光架橋多糖組成物およびその製造方法
多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法、および該製造方法により得られる光架橋多糖組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は光反応性基が結合した光反応性多糖を架橋させてなる光架橋多糖組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
多糖の架橋ゲルを得るための技術の一例としては、架橋剤としてジグリシジルエーテルを用いてコンドロイチン硫酸（以下、ＣＳとも言う）を架橋させてゲル化させる例がＥｕｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００２ Ｍａｒ；１５（２）：１３９−４８に記載されている。しかし、このような架橋剤を使用すると、コンドロイチン硫酸と架橋剤の反応と同時に架橋反応が起こるため、未反応の架橋剤をゲルから除去するのが困難であるという問題点が存在した。
そこで、架橋剤の除去が容易である光反応性多糖を光架橋させる技術が開発されている。例えば光架橋基を予めグリコサミノグリカンに結合して、光反応性グリコサミノグリカンを得、これを精製することにより未反応の架橋剤を除去した後、光を照射して架橋グリコサミノグリカンを得る技術が知られている（特開平６−７３１０２号）。この文献には、コンドロイチン硫酸に光架橋基を結合させて光反応性コンドロイチン硫酸を得、これをリン酸緩衝生理的食塩水に溶解した後、溶液状態で水銀ランプを用いて紫外線を照射してゲル化させる技術が記載されている。しかし、かかる方法によって架橋グリコサミノグリカンのゲルを得ようとしても、溶液状態での架橋反応では、架橋の効率が悪く、高い濃度（１０％以上）の光反応性グリコサミノグリカンを含む水溶液を調製して光を照射しなければならず、必ずしも効率の良い方法とは言うことができなかった。
一方、光反応性多糖を効率よく架橋させる技術として、例えばグリコサミノグリカンに光架橋基を結合させた光反応性グリコサミノグリカンを水性溶媒に溶解した溶液を凍結させて、凍結状態を保ったまま光を照射して架橋させる技術が知られている（ＷＯ０２／０６０９７１）。この方法では、極めて優れた給排水性を有するスポンジ（多孔質）性状を示す架橋グリコサミノグリカンが特異的に得られ、ゲル性状を示す架橋グリコサミノグリカンは得られなかった。
【発明の開示】
光反応性基が結合してなる光反応性多糖を効率よく容易に架橋させることが出来、ゲル性状を得ることが出来る光架橋多糖の製造方法が望まれていた。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、光反応性多糖と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤またはキレート剤の何れか一つの物質とを水性溶媒に溶解した溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、これを必要に応じて溶融させることにより、容易に、ゲル性状のものも得られ、また、当該方法により光反応性多糖が容易に且つ非常に効率良く架橋するという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成した。
すなわち本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１） 多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法。
（２） アルコールが、前記光反応性多糖の水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールである上記（１）記載の方法。
（３） アルコールが、下記式（Ｉ）で表される上記（１）又は（２）の何れか一項に記載の方法。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
（４） 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又はアニオン界面活性剤である上記（１）記載の方法。
（５） 非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールであり、アニオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である上記（４）記載の方法。
（６） キレート剤が、オキシカルボン酸類またはポリアミノカルボン酸類から選択される上記（１）記載の方法。
（７） オキシカルボン酸類がクエン酸であり、ポリアミノカルボン酸類がエチレンジアミン四酢酸である上記（６）記載の方法。
（８） 光反応性多糖を構成する多糖が、ヘテログリカン、ホモグリカン、またはそれらの誘導体である上記（１）〜（７）の何れか一項に記載の方法。
（９） ヘテログリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択されるグリコサミノグリカンであり、ホモグリカンが、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される酸性ホモグリカンである上記（８）記載の方法。
（１０） グリコサミノグリカン誘導体が、脱硫酸化および／または酸化還元誘導体である上記（８）記載の方法。
（１１） 脱硫酸化誘導体が、ヘパリンのＮ−アセチルグコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基を除去した６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンである上記（１０）記載の方法。
（１２） 多糖の重量平均分子量が１，５００以上５００，０００以下であることを特徴とする上記（１）〜（１１）の何れか一項記載の方法。
（１３） 光反応性多糖における光反応性基が、多糖のカルボキシル基に結合してなることを特徴とする上記（１）〜（１２）の何れか一項記載の方法。
（１４） 光反応性多糖含有溶液中に光反応性多糖が０．５〜１０％含有する溶液である上記（１）〜（１３）の何れか一項記載の方法。
（１５） 光反応性多糖が、分子量１，５００以上１００，０００以下のグリコサミノグリカンである上記（１４）記載の方法。
（１６） 光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物。
（１７） 回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓであり、且つ、ゲル状を示す上記（１６）記載の光架橋多糖組成物。
（１８） 上記（１７）記載の光架橋多糖組成物が、該組成物を押し出し可能な注入具に充填された光架橋多糖組成物注入用キット。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）、クエン酸（２％）、クエン酸（４％）、ＳＤＳ（４％）、ＥＤＴＡ（４％）及びｄ−ソルビトール（８％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの性状を示す写真である。
第２図は、実施例６における、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）及びクエン酸を各々添加し得られた光架橋多糖組成物と、対照についてのオシレーションテストの結果である。図中、菱形は試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）、四角は試料１ｍＬの損失弾性率（Ｇ”）、三角は損失正接（ｔａｎδ：（Ｇ”／Ｇ’））を示す。左側の縦軸の目盛は応力（Ｐａ；パスカル）を、右側の縦軸の目盛は損失正接を示す。横軸の目盛は周波数（Ｈｚ；ヘルツ）を示す。
第３図は、ＰＥＧ４０００（２％）、ＳＤＳ（４％）及びＥＤＴＡ（４％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの性状を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本発明は、多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法に関する（以下、「本発明製造方法」とも言う）。
更に、本発明は、光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物に関する（以下、「本発明組成物」とも言う）。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖を構成する多糖とは、ヘテログリカンもしくはホモグリカンまたはそれらの誘導体があげられる。なお、光反応性多糖を構成する多糖とは、本発明組成物における光架橋多糖を構成する多糖と同一である。
ヘテログリカンとは二種類以上の異なる単糖を構成糖とする多糖であり、本発明においては、特にグリコサミノグリカン又はその誘導体が好ましい。グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧとも言う。）とは、アミノ糖とウロン酸（又はガラクトース）を含む基本骨格からなる多糖である。例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸が挙げられ、好ましくは、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパリンが挙げられ、更に好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパリンが挙げられる。
この様なグリコサミノグリカンの誘導体とは、ＧＡＧに硫酸基を結合させた硫酸化誘導体、ＧＡＧから硫酸基を部分的又は完全に除去した脱硫酸化誘導体、ＧＡＧを酸化還元反応に付した酸化還元誘導体、ＧＡＧを酸化還元反応および脱硫酸化反応に付した酸化還元−脱硫酸化誘導体などが挙げられる。硫酸化誘導体としては、硫酸化ヒアルロン酸やコンドロイチンポリ硫酸などが挙げられ、脱硫酸化誘導体としては、６位脱硫酸化ヘパリン（ＷＯ００／０６６０８）、２位脱硫酸化ヘパリン（特開２００３−１１３０９０）及び完全脱硫酸化ヘパリン等が挙げられ、酸化還元−脱硫酸化誘導体としては、過ヨウ素酸酸化還元−脱硫酸化ヘパリン（特開平１１−３１０６０２）等が挙げられる。中でも脱硫酸化誘導体及び酸化還元−脱硫酸化誘導体が好ましく、特に脱硫酸化誘導体が好ましい。
一方、ホモグリカンとは一種類の単糖を構成糖とする多糖であり、本発明においては、グルカン（アミロース、セルロース等）、マンナン、グリクロナン（ペクチン酸、アルギン酸等）、ポリグリコサミン（キチン、コロミン酸等）、ポリガラクトサミン等が例示され、より好ましくはグルカン、アルギン酸が挙げられ、特に好ましくはセルロース及びアルギン酸が挙げられる。
この様なホモグリカンの誘導体とは、カルボキシメチルセルロース等の様なカルボキシメチル誘導体、ヒドロキシメチルセルロース等の様なヒドロキシメチル誘導体、キトサン等の様な脱アセチル化誘導体等が挙げられる。本発明においては、特に水溶性を呈する誘導体が好ましい為、カルボキシメチル誘導体及びヒドロキシメチル誘導体が好ましく、カルボキシメチル誘導体がより好ましく、中でもカルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣとも言う。）が最も好ましい。
なお、アルギン酸およびＣＭＣはいずれも酸性ホモグリカンである。
また、本発明においては、上記で例示した多糖を２種類以上混合して使用しても構わない。
本発明に用いる多糖の重量平均分子量は１，５００以上５００，０００以下であることが好ましく、１，５００以上２５０，０００以下であることがより好ましく、１，５００以上１５０，０００以下であることが更に好ましく、１，５００以上１００，０００以下であることが最も好ましい。
なお、従来、比較的低分子量のＧＡＧに光反応性基を結合してなる光反応性ＧＡＧを溶解した溶液に、光照射し、架橋させ、ゲル状の光架橋ＧＡＧを得る技術は、条件設定等が困難であり難しかった。しかし、本発明製造方法を用いると、比較的低分子量の多糖からなる光反応性多糖を用いても、極めて容易にゲル性状の光架橋多糖組成物を得ることが出来る。
本発明に用いる多糖は、天然物由来でも、化学的に合成したり、遺伝子工学的手法により酵母等の微生物に生産させたものであっても良い。ＧＡＧに関しては、一般的には生物材料（鶏冠、臍帯、軟骨、皮膚、小腸、血管など）から抽出することで調製することが可能であり、好ましい。
本発明における光架橋多糖を構成する光反応性基（光架橋基）とは、光反応性多糖を構成する光反応性残基からなる架橋基である。光反応性残基としては、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合化反応を生じる化合物の残基であれば良く、具体例としては、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、アクリル酸、アクリル酸誘導体、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン等が挙げられる。なお、置換ケイ皮酸としては、例えばベンゼン環の何れかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸であるアミノケイ皮酸（好ましくはｐ−アミノケイ皮酸）が挙げられ、アクリル酸誘導体としては、例えばチオフェンアクリル酸、フリルアクリル酸等が挙げられる。
これら光反応性残基の中でも、光反応によりシクロブタン環を形成可能なビニレン基を有したものであることが好ましく、光反応性及び安全性の面から、ケイ皮酸または置換ケイ皮酸が特に好ましく、置換ケイ皮酸としては中でもアミノケイ皮酸が好ましい。
また、本発明においては、光反応性多糖を形成した時に、光反応性残基と多糖の両方に結合して一定の距離を保つためのスペーサーを含んでいても構わない。本発明において使用される光反応性基（光架橋基）は光反応性残基とスペーサーが結合していても良く、スペーサーを介して多糖に結合していることが好ましい。従って、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸にスペーサーが結合した誘導体が、光反応性基としては最も好ましく、光架橋基としても最も好ましい。
本発明においては、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、チミン等の光反応によって光二量化反応又は光重合化反応を惹起する官能基を「光反応性残基」とし、光反応性残基のみと、光反応性残基にスペーサーが結合した置換基の両方を「光反応性基」又は「光架橋基」と定義する。
上述の様に最も好ましい光架橋基の具体例としては、ケイ皮酸のカルボキシル基に、アミノアルコール（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ：ｎ＝１〜１８、又はＨ２Ｎ−（ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−ＯＨ：ｍ＝１〜９）がエステル結合したケイ皮酸アミノアルキルエステル誘導体、ジアミン（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨ２：ｌ＝１〜１０）やジオール（ＨＯ−（ＣＨ２）ｋ−ＯＨ：ｋ＝１〜１０）がケイ皮酸又は置換ケイ皮酸に導入された誘導体、アミノ酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨＲ）ｊ−ＮＨ２：ｊ＝１〜１０）やペプチドなどを置換ケイ皮酸（アミノケイ皮酸）に導入した誘導体などが挙げられる。中でも、ケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールが導入された誘導体（ケイ皮酸アミノアルキルエステル）が好ましく、アミノアルコールは上記一般式においてｎが１〜１８が好ましく、特に３〜６が好ましく、３〜４が極めて好ましい。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖の多糖と光反応性基が結合している部位、つまり、本発明組成物における光架橋多糖の多糖と光架橋基の結合している部位は、用いる多糖と用いる光反応性基（光架橋基）各々が有する官能基により選択可能であり、特に限定されない。例えば、多糖としてヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びその誘導体等のＧＡＧを用いる場合には、当該結合部位としてはアミノ基（アセチルアミノ基又はスルファミノ基として存在する）、ヒドロキシル基、カルボキシル基等が挙げられるが、特にカルボキシル基が好ましい。一例として、ケイ皮酸アミノアルキルエステルを光反応性基（光架橋基）として使用し、多糖としてＧＡＧ又はその誘導体を使用する場合には、アミノアルキルのアミノ基とＧＡＧ又はその誘導体のカルボキシル基とがアミド結合することによって光反応性基（光架橋基）がＧＡＧに結合される。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖の光反応性基の導入率は、０．１〜７５％、好ましくは０．３〜７０％であり、上述の様に、本発明組成物における光架橋多糖の光架橋基の導入率も、０．１〜７５％、好ましくは０．３〜７０％である。光反応性基（光架橋基）の多糖への導入反応は、例えば特開平６−０７３１０２号等に記載の方法に従い行うことが可能であり、また、この導入率の値は、反応させる多糖のモル数と光反応性基（光架橋基）のモル数とを調節することにより、適宜変更や調節することが可能である。なお、導入率は、後述の測定例１記載の方法により測定することが出来る。
本発明におけるアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質（以下、本発明添加物質とも言う）とは、水性溶媒混和性を有する限りにおいて特に限定はされない。
アルコールとしては、下記式（Ｉ）で示されるアルコールが挙げられる。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
炭素数１〜１０の鎖状アルキルとしてはメチル、エチル等が、炭素数３〜１０の分岐を有するアルキルとしてはイソプロピル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
上記の様なアルコールとしては、低級アルコール、多価アルコールまたは糖アルコールが挙げられる。
低級アルコールとしては、炭素数が１〜１０、より好ましくは１〜８のアルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が例示される。多価アルコールとは、すなわち、分子内に存在するヒドロキシル基が２個以上であるアルコールであり、より好ましくは３個以上のヒドロキシル基を有するアルコールが挙げられる。例えば、エチレングリコール、グリセリンが挙げられ、エチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。また、糖アルコールとしては、鎖状の糖アルコールであっても、環式糖アルコールであっても使用することは可能であるが、鎖状の糖アルコールが好ましい。糖アルコールとしては、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどが好ましく挙げられるが、マンニトール、キシリトール、ソルビトールがより好ましく、マンニトール又はソルビトールが更に好ましく挙げられる。
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤又はアニオン界面活性剤が好ましく挙げられ、中でも、非イオン界面活性剤としてはポリエチレングリコールが、アニオン界面活性剤としてはアルキル硫酸塩が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウムが好ましく挙げられる。
キレート剤としては、クエン酸の様なオキシカルボン酸類やエチレンジアミン四酢酸の様なポリアミノカルボン酸類が挙げられる。
更に、本発明添加物質、特に上記アルコールは、光反応性多糖の水性溶媒溶液に本発明添加物質を添加し凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では当該凍結体が凍結状態を保持している性質を有していると好ましい。ここで凍結状態とは完全に凝固している状態をいう。また、ゲル性状を有する本発明組成物を製造するには、本発明製造方法に従い光照射をした際に生成する架橋体が不溶性固形物にならない性能を有している本発明添加物質が好ましく用いられる。
なお、後述の通り、本発明組成物は医療または医薬用途に用いることが可能であり、その様な用途に用いる際は、本発明添加物質として少なくとも水性溶媒混和性と高い生体適合性を有する物質を選択する必要がある。
本発明製造方法における光反応性多糖含有溶液の溶媒は、光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒であり、水を含んでいる限りにおいて特に限定はされないが、溶液には塩が含まれていても構わない。すなわち、水または水を含む溶液を水性溶媒として、光反応性多糖と本発明添加物質とを溶解しうる溶媒を用いることが出来る。水性溶媒としては、例えば、水、注射用水、生理食塩水、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液やリン酸緩衝生理的食塩水等の緩衝液等を用いることが出来る。
本発明製造方法における光反応性多糖含有溶液中での光反応性多糖の濃度は、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．８〜８％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜６％（ｗ／ｗ）が例示される。また、光反応性多糖含有溶液中での本発明添加物質の濃度は０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．８〜９％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜８％（ｗ／ｗ）が例示される。
なお、本発明製造方法の好ましい態様として、光反応性多糖を構成する多糖の分子量と溶液中での光反応性多糖の濃度との関係からみると、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度０．５〜１０％が好ましく、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度０．８〜８％が更に好ましく、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度１〜６％が最も好ましい。上記の様な条件では、従来の光架橋方法でゲル状の光架橋多糖を得ることが難しかったが、本発明製造方法により容易にゲル状組成物を得ることができる。
光反応性多糖含有溶液の凍結を行なう温度条件は、該溶液が凍結する条件下であれば特に限定はされない。凍結は溶液が完全に凝固する必要はなく、溶液が部分的に凝固している固液混相のいわゆる「シャーベット状」を呈する程度の温度条件であってもよい。従って、本発明製造方法における「凍結」は、かかる固液混相の状態も包含する概念である。しかし、最も好ましい「凍結を行なう温度条件」は、溶液が完全に凝固して固化する温度条件であり、例えば０℃以下、好ましくは−５℃以下、より好ましくは−７℃以下、さらに好ましくは−１５℃以下、最も好ましくは−２０℃以下が挙げられる。
光の照射は、光反応性残基が光二量化反応又は光重合化反応を効率的に起こす程度の条件でなされることが好ましい。照射する光線の種類としては、紫外線が好ましく挙げられ、紫外線としては、多糖のグリコシド結合を切断せず且つ光反応性残基に光架橋反応を生じさせる波長（例えば２００〜６００ｎｍ）の紫外線が選択される。紫外線ランプとしては、高圧水銀ランプ又はメタルハライドランプが好ましい。更に、それらランプにより発生した紫外線の不要波長光を、例えばカットフィルター等で除去することが好ましい。カットフィルターとしては、専用の加工フィルターが好ましいが、不要波長光をカット出来るのであれば市販の硬質ガラスでも十分に対応させることができる。
照射光量は、光反応性多糖が十分に光架橋反応を起こすことができる光量である必要があり、具体的には例えば２８０ｎｍの紫外線で５００ｍＪ／ｃｍ２以上、好ましくは２５００ｍＪ／ｃｍ２以上、最も好ましくは４０００ｍＪ／ｃｍ２以上である。なお、光量計に１／１０減光フィルターを取り付けて使用した際、光量計上の数値は、実際の照射光量の１／１０の値が表示されるが、上記範囲は実際の照射光量である。
本発明組成物は、本発明製造方法により得られる光架橋多糖組成物であり、上述の様に、光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有する本発明添加物質とを少なくとも含む溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られうる。
つまり、本発明組成物は、光架橋多糖と、光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有する本発明添加物質とを少なくとも含む光架橋多糖組成物であり、本発明組成物は、水性溶媒を含む溶液を凍結し、光架橋反応を行った後、溶融させており、水を含む。
本発明組成物は、光反応性多糖含有溶液と比べて高い粘弾性を有しており、水分を豊富に含むヒドロゲルであるゲル性状又は水分の吸排水性に優れたスポンジの性状を示すが、特にゲル性状を示すものが好ましい。一般にゲル状やスポンジ状など粘弾性を有する物質の性状を数値を用いて明確に区分することは難しいが、ゲルの物性を粘弾性で示すのに、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ”）及び損失正接（ｔａｎδ：Ｇ”／Ｇ’）等の動的弾性率や粘度を用いることができる。
例えば、後述の様に本発明組成物を注射用シリンジ等の注入具に充填して用いる場合は、ゲル性状を有する本発明組成物が好適であり、その中でも下記の様な弾性率又は粘度を有するものが好ましい。コントロールストレス制御式レオメーター（英Ｃａｒｒｉ−Ｍｅｄ社製）により測定される弾性率を指標とした場合には、３７℃条件下で０．０１〜１０Ｈｚまで連続的に変化させて測定したときに、貯蔵弾性率（Ｇ’）として、好ましくは０．１〜８００Ｐａ、損失弾性率（Ｇ’’）として、好ましくは１〜１８０Ｐａを示し、損失正接（Ｇ”／Ｇ’）は、好ましくは０．１〜０．８を示す。尚、貯蔵弾性率が高く、損失弾性率が低い場合は、弾性が強く、固いゲルとなり、逆の場合は、粘性の強いゲルであることが知られている。また、回転粘度計により標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される本発明組成物１ｍＬの粘度を指標とした場合には、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓが好ましく、３００〜２０，０００ｍＰａ・Ｓがより好ましい。
本発明組成物における光架橋多糖は、架橋率０．５〜８０％、より好ましくは１．５〜７５％、最も好ましくは５〜７０％を示す。なお、架橋率は、多糖に導入された光架橋基のモル数に対する二量体のモル数の２倍のモル数の比（百分率）として表される。例えば光反応性残基としてケイ皮酸又は置換ケイ皮酸を用い、多糖としてＧＡＧを用いた場合には、測定例２に記載した方法で架橋率を算出することができる。
本発明組成物における光架橋多糖の濃度は、上記光反応性多糖含有溶液中での光反応性多糖の濃度と同じであり、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．８〜８％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜６％（ｗ／ｗ）が例示される。また、本発明組成物における本発明添加物質の濃度は、光反応性多糖含有溶液中での本発明添加物質の濃度とほぼ同じであり、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．８〜９％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜８％（ｗ／ｗ）が例示される。
本発明組成物は、例えば創傷部の保護のための医用材料（創傷被覆材）、生体内の空間を保持するための医用材料（空隙保持材）、骨等の結合組織の空洞を充填するための医用材料（骨充填材）、人工体液（人工関節液、人工涙液、眼科用手術補助材等）、生体表面等の保湿のための材（保湿材）、医薬などの剤型を保持するために添加する添加剤（賦形剤）、細胞培養における細胞の足がかりとするための基材（細胞培養用基材）等に使用することが可能である。特に、ゲル性状を有する本発明組成物は、粘性が高い流動体という特徴的な性状により、上記用途に使用することがより好適であり、また、本発明組成物を押出可能な注入具に充填した形態で上記医療用途に使用される注入用キットとして用いることも可能である。
なお、押出可能な注入具とは、薬剤押出用プランジャー等を具備し、充填されている薬剤を押出可能な注入具であり、通常用いられているものを用いることが可能である。
以下、本発明をより具体的に説明する。
測定例１
光架橋基の導入率の測定方法
多糖における光反応性基（光架橋基）の導入率は、多糖の繰り返し二糖単位あたりに導入された光反応性基の数を百分率で表した値を意味する。導入率の算出に必要な多糖の量は、検量線を利用したカルバゾール測定法により測定し、光反応性残基としてケイ皮酸又はアミノケイ皮酸を使用した場合の光反応性残基の量は、検量線を利用した吸光度測定法（測定波長２６９ｎｍ）により測定した。ただし、カルバゾール測定法が利用できない場合は、検量線を利用した乾燥減量法により測定した。
測定例２
架橋率の測定方法
架橋率は１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム１ｍＬで被検物質１ｇを１時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光反応性基由来物（光反応性残基の単量体及び二量体）を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって解析し、検量線を利用して二量体の量を測定した。そして多糖に導入された光反応性基に対する二量体となった光反応性基のモル数を百分率（％）により算出した。
以下の実施例において、特に断らない場合は％は重量％を示す。
【実施例１】
コンドロイチン硫酸を用いた本発明組成物
（１）サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（本明細書において、ＣＳとも言う。商品名：コンドロイチン硫酸Ｃ、生化学工業株式会社製、重量平均分子量：４５，０００）１ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＨＯＳｕとも言う。）１８２ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣＩ・ＨＣｌとも言う。）１５２ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩（ＨＣｌ・Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−Ｐｈ：Ｐｈはフェニル基を示す。）１９２ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌとも言う）１ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行ってＨＮ−（ＣＨ）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−ＰＨがＣＳのカルボキシル基に結合した光反応性ＣＳ１ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性ＣＳへの光反応性基の導入率は、５．３％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＳを、重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が６％となるように溶解させ、反応溶液とした。反応溶液を０．２２μｍのメンブレンフィルター（日本ミリポア株式会社製）でろ過した後、間隙が１ｍｍとなるよう調節したガラス板に流し込み、−２０℃雰囲気下で反応溶液を凍結させた。凍結状態を維持したまま８００Ｗ高圧水銀ランプ（オーク製作所製）を用いて照射光量が５０００ｍＪ／ｃｍ２となるよう紫外線照射を行った。照射後、室温に戻して融解させるとゲル状の光架橋ＣＳ組成物が得られた。測定例２に従って架橋率を測定したところ３３％であった。
コントロールストレス制御式レオメーター（英Ｃａｒｒｉ−Ｍｅｄ社製：アクリルパラレルプレート 直径４ｃｍ、０°）を用いて、３７℃で０．０１〜１０Ｈｚまで連続的に変化させて測定を行なったところ、試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）は８．１〜７０．５Ｐａ、損失弾性率（Ｇ’’）は５．６〜２９．７Ｐａであった。
一方、対照として、光反応性ＣＳを重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応に付した後、室温に戻して融解させて光架橋ＣＳを得た。当該光架橋ＣＳはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋ＣＳは得られなかった。
【実施例２】
デルマタン硫酸を用いた本発明組成物
（１）鶏冠由来のデルマタン硫酸（生化学工業株式会社製、重量平均分子：３０，０００、以下、ＤＳとも言う。）１ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後、ＨＯＳｕ ４６ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ３８ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩４８ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ １ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、ＨＮ−（ＣＨ）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−ＰＨがカルボキシル基に結合した光反応性ＤＳ１ｇを得た。光反応性ＤＳへの光反応性基の導入率を測定例１に従って測定したところ５．８％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＤＳを、重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が１．５％となるように溶解させ反応溶液とした。実施例１と同様の手順にて、照射光量が７０００ｍＪ／ｃｍ２となる様に当該反応溶液を光架橋反応させ、照射後、室温に戻して融解させてゲル状の光架橋ＤＳ組成物を得た。測定例２に従って架橋率を測定したところ３６％であった。
一方、対照として光反応性ＤＳを、重量濃度が３％となるように５ｍＭリン酸緩衝液に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応後、融解させて得られた光架橋ＤＳはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋ＤＳは得られなかった。
【実施例３】
ヘパリン誘導体を用いた本発明組成物
（１）ブタ小腸由来ヘパリンの誘導体である６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＷＯ００／０６６０８に記載された方法に従って調製したヘパリンの誘導体、重量平均分子量：約９，０００。以下、６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐとも言う。）３ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後、ＨＯＳｕ６１５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ５１３．４ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩６４８．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ２．７ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、６５．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が７％となるように溶解させ、反応溶液とした。反応溶液を０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、間隙が１ｍｍとなるよう調節したパイレックス板に流し込み、−２０℃雰囲気下で凍結させた。凍結状態を維持したまま８００Ｗ高圧水銀ランプを用いて照射光量が５０００ｍＪ／ｃｍ２となるよう紫外線照射を行った。光照射後、室温に戻して融解させると、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物が得られた。測定例２に従い架橋率を測定したところ、６７．６％であった。また、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ社製）を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下にて粘度を測定したところ、光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物１ｍＬの粘度は９８４０ｍＰａ・ｓであった。
一方、対照として、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度３％となる様に注射用水に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応させ、光照射後、融解させて得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐは得られなかった。
【実施例４】
（１）６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ ３ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ２０５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １７１．４ｍｇケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩２１６．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ２．７ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、１６．０％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が７％となる様に、ポリエチレングリコール４００（以下、ＰＥＧ４００とも言う。）を重量濃度が４％となる様に各々溶解させ、反応溶液とした。実施例３（２）と同様の手順にて、各反応溶液を光架橋反応させた後、室温に戻して融解させ光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物を得た。両反応溶液とも、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物であった。更に、得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物について、測定例２に従い架橋率を測定し、回転粘度計を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。尚、明らかに液状の検体にはＲＥ−８０Ｌ、ゲル状の検体にはＲＥ−８０Ｕを使用した。結果は、表１に示す。一方、ｄ−ソルビトールが添加された反応溶液については、未照射の反応溶液についても粘度を測定した。
一方、対照として光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを、重量濃度が３％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐは得られなかった。
【実施例５】
（１）６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ １ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ １３７１ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １１４２ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩１４４０ｍｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ １ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ１．１ｇを得た。測定法１に従い測定した導入率は、１６．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた溶液に、ＰＥＧ４００を重量濃度４％、ＰＥＧ４０００を重量濃度２％、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を重量濃度４％、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を重量濃度４％、クエン酸を重量濃度４％及び２％になる様に各々添加して溶解し、反応溶液とした。６種の反応溶液について、上記実施例３（２）と同様に光架橋反応を行い、光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物を得た。更に、得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物について、回転粘度計を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。結果は表２に示す。
尚、上記で得られた光反応性ＣＳを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた溶液についても、上記と同様に粘度を測定したところ、７６．８ｍＰａ・ｓであった。
【実施例６】
（１）サメ軟骨由来ＣＳ（ロット番号：Ｎ−２５１、生化学工業株式会社製、重量平均分子量：約３０，０００）５ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ１３．７ｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １１．４ｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩１４．４ｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ４ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性ＣＳ４ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、３２．４％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＳを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ４０００及びクエン酸を重量濃度が２％又は４％となる様に各々添加し、ＳＤＳ及びＥＤＴＡを重量濃度が４％となる様に各々添加し、ｄ−ソルビトールを重量濃度が８％となる様に添加し、溶解させ反応溶液とした。これら９種の反応溶液について実施例３（２）と同様に光架橋反応を行い、光架橋ＣＳ組成物を得た。更に、測定例２に従い架橋率を測定し、回転粘度計を用いてコーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。また、光架橋反応前の反応溶液についても同様に粘度を測定した。結果は表３に示す。
一方、対照として光反応性ＣＳを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋ＣＳはスポンジ化しており、ゲル状の架橋ＣＳは得られなかった。
ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）、クエン酸（２％）、クエン酸（４％）、ＳＤＳ（４％）、ＥＤＴＡ（４％）及びｄ−ソルビトール（８％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの外観については、第１図（写真）の通りである。
更に、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）及びクエン酸（４％）を添加して得られた光架橋多糖組成物と、対照について、オシレーションテストを行った。つまり、コントロールストレス制御式レオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製ＲＡ ２０００）を用いて、３７℃で、１０Ｈｚより開始し、０．０１Ｈｚまで連続的に変化させて測定を行ない、試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ’’）を測定し、更に、粘弾性の指標として通常用いられるｔａｎδ（Ｇ”／Ｇ’）を算出した（第２図）。
オシレーションテストの結果は、何れも貯蔵弾性率（Ｇ’）の方が損失弾性率（Ｇ”）より大きく（Ｇ’＞Ｇ”）、つまり、本実施例で得られた物質は、弾性（Ｇ’）が高く、粘性（Ｇ”）が低い物質であることを示している。
【実施例７】
（１）ブタ小腸由来ヘパリン（米ＳＰＦ社製、重量平均分子量：約９，０００、以下Ｈｅｐとも言う。）５ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ６１５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ５１３．４ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩６４８．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性Ｈｅｐ４ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、４７．４％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性Ｈｅｐを重量濃度４％となる様に注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ４０００、クエン酸、ＳＤＳ、ＥＤＴＡおよびｄ−ソルビトールを表４記載の濃度の通りに各々添加し、溶解させ反応溶液とした。これら８種の反応溶液について実施例６と同様に光架橋反応を行い、光架橋Ｈｅｐ組成物を得、架橋率及び粘度を測定した。また、光架橋反応前の未照射の反応溶液にっても同様に粘度を測定した。結果は表４に示す。
一方、対照として光反応性Ｈｅｐを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の架橋Ｈｅｐは得られなかった。
ＰＥＧ４０００（２％）、ＳＤＳ（４％）及びＥＤＴＡ（４％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの外観については、第３図（写真）の通りである。
【実施例８】
（１）カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク製、以下ＣＭＣとも言う）１ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ３２４ｍｇ、ＥＤＣＩ−ＨＣｌ２８５ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩３５０ｍｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ１ｇ添加後にエタノール６００ｍＬに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って光反応性ＣＭＣ１ｇを得た。光反応性基の導入率は、１９．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＭＣを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００を重量濃度が４％、ｄ−ソルビトールを重量濃度が８％となるように各々溶解させ反応溶液とした。反応溶液を実施例３（２）と同様に光架橋反応を行ったところ、両方共に、ゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物を得た。
一方、対照として光反応性ＣＭＣを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付したところ、スポンジ性状の光架橋ＣＭＣが得られた。
【実施例９】
実施例８で得られたゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物２種とスポンジ状の光架橋ＣＭＣを、１ｍＬシリンジに各々約０．３ｍＬ（約３０ｍｍ）充填し、これを被検物質とした。各被検物質に、上からブルーデキストラン溶液０．２ｍＬを静かに添加した後、４０００ｒｐｍ ｘ ３分間遠心分離した。尚、１ｍＬシリンジは、１ｍＬを１ｃｍに換算でき、一目盛りが１ｍｍである。、浸透割合はブルーデキストラン溶液との接触表面からの目盛り幅で表す。その結果、スポンジ性状の光架橋ＣＭＣにおいては、ブルーデキストランは２５ｍｍまで浸透していたが、ゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物においては、ブルーデキストランの浸透が抑制されており、ＰＥＧ４００（４％）を添加して得られた光架橋ＣＭＣ組成物が１５ｍｍ、ｄ−ソルビトール（８％）を添加して得られた光架橋ＣＭＣ組成物が４ｍｍであった。
更に、実施例６において、ｄ−ソルビトール（８％）、ＰＥＧ４０００（２％）を各々添加して得られたゲル状の光架橋ＣＳ組成物と対照としたスポンジ状の光架橋ＣＳを、１ｍＬシリンジに約０．４ｍＬ充填した。これを被検物質として、上記と同様にブルーデキストラン溶液の浸透割合をみた。結果、ｄ−ソルビトール（８％）を添加して得られた光架橋ＣＳ組成物においては、ブルーデキストラン溶液との接触表面から５ｍｍ、ＰＥＧ４０００（２％）を添加した得られた光架橋ＣＳ組成物においては４ｍｍであり、何れもブルーデキストランの浸透が抑制されていた。しかし、スポンジ状の光架橋ＣＳは１７ｍｍであり、ブルーデキストランの浸透性が高かった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年３月１１日出願の日本特許出願（特願２００３−０６５７０４）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明により、新規な光架橋多糖組成物及びその製造方法を提供する。当該製造方法により光反応性多糖は、効率的に光架橋することが可能になる。更に、当該製造方法によると、注入具により注入可能なゲル性状の光架橋多糖組成物も容易に得ることが出来る為、当該ゲルの特異的な性状を利用した医療用途等に用いることが出来、有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は光反応性基が結合した光反応性多糖を架橋させてなる光架橋多糖組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
多糖の架橋ゲルを得るための技術の一例としては、架橋剤としてジグリシジルエーテルを用いてコンドロイチン硫酸（以下、ＣＳとも言う）を架橋させてゲル化させる例がＥｕｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００２ Ｍａｒ；１５（２）：１３９−４８に記載されている。しかし、このような架橋剤を使用すると、コンドロイチン硫酸と架橋剤の反応と同時に架橋反応が起こるため、未反応の架橋剤をゲルから除去するのが困難であるという問題点が存在した。
そこで、架橋剤の除去が容易である光反応性多糖を光架橋させる技術が開発されている。例えば光架橋基を予めグリコサミノグリカンに結合して、光反応性グリコサミノグリカンを得、これを精製することにより未反応の架橋剤を除去した後、光を照射して架橋グリコサミノグリカンを得る技術が知られている（特開平６−７３１０２号）。この文献には、コンドロイチン硫酸に光架橋基を結合させて光反応性コンドロイチン硫酸を得、これをリン酸緩衝生理的食塩水に溶解した後、溶液状態で水銀ランプを用いて紫外線を照射してゲル化させる技術が記載されている。しかし、かかる方法によって架橋グリコサミノグリカンのゲルを得ようとしても、溶液状態での架橋反応では、架橋の効率が悪く、高い濃度（１０％以上）の光反応性グリコサミノグリカンを含む水溶液を調製して光を照射しなければならず、必ずしも効率の良い方法とは言うことができなかった。
一方、光反応性多糖を効率よく架橋させる技術として、例えばグリコサミノグリカンに光架橋基を結合させた光反応性グリコサミノグリカンを水性溶媒に溶解した溶液を凍結させて、凍結状態を保ったまま光を照射して架橋させる技術が知られている（ＷＯ０２／０６０９７１）。この方法では、極めて優れた給排水性を有するスポンジ（多孔質）性状を示す架橋グリコサミノグリカンが特異的に得られ、ゲル性状を示す架橋グリコサミノグリカンは得られなかった。
【発明の開示】
光反応性基が結合してなる光反応性多糖を効率よく容易に架橋させることが出来、ゲル性状を得ることが出来る光架橋多糖の製造方法が望まれていた。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、光反応性多糖と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤またはキレート剤の何れか一つの物質とを水性溶媒に溶解した溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、これを必要に応じて溶融させることにより、容易に、ゲル性状のものも得られ、また、当該方法により光反応性多糖が容易に且つ非常に効率良く架橋するという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成した。
すなわち本発明は以下の（１）〜（１８）に関する。
（１） 多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法。
（２） アルコールが、前記光反応性多糖の水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールである上記（１）記載の方法。
（３） アルコールが、下記式（Ｉ）で表される上記（１）又は（２）の何れか一項に記載の方法。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
（４） 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又はアニオン界面活性剤である上記（１）記載の方法。
（５） 非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールであり、アニオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である上記（４）記載の方法。
（６） キレート剤が、オキシカルボン酸類またはポリアミノカルボン酸類から選択される上記（１）記載の方法。
（７） オキシカルボン酸類がクエン酸であり、ポリアミノカルボン酸類がエチレンジアミン四酢酸である上記（６）記載の方法。
（８） 光反応性多糖を構成する多糖が、ヘテログリカン、ホモグリカン、またはそれらの誘導体である上記（１）〜（７）の何れか一項に記載の方法。
（９） ヘテログリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択されるグリコサミノグリカンであり、ホモグリカンが、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される酸性ホモグリカンである上記（８）記載の方法。
（１０） グリコサミノグリカン誘導体が、脱硫酸化および／または酸化還元誘導体である上記（８）記載の方法。
（１１） 脱硫酸化誘導体が、ヘパリンのＮ−アセチルグコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基を除去した６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンである上記（１０）記載の方法。
（１２） 多糖の重量平均分子量が１，５００以上５００，０００以下であることを特徴とする上記（１）〜（１１）の何れか一項記載の方法。
（１３） 光反応性多糖における光反応性基が、多糖のカルボキシル基に結合してなることを特徴とする上記（１）〜（１２）の何れか一項記載の方法。
（１４） 光反応性多糖含有溶液中に光反応性多糖が０．５〜１０％含有する溶液である上記（１）〜（１３）の何れか一項記載の方法。
（１５） 光反応性多糖が、分子量１，５００以上１００，０００以下のグリコサミノグリカンである上記（１４）記載の方法。
（１６） 光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物。
（１７） 回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓであり、且つ、ゲル状を示す上記（１６）記載の光架橋多糖組成物。
（１８） 上記（１７）記載の光架橋多糖組成物が、該組成物を押し出し可能な注入具に充填された光架橋多糖組成物注入用キット。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）、クエン酸（２％）、クエン酸（４％）、ＳＤＳ（４％）、ＥＤＴＡ（４％）及びｄ−ソルビトール（８％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの性状を示す写真である。
第２図は、実施例６における、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）及びクエン酸を各々添加し得られた光架橋多糖組成物と、対照についてのオシレーションテストの結果である。図中、菱形は試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）、四角は試料１ｍＬの損失弾性率（Ｇ”）、三角は損失正接（ｔａｎδ：（Ｇ”／Ｇ’））を示す。左側の縦軸の目盛は応力（Ｐａ；パスカル）を、右側の縦軸の目盛は損失正接を示す。横軸の目盛は周波数（Ｈｚ；ヘルツ）を示す。
第３図は、ＰＥＧ４０００（２％）、ＳＤＳ（４％）及びＥＤＴＡ（４％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの性状を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
本発明は、多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法に関する（以下、「本発明製造方法」とも言う）。
更に、本発明は、光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物に関する（以下、「本発明組成物」とも言う）。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖を構成する多糖とは、ヘテログリカンもしくはホモグリカンまたはそれらの誘導体があげられる。なお、光反応性多糖を構成する多糖とは、本発明組成物における光架橋多糖を構成する多糖と同一である。
ヘテログリカンとは二種類以上の異なる単糖を構成糖とする多糖であり、本発明においては、特にグリコサミノグリカン又はその誘導体が好ましい。グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧとも言う。）とは、アミノ糖とウロン酸（又はガラクトース）を含む基本骨格からなる多糖である。例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸が挙げられ、好ましくは、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパリンが挙げられ、更に好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパリンが挙げられる。
この様なグリコサミノグリカンの誘導体とは、ＧＡＧに硫酸基を結合させた硫酸化誘導体、ＧＡＧから硫酸基を部分的又は完全に除去した脱硫酸化誘導体、ＧＡＧを酸化還元反応に付した酸化還元誘導体、ＧＡＧを酸化還元反応および脱硫酸化反応に付した酸化還元−脱硫酸化誘導体などが挙げられる。硫酸化誘導体としては、硫酸化ヒアルロン酸やコンドロイチンポリ硫酸などが挙げられ、脱硫酸化誘導体としては、６位脱硫酸化ヘパリン（ＷＯ００／０６６０８）、２位脱硫酸化ヘパリン（特開２００３−１１３０９０）及び完全脱硫酸化ヘパリン等が挙げられ、酸化還元−脱硫酸化誘導体としては、過ヨウ素酸酸化還元−脱硫酸化ヘパリン（特開平１１−３１０６０２）等が挙げられる。中でも脱硫酸化誘導体及び酸化還元−脱硫酸化誘導体が好ましく、特に脱硫酸化誘導体が好ましい。
一方、ホモグリカンとは一種類の単糖を構成糖とする多糖であり、本発明においては、グルカン（アミロース、セルロース等）、マンナン、グリクロナン（ペクチン酸、アルギン酸等）、ポリグリコサミン（キチン、コロミン酸等）、ポリガラクトサミン等が例示され、より好ましくはグルカン、アルギン酸が挙げられ、特に好ましくはセルロース及びアルギン酸が挙げられる。
この様なホモグリカンの誘導体とは、カルボキシメチルセルロース等の様なカルボキシメチル誘導体、ヒドロキシメチルセルロース等の様なヒドロキシメチル誘導体、キトサン等の様な脱アセチル化誘導体等が挙げられる。本発明においては、特に水溶性を呈する誘導体が好ましい為、カルボキシメチル誘導体及びヒドロキシメチル誘導体が好ましく、カルボキシメチル誘導体がより好ましく、中でもカルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣとも言う。）が最も好ましい。
なお、アルギン酸およびＣＭＣはいずれも酸性ホモグリカンである。
また、本発明においては、上記で例示した多糖を２種類以上混合して使用しても構わない。
本発明に用いる多糖の重量平均分子量は１，５００以上５００，０００以下であることが好ましく、１，５００以上２５０，０００以下であることがより好ましく、１，５００以上１５０，０００以下であることが更に好ましく、１，５００以上１００，０００以下であることが最も好ましい。
なお、従来、比較的低分子量のＧＡＧに光反応性基を結合してなる光反応性ＧＡＧを溶解した溶液に、光照射し、架橋させ、ゲル状の光架橋ＧＡＧを得る技術は、条件設定等が困難であり難しかった。しかし、本発明製造方法を用いると、比較的低分子量の多糖からなる光反応性多糖を用いても、極めて容易にゲル性状の光架橋多糖組成物を得ることが出来る。
本発明に用いる多糖は、天然物由来でも、化学的に合成したり、遺伝子工学的手法により酵母等の微生物に生産させたものであっても良い。ＧＡＧに関しては、一般的には生物材料（鶏冠、臍帯、軟骨、皮膚、小腸、血管など）から抽出することで調製することが可能であり、好ましい。
本発明における光架橋多糖を構成する光反応性基（光架橋基）とは、光反応性多糖を構成する光反応性残基からなる架橋基である。光反応性残基としては、紫外線照射によって光二量化反応又は光重合化反応を生じる化合物の残基であれば良く、具体例としては、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、アクリル酸、アクリル酸誘導体、マレイン酸、フマル酸、ソルビン酸、クマリン、チミン等が挙げられる。なお、置換ケイ皮酸としては、例えばベンゼン環の何れかの水素がアミノ基に置換したケイ皮酸であるアミノケイ皮酸（好ましくはｐ−アミノケイ皮酸）が挙げられ、アクリル酸誘導体としては、例えばチオフェンアクリル酸、フリルアクリル酸等が挙げられる。
これら光反応性残基の中でも、光反応によりシクロブタン環を形成可能なビニレン基を有したものであることが好ましく、光反応性及び安全性の面から、ケイ皮酸または置換ケイ皮酸が特に好ましく、置換ケイ皮酸としては中でもアミノケイ皮酸が好ましい。
また、本発明においては、光反応性多糖を形成した時に、光反応性残基と多糖の両方に結合して一定の距離を保つためのスペーサーを含んでいても構わない。本発明において使用される光反応性基（光架橋基）は光反応性残基とスペーサーが結合していても良く、スペーサーを介して多糖に結合していることが好ましい。従って、ケイ皮酸又は置換ケイ皮酸にスペーサーが結合した誘導体が、光反応性基としては最も好ましく、光架橋基としても最も好ましい。
本発明においては、ケイ皮酸、置換ケイ皮酸、チミン等の光反応によって光二量化反応又は光重合化反応を惹起する官能基を「光反応性残基」とし、光反応性残基のみと、光反応性残基にスペーサーが結合した置換基の両方を「光反応性基」又は「光架橋基」と定義する。
上述の様に最も好ましい光架橋基の具体例としては、ケイ皮酸のカルボキシル基に、アミノアルコール（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ：ｎ＝１〜１８、又はＨ２Ｎ−（ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ２−ＯＨ：ｍ＝１〜９）がエステル結合したケイ皮酸アミノアルキルエステル誘導体、ジアミン（Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨ２：ｌ＝１〜１０）やジオール（ＨＯ−（ＣＨ２）ｋ−ＯＨ：ｋ＝１〜１０）がケイ皮酸又は置換ケイ皮酸に導入された誘導体、アミノ酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨＲ）ｊ−ＮＨ２：ｊ＝１〜１０）やペプチドなどを置換ケイ皮酸（アミノケイ皮酸）に導入した誘導体などが挙げられる。中でも、ケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールが導入された誘導体（ケイ皮酸アミノアルキルエステル）が好ましく、アミノアルコールは上記一般式においてｎが１〜１８が好ましく、特に３〜６が好ましく、３〜４が極めて好ましい。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖の多糖と光反応性基が結合している部位、つまり、本発明組成物における光架橋多糖の多糖と光架橋基の結合している部位は、用いる多糖と用いる光反応性基（光架橋基）各々が有する官能基により選択可能であり、特に限定されない。例えば、多糖としてヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びその誘導体等のＧＡＧを用いる場合には、当該結合部位としてはアミノ基（アセチルアミノ基又はスルファミノ基として存在する）、ヒドロキシル基、カルボキシル基等が挙げられるが、特にカルボキシル基が好ましい。一例として、ケイ皮酸アミノアルキルエステルを光反応性基（光架橋基）として使用し、多糖としてＧＡＧ又はその誘導体を使用する場合には、アミノアルキルのアミノ基とＧＡＧ又はその誘導体のカルボキシル基とがアミド結合することによって光反応性基（光架橋基）がＧＡＧに結合される。
本発明製造方法において用いられる光反応性多糖の光反応性基の導入率は、０．１〜７５％、好ましくは０．３〜７０％であり、上述の様に、本発明組成物における光架橋多糖の光架橋基の導入率も、０．１〜７５％、好ましくは０．３〜７０％である。光反応性基（光架橋基）の多糖への導入反応は、例えば特開平６−０７３１０２号等に記載の方法に従い行うことが可能であり、また、この導入率の値は、反応させる多糖のモル数と光反応性基（光架橋基）のモル数とを調節することにより、適宜変更や調節することが可能である。なお、導入率は、後述の測定例１記載の方法により測定することが出来る。
本発明におけるアルコール、界面活性剤及びキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質（以下、本発明添加物質とも言う）とは、水性溶媒混和性を有する限りにおいて特に限定はされない。
アルコールとしては、下記式（Ｉ）で示されるアルコールが挙げられる。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
炭素数１〜１０の鎖状アルキルとしてはメチル、エチル等が、炭素数３〜１０の分岐を有するアルキルとしてはイソプロピル、ｔ−ブチル等が挙げられる。
上記の様なアルコールとしては、低級アルコール、多価アルコールまたは糖アルコールが挙げられる。
低級アルコールとしては、炭素数が１〜１０、より好ましくは１〜８のアルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が例示される。多価アルコールとは、すなわち、分子内に存在するヒドロキシル基が２個以上であるアルコールであり、より好ましくは３個以上のヒドロキシル基を有するアルコールが挙げられる。例えば、エチレングリコール、グリセリンが挙げられ、エチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。また、糖アルコールとしては、鎖状の糖アルコールであっても、環式糖アルコールであっても使用することは可能であるが、鎖状の糖アルコールが好ましい。糖アルコールとしては、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどが好ましく挙げられるが、マンニトール、キシリトール、ソルビトールがより好ましく、マンニトール又はソルビトールが更に好ましく挙げられる。
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤又はアニオン界面活性剤が好ましく挙げられ、中でも、非イオン界面活性剤としてはポリエチレングリコールが、アニオン界面活性剤としてはアルキル硫酸塩が挙げられ、特にドデシル硫酸ナトリウムが好ましく挙げられる。
キレート剤としては、クエン酸の様なオキシカルボン酸類やエチレンジアミン四酢酸の様なポリアミノカルボン酸類が挙げられる。
更に、本発明添加物質、特に上記アルコールは、光反応性多糖の水性溶媒溶液に本発明添加物質を添加し凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では当該凍結体が凍結状態を保持している性質を有していると好ましい。ここで凍結状態とは完全に凝固している状態をいう。また、ゲル性状を有する本発明組成物を製造するには、本発明製造方法に従い光照射をした際に生成する架橋体が不溶性固形物にならない性能を有している本発明添加物質が好ましく用いられる。
なお、後述の通り、本発明組成物は医療または医薬用途に用いることが可能であり、その様な用途に用いる際は、本発明添加物質として少なくとも水性溶媒混和性と高い生体適合性を有する物質を選択する必要がある。
本発明製造方法における光反応性多糖含有溶液の溶媒は、光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒であり、水を含んでいる限りにおいて特に限定はされないが、溶液には塩が含まれていても構わない。すなわち、水または水を含む溶液を水性溶媒として、光反応性多糖と本発明添加物質とを溶解しうる溶媒を用いることが出来る。水性溶媒としては、例えば、水、注射用水、生理食塩水、またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液やリン酸緩衝生理的食塩水等の緩衝液等を用いることが出来る。
本発明製造方法における光反応性多糖含有溶液中での光反応性多糖の濃度は、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．８〜８％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜６％（ｗ／ｗ）が例示される。また、光反応性多糖含有溶液中での本発明添加物質の濃度は０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．８〜９％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜８％（ｗ／ｗ）が例示される。
なお、本発明製造方法の好ましい態様として、光反応性多糖を構成する多糖の分子量と溶液中での光反応性多糖の濃度との関係からみると、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度０．５〜１０％が好ましく、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度０．８〜８％が更に好ましく、分子量１，５００〜１００，０００であり、且つ、濃度１〜６％が最も好ましい。上記の様な条件では、従来の光架橋方法でゲル状の光架橋多糖を得ることが難しかったが、本発明製造方法により容易にゲル状組成物を得ることができる。
光反応性多糖含有溶液の凍結を行なう温度条件は、該溶液が凍結する条件下であれば特に限定はされない。凍結は溶液が完全に凝固する必要はなく、溶液が部分的に凝固している固液混相のいわゆる「シャーベット状」を呈する程度の温度条件であってもよい。従って、本発明製造方法における「凍結」は、かかる固液混相の状態も包含する概念である。しかし、最も好ましい「凍結を行なう温度条件」は、溶液が完全に凝固して固化する温度条件であり、例えば０℃以下、好ましくは−５℃以下、より好ましくは−７℃以下、さらに好ましくは−１５℃以下、最も好ましくは−２０℃以下が挙げられる。
光の照射は、光反応性残基が光二量化反応又は光重合化反応を効率的に起こす程度の条件でなされることが好ましい。照射する光線の種類としては、紫外線が好ましく挙げられ、紫外線としては、多糖のグリコシド結合を切断せず且つ光反応性残基に光架橋反応を生じさせる波長（例えば２００〜６００ｎｍ）の紫外線が選択される。紫外線ランプとしては、高圧水銀ランプ又はメタルハライドランプが好ましい。更に、それらランプにより発生した紫外線の不要波長光を、例えばカットフィルター等で除去することが好ましい。カットフィルターとしては、専用の加工フィルターが好ましいが、不要波長光をカット出来るのであれば市販の硬質ガラスでも十分に対応させることができる。
照射光量は、光反応性多糖が十分に光架橋反応を起こすことができる光量である必要があり、具体的には例えば２８０ｎｍの紫外線で５００ｍＪ／ｃｍ２以上、好ましくは２５００ｍＪ／ｃｍ２以上、最も好ましくは４０００ｍＪ／ｃｍ２以上である。なお、光量計に１／１０減光フィルターを取り付けて使用した際、光量計上の数値は、実際の照射光量の１／１０の値が表示されるが、上記範囲は実際の照射光量である。
本発明組成物は、本発明製造方法により得られる光架橋多糖組成物であり、上述の様に、光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有する本発明添加物質とを少なくとも含む溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られうる。
つまり、本発明組成物は、光架橋多糖と、光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有する本発明添加物質とを少なくとも含む光架橋多糖組成物であり、本発明組成物は、水性溶媒を含む溶液を凍結し、光架橋反応を行った後、溶融させており、水を含む。
本発明組成物は、光反応性多糖含有溶液と比べて高い粘弾性を有しており、水分を豊富に含むヒドロゲルであるゲル性状又は水分の吸排水性に優れたスポンジの性状を示すが、特にゲル性状を示すものが好ましい。一般にゲル状やスポンジ状など粘弾性を有する物質の性状を数値を用いて明確に区分することは難しいが、ゲルの物性を粘弾性で示すのに、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ”）及び損失正接（ｔａｎδ：Ｇ”／Ｇ’）等の動的弾性率や粘度を用いることができる。
例えば、後述の様に本発明組成物を注射用シリンジ等の注入具に充填して用いる場合は、ゲル性状を有する本発明組成物が好適であり、その中でも下記の様な弾性率又は粘度を有するものが好ましい。コントロールストレス制御式レオメーター（英Ｃａｒｒｉ−Ｍｅｄ社製）により測定される弾性率を指標とした場合には、３７℃条件下で０．０１〜１０Ｈｚまで連続的に変化させて測定したときに、貯蔵弾性率（Ｇ’）として、好ましくは０．１〜８００Ｐａ、損失弾性率（Ｇ’’）として、好ましくは１〜１８０Ｐａを示し、損失正接（Ｇ”／Ｇ’）は、好ましくは０．１〜０．８を示す。尚、貯蔵弾性率が高く、損失弾性率が低い場合は、弾性が強く、固いゲルとなり、逆の場合は、粘性の強いゲルであることが知られている。また、回転粘度計により標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される本発明組成物１ｍＬの粘度を指標とした場合には、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓが好ましく、３００〜２０，０００ｍＰａ・Ｓがより好ましい。
本発明組成物における光架橋多糖は、架橋率０．５〜８０％、より好ましくは１．５〜７５％、最も好ましくは５〜７０％を示す。なお、架橋率は、多糖に導入された光架橋基のモル数に対する二量体のモル数の２倍のモル数の比（百分率）として表される。例えば光反応性残基としてケイ皮酸又は置換ケイ皮酸を用い、多糖としてＧＡＧを用いた場合には、測定例２に記載した方法で架橋率を算出することができる。
本発明組成物における光架橋多糖の濃度は、上記光反応性多糖含有溶液中での光反応性多糖の濃度と同じであり、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．８〜８％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜６％（ｗ／ｗ）が例示される。また、本発明組成物における本発明添加物質の濃度は、光反応性多糖含有溶液中での本発明添加物質の濃度とほぼ同じであり、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．８〜９％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１〜８％（ｗ／ｗ）が例示される。
本発明組成物は、例えば創傷部の保護のための医用材料（創傷被覆材）、生体内の空間を保持するための医用材料（空隙保持材）、骨等の結合組織の空洞を充填するための医用材料（骨充填材）、人工体液（人工関節液、人工涙液、眼科用手術補助材等）、生体表面等の保湿のための材（保湿材）、医薬などの剤型を保持するために添加する添加剤（賦形剤）、細胞培養における細胞の足がかりとするための基材（細胞培養用基材）等に使用することが可能である。特に、ゲル性状を有する本発明組成物は、粘性が高い流動体という特徴的な性状により、上記用途に使用することがより好適であり、また、本発明組成物を押出可能な注入具に充填した形態で上記医療用途に使用される注入用キットとして用いることも可能である。
なお、押出可能な注入具とは、薬剤押出用プランジャー等を具備し、充填されている薬剤を押出可能な注入具であり、通常用いられているものを用いることが可能である。
以下、本発明をより具体的に説明する。
測定例１
光架橋基の導入率の測定方法
多糖における光反応性基（光架橋基）の導入率は、多糖の繰り返し二糖単位あたりに導入された光反応性基の数を百分率で表した値を意味する。導入率の算出に必要な多糖の量は、検量線を利用したカルバゾール測定法により測定し、光反応性残基としてケイ皮酸又はアミノケイ皮酸を使用した場合の光反応性残基の量は、検量線を利用した吸光度測定法（測定波長２６９ｎｍ）により測定した。ただし、カルバゾール測定法が利用できない場合は、検量線を利用した乾燥減量法により測定した。
測定例２
架橋率の測定方法
架橋率は１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム１ｍＬで被検物質１ｇを１時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光反応性基由来物（光反応性残基の単量体及び二量体）を抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって解析し、検量線を利用して二量体の量を測定した。そして多糖に導入された光反応性基に対する二量体となった光反応性基のモル数を百分率（％）により算出した。
以下の実施例において、特に断らない場合は％は重量％を示す。
【実施例１】
コンドロイチン硫酸を用いた本発明組成物
（１）サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（本明細書において、ＣＳとも言う。商品名：コンドロイチン硫酸Ｃ、生化学工業株式会社製、重量平均分子量：４５，０００）１ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＨＯＳｕとも言う。）１８２ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣＩ・ＨＣｌとも言う。）１５２ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩（ＨＣｌ・Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−Ｐｈ：Ｐｈはフェニル基を示す。）１９２ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、塩化ナトリウム（以下、ＮａＣｌとも言う）１ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行ってＨＮ−（ＣＨ）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−ＰＨがＣＳのカルボキシル基に結合した光反応性ＣＳ１ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性ＣＳへの光反応性基の導入率は、５．３％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＳを、重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が６％となるように溶解させ、反応溶液とした。反応溶液を０．２２μｍのメンブレンフィルター（日本ミリポア株式会社製）でろ過した後、間隙が１ｍｍとなるよう調節したガラス板に流し込み、−２０℃雰囲気下で反応溶液を凍結させた。凍結状態を維持したまま８００Ｗ高圧水銀ランプ（オーク製作所製）を用いて照射光量が５０００ｍＪ／ｃｍ２となるよう紫外線照射を行った。照射後、室温に戻して融解させるとゲル状の光架橋ＣＳ組成物が得られた。測定例２に従って架橋率を測定したところ３３％であった。
コントロールストレス制御式レオメーター（英Ｃａｒｒｉ−Ｍｅｄ社製：アクリルパラレルプレート 直径４ｃｍ、０°）を用いて、３７℃で０．０１〜１０Ｈｚまで連続的に変化させて測定を行なったところ、試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）は８．１〜７０．５Ｐａ、損失弾性率（Ｇ’’）は５．６〜２９．７Ｐａであった。
一方、対照として、光反応性ＣＳを重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応に付した後、室温に戻して融解させて光架橋ＣＳを得た。当該光架橋ＣＳはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋ＣＳは得られなかった。
【実施例２】
デルマタン硫酸を用いた本発明組成物
（１）鶏冠由来のデルマタン硫酸（生化学工業株式会社製、重量平均分子：３０，０００、以下、ＤＳとも言う。）１ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後、ＨＯＳｕ ４６ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ３８ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩４８ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ １ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、ＨＮ−（ＣＨ）３ＯＣＯＣＨ＝ＣＨ−ＰＨがカルボキシル基に結合した光反応性ＤＳ１ｇを得た。光反応性ＤＳへの光反応性基の導入率を測定例１に従って測定したところ５．８％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＤＳを、重量濃度が３％となるように５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が１．５％となるように溶解させ反応溶液とした。実施例１と同様の手順にて、照射光量が７０００ｍＪ／ｃｍ２となる様に当該反応溶液を光架橋反応させ、照射後、室温に戻して融解させてゲル状の光架橋ＤＳ組成物を得た。測定例２に従って架橋率を測定したところ３６％であった。
一方、対照として光反応性ＤＳを、重量濃度が３％となるように５ｍＭリン酸緩衝液に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応後、融解させて得られた光架橋ＤＳはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋ＤＳは得られなかった。
【実施例３】
ヘパリン誘導体を用いた本発明組成物
（１）ブタ小腸由来ヘパリンの誘導体である６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＷＯ００／０６６０８に記載された方法に従って調製したヘパリンの誘導体、重量平均分子量：約９，０００。以下、６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐとも言う。）３ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後、ＨＯＳｕ６１５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ５１３．４ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩６４８．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ２．７ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、６５．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が７％となるように溶解させ、反応溶液とした。反応溶液を０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、間隙が１ｍｍとなるよう調節したパイレックス板に流し込み、−２０℃雰囲気下で凍結させた。凍結状態を維持したまま８００Ｗ高圧水銀ランプを用いて照射光量が５０００ｍＪ／ｃｍ２となるよう紫外線照射を行った。光照射後、室温に戻して融解させると、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物が得られた。測定例２に従い架橋率を測定したところ、６７．６％であった。また、回転粘度計（ＴＯＫＩＭＥＣ社製）を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下にて粘度を測定したところ、光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物１ｍＬの粘度は９８４０ｍＰａ・ｓであった。
一方、対照として、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度３％となる様に注射用水に溶解させた溶液を、上記と同様に光架橋反応させ、光照射後、融解させて得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐは得られなかった。
【実施例４】
（１）６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ ３ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ２０５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １７１．４ｍｇケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩２１６．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ２．７ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、１６．０％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた後、ｄ−ソルビトールを重量濃度が７％となる様に、ポリエチレングリコール４００（以下、ＰＥＧ４００とも言う。）を重量濃度が４％となる様に各々溶解させ、反応溶液とした。実施例３（２）と同様の手順にて、各反応溶液を光架橋反応させた後、室温に戻して融解させ光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物を得た。両反応溶液とも、ゲル状の光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物であった。更に、得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物について、測定例２に従い架橋率を測定し、回転粘度計を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。尚、明らかに液状の検体にはＲＥ−８０Ｌ、ゲル状の検体にはＲＥ−８０Ｕを使用した。結果は、表１に示す。一方、ｄ−ソルビトールが添加された反応溶液については、未照射の反応溶液についても粘度を測定した。
一方、対照として光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを、重量濃度が３％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐは得られなかった。
【実施例５】
（１）６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ １ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン５０ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ １３７１ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １１４２ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩１４４０ｍｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ １ｇ添加後にエタノールに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行い、光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ１．１ｇを得た。測定法１に従い測定した導入率は、１６．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた溶液に、ＰＥＧ４００を重量濃度４％、ＰＥＧ４０００を重量濃度２％、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を重量濃度４％、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を重量濃度４％、クエン酸を重量濃度４％及び２％になる様に各々添加して溶解し、反応溶液とした。６種の反応溶液について、上記実施例３（２）と同様に光架橋反応を行い、光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物を得た。更に、得られた光架橋６−Ｏ−脱硫酸化Ｈｅｐ組成物について、回転粘度計を用いて、標準コーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。結果は表２に示す。
尚、上記で得られた光反応性ＣＳを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた溶液についても、上記と同様に粘度を測定したところ、７６．８ｍＰａ・ｓであった。
【実施例６】
（１）サメ軟骨由来ＣＳ（ロット番号：Ｎ−２５１、生化学工業株式会社製、重量平均分子量：約３０，０００）５ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ１３．７ｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ １１．４ｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩１４．４ｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ４ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性ＣＳ４ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、３２．４％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＳを重量濃度が４％となる様に注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ４０００及びクエン酸を重量濃度が２％又は４％となる様に各々添加し、ＳＤＳ及びＥＤＴＡを重量濃度が４％となる様に各々添加し、ｄ−ソルビトールを重量濃度が８％となる様に添加し、溶解させ反応溶液とした。これら９種の反応溶液について実施例３（２）と同様に光架橋反応を行い、光架橋ＣＳ組成物を得た。更に、測定例２に従い架橋率を測定し、回転粘度計を用いてコーン（１度）、２０℃条件下での粘度を測定した。また、光架橋反応前の反応溶液についても同様に粘度を測定した。結果は表３に示す。
一方、対照として光反応性ＣＳを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋ＣＳはスポンジ化しており、ゲル状の架橋ＣＳは得られなかった。
ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）、クエン酸（２％）、クエン酸（４％）、ＳＤＳ（４％）、ＥＤＴＡ（４％）及びｄ−ソルビトール（８％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの外観については、第１図（写真）の通りである。
更に、ＰＥＧ４００（２％）、ＰＥＧ４０００（２％）及びクエン酸（４％）を添加して得られた光架橋多糖組成物と、対照について、オシレーションテストを行った。つまり、コントロールストレス制御式レオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製ＲＡ ２０００）を用いて、３７℃で、１０Ｈｚより開始し、０．０１Ｈｚまで連続的に変化させて測定を行ない、試料１ｍＬの貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ’’）を測定し、更に、粘弾性の指標として通常用いられるｔａｎδ（Ｇ”／Ｇ’）を算出した（第２図）。
オシレーションテストの結果は、何れも貯蔵弾性率（Ｇ’）の方が損失弾性率（Ｇ”）より大きく（Ｇ’＞Ｇ”）、つまり、本実施例で得られた物質は、弾性（Ｇ’）が高く、粘性（Ｇ”）が低い物質であることを示している。
【実施例７】
（１）ブタ小腸由来ヘパリン（米ＳＰＦ社製、重量平均分子量：約９，０００、以下Ｈｅｐとも言う。）５ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ６１５．８ｍｇ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ ５１３．４ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩６４８．１ｍｇを順次添加し、室温で２時間反応させ、ＮａＣｌ３ｇ添加後にエタノールを注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って、光反応性Ｈｅｐ４ｇを得た。測定例１に従い測定した光反応性基の導入率は、４７．４％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性Ｈｅｐを重量濃度４％となる様に注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ４０００、クエン酸、ＳＤＳ、ＥＤＴＡおよびｄ−ソルビトールを表４記載の濃度の通りに各々添加し、溶解させ反応溶液とした。これら８種の反応溶液について実施例６と同様に光架橋反応を行い、光架橋Ｈｅｐ組成物を得、架橋率及び粘度を測定した。また、光架橋反応前の未照射の反応溶液にっても同様に粘度を測定した。結果は表４に示す。
一方、対照として光反応性Ｈｅｐを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付した。得られた光架橋Ｈｅｐはスポンジ化しており、ゲル状の架橋Ｈｅｐは得られなかった。
ＰＥＧ４０００（２％）、ＳＤＳ（４％）及びＥＤＴＡ（４％）を各々添加し得られた光架橋ＣＳ組成物と、対照の光架橋ＣＳの外観については、第３図（写真）の通りである。
【実施例８】
（１）カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク製、以下ＣＭＣとも言う）１ｇを蒸留水１５０ｍＬに溶解させ、１，４−ジオキサン７５ｍＬを加えた後に、ＨＯＳｕ３２４ｍｇ、ＥＤＣＩ−ＨＣｌ２８５ｍｇ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩３５０ｍｇを順次添加し、室温で３時間反応させ、ＮａＣｌ１ｇ添加後にエタノール６００ｍＬに注ぎ込んで沈殿を析出させた。沈殿を洗浄回収後、４０℃で減圧乾燥を行って光反応性ＣＭＣ１ｇを得た。光反応性基の導入率は、１９．５％であった。
（２）上記（１）で得られた光反応性ＣＭＣを重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させた後、ＰＥＧ４００を重量濃度が４％、ｄ−ソルビトールを重量濃度が８％となるように各々溶解させ反応溶液とした。反応溶液を実施例３（２）と同様に光架橋反応を行ったところ、両方共に、ゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物を得た。
一方、対照として光反応性ＣＭＣを、重量濃度が４％となるように注射用水に溶解させ、上記と同様に光架橋反応に付したところ、スポンジ性状の光架橋ＣＭＣが得られた。
【実施例９】
実施例８で得られたゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物２種とスポンジ状の光架橋ＣＭＣを、１ｍＬシリンジに各々約０．３ｍＬ（約３０ｍｍ）充填し、これを被検物質とした。各被検物質に、上からブルーデキストラン溶液０．２ｍＬを静かに添加した後、４０００ｒｐｍ ｘ ３分間遠心分離した。尚、１ｍＬシリンジは、１ｍＬを１ｃｍに換算でき、一目盛りが１ｍｍである。、浸透割合はブルーデキストラン溶液との接触表面からの目盛り幅で表す。その結果、スポンジ性状の光架橋ＣＭＣにおいては、ブルーデキストランは２５ｍｍまで浸透していたが、ゲル状の光架橋ＣＭＣ組成物においては、ブルーデキストランの浸透が抑制されており、ＰＥＧ４００（４％）を添加して得られた光架橋ＣＭＣ組成物が１５ｍｍ、ｄ−ソルビトール（８％）を添加して得られた光架橋ＣＭＣ組成物が４ｍｍであった。
更に、実施例６において、ｄ−ソルビトール（８％）、ＰＥＧ４０００（２％）を各々添加して得られたゲル状の光架橋ＣＳ組成物と対照としたスポンジ状の光架橋ＣＳを、１ｍＬシリンジに約０．４ｍＬ充填した。これを被検物質として、上記と同様にブルーデキストラン溶液の浸透割合をみた。結果、ｄ−ソルビトール（８％）を添加して得られた光架橋ＣＳ組成物においては、ブルーデキストラン溶液との接触表面から５ｍｍ、ＰＥＧ４０００（２％）を添加した得られた光架橋ＣＳ組成物においては４ｍｍであり、何れもブルーデキストランの浸透が抑制されていた。しかし、スポンジ状の光架橋ＣＳは１７ｍｍであり、ブルーデキストランの浸透性が高かった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００３年３月１１日出願の日本特許出願（特願２００３−０６５７０４）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明により、新規な光架橋多糖組成物及びその製造方法を提供する。当該製造方法により光反応性多糖は、効率的に光架橋することが可能になる。更に、当該製造方法によると、注入具により注入可能なゲル性状の光架橋多糖組成物も容易に得ることが出来る為、当該ゲルの特異的な性状を利用した医療用途等に用いることが出来、有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法。
【請求項２】
アルコールが、前記光反応性多糖の水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールである請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
アルコールが、下記式（Ｉ）で表される請求の範囲１又は２の何れか一項に記載の方法。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
【請求項４】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又はアニオン界面活性剤である請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールであり、アニオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
キレート剤が、オキシカルボン酸類またはポリアミノカルボン酸類から選択される請求の範囲１記載の方法。
【請求項７】
オキシカルボン酸類がクエン酸であり、ポリアミノカルボン酸類がエチレンジアミン四酢酸である請求の範囲６記載の方法。
【請求項８】
光反応性多糖を構成する多糖が、ヘテログリカン、ホモグリカン、またはそれらの誘導体である請求の範囲１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヘテログリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択されるグリコサミノグリカンであり、ホモグリカンが、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される酸性ホモグリカンである請求の範囲８記載の方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン誘導体が、脱硫酸化および／または酸化還元誘導体である請求の範囲８記載の方法。
【請求項１１】
脱硫酸化誘導体が、ヘパリンのＮ−アセチルグコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基を除去した６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンである請求の範囲１０記載の方法。
【請求項１２】
多糖の重量平均分子量が１，５００以上５００，０００以下であることを特徴とする請求の範囲１〜１１の何れか一項記載の方法。
【請求項１３】
光反応性多糖における光反応性基が、多糖のカルボキシル基に結合してなることを特徴とする請求の範囲１〜１２の何れか一項記載の方法。
【請求項１４】
光反応性多糖含有溶液中に光反応性多糖が０．５〜１０％含有する溶液である請求の範囲１〜１３の何れか一項記載の方法。
【請求項１５】
光反応性多糖が、分子量１，５００以上１００，０００以下のグリコサミノグリカンである請求の範囲１４記載の方法。
【請求項１６】
光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物。
【請求項１７】
回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓであり、且つ、ゲル状を示す請求の範囲１６記載の光架橋多糖組成物。
【請求項１８】
請求の範囲１７記載の光架橋多糖組成物が、該組成物を押し出し可能な注入具に充填された光架橋多糖組成物注入用キット。
【請求項１】
多糖に光反応性基が結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射することを特徴とする光架橋多糖組成物の製造方法。
【請求項２】
アルコールが、前記光反応性多糖の水性溶媒溶液に該アルコールを添加して凍結させ、凍結体を得た後、温度を上昇させていった場合に、−７℃以下では凍結状態を保持している性質を有するアルコールである請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
アルコールが、下記式（Ｉ）で表される請求の範囲１又は２の何れか一項に記載の方法。
ただし、上記式中、Ｒは、
炭素数１〜１０の鎖状アルキル、
炭素数３〜１０の分岐を有するアルキル、
および
からなる群から選択される。
【請求項４】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又はアニオン界面活性剤である請求の範囲１記載の方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールであり、アニオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である請求の範囲４記載の方法。
【請求項６】
キレート剤が、オキシカルボン酸類またはポリアミノカルボン酸類から選択される請求の範囲１記載の方法。
【請求項７】
オキシカルボン酸類がクエン酸であり、ポリアミノカルボン酸類がエチレンジアミン四酢酸である請求の範囲６記載の方法。
【請求項８】
光反応性多糖を構成する多糖が、ヘテログリカン、ホモグリカン、またはそれらの誘導体である請求の範囲１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヘテログリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸からなる群から選択されるグリコサミノグリカンであり、ホモグリカンが、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される酸性ホモグリカンである請求の範囲８記載の方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン誘導体が、脱硫酸化および／または酸化還元誘導体である請求の範囲８記載の方法。
【請求項１１】
脱硫酸化誘導体が、ヘパリンのＮ−アセチルグコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基を除去した６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンである請求の範囲１０記載の方法。
【請求項１２】
多糖の重量平均分子量が１，５００以上５００，０００以下であることを特徴とする請求の範囲１〜１１の何れか一項記載の方法。
【請求項１３】
光反応性多糖における光反応性基が、多糖のカルボキシル基に結合してなることを特徴とする請求の範囲１〜１２の何れか一項記載の方法。
【請求項１４】
光反応性多糖含有溶液中に光反応性多糖が０．５〜１０％含有する溶液である請求の範囲１〜１３の何れか一項記載の方法。
【請求項１５】
光反応性多糖が、分子量１，５００以上１００，０００以下のグリコサミノグリカンである請求の範囲１４記載の方法。
【請求項１６】
光反応性基を結合してなる光反応性多糖と、該光反応性多糖を溶解しうる水性溶媒と、水性溶媒混和性を有するアルコール、界面活性剤およびキレート剤からなる群から選択される何れか一つの物質とを少なくとも含む光反応性多糖含有溶液を凍結させ、得られた凍結物に光を照射した後、当該凍結物を溶融させて得られる光架橋多糖組成物。
【請求項１７】
回転粘度計による標準コーン（１度）、２０℃の条件下で測定される粘度が、３００〜３０，０００ｍＰａ・Ｓであり、且つ、ゲル状を示す請求の範囲１６記載の光架橋多糖組成物。
【請求項１８】
請求の範囲１７記載の光架橋多糖組成物が、該組成物を押し出し可能な注入具に充填された光架橋多糖組成物注入用キット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０５４
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３５７７（Ｐ２００５−５０３５７７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３２０４
【国際出願日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
パイレックス
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３２０４
【国際出願日】平成１６年３月１１日（２００４．３．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
パイレックス
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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