偽陽性反応を抑制する検体抽出液
【課題】鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、従来の方法で抑制しきれなかった偽陽性反応を簡便で安価に抑制できる検体抽出液を提供する。
【解決手段】以下の偽陽性反応抑制剤を含む検体抽出液によって前記課題を解決した。偽陽性反応抑制剤；以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤、１）鼻咽頭由来検体中に含まれる、２）検出対象物以外である、３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
【解決手段】以下の偽陽性反応抑制剤を含む検体抽出液によって前記課題を解決した。偽陽性反応抑制剤；以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤、１）鼻咽頭由来検体中に含まれる、２）検出対象物以外である、３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、特定の蛋白成分を含む検体抽出液を用いることによって、偽陽性反応を抑制する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中のウイルスを測定する方法としては、分離培養法やＰＣＲ法が知られている。前述の方法は、操作が煩雑で測定に時間がかかることから、迅速診断には適していない。一方、迅速診断に一定の役割を果たしているのが簡易検査キットであり、迅速性、簡便性に優れているため、近年急速に広まってきた。
簡易検査法としては、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマト法が知られており、被検出物に特異的に結合するメンブレン固相物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物の複合体をメンブレン上に形成させて被検出物を測定する方法である。標識物としては、被検出物と特異的に結合する抗体にアルカリフォスファターゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド及び着色ラテックス粒子が一般的であり、特に金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を用いる場合が多い。着色ラテックス粒子の場合、色、粒子径、官能基等、様々な種類のものが製造可能であり、選択性に優れている。また複数の色調のラテックス粒子を用いて、複数の被検出物を検出する方法も提案されている。
これらの簡易検査法では、被検出物と被検出物に対する抗体との特異的な結合以外で生じる偽陽性反応が検出されることがある。偽陽性反応の原因の一つとして、被検検体に含まれるムチンのような粘性物質やＩｇＡ、ＩｇＭといった免疫グロブリンなどが標識物の凝集を促進し、その凝集塊がメンブレン固相物質に非特異的にトラップされることが考えられる。この様な問題を解決するために、例えば、塩基性アミノ酸、無機塩類、及び界面活性剤からなる群より選択される少なくとも２種類の化合物を含むフロースルー式検査法用検体浮遊液組成物を用いる方法（特許文献１）、免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンのみ、このアルカリ金属イオンを少なくとも０．３Ｍ含むことを特徴とする検体前処理液を用いる方法（特許文献２）、及び、イオン性界面活性剤を含む、免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物を用いる方法（特許文献３）、動物由来免疫グロブリン等を添加する方法等（特許文献４）が提案されている。しかし、これらの方法は、偽陽性の発生率を減少させることはできたが、完全に除去するには至っていない。ウイルスの感染を測定する際にこのような偽陽性反応が生じてしまうと、誤った処置が施されてしまう可能性があり、偽陽性を完全に抑制することは簡易検査法において極めて重要な課題といえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２７９５７７号公報
【特許文献２】特開２００５−２４３２３号公報
【特許文献３】特開２００５−２９１７８３号公報
【特許文献４】特開２００４−３０１６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、従来の方法で抑制しきれなかった偽陽性反応を簡便で安価に抑制できる検体抽出液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの鼻咽頭由来検体における偽陽性反応を抑制する方法を鋭意検討した結果、偽陽性原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を見出し、これを検体抽出液に添加することによって、これまで検出されていた偽陽性反応を抑制できることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の構成を有する。
〔１〕抗検出対象物抗体を用いて検出対象物を検出するイムノクロマト法に用いられる検体抽出液であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む、検体抽出液。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔２〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔１〕に記載の検体抽出液。
〔３〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔１〕または〔２〕に記載の検体抽出液。
〔４〕偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔５〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔６〕抗検出対象物抗体を用いて検体中の検出対象物を検出するイムノクロマト法であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む検体抽出液と検体を接触させて検出対象物を抽出する工程と、
抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体固定化ストリップを接触させて検出対象物を検出する工程と、を含むイムノクロマト法。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔７〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕以下の構成を含む検出対象物測定用イムノクロマト試薬。
（１）抗検出対象物抗体固定化ストリップ
（２）前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液
〔１２〕抗検出対象物抗体固定化ストリップが、以下の構成を含む前記〔１１〕に記載のイムノクロマト試薬。
（ａ）標識された抗検出対象物抗体が塗布されたコンジュゲートパッド
（ｂ）抗検出対象物抗体固定化膜
〔１３〕検体の抽出方法であって、鼻咽頭由来の検体と前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液を接触させる工程を含む、検体の抽出方法。
〔１４〕以下の工程を有するイムノクロマト法の偽陽性反応抑制剤選択方法。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検体抽出液によれば、カラーラテックス又は金コロイドなどの粒子を標識物として使用し、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高いテストストリップを提供できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】テストストリップの模式構成図である。（ａ）プラスチック製粘着シート、（ｂ）抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜、（ｃ）コンジュゲート塗布パッド、（ｄ）吸収パッド、（ｅ）ポリエステルフィルム
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離パターンを示す図である。レーン１：Ｃ６０７、レーン２：Ｃ６２１、レーン３：Ｃ６２２、レーン４：ＵＲＡ、レーン５：Ｃ６０７＋ＤＷ、レーン６：Ｃ６０７＋５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、レーン７：５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM＋ＤＷ
【図３】ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの分離パターンを示す図である。レーン１：Ｃ６０７、レーン２：ＵＲＡ、レーン３：Ｃ６２１、レーン４：Ｃ６２２、レーン５：Ｃ６０７＋ＤＷ、レーン６：Ｃ６０７＋５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、レーン７：５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM＋ＤＷ
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（検体）
本発明が適用可能な検体は、ウイルスの存在が疑われる鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液等の鼻咽頭由来検体（以下、鼻咽頭由来検体という）であり、このうち鼻腔拭い液、鼻腔吸引液が特に好ましい。
【０００９】
（検出対象物）
本発明における検出対象物は、上記検体に含まれる可能性のあるウイルスや菌体全般であり、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルスなどがあるが、特にインフルエンザウイルスが好ましい。インフルエンザウイルスとしてはＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００１０】
（検体抽出液）
本発明の検体抽出液は、以下の偽陽性反応抑制剤を含むものであればいずれのものであってもよい。
偽陽性反応抑制；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
ここで、偽陽性反応原因成分としては、イムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体を非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した場合に分子量が２６０ＫＤａ付近および／又は５２〜７２ＫＤａにバンドが現れる成分が挙げられる。本発明者らは、鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体の共通成分について分析し、偽陽性原因成分が上記特定のバンドの成分であることをつきとめた。ここで、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分であるか否か、すなわち、本発明の偽陽性反応抑制剤かどうかは、以下のように判断することができる。
（１）偽陽性反応抑制候補物質を偽陽性原因成分を含む検体と混合したものをイムノクロマト法で検出した場合に、偽陽性反応を示さない。
（２）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性反応抑制剤の有効成分が変化する。
（３）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性原因成分が変化する。
【００１１】
上記（２）の変化は、例えば、偽陽性反応抑制剤の有効成分の量が減少することにより確認できる。量の減少は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で当該有効成分に対応するバンドの発色が薄くなること等で確認できる。すなわち、当該有効成分が有効に働き偽陽性反応を抑制することで消費されるからである。また、偽陽性原因成分と結合するなどして複合体を形成したり、化学変化をした場合も、当該有効成分の量の減少として捉えることができる。また、上記（３）の変化は、例えば、偽陽性原因成分の量が減少することで確認できる。量の減少は、上記（２）と同様に確認できる。
したがって、本発明の偽陽性反応抑制剤の選択は、例えば、次のステップ（Ａ）〜（Ｃ）により行うことができる。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【００１２】
本発明の検体抽出液は、偽陽性反応抑制剤の効果を維持できるものであれば他の成分を含むことができ、例えば緩衝液が挙げられる。また、本発明の検体抽出液は、偽陽性原因成分に対してなんらかの作用をする偽陽性反応抑制剤を含むものであるが、当該偽陽性反応抑制剤は、イムノクロマト試薬に用いられるテストストリップにあらかじめ固定化しておくこともできる。
検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度は、１％〜１０％が好ましく、２．５〜８％がさらに好ましく、４．５〜５．５％がもっとも好ましい。尚、後述の実施例に記載のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、およびＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度もこれと同じである。
【００１３】
（緩衝液の種類）
本発明の検体抽出液に用いられる緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜１０．０の範囲が好ましく、ｐＨ８．０〜９．０がさらに好ましい。ｐＨ８．０〜９．０の緩衝液としては、トリス緩衝液が特に好ましい。前記緩衝液には、さらにＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩類、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）等の非イオン性界面活性剤、スクロースなどの安定化剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は、ＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
【００１４】
（検体抽出方法）
本発明の検体を抽出する方法は、鼻咽頭由来の検体と本発明の前記検体抽出液を接触させることにより行われる。例えば、検体が鼻腔吸引検体の場合は、鼻腔吸引液に綿棒等を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。また、検体が鼻腔拭い検体の場合は、綿棒で鼻腔を拭い、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。
【００１５】
（検出対象物を検出するイムノクロマト法）
本発明の検出対象物をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法（イムノクロマト法）は、検出対象物に対する抗体（以下、抗検出対象物抗体ということがある。）を用いた免疫学的検出方法であれば特に限定されないが、抗検出対象物抗体と標識抗検出対象物抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。さらに、抗検出対象物抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。
上記イムノクロマト法は、上記検体抽出方法により抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体を固定化したストリップ等を接触させることにより行われる。
なお、本発明におけるイムノクロマト法は、定性的な検出、定量的な測定のいずれにも用いることができることはいうまでもない。
【００１６】
（標識物）
これらの抗体に標識する標識物としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特にカラーラテックスが好ましい。
カラーラテックスは、例えば特開平６−３０６１０８号公報の〔００２２〕記載の方法に従い、乳化剤を使用しないソープフリー重合によりポリスチレン系粒子を作製し、同〔００２５〕から〔００３５〕までに記載された方法に準じて作製可能であり、Ｓｅｒａｄｙｎ社やＭａｇｓｐｈｅｒｅ社などから市販されている着色粒子を用いることも出来る。
以下の説明では、標識物としてカラーラテックス粒子を用いた場合について詳述する。
【００１７】
（標識抗体固定化方法）
上記抗体のカラーラテックスへの固定化は、通常化学結合によって行うが、この際、抗体濃度は１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬに調製されるのが好ましく、緩衝液及びｐＨは、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）または５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９）が好ましく、さらに好ましくは２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）である。また、カラーラテックス上の抗体が結合していない領域は、ＢＳＡなどを結合させブロッキングするのが好適である。このようにして作製されたカラーラテックス標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、ＢＳＡなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。
【００１８】
（固相）
また、固相の素材としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、あるいはセラミックス等が挙げられる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社、ライデル社などより販売されているガラス繊維ろ紙や、セルロースろ紙などの他、ポリスチレンプレート、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。
以下、固相の素材としてニトロセルロース膜を用いた場合について詳述する。
【００１９】
（固相への捕捉用抗体の固定化）
検出対象物としての抗原（例えば、インフルエンザウイルス）と標識抗体との複合体を検出するための捕捉用抗体のニトロセルロース膜への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、ラテラルフロー式の場合には、ノズルから捕捉用抗体を含む液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状にニトロセルロース膜に捕捉用抗体液を塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、上記の抗体液は、通常、所定の緩衝液を用いて調製され得る。
前記緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜９．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜８．５がより好ましく、ｐＨ７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
ニトロセルロース膜に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
ニトロセルロース膜の孔径を適宜選択することにより、カラーラテックス標識抗体と検出対象物である抗原（例えば、インフルエンザウイルス）との免疫複合体が膜中を流れる速度を制御することが可能である。この流れる速度により、膜に固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、適切な孔径を有する膜を選択することが好ましい。好適には、ミリポア社、Ｈｉ Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１８０などが用いられる。
【００２０】
（イムノクロマト試薬、イムノクロマト試薬キット）
本発明の検体抽出液は、従来のイムノクロマト試薬とともに用いることができ、両者を併せてイムノクロマト試薬またはイムノクロマト試薬キットとして用いることもできる。
尚、「イムノクロマト試薬」とは、イムノクロマト法による測定に必要な試薬成分や、テストストリップ等の部材をも含めたものである。
次に、検出対象物をインフルエンザウイルスとした場合に、本発明の検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の偽陽性反応を抑制する技術に関して実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
＜インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の作製＞
１．青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、赤色カラーラテック
ス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬ、（ii）０．２ｍＬ、及び（iii）０．８ｍＬを加えて撹拌後、これに（iv）４ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）により得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体および赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
以下の試験において、コンジュゲートの吸光度の測定は、青色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（青色カラーラテックスの最大吸収波長）、赤色カラーラテックスを用いた場合は５５１ｎｍ（赤色カラーラテックスの最大吸収波長）、緑色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（緑色カラーラテックスの最大吸収波長）で測定した。
(ｉ)２％ 青色又は赤色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(ii) ２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(iii) 架橋剤１−ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１５ｍｇ／ｍＬ
(iv) ２．５ｍｇ／ｍＬ 抗Ａ型又は抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
【００２２】
２．コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨ（カコ貝ヘモシアニン：Ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬに、（ii）１．４ｍＬ、（iii）１．６ｍＬを加えて撹拌後、（iv）２ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）で得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨを得た。
（ｉ）２％ 緑色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（ii）２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（iii）１５ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ
（iv）０．５ｍｇ／ｍＬ ＫＬＨを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
【００２３】
３．コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１．および上記２．で調製したコンジュゲートを、青色６．４ ＯＤ／ｍＬ、赤色１０．４ ＯＤ／ｍＬ、緑色６．５ ＯＤ／ｍＬとなるように、０．５％カゼイン及び１０％スクロース含有トリス緩衝液（ｐＨ８．５）と混合して３色が混合したコンジュゲート溶液を作製した。そして、２２．０ｍｍ×２５４ｍｍ×０．５６ｍｍ（幅×長さ×厚さ）のグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）にイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用いて該コンジュゲート溶液を１０ｕＬ／ｃｍで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で７０℃で３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。また、界面活性剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行った。
【００２４】
４．抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜の作製
２５ｍｍ×２５４ｍｍ×０．２３５ｍｍ（短辺×長辺×厚さ）のニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した前記青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、１．０ｍｇ／ｍＬに調製した前記赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＫＬＨ抗体、及び２．５％スクロースを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、幅約１ｍｍのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用い、吐出量を１μＬ／ｃｍとなるよう設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜とした。ニトロセルロース膜上の抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＡライン、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＢライン、抗ＫＬＨ抗体を塗布したラインをコントロールラインという。
【００２５】
５．テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（a）に上記抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜（b）を貼り、上記３．で作製したコンジュゲート塗布パッド（ｃ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｄ）（Ｗｈａｔｍａｎ社、７４０−Ｅ）を配置装着した。また、最後に抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルム（ｅ）を配置装着しラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を４ｍｍ幅に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップの外寸は、４ｍｍ×９８ｍｍ（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。図１にテストストリップの模式構成図を示した。
【００２６】
６．検体抽出液の調製
２００ｍＭ 塩化カリウム、１５０ｍＭ Ｌ−アルギニン、０．５％ Ｂｒｉｊ３５、０．２５％ ＢＳＡ、及び０．０５％ プロクリン(登録商標)９５０を含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）を検体抽出液とした。
【００２７】
試験例１
鼻腔拭い液、もしくは鼻腔吸引液を用いた偽陽性反応原因成分の検討
（１）試験方法
（１−１）使用検体
培養法もしくはＰＣＲ法にてインフルエンザウイルス陰性が確認されている検体のうち、前記５．で作成されたテストストリップ（イムノクロマト試薬）で偽陽性を示す鼻腔拭い検体１本（検体名：ＵＲＡ）と鼻腔吸引検体１本（検体名：Ｃ６０７）、及び偽陽性を示さない鼻腔吸引検体２本（検体名：Ｃ６２１、Ｃ６２２）を用いた。
（１−２）サンプルの調製
ａ．鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒１本を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ入れて、検体成分をＰＢＳへ溶解させて本試験のサンプルとした。
ｂ．鼻腔拭い検体の場合
綿棒２本で鼻腔を拭い、綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ溶解して本試験のサンプルとした。
（１−３）測定
サンプルに上記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後にＡライン、Ｂラインおよびコントロ−ルラインの発色強度を測定した。発色強度測定には、青、赤、緑色の各色の発色見本から０．２５〜４．０の数値をつけたカラーチャートを用いた。発色強度の測定方法は以下の試験において同様である。
【００２８】
（１−４） 発色強度測定結果
結果を表１に示す。表中、数値が高いほど、偽陽性反応を示しており、「−」は検出限界以下を示している。また、Ａ ｌｉｎｅの数値は、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｂ ｌｉｎｅの数値は、赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｃｏｎｔ．は緑色カラーラテックス標識抗ＫＬＨによる発色ラインの発色強度を示す。これより、検体Ｃ６２１とＣ６２２は偽陽性反応を示さない検体であり、検体ＵＲＡおよびＣ６０７が偽陽性反応を示す検体であることがわかる。以後、偽陽性検体としてＵＲＡおよびＣ６０７を用いた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
（２−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１−１）で用いた４検体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離パターンを比較した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動を行った。
サンプルの調製は、上記（１−２）と同様に行い、調製されたサンプル１０μＬにトリス−ＳＤＳサンプル処理液（コスモバイオ社製）１０μＬを添加し混合したものを１０μＬアプライした。
【００３１】
（２−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
結果を図２に示す。図２によれば、偽陽性反応を示すサンプル（ＵＲＡ、Ｃ６０７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン（レーン４、レーン１）において分子量が２６０ＫＤａ付近、および５２〜７２ＫＤａの間のバンドが、偽陽性反応を示さない検体（Ｃ６２１、Ｃ６２２）のパターン（レーン２、レーン３）に比べて濃いことが判明した。したがって、これらの２種類のバンドの成分が偽陽性反応の原因成分であると考えられた。なお、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥでも同様に分離を行ったところ、同様の結果が得られた。すなわち、偽陽性反応を示さない検体に比べて偽陽性を示す検体で濃くなるバンドが認められた（図３）。
【００３２】
試験例２
偽陽性反応抑制効果を示す偽陽性反応抑制剤のスクリーニング
（１）試験方法
上記６．で調製した検体抽出液に下記９種類の偽陽性反応抑制剤候補物質を終濃度５％となるように添加して９種類の試験用検体抽出液を調製し、当該試験用検体抽出液３２０μＬに偽陽性反応を起こす鼻腔拭い検体（鼻腔を拭った綿棒４本の綿球部分）を加えて検体を抽出した。
該検体抽出液に上記５．で作製したテストストリップを浸し、１０分、３０分、６０分後にＡライン、Ｂライン、コントールラインの発色強度を測定した。
偽陽性反応抑制剤候補物質：
ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ（ＴＯＹＯＢＯ製）、イムノブロックTM（大日本製薬製）、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ（生化学バイオビジネス製）、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ（ＰＩＥＲＣＥ製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク製）、ＢＳＡ（プロリアント製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ製）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ製）、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTM（ＣＡＮＤＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅＧｍｂＨ製）
【００３３】
（２）試験結果
各種の偽陽性反応抑制剤候補物質を添加した試験用検体抽出液を用いた場合の発色強度測定結果を表２に示す。表２より、ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ、イムノブロックTM、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、ＢＳＡ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔの７種では偽陽性反応抑制効果を示さなかったのに対し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(以下、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM)、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは顕著に偽陽性反応抑制効果を示した。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMやＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制することにより、偽陽性反応を抑制したと考えられた。
【００３４】
【表２】
【００３５】
試験例３
StartingBlockTMの効果確認試験
（１）試験方法
試験例２のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを添加した各検体抽出液検体Ｃ６０７（偽陽性反応を起こす検体）を添加したものと、当該検体を添加しないものについて、試験例１と同様に非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動した。
試験例１で調製されたＣ６０７のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルに純水、又は５％にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン５，６）。また、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMと純水（ＤＷ）を等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン７）。
【００３６】
（２）試験結果
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの場合には、Ｃ６０７を添加した検体抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおいて（レーン６）、Ｃ６０７を添加しないＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ単独の検体抽出液（レーン７）に特有の成分（分子量が２８ＫＤａ付近のバンド）の消失が認められた（図２）。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの特有成分が偽陽性反応原因成分に何らかの作用をして、偽陽性反応を抑制していることがわかった。
【００３７】
試験例４
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応を抑制する効果の持続期間の確認
（１）試験方法
試験例２でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応抑制効果が認められたことから、これらの効果持続期間を確認するために、前記６．の検体抽出液にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMをそれぞれ５％（ｗ／ｗ）となるように添加して、６０℃で３日間保管（３０℃、２〜３ヶ月相当）した後、再度、偽陽性検体を摂取し、試験例２と同様にＡライン、Ｂライン、およびコントロールラインの発色強度を測定した。
【００３８】
（２）試験結果
測定結果を表３に示す。ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMでは偽陽性抑制効果が消失していたのに対して、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMでは、６０℃加速試験においても効果を持続していることを確認した。この結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMは試薬の安定性にも非常に優れていることがわかった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
試験例５
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度検討
（１）試験方法
試験例３，４でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMがもっとも偽陽性反応の抑制に効果を発揮することが判明したため、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM至適濃度を検討することとした。検体抽出液におけるＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度を０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％（ｗ／ｗ）まで変動させて試験例２と同様に各反応ラインの発色強度を測定した。
また、１％、５％（ｗ／ｗ）の濃度のものについては、６０℃加速試験も行い安定性を評価した。
【００４１】
（２）試験結果
至適濃度の試験結果を表４に、６０℃加速試験の結果を表５に示す。表４によればＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度が１％（ｗ／ｗ）以上で偽陽性反応を抑制できることを確認した。また、表５によれば６０℃、７日間（３０℃、６ヶ月相当）で１％以上において偽陽性反応の安定した抑制効果が認められた。以上の試験例４，５の結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度は１％以上であり、より好ましくは５％であることがわかった。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
試験例６
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加による検出感度変化確認
（１）試験方法
５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを検体抽出液に添加することによりインフルエンザウイルスの検出感度に影響が見られないかを確認した。具体的には、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加、非添加検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルスの検出を行った。Ａ型インフルエンザウイルスのサンプルとして、ＦｌｕＡ抗原 Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３（ｌｏｔ．０８０５２１，ＳＥＫＩＳＵＩ）を１２２０倍希釈したもの、Ｂ型インフルエンザウイルスのサンプルとしてＦｌｕＢ抗原 Ｂ／Ｌｅｅ（ｌｏｔ．０８１００３，ＳＥＫＩＳＵＩ）を７０４倍希釈したものを用いた。これらの抗原希釈サンプル１３５μＬに、前記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後の発色強度を検出した。
【００４５】
（２）試験結果
Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスともに検出感度の変化はほとんど認められず（図示せず）、検体抽出液へのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの添加が検出感度に影響しないことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の検体抽出液によれば、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高い測定方法を実現できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、特定の蛋白成分を含む検体抽出液を用いることによって、偽陽性反応を抑制する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中のウイルスを測定する方法としては、分離培養法やＰＣＲ法が知られている。前述の方法は、操作が煩雑で測定に時間がかかることから、迅速診断には適していない。一方、迅速診断に一定の役割を果たしているのが簡易検査キットであり、迅速性、簡便性に優れているため、近年急速に広まってきた。
簡易検査法としては、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマト法が知られており、被検出物に特異的に結合するメンブレン固相物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物の複合体をメンブレン上に形成させて被検出物を測定する方法である。標識物としては、被検出物と特異的に結合する抗体にアルカリフォスファターゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド及び着色ラテックス粒子が一般的であり、特に金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を用いる場合が多い。着色ラテックス粒子の場合、色、粒子径、官能基等、様々な種類のものが製造可能であり、選択性に優れている。また複数の色調のラテックス粒子を用いて、複数の被検出物を検出する方法も提案されている。
これらの簡易検査法では、被検出物と被検出物に対する抗体との特異的な結合以外で生じる偽陽性反応が検出されることがある。偽陽性反応の原因の一つとして、被検検体に含まれるムチンのような粘性物質やＩｇＡ、ＩｇＭといった免疫グロブリンなどが標識物の凝集を促進し、その凝集塊がメンブレン固相物質に非特異的にトラップされることが考えられる。この様な問題を解決するために、例えば、塩基性アミノ酸、無機塩類、及び界面活性剤からなる群より選択される少なくとも２種類の化合物を含むフロースルー式検査法用検体浮遊液組成物を用いる方法（特許文献１）、免疫クロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンのみ、このアルカリ金属イオンを少なくとも０．３Ｍ含むことを特徴とする検体前処理液を用いる方法（特許文献２）、及び、イオン性界面活性剤を含む、免疫測定に供する検体浮遊液調製用媒体組成物を用いる方法（特許文献３）、動物由来免疫グロブリン等を添加する方法等（特許文献４）が提案されている。しかし、これらの方法は、偽陽性の発生率を減少させることはできたが、完全に除去するには至っていない。ウイルスの感染を測定する際にこのような偽陽性反応が生じてしまうと、誤った処置が施されてしまう可能性があり、偽陽性を完全に抑制することは簡易検査法において極めて重要な課題といえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２７９５７７号公報
【特許文献２】特開２００５−２４３２３号公報
【特許文献３】特開２００５−２９１７８３号公報
【特許文献４】特開２００４−３０１６８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの検体中のウイルスをイムノクロマト法にて検出するウイルス測定用イムノクロマト試薬に関し、従来の方法で抑制しきれなかった偽陽性反応を簡便で安価に抑制できる検体抽出液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液などの鼻咽頭由来検体における偽陽性反応を抑制する方法を鋭意検討した結果、偽陽性原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を見出し、これを検体抽出液に添加することによって、これまで検出されていた偽陽性反応を抑制できることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の構成を有する。
〔１〕抗検出対象物抗体を用いて検出対象物を検出するイムノクロマト法に用いられる検体抽出液であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む、検体抽出液。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔２〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔１〕に記載の検体抽出液。
〔３〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔１〕または〔２〕に記載の検体抽出液。
〔４〕偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔５〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検体抽出液。
〔６〕抗検出対象物抗体を用いて検体中の検出対象物を検出するイムノクロマト法であって、以下の偽陽性反応抑制剤を含む検体抽出液と検体を接触させて検出対象物を抽出する工程と、
抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体固定化ストリップを接触させて検出対象物を検出する工程と、を含むイムノクロマト法。
偽陽性反応抑制剤；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
〔７〕抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕偽陽性反応原因成分が、非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる成分である前記〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である前記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である前記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕以下の構成を含む検出対象物測定用イムノクロマト試薬。
（１）抗検出対象物抗体固定化ストリップ
（２）前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液
〔１２〕抗検出対象物抗体固定化ストリップが、以下の構成を含む前記〔１１〕に記載のイムノクロマト試薬。
（ａ）標識された抗検出対象物抗体が塗布されたコンジュゲートパッド
（ｂ）抗検出対象物抗体固定化膜
〔１３〕検体の抽出方法であって、鼻咽頭由来の検体と前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検体抽出液を接触させる工程を含む、検体の抽出方法。
〔１４〕以下の工程を有するイムノクロマト法の偽陽性反応抑制剤選択方法。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検体抽出液によれば、カラーラテックス又は金コロイドなどの粒子を標識物として使用し、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高いテストストリップを提供できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】テストストリップの模式構成図である。（ａ）プラスチック製粘着シート、（ｂ）抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜、（ｃ）コンジュゲート塗布パッド、（ｄ）吸収パッド、（ｅ）ポリエステルフィルム
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離パターンを示す図である。レーン１：Ｃ６０７、レーン２：Ｃ６２１、レーン３：Ｃ６２２、レーン４：ＵＲＡ、レーン５：Ｃ６０７＋ＤＷ、レーン６：Ｃ６０７＋５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、レーン７：５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM＋ＤＷ
【図３】ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの分離パターンを示す図である。レーン１：Ｃ６０７、レーン２：ＵＲＡ、レーン３：Ｃ６２１、レーン４：Ｃ６２２、レーン５：Ｃ６０７＋ＤＷ、レーン６：Ｃ６０７＋５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、レーン７：５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM＋ＤＷ
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（検体）
本発明が適用可能な検体は、ウイルスの存在が疑われる鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻かみ液、咽頭拭い液等の鼻咽頭由来検体（以下、鼻咽頭由来検体という）であり、このうち鼻腔拭い液、鼻腔吸引液が特に好ましい。
【０００９】
（検出対象物）
本発明における検出対象物は、上記検体に含まれる可能性のあるウイルスや菌体全般であり、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルスなどがあるが、特にインフルエンザウイルスが好ましい。インフルエンザウイルスとしてはＡ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００１０】
（検体抽出液）
本発明の検体抽出液は、以下の偽陽性反応抑制剤を含むものであればいずれのものであってもよい。
偽陽性反応抑制；
以下の１）から３）の性質を有する偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分を含む偽陽性反応抑制剤
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
ここで、偽陽性反応原因成分としては、イムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体を非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した場合に分子量が２６０ＫＤａ付近および／又は５２〜７２ＫＤａにバンドが現れる成分が挙げられる。本発明者らは、鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体の共通成分について分析し、偽陽性原因成分が上記特定のバンドの成分であることをつきとめた。ここで、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制する成分であるか否か、すなわち、本発明の偽陽性反応抑制剤かどうかは、以下のように判断することができる。
（１）偽陽性反応抑制候補物質を偽陽性原因成分を含む検体と混合したものをイムノクロマト法で検出した場合に、偽陽性反応を示さない。
（２）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性反応抑制剤の有効成分が変化する。
（３）偽陽性反応抑制候補物質を、偽陽性原因成分を含む検体と混合した場合に、偽陽性原因成分が変化する。
【００１１】
上記（２）の変化は、例えば、偽陽性反応抑制剤の有効成分の量が減少することにより確認できる。量の減少は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で当該有効成分に対応するバンドの発色が薄くなること等で確認できる。すなわち、当該有効成分が有効に働き偽陽性反応を抑制することで消費されるからである。また、偽陽性原因成分と結合するなどして複合体を形成したり、化学変化をした場合も、当該有効成分の量の減少として捉えることができる。また、上記（３）の変化は、例えば、偽陽性原因成分の量が減少することで確認できる。量の減少は、上記（２）と同様に確認できる。
したがって、本発明の偽陽性反応抑制剤の選択は、例えば、次のステップ（Ａ）〜（Ｃ）により行うことができる。
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【００１２】
本発明の検体抽出液は、偽陽性反応抑制剤の効果を維持できるものであれば他の成分を含むことができ、例えば緩衝液が挙げられる。また、本発明の検体抽出液は、偽陽性原因成分に対してなんらかの作用をする偽陽性反応抑制剤を含むものであるが、当該偽陽性反応抑制剤は、イムノクロマト試薬に用いられるテストストリップにあらかじめ固定化しておくこともできる。
検体抽出液中の偽陽性反応抑制剤の濃度は、１％〜１０％が好ましく、２．５〜８％がさらに好ましく、４．５〜５．５％がもっとも好ましい。尚、後述の実施例に記載のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、およびＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度もこれと同じである。
【００１３】
（緩衝液の種類）
本発明の検体抽出液に用いられる緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜１０．０の範囲が好ましく、ｐＨ８．０〜９．０がさらに好ましい。ｐＨ８．０〜９．０の緩衝液としては、トリス緩衝液が特に好ましい。前記緩衝液には、さらにＮａＣｌ、ＫＣｌなどの塩類、アルギニンなどの塩基性アミノ酸、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）等の非イオン性界面活性剤、スクロースなどの安定化剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は、ＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
【００１４】
（検体抽出方法）
本発明の検体を抽出する方法は、鼻咽頭由来の検体と本発明の前記検体抽出液を接触させることにより行われる。例えば、検体が鼻腔吸引検体の場合は、鼻腔吸引液に綿棒等を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。また、検体が鼻腔拭い検体の場合は、綿棒で鼻腔を拭い、検体を浸み込ませた綿棒を本発明の検体抽出液に入れて検体を溶解させることで抽出することができる。
【００１５】
（検出対象物を検出するイムノクロマト法）
本発明の検出対象物をイムノクロマトグラフィーにより検出する方法（イムノクロマト法）は、検出対象物に対する抗体（以下、抗検出対象物抗体ということがある。）を用いた免疫学的検出方法であれば特に限定されないが、抗検出対象物抗体と標識抗検出対象物抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。さらに、抗検出対象物抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれでもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。
上記イムノクロマト法は、上記検体抽出方法により抽出された検出対象物と抗検出対象物抗体を固定化したストリップ等を接触させることにより行われる。
なお、本発明におけるイムノクロマト法は、定性的な検出、定量的な測定のいずれにも用いることができることはいうまでもない。
【００１６】
（標識物）
これらの抗体に標識する標識物としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特にカラーラテックスが好ましい。
カラーラテックスは、例えば特開平６−３０６１０８号公報の〔００２２〕記載の方法に従い、乳化剤を使用しないソープフリー重合によりポリスチレン系粒子を作製し、同〔００２５〕から〔００３５〕までに記載された方法に準じて作製可能であり、Ｓｅｒａｄｙｎ社やＭａｇｓｐｈｅｒｅ社などから市販されている着色粒子を用いることも出来る。
以下の説明では、標識物としてカラーラテックス粒子を用いた場合について詳述する。
【００１７】
（標識抗体固定化方法）
上記抗体のカラーラテックスへの固定化は、通常化学結合によって行うが、この際、抗体濃度は１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬに調製されるのが好ましく、緩衝液及びｐＨは、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．５）または５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９）が好ましく、さらに好ましくは２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）である。また、カラーラテックス上の抗体が結合していない領域は、ＢＳＡなどを結合させブロッキングするのが好適である。このようにして作製されたカラーラテックス標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、ＢＳＡなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。
【００１８】
（固相）
また、固相の素材としては、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、あるいはセラミックス等が挙げられる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社、ライデル社などより販売されているガラス繊維ろ紙や、セルロースろ紙などの他、ポリスチレンプレート、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜などが好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。
以下、固相の素材としてニトロセルロース膜を用いた場合について詳述する。
【００１９】
（固相への捕捉用抗体の固定化）
検出対象物としての抗原（例えば、インフルエンザウイルス）と標識抗体との複合体を検出するための捕捉用抗体のニトロセルロース膜への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、ラテラルフロー式の場合には、ノズルから捕捉用抗体を含む液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状にニトロセルロース膜に捕捉用抗体液を塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、上記の抗体液は、通常、所定の緩衝液を用いて調製され得る。
前記緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨはｐＨ６．０〜９．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜８．５がより好ましく、ｐＨ７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン（登録商標）などの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
ニトロセルロース膜に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
ニトロセルロース膜の孔径を適宜選択することにより、カラーラテックス標識抗体と検出対象物である抗原（例えば、インフルエンザウイルス）との免疫複合体が膜中を流れる速度を制御することが可能である。この流れる速度により、膜に固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、適切な孔径を有する膜を選択することが好ましい。好適には、ミリポア社、Ｈｉ Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１８０などが用いられる。
【００２０】
（イムノクロマト試薬、イムノクロマト試薬キット）
本発明の検体抽出液は、従来のイムノクロマト試薬とともに用いることができ、両者を併せてイムノクロマト試薬またはイムノクロマト試薬キットとして用いることもできる。
尚、「イムノクロマト試薬」とは、イムノクロマト法による測定に必要な試薬成分や、テストストリップ等の部材をも含めたものである。
次に、検出対象物をインフルエンザウイルスとした場合に、本発明の検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の偽陽性反応を抑制する技術に関して実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
＜インフルエンザウイルス測定用イムノクロマト試薬の作製＞
１．青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、赤色カラーラテック
ス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬ、（ii）０．２ｍＬ、及び（iii）０．８ｍＬを加えて撹拌後、これに（iv）４ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）により得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体および赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
以下の試験において、コンジュゲートの吸光度の測定は、青色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（青色カラーラテックスの最大吸収波長）、赤色カラーラテックスを用いた場合は５５１ｎｍ（赤色カラーラテックスの最大吸収波長）、緑色カラーラテックスを用いた場合は６５５ｎｍ（緑色カラーラテックスの最大吸収波長）で測定した。
(ｉ)２％ 青色又は赤色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(ii) ２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
(iii) 架橋剤１−ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１５ｍｇ／ｍＬ
(iv) ２．５ｍｇ／ｍＬ 抗Ａ型又は抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
【００２２】
２．コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨ（カコ貝ヘモシアニン：Ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）の調製
（１）下記（i）から（iv）を準備し、（ｉ）５ｍＬに、（ii）１．４ｍＬ、（iii）１．６ｍＬを加えて撹拌後、（iv）２ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した。
（２）上記（１）で得られた溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除去後、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加し、さらに２時間撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。
（３）上記（２）で得られたコンジュゲートに対し、１０％スクロース含有２％ＢＳＡ水溶液を１０ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させて、コントロール用緑色カラーラテックス標識ＫＬＨを得た。
（ｉ）２％ 緑色カラーラテックスを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（ii）２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
（iii）１５ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ
（iv）０．５ｍｇ／ｍＬ ＫＬＨを含む２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液
【００２３】
３．コンジュゲート塗布パッドの作製
上記１．および上記２．で調製したコンジュゲートを、青色６．４ ＯＤ／ｍＬ、赤色１０．４ ＯＤ／ｍＬ、緑色６．５ ＯＤ／ｍＬとなるように、０．５％カゼイン及び１０％スクロース含有トリス緩衝液（ｐＨ８．５）と混合して３色が混合したコンジュゲート溶液を作製した。そして、２２．０ｍｍ×２５４ｍｍ×０．５６ｍｍ（幅×長さ×厚さ）のグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）にイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用いて該コンジュゲート溶液を１０ｕＬ／ｃｍで滲みこませた。その後、ドライオーブン内で７０℃で３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲート塗布パッドとした。また、界面活性剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行った。
【００２４】
４．抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜の作製
２５ｍｍ×２５４ｍｍ×０．２３５ｍｍ（短辺×長辺×厚さ）のニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）に、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した前記青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、１．０ｍｇ／ｍＬに調製した前記赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とはエピトープを異にする抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体、０．７５ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＫＬＨ抗体、及び２．５％スクロースを含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、幅約１ｍｍのライン状に塗布した。塗布は、イムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ ＤＯＴ社）を用い、吐出量を１μＬ／ｃｍとなるよう設定した。ライン塗布後のニトロセルロース膜をドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜とした。ニトロセルロース膜上の抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＡライン、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を塗布したラインをＢライン、抗ＫＬＨ抗体を塗布したラインをコントロールラインという。
【００２５】
５．テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（a）に上記抗インフルエンザウイルス抗体固定化膜（b）を貼り、上記３．で作製したコンジュゲート塗布パッド（ｃ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｄ）（Ｗｈａｔｍａｎ社、７４０−Ｅ）を配置装着した。また、最後に抗体固定化膜および吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルム（ｅ）を配置装着しラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を４ｍｍ幅に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップの外寸は、４ｍｍ×９８ｍｍ（幅×長さ）であり、イムノクロマトテストストリップの形態にした。図１にテストストリップの模式構成図を示した。
【００２６】
６．検体抽出液の調製
２００ｍＭ 塩化カリウム、１５０ｍＭ Ｌ−アルギニン、０．５％ Ｂｒｉｊ３５、０．２５％ ＢＳＡ、及び０．０５％ プロクリン(登録商標)９５０を含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．５）を検体抽出液とした。
【００２７】
試験例１
鼻腔拭い液、もしくは鼻腔吸引液を用いた偽陽性反応原因成分の検討
（１）試験方法
（１−１）使用検体
培養法もしくはＰＣＲ法にてインフルエンザウイルス陰性が確認されている検体のうち、前記５．で作成されたテストストリップ（イムノクロマト試薬）で偽陽性を示す鼻腔拭い検体１本（検体名：ＵＲＡ）と鼻腔吸引検体１本（検体名：Ｃ６０７）、及び偽陽性を示さない鼻腔吸引検体２本（検体名：Ｃ６２１、Ｃ６２２）を用いた。
（１−２）サンプルの調製
ａ．鼻腔吸引検体の場合
鼻腔吸引液に綿棒１本を浸し、検体を浸み込ませた綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ入れて、検体成分をＰＢＳへ溶解させて本試験のサンプルとした。
ｂ．鼻腔拭い検体の場合
綿棒２本で鼻腔を拭い、綿棒を３２０μＬのＰＢＳへ溶解して本試験のサンプルとした。
（１−３）測定
サンプルに上記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後にＡライン、Ｂラインおよびコントロ−ルラインの発色強度を測定した。発色強度測定には、青、赤、緑色の各色の発色見本から０．２５〜４．０の数値をつけたカラーチャートを用いた。発色強度の測定方法は以下の試験において同様である。
【００２８】
（１−４） 発色強度測定結果
結果を表１に示す。表中、数値が高いほど、偽陽性反応を示しており、「−」は検出限界以下を示している。また、Ａ ｌｉｎｅの数値は、青色カラーラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｂ ｌｉｎｅの数値は、赤色カラーラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体による発色ラインの発色強度を示し、Ｃｏｎｔ．は緑色カラーラテックス標識抗ＫＬＨによる発色ラインの発色強度を示す。これより、検体Ｃ６２１とＣ６２２は偽陽性反応を示さない検体であり、検体ＵＲＡおよびＣ６０７が偽陽性反応を示す検体であることがわかる。以後、偽陽性検体としてＵＲＡおよびＣ６０７を用いた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
（２−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１−１）で用いた４検体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離パターンを比較した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動を行った。
サンプルの調製は、上記（１−２）と同様に行い、調製されたサンプル１０μＬにトリス−ＳＤＳサンプル処理液（コスモバイオ社製）１０μＬを添加し混合したものを１０μＬアプライした。
【００３１】
（２−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
結果を図２に示す。図２によれば、偽陽性反応を示すサンプル（ＵＲＡ、Ｃ６０７）のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン（レーン４、レーン１）において分子量が２６０ＫＤａ付近、および５２〜７２ＫＤａの間のバンドが、偽陽性反応を示さない検体（Ｃ６２１、Ｃ６２２）のパターン（レーン２、レーン３）に比べて濃いことが判明した。したがって、これらの２種類のバンドの成分が偽陽性反応の原因成分であると考えられた。なお、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥでも同様に分離を行ったところ、同様の結果が得られた。すなわち、偽陽性反応を示さない検体に比べて偽陽性を示す検体で濃くなるバンドが認められた（図３）。
【００３２】
試験例２
偽陽性反応抑制効果を示す偽陽性反応抑制剤のスクリーニング
（１）試験方法
上記６．で調製した検体抽出液に下記９種類の偽陽性反応抑制剤候補物質を終濃度５％となるように添加して９種類の試験用検体抽出液を調製し、当該試験用検体抽出液３２０μＬに偽陽性反応を起こす鼻腔拭い検体（鼻腔を拭った綿棒４本の綿球部分）を加えて検体を抽出した。
該検体抽出液に上記５．で作製したテストストリップを浸し、１０分、３０分、６０分後にＡライン、Ｂライン、コントールラインの発色強度を測定した。
偽陽性反応抑制剤候補物質：
ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ（ＴＯＹＯＢＯ製）、イムノブロックTM（大日本製薬製）、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ（生化学バイオビジネス製）、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ（ＰＩＥＲＣＥ製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク製）、ＢＳＡ（プロリアント製）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ製）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ製）、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTM（ＣＡＮＤＯＲ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅＧｍｂＨ製）
【００３３】
（２）試験結果
各種の偽陽性反応抑制剤候補物質を添加した試験用検体抽出液を用いた場合の発色強度測定結果を表２に示す。表２より、ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ、イムノブロックTM、ＡｐｐｌｉｅＢｌｏｃｋ、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫTM/ＥＩＡ/ＷＢ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ、ＢＳＡ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔの７種では偽陽性反応抑制効果を示さなかったのに対し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ(以下、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM)、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは顕著に偽陽性反応抑制効果を示した。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMやＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMは、偽陽性反応原因成分と抗検出対象物抗体との親和性を抑制することにより、偽陽性反応を抑制したと考えられた。
【００３４】
【表２】
【００３５】
試験例３
StartingBlockTMの効果確認試験
（１）試験方法
試験例２のＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを添加した各検体抽出液検体Ｃ６０７（偽陽性反応を起こす検体）を添加したものと、当該検体を添加しないものについて、試験例１と同様に非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）を用いて電気泳動した。
試験例１で調製されたＣ６０７のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルに純水、又は５％にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン５，６）。また、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMと純水（ＤＷ）を等量混合した溶液１０μＬとサンプル処理液１０μＬを添加し混合したものから１０μＬをアプライした（レーン７）。
【００３６】
（２）試験結果
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの場合には、Ｃ６０７を添加した検体抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおいて（レーン６）、Ｃ６０７を添加しないＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ単独の検体抽出液（レーン７）に特有の成分（分子量が２８ＫＤａ付近のバンド）の消失が認められた（図２）。このことから、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの特有成分が偽陽性反応原因成分に何らかの作用をして、偽陽性反応を抑制していることがわかった。
【００３７】
試験例４
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応を抑制する効果の持続期間の確認
（１）試験方法
試験例２でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMの偽陽性反応抑制効果が認められたことから、これらの効果持続期間を確認するために、前記６．の検体抽出液にＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMをそれぞれ５％（ｗ／ｗ）となるように添加して、６０℃で３日間保管（３０℃、２〜３ヶ月相当）した後、再度、偽陽性検体を摂取し、試験例２と同様にＡライン、Ｂライン、およびコントロールラインの発色強度を測定した。
【００３８】
（２）試験結果
測定結果を表３に示す。ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMでは偽陽性抑制効果が消失していたのに対して、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMでは、６０℃加速試験においても効果を持続していることを確認した。この結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMは試薬の安定性にも非常に優れていることがわかった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
試験例５
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度検討
（１）試験方法
試験例３，４でＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMがもっとも偽陽性反応の抑制に効果を発揮することが判明したため、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM至適濃度を検討することとした。検体抽出液におけるＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度を０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％（ｗ／ｗ）まで変動させて試験例２と同様に各反応ラインの発色強度を測定した。
また、１％、５％（ｗ／ｗ）の濃度のものについては、６０℃加速試験も行い安定性を評価した。
【００４１】
（２）試験結果
至適濃度の試験結果を表４に、６０℃加速試験の結果を表５に示す。表４によればＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの濃度が１％（ｗ／ｗ）以上で偽陽性反応を抑制できることを確認した。また、表５によれば６０℃、７日間（３０℃、６ヶ月相当）で１％以上において偽陽性反応の安定した抑制効果が認められた。以上の試験例４，５の結果より、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの好ましい濃度は１％以上であり、より好ましくは５％であることがわかった。
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
試験例６
ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加による検出感度変化確認
（１）試験方法
５％ ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMを検体抽出液に添加することによりインフルエンザウイルスの検出感度に影響が見られないかを確認した。具体的には、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM添加、非添加検体抽出液を用いて、インフルエンザウイルスの検出を行った。Ａ型インフルエンザウイルスのサンプルとして、ＦｌｕＡ抗原 Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３（ｌｏｔ．０８０５２１，ＳＥＫＩＳＵＩ）を１２２０倍希釈したもの、Ｂ型インフルエンザウイルスのサンプルとしてＦｌｕＢ抗原 Ｂ／Ｌｅｅ（ｌｏｔ．０８１００３，ＳＥＫＩＳＵＩ）を７０４倍希釈したものを用いた。これらの抗原希釈サンプル１３５μＬに、前記５．で作成したテストストリップを浸し、１０分後の発色強度を検出した。
【００４５】
（２）試験結果
Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスともに検出感度の変化はほとんど認められず（図示せず）、検体抽出液へのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTMの添加が検出感度に影響しないことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の検体抽出液によれば、検体中の被測定物を検出するイムノクロマト法において、偽陽性反応を回避した精度の高い測定方法を実現できる。また、偽陽性反応による誤った臨床診断を回避できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）から４）の性質を有する偽陽性反応原因成分と親和性を有する抗検出対象物抗体を用いて検出対象物を検出するイムノクロマト法に用いられる検体抽出液であって、
以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を有するイムノクロマト法の偽陽性反応抑制剤選択方法により選択されうる偽陽性反応抑制剤であって、かつ以下の１）から４）の性質を有する偽陽性反応原因成分と前記抗検出対象物抗体との親和性を抑制する偽陽性反応抑制剤を含む、検体抽出液。
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
４）非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【請求項２】
偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である請求項１に記載の検体抽出液。
【請求項３】
偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である請求項２に記載の検体抽出液。
【請求項４】
さらに、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、およびグッド緩衝液からならなる群から選択されるいずれか1以上の緩衝液であってｐＨ６〜１０である緩衝液を含む請求項１〜３のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項５】
さらに、塩化カリウム、Ｌ−アルギニン、ＢＳＡを含む請求項1〜４のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項６】
抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である請求項１〜５のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項７】
以下の構成を含む検出対象物測定用イムノクロマト試薬。
（１）抗検出対象物抗体固定化ストリップ
（２）請求項１〜６のいずれかに記載の検体抽出液
【請求項８】
抗検出対象物抗体固定化ストリップが、以下の構成を含む請求項７に記載のイムノクロマト試薬。
（ａ）標識された抗検出対象物抗体が塗布されたコンジュゲートパッド
（ｂ）抗検出対象物抗体固定化膜
【請求項９】
検体の抽出方法であって、鼻咽頭由来の検体と請求項１〜６のいずれかに記載の検体抽出液を接触させる工程を含む、検体の抽出方法。
【請求項１】
以下の１）から４）の性質を有する偽陽性反応原因成分と親和性を有する抗検出対象物抗体を用いて検出対象物を検出するイムノクロマト法に用いられる検体抽出液であって、
以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程を有するイムノクロマト法の偽陽性反応抑制剤選択方法により選択されうる偽陽性反応抑制剤であって、かつ以下の１）から４）の性質を有する偽陽性反応原因成分と前記抗検出対象物抗体との親和性を抑制する偽陽性反応抑制剤を含む、検体抽出液。
１）鼻咽頭由来検体中に含まれる
２）検出対象物以外である
３）抗検出対象物抗体と親和性を有する
４）非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供した場合に２６０ｋＤａ付近及び／又は５２〜７２ｋＤａの間にバンドが現れる
（Ａ）鼻咽頭由来検体のうちイムノクロマト法において偽陽性反応を示す検体に偽陽性反応抑制剤候補物質を添加して混合し、当該混合物を非還元条件下、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％）で電気泳動に供して分離する工程
（Ｂ）工程（Ａ）において分離されたバンド群と、偽陽性反応を示す検体もしくは偽陽性反応抑制剤候補物質のバンド群とを比較し、（i）〜（iii）のいずれかのバンドが消滅もしくは薄くなっているかどうかを判定する工程
（i）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、２６０ｋＤａ付近に現れるバンドのうちいずれか一以上
（ii）偽陽性反応を示す検体のバンド群のうち、５２〜７２ｋＤａの間に現れるバンドのうちいずれか一以上
（iii）偽陽性反応抑制剤候補物質のバンドのうちいずれか一以上
（Ｃ）工程（Ｂ）においていずれか一以上のバンドが消滅もしくは薄くなっている場合に、前記偽陽性反応抑制剤候補物質を偽陽性反応抑制物質であると判断する工程
【請求項２】
偽陽性反応抑制剤が、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM及びＳｍａｒｔＢｌｏｃｋTMから選ばれる１種以上である請求項１に記載の検体抽出液。
【請求項３】
偽陽性反応抑制剤の濃度が、１％〜１０％である請求項２に記載の検体抽出液。
【請求項４】
さらに、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、およびグッド緩衝液からならなる群から選択されるいずれか1以上の緩衝液であってｐＨ６〜１０である緩衝液を含む請求項１〜３のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項５】
さらに、塩化カリウム、Ｌ−アルギニン、ＢＳＡを含む請求項1〜４のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項６】
抗検出対象物抗体が、抗インフルエンザウイルス抗体である請求項１〜５のいずれかに記載の検体抽出液。
【請求項７】
以下の構成を含む検出対象物測定用イムノクロマト試薬。
（１）抗検出対象物抗体固定化ストリップ
（２）請求項１〜６のいずれかに記載の検体抽出液
【請求項８】
抗検出対象物抗体固定化ストリップが、以下の構成を含む請求項７に記載のイムノクロマト試薬。
（ａ）標識された抗検出対象物抗体が塗布されたコンジュゲートパッド
（ｂ）抗検出対象物抗体固定化膜
【請求項９】
検体の抽出方法であって、鼻咽頭由来の検体と請求項１〜６のいずれかに記載の検体抽出液を接触させる工程を含む、検体の抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−７３２７０（Ｐ２０１２−７３２７０Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６４２７８（Ｐ２０１１−２６４２７８）
【出願日】平成２３年１２月２日（２０１１．１２．２）
【分割の表示】特願２０１１−５１６１８０（Ｐ２０１１−５１６１８０）の分割
【原出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２日（２０１１．１２．２）
【分割の表示】特願２０１１−５１６１８０（Ｐ２０１１−５１６１８０）の分割
【原出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
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