光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法
【課題】２−オキソエステル化合物を酵素還元して光学活性な２−ヒドロキシエステル化合物を製造する方法において、効率的に高い光学純度の光学活性な２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法を提供すること。
【解決手段】式（１）：
【化１】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示す。）で表される２−オキソエステル化合物に、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）：
【化２】
（式中、Ｒは前記に同じ。＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法。
【解決手段】式（１）：
【化１】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示す。）で表される２−オキソエステル化合物に、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）：
【化２】
（式中、Ｒは前記に同じ。＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸に代表される式（３）：
【０００３】
【化１】
で表される２−ヒドロキシ酢酸化合物は、認知障害治療薬等、医農薬の原料として重要な化合物であることが知られており（例えば、特許文献１又は非特許文献１参照。）、その製造方法としては、３−ピリジンカルボキシアルデヒドとシアン化カリウムを塩酸中で反応させる方法（例えば、非特許文献１参照。）が知られている。一方、近年ではその光学活性体が医農薬の合成原料として要望されているが（例えば、特許文献２参照）、前述の製造方法では光学活性体を得ることは困難であり、光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物の工業的に有利な製造法が望まれている。
【特許文献１】ＵＳ５２９６４７８
【特許文献２】特開平８−２０５８７８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．，３５，１４５（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、光学活性な医農薬の合成原料として重要な化合物である光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物に容易に誘導可能な、式（２）：
【０００５】
【化２】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示し、＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（以下、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）という。）の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、式（１）：
【０００７】
【化３】
（式中、Ｒは前記に同じ。）で表される２−オキソエステル化合物（以下、２−オキソエステル化合物（１）という。）に、酵素又は当該酵素を含む触媒を作用させ、高い光学純度の光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、２−オキソエステル化合物（１）に、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を提供でき、光学活性な医農薬の合成原料として有用な光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物を工業的に容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
式（１）及び（２）中、Ｒは直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６の低級アルキル基を示し、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が例示される。
【００１１】
２−オキソエステル化合物（１）としては、例えば２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１２】
光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）としては、例えば光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１３】
本発明製造方法において、２−オキソエステル化合物（１）に作用させる酵素（即ち、本酵素）又は本酵素を含む触媒（即ち、本触媒）とは、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有するものであって、例えば、
（イ）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）若しくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素として要求する本酵素又は本触媒；
（ロ）本酵素又は本触媒が補酵素を要求するものであり、かつ本酵素又は当該触媒が、自らにより消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる能力を有する本酵素又は本触媒；
等を挙げることができる。
【００１４】
本酵素としては、通常キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ヤロイア（Ｙａｒｒｏｉｗａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アスパルジーラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ライフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属、エスシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素が挙げられ、好ましくは、例えばキャンディダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、スポリディオボラス・サルモニコーラー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ヤロイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｉｗａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アスパルジーラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、フサリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ライフソニア・スピーシーズ（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ）、エスシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素であり、特に好ましくは、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素である。
【００１５】
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００１６】
ここで、上記（イ）に記載される「補酵素として要求する本酵素」又は上記（ロ）に記載される「補酵素を要求するもの」であることは、例えば、単離された本酵素を用いて補酵素の非存在下で、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を調べることにより確認すればよい。
【００１７】
本酵素又は本触媒は、単離された蛋白質の形態であってもよいし、微生物等の細胞内に含まれた形態であってもよいし、当該細胞を処理することにより得られる細胞処理物のような形態であってもよい。さらに、本酵素を生産する形質転換体又はその処理物（以下、形質転換体処理物と記すこともある。）のような形態であってもよい。ここで「細胞処理物」又は「形質転換体処理物」としては、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞、細胞摩砕物、細胞の自己消化物、細胞の超音波処理物、細胞抽出物、細胞のアルカリ処理物等を挙げることができ、さらにこれら通常用いられる方法で固定化したもの（固定化物）等が挙げられる。
【００１８】
本酵素又は本触媒は、天然に存在するものであっても、遺伝子工学的な手法を用いて作製された形質転換体により産生されるもの又はそれらから調製されるものであってもよい。尚、このような形質転換体を作製する際に用いられる、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子、即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、人為的に合成されたものであってもよい。
【００１９】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
【００２０】
前記（ｂ）「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００２１】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、２−オキソエステル化合物（１）を２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
【００２２】
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、［１］グリシン、アラニン；［２］バリン、イソロイシン、ロイシン；［３］アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；［４］セリン、スレオニン；［５］リジン、アルギニン；［６］フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００２３】
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
【００２４】
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
【００２５】
前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ、９０ｍＭ クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、１０Ｎ ＮａＣｌでｐＨを調製した後、全量を１０００ ｍｌとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． (１９８９), ６．３．１〜６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００２６】
本酵素又は本触媒の調製方法について以下に説明する。まず、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、本遺伝子）、例えば、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が８０％以上であるＤＮＡ、コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を調製する。具体的には、例えば、（Ｉ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（ＩＩ）配列番号２又は４で示される塩基配列（即ち、本塩基配列）を有するＤＮＡ等を調製すればよい。
【００２７】
本遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属又はペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）等のペニシリウム属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法［例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法］に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、例えば配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２又は４で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本遺伝子を調製する。
【００２８】
ここでコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム又はペニシリウム・シトリナム由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号５又は７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６又は８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本遺伝子を調製することになる。
【００２９】
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）〜５０℃（０．５分間）〜７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）〜５５℃（０．５分間）〜７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００３０】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００３１】
次いで、調製された本遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じて本酵素又は本触媒を製造・取得することにより本酵素又は本触媒を調製するには以下のように行う。まず、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本酵素又は本触媒を取得又は調製すればよい。
【００３２】
上記のプラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。ここで、「機能可能な形で」とは、当該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、ｔａｃプロモーター若しくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等を挙げることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナムにおいて本還元遺伝子等の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
【００３３】
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
【００３４】
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ ２０， ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｐ２０２， 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。宿主細胞としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）若しくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等（尚、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等であってもよい。）を挙げることができる。例えば、形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
【００３５】
本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３６】
宿主細胞において本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００３７】
形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源及びビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００３８】
培養温度は、形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００３９】
形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４０】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４１】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００４２】
本酵素又は本触媒の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法及び／又は細胞処理若しくは形質転換体処理に通常使用される方法等を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕又は溶解する。得られた破砕液又は溶解液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本酵素を精製することができる。
【００４３】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００４４】
また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等を遠心分離などで除去し、培養上清から本酵素を前記と同様にして精製してもよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本酵素等を閉じ込める方法）等により前記のようにして精製された本酵素を不溶化した固定化物として本触媒を調製してもよい。さらにまた、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等を、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）等により死滅化させた処理物として本触媒を調製してもよい。尚、前記の殺菌法のうちできるだけ本酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
【００４５】
続いて、本発明製造方法における還元反応について説明する。
本発明製造方法において２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する反応は、２−オキソエステル化合物（１）に本酵素（尚、勿論、形質転換体又はその死菌化細胞の形態で提供される本酵素であってもよい。）又は本触媒を作用させることによって達成される。当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は２−オキソエステル化合物（１）１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。当該反応に際しては、２−オキソエステル化合物（１）を反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００４６】
反応温度としては、本酵素又は本触媒の安定性、反応速度の点から１５〜５０℃程度をあげることができ、好ましくは約２０〜４０℃が挙げられる。反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、通常４〜１１、好ましくは６〜９を挙げることができる。
【００４７】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。反応に使用する有機溶媒の量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００４８】
本発明製造方法はさらに、本酵素又は本触媒が例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等のような補酵素を要求するものである場合には、本酵素又は当該触媒により消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる工程（即ち、補酵素再生工程）を含有させることもできる。反応に用いられる補酵素の量は、本発明における第一工程及び上記の補酵素再生工程が円滑に進行するだけの量が存在すればよいが、例えば、第一工程の場合は２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、１．０モル倍以上、好ましくは１．１モル倍以上の量であり、補酵素再生工程の場合は２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、０．５重量倍以下、好ましくは０．１重量倍以下の量を挙げることができる。
【００４９】
補酵素再生工程では、２−オキソエステル化合物（１）の不斉的な還元反応において化学量論量の還元型補酵素（電子供与体）が消費された結果生じた酸化型補酵素（電子受容体）を、再び還元型補酵素（電子供与体）に変換する能力を有する酵素（以下、補酵素再生酵素と記す。）の利用が不可欠となる。この場合には、補酵素再生酵素は、前記不斉的な還元反応を行う本酵素又は本触媒とは異なる酵素であってもよいし、また本酵素又は本触媒が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つものであってもよい。もちろん両者の組み合わせであってもよい。因みに、補酵素再生酵素が前記不斉的な還元反応を行う本酵素又は本触媒とは異なる酵素である場合における補酵素再生酵素の量としては、例えば、２−オキソエステル化合物（１）に対して０．１重量倍以下、好ましくは０．０５重量倍以下を挙げることができる。
【００５０】
ここで、「本酵素又は本触媒が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つもの」であることは、例えば、単離された酵素を用いて酸化型補酵素（電子受容体）の存在下で、補酵素再生酵素の基質である再生系原料化合物を酸化させる反応を行うことにより還元型補酵素（電子供与体）を生ずるか否かを調べることにより確認すればよい。
【００５１】
補酵素再生酵素としては、例えば、アルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。中でも、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール等の脂肪族アルコール又はグルコースを酸化することにより補酵素再生を行う補酵素再生酵素が好ましい。
【００５２】
この場合に用いられる脂肪族アルコールの使用量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して通常１００モル倍以下、好ましくは２０モル倍以下であり、グルコースの使用量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して通常０．５〜１０モル倍、好ましくは０．８〜５モル倍、より好ましくは１〜３モル倍である。尚、補酵素再生酵素は、酵素そのものとして反応系内に共存させてもよいし、また本酵素を含む微生物等の細胞又はその処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。さらにまた、補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、補酵素再生系遺伝子と記すこともある。）を含む形質転換体又はその処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。
【００５３】
ここで処理物とは、前述にある「細胞処理物」又は「形質転換体処理物」と同等なものを意味する。また「補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体」を作製する方法としては、例えば、単一である、本酵素の遺伝子と補酵素再生酵素の遺伝子との両遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入することにより作製する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換することにより作製する方法等が挙げられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も挙げることができる。尚、単一である、両遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築する方法を挙げることができる。
【００５４】
反応は、例えば、水、２−オキソエステル化合物（１）、形質転換体又はその死菌化細胞、及び必要に応じて補酵素、有機溶媒等を混合し、攪拌、振盪することにより行うことができる。
【００５５】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲を挙げることができる。
【００５６】
反応終了後は、触媒として酵素を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例等により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１（本酵素遺伝子、本酵素を発現する形質転換体及び本酵素液の調製）
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ（即ち、本遺伝子）を含有するプラスミドｐＫＡＲを以下のようにして調製した。まず、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５２，３８６−３９２（１９９９）等に記載されるプラスミドｐＵＡＲ（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）から、配列番号２で示されるＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩを用いて切り出した。切り出されたＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ／ＳｍａＩ処理したｐＫＫ２２３−３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＴａｃプロモーターの下流に挿入した。このようにしてプラスミドｐＫＡＲを構築した。構築されたプラスミドｐＫＡＲを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した。次に、フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを溶解した。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整した。）１００ｍｌを入れ、滅菌した後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、ＺｎＣｌ２を０．０１％（ｗ／ｖ）、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭになるように加えた。このようにして調製された培地に、上記で得られた形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＫＡＲ株）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、好気条件下３０℃で１４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、本遺伝子を含む形質転換体である洗浄菌体を得た。得られた洗浄菌体６．５４ｇを１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００５９】
実施例２（本酵素遺伝子の調製）
（２−１）
ｃＤＮＡライブラリーの調製５００ｍｌフラスコに培地（水にポテト・デキストロース・ブロース（ベクトン・ディッキンソン社製）を２４ｇ／Lの割合で溶解したもの）１００ｍｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ４６３１株の培養液０．５ｍｌを加え、３０℃で７２時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心し（８０００ｘｇ、１０分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０ｍｌで３回洗浄して、約１．０ｇの洗浄菌体を得た。ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ４６３１株の洗浄菌体を用いて、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法で全ＲＮＡを調製した。調製された全ＲＮＡから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）３０−Ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡを得た。ｃＤＮＡライブラリーの作製は、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ法に基づいて実施した。まず、上記のようにして得られたｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８−リンカープライマー（（含ＸＨｏｉサイト）宝酒造社製）、ＲＡＶ−２ Ｒｔａｓｅ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｒｔａｓｅを用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。調製された一本鎖ｃＤＮＡ（を含む前記反応液）にＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ及びＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えることにより、二本鎖ｃＤＮＡの合成及び当該二本鎖ｃＤＮＡの平滑末端化処理を行った。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡとＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造社製）とのライゲーションを行った。ライゲーション後に得られたＤＮＡを、以下の順で、リン酸化処理、ＸＨｏｉでの切断処理、スピンカラム（宝酒造社製）を用いる低分子量ＤＮＡの除去処理、λＺａｐＩＩ（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断）とのライゲーションした後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（以下、ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）と記すこともある。）を調製した。
【００６０】
（２−２）本酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐＴｒｃＲＰｃの構築）
配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（２−１）で調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００６１】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液 １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） 各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ（３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ） ０．３７５μｌ
超純水 ４１．７２５μｌ
【００６２】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）〜５５℃（０．５分間）〜７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
【００６３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクターｐＴｒｃ９９A（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＲＰｃと記すこともある。）を取り出した。
【００６４】
実施例３（本補酵素再生酵素遺伝子の調製）
（３−１）
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＩＦＯ１２１０８株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。このようにして得られた洗浄菌体からＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【００６５】
（３−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製（プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２の構築）
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．１１，６３８１−６３８５（１９８９）に記載された公知のＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＩＷＧ３由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（３−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例２（２−２）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用）。ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの既存「ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイト」にライゲーションする。得られるライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換する。得られる形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてグルコース脱水素酵素を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出す。次に、取り出されるプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析する。その結果を配列番号１１に示す。
【００６６】
実施例４（本酵素遺伝子及び本補酵素再生遺伝子を含有するプラスミドの調製：プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２の構築）
実施例３（３−２）で調製されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、実施例２で調製されるプラスミドｐＴｒｃＲＰｃに２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２と記すこともある。）を取り出した。
【００６７】
実施例５（本酵素遺伝子を含有する形質転換体及び酵素液の調製）
実施例２で調製されたプラスミドｐＴｒｃＲＰｃを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００６８】
実施例６（本酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体及び酵素液の調製）
実施例４で調製されたプラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００６９】
実施例７（大腸菌酵素液の調製）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００７０】
実施例８（大腸菌酵素液の調製）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００７１】
実施例９
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＨ１．３ｍｇ及びイソプロパノール０．１ｍｌを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例１で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１５ｍｇを得た（収率７５％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は９５％ｅｅであることが確認された。
【００７２】
実施例１０
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＰＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例５で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１５．３ｍｇを得た（収率７６％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅであることが確認された。
【００７３】
実施例１１
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例７で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１７．１ｍｇを得た（収率８５％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は４３％ｅｅであることが確認された。
【００７４】
実施例１２
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＰＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例８で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１６．５ｍｇを得た（収率８２％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９０％ｅｅであることが確認された。
【００７５】
実施例１３
ｐＨ７に調製されたリン酸緩衝液にＮＡＤＰ＋、グルコース及びグルコース脱水素酵素を混合し、その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルと実施例６で得られた酵素液とを投入して反応させる。この反応混合物を抽出後、濃縮し、得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィーで精製することで、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルが得られる。
【００７６】
上記の実施例におけるＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（４．６ｍｍΦ×２５ｃｍ；ダイセル化学工業社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１
検出：２５４ｎｍ
溶離液流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出時間：（Ｓ）−体８．３分、（Ｒ）−体９．６分
【００７７】
参考例１ （２−オキソエステル化合物（１）を光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）に変換する能力を有する微生物の取得方法）
（１−１） 洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌等から単離された微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
【００７８】
（１−２） スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１４−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ＋１２ｍｇ、ＮＡＤ＋１２ｍｇ、グルコース２．５ｇ及びグルコースヒドロゲナーゼ１５０Ｕを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇの２−オキソエステル化合物（１）を加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液にトルエン２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層にトルエン２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を混合した後、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、トルエンを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）が含まれていることを液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにて定性分析及び／定量分析（光学純度分析も可能）により確認する。
【００７９】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸に代表される式（３）：
【０００３】
【化１】
で表される２−ヒドロキシ酢酸化合物は、認知障害治療薬等、医農薬の原料として重要な化合物であることが知られており（例えば、特許文献１又は非特許文献１参照。）、その製造方法としては、３−ピリジンカルボキシアルデヒドとシアン化カリウムを塩酸中で反応させる方法（例えば、非特許文献１参照。）が知られている。一方、近年ではその光学活性体が医農薬の合成原料として要望されているが（例えば、特許文献２参照）、前述の製造方法では光学活性体を得ることは困難であり、光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物の工業的に有利な製造法が望まれている。
【特許文献１】ＵＳ５２９６４７８
【特許文献２】特開平８−２０５８７８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．，３５，１４５（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、光学活性な医農薬の合成原料として重要な化合物である光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物に容易に誘導可能な、式（２）：
【０００５】
【化２】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示し、＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（以下、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）という。）の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、式（１）：
【０００７】
【化３】
（式中、Ｒは前記に同じ。）で表される２−オキソエステル化合物（以下、２−オキソエステル化合物（１）という。）に、酵素又は当該酵素を含む触媒を作用させ、高い光学純度の光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、２−オキソエステル化合物（１）に、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を提供でき、光学活性な医農薬の合成原料として有用な光学活性２−ヒドロキシ酢酸化合物を工業的に容易に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
式（１）及び（２）中、Ｒは直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜６の低級アルキル基を示し、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が例示される。
【００１１】
２−オキソエステル化合物（１）としては、例えば２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸メチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸エチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸プロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ヘキシル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソプロピル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、２−オキソ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１２】
光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）としては、例えば光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−２−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸メチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸エチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸プロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ヘキシル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソプロピル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸イソブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｓｅｃ−ブチル、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。
【００１３】
本発明製造方法において、２−オキソエステル化合物（１）に作用させる酵素（即ち、本酵素）又は本酵素を含む触媒（即ち、本触媒）とは、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有するものであって、例えば、
（イ）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）若しくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素として要求する本酵素又は本触媒；
（ロ）本酵素又は本触媒が補酵素を要求するものであり、かつ本酵素又は当該触媒が、自らにより消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる能力を有する本酵素又は本触媒；
等を挙げることができる。
【００１４】
本酵素としては、通常キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ヤロイア（Ｙａｒｒｏｉｗａ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アスパルジーラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ライフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属、エスシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素が挙げられ、好ましくは、例えばキャンディダ・アンタルチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ）、スポリディオボラス・サルモニコーラー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ヤロイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｉｗａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、ノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アスパルジーラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、フサリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、ジベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、ライフソニア・スピーシーズ（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ）、エスシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素であり、特に好ましくは、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素である。
【００１５】
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００１６】
ここで、上記（イ）に記載される「補酵素として要求する本酵素」又は上記（ロ）に記載される「補酵素を要求するもの」であることは、例えば、単離された本酵素を用いて補酵素の非存在下で、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を調べることにより確認すればよい。
【００１７】
本酵素又は本触媒は、単離された蛋白質の形態であってもよいし、微生物等の細胞内に含まれた形態であってもよいし、当該細胞を処理することにより得られる細胞処理物のような形態であってもよい。さらに、本酵素を生産する形質転換体又はその処理物（以下、形質転換体処理物と記すこともある。）のような形態であってもよい。ここで「細胞処理物」又は「形質転換体処理物」としては、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞、細胞摩砕物、細胞の自己消化物、細胞の超音波処理物、細胞抽出物、細胞のアルカリ処理物等を挙げることができ、さらにこれら通常用いられる方法で固定化したもの（固定化物）等が挙げられる。
【００１８】
本酵素又は本触媒は、天然に存在するものであっても、遺伝子工学的な手法を用いて作製された形質転換体により産生されるもの又はそれらから調製されるものであってもよい。尚、このような形質転換体を作製する際に用いられる、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子、即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、人為的に合成されたものであってもよい。
【００１９】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
【００２０】
前記（ｂ）「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００２１】
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、２−オキソエステル化合物（１）を２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
【００２２】
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、［１］グリシン、アラニン；［２］バリン、イソロイシン、ロイシン；［３］アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；［４］セリン、スレオニン；［５］リジン、アルギニン；［６］フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００２３】
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
【００２４】
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
【００２５】
前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ、９０ｍＭ クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、１０Ｎ ＮａＣｌでｐＨを調製した後、全量を１０００ ｍｌとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． (１９８９), ６．３．１〜６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００２６】
本酵素又は本触媒の調製方法について以下に説明する。まず、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、本遺伝子）、例えば、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと配列相同性が８０％以上であるＤＮＡ、コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を調製する。具体的には、例えば、（Ｉ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列（即ち、本アミノ酸配列）をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（ＩＩ）配列番号２又は４で示される塩基配列（即ち、本塩基配列）を有するＤＮＡ等を調製すればよい。
【００２７】
本遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属又はペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）等のペニシリウム属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法［例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法］に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、例えば配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２又は４で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本遺伝子を調製する。
【００２８】
ここでコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム又はペニシリウム・シトリナム由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号５又は７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６又は８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本遺伝子を調製することになる。
【００２９】
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）〜５０℃（０．５分間）〜７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）〜５５℃（０．５分間）〜７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００３０】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００３１】
次いで、調製された本遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じて本酵素又は本触媒を製造・取得することにより本酵素又は本触媒を調製するには以下のように行う。まず、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本酵素又は本触媒を取得又は調製すればよい。
【００３２】
上記のプラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。ここで、「機能可能な形で」とは、当該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、ｔａｃプロモーター若しくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等を挙げることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナムにおいて本還元遺伝子等の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
【００３３】
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
【００３４】
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ ２０， ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｐ２０２， 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。宿主細胞としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）若しくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等（尚、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等であってもよい。）を挙げることができる。例えば、形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
【００３５】
本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００３６】
宿主細胞において本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００３７】
形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源及びビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００３８】
培養温度は、形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００３９】
形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４０】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００４１】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。さらに、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００４２】
本酵素又は本触媒の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法及び／又は細胞処理若しくは形質転換体処理に通常使用される方法等を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕又は溶解する。得られた破砕液又は溶解液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本酵素を精製することができる。
【００４３】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００４４】
また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等を遠心分離などで除去し、培養上清から本酵素を前記と同様にして精製してもよい。必要であれば、精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本酵素等を閉じ込める方法）等により前記のようにして精製された本酵素を不溶化した固定化物として本触媒を調製してもよい。さらにまた、前記の培養により得られた形質転換体や本酵素を含む細胞の培養物等を、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）等により死滅化させた処理物として本触媒を調製してもよい。尚、前記の殺菌法のうちできるだけ本酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
【００４５】
続いて、本発明製造方法における還元反応について説明する。
本発明製造方法において２−オキソエステル化合物（１）を不斉的に還元して光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）を生成する反応は、２−オキソエステル化合物（１）に本酵素（尚、勿論、形質転換体又はその死菌化細胞の形態で提供される本酵素であってもよい。）又は本触媒を作用させることによって達成される。当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は２−オキソエステル化合物（１）１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。当該反応に際しては、２−オキソエステル化合物（１）を反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００４６】
反応温度としては、本酵素又は本触媒の安定性、反応速度の点から１５〜５０℃程度をあげることができ、好ましくは約２０〜４０℃が挙げられる。反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、通常４〜１１、好ましくは６〜９を挙げることができる。
【００４７】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔｅｒｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。反応に使用する有機溶媒の量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００４８】
本発明製造方法はさらに、本酵素又は本触媒が例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等のような補酵素を要求するものである場合には、本酵素又は当該触媒により消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる工程（即ち、補酵素再生工程）を含有させることもできる。反応に用いられる補酵素の量は、本発明における第一工程及び上記の補酵素再生工程が円滑に進行するだけの量が存在すればよいが、例えば、第一工程の場合は２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、１．０モル倍以上、好ましくは１．１モル倍以上の量であり、補酵素再生工程の場合は２−オキソエステル化合物（１）に対して、通常、０．５重量倍以下、好ましくは０．１重量倍以下の量を挙げることができる。
【００４９】
補酵素再生工程では、２−オキソエステル化合物（１）の不斉的な還元反応において化学量論量の還元型補酵素（電子供与体）が消費された結果生じた酸化型補酵素（電子受容体）を、再び還元型補酵素（電子供与体）に変換する能力を有する酵素（以下、補酵素再生酵素と記す。）の利用が不可欠となる。この場合には、補酵素再生酵素は、前記不斉的な還元反応を行う本酵素又は本触媒とは異なる酵素であってもよいし、また本酵素又は本触媒が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つものであってもよい。もちろん両者の組み合わせであってもよい。因みに、補酵素再生酵素が前記不斉的な還元反応を行う本酵素又は本触媒とは異なる酵素である場合における補酵素再生酵素の量としては、例えば、２−オキソエステル化合物（１）に対して０．１重量倍以下、好ましくは０．０５重量倍以下を挙げることができる。
【００５０】
ここで、「本酵素又は本触媒が補酵素再生酵素としての機能を合わせ持つもの」であることは、例えば、単離された酵素を用いて酸化型補酵素（電子受容体）の存在下で、補酵素再生酵素の基質である再生系原料化合物を酸化させる反応を行うことにより還元型補酵素（電子供与体）を生ずるか否かを調べることにより確認すればよい。
【００５１】
補酵素再生酵素としては、例えば、アルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。中でも、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール等の脂肪族アルコール又はグルコースを酸化することにより補酵素再生を行う補酵素再生酵素が好ましい。
【００５２】
この場合に用いられる脂肪族アルコールの使用量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して通常１００モル倍以下、好ましくは２０モル倍以下であり、グルコースの使用量は、２−オキソエステル化合物（１）に対して通常０．５〜１０モル倍、好ましくは０．８〜５モル倍、より好ましくは１〜３モル倍である。尚、補酵素再生酵素は、酵素そのものとして反応系内に共存させてもよいし、また本酵素を含む微生物等の細胞又はその処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。さらにまた、補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、補酵素再生系遺伝子と記すこともある。）を含む形質転換体又はその処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。
【００５３】
ここで処理物とは、前述にある「細胞処理物」又は「形質転換体処理物」と同等なものを意味する。また「補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体」を作製する方法としては、例えば、単一である、本酵素の遺伝子と補酵素再生酵素の遺伝子との両遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入することにより作製する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換することにより作製する方法等が挙げられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も挙げることができる。尚、単一である、両遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築する方法を挙げることができる。
【００５４】
反応は、例えば、水、２−オキソエステル化合物（１）、形質転換体又はその死菌化細胞、及び必要に応じて補酵素、有機溶媒等を混合し、攪拌、振盪することにより行うことができる。
【００５５】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲を挙げることができる。
【００５６】
反応終了後は、触媒として酵素を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例等により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１（本酵素遺伝子、本酵素を発現する形質転換体及び本酵素液の調製）
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ（即ち、本遺伝子）を含有するプラスミドｐＫＡＲを以下のようにして調製した。まず、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５２，３８６−３９２（１９９９）等に記載されるプラスミドｐＵＡＲ（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）から、配列番号２で示されるＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩを用いて切り出した。切り出されたＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ／ＳｍａＩ処理したｐＫＫ２２３−３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＴａｃプロモーターの下流に挿入した。このようにしてプラスミドｐＫＡＲを構築した。構築されたプラスミドｐＫＡＲを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した。次に、フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを溶解した。この溶液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨを７．０に調整した。）１００ｍｌを入れ、滅菌した後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、ＺｎＣｌ２を０．０１％（ｗ／ｖ）、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を０．４ｍＭになるように加えた。このようにして調製された培地に、上記で得られた形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＫＡＲ株）が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、好気条件下３０℃で１４時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、本遺伝子を含む形質転換体である洗浄菌体を得た。得られた洗浄菌体６．５４ｇを１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００５９】
実施例２（本酵素遺伝子の調製）
（２−１）
ｃＤＮＡライブラリーの調製５００ｍｌフラスコに培地（水にポテト・デキストロース・ブロース（ベクトン・ディッキンソン社製）を２４ｇ／Lの割合で溶解したもの）１００ｍｌを入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。ここに同組成の培地中で培養（３０℃、４８時間、振盪培養）したペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ４６３１株の培養液０．５ｍｌを加え、３０℃で７２時間振盪培養した。その後、得られた培養液を遠心し（８０００ｘｇ、１０分）、生じた沈殿を集めた。この沈殿を２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５０ｍｌで３回洗浄して、約１．０ｇの洗浄菌体を得た。ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ４６３１株の洗浄菌体を用いて、チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法で全ＲＮＡを調製した。調製された全ＲＮＡから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ｄＴ）３０−Ｓｕｐｅｒ（宝酒造社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡを得た。ｃＤＮＡライブラリーの作製は、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ法に基づいて実施した。まず、上記のようにして得られたｐｏｌｙ（Ａ）を有するＲＮＡ、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８−リンカープライマー（（含ＸＨｏｉサイト）宝酒造社製）、ＲＡＶ−２ Ｒｔａｓｅ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ Ｒｔａｓｅを用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製した。調製された一本鎖ｃＤＮＡ（を含む前記反応液）にＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ及びＴ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えることにより、二本鎖ｃＤＮＡの合成及び当該二本鎖ｃＤＮＡの平滑末端化処理を行った。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡとＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造社製）とのライゲーションを行った。ライゲーション後に得られたＤＮＡを、以下の順で、リン酸化処理、ＸＨｏｉでの切断処理、スピンカラム（宝酒造社製）を用いる低分子量ＤＮＡの除去処理、λＺａｐＩＩ（ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断）とのライゲーションした後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングすることにより、ｃＤＮＡライブラリー（以下、ｃＤＮＡライブラリー（Ａ）と記すこともある。）を調製した。
【００６０】
（２−２）本酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐＴｒｃＲＰｃの構築）
配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（２−１）で調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用）
【００６１】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液 １μｌ
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ−ｍｉｘ） ０．４μｌ
プライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ） 各０．７５μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ２） ５μｌ
ｅｎｚ．ｅｘｐａｎｄＨｉＦｉ（３．５ｘ１０３Ｕ／ｍｌ） ０．３７５μｌ
超純水 ４１．７２５μｌ
【００６２】
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）−５５℃（０．５分間）−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）〜５５℃（０．５分間）〜７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持した。
【００６３】
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。一方、ベクターｐＴｒｃ９９A（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＲＰｃと記すこともある。）を取り出した。
【００６４】
実施例３（本補酵素再生酵素遺伝子の調製）
（３−１）
酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＩＦＯ１２１０８株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。このようにして得られた洗浄菌体からＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【００６５】
（３−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製（プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２の構築）
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．１１，６３８１−６３８５（１９８９）に記載された公知のＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＩＷＧ３由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（３−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例２（２−２）に記載させる反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う（ロシュ・ダイアグノスティック社製のＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用）。ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯＴＭＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットを用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターの既存「ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイト」にライゲーションする。得られるライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換する。得られる形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてグルコース脱水素酵素を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出す。次に、取り出されるプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析する。その結果を配列番号１１に示す。
【００６６】
実施例４（本酵素遺伝子及び本補酵素再生遺伝子を含有するプラスミドの調製：プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２の構築）
実施例３（３−２）で調製されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。一方、実施例２で調製されるプラスミドｐＴｒｃＲＰｃに２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて本還元酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２と記すこともある。）を取り出した。
【００６７】
実施例５（本酵素遺伝子を含有する形質転換体及び酵素液の調製）
実施例２で調製されたプラスミドｐＴｒｃＲＰｃを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００６８】
実施例６（本酵素遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を含有する形質転換体及び酵素液の調製）
実施例４で調製されたプラスミドｐＴｒｃＲＳｂＧ１２を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体を０．１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００６９】
実施例７（大腸菌酵素液の調製）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００７０】
実施例８（大腸菌酵素液の調製）
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ×１７本）に接種した後、これを振盪培養した（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体６．５４ｇを得た。得られた洗浄菌体を１５ｍｌの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）に懸濁し、１５ｇのガラスビーズを添加して、菌体破砕した。破砕終了後、遠心分離にて上清液を取得し、酵素液とした。
【００７１】
実施例９
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＨ１．３ｍｇ及びイソプロパノール０．１ｍｌを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例１で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１５ｍｇを得た（収率７５％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は９５％ｅｅであることが確認された。
【００７２】
実施例１０
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＰＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例５で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１５．３ｍｇを得た（収率７６％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は９９％ｅｅであることが確認された。
【００７３】
実施例１１
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例７で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１７．１ｍｇを得た（収率８５％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｒ）−体であり、光学純度は４３％ｅｅであることが確認された。
【００７４】
実施例１２
ｐＨ７に調製された２５０ｍＭリン酸緩衝液２ｍｌにＮＡＤＰＨ７５ｍｇを混合して、温度計を備えたガラス製フラスコに仕込み３０℃に保温した。その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル２０ｍｇと実施例８で得られた酵素液（５０ｍｇ）とを投入し、８時間撹拌して反応させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、エバポレーターを用いて濃縮して、濃縮オイルを得た。得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：トルエン／酢酸エチル＝２：１）で精製し、油状の光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチル１６．５ｍｇを得た（収率８２％）。得られた光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルをピリジン−ベンゾイルクロリドによりベンゾイル化したベンゾエート誘導体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の結果、立体構造は（Ｓ）−体であり、光学純度は９０％ｅｅであることが確認された。
【００７５】
実施例１３
ｐＨ７に調製されたリン酸緩衝液にＮＡＤＰ＋、グルコース及びグルコース脱水素酵素を混合し、その中に、２−オキソ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルと実施例６で得られた酵素液とを投入して反応させる。この反応混合物を抽出後、濃縮し、得られた濃縮オイルをカラムクロマトグラフィーで精製することで、光学活性２−ヒドロキシ−２−（ピリジン−３−イル）酢酸ブチルが得られる。
【００７６】
上記の実施例におけるＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（４．６ｍｍΦ×２５ｃｍ；ダイセル化学工業社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９／１
検出：２５４ｎｍ
溶離液流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出時間：（Ｓ）−体８．３分、（Ｒ）−体９．６分
【００７７】
参考例１ （２−オキソエステル化合物（１）を光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）に変換する能力を有する微生物の取得方法）
（１−１） 洗浄菌体の調製
市販の微生物又は土壌等から単離された微生物を滅菌ＬＢ培地（１０ｍｌ）に接種した後、これを振盪培養する（３０℃、１８時間）。培養後、培養液を遠心分離・洗浄することにより、洗浄菌体を回収する。
【００７８】
（１−２） スクリーニング
１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）２０ｍｌに、上記（１４−１）で調製された洗浄菌体１ｇ、ＮＡＤＰ＋１２ｍｇ、ＮＡＤ＋１２ｍｇ、グルコース２．５ｇ及びグルコースヒドロゲナーゼ１５０Ｕを加える。この混合物に、さらに２４０ｍｇの２−オキソエステル化合物（１）を加えた後、当該混合物のｐＨを１５％炭酸ナトリウム水溶液で７に調製する。このようにして得られる混合物（反応液）を３０℃で４時間攪拌することにより反応を行う。反応終了後、反応液にトルエン２５ｍｌを注加攪拌し、次いで遠心分離することにより有機層及び水層を別々に回収する。回収される水層にトルエン２５ｍｌを加えて同様な操作を行う。このようにして得られる有機層を混合した後、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥する。乾燥後、トルエンを留去することにより残渣を得る。得られる残渣に、光学活性２−ヒドロキシエステル化合物（２）が含まれていることを液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにて定性分析及び／定量分析（光学純度分析も可能）により確認する。
【００７９】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示す。）で表される２−オキソエステル化合物に、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）：
【化２】
（式中、Ｒは前記に同じ。＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法。
【請求項２】
酵素又は当該酵素を有する触媒が、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオシド）若しくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素として要求するものであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酵素又は当該酵素を含む触媒が補酵素を要求するものであり、且つ当該酵素又は当該触媒により消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる工程を含有することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
酵素又は当該酵素を含む触媒が補酵素を要求するものであり、且つ当該酵素又は当該触媒が、自らにより消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる能力を有するものであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム属、ペニシリウム属、エスシェリヒア属からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素又は当該酵素を含む触媒である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナム、エスシェリヒア・コリからなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素又は当該酵素を含む触媒である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項６記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項８】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム属に属する微生物由来の酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、ペニシリウム属に属する微生物由来の酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１】
式（１）：
【化１】
（式中、Ｒは低級アルキル基を示す。）で表される２−オキソエステル化合物に、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）：
【化２】
（式中、Ｒは前記に同じ。＊は光学活性な炭素原子であることを示す。）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素又は当該酵素を有する触媒を作用させることを特徴とする、式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物の製造方法。
【請求項２】
酵素又は当該酵素を有する触媒が、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオシド）若しくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素として要求するものであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
酵素又は当該酵素を含む触媒が補酵素を要求するものであり、且つ当該酵素又は当該触媒により消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる工程を含有することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
酵素又は当該酵素を含む触媒が補酵素を要求するものであり、且つ当該酵素又は当該触媒が、自らにより消費された補酵素を、電子受容体（酸化型補酵素）から電子供与体（還元型補酵素）に、不斉的な還元反応に付随しながら再生させる能力を有するものであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム属、ペニシリウム属、エスシェリヒア属からなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素又は当該酵素を含む触媒である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナム、エスシェリヒア・コリからなる群より選ばれた微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を酵素源とした酵素又は当該酵素を含む触媒である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項６記載の製造方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列に相補性を有する塩基配列がコードするアミノ酸配列を有し、かつ、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）コリネバクテリウム属又はペニシリウム属に属する微生物由来の、式（１）で表される２−オキソエステル化合物を不斉的に還元して式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシエステル化合物を生成する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項８】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、配列番号２又は４で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、コリネバクテリウム属に属する微生物由来の酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
酵素又は当該酵素を含む触媒が、ペニシリウム属に属する微生物由来の酵素又は当該酵素を含む触媒であることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【公開番号】特開２００６−３２５４９５（Ｐ２００６−３２５４９５Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５４８１４（Ｐ２００５−１５４８１４）
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（０００１６７６４６）広栄化学工業株式会社 (114)
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（０００１６７６４６）広栄化学工業株式会社 (114)
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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