合させた新規の分子構成を持つペプチド融合体を意味する。
【００２７】
前記の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドは、直接またはアミノ酸で構成されたリンカーを用いて、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体に結合できる。
【００２８】
前記の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドとアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体は、遺伝子組み換え技術を用いて結合させることが好ましいが、当業界における公知の架橋剤を用いてアルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に結合させることができる。
【００２９】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質(biological response modifier)およびその受容体、サイトカイン類およびその受容体、酵素類、抗体類、抗体断片類などを含むことができる。具体的には、前記生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄなどを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンおよびその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)およびその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片などを含むが、これに限定されない。
【００３１】
前記のアルファ−１アンチトリプシンは分子量約５０，０００ダルトンの哺乳類の血液内に存在するタンパク質の中の一つであって、血液内濃度は約２ｍｇ／ｍＬに達する主血液タンパク質の中の一つであり(Robin W.C. et al., Nature 298, 329-334, 1982)、アルファ−１プロテアーゼ抑制剤(alpha-1 protease inhibitor)とも呼ばれる。このタンパク質は、タンパク質分解酵素との試験の際に様々な種類のタンパク質分解酵素を抑制する。
【００３２】
しかし、現在知られている疾患に関連した生体内の主な機能は好中球エラスターゼ(neutrophil elastase)の抑制剤として知られている(Beatty et al., J Biol Chem 255, 3931-3934, 1980)。アルファ−１アンチトリプシンが欠乏すると、肺の機能が低下し、深刻な遺伝的疾患を引き起こすこともある。よって、血液内から抽出したアルファ−１アンチトリプシンは、ＦＤＡの許可を経て、プロラスチン(Prolastin)という商品名で肺気腫(emphysema)の治療剤として販売されている。プロラスチンは、通常、６０ｍｇ／ｋｇの用量で１週間の隔で静脈注射によって人体に投与され、人体における安全性および有害性が立証されたタンパク質である。また、アルファ−１アンチトリプシンの体内の半減期は約５〜６日程度であると知られている(Weweres, MD, et al., N. Engl J med 316, 1055-1062, 1987)。従って、人体に過量投与しても安定性などが既に立証されたアルファ−１アンチトリプシンを、生成活性を持つタンパク質またはペプチドと融合して、体内半減期の増加した持続性物質に作ろうとする論理的根拠が提供される。アルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤としての役目や構造などは既によく知られている(Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998)。アルファ−１アンチトリプシンのＰ１（Ｎ末端から３５８番目の位置）アミノ酸はメチオニン基であるが、このタンパク質はトリプシン、キモトリプシン(chymotrpsin)、トロンビンおよびエラスターゼなどの様々なプロテアーゼなどの活性を阻害するものと知られている。また、アルファ−１アンチトリプシンは、自然界に１００余種以上の対立遺伝子(allele)が存在していて表現型(phenotype)はＩＥＦ(isoelectric focusing)の類型によってＡ-Ｚに区分する(Stoller et al., The Lancet, 365, 2225 - 2236, 2005)。これらの中で最も多いＭ対立遺伝子は、正常型でアミノ酸配列変異によってさらにＭ１（Ｖａｌ２１３）、Ｍ１（Ａｌａ２１３）、Ｍ２、Ｍ３のように様々な亜型(subtype)に区分される。よって、本発明に使用されたアルファ−１アンチトリプシンは自然界に存在する特定の亜型であり、他の亜型に対しても同一の効果を得ることができる。
【００３３】
前記のアルファ−１アンチトリプシン変異体は、一つ以上のアミノ酸を変異させて特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagenesis)方法を用いて製造される。例えば、アルファ−１アンチトリプシン変異体における一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする。また、アルファ−１アンチトリプシン変異体における一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含む。前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異したり或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを含む。または、前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したものを含む。すなわち、アルファ−１アンチトリプシン変異体は、アルファ−１アンチトリプシン変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）］、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）］、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）］を含む。
【００３４】
前記のアルファ−１アンチトリプシン変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、Ｎ末端からＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン（Ａｓｎ）」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸の置換による免疫原性の可能性を最小化することができる。
【００３５】
前記のアルファ−１アンチトリプシン二重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させ、３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸の置換による免疫原性の可能性を最小化することができる。
【００３６】
前記のアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体２は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸置換による免疫原性の可能性を最小化することができ、遊離システインによる二重体形成などを除去することができる。
【００３７】
前記アルファ−１アンチトリプシン三重変異体［α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）］は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させ、２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させ、３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させたことを特徴とする。このようなアルファ−１アンチトリプシン変異体は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒの新しいＮ−糖化部位が生成されてアルファ−１アンチトリプシンのプロテアーゼ抑制剤の活性を中和させると同時に、体内注入の際にアミノ酸置換による免疫原性の可能性を最小化することができ、遊離システインによる二重体形成などを除去することができる。
【００３８】
本発明のタンパク質またはペプチド融合体は、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］（配列番号１）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］（配列番号２）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］（配列番号３）、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］（配列番号４）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号５）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号６）、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］（配列番号７）を含む。
【００３９】
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシ融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の血中半減期（ｔ１／２）は固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。
【００４０】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］を注射した、脳下垂体の除去されたラットの場合、体重増加を示し、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］を注射したラットの場合、白血球の数が増加する。また、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］を投与した群は、エキセンディン−４を投与した群より血糖減少効果に優れるうえ、２４時間後にも血糖が低く維持されて血糖減少の効果が長らく持続される。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は効果的に生体内活性が長らく維持されることが分かる。
【００４１】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ]、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性（ＥＣ５０）は、アルファ１−アンチトリプシンおよびアルファ−１アンチトリプシン変異体の種類に関係なく、大きい差なしに類似である。
【００４２】
また、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性およびヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が優位に現れるがヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性およびヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が低く現れる。よって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することにより体内半減期が増加することはアルファ−１アンチトリプシの固有性質によるものではないことが分かる。
【００４３】
上述したように、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、体内持続性を維持することにより血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体はタンパク質またはペプチド薬物の持続性製剤の開発に有用に使用できる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００４５】
実施例１：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体の製造［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］
１．発現ベクターｐＳＮＡＴの製造
ヒト成長ホルモンをアルファ−１アンチトリプシンのＣ末端に融合させて発現するために、アルファ−１アンチトリプシンのみを発現するベクターｐＳＮＡＴを製造した。具体的には、Ｃ末端にヒト成長ホルモンを挿入するためにアルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）を２つのプライマー「ＡＬＴ２１」（配列番号８）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅した。この際、使用されたプライマーＡＬＴ３０は融合されたタンパク質の活性を維持するために柔軟性を極大化するためのリンカーを含んでいる。前記の増幅されたニュークレオチドを末端に存在する２つの制限酵素「ＸｈｏI」と「ＢａｍＨI」で切断し、母ベクターｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）に結合してクローニングした。これをｐＳＮＡＴと命名した。
２．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシンベクターの製造［Ｔ１０９ｗｔ、α１ＡＴ／ｈＧＨ］
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をエンコードするＩＯＨ４５７３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターを母体として、２つのプライマーＤＨ２２（配列番号１０）とＡＬＴ１２（配列番号１１）を用いてＰＣＲでヒト成長ホルモンを増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを末端に存在する２つの制限酵素ＢａｍＨIとＮｏｔIで切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴに結合して発現ベクターＴ１０９ｗｔ（(配列番号１)を製造した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０２ｗｔ）の発現
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて、前記２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）の発現を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％ＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)と抗生剤を含むＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Media)に５％ＣＯ２と３７℃の条件で培養して維持した。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を導入する１日前、１００ｍｍの培養皿に細胞を１×１０６濃度で接種して培養した後、ＦＢＳと抗生剤のない８００μＬのＤＭＥＭと５μｇのヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を混合して常温で１分間維持した後、２０μｇのＰＥＩ(Polyethylenimine, linear, Polysciences Inc(Cat. No:23966, MW〜25000))と混合して１０〜１５分間常温で放置した。この際、１日前に培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培養液６ｍＬのＤＭＥＭを添加した。１０〜１５分後、常温に放置したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）をこの培養皿に添加した。翌ＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳのないＩＭＤＭ（Ｃａｔ. Ｎｏ１２２００−０２８、Ｇｉｂｃｏ）(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培地を添加してタンパク質の発現を確認した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）の精製
前記３によってチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）で発現したＴ１０９ｗｔタンパク質を下記のとおり精製した。具体的には、細胞培養液で分泌されたヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体（Ｔ１０９ｗｔ）を精製するために、培養液を遠心分離して細胞を除去した後、上澄み液のみを取った。細胞上澄み液を平衡緩衝溶液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で希釈し、平衡緩衝溶液で平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入した後、平衡緩衝溶液で十分に洗浄してから塩の濃度を増加（０〜４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）させて溶出した。溶出された前記のタンパク質溶液に塩を加えて、平衡化されているフェニル−セファロース(Phenyl-Sepharose)（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）カラムに注入した後、平衡緩衝溶液で十分に洗浄し、塩の濃度を減少（２〜０Ｍ ＮＡＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ６．８）させて溶出した。前記の溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を用いて濃縮し、高純度で精製されたＴ１０９ｗｔタンパク質を得た。
【００４６】
実施例２：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体の製造［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］
１．アルファ−１アンチトリプシン変異体の製造（ｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクター
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシンの活性を減少させるために、アルファ−１アンチトリプシン変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）をＰＣＲで増幅し、ｙＴ＆ＡベクターにクローニングしてｐＤＨＴ３ベクターを製造した。その後、２つのプライマーＡＬＴ１（配列番号１２）およびＡＬＴ２（配列番号１３）と変異体生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ II Ｃａｔ Ｎｏ．２００５２３−５）を用いて、アルファ−１アンチトリプシン活性に影響を与える、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮの製造
ヒト成長ホルモンを、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン変異体のＣ末端にヒト成長ホルモンを挿入するために、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３Ｎを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＥｃｏＲV」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮと命名した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ１０９、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］
前記の実施例１の２と同一の方法で増幅されたヒト成長ホルモンヌクレオチドを、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮに結合し、発現ベクターＴ１０９（配列番号２）を製造した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の発現を確認した。
５．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ１０９）を精製した。
【００４７】
実施例３：ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体の製造［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］
１．アルファ−１アンチトリプシン二重変異体の製造（ｐＤＨＴ３ＮＴクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシン変異体の糖化の均質性のために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ８２（配列番号１５）およびＡＬＴ８３（配列番号１６）と変異体生成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＥＺＣｈａｎｇｅ Ｃａｔ Ｎｏ．ＥＭ０２０）を用いて３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＴクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＴの製造
ヒト成長ホルモンを、糖化の均質性を有しながら活性が減少したアルファ−１アンチトリプシン二重変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＴベクターを製造した。
具体的には、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体のＣ末端にヒト成長ホルモンを挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＴを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＥｃｏＲV」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＴと命名した。
３．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ１０９Ｔ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］
前記実施例１の２と同一の方法で増幅されたヒト成長ホルモンヌクレオチドを、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＴに結合し、発現ベクターＴ１０９Ｔ（配列番号３）を製造した。
４．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の発現を確認した。
５．ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ１０９Ｔ）を精製した。
【００４８】
実施例４：ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の製造［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］
１．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ５０２、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］
ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）をエンコードするＭＨＳ１０１０−９８０５１９１３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマー ＡＬＴ４５（配列番号１７）およびＡＬＴ４９（配列番号１８）を用いてＰＣＲでヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を増幅した。前記の増幅したニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮに結合して発現ベクターＴ５０２（配列番号４）を製造した。
２．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の発現を確認した。
３．ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ５０２）を精製した。
【００４９】
実施例５：顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体の製造［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］
１．アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２の製造（ｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシンの固有な活性を減少させながら、アルファ−１アンチトリプシンのシステインによる二重体形成などのタンパク質変性の可能性を除去するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導したｐＤＨＴ３Ｎクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ５２（配列番号１９）およびＡＬＴ８３（配列番号２０）と変異体生成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅII Ｃａｔ Ｎｏ．２００５２３−５）を用いて、アルファ−１アンチトリプシンに存在する２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＳの製造
顆粒球刺激因子を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＳベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のＣ末端に顆粒球刺激因子を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＳを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＢｓｔＥII」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＳと命名した。
３．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異体２ベクターの製造［Ｔ６０２Ｓ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］
顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をエンコードするＩＨＳ１３８０−９７６５２３４３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマーＡＬＴ５６（配列番号２１）とＡＬＴ７（配列番号２２）を用いてＰＣＲで顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＳに結合して発現ベクターＴ６０２Ｓ（配列番号５）を製造した。
４．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の発現を確認した。
５．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法で顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体（Ｔ６０２Ｓ）を精製した。
【００５０】
実施例６：顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体の製造［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］
１．アルファ−１アンチトリプシン三重変異体の製造（ｐＤＨＴ３ＮＳＴクローニングベクター）
タンパク質治療剤またはペプチド治療剤の融合体の製造に用いられるアルファ−１アンチトリプシン二重変異体の糖化均質性のために、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体を製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンの活性に影響を与えるＰ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」を「アスパラギン」に変異させて活性を減少させ、Ｎ−糖化を誘導しアルファ−１アンチトリプシンのシステインによる二重体形成などのタンパク質変性の可能性を除去するために、２３２番目のアミノ酸「システイン」を「セリン」に変異させたアルファ−１アンチトリプシン二重変異体２のｐＤＨＴ３ＮＳクローニングベクターを母体として、２つのプライマーＡＬＴ８２（配列番号１５）およびＡＬＴ８３（配列番号１６）と変異体生成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＥＺｃｈａｎｇｅ Ｃａｔ Ｎｏ．ＥＭ０２０）を用いて３５９番目のアミノ酸「セリン」を「トレオニン」に変異させてｐＤＨＴ３ＮＳＴクローニングベクターを製造した。
２．発現ベクターｐＳＮＡＴＮＳＴの製造
顆粒球刺激因子を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン三重変異体のＣ末端に融合させて発現するために、ｐＳＮＡＴＮＳＴベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体のＣ末端に顆粒球刺激因子を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシン三重変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３ＮＳＴを２つのプライマー「ＡＬＴ１４」（配列番号１４）とＡＬＴ３０（配列番号９）を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＳＮＡＴと２つの制限酵素「ＢｓｔＥII」と「ＢａｍＨI」を用いてクローニングした。これをｐＳＮＡＴＮＳＴと命名した。
３．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異体ベクターの製造［Ｔ６０２ＳＴ、α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］
顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）をエンコードするＩＨＳ１３８０−９７６５２３４３（Ｏｐｅｎ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ベクターを母体とし、２つのプライマーＡＬＴ５６（配列番号２１）とＡＬＴ５７（配列番号２２）を用いてＰＣＲで顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素「ＢａｍＨI」と「ＮｏｔI」で切断し、ＢａｍＨI／ＮｏｔI切断部を持っているｐＳＮＡＴＮＳＴに結合して発現ベクターＴ６０２ＳＴ（配列番号６）を製造した。
４．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の発現を確認した。
５．顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法で顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体（Ｔ６０２ＳＴ）を精製した。
【００５１】
実施例７：エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の製造［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］
１．発現ベクターｐＳＣＡＴの製造
エキセンディン−４をアルファ−１アンチトリプシンのＮ末端に融合させて発現するために、ｐＳＣＡＴベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシンのＮ末端にエキセンディン−４を挿入するために、アルファ−１アンチトリプシンをコードするベクターｈＭＵ００１４４８（ＫＲＩＢＢ）を２つのプライマーＡＬＴ２１（配列番号８）とＡＬＴ５（配列番号２３）を用いてＰＣＲで増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素ＸｈｏIとＮｏｔIで切断し、母ベクターｐＳＧＨＶ０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２８５１８３）に結合してクローニングした。これをｐＳＣＡＴと命名した。
２．発現ベクターｐＳＣＡＴＮの製造
エキセンディン−４を、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端に融合させて発現するために、ｐＳＣＡＴＮベクターを製造した。具体的には、アルファ−１アンチトリプシン変異体のＮ末端にエキセネィン−４を挿入するために、活性の減少したアルファ−１アンチトリプシン変異体をコードするベクターｐＤＨＴ３Ｎを２つの制限酵素ＥｃｏＲVとＮｏｔIを用いてｐＳＣＡＴとクローニングした。これをｐＳＣＡＴＮと命名した。
３．エキセンディン−４の製造
エキセンディン−４をエンコードするポリヌクレオチドを製造するために、ＤＨ１５（ｓｅｎｓｅ ｃｏｄｏｎ、配列番号２４）とＤＨ１６（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｃｏｄｏｎ、配列番号２５）を用いてＰＣＲで増幅した。
４．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異体ベクターの製造［Ｔ３０４、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］
エキセンディン−４をエンコードするポリヌクレオチドは、前記３で製造されたものを鋳型として、２つのプライマーＡＬＴ４４（配列番号２６）とＡＬＴ４１（配列番号２７）を用いてＰＣＲで増幅した。前記の増幅されたニュークレオチドを、末端に存在する２つの制限酵素ＸｈｏIとＢａｍＨIで切断し、ＸｈｏIとＢａｍＨI切断部を持っているｐＳＣＡＴＮに結合してエキセンディン−４とアルファ−１アンチトリプシン変異体ベクター（Ｔ３０４、配列番号７）を製造した。
５．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の発現
前記の実施例１の３と同一の方法でチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を用いてエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の発現を確認した。
６．エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の精製
前記の実施例１の４と同一の方法でエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）を精製した。
【００５２】
実験例１：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の酵素免疫分析法
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の分析のために、下記のとおり酵素免疫分析法を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／α−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の酵素免疫分析法
ヒト成長ホルモンに対するモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、フィンランド）をリン酸塩緩衝溶液に１〜５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して１００μＬを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）に分注した後、常温で１５〜１８時間放置した。ウェルプレートに付着せずに残っている抗体を除去した後、１％牛血清アルブミンが溶解されたリン酸塩緩衝溶液２５０μＬを分注して常温で２時間放置させ、洗浄溶液（０．０５％ツイン２０、リン酸塩緩衝溶液）で３回洗浄した後、溶液を除去した。試料は１％牛血清アルブミンの溶解されたリン酸塩緩衝液で希釈し、９６ウェルプレートに添加して常温で２時間反応させた。９６ウェルプレートを洗浄溶液で５回洗浄した後、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を用いて接合させたヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体を希釈溶液で希釈して９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注した。次いで、プレートを常温で２時間反応させた後、洗浄溶液で５回洗浄し、しかる後に、ストレプタビジン−ＨＲＰ溶液を加えて常温で３０分間反応させた。洗浄溶液で５回洗浄し、ＴＭＢ（３，３'，５，５'−テトラメチルベンジディン）と過酸化水素水発色溶液１００μＬを各ウェルに添加した後、暗所で３０分間反応させた。１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに添加して反応を終了させ、ＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、米国）で４５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料の定量値は標準物質に対する標準曲線を作成した後、回帰分析によって求めた。
２．ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の酵素免疫分析法
ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体の酵素免疫分析法は、Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ（オーストリア）社のＨｕｍａｎ ＩＦＮ−α Ｍａｔｃｈｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒｓ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡの抗体を使用した。１０μｇ／ｍＬのＩＦＮ−α抗体を前記１の方法によってコートおよび遮断し、試料は希釈の後に常温で２時間シェーキングして反応させ、Ａｎｔｉ−ＩＦＮ−α−ＨＲＰ接合体は５０μＬを用いて常温で２時間シェーキングして反応させた。以後の過程は前記１の方法によって行った。
３．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の酵素免疫分析法
前記１でヒト成長ホルモン抗体の代わりに顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対するモノクローナル抗体（ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）をリン酸塩緩衝溶液に１〜５μｇ／ｍＬの濃度で希釈して使用し、ヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体の代わりに顆粒球刺激因子ポリクローナル抗体−ビオチン接合体（ＲＮＤ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用したものを除外しては、前記１の方法によって行った。
４．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の酵素免疫分析法
エキセンディン−４の場合、前記１でヒト成長ホルモンの代わりにエキセンディン−４に対するポリクローナル抗体（ペプトロン、韓国）をリン酸塩緩衝溶液に５〜１０μｇ／ｍＬの濃度で希釈して使用し、ヒト成長ホルモンモノクローナル抗体−ビオチン接合体の代わにエキセンディン−４モノクローナル抗体−ビオチン接合体を使用したものを除外しては、前記１と同様の過程を行った。
エキセンディン−４／α−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）の場合、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）をＦｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、米国）と混ぜてラットに注射して抗血清を生成させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、米国）を用いて精製した。前記の精製された抗体をリン酸緩衝溶液に１０〜２０μＬ／ｍＬの濃度で希釈して９６ウェルプレートにコートし、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を用いて接合させたエキセンディン−４／アルファ−１のアンチトリプシン変異融合体（Ｔ３０４）ポリクローナル抗体−ビオチン接合体を用いて前記１の方法によって行った。試料反応と接合体反応はプレートをシェーキングして行った。
【００５３】
実験例２：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の薬物動態実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の薬物動態を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。ヒト成長ホルモン投与群には３匹を割り当て、残りの融合体投与群にはそれぞれ５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例１〜３で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］をそれぞれラットｋｇ当たり７２０μｇの投与量で皮下注射した。希釈液はリン酸塩緩衝溶液を使用した。０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群では、ヒト成長ホルモンＳｃｉｔｒｏｐｉｎ（ＳｃｉＧｅｎ、シンガフォル）をラットｋｇ当たり２００μｇの投与量で皮下注射し、希釈液としてリン酸塩緩衝溶液を使用し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の薬物動態グラフは図１に示した。
図１に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．３時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は８時間であった。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．４時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２時間であった。ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］は、血中半減期（ｔ１／２）が４．９時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２．８時間であった。これに対し、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、血中半減期（ｔ１／２）が０．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１時間であった。よって、本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］は、ヒト成長ホルモンに比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
２．ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、ヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。各群当たり５匹ずつ割り当てた。一つの実験群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例４で製造したヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］をラットｋｇ当たり２００μｇの投与量で皮下注射し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４、３０、４８、７２、９６時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群として、ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ−α、インターマックスアルファ、ＬＧ生命科学）を用いてラットｋｇ当たり６０μｇの投与量で皮下注射し、０、０．３３、１、２、５、８、１２、１８、２４時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］の薬物動態グラフは図２に示した。
図２に示すように、本発明のヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］は、血中半減期（ｔ１／２）が１８．５時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１２時間であった。ヒトインターフェロンαは、血中半減期（ｔ１／２）が３．４時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１．４時間であった。よって、本発明に係るヒトインターフェロンα／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］は、ヒトインターフェロンαに比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
３．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。顆粒球刺激因子投与群には３匹を割り当て、残りの融合体投与群にはそれぞれ５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例５〜６で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（ＰＰ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をそれぞれラットｋｇ当たり３４０μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群では、顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｃｉｎ、第一薬品（株））を用いてラットｋｇ当たり１００μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１８、２４、３０、４８時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の薬物動態グラフは図３に示した。
図３に示すように、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、血中半減期（ｔ１／２）が５．１時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１３．６時間であった。顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、血中半減期（ｔ１／２）が４．５時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１６時間であった。これに対し、顆粒球刺激因子は、血中半減期（ｔ１／２）が１．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１．８時間であった。よって、本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、顆粒球刺激因子に比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
４．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。各群当たり５匹ずつ割り当てた。一つの実験群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］をラットｋｇ当たり５２０μｇの投与量で皮下注射し、０、１、２、４、８、１２、１６、２４、３０、４８、７２時間の後に採血して遠心分離した後、血清を得た。対照群としては、エキセンディン−４を用いてラットｋｇ当たり４０μｇの投与量で皮下注射し、０、１０、２０、３０、４０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０分の後にヘパリンの処理されたチューブに採血して遠心分離を行った後、血清を得た。各試料に対しては前記の実験例１の酵素免疫分析方法を用いて分析した。
本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の薬物動態グラフは図４に示した。
図４に示すように、本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、血中半減期（ｔ１／２）が１９．１時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は１０．４時間であったが、これに対し、エキセンディン−４は、血中半減期（ｔ１／２）が０．８時間であり、その血中最高濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は０．４時間であった。よって、本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］は、エキセンディン−４に比べて著しく増加した体内安定性を有することを確認することができた。
【００５４】
実験例３：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性
実験動物として脳下垂体の除去されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。実験群を３つの群に分け、各群当たり７匹ずつ割り当てた。各群の脳下垂体の除去されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をラット当たり１８μｇ、ヒト成長ホルモン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＬＧ生命科学）をラット当たり５μｇ、対照群としてリン酸塩緩衝溶液を用いて毎日皮下注射した。注射の後、ラットの重量を毎日測定した。
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］の生体内活性（脳下垂体が除去されたラットの重量増加）分析結果は図５に示した。
図５に示すように、リン酸塩緩衝溶液を注射した脳下垂体の除去されたラットの場合、体重増加が殆ど起こっていないがしかし、ヒト成長ホルモンとヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］を注射した脳下垂体の除去されたラットの場合は、７日目にそれぞれ約１０．２％と９．４％の体重増加を示した。したがって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、ヒト成長ホルモンと同様に、脳下垂体の除去されたラットで効果的に生体内活性を示すことが分かる。
２．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性
実験動物としてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。実験群を５つの群に分け、各群当たり５匹ずつ割り当てた。各群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、前記の実施例５で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（ＰＰ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］をラットｋｇ当たり３４０μｇと１７００μｇ、前記の実施例６で製造した顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をラットｋｇ当たり１７００μｇ、および顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｃｉｎ、第一薬品（株））をラットｋｇ当たり１００μｇの投与量で皮下注射し、実験の３日前、１日、２日、３日、４日、５日目に尾静脈から採血してＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｎｔｒａ１２０）を用いて白血球数を測定した。
本発明に係る顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の生体内活性（白血球数の増加）分析結果は図６に示した。
図６に示すように、顆粒球刺激因子Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ投与群では、白血球数の増加が注射後１日目に最高値に到達した後、２日目からは基底状態に止まったが、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］のラットｋｇ当たり３４０μｍ投与群では白血球数の増加が注射後２日目に最高値に到達した後、３日目から減少した。顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］をそれぞれラットｋｇ当たり１７００μｇ投与群では、白血球数の増加が注射後３日目まで維持されてから４日目から減少した。よって、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］は、顆粒球刺激因子に比べて生体内活性をさらに長らく維持するということを確認することができた。
３．エキセンディン−４、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の生体内活性
本発明に係るエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の生体内活性を確認するために、下記のとおり腹腔内糖負荷検査および糖尿モデルのマウスにおける血糖減少実験を行った。
３−１．腹腔内の糖負荷検査
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに４週間高脂肪の飼料を食餌させて肥満を誘導した。実験開始の１５時間前に絶食させた状態で腹腔内の糖負荷検査を行った。具体的には、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］とエキセンディン−４をそれぞれ１０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量でマウスの腹腔内に単回投与した。試験物質投与の後それぞれ３０分、１２時間、２４時間が経過した後、ブドウ糖を１．５ｇ／５ｍＬ／ｋｇ腹腔投与し、０、１０、２０、３０、６０、９０、１２０分に血糖計（ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）を用いて血糖を測定した。
本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の腹腔内の糖負荷検査結果は図７に示した。
図７に示すように、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］の投与群はエキセンディン−４の投与群より血糖減少の効果が長らく持続されて血糖減少効果に優れることを確認した。
３−２．糖尿モデルのマウスにおける血糖減少実験
実験動物として９週齢のｄｂ／ｄｂマウスを使用した。実験群を３つの群に分けて各群当たり６匹ずつ割り当てた。９週齢のｄｂ／ｄｂマウスに飼料制限を加えていない状態で、前記の実施例７で製造したエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］とエキセンディン−４をそれぞれ１００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で各実験群のマウスに皮下注射し、試験物質投与０、１、３、６、２４、４３、４８、５２時間経過の後に血糖計（ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ、韓国）を用いて血糖を測定した。
本発明のエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］が糖尿モデルのマウスにおいて血糖減少に及ぼす影響を示す結果は図８に示した。
図８に示すように、エキセンディン−４投与群は２４時間以後の血糖が対照群と類似であったが、エキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］投与群は２４時間後にも血糖が低く維持されて血糖減少の効果が長らく持続された。
【００５５】
実験例４：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の細胞内活性実験
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の生体内活性を確認するために、下記のとおり実験を行った。
１．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性
マウスリンパ腫細胞（ＮＢ２ ｃｅｌｌ）は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＨＳ(Horse serum)、１０％ＦＢＳ、２−メルカプトエタノールと抗生剤を含む培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。実験に使用するＮＢ２細胞を使用する２４時間前に、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＨＳが入っている培地に入れて培養した。培養２４時間後、ＮＢ２細胞を１×ＤＰＢＳ(Dulbecco's Phosphate buffered Saline)で１回洗浄した。その後、５％ＨＳ組成のＲＰＭＩ１６４０培地に細胞数が２×１０４／１００μＬ／ｗｅｌｌ状態になるように準備して９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）にそれぞれ１００μＬずつ分注し、濃度別に希釈した試料をウェルに２０μＬずつ接種させ、５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養させた。次いで、ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を９６ウェルプレートにウェル当たり２０μＬずつ入れて５％ＣＯ２、３７℃の培養器で３時間反応させた後、１０％ＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)を２０μＬずつ加えて反応を終了した。吸光度はＶｅｒｓａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、米国）を用いて４９０ｎｍで測定した。ＭＴＳ検索法で得られた吸光度の値で５０％の細胞が生き残るようにした薬物の濃度をＥＣ５０(50% effective concentration)に決定した。
本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性の分析結果は表１および図９に示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
表１および図９に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］のＥＣ５０値は、大きい差異がないため、お互い類似であった。よって、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の細胞内活性ＥＣ５０はアルファ−１アンチトリプシンのアミノ酸変異に関係なくお互い類似であるということを確認することができた。
２．顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性
マウス骨髄亜細胞（Ｍｕｒｉｎｅ ｍｙｅｌｏｂｌｓａｔｉｃ ＮＦＳ−６０細胞）は、ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＢＳ ｍｏｕｓｅＩＬ−３と抗生剤を含む培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その後、マウス骨髄亜細胞を用いて前記１の方法と同様に行って吸光度を４９０ｎｍで測定し、ＭＴＳ検索法で得られた吸光度の値で５０％の細胞を生き残るようにした薬物の濃度をＥＣ５０に決定した。
本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性の分析結果は表２および図１０に示した。
【００５８】
【表２】
【００５９】
表２および図１０に示すように、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、および顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］のＥＣ５０値は、大きい差異がないため、お互い類似であった。よって、本発明の顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］の細胞内活性ＥＣ５０は、アルファ−１アンチトリプシンのアミノ酸変異に関係なくお互い類似であることを確認することができた。
【００６０】
実験例５：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体のトリプシン活性の抑制比較実験
本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のトリプシン活性の抑制効果を確認するために、下記のとおり実験を行った。
前記の実施例１で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］と前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をそれぞれトリプシンと混ぜた。この際、トリプシンと融合体の濃度は１０ｎＭであり、１時間常温で反応させた後、基質であるＮ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ、米国）を０．２ｍＭとなるように加えて４０５ｎｍで吸光度の変化を測定した。トリプシンの酵素ｕｎｉｔは１分当たり吸光度０．００１を変化させる基質濃度に設定し、酵素活性はｕｎｉｔｓ／ｍｇトリプシンで計算した。対照群としてはトリプシンを使用した。
結果は図１１に示した。
図１１に示すように、トリプシンとアルファ−１アンチトリプシンのＫａ(association constant)値を計算した結果、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］のＫａ値は約７．５×１０８Ｍ−１であり、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のＫａ値は約８．０×１０６Ｍ−１であった。前述したように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性が優れ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はトリプシン抑制活性が低く現れることにより、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することによって体内半減期が増加することがアルファ−１アンチトリプシンの固有性質によるものではないことが分かった。
【００６１】
実験例６：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体のヒト好中球エラスターゼ活性の抑制比較実験
本発明に係る天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］とヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］のヒト好中球エラスターゼ活性の抑制効果を確認するために、下記のとおり実験を行った。
前記の実施例１で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］と前記の実施例２で製造したヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］をそれぞれヒト好中球エラスターゼと混ぜた。この際、エラスターゼと融合体の濃度は４０ｎＭであり、１時間常温で反応させた後、基質であるＭｅＯＳｕｃ−ＡＡＰＶ−ｐＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，米国）を１ｍＭとなるように加えて４０５ｎｍで吸光度の変化を測定した。ヒト好中球エラスターゼの酵素ｕｎｉｔは１分当たり吸光度０．００１を変化させる基質濃度に設定し、酵素活性はｕｎｉｔｓ／ｍｇトリプシンで計算した。
結果は図１２に示した。
図１２に示すように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］は、ヒト好中球エラスターゼをほぼ１００％抑制させ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ」のＫａ値は約１．４×１０７Ｍ−１であった。前述したように、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］はヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が優れ、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］はヒト好中球エラスターゼに対する抑制活性が低く現れることにより、本発明のヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］およびヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］が体内で活性を持続的に維持することによって体内半減期が増加することはアルファ−１アンチトリプシンの固有性質によるものではないことが分かった。
【００６２】
実験例７：本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体の電気泳動実験
本発明に係る天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の糖化部位の追加による分子量の変化を調べるために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験を行った。
結果は図１３に示した。
図１３に示すように、糖化部位の追加のない天然型ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］に比べて糖化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ）が追加されたヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］は、タンパク質染色帯が分子量の高い方にさらに広がって現れ、追加糖化の部位がＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのアミノ酸の配列を有するヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］の場合は、分子量の増加をさらに明確に確認することができた。よって、本発明に係るヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］とヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］から糖化部位の追加による分子量の変化を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、体内持続性を維持することによって血中半減期（Ｔ１／２）が固有の生理活性タンパク質または生理活性ペプチドより著しく増加して体内安定性に優れる。よって、本発明に係るタンパク質またはペプチド融合体は、タンパク質またはペプチド薬物の持続性製剤の開発に有用に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンと結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項２】
前記の融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドが、直接またはアミノ酸からなるリンカーを用いて、アルファ−１アンチトリプシンに結合したことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項３】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質(biological response modifier)そしてその受容体、サイトカイン類それからその受容体、酵素類、抗体類および抗体断片類よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項４】
前記の生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄよりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項５】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンそしてその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)それからその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片よりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項６】
前記の融合体は、配列番号１で表されるヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項７】
生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項８】
前記の融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドが、直接またはアミノ酸からなるリンカーを用いて、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体に結合したことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項９】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質そしてその受容体、サイトカイン類それからその受容体、酵素類、抗体類および抗体断片類よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１０】
前記の生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄよりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１１】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンそしてその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)それからその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片よりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１２】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１３】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含むことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１４】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１５】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１６】
前記の融合体は、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］（配列番号２）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］（配列番号３）、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］（配列番号４）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号５）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号６）、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］（配列番号７）よりなる群から選ばれた１種であることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１７】
生理活性タンパク質／生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項１８】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする、請求項１７に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項１９】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項２０】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１９に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項２１】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１９に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項１】
生理活性タンパク質または生理活性ペプチドをアルファ−１アンチトリプシンと結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項２】
前記の融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドが、直接またはアミノ酸からなるリンカーを用いて、アルファ−１アンチトリプシンに結合したことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項３】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質(biological response modifier)そしてその受容体、サイトカイン類それからその受容体、酵素類、抗体類および抗体断片類よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項４】
前記の生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄよりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項５】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンそしてその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)それからその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片よりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項６】
前記の融合体は、配列番号１で表されるヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン融合体［Ｔ１０９ｗｔ：α１ＡＴ／ｈＧＨ］であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項７】
生理活性タンパク質または生理活性ペプチドを、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期が増加したタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項８】
前記の融合体は、生理活性タンパク質または生理活性ペプチドが、直接またはアミノ酸からなるリンカーを用いて、一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体に結合したことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項９】
前記の生理活性タンパク質は、ホルモン類およびその受容体、生物学的反応調節物質そしてその受容体、サイトカイン類それからその受容体、酵素類、抗体類および抗体断片類よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１０】
前記の生理活性タンパク質は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インスリン、卵胞 刺激ホルモン(follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ)、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン(human chorionic gonadotropin)、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone、ＰＴＨ)、赤血球促進因子（ＥＰＯ）、血小板生成促進因子（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、組織プラスミノゲン活性体(tissue plasminogen activator)、血液凝固因子VII、VIIα、Ｄ、IX、ｈＢＭＰ２(human bone morphogenic protein 2)、ＫＧＦ(keratinocyte growth factor)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、α−ガラクトシダーゼＡ(α-galactosidase A)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(α-L-iduronidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、ラクターゼ(lactase)、アデノシン・デアミナーゼ(adenosine deaminase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ (imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、ウリカーゼ(uricase)、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)、スーパーオキシドジスムターゼ (superoxide dismutase)、ボトルリウム毒素、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)、Ｌ−アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｄよりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１１】
前記の生理活性ペプチドは、グルカゴン様ペプチド−１(glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ−１)およびその類似体、エキセンディンそしてその類似体、ソマトスタチン(somatostatin)それからその類似体、ＬＨＲＨ(luteinizing hormone-releasing hormone)作用剤および拮抗剤、副腎皮質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone)、成長ホルモン放出ホルモン(growth hormone-releasing hormone)、オキシトシン(oxytocin)、サイモシンアルファ−１(thymosin alpha-1)、コルチコトロピン放出因子(corticotropin-releasing factor)、カルシトニン(calcitonin)、ビバリルジン(bivalirudin)、バソプレシン類似体(vasopressin analogues)、および生理活性タンパク質の断片よりなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１２】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１３】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含むことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１４】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１５】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１３に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１６】
前記の融合体は、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ１０９：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ｈＧＨ］（配列番号２）、ヒト成長ホルモン／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ１０９Ｔ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｓ３５９Ｔ）／ｈＧＨ］（配列番号３）、ヒトインターフェロンα／アルファ１−アンチトリプシン変異融合体［Ｔ５０２：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）／ＩＦＮ−α］（配列番号４）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン二重変異融合体［Ｔ６０２Ｓ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号５）、顆粒球刺激因子／アルファ−１アンチトリプシン三重変異融合体［Ｔ６０２ＳＴ：α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ、Ｃ２３２Ｓ、Ｓ３５９Ｔ）／Ｇ−ＣＳＦ］（配列番号６）、およびエキセンディン−４／アルファ−１アンチトリプシン変異融合体［Ｔ３０４：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４／α１ＡＴ（Ｐ３５７Ｎ）］（配列番号７）よりなる群から選ばれた１種であることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質またはペプチド融合体。
【請求項１７】
生理活性タンパク質／生理活性ペプチドを、アルファ−１アンチトリプシンまたは一つ以上のアミノ酸を変異させたアルファ−１アンチトリプシン変異体と結合させ、体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項１８】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを特徴とする、請求項１７に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項１９】
前記の一つ以上のアミノ酸の変異は、Ｐ２位置である３５７番目のアミノ酸「プロリン」が「アスパラギン」に変異したことを含み、他の位置にある一つ以上のアミノ酸を変異させたことを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項２０】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、或いは２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１９に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【請求項２１】
前記の他の位置にある一つ以上のアミノ酸の変異は、３５９番目のアミノ酸「セリン」が「トレオニン」に変異し、２３２番目のアミノ酸「システイン」が「セリン」に変異したことを特徴とする、請求項１９に記載の体内持続性を維持することにより体内半減期を増加させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５２４０６２（Ｐ２０１２−５２４０６２Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５８３３（Ｐ２０１２−５０５８３３）
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００２５２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３２９０
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５１１２５１７６６）アルテオゼン， インク (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＴＥＯＧＥＮ， ＩＮＣ
【住所又は居所原語表記】２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ Ｇｙｅｏｎｇｂｉｄｏｎｇ， Ｅｘｐｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， ３−１ Ｄｏｒｙｏｎｇ−ｄｏｎｇ， Ｙｕｓｅｏｎｇ−ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３０５−３４０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００２５２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３２９０
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５１１２５１７６６）アルテオゼン， インク (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＴＥＯＧＥＮ， ＩＮＣ
【住所又は居所原語表記】２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ Ｇｙｅｏｎｇｂｉｄｏｎｇ， Ｅｘｐｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， ３−１ Ｄｏｒｙｏｎｇ−ｄｏｎｇ， Ｙｕｓｅｏｎｇ−ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３０５−３４０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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