免疫刺激薬、腫瘍溶解性ウイルスおよび付加的抗癌療法の組合せ
哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬を投与することを含んでなる方法。第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を処置する方法であって、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること；および免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与することを含んでなる方法。腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなるキット。腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびに腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって第一の腫瘍を有する哺乳類における第二の腫瘍を処置することに関する説明書を含んでなるキット。本発明は場合により、付加的抗癌療法を施すことを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、引用することにより本明細書の一部とされる２００９年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１７９，４８０号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、癌治療に関する。
【発明の概要】
【０００３】
一つの実施態様において、本発明は、哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬を投与することを含んでなる方法に関する。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００４】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法に関する。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与することを含んでなる。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００５】
別の実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】実施例１に述べられた足蹠腫瘍の増殖のグラフである。
【図２】実施例１に述べられた反対側の側腹腫瘍の増殖のグラフである。
【発明の具体的説明】
【０００７】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍を有する哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬投与することを含んでなる方法に関する。さらなる実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００８】
一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される。さらなる一つの実施態様において、パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される。なおさらなる一つの実施態様において、ＮＤＶは、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する。腫瘍溶解性ウイルスを、上記に挙げた具体的なものを含め、以下にさらに詳しく記載する。
【０００９】
本明細書において「多重感染度」または「ＭＯＩ」とは、腫瘍細胞に対する感染性ウイルス粒子の比を意味する。
【００１０】
「単離された」または「精製された」ウイルスとは、細胞性の、または細胞培養液もしくはウイルスが増殖される他の媒体（水、水溶液およびウイルスを保存もしくは投与する際に用いるための当技術分野で公知の材料で、夾雑材料ではない）の由来する他の夾雑材料を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、夾雑材料の約５０重量％未満、例えば、約４０重量％未満、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約２．５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満または約０．１重量％未満の夾雑材料を含むウイルス調製物を意味する。
【００１１】
本明細書において腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染し、癌細胞を溶解させることができるウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を助長するとともに、その腫瘍での用量増幅をもたらし得る。
【００１２】
ＮＤＶは、数種の飼い鳥および野鳥種を侵す伝染性の高い疾病を引き起こすネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。具体的には、ＮＤＶは、モノネガウイルス(mononegaviralis)目パラミクソウイルス科ルブラウイルス属の鳥パラミクソウイルス−１（ＡＰＭＶ−１）として分類される。ＮＤＶは、およそ１６，０００ヌクレオチドのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する１００〜３００ｎｍ径の、エンベロープを有するウイルスである。ＮＤＶゲノムは、６つの主要ポリペプチド：Ｌ、ＨＮ、Ｆ、Ｍ、ＰおよびＮＰをコードする６つの遺伝子を含む。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、タンパク質Ｌ、ＰおよびＮＰを含み、これらは感染細胞の細胞質の遊離リボソームにおいて翻訳される。Ｆ糖タンパク質は不活性前駆体（Ｆ０、６７ｋＤａ）として合成され、タンパク質分解切断を受けて、Ｆ１鎖（５５ｋＤａ）とＦ２鎖（１２．５ｋＤａ）がジスルフィド結合したものからなる生物学的に活性なタンパク質を生じる。
【００１３】
種々の分野によって単離された形態のＮＤＶは、それらの毒力に応じて、短潜伏期性(velogenic)（高病原性）、亜病原性(mesogenic)（中間病原性）、または長潜伏期性（非病原性）に分類されてきた。
【００１４】
ＮＤＶは一般にヒトの健康に害を持たないと考えられるが、ヒトがこのウイルスに曝されると、軽度の結膜炎や風邪のような症状（例えば、約２４時間の軽い発熱）に至ることがある。ＮＤＶのようなエンベロープを有するウイルスは、２つの主要な経路、すなわち、１）エンベロープと原形質膜との直接的融合、および２）受容体により媒介されるエンドサイトーシスを介して細胞に侵入する。ＮＤＶに関しては、膜融合プロセスはｐＨ非依存的に宿主原形質膜で起こることが確認されている。融合タンパク質Ｆの活性化は、ウイルスの糖タンパク質と、ガングリオシドおよびＮ−糖タンパク質などのシアル酸を含む細胞受容体との相互作用によって起こる。さらに、最近、ＮＤＶは、もう１つの経路としてカベオラ依存性エンドサイトーシス経路によっても細胞に感染することがあることが示された。融合が低ｐＨで起こる場合には、一定のパーセンテージのビリオンがエンドソームにエンドサイトーシスされるようになる。規則正しいアセンブリと感染性ＮＤＶ粒子の放出は、膜脂質ラフトに依存していることが示されている。これらは細胞の原形質膜の外葉にあるコレステロールおよびスフィンゴ脂質が豊富な微小ドメインとして定義される。新たに産生されたビリオンは、合成後の早期に脂質ラフトにおけるＨＮ、ＦおよびＮＰウイルスタンパク質の蓄積を示し、脂質ラフト会合タンパク質であるカベオリン−１、フロチリン−２およびアクチンを含むが、非脂質ラフト会合形質転換受容体は含まなかった。
【００１５】
種々のＮＤＶ株が、ヒト細胞に対して溶解性または非溶解性であることが見出されている。溶解性株は一般に、ヒト細胞内の後代ウイルスの外被で活性化血球凝集素−ノイラミダーゼと融合タンパク質分子を産生するが、非溶解性株は一般に、これらの分子の不活性型を産生する。特定の理論に縛られるものではないが、ＮＤＶのヒト細胞への侵入は、ヒト細胞表面上のシアル酸含有分子と結合するウイルス表面上の活性化血球凝集素−ノイラミダーゼおよび融合タンパク質分子に依存している可能性がある。
【００１６】
ＮＤＶの溶解性株と非溶解性株はまた、感染細胞を期滅させる機構が異なる。溶解性株では、外被に活性化血球凝集素−ノイラミダーゼおよび融合タンパク質分子を含む後代ウイルスの出芽が一般にＮＤＶ感染細胞の原形質膜を隣接する細胞の原形質膜と融合させ、大きな、生存不能の融合細胞（合胞体）の形成をもたらす。非溶解性株は、ウイルスが正常な宿主細胞代謝を見出すことによって、もっと緩慢に感染細胞を死に至らせる。非溶解性株によって生産された後代ウイルス粒子は、不活性型のＦ分子を含む。
【００１７】
ＮＤＶは、細胞死の内因性および外因性双方のカスパーゼ依存経路によって腫瘍溶解を発揮する。腫瘍溶解性ＮＤＶ株は、外胚葉、内胚葉および中胚葉起源のヒト腫瘍細胞系統に対して細胞傷害性を示す。このような細胞傷害性は主として、複数のカスパーゼ依存性アポトーシス経路によるものである。ＮＤＶは、ミトコンドリア系／内因性アポトーシス経路を活性化することによってアポトーシスを誘発する。ＮＤＶ感染は、ミトコンドリア膜電位の低下とミトコンドリアタンパク質シトクロムＣの放出をもたらす。さらに、ＮＤＶ感染は、カスパーゼ９およびカスパーゼ３の初期活性化をもたらす。これに対して、主として細胞死受容体経路によって活性化されるカスパーゼ８の切断は、腫瘍細胞のＮＤＶ媒介性アポトーシスにおける、ＴＲＡＩＬにより誘導される後期事象である。腫瘍細胞においてＮＤＶによって生成された細胞死シグナルは最終的にミトコンドリアに収束する。
【００１８】
どちらのタイプのＮＤＶ株も一般に、ヒト癌細胞では、ほとんどのヒト細胞におけるよりも遙かに容易に複製する。あるＮＤＶ株はヒト新生物形質転換細胞で、ほとんどのヒト細胞におけるよりも、最大１０，０００倍良好に増幅することができた。例えば、非腫瘍形成性ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では、ＮＤＶの複製はポジティブ鎖ＲＮＡが産生された後に停止するが、ＰＢＭＣ腫瘍細胞は、感染後１０〜５０時間以内は、複製周期を継続し、ウイルスゲノムをコピーする。
【００１９】
ＮＤＶ株の例としては、７３−Ｔ、ＭＴＨ−６８、ＵｌｓｔｅｒおよびＮＤＶ−ＨＵＪが挙げられる。Sinkovics, et al, J. Clin. Virol. 16:1-15 (2000); Freeman, et al., Molec. Therapy 13:221 (2006);米国特許第７，２２３，３８９号; ＷＯ２００５／０５１３３０; ＷＯ２００５／０５１４３３; Csatary, et al., Anticancer Res. 19:635-638 (1999); Csatary, et al., J. Am. Med. Assoc. 281:1588-1589 (1999); Csatary, et al., J. Neurooncol. 67:83-93 (2004)。
【００２０】
他の腫瘍溶解性ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、レオウイルス、Ｅ１Ｂ欠失アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびポックスウイルスが挙げられる。これらの腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を破壊するだけでなく、破壊された腫瘍細胞から抗原を放出し、それにより免疫応答を誘発する可能性を持つ。
【００２１】
上述のように、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【００２２】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である。
【００２３】
一つの実施態様において、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる。ＣＴＬＡ−４遮断薬、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなるものを含め、以下および引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第７，２２９，６２８号にさらに詳しく記載される。
【００２４】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、顆粒球(granulocyes)および単球（プロト−マクロファージ）を産生し、樹状細胞の発達を促すように幹細胞を刺激する。ＧＭ−ＣＳＦは任意の供給源から、好都合には、ＧＭ−ＣＳＦをコードするコード領域で形質転換された組換え微生物で発現させ、そこから単離することによって誘導することができる。一つの実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦは、その免疫刺激薬が投与される哺乳類の天然ＧＭ−ＣＳＦと少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％同一）である。
【００２５】
一つの実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦは、上述した腫瘍溶解性ウイルスの組換え株に由来する。一つの実施態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルス内のＧＭ−ＣＳＦをコードするコード領域は、構成プロモーターまたはin vivoにおいて腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に注射した後に優勢となる条件によって誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。特定の理論に縛られるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスは、樹状細胞作用の増強をもたらし得る（以下に述べる）。その後、組換え腫瘍溶解性ウイルス内のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが樹状細胞を活性化して、次に、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【００２６】
特定の理論に縛られるものではないが、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ＣＴＬＡ−４を介して媒介される阻害シグナルからＴ細胞を解放するものと予想される。ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナルは、細胞周期の進行およびＩＬ−２発現を明らかに阻害する。これにより、抗原および共刺激ＣＤ２８のシグナル伝達に対するＴ細胞応答が、ＣＴＬＡ−４遮断薬の存在下でアップレギュレーションされる。ＣＴＬＡ−４遮断薬は無刺激Ｔ細胞の増殖全般を促進するのではない。
【００２７】
in vivoにおいてＴ細胞により媒介される応答は、細胞溶解性Ｔ細胞の生成および大部分の抗体応答、特に免疫グロブリンイソ型のクラススイッチを含む応答を含む。抗原刺激は感染細胞におけるウイルス抗原の存在；非天然状態の、もしくはこのようなタンパク質をコードする遺伝子の体細胞突然変異の過程で生じたタンパク質もしくはタンパク質の組合せを発現する腫瘍細胞；寄生体もしくは細菌の感染；または感作、例えば、腫瘍抗原の予防接種などであり得る。in vitroにおいて、当該法は、抗原に対する培養Ｔ細胞の応答を増強するために使用することもできる。このような活性化Ｔ細胞は、養子免疫療法、活性化機構の研究、薬物スクリーニングなどに使用が見出せる。
【００２８】
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ＣＴＬＡ−４タンパク質の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、その対抗受容体、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６などへの結合を遮断する分子である。通常、遮断薬の結合親和性は少なくとも約１００μＭである。遮断薬は、ＣＤ２８などのＣＴＬＡ−４の近縁分子やこの免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーとは実質的に反応しない。従って、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような分子は遮断薬としては排除される。さらに、遮断薬はＣＴＬＡ−４シグナル伝達を活性化しない。好都合には、これは一価または二価結合分子を用いることによって達成される。当業者には、異分子間の交差反応性および競合に関する以下の考察が、同種の起源を有する分子に関して言及することを意図するものであることが理解されるであろう（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４はヒトＣＤ８０および８６と結合するなど）。
【００２９】
候補遮断薬は、この基準を満たすそれらの能力に関してスクリーニングすればよく、このスクリーニングは当業者には慣例の実験の範囲である。例えば、結合の親和性および特異性を判定するアッセイは、競合および非競合アッセイを含め、当技術分野で公知である。着目されるアッセイとして、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリーなどが挙げられる。結合アッセイは精製されたまたは半精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質を用いてもよいし、あるいはＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞、例えば、ＣＴＬＡ−４の発現構築物でトランスフェクトされた細胞；ＣＤ３とＣＤ２８の架橋を介して刺激されたＴ細胞；照射した同種異系細胞の添加などを用いてもよい。結合アッセイの一例として、精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質を不溶性支持体、例えば、マイクロタイタープレート、磁性ビーズなどに結合させる。候補遮断薬および可溶性の標識ＣＤ８０またはＣＤ８６を細胞に加えた後、非結合成分を洗い流せばよい。ＣＴＬＡ−４との結合をめぐってＣＤ８０およびＣＤ８６と競合する遮断薬の能力は、結合した標識ＣＤ８０またはＣＤ８６を定量することによって測定される。遮断薬がＣＤ２８と交差反応しないという確認は、ＣＴＬＡ−４をＣＤ２８に置き換えて同様のアッセイを行えばよい。好適な分子としては、ＣＴＬＡ−４に対するよりも、少なくとも約１０３低い結合、より通常には少なくとも約１０４低い結合をＣＤ２８に対して示す。
【００３０】
一般に、可溶性一価または二価結合分子は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達を活性化しない。確認には、Ｔ細胞の活性化を検出する機能アッセイを使用することができる。例えば、あるＴ細胞集団を、候補遮断薬の存在下または不在下、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する同種異系細胞に照射を行ったもので刺激すればよい。ＣＴＬＡ−４シグナル伝達を遮断する薬剤は、増殖および細胞周期の進行、ＩＬ−２の放出、ＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションなどによって測定される、Ｔ細胞活性化の増大を生じる。当業者には、細胞表面での発現、リポソーム内へのパッケージング、粒子またはウェルへの接着などが分子の有効原子価を増すことが理解されるであろう。
【００３１】
遮断薬には、ペプチド、小有機分子、ペプチドミメティクス、可溶性Ｔ細胞受容体または抗体などが含まれる。抗体は好ましい遮断薬である。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく；完全なものでも末端切断型、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖでもよく；異種、同種異系、同系またはそれらの改変型、例えば、ヒト化型、キメラ型などであり得る。
【００３２】
多くの場合、遮断薬はオリゴペプチド、例えば、抗体またはそのフラグメントなどであるが、相対的に高い特異性および親和性を提供する他の分子も使用可能である。コンビナトリアルライブラリーは、必要な結合特性を有するオリゴペプチド以外の化合物を提供する。一般に、この親和性は少なくとも約１０−６、より通常には約１０−８Ｍ、すなわち、特異的モノクローナル抗体の場合に通常見られる結合親和性である。
【００３３】
遮断薬には、いくつかのスクリーニングアッセイを利用できる。このようなアッセイの成分は一般に、ＣＴＬＡ−４タンパク質と、場合によりＣＴＬＡ−４活性化剤、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６などを含む。一般に、異なる薬剤濃度を用いて複数のアッセイ混合物を並行して実施し、種々の濃度に対する示差的反応を得ることができる。一般に、これらの濃度の１つを陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出に満たないレベルとする。
【００３４】
好都合には、これらのアッセイにおいて、１以上の分子を標識と結合させるが、この場合、この標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する。様々な標識として、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁性粒子などが挙げられる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのペアが含まれる。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーを通常、既知の手順に従って、検出のために提供する分子で標識する。
【００３５】
注目される１つのスクリーニングアッセイとして、その対抗受容体によりＣＴＬＡ−４の活性化を妨げる薬剤に向けたものがある。活性化の定量は、当技術分野で公知のいくつかの方法によって行うことができる。例えば、Ｔ細胞活性化の阻害は、細胞増殖、サイトカインの放出を定量することなどによって測定することができる。
【００３６】
注目される他のアッセイとして、ＣＴＬＡ−４とその対抗受容体との結合を遮断する薬剤に向けたものがある。アッセイ混合物は、天然対抗受容体の少なくとも一部、または特異的結合を提供するのに十分な配列類似性を有するオリゴペプチド、および候補医薬を含んでなる。オリゴペプチドは、アッセイ条件および要件に見合った任意の長さであってよく、通常には少なくとも約８ａａの長さ、最大には全長タンパク質またはその融合物であり得る。ＣＴＬＡ−４は不溶性支持体に結合させてもよい。この支持体は、例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、レジン粒子など、多様な材料で製造され、多様な形状であってよい。支持体は、バックグラウンドを最小にし、かつ、シグナル／ノイズ比を最大にするように選択される。結合は当技術分野で公知の様々な方法によって定量することができる。結合を平衡に到達させるに十分なインキュベーション期間の後、不溶性支持体を洗浄し、残留する標識を定量する。結合を妨げる薬剤は検出される標識を少なくする。
【００３７】
候補薬剤は多くの化学種を包含するが、一般には、有機分子、好ましくは、５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでなり、一般に、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能性化学基を含む。候補薬剤は多くの場合、１以上の上記官能基で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでなる。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せをはじめとする生体分子にも見られる。
【００３８】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得ることもできる。例えば、多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成には、ランダムオリゴヌクレオチドの発現をはじめとする多くの手段が利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーが利用可能であるか、または容易に作製される。さらに、天然または合成により製造したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。既知の医薬剤に、構造類似体を作出するために、アシル化、アルキル化、エステル化、またはアミジフィケーション(amidification)などの定方向またはランダムな化学修飾を施してもよい。
【００３９】
様々な他の試薬もこのスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などのような、最適なタンパク質−ＤＮＡ結合を助け、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用することができる試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などのような、別の方法でアッセイ効率を改善する試薬も使用可能である。
【００４０】
遮断薬として用いるのに好適な抗体は、宿主動物を、ＣＴＬＡ−４タンパク質の全部または一部を含んでなるペプチドで免疫化することによって得ることができる。好適な宿主動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。タンパク質免疫原の起源はマウス、ヒト、ラット、サルなどであり得る。宿主動物は一般に免疫原とは異なる種であり、例えば、ハムスターを免疫化するにはマウスＣＴＬＡ−４を用い、マウスを免疫化するにはヒトＣＴＬＡ−４を用いる。ヒトＣＴＬＡ−４とマウスＣＴＬＡ−４は、その細胞外ドメインに保存性の高いストレッチを含む(Harper et al. (1991) J. Immunol. 147: 1037-1044)。このように保存性の高い領域に由来するペプチドは、交差特異的抗体を作製するための免疫原として使用することができる。
【００４１】
免疫原は、完全なタンパク質、またはそのフラグメントおよび誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン（例えば、アミノ酸残基３８〜１６１）の全部または一部を含んでなり、この場合、これらの残基は、天然ＣＴＬＡ−４に見られるグリコシル化などの翻訳後調節を含む。細胞外ドメインを含んでなる免疫原は、例えば、従来の組換え法を用いたクローニング遺伝子の発現、高レベルのＣＴＬＡ−４を発現する選別細胞集団であるＴ細胞からの単離などの、当技術分野で公知の様々な方法で作製することができる。
【００４２】
組換えまたは改変タンパク質の発現が望まれる場合には、ＣＴＬＡ−４の所望の部分をコードするベクターを使用する。一般に、発現ベクターは、ＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインがトランスフェクト細胞の表面にあるように、あるいは、細胞外ドメインが細胞から分泌されるように設計される。細胞外ドメインを分泌させる場合には、細胞外ドメインのコード配列を、シグナルペプチドを含む、分泌を可能とする配列とインフレームで融合する。シグナルペプチドは外因性のものでも天然のものでもよい。免疫目的の融合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインと免疫グロブリンの定常領域を連結したものである。例えば、マウスＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとヒトＣｇＩ（例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインのヒンジ領域を連結したものを含んでなる融合タンパク質を、ハムスターの免疫に使用することができる。
【００４３】
ＣＴＬＡ−４を細胞表面で発現させる場合には、細胞外ドメインのコード配列を、その細胞外ドメインを膜およびシグナル配列に係留するペプチドをコードする配列とインフレームで融合させる。このような係留配列としては、天然ＣＴＬＡ−４トランスメンブランドメイン、または他の細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇなどのトランスメンブランドメインが含まれる。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子でトランスフェクトされたマウス細胞を用いてマウスを免疫化し、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的な抗体を作製することができる。
【００４４】
モノクローナル抗体は従来の技術によって作製することができる。一般に、免疫化した宿主動物の脾臓および／またはリンパ節が形質細胞源となる。これらの形質細胞は、骨髄腫細胞と融合させることにより不死化してハイブリドーマ細胞を作製することができる。個々のハイブリドーマからの培養上清を、所望の特異性を有する抗体を産生するものを同定するための標準技術を用いてスクリーニングする。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するのに好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどが挙げられる。マウスタンパク質に対する抗体を作製するには、この動物は一般にハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、例えば、不溶性の支持体であるプロテインＡセファロースなどに結合されたＣＴＬＡ−４を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの従来技術によって、ハイブリドーマ細胞上清または腹水から精製することができる。
【００４５】
抗体は、通常の多量体構造の代わりに一本鎖として作製することもできる。一本鎖抗体はJost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73およびその他に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、グリシンおよび／またはセリンを含む小型の中性アミノ酸の少なくとも約４個のアミノ酸をコードするスペーサーと連結することができる。この融合物によってコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能的可変領域のアセンブリを可能とする。
【００４６】
in vivo使用、特にヒトへの注射に関しては、遮断薬の抗原性を低減することが望ましい。遮断薬に対するレシピエントの免疫応答は、その療法が有効である期間を短くする可能性がある。抗体をヒト化する方法は当技術分野で公知である。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物であり得る（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１００７７およびＷＯ９０／０４０３６参照）。あるいは、目的の抗体を、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列に置き換えるべく組換えＤＮＡ技術によって操作することもできる（ＷＯ９２／０２１９０参照）。
【００４７】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮＡの使用は当技術分野で公知である(Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439および(1987) J. Immunol. 139:3521)。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡを作製する。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製し、目的配列を単離するためにスクリーニングする。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト定常領域配列と融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242に見出せる。ヒトＣ領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。イソ型の選択は、補体結合などの所望のエフェクター機能、または抗体依存性細胞傷害性における活性を指針とすることができる。好ましいイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κまたはλのいずれかを使用することができる。その後、キメラ、ヒト化抗体を従来法によって発現させる。
【００４８】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂなどの抗体フラグメントは、完全なタンパク質の切断、例えばプロテアーゼまたは化学的切断によって作製することができる。あるいは、末端切断型遺伝子を設計することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、末端切断型分子となるようにＨ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域、その後に翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４９】
ＨおよびＬ Ｊ領域のコンセンサス配列を用い、Ｊ領域に、後にＶ領域セグメントをヒトＣ領域セグメントに結合させるのに有用な制限部位を導入するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｃ領域のｃＤＮＡは、ヒト配列の類似の位置に制限部位を配置するための部位特異的突然変異誘発によって改変することができる。
【００５０】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。好都合のベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入および発現可能なように操作された適当な制限部位を伴うものである。このようなベクターでは、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域のスプライス供与部位とヒトＣ領域の前のスプライス受容部位の間で、また、ヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域においても生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然染色体部位で起こる。得られたキメラ抗体をレトロウイルスＬＴＲ、例えば、ＳＶ−４０初期プロモーター(Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280)、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ(Gorman et al. (1982) P.N.A.S. 79:6777)およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ(Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885)；天然Ｉｇプロモーターなどをはじめとする任意の強力なプロモーターと連結することができる。
【００５１】
抗原に対する欠陥型の宿主Ｔ細胞応答に特徴的な状態としては、慢性感染、腫瘍、ペプチドワクチンによる免疫化などが含まれる。当該ＣＴＬＡ−４遮断薬をこのような宿主に投与すると、活性化Ｔ細胞の表現型を特異的に変化し、抗原により媒介された活性化に対する応答が増強される。
【００５２】
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、抗原刺激に対するＴ細胞の応答を増強するのに有効な用量で投与される。当該処置により、この活性化Ｔ細胞の応答は、休止Ｔ細胞よりも高い程度で影響を受け得る。Ｔ細胞応答の測定は、処置される条件によって異なる。Ｔ細胞活性の有用な尺度は、増殖、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａなどの放出；ＣＤ２５およびＣＤ６９などのマーカーの細胞発現；ならびに当技術分野で公知のＴ細胞活性の他の尺度であり得る。
【００５３】
市販のＣＴＬＡ−４遮断薬としては、イピリムマブ(Bristol-Myers Squibb, New York, NY)およびトレミリムマブ(tremilimumab)(Pfizer, New York, NY)が挙げられる。
【００５４】
一つの実施態様において、免疫刺激薬はインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）である。ＩＬ−２１は、Parrish-Novak, et al, Nature 408:57-63 (2000); Wang, et al., Cancer Res. 63:9016-9022 (2003);およびThompson, et al., J. Clin. Oncol. 26:2034-2039 (2008)により記載されている。これらの文献は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【００５５】
インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、先天免疫と適応免疫の双方に影響を及ぼすクラスＩサイトカインである。ＩＬ−２１の影響としては、腫瘍特異的ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、増殖の増大および生存の延長；Ｔ細胞依存性Ｂ細胞増殖および抗体産生の増強；ならびにナチュラルキラー細胞の最終分化および活性化が含まれる。ＩＬ−２とは違い、ＩＬ−２１は、ＣＤ４ Ｔ細胞を調節性Ｔ細胞抑制に対して耐性とし、調節性Ｔ細胞の増殖を促進せず、ＩＬ−２１はまた、メモリーＴ細胞の生成の促進をもたらし得る。ＩＬ−２１は、種々の前臨床癌モデルにおいて抗腫瘍効果を持つことが報告されている。
【００５６】
ある研究では、マウスにおいて確立した皮下腫瘍を、流体力学に基づく遺伝子送達技術を用い、ネズミＩＬ−２１をコードするプラスミドＤＮＡを全身投与することによって処置した。ＩＬ−２１プラスミドＤＮＡの投与の結果、in vivoにおいて高レベルの循環ＩＬ−２１が得られた。担癌マウスをＩＬ−２１プラスミドＤＮＡで処置したところ、対照プラスミドＤＮＡで処置したマウスに比べ、Ｂ１６黒色腫およびＭＣＡ２０５繊維肉腫の増殖を、有意な毒性なく、用量依存的に有意に阻害し、生存率も高めた。in vivoにおいてＣＤ４またはＣＤ８のいずれかのＴ細胞を枯渇させたが、ＩＬ−２１により媒介される抗腫瘍活性は影響を受けなかった。しかしながら、ＮＫ細胞を枯渇させると、ＩＬ−２１により誘導される腫瘍阻害は実質的に消失した。このことと一致して、ＩＬ−２１の抗腫瘍活性は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増強によって媒介されるものと思われた。この研究により、ＩＬ−２１が有意な抗腫瘍活性を持ち、臨床において抗腫瘍薬としての治療可能性を持ち得ることが示唆された。
【００５７】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は抗ＣＤ４０である。ＣＤ４０は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞および樹状細胞で発現される。ＣＤ４０リガンドは、活性化Ｔ細胞で発現される。樹状細胞においてＣＤ４０が刺激されると、樹状細胞の活性化とＩＬ−１２の放出が誘発される。ＣＤ４０に対する刺激性抗体は、抗原特異的免疫応答を増強することができる。
【００５８】
免疫刺激薬の投与は、抗原提示細胞を刺激するサイトカイン、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）などの投与と組み合わせてもよい。Ｔ細胞の増殖および分泌を増強することが知られている、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、Ｂ７、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８などの付加的タンパク質および／またはサイトカインを免疫刺激薬と同時または逐次に用いて、免疫応答を増強することができる。免疫刺激薬の投与は、種々のサイトカインまたは細胞表面受容体をコードする遺伝子による腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球のトランスフェクションと組み合わせてもよい(Ogasawara et al. (1993) Cancer Res. 53:3561-8;およびTownsend et al. (1993) Science 259:368-370参照)。例えば、ＣＤ８０をコードするｃＤＮＡによる腫瘍細胞のトランスフェクションはトランスフェクトされた腫瘍細胞の排除をもたらし、その後の非トランスフェクト親腫瘍細胞による攻撃に対して免疫を誘導することができることが示されている(Townsend et al. (1994) Cancer Res. 54:6477-6483)。
【００５９】
腫瘍特異的宿主Ｔ細胞は、ex vivoにおいて、免疫刺激薬および腫瘍抗原または腫瘍細胞と組み合わせ、患者に再注入してもよい。宿主に投与すると、刺激された細胞は腫瘍死滅反応誘発し、その結果、腫瘍が退縮する。これらの宿主細胞は、リンパ節、例えば、鼠径リンパ節、腸間膜リンパ節、表在性遠位液窩リンパ節；骨髄；脾臓；または末梢血などの種々の供給源から、ならびに腫瘍、例えば、腫瘍浸潤リンパ球から単離することができる。細胞は同種異系のものであってよく、自己のものが好ましい。ex vivo刺激については、宿主細胞を無菌的に取り出し、当技術分野で公知の任意の好適な培地に懸濁させればよい。これらの細胞を、種々のプロトコールのいずれか、特に、Ｂ７、抗ＣＤ２８などの組合せにより、遮断薬と組み合わせて刺激することができる。刺激された細胞は、結合剤、増量剤、担体、保存剤、分解防止剤、乳化剤およびバッファーなどの添加剤を含む種々の医薬処方物として、例えば静脈注射、腹腔内注射などの注射によって宿主に再導入することができる。好適な希釈剤および賦形剤としては、水、生理食塩水、グルコースなどが挙げられる。
【００６０】
免疫刺激遮断薬の投与によって増殖が低下可能な腫瘍細胞としては、癌腫、例えば、乳房、卵巣、子宮内膜、頸部、結腸、肺、膵臓、食道、前立腺、小腸、直腸、子宮または胃に原発腫瘍部位を持ち得る腺癌；ならびに肺、口腔、舌、喉頭、食道、皮膚、膀胱、頸部、眼瞼、結膜、膣などに原発部位を持ち得る扁平上皮癌が含まれる。処置可能な他のクラスの腫瘍としては、肉腫、例えば、筋原性肉腫；神経腫；黒色腫；白血病、ある種のリンパ腫、栄養膜腫瘍および生殖細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍が含まれる。
【００６１】
特に注目される腫瘍としては、腫瘍特異的抗原を提示するものが含まれる。このような抗原は、異常な関係性で、または異常に高いレベルで提示され得るか、または突然変異型であり得る。この腫瘍抗原は、腫瘍細胞に対する宿主Ｔ細胞応答を増強するために当該遮断薬とともに投与することができる。このような抗原調製物は、精製タンパク質、または腫瘍細胞由来の溶解液を含んでなり得る。
【００６２】
腫瘍抗原の例としては、癌腫の抗原としてのサイトケラチン、特に、サイトケラチン８、１８および１９が挙げられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）；ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６およびＴ１６も既知の癌腫抗原である。デスミンおよび筋肉特異的アクチンは、筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリ性ホスファターゼ、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよびα−フェトタンパク質は、栄養膜腫瘍および生殖細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原としては、前立腺癌腫の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原がある。ＨＭＢ−４５は、黒色腫の抗原である。クロモグラニン(Chromagranin)−Ａおよびシナプトフィジンは、神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に注目されるものとしては、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する急速進行性腫瘍が挙げられる。このような壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源である。
【００６３】
免疫刺激薬の投与は、ある種のリンパ腫に対しては禁忌である場合がある。特に、Ｔ細胞リンパ腫は、活性化の増大からは利益を受けない場合がある。ＣＤ８０抗原は、ホジキン病のリード・シュテルンベルク(Reed-Sternberg)細胞によって強く発現され、ＣＤ２８発現Ｔ細胞によって取り囲まれている場合が多い(Delabie et al. (1993) Blood 82:2845-52)。このリード・シュテルンベルク細胞の補助的細胞機能はＴ細胞の活性化をもたらし、ホジキン症候群の一因となることが示唆されている。
【００６４】
化学療法および放射線療法などの多くの従来の癌療法が、リンパ球集団を著しく減らしてしまう。免疫刺激薬の投与はこの免疫抑制をある程度緩和することができるが、１つの併用治療コースとして、腫瘍抗原をさらに放出させるため、または免疫調節リンパ球集団を減らすために当該療法の前および／または後にこのようなリンパ球毒性療法を用いるものがある。
【００６５】
アジュバントは抗原に対する免疫応答を増強する。免疫刺激薬は、Ｔ細胞の活性化を増強し、抗体産生細胞のクラススイッチを増大させ、それにより、免疫原に応答して産生されるＩｇＧクラス抗体の濃度を高めるためにアジュバントとして用いられる。免疫刺激薬は、アジュバント使用に関する従来技術に従って、生理学上許容される媒体中で免疫原と合わせる。免疫原は単一の処方物として免疫刺激薬と合わせてもよいし、あるいは別に投与してもよい。免疫原としては、多糖、タンパク質、タンパク質フラグメント、ハプテンなどが含まれる。特に注目されるものとして、ペプチド免疫原の併用がある。ペプチド免疫原としては、上記のような腫瘍抗原およびウイルス抗原またはそれらのフラグメントが挙げられる。
【００６６】
免疫刺激薬は、モノクローナル抗体生産用の、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの実験動物の免疫化の際に使用することができる。免疫刺激薬を投与すると、抗原に対する応答レベルが高まり、クラススイッチを受ける形質細胞の割合が増える。
【００６７】
免疫刺激薬は、例えば不死化細胞系統、混合または精製細胞集団の初代培養物、非形質転換細胞などの任意のin vitro細胞培養系を含む、培養Ｔ細胞の活性化を増強するためにin vitroにおいて投与することができる。特に注目されるものとしては、細胞が患者または同種異系ドナーから取り出され、ex vivoで刺激され、患者に再注入され得る初代Ｔ細胞培養物である。
【００６８】
場合によっては、過剰なＴ細胞増殖のために治療期間を制限するのが望ましいこともある。これらの制限は、療法に対する患者の応答、患者のＴ細胞数などに応じて経験的に決定することができる。Ｔ細胞数は、Ｔ細胞特異的抗体による染色およびフローサイトメトリーを含む当技術分野で公知の方法によって患者においてモニタリングすることができる。
【００６９】
また、免疫刺激の機能的効果は、当該発明を用いた場合に見られる細胞内シグナル伝達における変換を模倣する他の薬剤の投与によって誘導することもできる。例えば、特定の細胞質キナーゼが細胞外受容体の結合に応答して活性化され得ることが知られている。キナーゼ活性を遮断する薬剤は、受容体結合の遮断と類似の生理学的効果を持つであろう。同様に、環状ＡＭＰ、ＧＴＰ濃度および細胞内カルシウムレベルを高める薬剤は、細胞外受容体結合の場合に見られるものと類似の生理学的効果をもたらし得る。
【００７０】
腫瘍を有するいずれの哺乳類にも、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を施すことができる。哺乳類は、ヒトまたはヒトにとって経済的または美的有用性を有する哺乳類、例えば、農用動物、補助動物またはペットであり得る。一つの実施態様において、哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットからなる群から選択される。
【００７１】
一つの実施態様において、腫瘍は、脳、肺、皮膚、口腔、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、腎臓、乳房、卵巣、前立腺、精巣、膵臓、膀胱およびリンパ節からなる群から選択される器官におけるものである。
【００７２】
腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬は哺乳類に、同じ経路によって投与してもよいし、または異なる経路によって投与してもよい。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスを、例えば腫瘍内注射によって腫瘍に投与し、免疫刺激薬を、例えば血管内、皮下、腹腔内などで全身投与する。
【００７３】
腫瘍溶解性ウイルスの別の投与経路としては、静脈注射、筋肉注射、吸入（肺の腫瘍に特に好適であり得る）、または直腸（大腸または結腸の腫瘍に特に好適であり得る）経路が含まれる。
【００７４】
腫瘍溶解性ウイルスの用量レベルは、医師または獣医師によって慣例的に選択することができる。望ましくは、腫瘍溶解性ウイルスの用量は、所望の治療応答が迅速に起こるに十分多く、患者に対して有害とならないよう十分少ないものである（ここで、「患者に対して有害」とは、重度の悪心および毛髪の喪失などの、薬物または放射線に基づく抗癌療法の典型的な症状、ならびに重度の呼吸器系疾患、重度の消化管障害、神経系の損傷などの鳥類のＮＤＶ感染の典型的症状、および呼吸困難、下痢、脱水、一時的血小板減少症および広汎性血管漏出などのヒトに対する過量のＮＤＶの症状を含む。軽度の発熱、結膜炎、その他の一時的な風邪のような症状は「患者に対して有害」ではない）。例えば、ＮＤＶ株ＰＶ−７０１は、進行固形癌を有する患者において、ｉ．ｖ．経路による場合には少なくとも３×１０９感染性粒子、そして腫瘍内経路による場合には少なくとも４×１０１２の用量で、十分な耐用性がある。患者がより低い初期用量で脱感作された場合、最大耐用量（ＭＴＤ）は約１０倍増加した。
【００７５】
一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、約２〜４ヶ月間、週に１回腫瘍内注射によって投与した後、約２〜４か月おきに腫瘍内注射１回の維持レジメンを行う。
【００７６】
免疫刺激薬の用量は、疾病の性質、投与頻度、投与様式、投与目的、宿主からの薬剤の排泄などによって、幅広く変更可能である。投与量は、特定の薬剤の薬力学的特徴、投与の様式および経路、レシピエントの齢、健康状態および体重、症状の性質および程度、併用治療、治療頻度、ならびに望まれる高価などの既知の因子によって異なる。この用量は、毎週もしくは隔週といった低頻度で投与してもよいし、または有効用量レベルを維持するために、少用量に分割して毎日、週２回などの投与を行ってもよい。一般に、有効成分の１日量は約０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇとすることができる。内服投与に好適な投与形は一般に、１単位当たり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇの有効成分を含有する。有効成分は、免疫刺激薬の総重量に対して０．５〜９５重量％まで可変である。
【００７７】
一般に、免疫刺激薬は、本発明の方法に従って投与した場合、腫瘍溶解性ウイルスを伴わずに投与した場合の免疫刺激薬で一般に見られるものよりも低用量で有効であり得る。
【００７８】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は、約２〜４か月間、約２〜４週おきに１回、約１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で静脈注射によって投与し、その後、約２〜４か月おきに１回、約１０ｍｇ／体重ｋｇ用量の静脈注射で維持レジメンを行う。
【００７９】
当該免疫刺激薬は、例えば、生理食塩水、植物油、鉱油、ＰＢＳなどの薬学上許容される媒体中の有効用量で処方物として調製することができる。治療製剤は、生理学上許容される液体、ゲルまたは固体担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を含み得る。添加剤は、殺菌剤、例えばＮａＣｌ、マンニトールなどの等張性を維持する添加剤；および例えばバッファーおよび保存剤などの化学的安定性を維持するための添加剤などを含み得る。免疫刺激薬はカクテルとして投与してもよいし、または単一の薬剤として投与してもよい。非経口投与に関しては、免疫刺激薬は、薬学上許容される非経口ビヒクルと組み合わせた溶液、懸濁液、エマルションまたは凍結乾燥粉末として処方することができる。リポソーム、または硬化油などの非水性ビヒクルも使用可能である。処方物は当技術分野で公知の技術によって滅菌することができる。
【００８０】
腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激薬が投与される前のある時点で、哺乳類に投与することができる。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激薬が投与される１日〜５日前に投与される。特定の理論に縛られるものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、２つの役割を果たし得る。第一に、腫瘍溶解性ウイルスはいくつかの腫瘍細胞を直接死滅させることができる。第二に、腫瘍溶解性ウイルスは、それが死滅させる腫瘍細胞の溶解を導くことによって免疫系を刺激することができ、その後、溶解によって放出された腫瘍細胞抗原は樹状細胞によって捕捉され、Ｔ細胞を刺激し、それにより、その哺乳類の免疫系による他の腫瘍細胞の死滅を促進する。免疫刺激薬は、後者のプロセスを促進することができる。例えば、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、Ｔ細胞をダウンレギュレーションするＣＴＬＡ−４の活性を低減させ得る。ウイルスはまた、免疫細胞においてｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を誘発することにより、先天免疫を直接活性化させることができる。
【００８１】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を投与することに加え、種々の実施態様では、この方法は付加的工程をさらに含んでなってよい。
【００８２】
一つの実施態様において、この方法は、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を除く他の抗癌薬を哺乳類に投与することをさらに含んでなる。いずれの既知の抗癌薬も、抗癌療法の熟練者に知られた経路、用量および治療レジメンで投与することができる。
【００８３】
さらなる一つの実施態様において、前記抗癌薬は、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン(mitozantrone)、オキサリプラチン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、タキソテール、テモゾロミド(tamozolomide)、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、ＵＦＴ（ウラシル−テガフール(tegufur)）、ビンブラスチン、ビンデシン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８４】
別のさらなる実施態様では、抗癌薬は、アレムツズマブ、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン(campothecin)、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣｅａＶａｃ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクリズマブ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エドレコロマブ、エピルビシン、エピラツズマブ、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゲニステイン、ゴセレリン、ｈｕＪ５９１、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、ＩＧＮ−１０１、イマチニブ、インターフェロン、インターロイキン−２、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、リンツズマブ、ロムスチン、ＭＤＸ−２１０、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ミツモマブ、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、ペルツズマブ、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフィニブ(sorafinib)、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、チボシニブ(tivosinib)、バタラニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８５】
さらに別のさらなる実施態様では、抗癌薬は、ＭＤＸ−０１０；ＭＡｂ、ＡＭＥ；ＡＢＸ−ＥＧＦ；ＥＭＤ７２０００；アポリズマブ；ラベツズマブ；ｉｏｒ−ｔｌ；ＭＤＸ−２２０；ＭＲＡ；Ｈ−１１ ｓｃＦｖ；オレゴボマブ；ｈｕＪ５９１ ＭＡｂ、ＢＺＬ；ビジリズマブ；ＴｒｉＧｅｍ；ＴｒｉＡｂ；Ｒ３；ＭＴ−２０１；Ｇ−２５０、非複合体；ＡＣＡ−１２５；Ｏｎｙｖａｘ−１０５；ＣＤＰ−８６０；ＢｒｅｖａＲｅｘ ＭＡｂ；ＡＲ５４；ＩＭＣ−１Ｃ１１；ＧｌｉｏＭＡｂ−Ｈ；ＩＮＧ−１；抗ＬＣＧ ＭＡｂ；ＭＴ−１０３；ＫＳＢ−３０３；Ｔｈｅｒｅｘ；ＫＷ−２８７１；抗ＨＭＩ．２４；抗ＰＴＨｒＰ；２Ｃ４抗体；ＳＧＮ−３０；ＴＲＡＩＬ−ＲＩ ＭＡｂ、ＣＡＴ；前立腺癌抗体；Ｈ２２ｘＫｉ−４；ＡＢＸ−ＭＡ１；イムテラン(Imuteran)；モノファーム(Monopharm)−Ｃ；ＡＶ−２９９；およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８６】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外のこれら抗癌薬は、それらの作用機序によって例えば以下の群に分類することができる：ピリミジン類似体（例えば、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗薬および関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの抗代謝産物／抗癌薬；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）などの天然物、微小管崩壊剤［タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンなど］、エピジポドフィロトキシン(epidipodophyllotoxin)（テニポシド）、ＤＮＡ傷害薬（例えば、アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレアミン(merchlorethamine)、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））を含む抗増殖／抗有糸分裂薬；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（例えば、Ｌ−アスパラギンを全身代謝し、それら独自のアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン、およびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン(trazenes - dacarbazinine)（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）；プラチナ錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミドなどの抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬；ホルモン、ホルモン類似体（例えば、エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（例えば、ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；繊維素溶解薬（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ＣＯＸ−２阻害剤、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走薬；分泌抑制薬（例えば、ブレベルジン）；免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管形成化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（例えば、トラスツズマブおよび上記に挙げられている他のもの）；細胞周期阻害剤および分化誘導物質（例えば、トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド(eniposide)、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（例えば、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン(methylpednisolone)、プレドニゾンおよびプレドニソロン(prenisolone)）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘発薬およびカスパーゼアクチベーター；クロマチン崩壊薬。
【００８７】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外の抗癌薬の用量を減らしたり、治療レジメンを短縮または弱化したりしても、本方法の一部として行う場合には、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外の抗癌薬をそれ自体で投与する場合よりも有効であり得ることが当業者には分かるであろう。特定の実施態様において、抗癌薬または薬剤組合せの有効用量（ＥＤ５０）は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬と併用する場合には、抗癌薬単独のＥＤ５０の少なくとも２分の１、いっそうより好ましくは５分の１、１０分の１、さらには２５分の１である。逆に、このような抗癌薬または薬剤組合せの治療係数（ＴＩ）は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬と併用する場合には、従来の化学療法レジメン単独のＴＩの少なくとも２倍、いっそうより好ましくは５倍、１０倍、さらには２５倍であり得る。
【００８８】
一つの実施態様において、本方法は、哺乳類に放射線療法を施すことをさらに含んでなる。いずれの既知の放射線源を、癌に対する放射線療法の熟練者に知られている技術、線量および治療レジメンで施してもよい。放射線療法の線量を減らしたり、治療レジメンを短縮または弱化したりしても、本方法の一部として行う場合には、放射線療法をそれ自体で施す場合よりも有効であり得ることが当業者には分かるであろう。
【００８９】
本方法の実施からもたらされる治療の進行は、限定されるものではないが、とりわけ、非侵襲的画像法、生検および腫瘍活性（一般に腫瘍質量に相関）の血中マーカーの分析を含む当業者に公知の技術によって慣例的にモニタリングすることができる。
【００９０】
別の実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を、腫瘍を有する哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなるキットに関する。腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬は上記の通りであり得る。
【００９１】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法に関する。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与することを含んでなる。
【００９２】
一般的な癌の進行は、原発腫瘍が哺乳類の身体の特定の組織、器官、または器官系に発生することである。その後、原発腫瘍の１以上の細胞が哺乳類の血液またはリンパを通じて移動することにより、原発腫瘍の１以上の転移が哺乳類身体の他の特定の組織、器官または器官系に生じ得る。
【００９３】
多くの場合、転移癌を治療することは原発腫瘍の場合よりも難しい。転移癌は、種々の治療選択に従いにくい１以上の場所、および／または種々の治療選択が比較的効果的でないような多数の部位で生じ得る。さらに、転移癌は、原発腫瘍が比較的進行し、患者の予後がすでに比較的悪い場合に生じる。
【００９４】
予期しないことに、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍（原発腫瘍または転移腫瘍であり得る）に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与することだけまたは免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することだけを行う場合に見られるものよりも、第二の腫瘍の大きさをより縮小できることを見出した。
【００９５】
本明細書において「腫瘍」とは、特に、この語を含む句または文章が、その語が固形新生物を表すことが当業者に示唆される下りを除き、固形新生物に見られるものに限らず、任意の新生細胞に対して用いられる。
【００９６】
腫瘍溶解性ウイルスは上記の通りであり得る。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される。
【００９７】
免疫刺激薬は上記の通りであり得る。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【００９８】
一つの実施態様において、この方法は、第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すことをさらに含んでなる。局部的抗癌療法は放射線療法であり得るが、代わりに、または加えて、標的化学療法を含む標的療法などの他の局部的抗癌療法を使用することもできる。予期しないことに、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与すること、および局部的抗癌療法を第一の腫瘍に施すことによって、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与することだけ、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することだけ、または局部的抗癌療法を第一の腫瘍に投与することだけを行う場合に見られるものよりも、第二の腫瘍の大きさをより縮小できることを見出した。
【００９９】
腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍の大きさを縮小することができる。また、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与すること、および局部的抗癌療法を第一の腫瘍に施すことによって、第一の腫瘍の大きさを縮小することができる。
【０１００】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびに腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方を治療することに関する説明書を含んでなるキットに関する。
【０１０１】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤としての腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬に関する。さらなる実施態様において、本発明は、薬剤としての腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌療法に関する。
【０１０２】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方の治療を目的とした薬剤の製造のための腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬の使用に関する。さらなる実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方の治療を目的とした薬剤の製造のための腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌薬の使用に関する。
【０１０３】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を含んでなるキットに関する。さらなる実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌療法を含んでなるキットに関する。指定された成分は、目的指向適用（本明細書に示される通り）機能的単位を形成する（本明細書で示される理由で）。
【０１０４】
以下、実施例を示し、本発明の特定の実施態様を説明する。当業者には、以下の実施例に開示されている技術が本発明の実施において十分機能することが発明者らによって見出された技術を表すことが理解されるはずである。しかしながら、当業者には、本開示に照らして、開示されている特定の実施態様に多くの変更を行っても、なお、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様の、または類似体時の結果が得られることが理解されるはずである。
【実施例】
【０１０５】
８〜１０週齢の雄Ｃ５７Ｂ１６Ｊマウスを用いた。これらのマウスの平均体重は２０〜２２ｇであった。マウスを、１群各５または６匹ずつの６つの試験群に分けた。実験群は次の通りであった。
第１群 Ｍｏｃｋ処置（腫瘍内および腹腔内ＰＢＳ、切断）
第２群 Ｘ線処置
第３群 ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）処置
第４群 ＮＤＶ処置およびＸ線処置
第５群 ＣＴＬＡ４処置
第６群 ＮＤＶ処置、抗ＣＴＬＡ−４処置およびＸ線処置
【０１０６】
以下の手順を行った。
０日目に、２０μｌ容量のＰＢＳ中、３００，０００個の腫瘍細胞（ＭＣＡ２０５、Ｂ１６ｏｖａ）（第１群〜６群）を右足蹠に移植した。
６日後、１００μｌ容量のＰＢＳ中、２００，０００個の腫瘍細胞（ＭＣＡ２０５、Ｂｌ６ｏｖａ）（第１群〜６群）を左側腹（すなわち、反対側）に移植した。
１２日目に、足蹠腫瘍が明らかに視認できた。第２群、４群および６群の足蹠腫瘍に、０．５２８Ｇｙ／分の線量率で４ＧｙのＸ線を照射した。腫瘍照射中、マウス身体の残りの部分は鉛で遮蔽した。
Ｘ線処置後すぐに、第３、４群および６群では、足蹠腫瘍に１０μｌのＰＢＳ中０．６×１０７個のＮＤＶ ＭＴＨ６８Ｈ株ウイルス粒子を注射した。第１群には、１０μｌのＰＢＳのｍｏｃｋ注射を施した。実験期間の間、ＮＤＶ処置は、月〜金曜の毎日１回、週に５回行った。第２週目の処置以降、２０μｌのＮＤＶ溶液（１．２×１０８個のウイルス粒子）を注射した。
第５群および６群には、１回目のＸ線処置の１時間後、抗ＣＴＬＡ−４を腹膜内に投与した（１００μｇ／マウス、およそ１００μｌ ＰＢＳ中）。第１群には、１００μｌ ＰＢＳのｍｏｃｋ注射を施した。処置は３日おきに５回繰り返した。
第１群〜６群について、足蹠腫瘍と反対側腫瘍の双方の腫瘍増殖を平均腫瘍体積から定量した。
【０１０７】
図１は、足蹠腫瘍の増殖を示す。照射とＮＤＶと抗ＣＴＬＡ−４の組合せを施した第６群は、３２日目において、第２群（照射だけを施与）および第４群（照射とＮＤＶを施与）の双方を含む他のどの群よりも腫瘍体積が小さかった。
【０１０８】
図２は、第１群〜６群について、反対側の側腹腫瘍の増殖を示す。上記から明らかであることが示されるように、側腹腫瘍は照射、ウイルス注射または抗ＣＴＬＡ−４によって直接処置されなかった。照射とＮＤＶと抗ＣＴＬＡ−４の組合せを施した第６群は、１９〜２８日目において、第２群（照射だけを施与）および第４群（照射とＮＤＶを施与）の双方を含む他のどの群よりも腫瘍体積が小さかった。
【０１０９】
本明細書に開示され、特許請求される組成物および方法は総て、本開示に照らし、過度な実験を行わなくとも実施および達成可能である。本発明の組成物および方法は特定の実施態様において記載されているが、変形形態が、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に記載されている組成物および方法、方法の工程または一連の工程に適用可能であることは当業者には自明である。より具体的には、本明細書に記載されている薬剤を、化学的に関連するある特定の薬剤に置き換えても同じまたは類似の結果を達成できるのは明らかである。このような当業者に自明の類似の置換および改変は総て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【発明の背景】
【０００１】
本願は、引用することにより本明細書の一部とされる２００９年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／１７９，４８０号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、癌治療に関する。
【発明の概要】
【０００３】
一つの実施態様において、本発明は、哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬を投与することを含んでなる方法に関する。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００４】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法に関する。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与することを含んでなる。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００５】
別の実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】実施例１に述べられた足蹠腫瘍の増殖のグラフである。
【図２】実施例１に述べられた反対側の側腹腫瘍の増殖のグラフである。
【発明の具体的説明】
【０００７】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍を有する哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬投与することを含んでなる方法に関する。さらなる実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【０００８】
一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される。さらなる一つの実施態様において、パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される。なおさらなる一つの実施態様において、ＮＤＶは、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する。腫瘍溶解性ウイルスを、上記に挙げた具体的なものを含め、以下にさらに詳しく記載する。
【０００９】
本明細書において「多重感染度」または「ＭＯＩ」とは、腫瘍細胞に対する感染性ウイルス粒子の比を意味する。
【００１０】
「単離された」または「精製された」ウイルスとは、細胞性の、または細胞培養液もしくはウイルスが増殖される他の媒体（水、水溶液およびウイルスを保存もしくは投与する際に用いるための当技術分野で公知の材料で、夾雑材料ではない）の由来する他の夾雑材料を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、夾雑材料の約５０重量％未満、例えば、約４０重量％未満、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約２．５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満または約０．１重量％未満の夾雑材料を含むウイルス調製物を意味する。
【００１１】
本明細書において腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染し、癌細胞を溶解させることができるウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を助長するとともに、その腫瘍での用量増幅をもたらし得る。
【００１２】
ＮＤＶは、数種の飼い鳥および野鳥種を侵す伝染性の高い疾病を引き起こすネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。具体的には、ＮＤＶは、モノネガウイルス(mononegaviralis)目パラミクソウイルス科ルブラウイルス属の鳥パラミクソウイルス−１（ＡＰＭＶ−１）として分類される。ＮＤＶは、およそ１６，０００ヌクレオチドのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する１００〜３００ｎｍ径の、エンベロープを有するウイルスである。ＮＤＶゲノムは、６つの主要ポリペプチド：Ｌ、ＨＮ、Ｆ、Ｍ、ＰおよびＮＰをコードする６つの遺伝子を含む。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、タンパク質Ｌ、ＰおよびＮＰを含み、これらは感染細胞の細胞質の遊離リボソームにおいて翻訳される。Ｆ糖タンパク質は不活性前駆体（Ｆ０、６７ｋＤａ）として合成され、タンパク質分解切断を受けて、Ｆ１鎖（５５ｋＤａ）とＦ２鎖（１２．５ｋＤａ）がジスルフィド結合したものからなる生物学的に活性なタンパク質を生じる。
【００１３】
種々の分野によって単離された形態のＮＤＶは、それらの毒力に応じて、短潜伏期性(velogenic)（高病原性）、亜病原性(mesogenic)（中間病原性）、または長潜伏期性（非病原性）に分類されてきた。
【００１４】
ＮＤＶは一般にヒトの健康に害を持たないと考えられるが、ヒトがこのウイルスに曝されると、軽度の結膜炎や風邪のような症状（例えば、約２４時間の軽い発熱）に至ることがある。ＮＤＶのようなエンベロープを有するウイルスは、２つの主要な経路、すなわち、１）エンベロープと原形質膜との直接的融合、および２）受容体により媒介されるエンドサイトーシスを介して細胞に侵入する。ＮＤＶに関しては、膜融合プロセスはｐＨ非依存的に宿主原形質膜で起こることが確認されている。融合タンパク質Ｆの活性化は、ウイルスの糖タンパク質と、ガングリオシドおよびＮ−糖タンパク質などのシアル酸を含む細胞受容体との相互作用によって起こる。さらに、最近、ＮＤＶは、もう１つの経路としてカベオラ依存性エンドサイトーシス経路によっても細胞に感染することがあることが示された。融合が低ｐＨで起こる場合には、一定のパーセンテージのビリオンがエンドソームにエンドサイトーシスされるようになる。規則正しいアセンブリと感染性ＮＤＶ粒子の放出は、膜脂質ラフトに依存していることが示されている。これらは細胞の原形質膜の外葉にあるコレステロールおよびスフィンゴ脂質が豊富な微小ドメインとして定義される。新たに産生されたビリオンは、合成後の早期に脂質ラフトにおけるＨＮ、ＦおよびＮＰウイルスタンパク質の蓄積を示し、脂質ラフト会合タンパク質であるカベオリン−１、フロチリン−２およびアクチンを含むが、非脂質ラフト会合形質転換受容体は含まなかった。
【００１５】
種々のＮＤＶ株が、ヒト細胞に対して溶解性または非溶解性であることが見出されている。溶解性株は一般に、ヒト細胞内の後代ウイルスの外被で活性化血球凝集素−ノイラミダーゼと融合タンパク質分子を産生するが、非溶解性株は一般に、これらの分子の不活性型を産生する。特定の理論に縛られるものではないが、ＮＤＶのヒト細胞への侵入は、ヒト細胞表面上のシアル酸含有分子と結合するウイルス表面上の活性化血球凝集素−ノイラミダーゼおよび融合タンパク質分子に依存している可能性がある。
【００１６】
ＮＤＶの溶解性株と非溶解性株はまた、感染細胞を期滅させる機構が異なる。溶解性株では、外被に活性化血球凝集素−ノイラミダーゼおよび融合タンパク質分子を含む後代ウイルスの出芽が一般にＮＤＶ感染細胞の原形質膜を隣接する細胞の原形質膜と融合させ、大きな、生存不能の融合細胞（合胞体）の形成をもたらす。非溶解性株は、ウイルスが正常な宿主細胞代謝を見出すことによって、もっと緩慢に感染細胞を死に至らせる。非溶解性株によって生産された後代ウイルス粒子は、不活性型のＦ分子を含む。
【００１７】
ＮＤＶは、細胞死の内因性および外因性双方のカスパーゼ依存経路によって腫瘍溶解を発揮する。腫瘍溶解性ＮＤＶ株は、外胚葉、内胚葉および中胚葉起源のヒト腫瘍細胞系統に対して細胞傷害性を示す。このような細胞傷害性は主として、複数のカスパーゼ依存性アポトーシス経路によるものである。ＮＤＶは、ミトコンドリア系／内因性アポトーシス経路を活性化することによってアポトーシスを誘発する。ＮＤＶ感染は、ミトコンドリア膜電位の低下とミトコンドリアタンパク質シトクロムＣの放出をもたらす。さらに、ＮＤＶ感染は、カスパーゼ９およびカスパーゼ３の初期活性化をもたらす。これに対して、主として細胞死受容体経路によって活性化されるカスパーゼ８の切断は、腫瘍細胞のＮＤＶ媒介性アポトーシスにおける、ＴＲＡＩＬにより誘導される後期事象である。腫瘍細胞においてＮＤＶによって生成された細胞死シグナルは最終的にミトコンドリアに収束する。
【００１８】
どちらのタイプのＮＤＶ株も一般に、ヒト癌細胞では、ほとんどのヒト細胞におけるよりも遙かに容易に複製する。あるＮＤＶ株はヒト新生物形質転換細胞で、ほとんどのヒト細胞におけるよりも、最大１０，０００倍良好に増幅することができた。例えば、非腫瘍形成性ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では、ＮＤＶの複製はポジティブ鎖ＲＮＡが産生された後に停止するが、ＰＢＭＣ腫瘍細胞は、感染後１０〜５０時間以内は、複製周期を継続し、ウイルスゲノムをコピーする。
【００１９】
ＮＤＶ株の例としては、７３−Ｔ、ＭＴＨ−６８、ＵｌｓｔｅｒおよびＮＤＶ−ＨＵＪが挙げられる。Sinkovics, et al, J. Clin. Virol. 16:1-15 (2000); Freeman, et al., Molec. Therapy 13:221 (2006);米国特許第７，２２３，３８９号; ＷＯ２００５／０５１３３０; ＷＯ２００５／０５１４３３; Csatary, et al., Anticancer Res. 19:635-638 (1999); Csatary, et al., J. Am. Med. Assoc. 281:1588-1589 (1999); Csatary, et al., J. Neurooncol. 67:83-93 (2004)。
【００２０】
他の腫瘍溶解性ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、レオウイルス、Ｅ１Ｂ欠失アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびポックスウイルスが挙げられる。これらの腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を破壊するだけでなく、破壊された腫瘍細胞から抗原を放出し、それにより免疫応答を誘発する可能性を持つ。
【００２１】
上述のように、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【００２２】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である。
【００２３】
一つの実施態様において、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる。ＣＴＬＡ−４遮断薬、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなるものを含め、以下および引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第７，２２９，６２８号にさらに詳しく記載される。
【００２４】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、顆粒球(granulocyes)および単球（プロト−マクロファージ）を産生し、樹状細胞の発達を促すように幹細胞を刺激する。ＧＭ−ＣＳＦは任意の供給源から、好都合には、ＧＭ−ＣＳＦをコードするコード領域で形質転換された組換え微生物で発現させ、そこから単離することによって誘導することができる。一つの実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦは、その免疫刺激薬が投与される哺乳類の天然ＧＭ−ＣＳＦと少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％同一）である。
【００２５】
一つの実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦは、上述した腫瘍溶解性ウイルスの組換え株に由来する。一つの実施態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルス内のＧＭ−ＣＳＦをコードするコード領域は、構成プロモーターまたはin vivoにおいて腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に注射した後に優勢となる条件によって誘導されるプロモーターの制御下に置かれる。特定の理論に縛られるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルスは、樹状細胞作用の増強をもたらし得る（以下に述べる）。その後、組換え腫瘍溶解性ウイルス内のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが樹状細胞を活性化して、次に、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【００２６】
特定の理論に縛られるものではないが、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ＣＴＬＡ−４を介して媒介される阻害シグナルからＴ細胞を解放するものと予想される。ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナルは、細胞周期の進行およびＩＬ−２発現を明らかに阻害する。これにより、抗原および共刺激ＣＤ２８のシグナル伝達に対するＴ細胞応答が、ＣＴＬＡ−４遮断薬の存在下でアップレギュレーションされる。ＣＴＬＡ−４遮断薬は無刺激Ｔ細胞の増殖全般を促進するのではない。
【００２７】
in vivoにおいてＴ細胞により媒介される応答は、細胞溶解性Ｔ細胞の生成および大部分の抗体応答、特に免疫グロブリンイソ型のクラススイッチを含む応答を含む。抗原刺激は感染細胞におけるウイルス抗原の存在；非天然状態の、もしくはこのようなタンパク質をコードする遺伝子の体細胞突然変異の過程で生じたタンパク質もしくはタンパク質の組合せを発現する腫瘍細胞；寄生体もしくは細菌の感染；または感作、例えば、腫瘍抗原の予防接種などであり得る。in vitroにおいて、当該法は、抗原に対する培養Ｔ細胞の応答を増強するために使用することもできる。このような活性化Ｔ細胞は、養子免疫療法、活性化機構の研究、薬物スクリーニングなどに使用が見出せる。
【００２８】
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ＣＴＬＡ−４タンパク質の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、その対抗受容体、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６などへの結合を遮断する分子である。通常、遮断薬の結合親和性は少なくとも約１００μＭである。遮断薬は、ＣＤ２８などのＣＴＬＡ−４の近縁分子やこの免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーとは実質的に反応しない。従って、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような分子は遮断薬としては排除される。さらに、遮断薬はＣＴＬＡ−４シグナル伝達を活性化しない。好都合には、これは一価または二価結合分子を用いることによって達成される。当業者には、異分子間の交差反応性および競合に関する以下の考察が、同種の起源を有する分子に関して言及することを意図するものであることが理解されるであろう（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４はヒトＣＤ８０および８６と結合するなど）。
【００２９】
候補遮断薬は、この基準を満たすそれらの能力に関してスクリーニングすればよく、このスクリーニングは当業者には慣例の実験の範囲である。例えば、結合の親和性および特異性を判定するアッセイは、競合および非競合アッセイを含め、当技術分野で公知である。着目されるアッセイとして、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリーなどが挙げられる。結合アッセイは精製されたまたは半精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質を用いてもよいし、あるいはＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞、例えば、ＣＴＬＡ−４の発現構築物でトランスフェクトされた細胞；ＣＤ３とＣＤ２８の架橋を介して刺激されたＴ細胞；照射した同種異系細胞の添加などを用いてもよい。結合アッセイの一例として、精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質を不溶性支持体、例えば、マイクロタイタープレート、磁性ビーズなどに結合させる。候補遮断薬および可溶性の標識ＣＤ８０またはＣＤ８６を細胞に加えた後、非結合成分を洗い流せばよい。ＣＴＬＡ−４との結合をめぐってＣＤ８０およびＣＤ８６と競合する遮断薬の能力は、結合した標識ＣＤ８０またはＣＤ８６を定量することによって測定される。遮断薬がＣＤ２８と交差反応しないという確認は、ＣＴＬＡ−４をＣＤ２８に置き換えて同様のアッセイを行えばよい。好適な分子としては、ＣＴＬＡ−４に対するよりも、少なくとも約１０３低い結合、より通常には少なくとも約１０４低い結合をＣＤ２８に対して示す。
【００３０】
一般に、可溶性一価または二価結合分子は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達を活性化しない。確認には、Ｔ細胞の活性化を検出する機能アッセイを使用することができる。例えば、あるＴ細胞集団を、候補遮断薬の存在下または不在下、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する同種異系細胞に照射を行ったもので刺激すればよい。ＣＴＬＡ−４シグナル伝達を遮断する薬剤は、増殖および細胞周期の進行、ＩＬ−２の放出、ＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションなどによって測定される、Ｔ細胞活性化の増大を生じる。当業者には、細胞表面での発現、リポソーム内へのパッケージング、粒子またはウェルへの接着などが分子の有効原子価を増すことが理解されるであろう。
【００３１】
遮断薬には、ペプチド、小有機分子、ペプチドミメティクス、可溶性Ｔ細胞受容体または抗体などが含まれる。抗体は好ましい遮断薬である。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく；完全なものでも末端切断型、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖでもよく；異種、同種異系、同系またはそれらの改変型、例えば、ヒト化型、キメラ型などであり得る。
【００３２】
多くの場合、遮断薬はオリゴペプチド、例えば、抗体またはそのフラグメントなどであるが、相対的に高い特異性および親和性を提供する他の分子も使用可能である。コンビナトリアルライブラリーは、必要な結合特性を有するオリゴペプチド以外の化合物を提供する。一般に、この親和性は少なくとも約１０−６、より通常には約１０−８Ｍ、すなわち、特異的モノクローナル抗体の場合に通常見られる結合親和性である。
【００３３】
遮断薬には、いくつかのスクリーニングアッセイを利用できる。このようなアッセイの成分は一般に、ＣＴＬＡ−４タンパク質と、場合によりＣＴＬＡ−４活性化剤、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６などを含む。一般に、異なる薬剤濃度を用いて複数のアッセイ混合物を並行して実施し、種々の濃度に対する示差的反応を得ることができる。一般に、これらの濃度の１つを陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出に満たないレベルとする。
【００３４】
好都合には、これらのアッセイにおいて、１以上の分子を標識と結合させるが、この場合、この標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する。様々な標識として、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁性粒子などが挙げられる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのペアが含まれる。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーを通常、既知の手順に従って、検出のために提供する分子で標識する。
【００３５】
注目される１つのスクリーニングアッセイとして、その対抗受容体によりＣＴＬＡ−４の活性化を妨げる薬剤に向けたものがある。活性化の定量は、当技術分野で公知のいくつかの方法によって行うことができる。例えば、Ｔ細胞活性化の阻害は、細胞増殖、サイトカインの放出を定量することなどによって測定することができる。
【００３６】
注目される他のアッセイとして、ＣＴＬＡ−４とその対抗受容体との結合を遮断する薬剤に向けたものがある。アッセイ混合物は、天然対抗受容体の少なくとも一部、または特異的結合を提供するのに十分な配列類似性を有するオリゴペプチド、および候補医薬を含んでなる。オリゴペプチドは、アッセイ条件および要件に見合った任意の長さであってよく、通常には少なくとも約８ａａの長さ、最大には全長タンパク質またはその融合物であり得る。ＣＴＬＡ−４は不溶性支持体に結合させてもよい。この支持体は、例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、レジン粒子など、多様な材料で製造され、多様な形状であってよい。支持体は、バックグラウンドを最小にし、かつ、シグナル／ノイズ比を最大にするように選択される。結合は当技術分野で公知の様々な方法によって定量することができる。結合を平衡に到達させるに十分なインキュベーション期間の後、不溶性支持体を洗浄し、残留する標識を定量する。結合を妨げる薬剤は検出される標識を少なくする。
【００３７】
候補薬剤は多くの化学種を包含するが、一般には、有機分子、好ましくは、５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでなり、一般に、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能性化学基を含む。候補薬剤は多くの場合、１以上の上記官能基で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでなる。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せをはじめとする生体分子にも見られる。
【００３８】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得ることもできる。例えば、多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成には、ランダムオリゴヌクレオチドの発現をはじめとする多くの手段が利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーが利用可能であるか、または容易に作製される。さらに、天然または合成により製造したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。既知の医薬剤に、構造類似体を作出するために、アシル化、アルキル化、エステル化、またはアミジフィケーション(amidification)などの定方向またはランダムな化学修飾を施してもよい。
【００３９】
様々な他の試薬もこのスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などのような、最適なタンパク質−ＤＮＡ結合を助け、かつ／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用することができる試薬が含まれる。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌薬などのような、別の方法でアッセイ効率を改善する試薬も使用可能である。
【００４０】
遮断薬として用いるのに好適な抗体は、宿主動物を、ＣＴＬＡ−４タンパク質の全部または一部を含んでなるペプチドで免疫化することによって得ることができる。好適な宿主動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが挙げられる。タンパク質免疫原の起源はマウス、ヒト、ラット、サルなどであり得る。宿主動物は一般に免疫原とは異なる種であり、例えば、ハムスターを免疫化するにはマウスＣＴＬＡ−４を用い、マウスを免疫化するにはヒトＣＴＬＡ−４を用いる。ヒトＣＴＬＡ−４とマウスＣＴＬＡ−４は、その細胞外ドメインに保存性の高いストレッチを含む(Harper et al. (1991) J. Immunol. 147: 1037-1044)。このように保存性の高い領域に由来するペプチドは、交差特異的抗体を作製するための免疫原として使用することができる。
【００４１】
免疫原は、完全なタンパク質、またはそのフラグメントおよび誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン（例えば、アミノ酸残基３８〜１６１）の全部または一部を含んでなり、この場合、これらの残基は、天然ＣＴＬＡ−４に見られるグリコシル化などの翻訳後調節を含む。細胞外ドメインを含んでなる免疫原は、例えば、従来の組換え法を用いたクローニング遺伝子の発現、高レベルのＣＴＬＡ−４を発現する選別細胞集団であるＴ細胞からの単離などの、当技術分野で公知の様々な方法で作製することができる。
【００４２】
組換えまたは改変タンパク質の発現が望まれる場合には、ＣＴＬＡ−４の所望の部分をコードするベクターを使用する。一般に、発現ベクターは、ＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインがトランスフェクト細胞の表面にあるように、あるいは、細胞外ドメインが細胞から分泌されるように設計される。細胞外ドメインを分泌させる場合には、細胞外ドメインのコード配列を、シグナルペプチドを含む、分泌を可能とする配列とインフレームで融合する。シグナルペプチドは外因性のものでも天然のものでもよい。免疫目的の融合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインと免疫グロブリンの定常領域を連結したものである。例えば、マウスＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとヒトＣｇＩ（例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインのヒンジ領域を連結したものを含んでなる融合タンパク質を、ハムスターの免疫に使用することができる。
【００４３】
ＣＴＬＡ−４を細胞表面で発現させる場合には、細胞外ドメインのコード配列を、その細胞外ドメインを膜およびシグナル配列に係留するペプチドをコードする配列とインフレームで融合させる。このような係留配列としては、天然ＣＴＬＡ−４トランスメンブランドメイン、または他の細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇなどのトランスメンブランドメインが含まれる。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子でトランスフェクトされたマウス細胞を用いてマウスを免疫化し、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的な抗体を作製することができる。
【００４４】
モノクローナル抗体は従来の技術によって作製することができる。一般に、免疫化した宿主動物の脾臓および／またはリンパ節が形質細胞源となる。これらの形質細胞は、骨髄腫細胞と融合させることにより不死化してハイブリドーマ細胞を作製することができる。個々のハイブリドーマからの培養上清を、所望の特異性を有する抗体を産生するものを同定するための標準技術を用いてスクリーニングする。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するのに好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどが挙げられる。マウスタンパク質に対する抗体を作製するには、この動物は一般にハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、例えば、不溶性の支持体であるプロテインＡセファロースなどに結合されたＣＴＬＡ−４を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの従来技術によって、ハイブリドーマ細胞上清または腹水から精製することができる。
【００４５】
抗体は、通常の多量体構造の代わりに一本鎖として作製することもできる。一本鎖抗体はJost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73およびその他に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、グリシンおよび／またはセリンを含む小型の中性アミノ酸の少なくとも約４個のアミノ酸をコードするスペーサーと連結することができる。この融合物によってコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能的可変領域のアセンブリを可能とする。
【００４６】
in vivo使用、特にヒトへの注射に関しては、遮断薬の抗原性を低減することが望ましい。遮断薬に対するレシピエントの免疫応答は、その療法が有効である期間を短くする可能性がある。抗体をヒト化する方法は当技術分野で公知である。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物であり得る（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１００７７およびＷＯ９０／０４０３６参照）。あるいは、目的の抗体を、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列に置き換えるべく組換えＤＮＡ技術によって操作することもできる（ＷＯ９２／０２１９０参照）。
【００４７】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ ｃＤＮＡの使用は当技術分野で公知である(Liu et al. (1987) P.N.A.S. 84:3439および(1987) J. Immunol. 139:3521)。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡを作製する。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。あるいは、ライブラリーを作製し、目的配列を単離するためにスクリーニングする。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト定常領域配列と融合させる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242に見出せる。ヒトＣ領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。イソ型の選択は、補体結合などの所望のエフェクター機能、または抗体依存性細胞傷害性における活性を指針とすることができる。好ましいイソ型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域κまたはλのいずれかを使用することができる。その後、キメラ、ヒト化抗体を従来法によって発現させる。
【００４８】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂなどの抗体フラグメントは、完全なタンパク質の切断、例えばプロテアーゼまたは化学的切断によって作製することができる。あるいは、末端切断型遺伝子を設計することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、末端切断型分子となるようにＨ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域、その後に翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００４９】
ＨおよびＬ Ｊ領域のコンセンサス配列を用い、Ｊ領域に、後にＶ領域セグメントをヒトＣ領域セグメントに結合させるのに有用な制限部位を導入するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを設計することができる。Ｃ領域のｃＤＮＡは、ヒト配列の類似の位置に制限部位を配置するための部位特異的突然変異誘発によって改変することができる。
【００５０】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが含まれる。好都合のベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入および発現可能なように操作された適当な制限部位を伴うものである。このようなベクターでは、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域のスプライス供与部位とヒトＣ領域の前のスプライス受容部位の間で、また、ヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域においても生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然染色体部位で起こる。得られたキメラ抗体をレトロウイルスＬＴＲ、例えば、ＳＶ−４０初期プロモーター(Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280)、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ(Gorman et al. (1982) P.N.A.S. 79:6777)およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ(Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885)；天然Ｉｇプロモーターなどをはじめとする任意の強力なプロモーターと連結することができる。
【００５１】
抗原に対する欠陥型の宿主Ｔ細胞応答に特徴的な状態としては、慢性感染、腫瘍、ペプチドワクチンによる免疫化などが含まれる。当該ＣＴＬＡ−４遮断薬をこのような宿主に投与すると、活性化Ｔ細胞の表現型を特異的に変化し、抗原により媒介された活性化に対する応答が増強される。
【００５２】
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、抗原刺激に対するＴ細胞の応答を増強するのに有効な用量で投与される。当該処置により、この活性化Ｔ細胞の応答は、休止Ｔ細胞よりも高い程度で影響を受け得る。Ｔ細胞応答の測定は、処置される条件によって異なる。Ｔ細胞活性の有用な尺度は、増殖、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａなどの放出；ＣＤ２５およびＣＤ６９などのマーカーの細胞発現；ならびに当技術分野で公知のＴ細胞活性の他の尺度であり得る。
【００５３】
市販のＣＴＬＡ−４遮断薬としては、イピリムマブ(Bristol-Myers Squibb, New York, NY)およびトレミリムマブ(tremilimumab)(Pfizer, New York, NY)が挙げられる。
【００５４】
一つの実施態様において、免疫刺激薬はインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）である。ＩＬ−２１は、Parrish-Novak, et al, Nature 408:57-63 (2000); Wang, et al., Cancer Res. 63:9016-9022 (2003);およびThompson, et al., J. Clin. Oncol. 26:2034-2039 (2008)により記載されている。これらの文献は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【００５５】
インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）は、先天免疫と適応免疫の双方に影響を及ぼすクラスＩサイトカインである。ＩＬ−２１の影響としては、腫瘍特異的ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、増殖の増大および生存の延長；Ｔ細胞依存性Ｂ細胞増殖および抗体産生の増強；ならびにナチュラルキラー細胞の最終分化および活性化が含まれる。ＩＬ−２とは違い、ＩＬ−２１は、ＣＤ４ Ｔ細胞を調節性Ｔ細胞抑制に対して耐性とし、調節性Ｔ細胞の増殖を促進せず、ＩＬ−２１はまた、メモリーＴ細胞の生成の促進をもたらし得る。ＩＬ−２１は、種々の前臨床癌モデルにおいて抗腫瘍効果を持つことが報告されている。
【００５６】
ある研究では、マウスにおいて確立した皮下腫瘍を、流体力学に基づく遺伝子送達技術を用い、ネズミＩＬ−２１をコードするプラスミドＤＮＡを全身投与することによって処置した。ＩＬ−２１プラスミドＤＮＡの投与の結果、in vivoにおいて高レベルの循環ＩＬ−２１が得られた。担癌マウスをＩＬ−２１プラスミドＤＮＡで処置したところ、対照プラスミドＤＮＡで処置したマウスに比べ、Ｂ１６黒色腫およびＭＣＡ２０５繊維肉腫の増殖を、有意な毒性なく、用量依存的に有意に阻害し、生存率も高めた。in vivoにおいてＣＤ４またはＣＤ８のいずれかのＴ細胞を枯渇させたが、ＩＬ−２１により媒介される抗腫瘍活性は影響を受けなかった。しかしながら、ＮＫ細胞を枯渇させると、ＩＬ−２１により誘導される腫瘍阻害は実質的に消失した。このことと一致して、ＩＬ−２１の抗腫瘍活性は、ＮＫ細胞の細胞溶解活性の増強によって媒介されるものと思われた。この研究により、ＩＬ−２１が有意な抗腫瘍活性を持ち、臨床において抗腫瘍薬としての治療可能性を持ち得ることが示唆された。
【００５７】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は抗ＣＤ４０である。ＣＤ４０は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞および樹状細胞で発現される。ＣＤ４０リガンドは、活性化Ｔ細胞で発現される。樹状細胞においてＣＤ４０が刺激されると、樹状細胞の活性化とＩＬ−１２の放出が誘発される。ＣＤ４０に対する刺激性抗体は、抗原特異的免疫応答を増強することができる。
【００５８】
免疫刺激薬の投与は、抗原提示細胞を刺激するサイトカイン、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）などの投与と組み合わせてもよい。Ｔ細胞の増殖および分泌を増強することが知られている、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、Ｂ７、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８などの付加的タンパク質および／またはサイトカインを免疫刺激薬と同時または逐次に用いて、免疫応答を増強することができる。免疫刺激薬の投与は、種々のサイトカインまたは細胞表面受容体をコードする遺伝子による腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球のトランスフェクションと組み合わせてもよい(Ogasawara et al. (1993) Cancer Res. 53:3561-8;およびTownsend et al. (1993) Science 259:368-370参照)。例えば、ＣＤ８０をコードするｃＤＮＡによる腫瘍細胞のトランスフェクションはトランスフェクトされた腫瘍細胞の排除をもたらし、その後の非トランスフェクト親腫瘍細胞による攻撃に対して免疫を誘導することができることが示されている(Townsend et al. (1994) Cancer Res. 54:6477-6483)。
【００５９】
腫瘍特異的宿主Ｔ細胞は、ex vivoにおいて、免疫刺激薬および腫瘍抗原または腫瘍細胞と組み合わせ、患者に再注入してもよい。宿主に投与すると、刺激された細胞は腫瘍死滅反応誘発し、その結果、腫瘍が退縮する。これらの宿主細胞は、リンパ節、例えば、鼠径リンパ節、腸間膜リンパ節、表在性遠位液窩リンパ節；骨髄；脾臓；または末梢血などの種々の供給源から、ならびに腫瘍、例えば、腫瘍浸潤リンパ球から単離することができる。細胞は同種異系のものであってよく、自己のものが好ましい。ex vivo刺激については、宿主細胞を無菌的に取り出し、当技術分野で公知の任意の好適な培地に懸濁させればよい。これらの細胞を、種々のプロトコールのいずれか、特に、Ｂ７、抗ＣＤ２８などの組合せにより、遮断薬と組み合わせて刺激することができる。刺激された細胞は、結合剤、増量剤、担体、保存剤、分解防止剤、乳化剤およびバッファーなどの添加剤を含む種々の医薬処方物として、例えば静脈注射、腹腔内注射などの注射によって宿主に再導入することができる。好適な希釈剤および賦形剤としては、水、生理食塩水、グルコースなどが挙げられる。
【００６０】
免疫刺激遮断薬の投与によって増殖が低下可能な腫瘍細胞としては、癌腫、例えば、乳房、卵巣、子宮内膜、頸部、結腸、肺、膵臓、食道、前立腺、小腸、直腸、子宮または胃に原発腫瘍部位を持ち得る腺癌；ならびに肺、口腔、舌、喉頭、食道、皮膚、膀胱、頸部、眼瞼、結膜、膣などに原発部位を持ち得る扁平上皮癌が含まれる。処置可能な他のクラスの腫瘍としては、肉腫、例えば、筋原性肉腫；神経腫；黒色腫；白血病、ある種のリンパ腫、栄養膜腫瘍および生殖細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍が含まれる。
【００６１】
特に注目される腫瘍としては、腫瘍特異的抗原を提示するものが含まれる。このような抗原は、異常な関係性で、または異常に高いレベルで提示され得るか、または突然変異型であり得る。この腫瘍抗原は、腫瘍細胞に対する宿主Ｔ細胞応答を増強するために当該遮断薬とともに投与することができる。このような抗原調製物は、精製タンパク質、または腫瘍細胞由来の溶解液を含んでなり得る。
【００６２】
腫瘍抗原の例としては、癌腫の抗原としてのサイトケラチン、特に、サイトケラチン８、１８および１９が挙げられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）；ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６およびＴ１６も既知の癌腫抗原である。デスミンおよび筋肉特異的アクチンは、筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリ性ホスファターゼ、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよびα−フェトタンパク質は、栄養膜腫瘍および生殖細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原としては、前立腺癌腫の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原がある。ＨＭＢ−４５は、黒色腫の抗原である。クロモグラニン(Chromagranin)−Ａおよびシナプトフィジンは、神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に注目されるものとしては、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する急速進行性腫瘍が挙げられる。このような壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源である。
【００６３】
免疫刺激薬の投与は、ある種のリンパ腫に対しては禁忌である場合がある。特に、Ｔ細胞リンパ腫は、活性化の増大からは利益を受けない場合がある。ＣＤ８０抗原は、ホジキン病のリード・シュテルンベルク(Reed-Sternberg)細胞によって強く発現され、ＣＤ２８発現Ｔ細胞によって取り囲まれている場合が多い(Delabie et al. (1993) Blood 82:2845-52)。このリード・シュテルンベルク細胞の補助的細胞機能はＴ細胞の活性化をもたらし、ホジキン症候群の一因となることが示唆されている。
【００６４】
化学療法および放射線療法などの多くの従来の癌療法が、リンパ球集団を著しく減らしてしまう。免疫刺激薬の投与はこの免疫抑制をある程度緩和することができるが、１つの併用治療コースとして、腫瘍抗原をさらに放出させるため、または免疫調節リンパ球集団を減らすために当該療法の前および／または後にこのようなリンパ球毒性療法を用いるものがある。
【００６５】
アジュバントは抗原に対する免疫応答を増強する。免疫刺激薬は、Ｔ細胞の活性化を増強し、抗体産生細胞のクラススイッチを増大させ、それにより、免疫原に応答して産生されるＩｇＧクラス抗体の濃度を高めるためにアジュバントとして用いられる。免疫刺激薬は、アジュバント使用に関する従来技術に従って、生理学上許容される媒体中で免疫原と合わせる。免疫原は単一の処方物として免疫刺激薬と合わせてもよいし、あるいは別に投与してもよい。免疫原としては、多糖、タンパク質、タンパク質フラグメント、ハプテンなどが含まれる。特に注目されるものとして、ペプチド免疫原の併用がある。ペプチド免疫原としては、上記のような腫瘍抗原およびウイルス抗原またはそれらのフラグメントが挙げられる。
【００６６】
免疫刺激薬は、モノクローナル抗体生産用の、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの実験動物の免疫化の際に使用することができる。免疫刺激薬を投与すると、抗原に対する応答レベルが高まり、クラススイッチを受ける形質細胞の割合が増える。
【００６７】
免疫刺激薬は、例えば不死化細胞系統、混合または精製細胞集団の初代培養物、非形質転換細胞などの任意のin vitro細胞培養系を含む、培養Ｔ細胞の活性化を増強するためにin vitroにおいて投与することができる。特に注目されるものとしては、細胞が患者または同種異系ドナーから取り出され、ex vivoで刺激され、患者に再注入され得る初代Ｔ細胞培養物である。
【００６８】
場合によっては、過剰なＴ細胞増殖のために治療期間を制限するのが望ましいこともある。これらの制限は、療法に対する患者の応答、患者のＴ細胞数などに応じて経験的に決定することができる。Ｔ細胞数は、Ｔ細胞特異的抗体による染色およびフローサイトメトリーを含む当技術分野で公知の方法によって患者においてモニタリングすることができる。
【００６９】
また、免疫刺激の機能的効果は、当該発明を用いた場合に見られる細胞内シグナル伝達における変換を模倣する他の薬剤の投与によって誘導することもできる。例えば、特定の細胞質キナーゼが細胞外受容体の結合に応答して活性化され得ることが知られている。キナーゼ活性を遮断する薬剤は、受容体結合の遮断と類似の生理学的効果を持つであろう。同様に、環状ＡＭＰ、ＧＴＰ濃度および細胞内カルシウムレベルを高める薬剤は、細胞外受容体結合の場合に見られるものと類似の生理学的効果をもたらし得る。
【００７０】
腫瘍を有するいずれの哺乳類にも、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を施すことができる。哺乳類は、ヒトまたはヒトにとって経済的または美的有用性を有する哺乳類、例えば、農用動物、補助動物またはペットであり得る。一つの実施態様において、哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットからなる群から選択される。
【００７１】
一つの実施態様において、腫瘍は、脳、肺、皮膚、口腔、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、腎臓、乳房、卵巣、前立腺、精巣、膵臓、膀胱およびリンパ節からなる群から選択される器官におけるものである。
【００７２】
腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬は哺乳類に、同じ経路によって投与してもよいし、または異なる経路によって投与してもよい。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスを、例えば腫瘍内注射によって腫瘍に投与し、免疫刺激薬を、例えば血管内、皮下、腹腔内などで全身投与する。
【００７３】
腫瘍溶解性ウイルスの別の投与経路としては、静脈注射、筋肉注射、吸入（肺の腫瘍に特に好適であり得る）、または直腸（大腸または結腸の腫瘍に特に好適であり得る）経路が含まれる。
【００７４】
腫瘍溶解性ウイルスの用量レベルは、医師または獣医師によって慣例的に選択することができる。望ましくは、腫瘍溶解性ウイルスの用量は、所望の治療応答が迅速に起こるに十分多く、患者に対して有害とならないよう十分少ないものである（ここで、「患者に対して有害」とは、重度の悪心および毛髪の喪失などの、薬物または放射線に基づく抗癌療法の典型的な症状、ならびに重度の呼吸器系疾患、重度の消化管障害、神経系の損傷などの鳥類のＮＤＶ感染の典型的症状、および呼吸困難、下痢、脱水、一時的血小板減少症および広汎性血管漏出などのヒトに対する過量のＮＤＶの症状を含む。軽度の発熱、結膜炎、その他の一時的な風邪のような症状は「患者に対して有害」ではない）。例えば、ＮＤＶ株ＰＶ−７０１は、進行固形癌を有する患者において、ｉ．ｖ．経路による場合には少なくとも３×１０９感染性粒子、そして腫瘍内経路による場合には少なくとも４×１０１２の用量で、十分な耐用性がある。患者がより低い初期用量で脱感作された場合、最大耐用量（ＭＴＤ）は約１０倍増加した。
【００７５】
一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、約２〜４ヶ月間、週に１回腫瘍内注射によって投与した後、約２〜４か月おきに腫瘍内注射１回の維持レジメンを行う。
【００７６】
免疫刺激薬の用量は、疾病の性質、投与頻度、投与様式、投与目的、宿主からの薬剤の排泄などによって、幅広く変更可能である。投与量は、特定の薬剤の薬力学的特徴、投与の様式および経路、レシピエントの齢、健康状態および体重、症状の性質および程度、併用治療、治療頻度、ならびに望まれる高価などの既知の因子によって異なる。この用量は、毎週もしくは隔週といった低頻度で投与してもよいし、または有効用量レベルを維持するために、少用量に分割して毎日、週２回などの投与を行ってもよい。一般に、有効成分の１日量は約０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇとすることができる。内服投与に好適な投与形は一般に、１単位当たり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇの有効成分を含有する。有効成分は、免疫刺激薬の総重量に対して０．５〜９５重量％まで可変である。
【００７７】
一般に、免疫刺激薬は、本発明の方法に従って投与した場合、腫瘍溶解性ウイルスを伴わずに投与した場合の免疫刺激薬で一般に見られるものよりも低用量で有効であり得る。
【００７８】
一つの実施態様において、免疫刺激薬は、約２〜４か月間、約２〜４週おきに１回、約１０ｍｇ／体重ｋｇの用量で静脈注射によって投与し、その後、約２〜４か月おきに１回、約１０ｍｇ／体重ｋｇ用量の静脈注射で維持レジメンを行う。
【００７９】
当該免疫刺激薬は、例えば、生理食塩水、植物油、鉱油、ＰＢＳなどの薬学上許容される媒体中の有効用量で処方物として調製することができる。治療製剤は、生理学上許容される液体、ゲルまたは固体担体、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を含み得る。添加剤は、殺菌剤、例えばＮａＣｌ、マンニトールなどの等張性を維持する添加剤；および例えばバッファーおよび保存剤などの化学的安定性を維持するための添加剤などを含み得る。免疫刺激薬はカクテルとして投与してもよいし、または単一の薬剤として投与してもよい。非経口投与に関しては、免疫刺激薬は、薬学上許容される非経口ビヒクルと組み合わせた溶液、懸濁液、エマルションまたは凍結乾燥粉末として処方することができる。リポソーム、または硬化油などの非水性ビヒクルも使用可能である。処方物は当技術分野で公知の技術によって滅菌することができる。
【００８０】
腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激薬が投与される前のある時点で、哺乳類に投与することができる。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激薬が投与される１日〜５日前に投与される。特定の理論に縛られるものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、２つの役割を果たし得る。第一に、腫瘍溶解性ウイルスはいくつかの腫瘍細胞を直接死滅させることができる。第二に、腫瘍溶解性ウイルスは、それが死滅させる腫瘍細胞の溶解を導くことによって免疫系を刺激することができ、その後、溶解によって放出された腫瘍細胞抗原は樹状細胞によって捕捉され、Ｔ細胞を刺激し、それにより、その哺乳類の免疫系による他の腫瘍細胞の死滅を促進する。免疫刺激薬は、後者のプロセスを促進することができる。例えば、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、Ｔ細胞をダウンレギュレーションするＣＴＬＡ−４の活性を低減させ得る。ウイルスはまた、免疫細胞においてｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を誘発することにより、先天免疫を直接活性化させることができる。
【００８１】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を投与することに加え、種々の実施態様では、この方法は付加的工程をさらに含んでなってよい。
【００８２】
一つの実施態様において、この方法は、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を除く他の抗癌薬を哺乳類に投与することをさらに含んでなる。いずれの既知の抗癌薬も、抗癌療法の熟練者に知られた経路、用量および治療レジメンで投与することができる。
【００８３】
さらなる一つの実施態様において、前記抗癌薬は、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン(mitozantrone)、オキサリプラチン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、タキソテール、テモゾロミド(tamozolomide)、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、ＵＦＴ（ウラシル−テガフール(tegufur)）、ビンブラスチン、ビンデシン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８４】
別のさらなる実施態様では、抗癌薬は、アレムツズマブ、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン(campothecin)、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣｅａＶａｃ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクリズマブ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エドレコロマブ、エピルビシン、エピラツズマブ、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、ゲニステイン、ゴセレリン、ｈｕＪ５９１、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、ＩＧＮ−１０１、イマチニブ、インターフェロン、インターロイキン−２、イリノテカン、イロノテカン(ironotecan)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、リンツズマブ、ロムスチン、ＭＤＸ−２１０、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ミツモマブ、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、ペルツズマブ、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフィニブ(sorafinib)、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、チボシニブ(tivosinib)、バタラニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８５】
さらに別のさらなる実施態様では、抗癌薬は、ＭＤＸ−０１０；ＭＡｂ、ＡＭＥ；ＡＢＸ−ＥＧＦ；ＥＭＤ７２０００；アポリズマブ；ラベツズマブ；ｉｏｒ−ｔｌ；ＭＤＸ−２２０；ＭＲＡ；Ｈ−１１ ｓｃＦｖ；オレゴボマブ；ｈｕＪ５９１ ＭＡｂ、ＢＺＬ；ビジリズマブ；ＴｒｉＧｅｍ；ＴｒｉＡｂ；Ｒ３；ＭＴ−２０１；Ｇ−２５０、非複合体；ＡＣＡ−１２５；Ｏｎｙｖａｘ−１０５；ＣＤＰ−８６０；ＢｒｅｖａＲｅｘ ＭＡｂ；ＡＲ５４；ＩＭＣ−１Ｃ１１；ＧｌｉｏＭＡｂ−Ｈ；ＩＮＧ−１；抗ＬＣＧ ＭＡｂ；ＭＴ−１０３；ＫＳＢ−３０３；Ｔｈｅｒｅｘ；ＫＷ−２８７１；抗ＨＭＩ．２４；抗ＰＴＨｒＰ；２Ｃ４抗体；ＳＧＮ−３０；ＴＲＡＩＬ−ＲＩ ＭＡｂ、ＣＡＴ；前立腺癌抗体；Ｈ２２ｘＫｉ−４；ＡＢＸ−ＭＡ１；イムテラン(Imuteran)；モノファーム(Monopharm)−Ｃ；ＡＶ−２９９；およびそれらの２種類以上からなる群から選択される。
【００８６】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外のこれら抗癌薬は、それらの作用機序によって例えば以下の群に分類することができる：ピリミジン類似体（例えば、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗薬および関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの抗代謝産物／抗癌薬；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン）などの天然物、微小管崩壊剤［タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンなど］、エピジポドフィロトキシン(epidipodophyllotoxin)（テニポシド）、ＤＮＡ傷害薬（例えば、アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレアミン(merchlorethamine)、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））を含む抗増殖／抗有糸分裂薬；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（例えば、Ｌ−アスパラギンを全身代謝し、それら独自のアスパラギンを合成する能力を持たない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板薬；ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン、およびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン(trazenes - dacarbazinine)（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）；プラチナ錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミドなどの抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬；ホルモン、ホルモン類似体（例えば、エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（例えば、ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；繊維素溶解薬（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ＣＯＸ−２阻害剤、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走薬；分泌抑制薬（例えば、ブレベルジン）；免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管形成化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（例えば、トラスツズマブおよび上記に挙げられている他のもの）；細胞周期阻害剤および分化誘導物質（例えば、トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド(eniposide)、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（例えば、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン(methylpednisolone)、プレドニゾンおよびプレドニソロン(prenisolone)）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘発薬およびカスパーゼアクチベーター；クロマチン崩壊薬。
【００８７】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外の抗癌薬の用量を減らしたり、治療レジメンを短縮または弱化したりしても、本方法の一部として行う場合には、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬以外の抗癌薬をそれ自体で投与する場合よりも有効であり得ることが当業者には分かるであろう。特定の実施態様において、抗癌薬または薬剤組合せの有効用量（ＥＤ５０）は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬と併用する場合には、抗癌薬単独のＥＤ５０の少なくとも２分の１、いっそうより好ましくは５分の１、１０分の１、さらには２５分の１である。逆に、このような抗癌薬または薬剤組合せの治療係数（ＴＩ）は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬と併用する場合には、従来の化学療法レジメン単独のＴＩの少なくとも２倍、いっそうより好ましくは５倍、１０倍、さらには２５倍であり得る。
【００８８】
一つの実施態様において、本方法は、哺乳類に放射線療法を施すことをさらに含んでなる。いずれの既知の放射線源を、癌に対する放射線療法の熟練者に知られている技術、線量および治療レジメンで施してもよい。放射線療法の線量を減らしたり、治療レジメンを短縮または弱化したりしても、本方法の一部として行う場合には、放射線療法をそれ自体で施す場合よりも有効であり得ることが当業者には分かるであろう。
【００８９】
本方法の実施からもたらされる治療の進行は、限定されるものではないが、とりわけ、非侵襲的画像法、生検および腫瘍活性（一般に腫瘍質量に相関）の血中マーカーの分析を含む当業者に公知の技術によって慣例的にモニタリングすることができる。
【００９０】
別の実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を、腫瘍を有する哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなるキットに関する。腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬は上記の通りであり得る。
【００９１】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法に関する。この方法は、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与することを含んでなる。
【００９２】
一般的な癌の進行は、原発腫瘍が哺乳類の身体の特定の組織、器官、または器官系に発生することである。その後、原発腫瘍の１以上の細胞が哺乳類の血液またはリンパを通じて移動することにより、原発腫瘍の１以上の転移が哺乳類身体の他の特定の組織、器官または器官系に生じ得る。
【００９３】
多くの場合、転移癌を治療することは原発腫瘍の場合よりも難しい。転移癌は、種々の治療選択に従いにくい１以上の場所、および／または種々の治療選択が比較的効果的でないような多数の部位で生じ得る。さらに、転移癌は、原発腫瘍が比較的進行し、患者の予後がすでに比較的悪い場合に生じる。
【００９４】
予期しないことに、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍（原発腫瘍または転移腫瘍であり得る）に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与することだけまたは免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することだけを行う場合に見られるものよりも、第二の腫瘍の大きさをより縮小できることを見出した。
【００９５】
本明細書において「腫瘍」とは、特に、この語を含む句または文章が、その語が固形新生物を表すことが当業者に示唆される下りを除き、固形新生物に見られるものに限らず、任意の新生細胞に対して用いられる。
【００９６】
腫瘍溶解性ウイルスは上記の通りであり得る。一つの実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される。
【００９７】
免疫刺激薬は上記の通りであり得る。一つの実施態様において、免疫刺激薬は、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される。
【００９８】
一つの実施態様において、この方法は、第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すことをさらに含んでなる。局部的抗癌療法は放射線療法であり得るが、代わりに、または加えて、標的化学療法を含む標的療法などの他の局部的抗癌療法を使用することもできる。予期しないことに、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与すること、および局部的抗癌療法を第一の腫瘍に施すことによって、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与することだけ、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することだけ、または局部的抗癌療法を第一の腫瘍に投与することだけを行う場合に見られるものよりも、第二の腫瘍の大きさをより縮小できることを見出した。
【００９９】
腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍の大きさを縮小することができる。また、腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、免疫刺激薬を哺乳類に全身投与すること、および局部的抗癌療法を第一の腫瘍に施すことによって、第一の腫瘍の大きさを縮小することができる。
【０１００】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびに腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方を治療することに関する説明書を含んでなるキットに関する。
【０１０１】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤としての腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬に関する。さらなる実施態様において、本発明は、薬剤としての腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌療法に関する。
【０１０２】
一つの実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方の治療を目的とした薬剤の製造のための腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬の使用に関する。さらなる実施態様において、本発明は、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方の治療を目的とした薬剤の製造のための腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌薬の使用に関する。
【０１０３】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を含んでなるキットに関する。さらなる実施態様において、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬および抗癌療法を含んでなるキットに関する。指定された成分は、目的指向適用（本明細書に示される通り）機能的単位を形成する（本明細書で示される理由で）。
【０１０４】
以下、実施例を示し、本発明の特定の実施態様を説明する。当業者には、以下の実施例に開示されている技術が本発明の実施において十分機能することが発明者らによって見出された技術を表すことが理解されるはずである。しかしながら、当業者には、本開示に照らして、開示されている特定の実施態様に多くの変更を行っても、なお、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様の、または類似体時の結果が得られることが理解されるはずである。
【実施例】
【０１０５】
８〜１０週齢の雄Ｃ５７Ｂ１６Ｊマウスを用いた。これらのマウスの平均体重は２０〜２２ｇであった。マウスを、１群各５または６匹ずつの６つの試験群に分けた。実験群は次の通りであった。
第１群 Ｍｏｃｋ処置（腫瘍内および腹腔内ＰＢＳ、切断）
第２群 Ｘ線処置
第３群 ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）処置
第４群 ＮＤＶ処置およびＸ線処置
第５群 ＣＴＬＡ４処置
第６群 ＮＤＶ処置、抗ＣＴＬＡ−４処置およびＸ線処置
【０１０６】
以下の手順を行った。
０日目に、２０μｌ容量のＰＢＳ中、３００，０００個の腫瘍細胞（ＭＣＡ２０５、Ｂ１６ｏｖａ）（第１群〜６群）を右足蹠に移植した。
６日後、１００μｌ容量のＰＢＳ中、２００，０００個の腫瘍細胞（ＭＣＡ２０５、Ｂｌ６ｏｖａ）（第１群〜６群）を左側腹（すなわち、反対側）に移植した。
１２日目に、足蹠腫瘍が明らかに視認できた。第２群、４群および６群の足蹠腫瘍に、０．５２８Ｇｙ／分の線量率で４ＧｙのＸ線を照射した。腫瘍照射中、マウス身体の残りの部分は鉛で遮蔽した。
Ｘ線処置後すぐに、第３、４群および６群では、足蹠腫瘍に１０μｌのＰＢＳ中０．６×１０７個のＮＤＶ ＭＴＨ６８Ｈ株ウイルス粒子を注射した。第１群には、１０μｌのＰＢＳのｍｏｃｋ注射を施した。実験期間の間、ＮＤＶ処置は、月〜金曜の毎日１回、週に５回行った。第２週目の処置以降、２０μｌのＮＤＶ溶液（１．２×１０８個のウイルス粒子）を注射した。
第５群および６群には、１回目のＸ線処置の１時間後、抗ＣＴＬＡ−４を腹膜内に投与した（１００μｇ／マウス、およそ１００μｌ ＰＢＳ中）。第１群には、１００μｌ ＰＢＳのｍｏｃｋ注射を施した。処置は３日おきに５回繰り返した。
第１群〜６群について、足蹠腫瘍と反対側腫瘍の双方の腫瘍増殖を平均腫瘍体積から定量した。
【０１０７】
図１は、足蹠腫瘍の増殖を示す。照射とＮＤＶと抗ＣＴＬＡ−４の組合せを施した第６群は、３２日目において、第２群（照射だけを施与）および第４群（照射とＮＤＶを施与）の双方を含む他のどの群よりも腫瘍体積が小さかった。
【０１０８】
図２は、第１群〜６群について、反対側の側腹腫瘍の増殖を示す。上記から明らかであることが示されるように、側腹腫瘍は照射、ウイルス注射または抗ＣＴＬＡ−４によって直接処置されなかった。照射とＮＤＶと抗ＣＴＬＡ−４の組合せを施した第６群は、１９〜２８日目において、第２群（照射だけを施与）および第４群（照射とＮＤＶを施与）の双方を含む他のどの群よりも腫瘍体積が小さかった。
【０１０９】
本明細書に開示され、特許請求される組成物および方法は総て、本開示に照らし、過度な実験を行わなくとも実施および達成可能である。本発明の組成物および方法は特定の実施態様において記載されているが、変形形態が、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に記載されている組成物および方法、方法の工程または一連の工程に適用可能であることは当業者には自明である。より具体的には、本明細書に記載されている薬剤を、化学的に関連するある特定の薬剤に置き換えても同じまたは類似の結果を達成できるのは明らかである。このような当業者に自明の類似の置換および改変は総て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法であって、
腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること；および
免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すこと
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
局部的抗癌療法が放射線療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項７】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
免疫刺激薬が、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ−４遮断薬が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
パラミクソウイルスが、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＤＶが、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類が、脳、肺、皮膚、口腔、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、腎臓、乳房、卵巣、前立腺、精巣、膵臓、膀胱およびリンパ節からなる群から選択される器官に腫瘍を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を除く他の抗癌薬を哺乳類に投与することをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗癌薬が、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、タキソテール、テモゾロミド、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、ＵＦＴ（ウラシル−テガフール）、ビンブラスチン、ビンデシン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類に放射線療法を施すことをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなる、キット。
【請求項１８】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
免疫刺激薬が、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＣＴＬＡ−４遮断薬が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
パラミクソウイルスが、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＮＤＶが、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびに腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方を治療することに関する説明書を含んでなる、キット。
【請求項２５】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
説明書が、
第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すこと
をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
局部的抗癌療法が放射線療法である、請求項２４に記載のキット。
【請求項１】
第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍、またはその双方を治療する方法であって、
腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること；および
免疫刺激薬を該哺乳類に全身投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すこと
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
局部的抗癌療法が放射線療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類に腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激薬を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項７】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
免疫刺激薬が、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ−４遮断薬が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
パラミクソウイルスが、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＤＶが、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類が、脳、肺、皮膚、口腔、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、腎臓、乳房、卵巣、前立腺、精巣、膵臓、膀胱およびリンパ節からなる群から選択される器官に腫瘍を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を除く他の抗癌薬を哺乳類に投与することをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗癌薬が、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、タキソテール、テモゾロミド、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、ＵＦＴ（ウラシル−テガフール）、ビンブラスチン、ビンデシン、およびそれらの２種類以上からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類に放射線療法を施すことをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびにその腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫刺激薬を哺乳類に投与することに関する説明書を含んでなる、キット。
【請求項１８】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
免疫刺激薬が、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＣＴＬＡ−４遮断薬が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
パラミクソウイルスが、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルスからなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＮＤＶが、ＭＴＨ６８／Ｈ、ＰＶ−７０１および７３−Ｔからなる群から選択される株に由来する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
腫瘍溶解性ウイルス、免疫刺激薬、ならびに腫瘍溶解性ウイルスを第一の腫瘍に投与すること、および免疫刺激薬を哺乳類に全身投与することによって、第一の腫瘍を有する哺乳類において第一の腫瘍、第二の腫瘍またはその双方を治療することに関する説明書を含んでなる、キット。
【請求項２５】
腫瘍溶解性ウイルスが、パラミクソウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスからなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
免疫刺激薬が、（ｉ）ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインと特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４の、ＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を遮断するＣＴＬＡ−４遮断薬；（ｉｉ）インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）；（ｉｉｉ）抗ＣＤ４０；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦ；およびその２つ以上からなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
説明書が、
第一の腫瘍に局部的抗癌療法を施すこと
をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
局部的抗癌療法が放射線療法である、請求項２４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５２７４６５（Ｐ２０１２−５２７４６５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１９３４（Ｐ２０１２−５１１９３４）
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５１１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５２４２
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１１８７）エデン、セラピューティックス、インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＥＤＥＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５１１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５２４２
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８１１８７）エデン、セラピューティックス、インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＥＤＥＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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