免疫調節剤および免疫調節食品
【課題】 免疫系に直接作用し、低下した免疫機能を高めたり、またそのバランスを好ましい状態にすることのできる乳酸菌を見出し、これを有効成分とする免疫調節剤や免疫調節食品を提供すること。
【解決手段】 ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【解決手段】 ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低下した生体の免疫活性を高め、正常化する免疫調節剤および免疫調節食品に関し、更に詳細には、免疫活性を賦活することにより、例えば、サルモネラ菌などの食中毒菌の感染を予防、治療することができ、また、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する効果をも有する免疫調節剤および免疫調節食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫活性は、生体の防御機能として重要な役目を果たしているが、現代人は、不規則な生活、ストレス、過剰な清潔志向といったライフスタイルの変化が原因で、免疫力に変調をきたしていると言われている。その例として、近年の結核菌感染者の増加や大腸菌０１５７、サルモネラなどを原因とする食中毒発生の増加など、感染症に対するバリアーが低くなる一方、花粉症をはじめとするアレルギー疾患も増加しており、現代人の免疫力を正常化することが大きな課題となっている。
【０００３】
感染症のうち、サルモネラ菌によるものは、ヒトの急性胃腸炎として最も重要なものの一つであり、その症状は、悪寒、高熱、嘔吐、下痢、腹痛等を伴い、感染後数時間から２４時聞後に発症し、その症状は一般に重く、回復が遅いという特徴がある。この疾患に対する治療法は、通常、抗生物質の投与であるが、抗生物質の投与には副作用のおそれがあり、また、耐性菌の出現も予想されるため好ましくない。
【０００４】
そこで、このような病原菌による感染症を予防するため、あらかじめ生体の免疫力を向上させることが検討されている。このように免疫力を向上させるために使用する免疫賦活剤としては、種々の天然成分が検討されており、その一つとして微生物あるいはその成分の使用が広く行われている。
【０００５】
ところで、免疫賦活のために使用される微生物は、それ自体が安全性を有するものである必要があり、古くから発酵食品の製造に使用されている乳酸菌が注目されつつある。この乳酸菌の使用に関しては、例えばラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を経口投与する食中毒菌感染予防(特許文献１)や、ラクトバチルス・プランタラムと茶抽出物と組み合わせた発酵生成物の形で投与する方法(特許文献２)が知られている。
【０００６】
しかし、これらは経ロ摂取あるいは経口投与により、免疫機能に直接作用して食中毒菌感染を予防および/または治療するものとはいえず、直接免疫系に作用し、免疫機能を高めたり、好ましいバランスにする免疫調節機能を有する乳酸菌の提供が求められている。
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０２７０３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明は、免疫系に直接作用し、低下した免疫機能を高めたり、またそのバランスを好ましい状態にすることのできる乳酸菌を見出し、これを有効成分とする免疫調節剤や免疫調節食品の提供をその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の性質を有するラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）に属する微生物は、これを経口投与することにより、免疫機能を高めることができ、サルモネラ菌等による食中毒を予防することができ、また、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスを正常化させることも可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤である。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ（Dehydratase）活性を示す。
【００１１】
また本発明は、上記性質を有するラクトバチルス・ロイテリに属する微生物を有効成分とする免疫調節食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の免疫調節剤および免疫調節食品の有効成分である微生物は、乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリに属するものであり、安全性の高いものである。
【００１３】
従って、上記微生物を有効成分とする免疫調節剤や免疫調節食品を摂取することにより、低下した免疫機能を回復し、正常化して疾病を予防、治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の免疫調節剤および免疫調節食品（以下、「免疫調節剤等」ということがある）の有効成分である微生物は、乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリに属するものであり、以下の性質を有するものである。
【００１５】
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【００１６】
上記の性質を有するラクトバチルス・ロイテリに属する微生物（以下、「本発明乳酸菌」ということがある）は、ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物を、例えば、次のスクリーニング法に付すことによりデハイドラターゼ活性を調べ、これからその活性が湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のものを選抜することにより取得することができる。
【００１７】
デハイドラターゼ活性の測定法：
デハイドラターゼ活性の測定は３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone ；MBTH）法を用いて行った（Toraya, T., K. Ushio, S. Fukui, and H. P. C. Hogenkamp., Studies on the mechanism of the adenosylcobalamin-dependent dioldehydrase reaction by the use of analogs of the coenzyme., J. Biol. Chem., 252:963-970. 1977.）。ＭＢＴＨ法は、デハイドラターゼによって産生された３−ＨＰＡをＭＢＴＨと反応させ、形成されたアジン誘導体を分光光度計により検出する方法である。０.２Ｍグリセロール、０.０５Ｍ ＫＣｌ、０.０３５Ｍ リン酸カリウムバッファー (pH 8.0)、１５μＭ ＡｄｏＣｂｌおよび適正量のデハイドラターゼを含んだ混合液を３７℃、１０分間静置した。０.１Ｍ クエン酸カリウムバッファー (pH 3.6)と０.５ｍｌのＭＢＴＨを添加し反応を止め、３７℃、１５分間静置後、３０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１８】
このような性質を持った本発明乳酸菌の代表的なものとしては、理化学研究所の標準株であるラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを挙げることができる。
【００１９】
本発明の免疫調節剤は、上記の本発明乳酸菌を、経ロ投与可能で生きたまま腸管に到遠させうる生菌剤とすることにより調製される。この剤形については特に制約はなく、例えば、粉末剤、顆粒、錠剤、カプセル剤などの固形、ゼリー、ペーストなどの半固形、懸濁液、シロップなどの液状であってもよい。これらの各剤形は製薬分野で公知の方法により製造することができる。
【００２０】
上記免疫調節剤に配合される本発明乳酸菌は、公知の乳酸菌の培養方法を適用して培養を行うことができる。この培養方法としては、常法に従い本発明乳酸菌を液体培養し、得られた培養物をそのまま利用しても、また、この培養物から遠心分離等の手段により菌体を集めて用いても、あるいは培養物を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いてもよい。
【００２１】
固形状である本発明免疫調節剤の一般的な製法としては、本発明乳酸菌を、水、デンプン、微細結晶セルロース、小麦粉、砂糖などの担体とともに配合し、所望の形態とする方法が挙げられる。上記担体も公知であり、使用形態に合わせ、適宜選択して使用することができる。より具体的には、常法により培養して得られた本発明乳酸菌菌体を凍結乾燥粉末とし、これを砂糖と混合することにより粉末剤を調製してもよい。また、本発明乳酸菌菌体を適切な錠剤用担体とともに混合し、これを常法に従って打錠して錠剤を得ることもできる。更に、本発明乳酸菌の湿菌体をシロップ中に懸濁してシロップ剤としてもよい。本発明の免疫調節剤の調製に当たっては、必要に応じて他の成分、例えば、他の微生物や有効成分、あるいは甘味料、香料、着色剤などを含有していてもよい。
【００２２】
上記のようにして得られる免疫調節剤の投与量は、対象の身体的状況、例えば健康状態、体重、年齢、既往症、使用される他の成分などを考慮して、適宜決定することができるが、一般的には本発明乳酸菌の菌数として、大人一人当たりおおよそ１０９ＣＦＵ／日程度前後である。
【００２３】
また、本発明乳酸菌を使用して免疫調節食品を調製するには、従来公知の乳酸菌の培養方法を利用して経口摂取可能な発酵食品とすればよい。具体的には、ヨーグルトなどの発酵乳、乳酸菌飲料、発酵ソーセージなどの食品とすることができ、これらの食品の製造は、使用乳酸菌の1部または全部を本発明乳酸菌とすることにより行うことができる。また、本発明乳酸菌をより多く含む形態とし、健康食品や機能性食品とすることもできる。この免疫調節食品の調製に当たっては、本発明乳酸菌単独でなく他の乳酸菌を含んでいても良いことは言うまでもなく、また、食品添加物または調味料などを加えてもよい。
【００２４】
本発明乳酸菌は、生体の免疫活性を向上させ、種々の病原性微生物の感染、例えば、食中毒菌の感染および臓器への侵入を抑え、感染症を予防、治療するものである。これら病原性微生物の例としては、サルモネラ菌、血清型O157をはじめとする病原性大腸菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ菌、アエロモナス菌、カンピロバクター菌、ウエルシュ菌、セレウス菌、エルシニア菌、プレシオモナス菌、クリプトスポリジウム菌などが挙げられる
【００２５】
また、本発明乳酸菌は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善することも可能である。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
【００２７】
実 施 例 １
Ｌ.ロイテリＪＣＭ１１１２ＴのＳ.エンテリティディス感染防御能試験：
下記の材料および方法により、Ｌ.ロイテリＪＣＭ１１１２ＴのＳ.エンテリティディス感染防御能を調べた。
【００２８】
使用材料および試験方法：
（１）使用実験動物
ＳＰＦグレードのウイスター（Wistar）系ラット（８週齢−雄；日本ＳＬＣ株式会社）の体重約１８０〜２００ｇのものを使用し、実験室搬入日より７日間の馴致期間を設け、実験を開始した。飼育環境は、温度２２±１℃、湿度５５±５％、照明時間１２時間（８時〜２０時）に設定し、ラットは１匹／ゲージとし、滅菌蒸留水を給水瓶にて、またラット用放射線滅菌固形試料（ＣＥ−２、日本クレア）を給餌器にて、それぞれ自由摂取とした。用いた飼育器具はすべて高圧蒸気滅菌器により滅菌したものを使用した。
【００２９】
（２）Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの調製およびその投与
被験菌として用意した、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔ（理化学研究所の標準菌であり、同所より分譲を受けた）は、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｉｄ）に接種して３７℃で一晩培養し、プレ培養液とした。新たなＭＲＳ液体培地に１％量の上記プレ培養液を添加し、３７℃で１８時間培養したものを投与菌液とした。この投与菌液は、感染前９日間（１日１回、午前１０時）および感染後２時間の合計１０回、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与し、これをＪＣＭ１１１２投与群とした。投与菌液は用時調製し、投与菌量はラット１匹当り１０９ＣＦＵとした。また、２つのコントロール群（コントロール群および感染コントロール群）には同容量のＰＢＳを投与した。
【００３０】
（３）サルモネラ・エンテリティディス感染モデル動物
イスラム(Islam)らおよびハベラー(Havelaar)らの方法に準じて各種条件を設定した。
サルモネラ・エンテリティディスは、ヒトの食中毒患者から分離されたＳ３８１株を供試した。この微生物は、まず、普通培地（栄研化学社製）に接種し、３７℃で一晩培養したものをプレ培養液とした。新たな普通培地に１％量の上記プレ培養液を添加し、３７℃で１８時間培養したものを菌体培養液とした。投与前日から１２時間の絶食を行なった、ＪＣＭ１１１２投与群と感染コントロール群のラットに、日本クレア株式会社フレキシブルラット用経口ゾンデ（ＲＺ−１）を用い、Ｓ.エンテリティディス投与を行った。すなわち、菌体培養液５００μｌ（１〜２×１０９ＣＦＵ）をシリンジに吸引した後、直ちに６％重炭酸ナトリウム溶液を重層するように静かに吸引し、即座にラット胃内へ投与した。６％重炭酸ナトリウム溶液投与は胃酸中和による感染率向上を目的として行った。菌体培養液（Ｓ.エンテリティディス）の投与後、直ちに絶食を解除し、５日間通常飼育した後、剖検を行った。
【００３１】
（４）供試動物の剖検
実験終了後、飼育施設併設の実験室でラットを安楽死させ、心採血した後に放血し、腹腔内をハンクス(Hanks)液にて洗浄して遊離マクロファージを回収した。最後に肝臓、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を摘出した。ラットから摘出した脾臓は、あらかじめカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加したインビトロゲン（Invitrogen）社のＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地）２ｍｌを分注した１５ｍｌポリプロピレンチューブに入れ、細胞培養施設に運搬した。
【００３２】
（５）肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器侵入Ｓ.エンテリティディス菌数の測定
Ｓ.エンテリティディスの生体内への侵入を評価するために、肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器重量１ｇ当たりの菌数を算出した。摘出した各臓器は全量をホモジナイズし、生理食塩水を用いて段階希釈した後に普通寒天培地に塗抹した。１平板当たり３０〜３００コロニーが得られた希釈段階平板を選択し、その希釈段階の平板３枚の平均値をその臓器におけるＳ.エンテリティディスの生菌数とした。
【００３３】
（６）末梢血単球および腹腔マクロファージ貪食活性の測定
(ａ)末梢血単球の分離
採血後直ちに４.５％デキストラン溶液を添加し、３０分静置後、白血球層を分取した。ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地で２回洗浄してデキストランを除去した後、１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ添加した。３７℃、５％炭酸ガス下で２時間培養し、ウェル底面に付着した細胞を単球として貪食活性の測定を行った。
【００３４】
(ｂ)腹腔マクロファージの分離
腹腔洗浄液を遠心分離し、得られた細胞をＲＰＭＩ１６４０−ｋｍ培地で２回洗浄した後に１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ添加した。３７℃、５％炭酸ガス下で２時間培養し、ウェル底面に付着した細胞を腹腔マクロファージとして貪食活性の測定を行った。
【００３５】
(ｃ)蛍光ビーズの貪食
マイクロプレートに付着した単球あるいはマクロファージをＰＢＳで洗浄後、これに２.５％蛍光ラテックス微小粒子液（POLYSCIENCE Inc.：直径１μｍ）を０.５％含むＲＰＭＩ１６４０−ｋｍ培地を添加し、３７℃、５％炭酸ガス下で１時間、ビーズを貪食させた。
【００３６】
(ｄ)貪食活性の測定
反応後のマイクロプレートをＰＢＳで２回洗浄し、フルオロマーク・マイクロプレート・フルオロメーター（ Fluoromark Microplate Fluorometer ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で各ウェルの蛍光強度を測定した。測定時のゲイン設定は３５とした。
【００３７】
（７）ＦＣＭによるヘルパーＴ細胞の測定
(ａ)ラット脾臓からのリンパ球の分離
ＲＰＭ１６４０−Ｋｍ培地に浸漬した脾臓を９０ｍｍディッシュに移した後に、ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地３ｍｌを添加し、小尖刀で脾臓を十分細切し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を、臓器片を除くために２００番ナイロンメッシュを通して新しい１５ｍｌチューブに移した。再度、ディッシュに５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地を添加し、残った脾臓を同様に処理し、細胞を同じ１５ｍｌチューブに移した。
【００３８】
脾細胞懸濁液にはリンパ球以外に赤血球、顆粒球など多種の細胞が含まれるため、パーコール（Percoll）（Amersham Bioscience Corp.）を用いた密度勾配分離法によりリンパ球のみ分離した。比重は市販のラット用リンパ球分離液リンフォライト−Ｍ（大日本製薬）を参考に１.０９４０とした。
【００３９】
(ｂ)リンパ球の活性化
分離したリンパ球を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地に懸濁し、２５ｃｍ２培養フラスコに移した後、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。１０時間後にリンパ球刺激物質として９ｍｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Phytohaemagglutinin；ＰＨＡ）溶液（Murex Biotech Ltd.）を１００μｌ添加し、８時間インキュベートした。
【００４０】
(ｃ)抗体による染色
抗体による細胞表面抗原染色、細胞膜透過処理および細胞内サイトカイン染色については、渋谷の著書を参考にした。以下にその方法を具体的に示す。
(ｉ)ＰＨＡを添加してインキュベーション後、６時間経過時に、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるようブレフェルディンＡ溶液（Sigma-Aldrich Inc.）を添加した。
(ii)フラスコを氷上に置き、反応を止めた後、細胞を１５ｍｌチューブに移して冷ＰＢＳで２回洗浄した。
(iii)１０６ｃｅｌｌ／５０μｌになるようにＰＢＳで懸濁し、Ｃｙ５標識抗ラットＣＤ４抗体（５５４８３９：BD Bioscience）を１０μｌ添加し、室温、遮光下で３０分間静置した。
(iv)１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ ２５０μｌで懸濁、等量の固定液（４％ホルムアルデヒド溶液）を加えてよく混合し、室温、遮光下で２０分間静置した。
(ｖ)冷ＰＢＳで２回洗浄して、遠心後、上清を除去した後に、細胞膜透過用バッファー（０.５％サポニン、０.５％ウシ血清アルブミン、０.１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ溶液）を１５０μｌ加え、細胞をピペッティングし、室温で１０分間静置した。
(vi)遠心後、上清を除去し、冷ＰＢＳ ５０μｌで懸濁後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩＦＮ−γ抗体（５５９４９８：BD Bioscience）２０μｌ、ＰＥ標識抗ラットＩＬ４抗体（５５５０８２：BD Bioscience）１０μｌをそれぞれ加え、室温で３０分間インキュベートした。
(vii)０.５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で細胞を洗浄後、再度０.５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌに懸濁し、ＦＣＭ解析を行った。
【００４１】
（ｄ）ＦＣＭによる解析
解析にはベックマン・コールター・エピクス(BECKMAN COULTER EPICS) ＸＬデジタルフローサイトメーターを用い、細胞５,０００個当たりの各ヘルパーＴ細胞の数を求めた。
【００４２】
（８）白血球数測定
心採血した血液２ｍｌをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）採血管に移して凝固阻止した後、各白血球数は自動血球計算計を用いて測定した。白血球は、桿状核好中球、分葉核好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球に細分した。
【００４３】
（９）統計処理
Ｔ検定を行い、統計的有意差は、ｐ＜０.０５の場合を有意であるとした。体重および体重増減は群毎の平均値および標準誤差を算出した。
【００４４】
結果および考察：
（１）体重変化
（ａ）−９日目〜−１日目
被検菌であるＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを９日間投与した群（ＪＣＭ１１１２群）と、これを投与しなかった群（感染コントロール群）の体重増加量を図１に示した。ＪＣＭ１１１２投与群は、感染コントロール群に比べ、体重の増加量が大きかった。その要因としては、Ｌ.ロイテリがラット腸管内での生残性が高く、良好な結果が得られたものと考えられた。
【００４５】
（ｂ）０日目〜５日目
被検菌投与１０日目のＳ.エンテリティディス（１０９／ｒａｔ）接種を０日として、剖検までの５日間の各群のラットの体重増加量を図２に示した。 コントロール群、感染コントロール群の両コントロール群に対して、ＪＣＭ１１１２投与群では体重の増加はみられたものの、有意差は認められなかった。
【００４６】
（ｃ）−９日目〜５日目までの体重推移
この期間の増体量の推移において、感染コントロール群における０〜２日目にかけての増体量が減少しなかったのは、物理的、化学的バリアとしての腸管上皮をＳ.エンテリティディスが突破し、ラット生体内へ侵入する時期と考えられ、腸管から体内へ侵入したＳ.エンテリティディスはリンパ行性に腸間膜リンパ節、さらにリンパ管を走行して、あるいは血行性に各種臓器へ移行し、３〜４日目には各臓器でＳ.エンテリティディスが増殖、それが２度目の増体量低下に影響したと考えられた。ＪＣＭ１１１２投与群は、急激な体重増加はないものの、前述の３〜４日目付近にみられる一時的な増体量の落ち込みや大きな変化がなく、滑らかに増体が増加している。この菌株では、増体量に関して明らかにＳ.エンテリティディス感染パターンとは異なっており、感染の影響に差があることが伺える。
【００４７】
（２）肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器侵入Ｓ.エンテリティディス菌数の測定
各臓器から検出されたＳ.エンテリティディス生菌数を図３に示した。ＭＬＮでは各試験群とも減少傾向ではあったが、１０５レベルとＳ.エンテリティディス生菌数に大きな差は認められなかった。これは、明確な感染を目的としたモデル系であるためにラットへのＳ.エンテリティディス投与菌数が１０９ＣＦＵと、ヒトでの一般的な感染成立菌数よりもはるかに多く、腸管上皮やパイエル板に侵入するＳ.エンテリティディスが好中球や組織マクロファージ、単球由来マクロファージといった貪食細胞の動員で防御可能な菌数を上回っており、感染局所である腸管から最も近傍のリンパ節であるＭＬＮへ大量のＳ.エンテリティディスが侵入したことが要因ではないかと考えられる。
【００４８】
脾臓に関して、ＪＣＭ１１１２群は感染コントロール群との間で有意差がなかった。一方、肝臓では、ＪＣＭ１１１２群において感染コントロール群に対し１／１０程度の１０４ＣＦＵにまでＳ.エンテリティディス菌数が減少している。
【００４９】
被検菌による感染防御の差異は、貪食細胞の活性化誘導能およびそれ以降の適応免疫の強度に現れ、結果として肝臓、脾臓の侵入菌数に影響を及ぼすものと推測される。
【００５０】
（３）末梢血単球および腹腔マクロファージの貪食能
腸管感染に対して、単球およびマクロファージは以下に示すメカニズムによって活性化される。すなわち、腸管上皮への抗原（本研究ではＳ.エンテリティディス、あるいはＬ. ロイテリ）の付着刺激で上皮細胞から産生されるＩＬ−８やＬＡＲＣによって局所に遊走する単球や、パイエル板のＭ細胞に取り込まれた後にマクロファージや樹状細胞によって、マンノースレセプター、βグルカンレセプター、ＴＬＲ２、補体レセプターなどを介した抗原の貪食、細胞内プロセッシングとＭＨＣクラスIIへの結合と提示が行われると同時にＩＬ−１２が産生される。
【００５１】
また、血中の単球は樹状細胞（ＤＣ１）にも分化し、上皮細胞により産生されたβディフェンシンにより集合した未熟樹状細胞も加わり、マクロファージと同様に抗原提示され、ＩＬ−１２の産生を行う。自ら産生するＩＬ−１２に反応したマクロファージや樹状細胞はＩＦＮ−γを産生し、ＩＦＮ−γはさらにマクロファージや樹状細胞を活性化してＩＬ−１２産生を増強するといったオートクリン活性化機構が存在する。ＩＦＮ−γによって活性化されたマクロファージは貪食能が高まるとともに一酸化窒素などを産生することによって強力な殺菌作用を示す。
【００５２】
図４のＡは、末梢血単球、Ｂは腹腔マクロファージの貪食能測定結果を示す図面である。末梢血単球ではＪＣＭ１１１２群で貪食能の向上が認められたものの、感染コントロール群に対して有意差は得られなかった。
【００５３】
ヒトのサルモネラ感染症患者では、血清中のＩＦＮ−γが胃腸炎型よりも全身型で高値になることが報告されており、本感染モデルでも感染局所で産生されたＩＬ−１２とＩＦＮ−γが血流に乗り、その拡散とともに末梢血単球の活性化が誘導されて組織マクロファージの一種である腹腔マクロファージの活性化に至るものと考えられている。
【００５４】
（４）Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス
一般にウイルス、リステリア菌、抗酸菌、サルモネラ菌などの細胞内寄生菌による感染症では、その感染防御にＣＴＬや武装化マクロファージが関与している。そのため、ＣＴＬ増殖、マクロファージ武装化を担うＩＬ−２やＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞が重要な働きをもつ。本研究のＳ.エンテリティディス感染症ではＴｈ１優位の免疫状態へとシフトする必要があるが、Ｔｈ１反応の持続あるいは過剰すぎることは自己免疫性疾患の要因とも考えられていることから、必要十分なＴｈ１反応を誘導し、かつ治癒と同時に速やかに健常状態のＴｈ１／Ｔｈ２バランスに復帰することが求められる。つまり、結果として、各被検菌投与により、コントロール群の総細胞数および細胞種比率に近づいたかという点が最も注目される。
【００５５】
図５は、各ラット群でのヘルパーＴ細胞数を示す。また、下記表１にその結果に対する統計評価を示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
被験菌を投与した群において、有意なＴｈ１細胞増加とＴｈ２細胞減少によるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの改善が認められた。すなわち、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔはコントロール群と比較してもＴｈ１優位状態を示し、Ｓ.エンテリティディス感染５日目にして、Ｔｈ１細胞によるＣＴＬおよびマクロファージの活性化による細胞性免疫が速やかに誘導され、感染防御に貢献していることを示している。
【００５８】
（５）白血球数
表２に各ラット群における白血球等の数を示した。Ｓ.エンテリティディスを接種した群（感染コントロール群）では、コントロール群と比較して、反応性の好中球および単球の増加が認められた。ＪＣＭ１１１２群では感染コントロール群に対しても好中球と単球の増加が認められ、桿状好中球増加による好中球新生も示唆されることから、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔによる自然免疫の誘導がなされていることを示している。
【００５９】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明乳酸菌の代表であるＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを使用した上記実施例の結果から、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔ投与群では、Ｓ.エンテリティディス接種後の体重増加率も良く、Ｓ.エンテリティディス臓器侵入菌数も全項目で低下していたことが明らかになった。また、好中球数増加、単核食細胞活性化に対しての作用が弱く、有意差は得られなかったが、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善に特化した特徴を示した。これは、メカニズムとして花粉症対策としても役立つことが示された。
【００６１】
このように、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの投与は、好中球、単球、マクロファージなどによる自然免疫の活性化から、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの改善まで広範囲にわたる作用みられた。従って、本発明乳酸菌の作用は、薬剤などにみられる局所的な効果ではなく、病的状態を健常範囲内に復帰させる、つまり、ホメオスタシスの維持に効果的であることが推察された。したがって、上記効果の認められたプロバイオティクスを長期に渡って摂取することによって、病原菌の侵入を事前に防御し、生体の健康を増進することが可能となる。
【００６２】
なお、本発明のＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの全ゲノム配列からのグリセロール代謝マップを図６として示す。Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔにはジハイドオキシアセトン・キナーゼ（dihydroxyacetone kinase）がない。
【００６３】
これに対し、シトバクター・フラウンデイ（Citrobacter freundii）は、グリセロールのみで生育するが、L. ロイテリにはないジハイドオキシアセトン・キナーゼを持っているので、グリセロールから解糖系に入る経路があると考えられている。この細菌において、その1つ前の酵素グリセロール・デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤからＮＡＤＨに変換して酵素活性を示す。その場合、ＮＡＤＨをＮＡＤに戻す必要がある。シトバクター・フラウンデイは、そのＮＡＤを得るためにｐｄｕ経路から１,３−プロパンジオール・デヒドロゲナーゼがあると考えられている。結局、ＮＡＤＨとＮＡＤの収支計算が合う。例えば有名な解糖系でも、その反応の中でＮＡＤとＮＡＤＨの収支が合うようになっている。
【００６４】
また、グリセロール代謝マップ中Ｃカテゴリーにおいて、グルコースの代表的な代謝経路である解糖系と比較すると、L. ロイテリには、６−ホスホフルクトキナーゼ（6-phosphofructokinase）がない。一方、ヘテロ発酵Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓには、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(fructose-bisphosphate aldolase)遺伝子がないと文献に記載されているが、L. ロイテリにはこの遺伝子が存在する。このカテゴリー内において、酢酸が菌体外に放出される系では、ＮＡＤとＮＡＤＨの収支は合っている。しかしながら、その過程で酢酸が代謝され、アセトアルデヒドができるとＮＡＤが産生される。この経路によって、ＡカテゴリーからＣカテゴリーに入ったグリセロール代謝経路にＮＡＤが供給され、グリセロール１分子とグルコース１分子とから、３ＡＴＰが産生される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】−９日目から−１日目における、各ラット群の増体量を示す図面である。
【図２】０日目から５日目における、各ラット群の増体量を示す図面である。
【図３】各ラット群の、各臓器中のＳ.エンテリティディス生菌数を示す図面である。
【図４】各ラット群での末梢血単球（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）の貪食能を示す図面である。
【図５】各ラット群のヘルパーＴ細胞数を示す図面である。
【図６】Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの全ゲノム配列からのグリセロール代謝マップを示す図面である。 以 上
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低下した生体の免疫活性を高め、正常化する免疫調節剤および免疫調節食品に関し、更に詳細には、免疫活性を賦活することにより、例えば、サルモネラ菌などの食中毒菌の感染を予防、治療することができ、また、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調整する効果をも有する免疫調節剤および免疫調節食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫活性は、生体の防御機能として重要な役目を果たしているが、現代人は、不規則な生活、ストレス、過剰な清潔志向といったライフスタイルの変化が原因で、免疫力に変調をきたしていると言われている。その例として、近年の結核菌感染者の増加や大腸菌０１５７、サルモネラなどを原因とする食中毒発生の増加など、感染症に対するバリアーが低くなる一方、花粉症をはじめとするアレルギー疾患も増加しており、現代人の免疫力を正常化することが大きな課題となっている。
【０００３】
感染症のうち、サルモネラ菌によるものは、ヒトの急性胃腸炎として最も重要なものの一つであり、その症状は、悪寒、高熱、嘔吐、下痢、腹痛等を伴い、感染後数時間から２４時聞後に発症し、その症状は一般に重く、回復が遅いという特徴がある。この疾患に対する治療法は、通常、抗生物質の投与であるが、抗生物質の投与には副作用のおそれがあり、また、耐性菌の出現も予想されるため好ましくない。
【０００４】
そこで、このような病原菌による感染症を予防するため、あらかじめ生体の免疫力を向上させることが検討されている。このように免疫力を向上させるために使用する免疫賦活剤としては、種々の天然成分が検討されており、その一つとして微生物あるいはその成分の使用が広く行われている。
【０００５】
ところで、免疫賦活のために使用される微生物は、それ自体が安全性を有するものである必要があり、古くから発酵食品の製造に使用されている乳酸菌が注目されつつある。この乳酸菌の使用に関しては、例えばラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を経口投与する食中毒菌感染予防(特許文献１)や、ラクトバチルス・プランタラムと茶抽出物と組み合わせた発酵生成物の形で投与する方法(特許文献２)が知られている。
【０００６】
しかし、これらは経ロ摂取あるいは経口投与により、免疫機能に直接作用して食中毒菌感染を予防および/または治療するものとはいえず、直接免疫系に作用し、免疫機能を高めたり、好ましいバランスにする免疫調節機能を有する乳酸菌の提供が求められている。
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０２７０３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明は、免疫系に直接作用し、低下した免疫機能を高めたり、またそのバランスを好ましい状態にすることのできる乳酸菌を見出し、これを有効成分とする免疫調節剤や免疫調節食品の提供をその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の性質を有するラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）に属する微生物は、これを経口投与することにより、免疫機能を高めることができ、サルモネラ菌等による食中毒を予防することができ、また、Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスを正常化させることも可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤である。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ（Dehydratase）活性を示す。
【００１１】
また本発明は、上記性質を有するラクトバチルス・ロイテリに属する微生物を有効成分とする免疫調節食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の免疫調節剤および免疫調節食品の有効成分である微生物は、乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリに属するものであり、安全性の高いものである。
【００１３】
従って、上記微生物を有効成分とする免疫調節剤や免疫調節食品を摂取することにより、低下した免疫機能を回復し、正常化して疾病を予防、治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の免疫調節剤および免疫調節食品（以下、「免疫調節剤等」ということがある）の有効成分である微生物は、乳酸菌であるラクトバチルス・ロイテリに属するものであり、以下の性質を有するものである。
【００１５】
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【００１６】
上記の性質を有するラクトバチルス・ロイテリに属する微生物（以下、「本発明乳酸菌」ということがある）は、ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物を、例えば、次のスクリーニング法に付すことによりデハイドラターゼ活性を調べ、これからその活性が湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のものを選抜することにより取得することができる。
【００１７】
デハイドラターゼ活性の測定法：
デハイドラターゼ活性の測定は３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone ；MBTH）法を用いて行った（Toraya, T., K. Ushio, S. Fukui, and H. P. C. Hogenkamp., Studies on the mechanism of the adenosylcobalamin-dependent dioldehydrase reaction by the use of analogs of the coenzyme., J. Biol. Chem., 252:963-970. 1977.）。ＭＢＴＨ法は、デハイドラターゼによって産生された３−ＨＰＡをＭＢＴＨと反応させ、形成されたアジン誘導体を分光光度計により検出する方法である。０.２Ｍグリセロール、０.０５Ｍ ＫＣｌ、０.０３５Ｍ リン酸カリウムバッファー (pH 8.0)、１５μＭ ＡｄｏＣｂｌおよび適正量のデハイドラターゼを含んだ混合液を３７℃、１０分間静置した。０.１Ｍ クエン酸カリウムバッファー (pH 3.6)と０.５ｍｌのＭＢＴＨを添加し反応を止め、３７℃、１５分間静置後、３０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１８】
このような性質を持った本発明乳酸菌の代表的なものとしては、理化学研究所の標準株であるラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを挙げることができる。
【００１９】
本発明の免疫調節剤は、上記の本発明乳酸菌を、経ロ投与可能で生きたまま腸管に到遠させうる生菌剤とすることにより調製される。この剤形については特に制約はなく、例えば、粉末剤、顆粒、錠剤、カプセル剤などの固形、ゼリー、ペーストなどの半固形、懸濁液、シロップなどの液状であってもよい。これらの各剤形は製薬分野で公知の方法により製造することができる。
【００２０】
上記免疫調節剤に配合される本発明乳酸菌は、公知の乳酸菌の培養方法を適用して培養を行うことができる。この培養方法としては、常法に従い本発明乳酸菌を液体培養し、得られた培養物をそのまま利用しても、また、この培養物から遠心分離等の手段により菌体を集めて用いても、あるいは培養物を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いてもよい。
【００２１】
固形状である本発明免疫調節剤の一般的な製法としては、本発明乳酸菌を、水、デンプン、微細結晶セルロース、小麦粉、砂糖などの担体とともに配合し、所望の形態とする方法が挙げられる。上記担体も公知であり、使用形態に合わせ、適宜選択して使用することができる。より具体的には、常法により培養して得られた本発明乳酸菌菌体を凍結乾燥粉末とし、これを砂糖と混合することにより粉末剤を調製してもよい。また、本発明乳酸菌菌体を適切な錠剤用担体とともに混合し、これを常法に従って打錠して錠剤を得ることもできる。更に、本発明乳酸菌の湿菌体をシロップ中に懸濁してシロップ剤としてもよい。本発明の免疫調節剤の調製に当たっては、必要に応じて他の成分、例えば、他の微生物や有効成分、あるいは甘味料、香料、着色剤などを含有していてもよい。
【００２２】
上記のようにして得られる免疫調節剤の投与量は、対象の身体的状況、例えば健康状態、体重、年齢、既往症、使用される他の成分などを考慮して、適宜決定することができるが、一般的には本発明乳酸菌の菌数として、大人一人当たりおおよそ１０９ＣＦＵ／日程度前後である。
【００２３】
また、本発明乳酸菌を使用して免疫調節食品を調製するには、従来公知の乳酸菌の培養方法を利用して経口摂取可能な発酵食品とすればよい。具体的には、ヨーグルトなどの発酵乳、乳酸菌飲料、発酵ソーセージなどの食品とすることができ、これらの食品の製造は、使用乳酸菌の1部または全部を本発明乳酸菌とすることにより行うことができる。また、本発明乳酸菌をより多く含む形態とし、健康食品や機能性食品とすることもできる。この免疫調節食品の調製に当たっては、本発明乳酸菌単独でなく他の乳酸菌を含んでいても良いことは言うまでもなく、また、食品添加物または調味料などを加えてもよい。
【００２４】
本発明乳酸菌は、生体の免疫活性を向上させ、種々の病原性微生物の感染、例えば、食中毒菌の感染および臓器への侵入を抑え、感染症を予防、治療するものである。これら病原性微生物の例としては、サルモネラ菌、血清型O157をはじめとする病原性大腸菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ菌、アエロモナス菌、カンピロバクター菌、ウエルシュ菌、セレウス菌、エルシニア菌、プレシオモナス菌、クリプトスポリジウム菌などが挙げられる
【００２５】
また、本発明乳酸菌は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを改善することも可能である。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
【００２７】
実 施 例 １
Ｌ.ロイテリＪＣＭ１１１２ＴのＳ.エンテリティディス感染防御能試験：
下記の材料および方法により、Ｌ.ロイテリＪＣＭ１１１２ＴのＳ.エンテリティディス感染防御能を調べた。
【００２８】
使用材料および試験方法：
（１）使用実験動物
ＳＰＦグレードのウイスター（Wistar）系ラット（８週齢−雄；日本ＳＬＣ株式会社）の体重約１８０〜２００ｇのものを使用し、実験室搬入日より７日間の馴致期間を設け、実験を開始した。飼育環境は、温度２２±１℃、湿度５５±５％、照明時間１２時間（８時〜２０時）に設定し、ラットは１匹／ゲージとし、滅菌蒸留水を給水瓶にて、またラット用放射線滅菌固形試料（ＣＥ−２、日本クレア）を給餌器にて、それぞれ自由摂取とした。用いた飼育器具はすべて高圧蒸気滅菌器により滅菌したものを使用した。
【００２９】
（２）Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの調製およびその投与
被験菌として用意した、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔ（理化学研究所の標準菌であり、同所より分譲を受けた）は、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｉｄ）に接種して３７℃で一晩培養し、プレ培養液とした。新たなＭＲＳ液体培地に１％量の上記プレ培養液を添加し、３７℃で１８時間培養したものを投与菌液とした。この投与菌液は、感染前９日間（１日１回、午前１０時）および感染後２時間の合計１０回、ラット用経口ゾンデを用いて強制経口投与し、これをＪＣＭ１１１２投与群とした。投与菌液は用時調製し、投与菌量はラット１匹当り１０９ＣＦＵとした。また、２つのコントロール群（コントロール群および感染コントロール群）には同容量のＰＢＳを投与した。
【００３０】
（３）サルモネラ・エンテリティディス感染モデル動物
イスラム(Islam)らおよびハベラー(Havelaar)らの方法に準じて各種条件を設定した。
サルモネラ・エンテリティディスは、ヒトの食中毒患者から分離されたＳ３８１株を供試した。この微生物は、まず、普通培地（栄研化学社製）に接種し、３７℃で一晩培養したものをプレ培養液とした。新たな普通培地に１％量の上記プレ培養液を添加し、３７℃で１８時間培養したものを菌体培養液とした。投与前日から１２時間の絶食を行なった、ＪＣＭ１１１２投与群と感染コントロール群のラットに、日本クレア株式会社フレキシブルラット用経口ゾンデ（ＲＺ−１）を用い、Ｓ.エンテリティディス投与を行った。すなわち、菌体培養液５００μｌ（１〜２×１０９ＣＦＵ）をシリンジに吸引した後、直ちに６％重炭酸ナトリウム溶液を重層するように静かに吸引し、即座にラット胃内へ投与した。６％重炭酸ナトリウム溶液投与は胃酸中和による感染率向上を目的として行った。菌体培養液（Ｓ.エンテリティディス）の投与後、直ちに絶食を解除し、５日間通常飼育した後、剖検を行った。
【００３１】
（４）供試動物の剖検
実験終了後、飼育施設併設の実験室でラットを安楽死させ、心採血した後に放血し、腹腔内をハンクス(Hanks)液にて洗浄して遊離マクロファージを回収した。最後に肝臓、脾臓および腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を摘出した。ラットから摘出した脾臓は、あらかじめカナマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加したインビトロゲン（Invitrogen）社のＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地）２ｍｌを分注した１５ｍｌポリプロピレンチューブに入れ、細胞培養施設に運搬した。
【００３２】
（５）肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器侵入Ｓ.エンテリティディス菌数の測定
Ｓ.エンテリティディスの生体内への侵入を評価するために、肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器重量１ｇ当たりの菌数を算出した。摘出した各臓器は全量をホモジナイズし、生理食塩水を用いて段階希釈した後に普通寒天培地に塗抹した。１平板当たり３０〜３００コロニーが得られた希釈段階平板を選択し、その希釈段階の平板３枚の平均値をその臓器におけるＳ.エンテリティディスの生菌数とした。
【００３３】
（６）末梢血単球および腹腔マクロファージ貪食活性の測定
(ａ)末梢血単球の分離
採血後直ちに４.５％デキストラン溶液を添加し、３０分静置後、白血球層を分取した。ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地で２回洗浄してデキストランを除去した後、１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ添加した。３７℃、５％炭酸ガス下で２時間培養し、ウェル底面に付着した細胞を単球として貪食活性の測定を行った。
【００３４】
(ｂ)腹腔マクロファージの分離
腹腔洗浄液を遠心分離し、得られた細胞をＲＰＭＩ１６４０−ｋｍ培地で２回洗浄した後に１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、９６穴マイクロプレートに１００μｌずつ添加した。３７℃、５％炭酸ガス下で２時間培養し、ウェル底面に付着した細胞を腹腔マクロファージとして貪食活性の測定を行った。
【００３５】
(ｃ)蛍光ビーズの貪食
マイクロプレートに付着した単球あるいはマクロファージをＰＢＳで洗浄後、これに２.５％蛍光ラテックス微小粒子液（POLYSCIENCE Inc.：直径１μｍ）を０.５％含むＲＰＭＩ１６４０−ｋｍ培地を添加し、３７℃、５％炭酸ガス下で１時間、ビーズを貪食させた。
【００３６】
(ｄ)貪食活性の測定
反応後のマイクロプレートをＰＢＳで２回洗浄し、フルオロマーク・マイクロプレート・フルオロメーター（ Fluoromark Microplate Fluorometer ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で各ウェルの蛍光強度を測定した。測定時のゲイン設定は３５とした。
【００３７】
（７）ＦＣＭによるヘルパーＴ細胞の測定
(ａ)ラット脾臓からのリンパ球の分離
ＲＰＭ１６４０−Ｋｍ培地に浸漬した脾臓を９０ｍｍディッシュに移した後に、ＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地３ｍｌを添加し、小尖刀で脾臓を十分細切し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を、臓器片を除くために２００番ナイロンメッシュを通して新しい１５ｍｌチューブに移した。再度、ディッシュに５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地を添加し、残った脾臓を同様に処理し、細胞を同じ１５ｍｌチューブに移した。
【００３８】
脾細胞懸濁液にはリンパ球以外に赤血球、顆粒球など多種の細胞が含まれるため、パーコール（Percoll）（Amersham Bioscience Corp.）を用いた密度勾配分離法によりリンパ球のみ分離した。比重は市販のラット用リンパ球分離液リンフォライト−Ｍ（大日本製薬）を参考に１.０９４０とした。
【００３９】
(ｂ)リンパ球の活性化
分離したリンパ球を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−Ｋｍ培地に懸濁し、２５ｃｍ２培養フラスコに移した後、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。１０時間後にリンパ球刺激物質として９ｍｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Phytohaemagglutinin；ＰＨＡ）溶液（Murex Biotech Ltd.）を１００μｌ添加し、８時間インキュベートした。
【００４０】
(ｃ)抗体による染色
抗体による細胞表面抗原染色、細胞膜透過処理および細胞内サイトカイン染色については、渋谷の著書を参考にした。以下にその方法を具体的に示す。
(ｉ)ＰＨＡを添加してインキュベーション後、６時間経過時に、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるようブレフェルディンＡ溶液（Sigma-Aldrich Inc.）を添加した。
(ii)フラスコを氷上に置き、反応を止めた後、細胞を１５ｍｌチューブに移して冷ＰＢＳで２回洗浄した。
(iii)１０６ｃｅｌｌ／５０μｌになるようにＰＢＳで懸濁し、Ｃｙ５標識抗ラットＣＤ４抗体（５５４８３９：BD Bioscience）を１０μｌ添加し、室温、遮光下で３０分間静置した。
(iv)１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ ２５０μｌで懸濁、等量の固定液（４％ホルムアルデヒド溶液）を加えてよく混合し、室温、遮光下で２０分間静置した。
(ｖ)冷ＰＢＳで２回洗浄して、遠心後、上清を除去した後に、細胞膜透過用バッファー（０.５％サポニン、０.５％ウシ血清アルブミン、０.１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ溶液）を１５０μｌ加え、細胞をピペッティングし、室温で１０分間静置した。
(vi)遠心後、上清を除去し、冷ＰＢＳ ５０μｌで懸濁後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩＦＮ−γ抗体（５５９４９８：BD Bioscience）２０μｌ、ＰＥ標識抗ラットＩＬ４抗体（５５５０８２：BD Bioscience）１０μｌをそれぞれ加え、室温で３０分間インキュベートした。
(vii)０.５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液で細胞を洗浄後、再度０.５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液１ｍｌに懸濁し、ＦＣＭ解析を行った。
【００４１】
（ｄ）ＦＣＭによる解析
解析にはベックマン・コールター・エピクス(BECKMAN COULTER EPICS) ＸＬデジタルフローサイトメーターを用い、細胞５,０００個当たりの各ヘルパーＴ細胞の数を求めた。
【００４２】
（８）白血球数測定
心採血した血液２ｍｌをエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）採血管に移して凝固阻止した後、各白血球数は自動血球計算計を用いて測定した。白血球は、桿状核好中球、分葉核好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球に細分した。
【００４３】
（９）統計処理
Ｔ検定を行い、統計的有意差は、ｐ＜０.０５の場合を有意であるとした。体重および体重増減は群毎の平均値および標準誤差を算出した。
【００４４】
結果および考察：
（１）体重変化
（ａ）−９日目〜−１日目
被検菌であるＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを９日間投与した群（ＪＣＭ１１１２群）と、これを投与しなかった群（感染コントロール群）の体重増加量を図１に示した。ＪＣＭ１１１２投与群は、感染コントロール群に比べ、体重の増加量が大きかった。その要因としては、Ｌ.ロイテリがラット腸管内での生残性が高く、良好な結果が得られたものと考えられた。
【００４５】
（ｂ）０日目〜５日目
被検菌投与１０日目のＳ.エンテリティディス（１０９／ｒａｔ）接種を０日として、剖検までの５日間の各群のラットの体重増加量を図２に示した。 コントロール群、感染コントロール群の両コントロール群に対して、ＪＣＭ１１１２投与群では体重の増加はみられたものの、有意差は認められなかった。
【００４６】
（ｃ）−９日目〜５日目までの体重推移
この期間の増体量の推移において、感染コントロール群における０〜２日目にかけての増体量が減少しなかったのは、物理的、化学的バリアとしての腸管上皮をＳ.エンテリティディスが突破し、ラット生体内へ侵入する時期と考えられ、腸管から体内へ侵入したＳ.エンテリティディスはリンパ行性に腸間膜リンパ節、さらにリンパ管を走行して、あるいは血行性に各種臓器へ移行し、３〜４日目には各臓器でＳ.エンテリティディスが増殖、それが２度目の増体量低下に影響したと考えられた。ＪＣＭ１１１２投与群は、急激な体重増加はないものの、前述の３〜４日目付近にみられる一時的な増体量の落ち込みや大きな変化がなく、滑らかに増体が増加している。この菌株では、増体量に関して明らかにＳ.エンテリティディス感染パターンとは異なっており、感染の影響に差があることが伺える。
【００４７】
（２）肝臓、脾臓およびＭＬＮにおける臓器侵入Ｓ.エンテリティディス菌数の測定
各臓器から検出されたＳ.エンテリティディス生菌数を図３に示した。ＭＬＮでは各試験群とも減少傾向ではあったが、１０５レベルとＳ.エンテリティディス生菌数に大きな差は認められなかった。これは、明確な感染を目的としたモデル系であるためにラットへのＳ.エンテリティディス投与菌数が１０９ＣＦＵと、ヒトでの一般的な感染成立菌数よりもはるかに多く、腸管上皮やパイエル板に侵入するＳ.エンテリティディスが好中球や組織マクロファージ、単球由来マクロファージといった貪食細胞の動員で防御可能な菌数を上回っており、感染局所である腸管から最も近傍のリンパ節であるＭＬＮへ大量のＳ.エンテリティディスが侵入したことが要因ではないかと考えられる。
【００４８】
脾臓に関して、ＪＣＭ１１１２群は感染コントロール群との間で有意差がなかった。一方、肝臓では、ＪＣＭ１１１２群において感染コントロール群に対し１／１０程度の１０４ＣＦＵにまでＳ.エンテリティディス菌数が減少している。
【００４９】
被検菌による感染防御の差異は、貪食細胞の活性化誘導能およびそれ以降の適応免疫の強度に現れ、結果として肝臓、脾臓の侵入菌数に影響を及ぼすものと推測される。
【００５０】
（３）末梢血単球および腹腔マクロファージの貪食能
腸管感染に対して、単球およびマクロファージは以下に示すメカニズムによって活性化される。すなわち、腸管上皮への抗原（本研究ではＳ.エンテリティディス、あるいはＬ. ロイテリ）の付着刺激で上皮細胞から産生されるＩＬ−８やＬＡＲＣによって局所に遊走する単球や、パイエル板のＭ細胞に取り込まれた後にマクロファージや樹状細胞によって、マンノースレセプター、βグルカンレセプター、ＴＬＲ２、補体レセプターなどを介した抗原の貪食、細胞内プロセッシングとＭＨＣクラスIIへの結合と提示が行われると同時にＩＬ−１２が産生される。
【００５１】
また、血中の単球は樹状細胞（ＤＣ１）にも分化し、上皮細胞により産生されたβディフェンシンにより集合した未熟樹状細胞も加わり、マクロファージと同様に抗原提示され、ＩＬ−１２の産生を行う。自ら産生するＩＬ−１２に反応したマクロファージや樹状細胞はＩＦＮ−γを産生し、ＩＦＮ−γはさらにマクロファージや樹状細胞を活性化してＩＬ−１２産生を増強するといったオートクリン活性化機構が存在する。ＩＦＮ−γによって活性化されたマクロファージは貪食能が高まるとともに一酸化窒素などを産生することによって強力な殺菌作用を示す。
【００５２】
図４のＡは、末梢血単球、Ｂは腹腔マクロファージの貪食能測定結果を示す図面である。末梢血単球ではＪＣＭ１１１２群で貪食能の向上が認められたものの、感染コントロール群に対して有意差は得られなかった。
【００５３】
ヒトのサルモネラ感染症患者では、血清中のＩＦＮ−γが胃腸炎型よりも全身型で高値になることが報告されており、本感染モデルでも感染局所で産生されたＩＬ−１２とＩＦＮ−γが血流に乗り、その拡散とともに末梢血単球の活性化が誘導されて組織マクロファージの一種である腹腔マクロファージの活性化に至るものと考えられている。
【００５４】
（４）Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス
一般にウイルス、リステリア菌、抗酸菌、サルモネラ菌などの細胞内寄生菌による感染症では、その感染防御にＣＴＬや武装化マクロファージが関与している。そのため、ＣＴＬ増殖、マクロファージ武装化を担うＩＬ−２やＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞が重要な働きをもつ。本研究のＳ.エンテリティディス感染症ではＴｈ１優位の免疫状態へとシフトする必要があるが、Ｔｈ１反応の持続あるいは過剰すぎることは自己免疫性疾患の要因とも考えられていることから、必要十分なＴｈ１反応を誘導し、かつ治癒と同時に速やかに健常状態のＴｈ１／Ｔｈ２バランスに復帰することが求められる。つまり、結果として、各被検菌投与により、コントロール群の総細胞数および細胞種比率に近づいたかという点が最も注目される。
【００５５】
図５は、各ラット群でのヘルパーＴ細胞数を示す。また、下記表１にその結果に対する統計評価を示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
被験菌を投与した群において、有意なＴｈ１細胞増加とＴｈ２細胞減少によるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの改善が認められた。すなわち、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔはコントロール群と比較してもＴｈ１優位状態を示し、Ｓ.エンテリティディス感染５日目にして、Ｔｈ１細胞によるＣＴＬおよびマクロファージの活性化による細胞性免疫が速やかに誘導され、感染防御に貢献していることを示している。
【００５８】
（５）白血球数
表２に各ラット群における白血球等の数を示した。Ｓ.エンテリティディスを接種した群（感染コントロール群）では、コントロール群と比較して、反応性の好中球および単球の増加が認められた。ＪＣＭ１１１２群では感染コントロール群に対しても好中球と単球の増加が認められ、桿状好中球増加による好中球新生も示唆されることから、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔによる自然免疫の誘導がなされていることを示している。
【００５９】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明乳酸菌の代表であるＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔを使用した上記実施例の結果から、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔ投与群では、Ｓ.エンテリティディス接種後の体重増加率も良く、Ｓ.エンテリティディス臓器侵入菌数も全項目で低下していたことが明らかになった。また、好中球数増加、単核食細胞活性化に対しての作用が弱く、有意差は得られなかったが、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランス改善に特化した特徴を示した。これは、メカニズムとして花粉症対策としても役立つことが示された。
【００６１】
このように、Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの投与は、好中球、単球、マクロファージなどによる自然免疫の活性化から、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの改善まで広範囲にわたる作用みられた。従って、本発明乳酸菌の作用は、薬剤などにみられる局所的な効果ではなく、病的状態を健常範囲内に復帰させる、つまり、ホメオスタシスの維持に効果的であることが推察された。したがって、上記効果の認められたプロバイオティクスを長期に渡って摂取することによって、病原菌の侵入を事前に防御し、生体の健康を増進することが可能となる。
【００６２】
なお、本発明のＬ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの全ゲノム配列からのグリセロール代謝マップを図６として示す。Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔにはジハイドオキシアセトン・キナーゼ（dihydroxyacetone kinase）がない。
【００６３】
これに対し、シトバクター・フラウンデイ（Citrobacter freundii）は、グリセロールのみで生育するが、L. ロイテリにはないジハイドオキシアセトン・キナーゼを持っているので、グリセロールから解糖系に入る経路があると考えられている。この細菌において、その1つ前の酵素グリセロール・デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤからＮＡＤＨに変換して酵素活性を示す。その場合、ＮＡＤＨをＮＡＤに戻す必要がある。シトバクター・フラウンデイは、そのＮＡＤを得るためにｐｄｕ経路から１,３−プロパンジオール・デヒドロゲナーゼがあると考えられている。結局、ＮＡＤＨとＮＡＤの収支計算が合う。例えば有名な解糖系でも、その反応の中でＮＡＤとＮＡＤＨの収支が合うようになっている。
【００６４】
また、グリセロール代謝マップ中Ｃカテゴリーにおいて、グルコースの代表的な代謝経路である解糖系と比較すると、L. ロイテリには、６−ホスホフルクトキナーゼ（6-phosphofructokinase）がない。一方、ヘテロ発酵Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓには、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(fructose-bisphosphate aldolase)遺伝子がないと文献に記載されているが、L. ロイテリにはこの遺伝子が存在する。このカテゴリー内において、酢酸が菌体外に放出される系では、ＮＡＤとＮＡＤＨの収支は合っている。しかしながら、その過程で酢酸が代謝され、アセトアルデヒドができるとＮＡＤが産生される。この経路によって、ＡカテゴリーからＣカテゴリーに入ったグリセロール代謝経路にＮＡＤが供給され、グリセロール１分子とグルコース１分子とから、３ＡＴＰが産生される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】−９日目から−１日目における、各ラット群の増体量を示す図面である。
【図２】０日目から５日目における、各ラット群の増体量を示す図面である。
【図３】各ラット群の、各臓器中のＳ.エンテリティディス生菌数を示す図面である。
【図４】各ラット群での末梢血単球（Ａ）、腹腔マクロファージ（Ｂ）の貪食能を示す図面である。
【図５】各ラット群のヘルパーＴ細胞数を示す図面である。
【図６】Ｌ.ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔの全ゲノム配列からのグリセロール代謝マップを示す図面である。 以 上
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物が、ラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔである請求項第１項記載の免疫調節剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節食品。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【請求項４】
ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物が、ラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔである請求項第３項記載の免疫調節食品。
【請求項１】
ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節剤。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【請求項２】
ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物が、ラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔである請求項第１項記載の免疫調節剤。
【請求項３】
ラクトバチルス・ロイテリに属し、以下の性質を有する微生物を有効成分とする免疫調節食品。
（１）ロイテリンを産生する
（２）湿菌体１ｇ当たり、２５０Ｕ以上のデハイドラターゼ活性を示す。
【請求項４】
ラクトバチルス・ロイテリに属する微生物が、ラクトバチルス・ロイテリ ＪＣＭ１１１２Ｔである請求項第３項記載の免疫調節食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２５７０７７（Ｐ２００６−２５７０７７Ａ）
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３７３７１（Ｐ２００６−３７３７１）
【出願日】平成１８年２月１５日（２００６．２．１５）
【出願人】（５９１１０５８０１）丸大食品株式会社 (19)
【出願人】（５０５０６２５３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１５日（２００６．２．１５）
【出願人】（５９１１０５８０１）丸大食品株式会社 (19)
【出願人】（５０５０６２５３６）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]