修飾された抗体を製造する方法
【課題】抗体が有する２以上の特異的結合部位の活性を維持可能な抗体の修飾方法の提供。
【解決手段】第１の特異的結合部位６と特異的に結合する第１保護剤１を表面に有する第１磁性粒子３、第２の特異的結合部位７と特異的に結合する第２保護剤２を表面に有する第２磁性粒子４、および抗体５を混合し、第１の特異的結合部位６および第２の特異的結合部位７を第１保護剤１および第２保護剤２にそれぞれ特異的に結合させる工程、抗体５を修飾物質８によって修飾する工程、解離剤を添加し、第１・第２の特異的結合部位６・７から第１保護剤１および第２保護剤２をそれぞれ解離する工程、磁石を用いて第１磁性粒子３および第２磁性粒子４から抗体５を分離する工程、および分離された抗体５を回収する工程を有する修飾方法により、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能したまま、抗体を修飾する方法。
【解決手段】第１の特異的結合部位６と特異的に結合する第１保護剤１を表面に有する第１磁性粒子３、第２の特異的結合部位７と特異的に結合する第２保護剤２を表面に有する第２磁性粒子４、および抗体５を混合し、第１の特異的結合部位６および第２の特異的結合部位７を第１保護剤１および第２保護剤２にそれぞれ特異的に結合させる工程、抗体５を修飾物質８によって修飾する工程、解離剤を添加し、第１・第２の特異的結合部位６・７から第１保護剤１および第２保護剤２をそれぞれ解離する工程、磁石を用いて第１磁性粒子３および第２磁性粒子４から抗体５を分離する工程、および分離された抗体５を回収する工程を有する修飾方法により、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能したまま、抗体を修飾する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾された抗体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の濃度を測定する従来の方法は、測定しようとする抗体を修飾物質により修飾する工程、次いで当該修飾物質の濃度を電気化学的または光学的に測定する工程を有する。
【０００３】
図４は、測定しようとする抗体を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す。図４では、修飾物質は蛍光物質である。
【０００４】
まず、抗体を含む溶液中に蛍光物質を添加する。すると、蛍光物質は抗体と結合する。ここで、図５に示すように、抗体はＹ文字型を有する。そして、抗体は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域を有する。これら３つの領域は、いずれも「特異的結合部位」として知られている。
【０００５】
２つのＦａｂ領域には抗原が特異的に結合する。しかし、蛍光物質が２つのＦａｂ領域のいずれにも結合した後には、２つのＦａｂ領域のいずれにも抗原は特異的に結合しない。すなわち、そのような抗体は、抗原に対して不活性性を有する。
【０００６】
特許文献１は、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体を排除する方法を開示している。図６は特許文献１に示された方法を示す。まず、抗原は抗体と反応し、複合体を得る。次に、当該複合体に修飾物質が結合する。修飾物質が結合した複合体から抗原が解離される。
【０００７】
この方法では、修飾物質は抗体のＦａｂ領域に結合しない。なぜなら、修飾物質が抗体に結合する時には、抗体のＦａｂ領域は抗原と特異的に結合しているからである。よって、Ｆａｂ領域に修飾物質が全く結合していない抗体が得られ得る。
【０００８】
特許文献１の他、特許文献２〜５は本発明に関連し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平４−３５５３６９号公報
【特許文献２】特開平１−２２４６６４号公報
【特許文献３】特開昭６１−４９６１号公報
【特許文献４】特開昭５２−１５４５１９号公報
【特許文献５】特開２００４−１７７４０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１は、抗体のＦｃ領域の保護を開示も示唆もしていない。特許文献１に開示された方法によれば、Ｆｃ領域が修飾物質によって修飾され、Ｆｃ領域の活性は消失し得る。
【００１１】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、特許文献１に開示された方法にＦｃ領域の保護を加えたフローチャートを示す。
【００１２】
図３（ａ）では、まず、第１の特異的結合部位、すなわちＦａｂ領域を第１保護剤により保護する。次いで、当該Ｆａｂ領域が保護された抗体は修飾物質によって修飾される。このようにして、Ｆａｂ領域に修飾物質が結合していない抗体が得られる。その後、抗体は第１保護剤から解離され、回収される。プロテインＡおよびプロテインＧのような、第２の特異的結合部位、すなわちＦｃ領域と特異的に結合する抗体結合性タンパクを保持する支持体に抗体は供給される。Ｆｃ領域に修飾物質を有さない抗体は、当該支持体に結合する。一方、Ｆｃ領域に修飾物質が結合している抗体は、当該支持体に結合せず、除去される。最後に、支持体に結合した抗体を回収する。ここで、支持体としては、アフィニティーカラム、磁性微粒子、および非磁性微粒子が挙げられる。
【００１３】
しかし、図３（ａ）では、Ｆｃ領域を修飾物質によって修飾された抗体を修飾後に除去するため、抗体の損失が大きい。さらに、Ｆｃ領域と結合した抗体結合性タンパクから抗体を低ｐＨのような厳しい溶媒条件で解離させるために、抗体が変性し易い。これは、低収率および凝集体混入の原因になり得る。
【００１４】
図３（ｂ）では、まず、第１の特異的結合部位、すなわちＦａｂ領域を第１保護剤により保護する。同時に、第２の特異的結合部位、すなわちＦｃ領域を第２保護剤により保護する。次いで、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域が保護された抗体は修飾物質によって修飾される。このようにして、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域に修飾物質が結合していない抗体が得られる。その後、抗体は第１保護剤から解離され、回収される。さらにその後、抗体は第２保護剤から解離される。
【００１５】
しかし、図３（ｂ）に示す方法は、修飾後に活性を失った抗体を除去する工程、および低解離した抗体と抗原を分離する工程を必要とする。
【００１６】
本発明の目的は、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域のいずれの領域の活性も維持している被修飾抗体を、低工程数および高収率に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の修飾方法は、第一の特異的結合部位と特異的に結合する第１保護剤を表面に有する第１磁性粒子、および前記第２の特異的結合部位と特異的に結合する第２保護剤を表面に有する第２磁性粒子、および前記抗体を混合し、前記第１の特異的結合部位および前記第２の特異的結合部位を前記第１保護剤および前記第２保護剤にそれぞれ特異的に結合させて、前記第１および第２の特異的結合部位を同時に保護する工程
前記抗体を修飾物質によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記第１の特異的結合部位および前記第２の特異的結合部位から前記第１保護剤および前記第２保護剤をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子から前記抗体を同時に前記抗体から分離する工程、および
分離された前記抗体を回収する工程
を有し、第１の特異的結合部位と第２の特異的結合部位の活性を維持可能したまま、修飾された抗体を製造する。
【００１８】
本構成によって、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能したまま、高収率で効率よく、抗体を修飾することができる。
【００１９】
ただし、前記第１の特異的結合部位はＦａｂ領域にあり、前記第２の特異的結合部位はＦｃ領域にある。
【００２０】
前記第１保護剤は、前記抗体が認識するエピトープを有した生体由来物質であり、前記第２保護剤はプロテインＡまたはプロテインＧである。
【００２１】
これによって、２以上の特異的結合部位を保護して修飾することができ、複数の保護剤を磁力によって同時に集めることで、それぞれの保護剤から解離した修飾抗体を、容易に分離・回収することが可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、抗体が有する２以上の特異的結合部位の活性を維持したまま、修飾された抗体を効率よく製造する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の各工程を示すフローチャート
【図２】本発明の各工程を示す図
【図３】各方法における各工程を示すフローチャート
【図４】測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す図
【図５】抗体の模式図
【図６】特許文献１に開示されているタンパク質の修飾方法を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、抗原結合部位およびプロテインＡ結合部位の活性を維持したまま、抗体に修飾を行う方法を説明する。抗原結合部位およびプロテインＡ結合部位は、いずれも、抗体が有する特異的結合部位である。
【００２５】
（実施の形態１）
以下の精製において、化学薬品は使用前に０．０４５μｍのフィルターに通される。
【００２６】
図１は、本実施の形態である修飾方法を表すフローチャートである。図２は、本実施の形態を模式的に表した図である。
【００２７】
まず、工程Ｓｔ１において、第１磁性粒子３、第２磁性粒子４、および抗体５を溶液中で混合する。第１磁性粒子３の表面には第１保護剤１が予め結合している。第２磁性粒子４の表面には第１保護剤２が予め結合している。抗体５は第１の特異的結合部位５および第２の特異的結合部位６を有する。
【００２８】
図２（ａ）および図２（ｂ）は、工程Ｓｔ１を模式的に示す。第１磁性粒子３および第２磁性粒子４の量は、混合される抗体５の量よりも過剰な量の抗体５に対する結合し得る量になるように設定される。
【００２９】
第１保護剤１としてはＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）（以下、ＨＳＡと略す）が用いられ得る。第２保護剤２としてはプロテインＡが用いられ得る。第１磁性粒子としてはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が用いられ得る。第２磁性粒子４としてはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が用いられ得る。抗体５としては抗ＨＳＡマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（以下、マウスモノクローナル抗体と略す）が用いられ得る。この場合、第１の特異的結合部位６は、マウスモノクローナル抗体のＨＳＡ結合部位である。第２の特異的結合部位７は、マウスモノクローナル抗体のプロテインＡ結合部位である。
【００３０】
図２（ａ）に示すように、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１ｍｌのマウスモノクローナル抗体、予めＨＳＡを結合させておいた３０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、および予めプロテインＡが結合されている３０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を、０．２ Ｍ ＮａＨＣＯ3および０．５ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ８．９）を含有する緩衝液中で混合する。
【００３１】
この混合溶液は１０分間室温で攪拌される。ＨＳＡはマウスモノクローナル抗体が有する第１の特異的結合部位６（Ｆａｂ領域）と特異的に結合し、ＰｒｏｔｅｉｎＡは抗体が有する第２の特異的結合部位７（Ｆｃ領域）と特異的に結合する。これにより図２（ｂ）に示すように、マウスモノクローナル抗体、ＨＳＡ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ、プロテインＡ、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとからなる複合体が形成される。
【００３２】
反応に用いる緩衝液は、１級アミノ基（−ＮＨ2）を持たない中性の生体用緩衝液である限り、特に限定されない。プロテインＡに対する低い親和性を有するマウスＩｇＧ１抗体が結合される場合には、好ましくは、例えば、１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ９．０のような高モル濃度かつ高ｐＨの緩衝液が用いられ、結合力を高める。
【００３３】
次に、工程Ｓｔ２で、修飾物質８によって抗体５が修飾される。図２（ｃ）は、工程Ｓｔ２を模式的に示す。第１の特異的結合部位６および第２の特異的結合部位７はそれぞれ第１保護剤１および第２保護剤２によって保護されているので、修飾物質８によって修飾されない。
【００３４】
修飾物質８としてはＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが用いられ得る。
【００３５】
まず、ＤＭＳＯに溶解させた１．７８ｍＭの濃度を有する１５μｌのＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが作成される。そして、図２（ｃ）に示すように、溶解後これは直ちに上記混合溶液に加えられ、室温で一時間攪拌される。これをもう一度繰り返す。
【００３６】
次に、工程Ｓｔ３において、混合溶液から未反応の修飾物質８が除去される。図２（ｄ）は工程Ｓｔ３を模式的に示す。
【００３７】
攪拌後、溶液中には、マウスモノクローナル抗体と反応しなかった未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが存在している。そこで、図２（ｄ）に示すように、修飾された上記複合体は、ＤｙｎａＭａｇ−１５（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて磁力により集められる。上清を上記緩衝液に置換して再度、懸濁する。これを２〜３回繰り返し、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒを除去する。
【００３８】
好ましくは、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒは、０．５ Ｍの１級アミノ基（−ＮＨ2）を持つ低分子化合物（例えば、モノエタノールアミン、グリシン、またはトリス）、および０．５ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）によって、回収前に不活性化される。ただし、マウスＩｇＧ１抗体が用いられる場合には、プロテインＡに対する弱い親和性を有するマウスＩｇＧ１抗体がプロテインＡから解離する可能性がある。そのため、０．５ Ｍの１級アミノ基（−ＮＨ2）を持つ低分子化合物（モノエタノールアミン、グリシン、トリスなど）および１．０ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）のような高モル濃度かつ高ｐＨによって不活性化することが好ましい。
【００３９】
次に、工程Ｓｔ４において、抗体５が第１の保護剤１および第２の保護剤３から解離される。図２（ｅ）および図２（ｆ）は、工程Ｓｔ４を模式的に示す。
【００４０】
未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが緩やかに攪拌された後、磁力によって上記複合体が再度集められて、上清が捨てられる。そこへ、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）が加えられる。これによって、図２（ｅ）のように、マウスモノクローナル抗体が、ＨＳＡおよびプロテインＡから解離する。
【００４１】
本実施の形態では、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）が加えられて複合体からマウスモノクローナル抗体を解離する。しかし、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）のような３．０以下のｐＨを有する緩衝液である限り、緩衝液は特に限定されない。
【００４２】
最後に工程Ｓｔ５において、図２（ｆ）に示すように、ＨＳＡが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ ＥｐｏｘｙおよびプロテインＡが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡを磁力によって分離し、上清を回収する。回収した溶液は、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ９．０）により直ちに中和される。
【００４３】
回収された修飾抗体９のＨＳＡ結合部位およびプロテインＡ結合部位は修飾されていない。すなわち、２つ以上の特異的結合部位は修飾されておらず、それらの活性は維持されている。このようにして、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持したまま、修飾された抗体（以下、「被修飾抗体」という）が得られる。
【００４４】
第１保護剤１は、抗体５が特異的結合部位６を介して認識する特定のタンパク質であり得る。例えば第１の特異的結合部位６が抗体のＦａｂ部位である場合、第１保護剤１として、抗体５を認識するエピドープを有する抗原を挙げることができる。
【００４５】
第２の保護剤２は、抗体５が特異的結合部位７を介して認識する特定のタンパク質であり得る。例えば第２の特異的結合部位７が抗体のＦｃ部位である場合、第２保護剤２として、プロテインＡおよびプロテインＧを挙げることができる。プロテインＡおよびプロテインＧは、抗体のＦｃ部分と特異的に結合する性質を有する。
【００４６】
抗体５は抗原およびプロテインＡまたはＧと特異的に結合することが可能である限り、、特に限定されない。例えば第２保護剤２がプロテインＡである場合、抗体５としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ２ｃ、ウシＩｇＧ２、イヌＩｇＧ、ヤギＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、サルＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、およびヒツジＩｇＧ２が、プロテインＡとの強い結合という観点から、好ましい。第２保護剤２がプロテインＧである場合、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ウシＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ヤギＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ウマＩｇＧ、サルＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、およびヒツジＩｇＧ１、ＩｇＧ２が、プロテインＧとの強い結合という観点から、好ましい。
【００４７】
第１磁性粒子３および第２磁性粒子４は、第１保護剤１と結合可能な官能基を備え、かつ抗体回収時に容易に分離可能な物質である。第１磁性粒子３および第２磁性粒子４が磁力によって同時に集合することが可能であるため、修飾物質８によって修飾された抗体５を短時間で効率よく回収することができる。
【００４８】
強い酸またはアルカリでの処理、および界面活性剤による洗浄により、第１磁性粒子３および第４磁性粒子に固定化された抗原またはタンパク質を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【００４９】
本実施形態では、磁性粒子を集めるための磁力の発生にＤｙｎａＭａｇ−１５を挙げているが、永久磁石または電磁石が用いられ得る。
【００５０】
修飾物質８としては、（１） フェリシアニドもしくはフェロセン及びおよびその誘導物質のような金属錯体、又はキノン類等の電気化学的に活性な物質、（２）2Ｈ、3Ｈ、125Ｉ、および131Ｉのような放射性物質、（３）フルオレセインイソチオシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート、フルオレスカミン、および４−フルオロー７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアソールのような蛍光物質、（４）アミノピレン、ルミノール誘導体、およびアクリジニウム誘導体のような化学発光物質、（５）ペルオキシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、およびウレアーゼのような酵素が使用され得る。
【００５１】
本実施の形態では、修飾物質８の酸化還元反応における電流応答から、抗体の量を定量的に計測するため、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが化学修飾されている。これに代えて、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ、ＥＤＣ、またはＮＨＳを用いて活性化させたフェロセンカルボン酸によって抗体にフェロセン誘導体を修飾し得る。
【００５２】
修飾物質を導入する部位を形成する方法としては、アミノ基、チオール基、または水酸基を利用する方法がある。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係る修飾された抗体を製造する方法は、複数の特異的結合部位の活性を維持したまま、修飾物質によってタンパク質を修飾し得る。本発明の方法は、タンパク質の特異的相互作用を用いた分析方法において用いられる修飾タンパクを作成するために有用である。本発明の方法は、医学、薬学、生物学、化学、食品学のような様々な分野における免疫反応測定抗体を修飾する方法にも応用できる。
【００５４】
上記の開示内容から導出される本発明は以下の通りである。
１．
修飾物質によって修飾された抗体を製造する方法であって、
前記抗体はＦａｂ領域およびＦｃ領域を具備しており、
前記方法は、
前記Ｆａｂ領域と特異的に結合する第１保護剤（１）を表面に有する第１磁性粒子（３）、および前記Ｆｃ領域と特異的に結合する第２保護剤（２）を表面に有する第２磁性粒子（４）、および前記抗体（５）を混合し、前記Ｆａｂ領域および前記Ｆｃ領域を前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）にそれぞれ特異的に結合させる工程
前記抗体（５）を修飾物質によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記Ｆａｂ領域および前記Ｆｃ領域から前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子（３・４）から前記抗体（５）を分離する工程、および
前記分離された抗体（５）を回収する工程
を有する。
A method for fabricating an antibody modified with a modification substance, said antibody comprising a Fab-flagment and an Fc-flagment, comprising:
mixing a first magnetic particle(3) with a first protection reagent(1) binding to said Fab-flagment on the surface thereof, a second magnetic particle(4) with a second protection reagent(2) binding to said Fc-flagment on the surface thereof, and said antibody to bind specifically said Fab-flagment and Fc-flagment with said first and second protection agent(1・2) respectively,
modifying said anbibody(5) with said modification substance,
adding a releasing reagent to release said first and second protection agent(1・2) from said Fab-flagment and said Fc-flagment,
dividing said antibody from said first and second magnetic particles with a magnet, and
collecting said divided antibody.
２．
前記第１保護剤（１）がアルブミンである、前記項目１に記載の方法。
３．
前記第１保護剤（１）が血清アルブミンである、前記項目２に記載の方法。
４．
前記第１保護剤（１）がヒト血清アルブミンである、前記項目３に記載の方法。
５．
前記第２保護剤（２）がプロテインＡまたはプロテインＧである、前記項目１に記載の方法。
６．
前記第２保護剤（２）がプロテインＡまたはプロテインＧである、前記項目２に記載の方法。
７．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目１に記載の方法。
８．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目２に記載の方法。
９．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目５に記載の方法。
１０．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目６に記載の方法。
【符号の説明】
【００５５】
１ 第１保護剤
２ 第２保護剤
３ 第１磁性粒子
４ 第２磁性粒子
５ 抗体
６ 第１の特異的結合部位
７ 第２の特異的結合部位
８ 修飾物質
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾された抗体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の濃度を測定する従来の方法は、測定しようとする抗体を修飾物質により修飾する工程、次いで当該修飾物質の濃度を電気化学的または光学的に測定する工程を有する。
【０００３】
図４は、測定しようとする抗体を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す。図４では、修飾物質は蛍光物質である。
【０００４】
まず、抗体を含む溶液中に蛍光物質を添加する。すると、蛍光物質は抗体と結合する。ここで、図５に示すように、抗体はＹ文字型を有する。そして、抗体は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域を有する。これら３つの領域は、いずれも「特異的結合部位」として知られている。
【０００５】
２つのＦａｂ領域には抗原が特異的に結合する。しかし、蛍光物質が２つのＦａｂ領域のいずれにも結合した後には、２つのＦａｂ領域のいずれにも抗原は特異的に結合しない。すなわち、そのような抗体は、抗原に対して不活性性を有する。
【０００６】
特許文献１は、２つのＦａｂ領域のいずれにも蛍光物質が結合した抗体を排除する方法を開示している。図６は特許文献１に示された方法を示す。まず、抗原は抗体と反応し、複合体を得る。次に、当該複合体に修飾物質が結合する。修飾物質が結合した複合体から抗原が解離される。
【０００７】
この方法では、修飾物質は抗体のＦａｂ領域に結合しない。なぜなら、修飾物質が抗体に結合する時には、抗体のＦａｂ領域は抗原と特異的に結合しているからである。よって、Ｆａｂ領域に修飾物質が全く結合していない抗体が得られ得る。
【０００８】
特許文献１の他、特許文献２〜５は本発明に関連し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平４−３５５３６９号公報
【特許文献２】特開平１−２２４６６４号公報
【特許文献３】特開昭６１−４９６１号公報
【特許文献４】特開昭５２−１５４５１９号公報
【特許文献５】特開２００４−１７７４０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１は、抗体のＦｃ領域の保護を開示も示唆もしていない。特許文献１に開示された方法によれば、Ｆｃ領域が修飾物質によって修飾され、Ｆｃ領域の活性は消失し得る。
【００１１】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、特許文献１に開示された方法にＦｃ領域の保護を加えたフローチャートを示す。
【００１２】
図３（ａ）では、まず、第１の特異的結合部位、すなわちＦａｂ領域を第１保護剤により保護する。次いで、当該Ｆａｂ領域が保護された抗体は修飾物質によって修飾される。このようにして、Ｆａｂ領域に修飾物質が結合していない抗体が得られる。その後、抗体は第１保護剤から解離され、回収される。プロテインＡおよびプロテインＧのような、第２の特異的結合部位、すなわちＦｃ領域と特異的に結合する抗体結合性タンパクを保持する支持体に抗体は供給される。Ｆｃ領域に修飾物質を有さない抗体は、当該支持体に結合する。一方、Ｆｃ領域に修飾物質が結合している抗体は、当該支持体に結合せず、除去される。最後に、支持体に結合した抗体を回収する。ここで、支持体としては、アフィニティーカラム、磁性微粒子、および非磁性微粒子が挙げられる。
【００１３】
しかし、図３（ａ）では、Ｆｃ領域を修飾物質によって修飾された抗体を修飾後に除去するため、抗体の損失が大きい。さらに、Ｆｃ領域と結合した抗体結合性タンパクから抗体を低ｐＨのような厳しい溶媒条件で解離させるために、抗体が変性し易い。これは、低収率および凝集体混入の原因になり得る。
【００１４】
図３（ｂ）では、まず、第１の特異的結合部位、すなわちＦａｂ領域を第１保護剤により保護する。同時に、第２の特異的結合部位、すなわちＦｃ領域を第２保護剤により保護する。次いで、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域が保護された抗体は修飾物質によって修飾される。このようにして、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域に修飾物質が結合していない抗体が得られる。その後、抗体は第１保護剤から解離され、回収される。さらにその後、抗体は第２保護剤から解離される。
【００１５】
しかし、図３（ｂ）に示す方法は、修飾後に活性を失った抗体を除去する工程、および低解離した抗体と抗原を分離する工程を必要とする。
【００１６】
本発明の目的は、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域のいずれの領域の活性も維持している被修飾抗体を、低工程数および高収率に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の修飾方法は、第一の特異的結合部位と特異的に結合する第１保護剤を表面に有する第１磁性粒子、および前記第２の特異的結合部位と特異的に結合する第２保護剤を表面に有する第２磁性粒子、および前記抗体を混合し、前記第１の特異的結合部位および前記第２の特異的結合部位を前記第１保護剤および前記第２保護剤にそれぞれ特異的に結合させて、前記第１および第２の特異的結合部位を同時に保護する工程
前記抗体を修飾物質によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記第１の特異的結合部位および前記第２の特異的結合部位から前記第１保護剤および前記第２保護剤をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子から前記抗体を同時に前記抗体から分離する工程、および
分離された前記抗体を回収する工程
を有し、第１の特異的結合部位と第２の特異的結合部位の活性を維持可能したまま、修飾された抗体を製造する。
【００１８】
本構成によって、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持可能したまま、高収率で効率よく、抗体を修飾することができる。
【００１９】
ただし、前記第１の特異的結合部位はＦａｂ領域にあり、前記第２の特異的結合部位はＦｃ領域にある。
【００２０】
前記第１保護剤は、前記抗体が認識するエピトープを有した生体由来物質であり、前記第２保護剤はプロテインＡまたはプロテインＧである。
【００２１】
これによって、２以上の特異的結合部位を保護して修飾することができ、複数の保護剤を磁力によって同時に集めることで、それぞれの保護剤から解離した修飾抗体を、容易に分離・回収することが可能となる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、抗体が有する２以上の特異的結合部位の活性を維持したまま、修飾された抗体を効率よく製造する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の各工程を示すフローチャート
【図２】本発明の各工程を示す図
【図３】各方法における各工程を示すフローチャート
【図４】測定しようとするタンパク質を修飾物質により修飾する具体的な方法を示す図
【図５】抗体の模式図
【図６】特許文献１に開示されているタンパク質の修飾方法を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、抗原結合部位およびプロテインＡ結合部位の活性を維持したまま、抗体に修飾を行う方法を説明する。抗原結合部位およびプロテインＡ結合部位は、いずれも、抗体が有する特異的結合部位である。
【００２５】
（実施の形態１）
以下の精製において、化学薬品は使用前に０．０４５μｍのフィルターに通される。
【００２６】
図１は、本実施の形態である修飾方法を表すフローチャートである。図２は、本実施の形態を模式的に表した図である。
【００２７】
まず、工程Ｓｔ１において、第１磁性粒子３、第２磁性粒子４、および抗体５を溶液中で混合する。第１磁性粒子３の表面には第１保護剤１が予め結合している。第２磁性粒子４の表面には第１保護剤２が予め結合している。抗体５は第１の特異的結合部位５および第２の特異的結合部位６を有する。
【００２８】
図２（ａ）および図２（ｂ）は、工程Ｓｔ１を模式的に示す。第１磁性粒子３および第２磁性粒子４の量は、混合される抗体５の量よりも過剰な量の抗体５に対する結合し得る量になるように設定される。
【００２９】
第１保護剤１としてはＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｍｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）（以下、ＨＳＡと略す）が用いられ得る。第２保護剤２としてはプロテインＡが用いられ得る。第１磁性粒子としてはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が用いられ得る。第２磁性粒子４としてはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が用いられ得る。抗体５としては抗ＨＳＡマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（以下、マウスモノクローナル抗体と略す）が用いられ得る。この場合、第１の特異的結合部位６は、マウスモノクローナル抗体のＨＳＡ結合部位である。第２の特異的結合部位７は、マウスモノクローナル抗体のプロテインＡ結合部位である。
【００３０】
図２（ａ）に示すように、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１ｍｌのマウスモノクローナル抗体、予めＨＳＡを結合させておいた３０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、および予めプロテインＡが結合されている３０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を、０．２ Ｍ ＮａＨＣＯ3および０．５ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ８．９）を含有する緩衝液中で混合する。
【００３１】
この混合溶液は１０分間室温で攪拌される。ＨＳＡはマウスモノクローナル抗体が有する第１の特異的結合部位６（Ｆａｂ領域）と特異的に結合し、ＰｒｏｔｅｉｎＡは抗体が有する第２の特異的結合部位７（Ｆｃ領域）と特異的に結合する。これにより図２（ｂ）に示すように、マウスモノクローナル抗体、ＨＳＡ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ Ｅｐｏｘｙ、プロテインＡ、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとからなる複合体が形成される。
【００３２】
反応に用いる緩衝液は、１級アミノ基（−ＮＨ2）を持たない中性の生体用緩衝液である限り、特に限定されない。プロテインＡに対する低い親和性を有するマウスＩｇＧ１抗体が結合される場合には、好ましくは、例えば、１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ９．０のような高モル濃度かつ高ｐＨの緩衝液が用いられ、結合力を高める。
【００３３】
次に、工程Ｓｔ２で、修飾物質８によって抗体５が修飾される。図２（ｃ）は、工程Ｓｔ２を模式的に示す。第１の特異的結合部位６および第２の特異的結合部位７はそれぞれ第１保護剤１および第２保護剤２によって保護されているので、修飾物質８によって修飾されない。
【００３４】
修飾物質８としてはＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが用いられ得る。
【００３５】
まず、ＤＭＳＯに溶解させた１．７８ｍＭの濃度を有する１５μｌのＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが作成される。そして、図２（ｃ）に示すように、溶解後これは直ちに上記混合溶液に加えられ、室温で一時間攪拌される。これをもう一度繰り返す。
【００３６】
次に、工程Ｓｔ３において、混合溶液から未反応の修飾物質８が除去される。図２（ｄ）は工程Ｓｔ３を模式的に示す。
【００３７】
攪拌後、溶液中には、マウスモノクローナル抗体と反応しなかった未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが存在している。そこで、図２（ｄ）に示すように、修飾された上記複合体は、ＤｙｎａＭａｇ−１５（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて磁力により集められる。上清を上記緩衝液に置換して再度、懸濁する。これを２〜３回繰り返し、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒを除去する。
【００３８】
好ましくは、未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒは、０．５ Ｍの１級アミノ基（−ＮＨ2）を持つ低分子化合物（例えば、モノエタノールアミン、グリシン、またはトリス）、および０．５ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）によって、回収前に不活性化される。ただし、マウスＩｇＧ１抗体が用いられる場合には、プロテインＡに対する弱い親和性を有するマウスＩｇＧ１抗体がプロテインＡから解離する可能性がある。そのため、０．５ Ｍの１級アミノ基（−ＮＨ2）を持つ低分子化合物（モノエタノールアミン、グリシン、トリスなど）および１．０ Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）のような高モル濃度かつ高ｐＨによって不活性化することが好ましい。
【００３９】
次に、工程Ｓｔ４において、抗体５が第１の保護剤１および第２の保護剤３から解離される。図２（ｅ）および図２（ｆ）は、工程Ｓｔ４を模式的に示す。
【００４０】
未反応のＦｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが緩やかに攪拌された後、磁力によって上記複合体が再度集められて、上清が捨てられる。そこへ、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）が加えられる。これによって、図２（ｅ）のように、マウスモノクローナル抗体が、ＨＳＡおよびプロテインＡから解離する。
【００４１】
本実施の形態では、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）が加えられて複合体からマウスモノクローナル抗体を解離する。しかし、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．０）のような３．０以下のｐＨを有する緩衝液である限り、緩衝液は特に限定されない。
【００４２】
最後に工程Ｓｔ５において、図２（ｆ）に示すように、ＨＳＡが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ ＥｐｏｘｙおよびプロテインＡが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡを磁力によって分離し、上清を回収する。回収した溶液は、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ９．０）により直ちに中和される。
【００４３】
回収された修飾抗体９のＨＳＡ結合部位およびプロテインＡ結合部位は修飾されていない。すなわち、２つ以上の特異的結合部位は修飾されておらず、それらの活性は維持されている。このようにして、抗体が有する２以上の特異結合部位の活性を維持したまま、修飾された抗体（以下、「被修飾抗体」という）が得られる。
【００４４】
第１保護剤１は、抗体５が特異的結合部位６を介して認識する特定のタンパク質であり得る。例えば第１の特異的結合部位６が抗体のＦａｂ部位である場合、第１保護剤１として、抗体５を認識するエピドープを有する抗原を挙げることができる。
【００４５】
第２の保護剤２は、抗体５が特異的結合部位７を介して認識する特定のタンパク質であり得る。例えば第２の特異的結合部位７が抗体のＦｃ部位である場合、第２保護剤２として、プロテインＡおよびプロテインＧを挙げることができる。プロテインＡおよびプロテインＧは、抗体のＦｃ部分と特異的に結合する性質を有する。
【００４６】
抗体５は抗原およびプロテインＡまたはＧと特異的に結合することが可能である限り、、特に限定されない。例えば第２保護剤２がプロテインＡである場合、抗体５としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ２ｃ、ウシＩｇＧ２、イヌＩｇＧ、ヤギＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、サルＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、およびヒツジＩｇＧ２が、プロテインＡとの強い結合という観点から、好ましい。第２保護剤２がプロテインＧである場合、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ウシＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ヤギＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ウマＩｇＧ、サルＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、およびヒツジＩｇＧ１、ＩｇＧ２が、プロテインＧとの強い結合という観点から、好ましい。
【００４７】
第１磁性粒子３および第２磁性粒子４は、第１保護剤１と結合可能な官能基を備え、かつ抗体回収時に容易に分離可能な物質である。第１磁性粒子３および第２磁性粒子４が磁力によって同時に集合することが可能であるため、修飾物質８によって修飾された抗体５を短時間で効率よく回収することができる。
【００４８】
強い酸またはアルカリでの処理、および界面活性剤による洗浄により、第１磁性粒子３および第４磁性粒子に固定化された抗原またはタンパク質を完全に除去し、その磁性粒子に別の抗体または抗原を固定化することも可能である。
【００４９】
本実施形態では、磁性粒子を集めるための磁力の発生にＤｙｎａＭａｇ−１５を挙げているが、永久磁石または電磁石が用いられ得る。
【００５０】
修飾物質８としては、（１） フェリシアニドもしくはフェロセン及びおよびその誘導物質のような金属錯体、又はキノン類等の電気化学的に活性な物質、（２）2Ｈ、3Ｈ、125Ｉ、および131Ｉのような放射性物質、（３）フルオレセインイソチオシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート、フルオレスカミン、および４−フルオロー７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアソールのような蛍光物質、（４）アミノピレン、ルミノール誘導体、およびアクリジニウム誘導体のような化学発光物質、（５）ペルオキシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、およびウレアーゼのような酵素が使用され得る。
【００５１】
本実施の形態では、修飾物質８の酸化還元反応における電流応答から、抗体の量を定量的に計測するため、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒが化学修飾されている。これに代えて、Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ ａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ、ＥＤＣ、またはＮＨＳを用いて活性化させたフェロセンカルボン酸によって抗体にフェロセン誘導体を修飾し得る。
【００５２】
修飾物質を導入する部位を形成する方法としては、アミノ基、チオール基、または水酸基を利用する方法がある。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係る修飾された抗体を製造する方法は、複数の特異的結合部位の活性を維持したまま、修飾物質によってタンパク質を修飾し得る。本発明の方法は、タンパク質の特異的相互作用を用いた分析方法において用いられる修飾タンパクを作成するために有用である。本発明の方法は、医学、薬学、生物学、化学、食品学のような様々な分野における免疫反応測定抗体を修飾する方法にも応用できる。
【００５４】
上記の開示内容から導出される本発明は以下の通りである。
１．
修飾物質によって修飾された抗体を製造する方法であって、
前記抗体はＦａｂ領域およびＦｃ領域を具備しており、
前記方法は、
前記Ｆａｂ領域と特異的に結合する第１保護剤（１）を表面に有する第１磁性粒子（３）、および前記Ｆｃ領域と特異的に結合する第２保護剤（２）を表面に有する第２磁性粒子（４）、および前記抗体（５）を混合し、前記Ｆａｂ領域および前記Ｆｃ領域を前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）にそれぞれ特異的に結合させる工程
前記抗体（５）を修飾物質によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記Ｆａｂ領域および前記Ｆｃ領域から前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子（３・４）から前記抗体（５）を分離する工程、および
前記分離された抗体（５）を回収する工程
を有する。
A method for fabricating an antibody modified with a modification substance, said antibody comprising a Fab-flagment and an Fc-flagment, comprising:
mixing a first magnetic particle(3) with a first protection reagent(1) binding to said Fab-flagment on the surface thereof, a second magnetic particle(4) with a second protection reagent(2) binding to said Fc-flagment on the surface thereof, and said antibody to bind specifically said Fab-flagment and Fc-flagment with said first and second protection agent(1・2) respectively,
modifying said anbibody(5) with said modification substance,
adding a releasing reagent to release said first and second protection agent(1・2) from said Fab-flagment and said Fc-flagment,
dividing said antibody from said first and second magnetic particles with a magnet, and
collecting said divided antibody.
２．
前記第１保護剤（１）がアルブミンである、前記項目１に記載の方法。
３．
前記第１保護剤（１）が血清アルブミンである、前記項目２に記載の方法。
４．
前記第１保護剤（１）がヒト血清アルブミンである、前記項目３に記載の方法。
５．
前記第２保護剤（２）がプロテインＡまたはプロテインＧである、前記項目１に記載の方法。
６．
前記第２保護剤（２）がプロテインＡまたはプロテインＧである、前記項目２に記載の方法。
７．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目１に記載の方法。
８．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目２に記載の方法。
９．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目５に記載の方法。
１０．
前記解離剤がグリシンおよび塩酸の混合液である、前記項目６に記載の方法。
【符号の説明】
【００５５】
１ 第１保護剤
２ 第２保護剤
３ 第１磁性粒子
４ 第２磁性粒子
５ 抗体
６ 第１の特異的結合部位
７ 第２の特異的結合部位
８ 修飾物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾物質によって修飾された抗体を製造する方法であって、前期方法は、抗原と結合する第１の特異的結合部位を有するＦａｂ領域および、抗原とは異なる物質と結合する第２の特異的結合部位を有するＦｃ領域を具備しており、
前記方法は、
前記第一の特異的結合部位（６）と特異的に結合する第１保護剤（１）を表面に有する第１磁性粒子（３）、および前記第２の特異的結合部位（７）と特異的に結合する第２保護剤（２）を表面に有する第２磁性粒子（４）、および前記抗体（５）を混合し、
前記第１の特異的結合部位（６）および前記第２の特異的結合部位（７）を前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）にそれぞれ特異的に結合させて、前記第１および第２の特異的結合部位を同時に保護する工程
前記抗体（５）を修飾物質（８）によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記第１の特異的結合部位（６）および前記第２の特異的結合部位（７）から前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子（３・４）を同時に前記抗体（５）から分離する工程、および
前記分離された抗体（５）を回収する工程
を有する。
【請求項２】
前記第１保護剤が、前記抗体が認識するエピトープを有した生体由来物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２保護剤がプロテインＡまたはプロテインＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
修飾物質によって修飾された抗体を製造する方法であって、前期方法は、抗原と結合する第１の特異的結合部位を有するＦａｂ領域および、抗原とは異なる物質と結合する第２の特異的結合部位を有するＦｃ領域を具備しており、
前記方法は、
前記第一の特異的結合部位（６）と特異的に結合する第１保護剤（１）を表面に有する第１磁性粒子（３）、および前記第２の特異的結合部位（７）と特異的に結合する第２保護剤（２）を表面に有する第２磁性粒子（４）、および前記抗体（５）を混合し、
前記第１の特異的結合部位（６）および前記第２の特異的結合部位（７）を前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）にそれぞれ特異的に結合させて、前記第１および第２の特異的結合部位を同時に保護する工程
前記抗体（５）を修飾物質（８）によって修飾する工程、
解離剤を添加し、前記第１の特異的結合部位（６）および前記第２の特異的結合部位（７）から前記第１保護剤（１）および前記第２保護剤（２）をそれぞれ解離する工程、
磁石を用いて前記第１および第２磁性粒子（３・４）を同時に前記抗体（５）から分離する工程、および
前記分離された抗体（５）を回収する工程
を有する。
【請求項２】
前記第１保護剤が、前記抗体が認識するエピトープを有した生体由来物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２保護剤がプロテインＡまたはプロテインＧである、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１４０４５９（Ｐ２０１１−１４０４５９Ａ）
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６７１（Ｐ２０１０−１６７１）
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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