便検体から細菌類を検出する方法
【課題】従来の方法に比べて迅速に、高い検出感度で、かつより客観的に細菌類を便検体から検出できる方法を提供する。
【解決手段】便検体から細菌類を検出する方法であって、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程を含む方法。
【解決手段】便検体から細菌類を検出する方法であって、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、便検体から細菌類を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
便検体から細菌類を検出する方法が種々開発されている（特許文献１及び２）。従来は、検体中の細菌類を培養によって増殖させてから生化学テストを行うという方法が行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖しうるような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。
【０００３】
しかしながら、このような従来の方法では、（１）培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、（２）検出感度が低い点、及び（３）コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２５３２１６
【特許文献２】特開２００３−２３５５４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の方法に比べて迅速に、高い検出感度で、かつより客観的に細菌類を便検体から検出できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の末、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、二種以上の便から採取された便検体からなる検体（プール検体）を含む溶液中で行うと、予想外にも正確な検出が可能であることを見出した。
【０００７】
本発明はかかる知見に基づき、さらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．
便検体から細菌類を検出する方法であって、
（１）細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む方法。
項２．
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第一次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、項１に記載の方法。
項３．
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第二次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、項２に記載の方法。
項４．
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、項１に記載の方法。
項５．
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種の便から採取される便検体からなる第二次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、項２に記載の方法。
項６．
前記Ｘが、５０〜１００である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．
前記Ｙが、５〜１０である、項６に記載の方法。
項８．
前記Ｚが、１である、項７に記載の方法。
項９．
前記ＰＣＲが、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲである、項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
項１０．
前記細菌類が、サルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を含む、項９に記載の方法。
項１１．
前記細菌類が、さらにカンピロバクター及びノロウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の細菌類を含む、項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、（Ｉ）迅速に、（ＩＩ）良好な検出感度で、かつ（ＩＩＩ）客観性をもって便検体から細菌類を検出することができる。
【０００９】
特に、本発明は、プール検体を用い、かつＰＣＲによって検出するため、（１）迅速に細菌類を検出できる。また、本発明は、ＰＣＲによって検出するため、（２ａ）検出対象の細菌類が休眠状態にあっても検出でき、（２ｂ）検出対象の細菌類がごく微量であっても検出できる。また、本発明は培養工程が不要のため（２ｃ）培養工程において検出対象の細菌類が増殖しないことが原因で検出できないという問題は生じない。さらに本発明は、（３）検出対象の細菌類の有無を、目的のＤＮＡが増幅したか否かで判定するので、客観性をもって細菌類を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】小分けプール検体を便検体として細菌類を検出する本発明の方法を示した模式図である。１０００種の便から採取された便検体を用いて検出率が０．１０％の細菌類を検出する例を示している。この例では、出発検体として１００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用い、第一次小分けプール検体として１０種の便から採取された便検体からなるプール検体を用い、さらに第二次小分けプール検体として１種の便から採取された便検体を用いている。
【図２】１００種の便から採取された便検体からなるプール検体Ａ〜Ｊをそれぞれ出発検体としてサルモネラについての出発検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【図３】図２の出発検出の結果、サルモネラ陽性となったＤ検体を１０種ずつの便検体からなる第一次小分けプール検体Ｄ−１〜Ｄ−１０に小分けし、それぞれについて第一次小分け検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【図４】図３の第一次小分け検出の結果、サルモネラ陽性となったＤ−６検体を１種ずつの便検体からなる第二次小分けプール検体Ｄ−６−１〜Ｄ−６−１０に小分けし、それぞれについて第二次小分け検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、便検体から細菌類を検出する方法であって、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程を含む方法である。
１．便検体
本発明において便検体とは、便から採取された便検体をいう。便検体は、特に限定されないが、例えば便の一部を掻き取ることによって得ることができる。便検体は、検便のために採取されたものを用いることができる。
【００１２】
本発明において便検体とは、哺乳類の便から採取された便検体をいう。哺乳類としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。
【００１３】
本発明は、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、便検体をそのまま懸濁させた溶液中で行うことによっても細菌類を検出することができる。このため、本発明においては、細菌類を検出するにあたり、分離又は精製により便検体から特定の成分を選別する必要はない。したがって、本発明において使用する便検体は、特定の分離又は精製を経たものである必要はないが、特殊な事情がある場合は分離又は精製を経たものであってもよい。
【００１４】
本発明では、便検体としてプール検体を用いる。本発明において、プール検体とは、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるものである。
【００１５】
ここでいうＸ種の便とは、Ｘ種の個体が排泄したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が排泄したＸ種の便であってもよい。Ｘについては、特に限定されないが、検出しようとする細菌類の検出率（１００個の便から採取された便検体のうち、１個の便検体においてその細菌類が検出されるとき、検出率が１％であるとする。）に基づいて最適な数を設定することができる。便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡを標的とするＰＣＲによってサルモネラを検出しようとする場合、サルモネラの検出率は約０．０５％である。この場合、１０００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、サルモネラが検出される確率は、１０００（検体）×０．０５％＝５０％となる。したがって、順次別々のプール検体を入れ替えて検出をすると、２回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。同じ場合に、１００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２０回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。同じ場合に、１０種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２００回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。順次別々のプール検体を入れ替えて検出をする場合、どの程度の確率で目的の細菌類が検出されれば作業を効率的に進めることができるかを考慮して、プール検体に含まれる便検体の種類を決定することができる。通常は、数十回に１回の確率で目的の細菌類が検出されるようにするのが好ましい。
【００１６】
例えば、便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、ｉｎｖＡを標的とするＰＣＲによってサルモネラを検出しようとする場合、５０〜２００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、１０〜４０回に１回の確率でサルモネラを検出できる計算になる。通常であれば検出率をこの程度とするのが好ましいので、この場合は、５０〜２００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いるのが好ましい。
【００１７】
なお、二種以上の細菌類を一度に検出する場合、Ｘをどのように設定すべきかについても、上で説明したのと同様に決定することができる。ただし、検出しようとする細菌類のうちもっとも検出率が高いものを基準に考えるか、もっとも検出率が低いものを基準に考えるか、又は検出しようとする細菌類個々の検出率の平均値を基準に考えるかについては、場合に応じて決定することができる。
【００１８】
また、あまりに多数種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いると、個々の便検体が希釈されすぎてしまい、正確に検出できない場合がある。このため、Ｘは１００以下が好ましい。
２．細菌類
本発明において細菌類とは、特に限定されないが、便中に存在している可能性があり、それと身体の状態との因果関係が知られている、又は疑われている等の理由により、それを検出する何らかの要請が存在するものである。
【００１９】
本発明において細菌類とは、特に限定されないが、例えば、サルモネラ、病原性大腸菌、赤痢菌、カンピロバクター、ノロウイルス、黄色ブドウ球菌、リステリア、セレウス、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ、エルシニア等が挙げられる。病原性大腸菌としては、ベロ毒素産生菌、腸管侵入性大腸菌等が挙げられる。
３．ＰＣＲ
本発明では、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、細菌類を検出する。
【００２０】
細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対とは、細菌類由来ＤＮＡを鋳型（テンプレート）として、その特定の部分領域をＤＮＡ断片として増幅しうるプライマー対であって、当該部分領域の両鎖の５’末端と塩基対を形成する（アニールする）一組のプライマーの対である。
【００２１】
増幅されるＤＮＡ断片の長さは特に限定されないが、例えば２０〜１０００塩基、より好ましくは５０〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。
【００２２】
ＰＣＲによってＤＮＡの特定の部分領域が増幅されれば、検体中に細菌類が存在していると判定できる。
【００２３】
ＤＮＡの特定の部分領域が増幅されたか否かは、特に限定されないが、例えばＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を電気泳動に供すること等によって検出することができる。特に限定されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動の他、キャピラリー電気泳動等によって検出することができる。好ましくは、ＰＣＲによってＤＮＡの特定の部分領域が特異的に増幅（非特異的増幅は除く。）されたことを確認する。
【００２４】
プライマーは、従来公知の方法に従って設計できる。
【００２５】
細菌類由来ＤＮＡとは、細菌類に由来するＤＮＡであって、特に限定されない。検出しようとする細菌類が、さらにいくつかの群に分類される場合、いずれの群も検出できるようにするために、多くの群に共通の遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。
【００２６】
例えば、サルモネラとしては２菌種（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、及びＳ． ｂｏｎｇｏｒｉ）、６亜種、並びに血清型２５０１種が知られている。サルモネラを検出しようとする場合、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は約０．０５％である。
【００２７】
例えば、Ｏ−１５７をはじめとするベロ毒素産生菌としてはベロ毒素としてＶＴ１、並びにＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、及びＶＴ２ｖｐが知られている。ベロ毒素産生菌を検出しようとする場合、ＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうる二種のプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は約０．００２％である。
【００２８】
例えば、赤痢菌としてはＡ〜Ｄ群（Ａ群として１３種血清型；Ｂ群として６種血清型；Ｃ群として１８種血清型；Ｄ１群として１種血清型）が知られている。赤痢菌を検出しようとする場合、病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は０．０００１％以下である。
【００２９】
カンピロバクター属（16菌種、8亜種）のうちＣａｍｐｙｌｏｂａｃｒｅｒ ｊｅｊｕｎｉは食中毒や散発下痢症の原因菌として知られており、cdt 遺伝子をターゲットとしたPCRによって検出される事が報告されている。
【００３０】
ノロウイルスはG1ではG1-SKF/G1-SKR,COG1F/COG1Rを、G2ではG2-SKF/G2-SKR、G2-SKF/G2AL-SKR、COG2F/COG2R、ALPF/COG2R といったプライマーを用いて検出することができる。
【００３１】
ＰＣＲを、便検体を含む溶液中で行う。便検体を含む溶液としては、特に限定されないが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び緩衝液を含む通常のＰＣＲ反応液中に、便検体を混合させたものを用いることができる。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常ＰＣＲに用いられている耐熱性ポリメラーゼの中から適宜選択することができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤ、ＥＸ−Ｔａｑ、ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、並びにそれらの変異体等が挙げられる。
【００３３】
緩衝液としては、特に限定されないが、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリジン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、又はキャプス（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【００３４】
ＰＣＲ反応液中は、必要に応じてその他の成分をさらに配合してもよい。
【００３５】
便検体の混合割合は、適切にＰＣＲが行われればよく特に限定されないが、例えば、１〜１０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。
【００３６】
ＰＣＲにおける温度サイクルは、使用するプライマーに応じて適宜設定することができる。
【００３７】
また、本発明におけるＰＣＲは、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲであってもよい。マルチプレックスＰＣＲとは、複数の標的ＤＮＡ断片を増幅させるためにＰＣＲ反応液中において複数のプライマー対を混合させた状態でＰＣＲを行うものである。緩衝液の成分、プライマーの設計及び濃度、金属塩の選択及び濃度、ＤＮＡポリメラーゼの選択及び濃度、及びｄＮＴＰの濃度、並びに温度サイクル等をはじめとするマルチプレックスＰＣＲの諸条件は、適宜設定することができる。必要であればプライマーの濃度を通常のＰＣＲを行う場合よりも高濃度とする。
４．小分けプール検体を便検体として細菌類を検出する工程
上述のようにＸ種の便から採取された便検体からなるプール検体（出発検体）に対して検出（出発検出という。）を行い、所望のＤＮＡ断片の増幅が確認されることにより細菌類が検出された場合に、Ｘ種の便から適宜選択されたＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体を便検体として用い、この便検体に対してさらに同じ細菌類の検出（第一次小分け検出という。）を行う方法も、本発明に含まれる。
【００３８】
Ｙが２以上である場合であって、かつ第一次小分け検出においても目的の細菌類が検出された場合は、さらに第一次小分けプール検体を構成するＹ種の便から適宜選択されたＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取される便検体からなる第二次小分けプール検体を便検体として用い、この便検体に対してさらに同じ細菌類の検出（第二次小分け検出という。）を行う方法も、本発明に含まれる。
【００３９】
第二次小分け検出の後、同様に第三次以降の小分け検出を行うことができ、これらの方法も本発明に含まれる。
【００４０】
第一次以降の小分け検出においては、細菌類の検出を、出発検出におけるのと同様にＰＣＲで行ってもよいし、生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験によって行ってもよい。
【００４１】
生化学性状試験としては、特に限定されないが、例えば具体的には次のような試験を行うことができる。サルモネラが疑われるコロニーを、ＴＳＩおよびＬＩＭ培地に接種し、37℃、１夜培養後、サルモネラの性状を示したもの（ＴＳＩ：斜面赤色、硫化水素産生、ＬＩＭ:リジン陽性、インドール陰性、培地混濁等）をサルモネラと判定する。その他の細菌類を検出する場合は、これに準じた方法によって試験を行うことができる。
【００４２】
血清凝集試験としては、特に限定されないが、例えば具体的には次のような試験を行うことができる。生化学性状試験でサルモネラと判定された菌をサルモネラ診断用血清を用いＯ抗原の凝集試験を行う。具体的には、市販のＯ群多価血清をスライドグラス上に垂らし、ＴＳＩ斜面上からかきとった菌と混和する。凝集が認められた場合を陽性とする。陽性と判定された菌株は、さらにＯ群の個々の血清について同様の操作を行い、Ｏ群血清型を決定する。その他の細菌類を検出する場合は、これに準じた方法によって試験を行うことができる。
【００４３】
免疫学的試験としては、特に限定されないが、例えば免疫磁性ビーズ法、イムノクロマト法、ELISA法、EIA法等を挙げることができる。
【００４４】
特に限定されないが、例えばＹはＸの５〜２０分の１（具体的には例えば１０分の１）とすることができる。同様に、ＺはＹの５〜２０分の１（具体的には例えば１０分の１）とすることができる。一例として、Ｘが、５０〜１００である場合、Ｙを５〜１０、Ｚを１とすること等が挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１
本発明の方法を用いてヒトの便検体からサルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を検出した。なお、従来技術である塗沫培養法との比較も行った。
１．塗沫培養法
次のようにして行った。採便管内の便をCT-SMAC寒天培地に塗沫し、37℃、20h培養した。培養後コロニーを採取し、生化学的性状試験及び血清凝集試験を行って判定を行った。
２．本発明の方法
（１）プール検体の調製
ヒトの便検体は次のようにして調製した。採便管内の糞便少量を、滅菌水（1mL程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、１００種の便検体を等量ずつ（数μL程度）1本のチューブにプールした。95℃5min熱処理後、遠心上清を検体とした。
採便管
（２）ＰＣＲ
サルモネラを検出するプライマーとして細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００４６】
ベロ毒素産生菌を検出するプライマーとしてＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうる二種のプライマー対を用意した。
【００４７】
赤痢菌を検出するプライマーとして病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００４８】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製．）を使用し、全量を５０μｌとして実施した。５μｌの糞便懸濁溶液と試薬混合物（東洋紡製 Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）−ｐｌｕｓ− ２．５Ｕ、１０ＸＰＣＲ緩衝液５．０μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、各々０．３μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・３０秒の変性工程、５５℃・３０秒のアニーリング工程、７２℃・３０秒の伸長工程のサイクルを４０回繰り返した。なお、その他のＰＣＲ条件は常法通りである（例えば、遺伝子 操作技術マニュアル、医学書院、１９９５年発行を参照）。
（３）検出
（２）で得られたＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動によって検出した。キャピラリー電気泳動はマイクロチップ電気泳動装置MultiNA（島津社製）を使用して行った。
３．結果
従来法である塗沫培養法（１回目）では、サルモネラしか検出できなかった。これに対して、本発明の方法では、サルモネラ由来のｉｎｖＡのみならず、塗沫培養法では検出されなかったベロ毒素産生菌由来のＶＴも検出できた。
【００４９】
そこで、塗沫培養法（２回目）を再度同じ検体群に対して実施したところ、今回はベロ毒素産生菌を検出することができた。
【００５０】
このように、本発明の方法によれば、従来の塗沫培養法と同等の又はより高い感度で細菌類を検出できることが実証された。
実施例２
本発明の方法を用いてヒトの便検体からサルモネラを検出した。陽性率が０．１０％であることが分かっているプール検体を予め用い、出発検体を１００種の便から採取された便検体からなるプール検体、第一次小分けプール検体を１０種の便から採取された便検体からなるプール検体、さらに第二次小分けプール検体を１種の便から採取された便検体からなるプール検体として、出発検出、第一次小分け検出、及び第二次小分け検出を逐次行った。
１．方法
（１）プール検体の調製
ヒトの便検体は次のようにして調製した。採便管内の糞便少量を、滅菌水（1mL程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、１００種の便検体を等量ずつ（数μL程度）1本のチューブにプールした。95℃5min熱処理後、遠心上清を検体とした。
（２）ＰＣＲ
サルモネラを検出するプライマーとして細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００５１】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製．）を使用し、全量を５０μｌとして実施した。５μｌの糞便懸濁溶液と試薬混合物（東洋紡製 Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）−ｐｌｕｓ− ２．５Ｕ、１０ＸＰＣＲ緩衝液５．０μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、各々０．３μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・３０秒の変性工程、５５℃・３０秒のアニーリング工程、７２℃・３０秒の伸長工程のサイクルを４０回繰り返した。なお、その他のＰＣＲ条件は常法通りである（例えば、遺伝子 操作技術マニュアル、医学書院、１９９５年発行を参照）。
（３）検出
（２）で得られたＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動によって検出した。キャピラリー電気泳動は実施例１と同様に行った。
２．結果
検出の結果をそれぞれ図１〜３（出発検出（図１）、第一次小分け検出（図２）、及び第二次小分け検出（図３））に示す。各図中「※」はサルモネラが検出された検体を示している。
【００５２】
出発検出の結果、出発検体Ｄからサルモネラが検出された。続いて第一次小分け検出の結果、一つの第一次小分け検体Ｄ−６からサルモネラが検出された。最後に第二次小分け検出の結果、一つの第二次小分け検体Ｄ−６−１からサルモネラが検出された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、便検体から細菌類を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
便検体から細菌類を検出する方法が種々開発されている（特許文献１及び２）。従来は、検体中の細菌類を培養によって増殖させてから生化学テストを行うという方法が行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖しうるような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。
【０００３】
しかしながら、このような従来の方法では、（１）培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、（２）検出感度が低い点、及び（３）コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２５３２１６
【特許文献２】特開２００３−２３５５４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の方法に比べて迅速に、高い検出感度で、かつより客観的に細菌類を便検体から検出できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の末、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、二種以上の便から採取された便検体からなる検体（プール検体）を含む溶液中で行うと、予想外にも正確な検出が可能であることを見出した。
【０００７】
本発明はかかる知見に基づき、さらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。
項１．
便検体から細菌類を検出する方法であって、
（１）細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む方法。
項２．
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第一次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、項１に記載の方法。
項３．
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第二次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、項２に記載の方法。
項４．
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、項１に記載の方法。
項５．
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種の便から採取される便検体からなる第二次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、項２に記載の方法。
項６．
前記Ｘが、５０〜１００である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．
前記Ｙが、５〜１０である、項６に記載の方法。
項８．
前記Ｚが、１である、項７に記載の方法。
項９．
前記ＰＣＲが、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲである、項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
項１０．
前記細菌類が、サルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を含む、項９に記載の方法。
項１１．
前記細菌類が、さらにカンピロバクター及びノロウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の細菌類を含む、項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって、（Ｉ）迅速に、（ＩＩ）良好な検出感度で、かつ（ＩＩＩ）客観性をもって便検体から細菌類を検出することができる。
【０００９】
特に、本発明は、プール検体を用い、かつＰＣＲによって検出するため、（１）迅速に細菌類を検出できる。また、本発明は、ＰＣＲによって検出するため、（２ａ）検出対象の細菌類が休眠状態にあっても検出でき、（２ｂ）検出対象の細菌類がごく微量であっても検出できる。また、本発明は培養工程が不要のため（２ｃ）培養工程において検出対象の細菌類が増殖しないことが原因で検出できないという問題は生じない。さらに本発明は、（３）検出対象の細菌類の有無を、目的のＤＮＡが増幅したか否かで判定するので、客観性をもって細菌類を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】小分けプール検体を便検体として細菌類を検出する本発明の方法を示した模式図である。１０００種の便から採取された便検体を用いて検出率が０．１０％の細菌類を検出する例を示している。この例では、出発検体として１００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用い、第一次小分けプール検体として１０種の便から採取された便検体からなるプール検体を用い、さらに第二次小分けプール検体として１種の便から採取された便検体を用いている。
【図２】１００種の便から採取された便検体からなるプール検体Ａ〜Ｊをそれぞれ出発検体としてサルモネラについての出発検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【図３】図２の出発検出の結果、サルモネラ陽性となったＤ検体を１０種ずつの便検体からなる第一次小分けプール検体Ｄ−１〜Ｄ−１０に小分けし、それぞれについて第一次小分け検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【図４】図３の第一次小分け検出の結果、サルモネラ陽性となったＤ−６検体を１種ずつの便検体からなる第二次小分けプール検体Ｄ−６−１〜Ｄ−６−１０に小分けし、それぞれについて第二次小分け検出を行った結果を示す、図面に代わる写真である。サルモネラ陽性の検体を「※」で示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、便検体から細菌類を検出する方法であって、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程を含む方法である。
１．便検体
本発明において便検体とは、便から採取された便検体をいう。便検体は、特に限定されないが、例えば便の一部を掻き取ることによって得ることができる。便検体は、検便のために採取されたものを用いることができる。
【００１２】
本発明において便検体とは、哺乳類の便から採取された便検体をいう。哺乳類としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。
【００１３】
本発明は、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、便検体をそのまま懸濁させた溶液中で行うことによっても細菌類を検出することができる。このため、本発明においては、細菌類を検出するにあたり、分離又は精製により便検体から特定の成分を選別する必要はない。したがって、本発明において使用する便検体は、特定の分離又は精製を経たものである必要はないが、特殊な事情がある場合は分離又は精製を経たものであってもよい。
【００１４】
本発明では、便検体としてプール検体を用いる。本発明において、プール検体とは、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるものである。
【００１５】
ここでいうＸ種の便とは、Ｘ種の個体が排泄したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が排泄したＸ種の便であってもよい。Ｘについては、特に限定されないが、検出しようとする細菌類の検出率（１００個の便から採取された便検体のうち、１個の便検体においてその細菌類が検出されるとき、検出率が１％であるとする。）に基づいて最適な数を設定することができる。便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡを標的とするＰＣＲによってサルモネラを検出しようとする場合、サルモネラの検出率は約０．０５％である。この場合、１０００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、サルモネラが検出される確率は、１０００（検体）×０．０５％＝５０％となる。したがって、順次別々のプール検体を入れ替えて検出をすると、２回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。同じ場合に、１００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２０回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。同じ場合に、１０種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２００回に１回の確率でサルモネラが検出されることになる。順次別々のプール検体を入れ替えて検出をする場合、どの程度の確率で目的の細菌類が検出されれば作業を効率的に進めることができるかを考慮して、プール検体に含まれる便検体の種類を決定することができる。通常は、数十回に１回の確率で目的の細菌類が検出されるようにするのが好ましい。
【００１６】
例えば、便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、ｉｎｖＡを標的とするＰＣＲによってサルモネラを検出しようとする場合、５０〜２００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、１０〜４０回に１回の確率でサルモネラを検出できる計算になる。通常であれば検出率をこの程度とするのが好ましいので、この場合は、５０〜２００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いるのが好ましい。
【００１７】
なお、二種以上の細菌類を一度に検出する場合、Ｘをどのように設定すべきかについても、上で説明したのと同様に決定することができる。ただし、検出しようとする細菌類のうちもっとも検出率が高いものを基準に考えるか、もっとも検出率が低いものを基準に考えるか、又は検出しようとする細菌類個々の検出率の平均値を基準に考えるかについては、場合に応じて決定することができる。
【００１８】
また、あまりに多数種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いると、個々の便検体が希釈されすぎてしまい、正確に検出できない場合がある。このため、Ｘは１００以下が好ましい。
２．細菌類
本発明において細菌類とは、特に限定されないが、便中に存在している可能性があり、それと身体の状態との因果関係が知られている、又は疑われている等の理由により、それを検出する何らかの要請が存在するものである。
【００１９】
本発明において細菌類とは、特に限定されないが、例えば、サルモネラ、病原性大腸菌、赤痢菌、カンピロバクター、ノロウイルス、黄色ブドウ球菌、リステリア、セレウス、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ、エルシニア等が挙げられる。病原性大腸菌としては、ベロ毒素産生菌、腸管侵入性大腸菌等が挙げられる。
３．ＰＣＲ
本発明では、細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、細菌類を検出する。
【００２０】
細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対とは、細菌類由来ＤＮＡを鋳型（テンプレート）として、その特定の部分領域をＤＮＡ断片として増幅しうるプライマー対であって、当該部分領域の両鎖の５’末端と塩基対を形成する（アニールする）一組のプライマーの対である。
【００２１】
増幅されるＤＮＡ断片の長さは特に限定されないが、例えば２０〜１０００塩基、より好ましくは５０〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。
【００２２】
ＰＣＲによってＤＮＡの特定の部分領域が増幅されれば、検体中に細菌類が存在していると判定できる。
【００２３】
ＤＮＡの特定の部分領域が増幅されたか否かは、特に限定されないが、例えばＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を電気泳動に供すること等によって検出することができる。特に限定されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動の他、キャピラリー電気泳動等によって検出することができる。好ましくは、ＰＣＲによってＤＮＡの特定の部分領域が特異的に増幅（非特異的増幅は除く。）されたことを確認する。
【００２４】
プライマーは、従来公知の方法に従って設計できる。
【００２５】
細菌類由来ＤＮＡとは、細菌類に由来するＤＮＡであって、特に限定されない。検出しようとする細菌類が、さらにいくつかの群に分類される場合、いずれの群も検出できるようにするために、多くの群に共通の遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。
【００２６】
例えば、サルモネラとしては２菌種（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、及びＳ． ｂｏｎｇｏｒｉ）、６亜種、並びに血清型２５０１種が知られている。サルモネラを検出しようとする場合、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は約０．０５％である。
【００２７】
例えば、Ｏ−１５７をはじめとするベロ毒素産生菌としてはベロ毒素としてＶＴ１、並びにＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、及びＶＴ２ｖｐが知られている。ベロ毒素産生菌を検出しようとする場合、ＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうる二種のプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は約０．００２％である。
【００２８】
例えば、赤痢菌としてはＡ〜Ｄ群（Ａ群として１３種血清型；Ｂ群として６種血清型；Ｃ群として１８種血清型；Ｄ１群として１種血清型）が知られている。赤痢菌を検出しようとする場合、病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用いるのが好ましい。なお、この場合の検出率は０．０００１％以下である。
【００２９】
カンピロバクター属（16菌種、8亜種）のうちＣａｍｐｙｌｏｂａｃｒｅｒ ｊｅｊｕｎｉは食中毒や散発下痢症の原因菌として知られており、cdt 遺伝子をターゲットとしたPCRによって検出される事が報告されている。
【００３０】
ノロウイルスはG1ではG1-SKF/G1-SKR,COG1F/COG1Rを、G2ではG2-SKF/G2-SKR、G2-SKF/G2AL-SKR、COG2F/COG2R、ALPF/COG2R といったプライマーを用いて検出することができる。
【００３１】
ＰＣＲを、便検体を含む溶液中で行う。便検体を含む溶液としては、特に限定されないが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び緩衝液を含む通常のＰＣＲ反応液中に、便検体を混合させたものを用いることができる。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常ＰＣＲに用いられている耐熱性ポリメラーゼの中から適宜選択することができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤ、ＥＸ−Ｔａｑ、ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、並びにそれらの変異体等が挙げられる。
【００３３】
緩衝液としては、特に限定されないが、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリジン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、又はキャプス（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
【００３４】
ＰＣＲ反応液中は、必要に応じてその他の成分をさらに配合してもよい。
【００３５】
便検体の混合割合は、適切にＰＣＲが行われればよく特に限定されないが、例えば、１〜１０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。
【００３６】
ＰＣＲにおける温度サイクルは、使用するプライマーに応じて適宜設定することができる。
【００３７】
また、本発明におけるＰＣＲは、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲであってもよい。マルチプレックスＰＣＲとは、複数の標的ＤＮＡ断片を増幅させるためにＰＣＲ反応液中において複数のプライマー対を混合させた状態でＰＣＲを行うものである。緩衝液の成分、プライマーの設計及び濃度、金属塩の選択及び濃度、ＤＮＡポリメラーゼの選択及び濃度、及びｄＮＴＰの濃度、並びに温度サイクル等をはじめとするマルチプレックスＰＣＲの諸条件は、適宜設定することができる。必要であればプライマーの濃度を通常のＰＣＲを行う場合よりも高濃度とする。
４．小分けプール検体を便検体として細菌類を検出する工程
上述のようにＸ種の便から採取された便検体からなるプール検体（出発検体）に対して検出（出発検出という。）を行い、所望のＤＮＡ断片の増幅が確認されることにより細菌類が検出された場合に、Ｘ種の便から適宜選択されたＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体を便検体として用い、この便検体に対してさらに同じ細菌類の検出（第一次小分け検出という。）を行う方法も、本発明に含まれる。
【００３８】
Ｙが２以上である場合であって、かつ第一次小分け検出においても目的の細菌類が検出された場合は、さらに第一次小分けプール検体を構成するＹ種の便から適宜選択されたＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取される便検体からなる第二次小分けプール検体を便検体として用い、この便検体に対してさらに同じ細菌類の検出（第二次小分け検出という。）を行う方法も、本発明に含まれる。
【００３９】
第二次小分け検出の後、同様に第三次以降の小分け検出を行うことができ、これらの方法も本発明に含まれる。
【００４０】
第一次以降の小分け検出においては、細菌類の検出を、出発検出におけるのと同様にＰＣＲで行ってもよいし、生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験によって行ってもよい。
【００４１】
生化学性状試験としては、特に限定されないが、例えば具体的には次のような試験を行うことができる。サルモネラが疑われるコロニーを、ＴＳＩおよびＬＩＭ培地に接種し、37℃、１夜培養後、サルモネラの性状を示したもの（ＴＳＩ：斜面赤色、硫化水素産生、ＬＩＭ:リジン陽性、インドール陰性、培地混濁等）をサルモネラと判定する。その他の細菌類を検出する場合は、これに準じた方法によって試験を行うことができる。
【００４２】
血清凝集試験としては、特に限定されないが、例えば具体的には次のような試験を行うことができる。生化学性状試験でサルモネラと判定された菌をサルモネラ診断用血清を用いＯ抗原の凝集試験を行う。具体的には、市販のＯ群多価血清をスライドグラス上に垂らし、ＴＳＩ斜面上からかきとった菌と混和する。凝集が認められた場合を陽性とする。陽性と判定された菌株は、さらにＯ群の個々の血清について同様の操作を行い、Ｏ群血清型を決定する。その他の細菌類を検出する場合は、これに準じた方法によって試験を行うことができる。
【００４３】
免疫学的試験としては、特に限定されないが、例えば免疫磁性ビーズ法、イムノクロマト法、ELISA法、EIA法等を挙げることができる。
【００４４】
特に限定されないが、例えばＹはＸの５〜２０分の１（具体的には例えば１０分の１）とすることができる。同様に、ＺはＹの５〜２０分の１（具体的には例えば１０分の１）とすることができる。一例として、Ｘが、５０〜１００である場合、Ｙを５〜１０、Ｚを１とすること等が挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１
本発明の方法を用いてヒトの便検体からサルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を検出した。なお、従来技術である塗沫培養法との比較も行った。
１．塗沫培養法
次のようにして行った。採便管内の便をCT-SMAC寒天培地に塗沫し、37℃、20h培養した。培養後コロニーを採取し、生化学的性状試験及び血清凝集試験を行って判定を行った。
２．本発明の方法
（１）プール検体の調製
ヒトの便検体は次のようにして調製した。採便管内の糞便少量を、滅菌水（1mL程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、１００種の便検体を等量ずつ（数μL程度）1本のチューブにプールした。95℃5min熱処理後、遠心上清を検体とした。
採便管
（２）ＰＣＲ
サルモネラを検出するプライマーとして細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００４６】
ベロ毒素産生菌を検出するプライマーとしてＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうる二種のプライマー対を用意した。
【００４７】
赤痢菌を検出するプライマーとして病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００４８】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製．）を使用し、全量を５０μｌとして実施した。５μｌの糞便懸濁溶液と試薬混合物（東洋紡製 Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）−ｐｌｕｓ− ２．５Ｕ、１０ＸＰＣＲ緩衝液５．０μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、各々０．３μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・３０秒の変性工程、５５℃・３０秒のアニーリング工程、７２℃・３０秒の伸長工程のサイクルを４０回繰り返した。なお、その他のＰＣＲ条件は常法通りである（例えば、遺伝子 操作技術マニュアル、医学書院、１９９５年発行を参照）。
（３）検出
（２）で得られたＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動によって検出した。キャピラリー電気泳動はマイクロチップ電気泳動装置MultiNA（島津社製）を使用して行った。
３．結果
従来法である塗沫培養法（１回目）では、サルモネラしか検出できなかった。これに対して、本発明の方法では、サルモネラ由来のｉｎｖＡのみならず、塗沫培養法では検出されなかったベロ毒素産生菌由来のＶＴも検出できた。
【００４９】
そこで、塗沫培養法（２回目）を再度同じ検体群に対して実施したところ、今回はベロ毒素産生菌を検出することができた。
【００５０】
このように、本発明の方法によれば、従来の塗沫培養法と同等の又はより高い感度で細菌類を検出できることが実証された。
実施例２
本発明の方法を用いてヒトの便検体からサルモネラを検出した。陽性率が０．１０％であることが分かっているプール検体を予め用い、出発検体を１００種の便から採取された便検体からなるプール検体、第一次小分けプール検体を１０種の便から採取された便検体からなるプール検体、さらに第二次小分けプール検体を１種の便から採取された便検体からなるプール検体として、出発検出、第一次小分け検出、及び第二次小分け検出を逐次行った。
１．方法
（１）プール検体の調製
ヒトの便検体は次のようにして調製した。採便管内の糞便少量を、滅菌水（1mL程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、１００種の便検体を等量ずつ（数μL程度）1本のチューブにプールした。95℃5min熱処理後、遠心上清を検体とした。
（２）ＰＣＲ
サルモネラを検出するプライマーとして細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマー対を用意した。
【００５１】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製．）を使用し、全量を５０μｌとして実施した。５μｌの糞便懸濁溶液と試薬混合物（東洋紡製 Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）−ｐｌｕｓ− ２．５Ｕ、１０ＸＰＣＲ緩衝液５．０μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、各々０．３μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・３０秒の変性工程、５５℃・３０秒のアニーリング工程、７２℃・３０秒の伸長工程のサイクルを４０回繰り返した。なお、その他のＰＣＲ条件は常法通りである（例えば、遺伝子 操作技術マニュアル、医学書院、１９９５年発行を参照）。
（３）検出
（２）で得られたＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動によって検出した。キャピラリー電気泳動は実施例１と同様に行った。
２．結果
検出の結果をそれぞれ図１〜３（出発検出（図１）、第一次小分け検出（図２）、及び第二次小分け検出（図３））に示す。各図中「※」はサルモネラが検出された検体を示している。
【００５２】
出発検出の結果、出発検体Ｄからサルモネラが検出された。続いて第一次小分け検出の結果、一つの第一次小分け検体Ｄ−６からサルモネラが検出された。最後に第二次小分け検出の結果、一つの第二次小分け検体Ｄ−６−１からサルモネラが検出された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
便検体から細菌類を検出する方法であって、
（１）細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む方法。
【請求項２】
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第一次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第二次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｘが、５０〜１００である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記Ｙが、５〜１０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｚが、１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲが、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌類が、サルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌類が、さらにカンピロバクター及びノロウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の細菌類を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
便検体から細菌類を検出する方法であって、
（１）細菌類由来ＤＮＡを増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲを、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む方法。
【請求項２】
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種（ＹはＸよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第一次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２−１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（３−１）前記プライマー対を用いたＰＣＲを、前記Ｙ種の便から適宜選択したＺ種（ＺはＹよりも少ない整数を示す。）の便から採取された便検体からなる第二次小分けプール検体を含む溶液中で行う工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（１）においてＤＮＡが増幅された場合に、さらに、
（２−２）生化学性状試験、血清凝集試験、及び免疫学的試験からなる群より選択される少なくとも一種の試験を、前記Ｘ種の便から適宜選択したＹ種の便から採取される便検体からなる第一次小分けプール検体に対して行う工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｘが、５０〜１００である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記Ｙが、５〜１０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｚが、１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲが、二種以上の細菌類に由来するＤＮＡをそれぞれ増幅しうるマルチプレックスＰＣＲである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌類が、サルモネラ、ベロ毒素産生菌、及び赤痢菌を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌類が、さらにカンピロバクター及びノロウイルスからなる群より選択される少なくとも一種の細菌類を含む、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−５０３９１（Ｐ２０１２−５０３９１Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９６４４１（Ｐ２０１０−１９６４４１）
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５０３０８４７９４）株式会社らいふ (9)
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５０３０８４７９４）株式会社らいふ (9)
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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