免疫製剤を含む脳梗塞治療用医薬品組成物
【課題】脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物の提供。
【解決手段】血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含む脳梗塞の治療用医薬品組成物である。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者に投与される場合がある。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含む場合がある。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体を含む場合がある。
【解決手段】血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含む脳梗塞の治療用医薬品組成物である。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者に投与される場合がある。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含む場合がある。本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体を含む場合がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞治療用医薬品組成物に関し、具体的には、血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合阻害剤を含む、脳梗塞の治療用医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞は、脳における局所的な血流の遮断即ち虚血によって生じる。脳梗塞急性期の虚血中心部分は血流を再開しても不可逆的で細胞死に至るが、その周囲には可逆的な不完全虚血領域が存在し、特に、ペナンブラと呼ばれる。前記虚血中心部分は治療を施さない限り拡大し、ペナンブラは徐々に消失する。この結果、病理学的には脳梗塞部分が拡大され、臨床的には機能障害が生じ、最悪の場合には死に至る。脳梗塞急性期の治療目的は、前記ペナンブラでの血流を回復することである。前記回復は、虚血の程度及びその持続時間に依存する。つまり、前記ペナンブラへの血流をいかに迅速に再開させるかが脳梗塞の早期回復を決定する。
【０００３】
組織型プラスミノゲン・アクチベーター（以下、「ｔ−ＰＡ」と称することがある。）は、虚血の原因となっている血栓を溶解することによってペナンブラへの血液供給を再開させる血栓溶解療法として有効なので、脳梗塞急性期の治療薬として承認されている。しかし、脳梗塞急性期徒過後の患者へのｔ−ＰＡ投与は有効ではなく、むしろ脳出血の合併症と、予後の増悪とをもたらすので、脳梗塞急性期徒過後、即ち、脳梗塞の発症から３時間以上経過後の患者へのｔ−ＰＡの投与は禁忌とされている。
【０００４】
したがって、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物の早急な開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３３：１５８１−１５８７ （１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、前記血栓溶解薬の脳梗塞急性期徒過後の投与による脳出血の合併症や予後の増悪は、血栓溶解薬の投与により血流が再開されると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現が増加し、これにより、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達系が活性化され、血管壁を構築しているタンパク質の分解が促進されることによるものであることを見出した。
そこで、前記血栓溶解薬、及び、前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合を阻害する結合阻害剤を併用することで、脳梗塞急性期徒過後、即ち、脳梗塞の発症から３時間以上経過後の患者にも前記血栓溶解薬を投与できることを知見し、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含むことを特徴とする、脳梗塞の治療用医薬品組成物である。
＜２＞ 脳梗塞急性期徒過後の患者に投与されることを特徴とする、前記＜１＞に記載の組成物である。
＜３＞ 前記脳梗塞急性期は脳梗塞の発症から３時間以内であることを特徴とする、前記＜２＞に記載の組成物である。
＜４＞ 前記血栓溶解薬は組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことを特徴とする、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の組成物である。
＜５＞ 前記結合阻害剤は、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦの受容体の少なくともいずれかと特異的に結合して、該ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害する活性を有する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体と、これらの誘導体と、からなるグループから選択されることを特徴とする、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の組成物である。
＜６＞ 前記結合阻害剤はＶＥＧＦ−Ａと結合することを特徴とする、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の組成物である。
＜７＞ 前記ＶＥＧＦ特異的結合パートナーは抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体であることを特徴とする、前記＜６＞に記載の組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、従来のラット脳梗塞モデルの作製手順を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１におけるラット脳梗塞モデルの作製手順を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、血栓注入による脳梗塞発症２４時間後の動物の脳冠状切片の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡを投与した動物の脳冠状切片の写真である。
【図２Ｃ】図２Ｃ、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡを投与した動物の脳冠状切片の写真である。
【図３】図３は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与後にＶＥＧＦの発現が抑制されることを示すウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の脳梗塞の体積を示す棒グラフである。縦軸：脳梗塞の体積（ｍｍ３）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の浮腫の体積を示す棒グラフである。縦軸：浮腫の体積（ｍｍ３）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の脳出血量を示す棒グラフである。縦軸：脳出血量（ｍｇ／ｄＬ）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後の運動機能スケールを示す帯グラフである。縦軸：運動機能スケール。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（脳梗塞の治療用医薬品組成物）
本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合阻害剤を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１２】
＜血栓溶解薬＞
前記血栓溶解薬としては、脳梗塞急性期の血栓溶解に適用することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）、デスモテプラーゼなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、前記血栓溶解薬は、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことが、血栓溶解の成功率を高めることができる点で好ましい。
前記血栓溶解薬の製造方法としては、特に制限はなく、前記血栓溶解薬の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
前記ｔ−ＰＡの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｔ−ＰＡに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を結合したものなどが挙げられる。また、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
前記ｔ−ＰＡ誘導体の具体的な例としては、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ等の前記ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換されたｔ−ＰＡ誘導体；テネクテプラーゼ、ラノテプラーゼ等の前記ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換され、更に糖鎖が修飾されたｔ−ＰＡ誘導体などが挙げられる。
【００１３】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血清溶解薬の含有量としては、特に制限はなく、前記血清溶解薬の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００１４】
本発明における「脳梗塞急性期」とは、脳梗塞の発症の初期で、脳血流量の低下に伴う脳神経機能障害が認められるが、前記血栓溶解薬による迅速な血流再開のみによって回復可能な時期をいう。ここで、脳梗塞急性期は、一般的には脳梗塞の発症から３時間以内をいう。
【００１５】
本発明における「患者」とは、ヒトを含むがヒトに限られない。
【００１６】
＜結合阻害剤＞
前記結合阻害剤は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と、前記ＶＥＧＦ受容体との結合を阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体の少なくともいずれかと特異的に結合するものであることが好ましい。これにより、前記ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害することができる。
前記結合阻害剤としては、例えば、前記ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体の少なくともいずれかと特異的に結合するレセプター又はリガンドなどが挙げられる。
前記レセプター又はリガンドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、その他の生体高分子などが挙げられる。
【００１７】
＜＜ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤＞＞
前記ＶＥＧＦとは、脈管形成及び血管新生に関与する一群の糖タンパク質である。前記ＶＥＧＦが、血管内皮細胞表面に存在するＶＥＧＦ受容体にリガンドとして結合すると、ＶＥＧＦシグナル伝達系が活性化される。脳梗塞においては、このＶＥＧＦシグナル伝達系の活性化により血管壁を構築しているタンパク質の分解が促進され、脳出血の合併症が起こることが本発明において確認された。
前記ＶＥＧＦファミリーとしては、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）−１、ＰＩＧＦ−２などが挙げられる。ＶＥＧＦファミリーのそれぞれのメンバーには、更にいくつかの亜型が存在し、例えば、ヒトのＶＥＧＦ−Ａには、アミノ酸数が１２１個（ＶＥＧＦ−Ａ１２１）、１６５個（ＶＥＧＦ−Ａ１６５）、１８９個（ＶＥＧＦ−Ａ１８９）、２０６個（ＶＥＧＦ−Ａ２０６）、１４５個（ＶＥＧＦ−Ａ１４５）、１８３個（ＶＥＧＦ−Ａ１８３）などが知られている。また、ヒトのＶＥＧＦ−Ｂには、アミノ酸数が１６７個（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）、１８６個（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）などが知られている。
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、前記ＶＥＧＦファミリーのいずれに結合するものであってもよい。
【００１８】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＶＥＧＦを認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、該抗体の抗原結合断片、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体（以下、「抗ＶＥＧＦ抗体など」と称することがある。）、及びこれらの誘導体からなるグループから選択される場合がある。これらの中でも、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、モノクローナル抗体が好ましく、抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体が、血管新生時の血管の破綻に関与するＶＥＧＦ−Ａの、ＶＥＧＦ受容体への結合を効率よく阻害できる点でより好ましい。
【００１９】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
また、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、前記抗ＶＥＧＦ抗体など、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかそのものであってもよく、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等のその他の成分を結合又は添加してもかまわない。前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤における、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２０】
−ポリクローナル抗体−
前記ポリクローナル抗体は、前記ＶＥＧＦやこれらの断片を免疫原として、ほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えば、ニワトリ）のいずれかの動物宿主に注射される。ＶＥＧＦの断片を免疫原とする場合には、ウシ血清アルブミン又はスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。
前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。
前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。
前記ポリクローナル抗体は、かかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合されたＶＥＧＦやこれらの断片を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製され、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦ受容体との結合が阻害されることや、この結合阻害によりＶＥＧＦシグナル伝達を阻害できることを確認されたものの場合がある。
前記ポリクローナル抗体としては、例えば、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５を免疫源として作製したウサギ抗ラットＶＥＧＦ抗体ＩｇＧ（ＲＢ−２２２、１９ｋＤａ〜２２ｋＤａ）などが挙げられる。なお、前記ＲＢ−２２２は、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１を認識することができる。
【００２１】
−モノクローナル抗体−
前記モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６））の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。
前記不死性細胞株は、前記ポリクローナル抗体の製造方法と同様の方法で免疫された動物宿主由来の脾臓細胞から作製される場合がある。前記脾臓細胞は、様々な方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。
前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種かあるいは異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知の様々な融合技術を用いる場合がある。
【００２２】
例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは、非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それから、ハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１週間〜２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、該シングルコロニーは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）等の培地で培養され、その培養上清が、前記ＶＥＧＦやこれらの断片に対する結合活性についてテストされ、更に、前記ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦ受容体との結合が阻害されることや、この結合阻害によりＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する活性についてもテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。
更に、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるための様々な技術が用いられる場合がある。
前記モノクローナル抗体は、前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。細胞屑由来の不純タンパク質等の汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
【００２３】
また、前記モノクローナル抗体は、例えば、前記ＶＥＧＦに対するマウスモノクローナル抗体を遺伝子組み換えによってヒト化したベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、前記ベバシズマブのＦａｂフラグメントであり、前記ＶＥＧＦとの結合が更に強くなるように遺伝子改変が行われたラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）等のモノクローナル抗体製剤の抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体などが挙げられる。前記モノクローナル抗体製剤は、既に悪性腫瘍に対して臨床応用され、ヒトに対する安全性が確認されている。
【００２４】
−抗原結合断片−
前記抗体の抗原結合断片は、抗原結合に関与する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。
前記抗体の抗原結合断片は、それぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンでインタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００２５】
−組換え抗体−
前記組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換や、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションなどを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。
また、前記組換え抗体は、例えば、原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【００２６】
−キメラ抗体−
前記キメラ抗体は、前記組換え抗体の抗原結合部位がＶＥＧＦと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。
前記キメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。
【００２７】
−誘導体−
前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合阻害活性を有する前記抗ＶＥＧＦ抗体などの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等を結合したものなどが挙げられる。
【００２８】
前記抗ＶＥＧＦ抗体などの誘導体の具体的な例としては、前記ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン７部分に結合し、前記ＶＥＧＦの生成を阻害するＲＮＡアプタマーのペガプタニブなどが挙げられる。
【００２９】
また、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を添加したものであってもよい。
これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
＜＜ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤＞＞
前記ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）とは、受容体型チロシンキナーゼの一種であり、リガンドである前記ＶＥＧＦによる血管内皮細胞の増殖や遊走の促進などの作用の発現に関与している。
ＶＥＧＦ受容体には、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１と称することがある。）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１と称することがある。）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４と称することがある。）、可溶性ＶＥＧＦＲ−１、可溶性ＶＥＧＦＲ−２、可溶性ＶＥＧＦＲ−３などが知られている。前記ＶＥＧＦファミリーは、それぞれ決まった受容体に結合し、ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２に、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ−１、及びＰｌＧＦ−２はＶＥＧＦＲ１に、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３に、ＶＥＧＦ−ＥはＶＥＧＦＲ２に結合する。
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、前記ＶＥＧＦ受容体のいずれに結合するものであってもよい。
【００３１】
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＶＥＧＦのアナログ、ＶＥＧＦの拮抗阻害剤、ＶＥＧＦ受容体を認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、該抗体の抗原結合断片、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体（以下、「抗ＶＥＧＦＲ抗体など」と称することがある。）、及びこれらの誘導体からなるグループから選択される場合がある。これらの中でも、前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、モノクローナル抗体が好ましく、抗ＶＥＧＦＲ−１中和抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体がより好ましい。
【００３２】
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
また、前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、前記抗ＶＥＧＦＲ抗体など、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかそのものであってもよく、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等のその他の成分を結合又は添加してもかまわない。前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤における、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
−ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原結合断片−
前記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合断片は、ＶＥＧＦ受容体や、これらの断片を免疫原として、前記ＶＥＧＦを認識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合断片と同様の方法で製造することができる。
【００３４】
−組換え抗体−
前記組換え抗体は、前記ＶＥＧＦを認識する組換え抗体と同様の方法で製造することができる。
【００３５】
−キメラ抗体−
前記キメラ抗体は、前記組換え抗体の抗原結合部位がＶＥＧＦ受容体と特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質であること以外は、前記ＶＥＧＦを認識するキメラ抗体と同様の抗体などが挙げられる。
【００３６】
−誘導体−
前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合阻害活性を有する前記抗ＶＥＧＦＲ抗体などの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等を結合したものなどが挙げられる。
【００３７】
また、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を添加したものであってもよい。
前記添加剤、処理剤、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコールなどは、前記抗ＶＥＧＦ抗体などと同様のものなどが挙げられる。
これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記結合阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、前記結合阻害剤の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００３９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から投与方法や剤型などに応じて適宜選択することができる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、経口固形剤として用いられる場合、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等の崩壊剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等の滑沢剤；酸化チタン、酸化鉄等の着色剤；白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等の矯味／矯臭剤などが挙げられる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、経口液剤として用いられる場合、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等の矯味／矯臭剤；クエン酸ナトリウム等の緩衝剤；トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等の安定化剤などが挙げられる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、注射剤として用いられる場合、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調節剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等の局所麻酔剤；ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)、ポリエチレングリコール等の界面活性剤などが挙げられる。
また、前記脳梗塞の治療用組成物は、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを含有していてもよい。これらは、前記結合阻害剤と同様のものなどを用いることができる。これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
＜投与＞
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、脳梗塞発症後３時間以降が好ましく、３時間〜６時間がより好ましい。前記脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者に対しても投与でき、更に前記血栓溶解薬の投与による脳出血の合併症や予後の増悪を改善できる点で有利である。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与方法としては、特に制限はなく、該脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬や前記結合阻害剤の種類や含有量などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与量としても、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００４１】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬と、前記結合阻害剤とは、同時に併用して投与されてもよく、別々に投与されてもよい。
前記血栓溶解薬がｔ−ＰＡである場合、該ｔ−ＰＡによって活性化されるプラスミンがＶＥＧＦのプロセッシングに関与するため、ｔ−ＰＡの投与に先立って結合阻害剤を脳内に送達しておくことは、前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合をより強く阻害すること、これにより、前記ＶＥＧＦのシグナル伝達をより強く阻害することにつながる。したがって、結合阻害剤を投与した後にｔ−ＰＡを投与する場合もある。
【００４２】
前記血栓溶解薬の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、各医薬製造メーカーの指示に従った投与量及び投与方法が好ましい。
例えば、前記血栓溶解薬が、前記ｔ−ＰＡ製剤の１つであるアルテプラーゼである場合、その投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．６ｍｇ／ｋｇ〜０．９ｍｇ／ｋｇであり、上限としては、１個体当たり６０ｍｇ〜９０ｍｇを、静脈内投与する方法などが挙げられる。具体的には、全投与量の１０％を１分間〜２分間のボーラス投与で、残り９０％を１時間の点滴投与で静脈内注射する方法などが挙げられる。
【００４３】
前記結合阻害剤の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、各医薬製造メーカーの指示に従った投与量及び投与方法が好ましい。
例えば、前記結合阻害剤が、前記抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体である場合、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与する方法が好ましい。
また、前記抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体が、ベバシズマブである場合、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを生理食塩水１００ｍＬに溶解し、９０分間かけて静注投与することが好ましい。
【００４４】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬と、前記結合阻害剤とが、同時に投与される場合、前記組成物の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記組成物における前記血栓溶解薬及び前記結合阻害剤の種類、含有量などに応じて、適宜選択することができる。
【００４５】
＜用途＞
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与でき、脳出血の合併症や予後の増悪を改善できるため、脳梗塞の治療に好適に利用可能である。
前記脳梗塞の治療においては、血栓溶解薬を投与するステップと、該血栓溶解薬を投与するステップと同時に、あるいは、先だって、前記結合阻害剤を投与するステップとを含む治療方法を用いることが好ましい。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例は、新潟大学動物実験倫理委員会によって承認された後に実施された。
【００４７】
（実施例１：ラット脳梗塞モデルの作製）
＜実験動物＞
ラット脳梗塞モデルを作製するためにスプラーグ−ドーリーラット（オス、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）を用いた。
【００４８】
＜ラット脳梗塞モデルの作製＞
図１Ａ及び図１Ｂを参照して、本願発明のラット脳梗塞モデルの作製方法を説明する。
従来の中大脳動脈閉塞モデルでは、外頸動脈（ＥＣＡ）１と総頸動脈（ＣＣＡ）３の分岐部、若しくは外頚動脈（ＥＣＡ）１から中大脳動脈（ＭＣＡ）２起始部にナイロン糸を侵入させて中大脳動脈を閉塞させていた（図１Ａ）。
しかし、血栓溶解療法の治療可能時間を超えて血栓溶解薬を投与することによる脳出血併発を再現させるために、本実施例では、図１Ｂに示すラット脳塞栓モデルを作製した。血栓は、ラットの自家血液及びトロンビンを、直径０．３５ｍｍのポリエチレンチューブカテーテル（ＰＥ−５０、ベクトン・ディクティンソン社製）中でゲルとして凝固させ、終夜放置後、１ｍｍの長さに切断された。前記血栓は、前記カテーテルを用いて、１質量％〜１．５質量％のハロタン麻酔下でラットの外頸動脈（ＥＣＡ）１から中大脳動脈（ＭＣＡ）２に注入された。その後、血栓注入前と、血栓注入の３０分間後又は２４時間後に、レーザードップラー血流計（ＡＦＬ２１、株式会社アドバンス製、東京）を用いて脳表血流値（ＣＢＦ）が測定された。脳表血流値が血栓注入前と比べて５０％未満の動物を以下の実験でラット脳梗塞モデル動物として用いた。
【００４９】
＜栓溶解療法＞
ラット脳梗塞モデルに対する血栓溶解療法には、血栓溶解薬であるｔ−ＰＡ（アルテプラーゼ、田辺三菱製薬株式会社製）が、血栓注入の１時間又は４時間後に大腿静脈に３０分間静注された（１０ｍｇ／ｋｇ、１０％ボーラス投与及び９０％点滴投与）。
【００５０】
＜ＴＴＣ染色＞
血栓注入の２４時間後にハロタン過剰投与で安楽死させたラットにＰＢＳを潅流して、非固定の脳冠状切片が作製された。前記脳冠状切片は、３７℃で１５分間、２質量％トリフェニルテトラゾリウム塩（ＴＴＣ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＴＴＣ染色され、スキャナー（ＣａｎｏＳｃａｎｅｒ、Ｃａｎｏｎ社製）を用いて走査された。
脳梗塞及び浮腫の体積は、Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１０：２９０−２９３（１９９０））に基づいて算出された。
【００５１】
＜結果＞
図２Ａ〜図２Ｃは、ｔ−ＰＡ投与の脳梗塞軽減効果と、脳出血惹起効果とを示す脳冠状切片の写真である。黒色部分は、健常組織を示し、白色部分は、脳梗塞部分を示す。
血栓注入後ｔ−ＰＡを投与せずに２４時間経過すると、術側大脳に広範な脳梗塞が観察された（図２Ａ）。
血栓注入の１時間後にｔ−ＰＡを投与すると、ｔ−ＰＡ非投与動物と比較して脳梗塞部分の縮小が観察された（図２Ｂ）。
しかし、血栓注入の４時間後にｔ−ＰＡを投与すると、１時間後にｔ−ＰＡを投与した動物と比較して、脳梗塞部分の拡大と、前記部分での出血とが観察された（図２Ｃ）。
以上の結果から、前記ラット脳梗塞モデルは、ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と脳梗塞の増悪とを再現できることが示された。
【００５２】
（実施例２：抗ＶＥＧＦ抗体を用いたＶＥＧＦの発現抑制）
ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と、脳梗塞の増悪とを抑制又は軽減するために、１００μｇのウサギ抗ラットＶＥＧＦ抗体ＩｇＧ（ＲＢ−２２２、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ−Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ社製、以下、「抗ＶＥＧＦ抗体」と称することがある。）がｔ−ＰＡとともにボーラス投与された。対照実験では、１００μｇのウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｒ５Ｇ１０−０４８、ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製、以下、「対照抗体」と称することがある。）がｔ−ＰＡとともにボーラス投与された。
【００５３】
＜ウエスタン・ブロット法＞
ウエスタン・ブロット法は、全細胞抽出液をサンプルとして用いてＳｈｉｍｏｈａｔａ、 Ｔ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，２７：１４６３−１４７５ （２００７））に記載の方法に従って実施された。
ＶＥＧＦの検出には、１次抗体として抗ＶＥＧＦ抗体（ＳＣ−１５２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、希釈比１：２００）が、２次抗体としてペルオキダーゼ・コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈比１：１０，０００）が用いられた。
また、適用されたタンパク質の量がどのサンプルでも均一であることを確認するために、前記１次抗体及び前記２次抗体を除去した後のブロッティング膜に、抗β−アクチン抗体（ＳＣ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、希釈比１：２，０００）及び前記２次抗体を反応させてβ−アクチンが検出された。
【００５４】
＜結果＞
図３は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与後に、ＶＥＧＦの発現が抑制されたことを示すウエスタン・ブロット図である。
レーン１は、血栓注入による脳梗塞発症を行わなかった動物のサンプルを示し、レーン２は、血栓注入による脳梗塞発症を行わないでｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン３は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後に対照抗体のみを投与した動物のサンプルを示し、レーン４は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン５は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与した動物のサンプルを示し、レーン６は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン７は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与した動物のサンプルを示す。
【００５５】
レーン３及びレーン４では、ＶＥＧＦの発現が観察された。レーン６では、非常に多くのＶＥＧＦの発現が観察された。一方、レーン１、レーン２、レーン５、及びレーン７では、ほとんどＶＥＧＦの発現は観察されなかった。
これらのレーンで検出されたＶＥＧＦ量の相違は、β−アクチンの量の相違とは全く相関しなかった。レーン３、レーン４、及びレーン５の比較から、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡを投与すると、ＶＥＧＦの発現量が非常に増大したことがわかった。また、レーン４とレーン５との比較、並びに、レーン６とレーン７との比較によって、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、ＶＥＧＦの発現を顕著に抑制したことがわかった。
【００５６】
虚血性血管内皮細胞障害と、その後の脳血液関門の機能不全とがｔ−ＰＡ投与後の脳出血に関係することが知られている。また、ＶＥＧＦは、ＭＭＰ−９を活性化し、活性化されたＭＭＰ−９は、ゾナオクルデンス−１や基底膜ＩＶ型コラーゲンのような脳血液関門に関与するタンパク質を分解することが知られている。したがって、理論的に拘泥するわけではないが、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の作用機序は、脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与によるＶＥＧＦの増加を抑制することによって、ＭＭＰ−９活性化のような脳血液関門の機能不全を防止して、脳出血を予防することで説明できる可能性がある。
【００５７】
（実施例３：ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の影響評価）
ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、実施例２で説明されたとおり実施された。血栓注入による脳梗塞発症から４時間後のｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の効果は、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積、浮腫の体積、脳出血量、及び運動機能スケールを測定して評価された。
前記ＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積及び浮腫の体積は、Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１０：２９０−２９３（１９９０））に基づいて算出され、統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）にて検証され、事後比較（ｐｏｓｔ ｈｏｃ比較）は、Ｔｕｋｅｙ法で行った。
脳出血量は、分光光度計で術側脳組織１ｄＬ当たりのヘモグロビン濃度（単位：ｇ／ｄＬ）が測定された。
運動機能スケールは、Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｍ．ら（Ｓｔｒｏｋｅ、３０： １４６４−１４７１（１９９９））に基づいて５段階で評価された（段階０：運動障害なし、段階１：術側と反対側の前肢の屈曲、段階２：麻痺側へ身体を押し動かすことへの抵抗力の減少、段階３：麻痺側への自発的な回転、段階４：死亡）。運動機能スケールを比較する際の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）にて検証され、事後比較（ｐｏｓｔ ｈｏｃ比較）はＴｕｋｅｙ法で行った。
【００５８】
＜脳梗塞及び浮腫の体積と、脳出血量との結果＞
図４Ａ〜図４Ｃは、それぞれ、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積、浮腫の体積、及び脳出血量を示す棒グラフである。白色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後に対照抗体のみを投与した群で、黒色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群で、灰色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した群である。各群の個体数は６であった。
これらの結果から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した場合に比べて脳梗塞及び浮腫の体積を低減することはできなかったが、脳出血量を低減することはできた（Ｐ＝０．０１３）。
【００５９】
＜運動機能スケール評価結果＞
図４Ｄは、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後の運動機能スケールを示す帯グラフである。帯の異なる色の部分は、５段階のそれぞれの個体数を表す。左側の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後に対照抗体のみを投与した群（個体数２３）を示し、中央の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群（個体数２０）を示し、右側の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した群（個体数１２）を示す。
左側の帯と中央の帯との比較から、脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群は、対照抗体のみを投与した群より予後が悪かった。この結果から、前記ラット脳梗塞モデルが、ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と脳梗塞の増悪とを再現することを確認できた。
中央の帯と右側の帯との比較から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、ｔ−ＰＡ及び対照抗体の併合投与より予後が改善された（Ｐ＝０．０００１）。更に、左側の帯と右側の帯との比較から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、対照抗体のみの投与よりも予後が改善された（Ｐ＝０．０４５）。
なお、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併合投与されたラット個体を病理学的に剖検したところ、抗原抗体複合体の存在は肝臓、膵臓及び腎臓に認められなかった。
【００６０】
以上の実験結果から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、脳梗塞を発症した患者において、ｔ−ＰＡを投与するまでの時間を従来よりも延長することができ、かつ、脳出血合併症を予防しつつ運動機能及び生存割合を改善できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できるため、脳梗塞の治療に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１ 外頸動脈（ＥＣＡ）
２ 中大脳動脈（ＭＣＡ）
３ 総頸動脈（ＣＣＡ）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞治療用医薬品組成物に関し、具体的には、血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合阻害剤を含む、脳梗塞の治療用医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞は、脳における局所的な血流の遮断即ち虚血によって生じる。脳梗塞急性期の虚血中心部分は血流を再開しても不可逆的で細胞死に至るが、その周囲には可逆的な不完全虚血領域が存在し、特に、ペナンブラと呼ばれる。前記虚血中心部分は治療を施さない限り拡大し、ペナンブラは徐々に消失する。この結果、病理学的には脳梗塞部分が拡大され、臨床的には機能障害が生じ、最悪の場合には死に至る。脳梗塞急性期の治療目的は、前記ペナンブラでの血流を回復することである。前記回復は、虚血の程度及びその持続時間に依存する。つまり、前記ペナンブラへの血流をいかに迅速に再開させるかが脳梗塞の早期回復を決定する。
【０００３】
組織型プラスミノゲン・アクチベーター（以下、「ｔ−ＰＡ」と称することがある。）は、虚血の原因となっている血栓を溶解することによってペナンブラへの血液供給を再開させる血栓溶解療法として有効なので、脳梗塞急性期の治療薬として承認されている。しかし、脳梗塞急性期徒過後の患者へのｔ−ＰＡ投与は有効ではなく、むしろ脳出血の合併症と、予後の増悪とをもたらすので、脳梗塞急性期徒過後、即ち、脳梗塞の発症から３時間以上経過後の患者へのｔ−ＰＡの投与は禁忌とされている。
【０００４】
したがって、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物の早急な開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３３：１５８１−１５８７ （１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、前記血栓溶解薬の脳梗塞急性期徒過後の投与による脳出血の合併症や予後の増悪は、血栓溶解薬の投与により血流が再開されると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現が増加し、これにより、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達系が活性化され、血管壁を構築しているタンパク質の分解が促進されることによるものであることを見出した。
そこで、前記血栓溶解薬、及び、前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合を阻害する結合阻害剤を併用することで、脳梗塞急性期徒過後、即ち、脳梗塞の発症から３時間以上経過後の患者にも前記血栓溶解薬を投与できることを知見し、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含むことを特徴とする、脳梗塞の治療用医薬品組成物である。
＜２＞ 脳梗塞急性期徒過後の患者に投与されることを特徴とする、前記＜１＞に記載の組成物である。
＜３＞ 前記脳梗塞急性期は脳梗塞の発症から３時間以内であることを特徴とする、前記＜２＞に記載の組成物である。
＜４＞ 前記血栓溶解薬は組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことを特徴とする、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の組成物である。
＜５＞ 前記結合阻害剤は、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦの受容体の少なくともいずれかと特異的に結合して、該ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害する活性を有する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体と、これらの誘導体と、からなるグループから選択されることを特徴とする、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の組成物である。
＜６＞ 前記結合阻害剤はＶＥＧＦ−Ａと結合することを特徴とする、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の組成物である。
＜７＞ 前記ＶＥＧＦ特異的結合パートナーは抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体であることを特徴とする、前記＜６＞に記載の組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できる脳梗塞治療用医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、従来のラット脳梗塞モデルの作製手順を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１におけるラット脳梗塞モデルの作製手順を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、血栓注入による脳梗塞発症２４時間後の動物の脳冠状切片の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡを投与した動物の脳冠状切片の写真である。
【図２Ｃ】図２Ｃ、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡを投与した動物の脳冠状切片の写真である。
【図３】図３は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与後にＶＥＧＦの発現が抑制されることを示すウエスタン・ブロットの結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の脳梗塞の体積を示す棒グラフである。縦軸：脳梗塞の体積（ｍｍ３）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の浮腫の体積を示す棒グラフである。縦軸：浮腫の体積（ｍｍ３）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の脳出血量を示す棒グラフである。縦軸：脳出血量（ｍｇ／ｄＬ）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与したラットの発症２４時間後の運動機能スケールを示す帯グラフである。縦軸：運動機能スケール。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（脳梗塞の治療用医薬品組成物）
本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合阻害剤を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１２】
＜血栓溶解薬＞
前記血栓溶解薬としては、脳梗塞急性期の血栓溶解に適用することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲン・アクチベーター（ｕ−ＰＡ）、デスモテプラーゼなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、前記血栓溶解薬は、組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことが、血栓溶解の成功率を高めることができる点で好ましい。
前記血栓溶解薬の製造方法としては、特に制限はなく、前記血栓溶解薬の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
前記ｔ−ＰＡの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ｔ−ＰＡに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を結合したものなどが挙げられる。また、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
前記ｔ−ＰＡ誘導体の具体的な例としては、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ等の前記ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換されたｔ−ＰＡ誘導体；テネクテプラーゼ、ラノテプラーゼ等の前記ｔ−ＰＡのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換され、更に糖鎖が修飾されたｔ−ＰＡ誘導体などが挙げられる。
【００１３】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血清溶解薬の含有量としては、特に制限はなく、前記血清溶解薬の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００１４】
本発明における「脳梗塞急性期」とは、脳梗塞の発症の初期で、脳血流量の低下に伴う脳神経機能障害が認められるが、前記血栓溶解薬による迅速な血流再開のみによって回復可能な時期をいう。ここで、脳梗塞急性期は、一般的には脳梗塞の発症から３時間以内をいう。
【００１５】
本発明における「患者」とは、ヒトを含むがヒトに限られない。
【００１６】
＜結合阻害剤＞
前記結合阻害剤は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と、前記ＶＥＧＦ受容体との結合を阻害することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体の少なくともいずれかと特異的に結合するものであることが好ましい。これにより、前記ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害することができる。
前記結合阻害剤としては、例えば、前記ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体の少なくともいずれかと特異的に結合するレセプター又はリガンドなどが挙げられる。
前記レセプター又はリガンドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、その他の生体高分子などが挙げられる。
【００１７】
＜＜ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤＞＞
前記ＶＥＧＦとは、脈管形成及び血管新生に関与する一群の糖タンパク質である。前記ＶＥＧＦが、血管内皮細胞表面に存在するＶＥＧＦ受容体にリガンドとして結合すると、ＶＥＧＦシグナル伝達系が活性化される。脳梗塞においては、このＶＥＧＦシグナル伝達系の活性化により血管壁を構築しているタンパク質の分解が促進され、脳出血の合併症が起こることが本発明において確認された。
前記ＶＥＧＦファミリーとしては、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）−１、ＰＩＧＦ−２などが挙げられる。ＶＥＧＦファミリーのそれぞれのメンバーには、更にいくつかの亜型が存在し、例えば、ヒトのＶＥＧＦ−Ａには、アミノ酸数が１２１個（ＶＥＧＦ−Ａ１２１）、１６５個（ＶＥＧＦ−Ａ１６５）、１８９個（ＶＥＧＦ−Ａ１８９）、２０６個（ＶＥＧＦ−Ａ２０６）、１４５個（ＶＥＧＦ−Ａ１４５）、１８３個（ＶＥＧＦ−Ａ１８３）などが知られている。また、ヒトのＶＥＧＦ−Ｂには、アミノ酸数が１６７個（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）、１８６個（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）などが知られている。
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、前記ＶＥＧＦファミリーのいずれに結合するものであってもよい。
【００１８】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＶＥＧＦを認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、該抗体の抗原結合断片、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体（以下、「抗ＶＥＧＦ抗体など」と称することがある。）、及びこれらの誘導体からなるグループから選択される場合がある。これらの中でも、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、モノクローナル抗体が好ましく、抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体が、血管新生時の血管の破綻に関与するＶＥＧＦ−Ａの、ＶＥＧＦ受容体への結合を効率よく阻害できる点でより好ましい。
【００１９】
前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
また、前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤は、前記抗ＶＥＧＦ抗体など、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかそのものであってもよく、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等のその他の成分を結合又は添加してもかまわない。前記ＶＥＧＦに特異的に結合する結合阻害剤における、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２０】
−ポリクローナル抗体−
前記ポリクローナル抗体は、前記ＶＥＧＦやこれらの断片を免疫原として、ほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えば、ニワトリ）のいずれかの動物宿主に注射される。ＶＥＧＦの断片を免疫原とする場合には、ウシ血清アルブミン又はスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。
前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。
前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。
前記ポリクローナル抗体は、かかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合されたＶＥＧＦやこれらの断片を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製され、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦ受容体との結合が阻害されることや、この結合阻害によりＶＥＧＦシグナル伝達を阻害できることを確認されたものの場合がある。
前記ポリクローナル抗体としては、例えば、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５を免疫源として作製したウサギ抗ラットＶＥＧＦ抗体ＩｇＧ（ＲＢ−２２２、１９ｋＤａ〜２２ｋＤａ）などが挙げられる。なお、前記ＲＢ−２２２は、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１を認識することができる。
【００２１】
−モノクローナル抗体−
前記モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６））の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。
前記不死性細胞株は、前記ポリクローナル抗体の製造方法と同様の方法で免疫された動物宿主由来の脾臓細胞から作製される場合がある。前記脾臓細胞は、様々な方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。
前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種かあるいは異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知の様々な融合技術を用いる場合がある。
【００２２】
例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは、非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それから、ハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１週間〜２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、該シングルコロニーは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）等の培地で培養され、その培養上清が、前記ＶＥＧＦやこれらの断片に対する結合活性についてテストされ、更に、前記ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦ受容体との結合が阻害されることや、この結合阻害によりＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する活性についてもテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。
更に、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるための様々な技術が用いられる場合がある。
前記モノクローナル抗体は、前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。細胞屑由来の不純タンパク質等の汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。
【００２３】
また、前記モノクローナル抗体は、例えば、前記ＶＥＧＦに対するマウスモノクローナル抗体を遺伝子組み換えによってヒト化したベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、前記ベバシズマブのＦａｂフラグメントであり、前記ＶＥＧＦとの結合が更に強くなるように遺伝子改変が行われたラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）等のモノクローナル抗体製剤の抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体などが挙げられる。前記モノクローナル抗体製剤は、既に悪性腫瘍に対して臨床応用され、ヒトに対する安全性が確認されている。
【００２４】
−抗原結合断片−
前記抗体の抗原結合断片は、抗原結合に関与する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。
前記抗体の抗原結合断片は、それぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンでインタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
【００２５】
−組換え抗体−
前記組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換や、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションなどを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。
また、前記組換え抗体は、例えば、原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
【００２６】
−キメラ抗体−
前記キメラ抗体は、前記組換え抗体の抗原結合部位がＶＥＧＦと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。
前記キメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。
【００２７】
−誘導体−
前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合阻害活性を有する前記抗ＶＥＧＦ抗体などの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等を結合したものなどが挙げられる。
【００２８】
前記抗ＶＥＧＦ抗体などの誘導体の具体的な例としては、前記ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン７部分に結合し、前記ＶＥＧＦの生成を阻害するＲＮＡアプタマーのペガプタニブなどが挙げられる。
【００２９】
また、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を添加したものであってもよい。
これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
＜＜ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤＞＞
前記ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）とは、受容体型チロシンキナーゼの一種であり、リガンドである前記ＶＥＧＦによる血管内皮細胞の増殖や遊走の促進などの作用の発現に関与している。
ＶＥＧＦ受容体には、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１と称することがある。）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１と称することがある。）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４と称することがある。）、可溶性ＶＥＧＦＲ−１、可溶性ＶＥＧＦＲ−２、可溶性ＶＥＧＦＲ−３などが知られている。前記ＶＥＧＦファミリーは、それぞれ決まった受容体に結合し、ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２に、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ−１、及びＰｌＧＦ−２はＶＥＧＦＲ１に、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３に、ＶＥＧＦ−ＥはＶＥＧＦＲ２に結合する。
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、前記ＶＥＧＦ受容体のいずれに結合するものであってもよい。
【００３１】
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＶＥＧＦのアナログ、ＶＥＧＦの拮抗阻害剤、ＶＥＧＦ受容体を認識するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、該抗体の抗原結合断片、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体（以下、「抗ＶＥＧＦＲ抗体など」と称することがある。）、及びこれらの誘導体からなるグループから選択される場合がある。これらの中でも、前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、モノクローナル抗体が好ましく、抗ＶＥＧＦＲ−１中和抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体がより好ましい。
【００３２】
前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子組換え法、合成法などが挙げられる。また、市販品を用いてもよい。
また、前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤は、前記抗ＶＥＧＦＲ抗体など、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかそのものであってもよく、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等のその他の成分を結合又は添加してもかまわない。前記ＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する結合阻害剤における、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
−ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原結合断片−
前記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合断片は、ＶＥＧＦ受容体や、これらの断片を免疫原として、前記ＶＥＧＦを認識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合断片と同様の方法で製造することができる。
【００３４】
−組換え抗体−
前記組換え抗体は、前記ＶＥＧＦを認識する組換え抗体と同様の方法で製造することができる。
【００３５】
−キメラ抗体−
前記キメラ抗体は、前記組換え抗体の抗原結合部位がＶＥＧＦ受容体と特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質であること以外は、前記ＶＥＧＦを認識するキメラ抗体と同様の抗体などが挙げられる。
【００３６】
−誘導体−
前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合阻害活性を有する前記抗ＶＥＧＦＲ抗体などの誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤等を結合したものなどが挙げられる。
【００３７】
また、前記抗ＶＥＧＦ抗体などに、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、その他の医薬品として許容される添加剤や処理剤を添加したものであってもよい。
前記添加剤、処理剤、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコールなどは、前記抗ＶＥＧＦ抗体などと同様のものなどが挙げられる。
これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記結合阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、前記結合阻害剤の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００３９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から投与方法や剤型などに応じて適宜選択することができる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、経口固形剤として用いられる場合、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等の崩壊剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等の滑沢剤；酸化チタン、酸化鉄等の着色剤；白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等の矯味／矯臭剤などが挙げられる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、経口液剤として用いられる場合、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等の矯味／矯臭剤；クエン酸ナトリウム等の緩衝剤；トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等の安定化剤などが挙げられる。
例えば、前記脳梗塞の治療用組成物が、注射剤として用いられる場合、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調節剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；塩化ナトリウム、ブドウ糖等の等張化剤；塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等の局所麻酔剤；ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)、ポリエチレングリコール等の界面活性剤などが挙げられる。
また、前記脳梗塞の治療用組成物は、糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを含有していてもよい。これらは、前記結合阻害剤と同様のものなどを用いることができる。これらの糖鎖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール、添加剤や処理剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
＜投与＞
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、脳梗塞発症後３時間以降が好ましく、３時間〜６時間がより好ましい。前記脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者に対しても投与でき、更に前記血栓溶解薬の投与による脳出血の合併症や予後の増悪を改善できる点で有利である。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与方法としては、特に制限はなく、該脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬や前記結合阻害剤の種類や含有量などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物の投与量としても、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００４１】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬と、前記結合阻害剤とは、同時に併用して投与されてもよく、別々に投与されてもよい。
前記血栓溶解薬がｔ−ＰＡである場合、該ｔ−ＰＡによって活性化されるプラスミンがＶＥＧＦのプロセッシングに関与するため、ｔ−ＰＡの投与に先立って結合阻害剤を脳内に送達しておくことは、前記ＶＥＧＦと前記ＶＥＧＦ受容体との結合をより強く阻害すること、これにより、前記ＶＥＧＦのシグナル伝達をより強く阻害することにつながる。したがって、結合阻害剤を投与した後にｔ−ＰＡを投与する場合もある。
【００４２】
前記血栓溶解薬の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、各医薬製造メーカーの指示に従った投与量及び投与方法が好ましい。
例えば、前記血栓溶解薬が、前記ｔ−ＰＡ製剤の１つであるアルテプラーゼである場合、その投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．６ｍｇ／ｋｇ〜０．９ｍｇ／ｋｇであり、上限としては、１個体当たり６０ｍｇ〜９０ｍｇを、静脈内投与する方法などが挙げられる。具体的には、全投与量の１０％を１分間〜２分間のボーラス投与で、残り９０％を１時間の点滴投与で静脈内注射する方法などが挙げられる。
【００４３】
前記結合阻害剤の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、各医薬製造メーカーの指示に従った投与量及び投与方法が好ましい。
例えば、前記結合阻害剤が、前記抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体である場合、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与する方法が好ましい。
また、前記抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体が、ベバシズマブである場合、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを生理食塩水１００ｍＬに溶解し、９０分間かけて静注投与することが好ましい。
【００４４】
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物における、前記血栓溶解薬と、前記結合阻害剤とが、同時に投与される場合、前記組成物の投与量及び投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記組成物における前記血栓溶解薬及び前記結合阻害剤の種類、含有量などに応じて、適宜選択することができる。
【００４５】
＜用途＞
前記脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与でき、脳出血の合併症や予後の増悪を改善できるため、脳梗塞の治療に好適に利用可能である。
前記脳梗塞の治療においては、血栓溶解薬を投与するステップと、該血栓溶解薬を投与するステップと同時に、あるいは、先だって、前記結合阻害剤を投与するステップとを含む治療方法を用いることが好ましい。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例は、新潟大学動物実験倫理委員会によって承認された後に実施された。
【００４７】
（実施例１：ラット脳梗塞モデルの作製）
＜実験動物＞
ラット脳梗塞モデルを作製するためにスプラーグ−ドーリーラット（オス、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）を用いた。
【００４８】
＜ラット脳梗塞モデルの作製＞
図１Ａ及び図１Ｂを参照して、本願発明のラット脳梗塞モデルの作製方法を説明する。
従来の中大脳動脈閉塞モデルでは、外頸動脈（ＥＣＡ）１と総頸動脈（ＣＣＡ）３の分岐部、若しくは外頚動脈（ＥＣＡ）１から中大脳動脈（ＭＣＡ）２起始部にナイロン糸を侵入させて中大脳動脈を閉塞させていた（図１Ａ）。
しかし、血栓溶解療法の治療可能時間を超えて血栓溶解薬を投与することによる脳出血併発を再現させるために、本実施例では、図１Ｂに示すラット脳塞栓モデルを作製した。血栓は、ラットの自家血液及びトロンビンを、直径０．３５ｍｍのポリエチレンチューブカテーテル（ＰＥ−５０、ベクトン・ディクティンソン社製）中でゲルとして凝固させ、終夜放置後、１ｍｍの長さに切断された。前記血栓は、前記カテーテルを用いて、１質量％〜１．５質量％のハロタン麻酔下でラットの外頸動脈（ＥＣＡ）１から中大脳動脈（ＭＣＡ）２に注入された。その後、血栓注入前と、血栓注入の３０分間後又は２４時間後に、レーザードップラー血流計（ＡＦＬ２１、株式会社アドバンス製、東京）を用いて脳表血流値（ＣＢＦ）が測定された。脳表血流値が血栓注入前と比べて５０％未満の動物を以下の実験でラット脳梗塞モデル動物として用いた。
【００４９】
＜栓溶解療法＞
ラット脳梗塞モデルに対する血栓溶解療法には、血栓溶解薬であるｔ−ＰＡ（アルテプラーゼ、田辺三菱製薬株式会社製）が、血栓注入の１時間又は４時間後に大腿静脈に３０分間静注された（１０ｍｇ／ｋｇ、１０％ボーラス投与及び９０％点滴投与）。
【００５０】
＜ＴＴＣ染色＞
血栓注入の２４時間後にハロタン過剰投与で安楽死させたラットにＰＢＳを潅流して、非固定の脳冠状切片が作製された。前記脳冠状切片は、３７℃で１５分間、２質量％トリフェニルテトラゾリウム塩（ＴＴＣ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＴＴＣ染色され、スキャナー（ＣａｎｏＳｃａｎｅｒ、Ｃａｎｏｎ社製）を用いて走査された。
脳梗塞及び浮腫の体積は、Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１０：２９０−２９３（１９９０））に基づいて算出された。
【００５１】
＜結果＞
図２Ａ〜図２Ｃは、ｔ−ＰＡ投与の脳梗塞軽減効果と、脳出血惹起効果とを示す脳冠状切片の写真である。黒色部分は、健常組織を示し、白色部分は、脳梗塞部分を示す。
血栓注入後ｔ−ＰＡを投与せずに２４時間経過すると、術側大脳に広範な脳梗塞が観察された（図２Ａ）。
血栓注入の１時間後にｔ−ＰＡを投与すると、ｔ−ＰＡ非投与動物と比較して脳梗塞部分の縮小が観察された（図２Ｂ）。
しかし、血栓注入の４時間後にｔ−ＰＡを投与すると、１時間後にｔ−ＰＡを投与した動物と比較して、脳梗塞部分の拡大と、前記部分での出血とが観察された（図２Ｃ）。
以上の結果から、前記ラット脳梗塞モデルは、ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と脳梗塞の増悪とを再現できることが示された。
【００５２】
（実施例２：抗ＶＥＧＦ抗体を用いたＶＥＧＦの発現抑制）
ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と、脳梗塞の増悪とを抑制又は軽減するために、１００μｇのウサギ抗ラットＶＥＧＦ抗体ＩｇＧ（ＲＢ−２２２、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ−Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ社製、以下、「抗ＶＥＧＦ抗体」と称することがある。）がｔ−ＰＡとともにボーラス投与された。対照実験では、１００μｇのウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｒ５Ｇ１０−０４８、ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製、以下、「対照抗体」と称することがある。）がｔ−ＰＡとともにボーラス投与された。
【００５３】
＜ウエスタン・ブロット法＞
ウエスタン・ブロット法は、全細胞抽出液をサンプルとして用いてＳｈｉｍｏｈａｔａ、 Ｔ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，２７：１４６３−１４７５ （２００７））に記載の方法に従って実施された。
ＶＥＧＦの検出には、１次抗体として抗ＶＥＧＦ抗体（ＳＣ−１５２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、希釈比１：２００）が、２次抗体としてペルオキダーゼ・コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈比１：１０，０００）が用いられた。
また、適用されたタンパク質の量がどのサンプルでも均一であることを確認するために、前記１次抗体及び前記２次抗体を除去した後のブロッティング膜に、抗β−アクチン抗体（ＳＣ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、希釈比１：２，０００）及び前記２次抗体を反応させてβ−アクチンが検出された。
【００５４】
＜結果＞
図３は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与後に、ＶＥＧＦの発現が抑制されたことを示すウエスタン・ブロット図である。
レーン１は、血栓注入による脳梗塞発症を行わなかった動物のサンプルを示し、レーン２は、血栓注入による脳梗塞発症を行わないでｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン３は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後に対照抗体のみを投与した動物のサンプルを示し、レーン４は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン５は、血栓注入による脳梗塞発症の１時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与した動物のサンプルを示し、レーン６は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した動物のサンプルを示し、レーン７は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併用投与した動物のサンプルを示す。
【００５５】
レーン３及びレーン４では、ＶＥＧＦの発現が観察された。レーン６では、非常に多くのＶＥＧＦの発現が観察された。一方、レーン１、レーン２、レーン５、及びレーン７では、ほとんどＶＥＧＦの発現は観察されなかった。
これらのレーンで検出されたＶＥＧＦ量の相違は、β−アクチンの量の相違とは全く相関しなかった。レーン３、レーン４、及びレーン５の比較から、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡを投与すると、ＶＥＧＦの発現量が非常に増大したことがわかった。また、レーン４とレーン５との比較、並びに、レーン６とレーン７との比較によって、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、ＶＥＧＦの発現を顕著に抑制したことがわかった。
【００５６】
虚血性血管内皮細胞障害と、その後の脳血液関門の機能不全とがｔ−ＰＡ投与後の脳出血に関係することが知られている。また、ＶＥＧＦは、ＭＭＰ−９を活性化し、活性化されたＭＭＰ−９は、ゾナオクルデンス−１や基底膜ＩＶ型コラーゲンのような脳血液関門に関与するタンパク質を分解することが知られている。したがって、理論的に拘泥するわけではないが、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の作用機序は、脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与によるＶＥＧＦの増加を抑制することによって、ＭＭＰ−９活性化のような脳血液関門の機能不全を防止して、脳出血を予防することで説明できる可能性がある。
【００５７】
（実施例３：ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の影響評価）
ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、実施例２で説明されたとおり実施された。血栓注入による脳梗塞発症から４時間後のｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与の効果は、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積、浮腫の体積、脳出血量、及び運動機能スケールを測定して評価された。
前記ＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積及び浮腫の体積は、Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｒ．Ａ．ら（Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．、１０：２９０−２９３（１９９０））に基づいて算出され、統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）にて検証され、事後比較（ｐｏｓｔ ｈｏｃ比較）は、Ｔｕｋｅｙ法で行った。
脳出血量は、分光光度計で術側脳組織１ｄＬ当たりのヘモグロビン濃度（単位：ｇ／ｄＬ）が測定された。
運動機能スケールは、Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｍ．ら（Ｓｔｒｏｋｅ、３０： １４６４−１４７１（１９９９））に基づいて５段階で評価された（段階０：運動障害なし、段階１：術側と反対側の前肢の屈曲、段階２：麻痺側へ身体を押し動かすことへの抵抗力の減少、段階３：麻痺側への自発的な回転、段階４：死亡）。運動機能スケールを比較する際の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）にて検証され、事後比較（ｐｏｓｔ ｈｏｃ比較）はＴｕｋｅｙ法で行った。
【００５８】
＜脳梗塞及び浮腫の体積と、脳出血量との結果＞
図４Ａ〜図４Ｃは、それぞれ、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後のＴＴＣ染色脳冠状切片の、脳梗塞の体積、浮腫の体積、及び脳出血量を示す棒グラフである。白色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後に対照抗体のみを投与した群で、黒色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群で、灰色の棒は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した群である。各群の個体数は６であった。
これらの結果から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した場合に比べて脳梗塞及び浮腫の体積を低減することはできなかったが、脳出血量を低減することはできた（Ｐ＝０．０１３）。
【００５９】
＜運動機能スケール評価結果＞
図４Ｄは、血栓注入による脳梗塞発症の２４時間後の運動機能スケールを示す帯グラフである。帯の異なる色の部分は、５段階のそれぞれの個体数を表す。左側の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後に対照抗体のみを投与した群（個体数２３）を示し、中央の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群（個体数２０）を示し、右側の帯は、血栓注入による脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を投与した群（個体数１２）を示す。
左側の帯と中央の帯との比較から、脳梗塞発症の４時間後にｔ−ＰＡ及び対照抗体を投与した群は、対照抗体のみを投与した群より予後が悪かった。この結果から、前記ラット脳梗塞モデルが、ヒトにおける脳梗塞急性期徒過後のｔ−ＰＡ投与に伴う、脳出血合併症と脳梗塞の増悪とを再現することを確認できた。
中央の帯と右側の帯との比較から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、ｔ−ＰＡ及び対照抗体の併合投与より予後が改善された（Ｐ＝０．０００１）。更に、左側の帯と右側の帯との比較から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併合投与は、対照抗体のみの投与よりも予後が改善された（Ｐ＝０．０４５）。
なお、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体を併合投与されたラット個体を病理学的に剖検したところ、抗原抗体複合体の存在は肝臓、膵臓及び腎臓に認められなかった。
【００６０】
以上の実験結果から、ｔ−ＰＡ及び抗ＶＥＧＦ抗体の併用投与は、脳梗塞を発症した患者において、ｔ−ＰＡを投与するまでの時間を従来よりも延長することができ、かつ、脳出血合併症を予防しつつ運動機能及び生存割合を改善できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の脳梗塞の治療用医薬品組成物は、脳梗塞急性期徒過後の患者にも投与できるため、脳梗塞の治療に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１ 外頸動脈（ＥＣＡ）
２ 中大脳動脈（ＭＣＡ）
３ 総頸動脈（ＣＣＡ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含むことを特徴とする、脳梗塞の治療用医薬品組成物。
【請求項２】
脳梗塞急性期徒過後の患者に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脳梗塞急性期は脳梗塞の発症から３時間以内であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記血栓溶解薬は組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記結合阻害剤は、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦの受容体の少なくともいずれかと特異的に結合して、該ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害する活性を有する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体と、これらの誘導体と、からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記結合阻害剤はＶＥＧＦ−Ａと結合することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ特異的結合パートナーは抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１】
血栓溶解薬、及び、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と前記ＶＥＧＦの受容体との結合を阻害する結合阻害剤を含むことを特徴とする、脳梗塞の治療用医薬品組成物。
【請求項２】
脳梗塞急性期徒過後の患者に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脳梗塞急性期は脳梗塞の発症から３時間以内であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記血栓溶解薬は組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記結合阻害剤は、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦの受容体の少なくともいずれかと特異的に結合して、該ＶＥＧＦのシグナル伝達を阻害する活性を有する、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体と、これらの誘導体と、からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記結合阻害剤はＶＥＧＦ−Ａと結合することを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ特異的結合パートナーは抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体又はその誘導体であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【公開番号】特開２０１１−４６６８４（Ｐ２０１１−４６６８４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２４３７４（Ｐ２０１０−１２４３７４）
【出願日】平成２２年５月３１日（２０１０．５．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 新潟県医師会報 平成２１年１月号 通巻 第７０６号 新潟県医師会会長 佐々木 繁 平成２１年１月２８日発行
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月３１日（２０１０．５．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 新潟県医師会報 平成２１年１月号 通巻 第７０６号 新潟県医師会会長 佐々木 繁 平成２１年１月２８日発行
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
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