免疫調節化合物によるアレルギー性疾患の治療
被験者において、アレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法が、被験者に、有効量の免疫調節化合物（芳香族アミノ酸残基若しくは複素環アミノ酸残基、又はそれらの誘導体を含む）を投与することを含む。好ましくは、免疫調節化合物がＤ−トリプトファン残基又はＬ−トリプトファン残基を含むジペプチドである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の治療の分野に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年５月１７日に出願されたロシア特許出願第２００７１１８２３７号明細書の優先権と、２００７年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９５７，２０１号明細書の利点とを主張する。
【背景技術】
【０００３】
アトピー性気管支喘息は、産業先進国で広まっている疾患である。現在では、喘息の発症におけるＴリンパ球及びＴリンパ球によって産生されるサイトカインの役割は明らかである。１つの有力な仮説によれば、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の顕著な産出を伴う、ヘルパーＴ細胞のバランスが第２の型のヘルパーＴ細胞方向へと移行することが、肺組織において喘息過程を誘起及び維持するのに重要な因子である。
【０００４】
アレルギー状態は、患者の身体の免疫状態の低下及び環境汚染の進行に併せて産業先進国で広がっている。
【０００５】
現在、様々な医薬群に属する製剤が、アレルギーを予防及び治療するのに使用されている。特に、抗炎症薬の使用が提唱されており（アスピリン、イブプロフェン、ボルタレン、ヒドロコルチゾン）、抗ヒスタミン製剤（ジメドロール、ピポルフェン）が、症候性剤（symptomatic agents）、気管支拡張薬、吸着薬、天然起源及び合成起源の様々なホメオパシー製剤、コルチコステロイド等と併用して、様々なスキーム、及び脂肪細胞のカルシウムチャンネル遮断薬（クロマリン（chromalin）ナトリウム）とホルモン療法との様々な組合せで使用されている（特許文献１（２００２年）、特許文献２（１９９６年）、特許文献３（１９９４年）、非特許文献１、特許文献４（１９９０年）、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
最も知られている製剤の欠点は、比較的効率が低く、また非常に多くの禁忌があることである。特に、クロモグリク酸ナトリウム（インタール）は、吸入曝露中で且つアレルギー性疾患の症状が非常に小さい場合でしか効果がなく、抗ヒスタミン製剤は喘息には効果がなく、またアスピリントライアドは顕著な副作用を示す（特許文献５（１９９４年））といったことがある。
【０００７】
近年、一般的に受け入れられている或る理論が考慮されており、これによるとアレルギー性疾患は、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）と呼ばれるヘルパーＴリンパ球のアレルゲン特異的なクローンの活性化に付随した、免疫系の調節における障害によって引き起こされる（非特許文献４）。これに関連して、対となる（opposing）１型ヘルパーＴ細胞クローン（Ｔｈ１）の分化誘導因子を導入すること、又はＴｈ１によって合成されるサイトカインを使用することによるヘルパーＴ細胞クローンの相互調節の利用が、アレルギーの治療に提唱されている。特に、インターロイキン−１２、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）及び他の物質がこれらの目的で使用されている。
【０００８】
しかしながら、得られた結果は信頼性が不十分であり、多くの場合で矛盾していることが分かった。このため、ＩＦＮ−γのレベルが、炎症性アレルギー反応の強度及び疾患の臨床症状の重症度と相関関係にあることが示された（非特許文献５）。同時に、マウスでの多くの喘息モデルにおいて、動物でのＩＦＮ−γの投与が、気管支過敏性の増大を引き起こし得ることが示された（非特許文献６）。
【０００９】
喘息の患者での組換えインターロイキン−１２製剤の投与は、好酸球増加の低減を引き起こしたが、全体毒性が十分に高いという背景では、過敏性及び気管支痙攣症状の軽減を引き起こさなかった（非特許文献７）。
【００１０】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、アレルギー性疾患の治療に使用されている（非特許文献８）。全体として生物に正の効果を与える、動物でのＩＬ−１８の投与は、アレルギー症状の増大を引き起こすこともある。おそらくは、このことは、ＩＬ−１８が両方の種類のヘルパーＴ細胞クローンを活性化すると共に、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の両方の合成を強める可能性があるということに関連する。
【００１１】
ＩＬ−１８及び上述の他の製剤の欠点は、免疫系のポリクローナル活性化、効果の選択性の欠如、及び高い毒性であり、これは臨床試験中に見られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ロシア特許第２２４０１２６号明細書
【特許文献２】ロシア特許第２１３９１００号明細書
【特許文献３】ロシア特許第２１１６７６９１号明細書
【特許文献４】旧ソ連特許第１５４４４３８号明細書
【特許文献５】ロシア特許第２１７００９１号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Handbook for the Practical Physician, Moscow, Meditsina, 1988, Vol.1, p. 60-68
【非特許文献２】Immunocorrection on Pulmonology／A. G. Chuchalin編、Moscow, Meditsina, 1989, p. 202-210
【非特許文献３】Allergology. General Allergology, Vol. 1／G. B. Fedoseev編、St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, p. 816
【非特許文献４】Allergology. General Allergology, Vol. 1／G. B. Fedoseev編、St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, 816 pages
【非特許文献５】Leonardi A., Curnow S., Zhan H., Calder V. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast culture. Clin. Exp. Allergy, 2006, V. 36, p. 777-784
【非特許文献６】Hessel E., Van Oosterhout A., Van Ark I. et al. Development of airway hyperresponsiveness is dependent of IFN-gamma and independent of eosinophil infiltration. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1997, V. 16, p. 325-335
【非特許文献７】Bryan S., O'Connor B., Matti S. et al. Effects of recombinant human IL-12 on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response. Lancet, 2000, V. 356, p. 2149-2153
【非特許文献８】Wild J., Sigounas A., Sur N. et al. IFN-γ-inducing factor (IL-18) increases allergic sensitization, serum IgE, Th2 cytokines, and airway eosinophilia in a mouse model of allergic asthma. J. Immunol., 2000, V. 164, p. 2701-2710
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
当該技術分野において、被験者においてアレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、被験者において、アレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法は、被験者に、有効量の式Ａの免疫調節化合物を投与することを含む。
【００１６】
【化１】
【００１７】
式Ａにおいて、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である。好ましくは、ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一実施形態による結果を示す図である。
【図２】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図３】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図４】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図５】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図６】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図７】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図８】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一実施形態によれば、本発明は、被験者、好ましくはヒト患者において、喘息等のアレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法に関する。或る特定の実施形態では、アトピー性気管支喘息が治療される。
【００２０】
本発明による免疫調節化合物は式Ａの免疫調節剤を含む。
【００２１】
【化２】
【００２２】
式Ａにおいて、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である。好ましくは、ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。
【００２３】
「Ｘ」に対する芳香族アミノ酸又は複素環アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−又はジ−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル置換アミド、アリールアミド、及び（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルエステル又はアリールエステルである。「Ｒ」に適切なアシル部又はアルキル部は、炭素数１〜約６の分岐アルキル基又は非分岐アルキル基、炭素数２〜約１０のアシル基、並びにカルボベンジルオキシ及びｔ−ブチルオキシカルボニル等の保護基である。ｎが２のとき、式Ａに示されるＣＨ基の炭素は、Ｘの立体配置と異なる立体配置を有していることが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、及びβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン等の化合物が利用される。特に好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７と称することもある）が利用される。これらの化合物と、これらの化合物、これらの化合物の医薬的に許容可能な塩、及びこれらの製剤処方を調製する方法とは、米国特許第５，９１６，８７８号明細書（参照されて本明細書の一部とする）に開示される。
【００２５】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンであるＳＣＶ−０７は、γ−グルタミル部又はβ−アスパルチル部を有する免疫調節剤群の成員であり、これはロシアの科学者によって発見され、SciClone Pharmaceuticals, Inc.により米国で幾つかの症状に対する有効性が試験されている。ＳＣＶ−０７は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの免疫調節活性を有している。ＳＣＶ−０７はＣｏｎ−Ａ誘導性の胸腺細胞及びリンパ細胞の増殖を高め、Ｃｏｎ−Ａ誘導性のインターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生及び脾臓リンパ細胞によるＩＬ−２受容体の発現を高めると共に、骨髄細胞におけるＴｈｙ−１．２の発現を刺激する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＳＣＶ−０７は、５−ＦＵ免疫阻害動物及びヒツジの赤血球による免疫付与モデルにおいて強い免疫刺激効果がある。
【００２６】
任意の有効用量、例えば約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲の用量で、式Ａの化合物を投与することができる。１日に１回又は複数回の調剤の投与で、１週間に１回又は複数回、例えば毎日、調剤を投与してもよい。経口、鼻孔、経皮、舌下、注射による、定期的な注入、連続注入等を含む任意の好適な方法で、投与することができる。この調剤は、筋肉内注射で投与することができるが、他の形態の注射及び注入を利用してもよく、経口吸入若しくは鼻孔吸入、又は経口摂取等の他の投与形態を用いることができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、式Ａの化合物を約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１ｍｇの範囲内の用量で、最も好ましくは約０．１ｍｇの用量で投与する。
【００２８】
また用量は、１ｋｇ当たりのμｇで測定することができ、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００２９】
ＳＣＶ−０７は、化学合成によって得られ、均質になるまで高速液体クロマトグラフィで精製した有効成分ジペプチド−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン）を含有する（ロシア特許第２０９１３８９号明細書（１９９７年）、ロシア特許第２１２０２９８号明細書（１９９８年））。製剤はこれまで、感染症において、及び外科手術後に免疫力を回復させるのに使用されてきた。製剤には、体重１ｋｇ当たり０．００００１ｍｇ〜０．０１ｍｇという低い用量で免疫刺激効果があり、即ち製剤は極めて低い濃度で効果を示す。
【００３０】
アレルギー性疾患を治療するために、製剤を薬局方で許可された用量で投与する。身体への投与形態及び疾患の特徴に応じて、或る特定の実施形態では、製剤の１日用量は０．１ｍｇ〜１．５ｍｇである。より低い用量での製剤の使用が可能ではあるが、治療効果が低減し、１．５ｍｇを超える用量での使用は経済的に得策ではない。製剤は、用いられる用量の最低１０００００倍であっても非毒性である。
【００３１】
非経口（筋肉内又は腹腔内）で用いる場合、或る特定の実施形態では、製剤は、１ｍＬの容量の塩化ナトリウム等張溶液中で使用し、その溶液中に、賦形剤（Ｄ−マンニトール ９．０ｍｇ、塩化ナトリウム １．０ｍｇ）と共に有効成分を溶解する（γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ １００μｇ）。或る特定の実施形態での単回用量は、０．１ｍｇ（０．００１ｍｇ／ｋｇ）である。或る特定の実施形態では、５回〜１０回の注射の形で製剤による治療が行われる。
【００３２】
経口で用いる場合、或る特定の実施形態では、製剤は、０．３５ｍｇ又は１．５ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形で使用する。或る特定の実施形態では、製剤は、１週間〜２週間、１日１回又は２回使用する。
【００３３】
置換部(substituted)、欠失部、伸長部、置き換え部(replaced)、又はそうでなければＳＣＶ−０７と実質的に同等の生物活性のある修飾部を有する生物学的に活性な類似体、例えばＳＣＶ−０７と実質的に同等の活性を伴って、実質的に同じように機能するような、ＳＣＶ−０７と十分に相同性であるＳＣＶ−０７由来ペプチドが含まれる。
【００３４】
一実施形態によれば、治療期間又は予防期間、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、式Ａ化合物を患者に投与することができる。本発明に従うと治療期間が非常に長くなると考えられるが、本発明の実施形態は、少なくとも約６時間、１０時間、１２時間、又はそれ以上の治療期間、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持することを包含する。他の実施形態では、治療期間は、少なくとも約１日、さらには数日、例えば１週間又はそれ以上である。しかしながら、上記で規定したように、有効量の式Ａ化合物が患者の循環系において実質的に継続して維持される治療は、同様の又は異なる長さの非治療期間で分断されていてもよいと考えられる。
【００３５】
一実施形態によれば、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、治療期間中、例えば静注によって式Ａ化合物を患者に継続して注入する。注入は、ミニポンプのような任意の好適な手段によって実施し得る。
【００３６】
代替的には、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、式Ａ化合物の注射レジメンを維持することができる。好適な注射レジメンは、治療期間中、患者の循環系において有効量の免疫調節化合物ペプチドを実質的に継続して維持するように、１時間、２時間、４時間、６時間等ごとの注射を包含し得る。
【００３７】
式Ａ化合物の継続注入の間、実質的に投与期間が長くなると考えられるが、一実施形態によれば、式Ａ化合物の継続注入による治療期間は少なくとも約１時間である。より好ましくは、より長い期間、例えば少なくとも約６時間、８時間、１０時間、１２時間又はそれ以上の期間、継続注入を実施する。他の実施形態では、少なくとも約１日、さらには数日、例えば１週間又はそれ以上、継続注入を行う。
【００３８】
実施形態によっては、式Ａ化合物は、注射用水、生理学的濃度の生理食塩水等のような医薬的に許容可能な液体担体中に存在する。
【００３９】
式Ａ化合物の有効量は、日常の用量漸増実験によって求めることができる。
【００４０】
式Ａ化合物を他の喘息治療剤と共に投与することもできる。
【００４１】
以下の非限定的な実施例で、本発明を説明する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：アトピー性気管支喘息の治療
ＳＣＶ−０７は、免疫系に対して広範な作用を有する、具体的にはＩＬ−２及びインターフェロン-γ産生を高めることができる合成免疫調節剤である。この活性は、製剤の影響下で、ヘルパーＴ細胞のバランスが第１の型のヘルパーＴ細胞へと移行することに明らかに起因している。この研究の目的は、マウスにおける実験的なアレルギー性喘息に対するＳＣＶ−０７の効果を調べることであった。このために、本発明者らは、アレルゲンの吸入投与によるアレルギー性オボアルブミン喘息モデルを用いた。予め感作した生物にアレルゲンが接触した状態をモデル化するために、予備全身免疫付与後、ＳＣＶ−０７を動物に投与した。
【００４３】
材料及び方法
実験的なアレルギー性喘息のモデル化
Ｂａｌｂ／Ｃ株の非病原性の雌マウス（「Pushchtino」の実験動物のブリーダー）を、一定温度、１２時間の昼／夜サイクルで、ＳＰＦビバリウム（vivarium：動物施設）条件下に置き、自由に殺菌飼料及び水を与えた。２系統の実験では、６週齢〜８週齢のマウスと、１８週齢〜２０週齢のマウスとをそれぞれ、実験開始時に用いた。
【００４４】
動物に、１匹のマウス当たり８μｇの用量で硫酸アンモニウムを基にしたアジュバント中のオボアルブミン溶液（Sigma）を５日間隔で２回免疫付与した。ＳＣＶ−０７を、１回目の免疫付与後６日目〜１１日目に１日１回、２００μＬ量のＰＢＳ中０．１μｇ／ｋｇ又は１．０μｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。対照群は、同じ日に生理食塩水を摂取した。各群には６匹〜１０匹の動物が含まれていた。１回目の免疫付与後、１２日目、１６日目及び２０日目に、動物を密封箱に入れ、そこに空気を連続混合させながら、１分間、超音波ネブライザＬＤ−２０７Ｕ（Little Doctor）によって、１％オボアルブミンのＰＢＳ溶液（ＯｖＡ）のエアロゾルを発生させた。動物のエアロゾルへの曝露時間は１５分であった。実験的なアレルギー性喘息の重症度の解析は、最後のエアロゾル曝露の２４時間後に実施した。
【００４５】
ＳＣＶ−０７の使用中における実験的なアレルギー性喘息の重症度変化の解析は、気管支肺胞洗浄液の細胞学的組成、組織学的試験及び抗原特異的なＩｇＥ抗体の力価の決定に従って実施した。
【００４６】
マウスを、致死用量のバルビタールナトリウムの腹腔内投与によって屠殺した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、ＰＢＳ溶液１ｍＬを気管に通し肺を洗浄することによって得た。ＢＡＬ細胞を遠心分離して沈殿させ、沈殿物を再懸濁し、細胞濃度をＧｏｒｙａｅｖチャンバで計算して、塗抹標本（smears）を調製した。塗抹標本を乾燥させ、固定し、ロマノフスキー色素で染色した。気管支肺胞洗浄液の細胞学的組成は、油浸レンズを備えた光学顕微鏡（接眼レンズ×１６、対物レンズ×１００）下で調べた。細胞２００個当たりの単球／マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球の数を計測し、これは少なくとも５つの視野で観察した。各細胞集団の相対的な細胞数を総細胞数の割合として表した。
【００４７】
気管支肺胞洗浄液を回収した後、３日〜７日間、肺を４％パラホルムアルデヒドで固定し、アルコール（２％セルイジン（celluidine）−ヒマシ油）とクロロホルムとを増大させながら、ぺテルフィ溶液を通し、パラフィンに流し込んだ。５μｍ厚の切片を調製した。細胞浸潤及びシッフヨード酸の強度を評価するのに、切片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、杯細胞の数を計算した。
【００４８】
気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の定量評価を、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅプログラムパッケージによって形態計測的に実施した。各動物由来の肺切片の３つの気管支と３つの血管とを解析した。浸潤領域を、気管支又は血管及びその周囲の浸潤を含有する組織領域と、血管又は気管支自体の領域との間の差として算出した。浸潤指数を、浸潤領域と、血管又は気管支の領域との比として算出した。実験群は、解析に含まれる気管支及び血管の領域に関しては同程度であった（群間の差は有意なものではなかった、ｐ＞０．６）。
【００４９】
気管支切片での杯細胞と上皮細胞との数は、各動物由来の肺切片で少なくとも５つの視野で算出し、全細胞数の割合として表した。実験群は、解析に含まれる気管支の大きさでは同程度であった（気管支における細胞数に関しては、群間の差は有意なものではなかった、ｐ＞０．５）。
【００５０】
末梢血を後眼窩洞から採取した。血清及び気管支肺胞洗浄液において抗ＯｖＡ ＩｇＥの力価を、以下のスキームに従って固相ＩＦＡによって求めた。ビオチンで標識したマウスＩｇＥに対するラット抗体（Caltag）を製造業者が推奨する希釈で（１００μＬ／ウェル）ＩＦＡに対する９６ウェルプレート（（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に導入し、室温で１時間インキュベートして洗浄した。それから、血清試料又はＢＡＬを段階希釈して導入し、室温で１時間インキュベートして洗浄した。その後、ＯｖＡを加え、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識して、室温で１時間振盪器でインキュベートして洗浄し、ペルオキシダーゼ用の基質を導入して（ＯＰＤ、Sigma）、１５分間インキュベートした。１ＭのＨ2ＳＯ4を添加することで反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍの波長で、Ｖｉｃｔｏｒ２分光光度計（Wallac）で解析した。バックグラウンドを差し引いた後、抗原特異的なＩｇＥの力価の定量比較のために、本発明者らは、動物対照群の試料での各希釈における平均光学密度を算出し、実験の全ての動物由来の試料での対応する希釈における光学密度を、得られた値の割合として表した。
【００５１】
結果の統計処理を、Microsoft社のエクセルとウィンドウズ（登録商標）用のＳＰＳＳプログラム（バージョン１３）とで実施した。コルモゴロフ・スミルノフ基準を用いて、分布の正規性を求めた。正規分布した値に対する群間の差の有意性を評価するために、本発明者らは、偏差が等しくない両側スチューデント検定を使用し、非正規分布した差には、マンホイットニー検定を使用した。差は、ｐ＜０．０５で有意性があると考えられた。特に明記しない限り、データは平均±標準偏差の形で表す。
【００５２】
得られた結果によれば、幼若動物（実験開始時で６週齢〜８週齢）での実験におけるＢＡＬの細胞組成の解析は、ＳＣＶ−０７の有意な効果を示してはいなかった。全ての群におけるＢＡＬの総細胞性（cellularity：細胞充実度）はおおよそ同じであった（対照群では２．００±０．３４×１０6個の細胞、０．１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群では１．９６±０．９９×１０6個、及び１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群では２．２１±１.１６×１０6個）。ＢＡＬでの個々の白血球集団の相対的割合を比較することによって、本発明者らは、対照動物に比べて１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群で、好酸球の割合が有意に低くなり、マクロファージの割合が有意に高くなったことに気が付いた（表１を参照されたい）。ＢＡＬにおける個々の集団の細胞絶対量は、群間で有意に異なっていなかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
１８週齢〜２０週齢の動物での実験において、ＳＣＶ−０７を摂取した群におけるＢＡＬの細胞組成の変化が本質的に異なっていた。本発明者らは、０．１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群での洗浄液における総細胞数の有意な低減（対照群の２．０３±０．７８×１０6個に比べて１．１２±０．１５×１０6個、ｐ＜０．０５）、及び１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群でのこの指数における異なる低減傾向（１．３２±０．２３×１０6個）に気が付いた。個々の亜集団の白血球含有率において有意差がない場合、絶対値の解析は、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群での好酸球、好中球及びリンパ球の数、並びに１．０μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群での単球／マクロファージ、好中球及びリンパ球の数の有意な低減を示した（表２、図１を参照されたい、ＳＣＶ−０７はＳＣＶ−０７と呼ばれる）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
６ヶ月齢〜８ヶ月[sic]齢の動物の血清及び気管支肺胞洗浄液におけるモデルで使用されたＩｇＥ抗原に特異的な力価の測定は、対照群に比べて、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群の血清における力価において有意な低減を示す。１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取したマウスでは、抗ＯｖＡ ＩｇＥの力価は、血清と気管支肺胞洗浄液との両方で有意に低くなった（表３、図２を参照されたい、ＳＣＶ−０７はＳＣＶ−０７と呼ばれる）。
【００５７】
【表３】
【００５８】
１８週齢〜２０週齢のマウスを使用した実験では、本発明者らは、ＳＣＶ−０７を使用した後にＩｇＥに特異的な力価において減少傾向も観察したが、全ての群の指数で、非常に高い変動性があり、統計的に有意な差はなかった（表４を参照されたい）。
【００５９】
【表４】
【００６０】
マウス切片の形態解析は、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した動物の気管支上皮における杯細胞の割合において２倍を超える低減を示し、対照群に比べて有意であった（表５を参照されたい）。今のところ、気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の強度の形態学的評価は完了していない。
【００６１】
【表５】
【００６２】
気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の強度の形態学的評価によって、ＳＣＶ−０７を摂取した両方の群の気管支周囲浸潤において信頼性のある低減が実証された。また血管周囲浸潤の強度は、ＳＣＶ−０７を摂取した群において異なる減少傾向であったが、兆候の変動性が高かったために、対照との差は統計的に信頼できるものではなかった（表６を参照されたい）。
【００６３】
【表６】
【００６４】
結論
得られた結果は、アレルギー性喘息モデルにおいてＳＣＶ−０７を使用する間、実験的プロセスの重症度の低減が観察され、具体的には気管支内腔への白血球の発生及び気管支周囲の浸潤が少なくなり、気管支肺胞洗浄液の好酸球増加が軽減し、血清及び洗浄液における抗原特異的なＩｇＥの量が少なくなり、且つ気管支上皮における粘液形成杯細胞の数も減少することを示している。
【００６５】
実施例２．クローンＴｈ１及びＴｈ２によるサイトカインの産生に対するＳＣＶ−０７の効果
体重１ｋｇ当たり０．１μｇ及び１．０μｇの用量で１日５回、腹腔内注射の形でＳＣＶ−０７を無処理の野生型マウスに投与した。この後、脾臓細胞の単離を行い、細胞を５μｇ／ｍＬの用量でコンカナバリンＡで刺激することによって、培養液中でサイトカイン合成を誘導した。合成サイトカインの量を定量的な免疫酵素解析によって求めた。実験結果を図１に示し、これはＳＣＶ−０７の腹腔内投与後、マウス脾臓細胞によるインターロイキン−４及びインターフェロン−γのマイトジェン誘導性の産生を示す。図１で明らかなように、２つの異なる[sic]サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のＣｏｎＡ誘導性の産生変化は実際は相互に関係していた。ＳＣＶ−０７の影響下で（１μｇ／ｋｇ）、脾臓細胞によるＩＬ−４産生における２倍の低減と、ＩＦＮ−γ産生におけるおよそ５倍の増大に気が付いた。これらのデータは、ＳＣＶ−０７が脾臓のＴ細胞の機能的反応を刺激し、ＩＬ−２産生を高めるだけでなく、同時に主に１型ヘルパーＴ細胞を活性化することによって、ヘルパーＴ細胞の極性化に影響を与えることを示唆している。
【００６６】
実施例３．ＳＣＶ−０７による気管支喘息の治療
１９５２年生まれの患者B-skiiは、１日に６、７回の呼吸困難の発作、退院を困難にする痰を伴う咳、息切れ及び鼻閉を訴えていたことが報告された。１９８５年以降、彼は気管支喘息を患い、疾患の憎悪に併せてアレルギー科の救急医療センターに数回入院していたことが病歴から知られている。１９９７年以降、彼はグルココルチコイドの全身投与を受けている（プレドニゾロン１日２錠−維持用量）。彼は、ベクラゾン ＬＤ ２５０（１０００μｇ以下／日）、Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅ ２５０（１０００μｇ以下／日）、持続性気管支拡張薬（セレベント ２５μｇ／単位 ５０μｇ／ｓ）、Ｔｅｏｔａｒｄ ２００（２ｋ／日、４００ｍｇ／日）も服用している。発作はサルブタモール（ベントリン）で治療する。
【００６７】
１９９４年に、彼は、Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｏｆｆｉｃｅでアレルギー試験を受け、家庭内アレルゲンが見つかった（ハウスダスト（household dust）、イエダニ）。重篤な疾患経過を考慮して、ダストＡＳＩＴは行わなかった。最近の憎悪は２週間前であり、この時ベース療法を背景に呼吸困難の発作が起こり、β−２アゴニスト（短期間）での治療が困難であり、気管支痙攣及び息切れが増大した。彼は、通院治療の不応期に併せて、ＧＵＺ２号病院のアレルギー科に入院した。
【００６８】
アレルギー病理に関する遺伝性を材料系に沿って追跡した。
アレルギー歴：
薬剤−陰性、
食べ物−ハチミツ、柑橘類、スイカ、メロン（鼻閉、呼吸困難発作、咳）、
家庭内（ハウスダスト）−呼吸困難の発作、咳、鼻閉、鼻漏、
表皮−陰性、
鼻炎のダストによる季節性の憎悪（Dust-seasonal exacerbation）、結膜炎、１０年間の夏秋期間（７月〜１０月）における呼吸困難頻度の増大、
昆虫−陰性。
【００６９】
検査時：平均の重症状態。誘導した患者の体位（座位）。皮膚片−清潔、蒼白、乾燥。皮下リンパ節は肥大していない。甲状腺は触診しない。鼻呼吸は重度に妨げられており、わずかな粘液しか鼻孔から分離しないが、患者は匂いを認識しない。結膜−桃色。鼻粘膜（検鼻法中）−蒼白、浮腫。口腔粘膜−桃色。呼気の呼吸困難特性。呼吸数＝１分間当たり２４回。胸腔 樽状。打診−肺音の夾膜共鳴（capsular resonance）。聴診−全ての肺野にわたって散在した大量の乾性ラ音。心音は律動的である。ＨＲ＝Ｐ５＝１分当たり７８回。ＢＰ＝１３０／８５ｍｍＨｇ。
【００７０】
舌が白色痂皮に覆われている。腹部は柔らかく無痛である。肝臓は肋骨弓の縁に沿っている。腎臓域は変わらず、パステルナーク症候群は両側で陰性である。
【００７１】
入院時に、検査を実施した：
一般的な血液解析：赤血球＝５．０７×１０12／Ｌ、ヘモグロビン＝１６７ｇ／Ｌ、白血球＝１１．６×１０9／Ｌ、ＥＳＲ＝５ｍｍ／時間、Ｂ＝１％、Ｅ＝３％、杆状核（rod nuclears）＝１０％、分葉核＝７０％、リンパ球＝１１％、ＭＯＮ＝５％。
【００７２】
一般的な痰解析：色−灰色、特性−粘液性、粘稠度（constitution）−粘性、扁平上皮−１０〜１２×、肺胞上皮−３〜５×、Ｌ−１０〜１２×、赤血球−なし、杯細胞−見られず。
【００７３】
血液生化学解析：グルコース−５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、総ビリルビン−１１μｍｏｌ／Ｌ、ＡＬＴ−０．２４、ＡＳＴ−０.１６ｍｍｏｌ／時間／Ｌ、尿素−５．１２ｍｍｏｌ／Ｌ、クレアチニン−０．１０８ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アミラーゼ−７．０ｍｍｏｌ／Ｌ。
ホルモン状態：血清コルチゾール−３９．８ｎｍｏｌ／Ｌ
免疫状態の評価：
ＣＤ３+−５３％ ＩｇＧ−８．７４ ＴＳＩＫ−４０相対単位
ＣＤ４+−３４％ ＩｇＡ−０．６７ ＮＳＴ−９４／１５８／１．７
ＣＤ８+−１５％ ＩｇＭ−１．３９
ＣＤ１６+−１２％ ＩｇＥ−１１３０．６
ＣＤ２０+−１８％
ＣＤ２５+−１．３％
ＥＫＧ：洞律動。ＨＲ＝７６拍動／分
画像：病変なし
ＦＶＤ：ＦＶＣ＝６６％、ＦＥＶ＝５２％、ＦＥＶ／ＦＶＣ＝６１％、
ＭＯＣ７５＝３７％、ＭＯＣ５０＝３４％、ＭＯＣ２５＝５１％。
ＰＴＭ：Ｌ／ｅｘｐ−２．０Ｌ／ｓ Ｌ／ｅｘｐ−１．０Ｌ／ｓ。
胸部ｘ線：気腫性の肺野、より小さい区画でのびまん性肺硬化症
ＥＮＴ診察：診断：持続性アレルギー鼻炎。慢性咽頭炎。
【００７４】
患者は以下のように診断された：ＤＳ：気管支喘息、持続性の疾患経過が重篤なホルモン依存性の憎悪。合併症：ＤＮ２。肺気腫、肺硬化症。
【００７５】
付随疾患：持続性アレルギー鼻炎。憎悪しない花粉症。
患者に以下のような治療を指示した：
１．呼吸困難の発作中のネブライザによるベントリン−２日間、その後多くても１日３、４回の呼吸困難中のアスタリン（ＤＡＩ）、
２．点滴：
１．２００．０ｍＬの生理食塩水中、プレドニゾロン９０ｎｕ−６０ｎｕ−３０ｎｕ、
２．Ｅｕｐｈｙｌｌｉｎｅ ２．４％−１０．０ｍＬ〜５．０ｍＬ。
３．ヘパリン ５０００単位。
４．Ｂｅｎａｃｏｒｔ２００（８００μｇ／日）。
５．プレドニゾロン ４錠／日（８：００、１２：００）
６．ネブライザによるＬａｚｏｌｖａｎ、その後１日３回の１錠のＡｍｂｒｏｈｅｘａｌ。
【００７６】
急性疾患の減衰中に（入院８日目）、毎日、５回の（No. 5）［sic］筋肉内で１日１回、１．０ｍＬの生理食塩水中０．１ｍｇの量でＳＣＶ−０７を処方した。治療過程を実施した（５回の筋肉内注射）後、患者は、健康、陽性気分の大幅な改善が見られ、副作用もなく、製剤が良好な耐容性を示し、体温は正常値内であった。
患者は、動的条件下で別の検査を受けた（ＳＣＶ−０７の５回目の筋肉内注射の２４時間後）：
総血液解析：赤血球−５．１２×１０12／Ｌ、ＨB−１５９ｇ／Ｌ、白血球−９．７×１０9／Ｌ、ＥＳＲ＝６ｍｍ／時間、ｂ−、ｅ−２％、杆状核−５％、分葉核−６７％、リンパ球−２０％、Ｍ−６％。
血液生化学解析：糖類−５．７、総ビリルビン−８．９、ＡＬＴ−０．１２、ＡＳＴ−０.１３、尿素−５．１２、クレアチニン−０．０７３。
一般的な痰解析−特性−粘液性、色 灰色、粘稠度 粘性、扁平上皮 ７〜８、肺胞上皮−なし、白血球−視野で１〜２×。
ホルモン状態−コルチゾール−７２．４
免疫状態の評価：
ＣＤ４+−３６ ＩｇＧ−１１．５
ＣＤ３+−５２ ＩｇＡ−１．１１
ＣＤ８+−１５ ＩｇＭ−０．９
ＣＤ１６+−７ ＩｇＥ−６７２．１ ＮＳＴ−１００／１６３
ＣＤ２０+−１１ κ−１．６
ＣＤ２５+−１．３ ＴＳＩＫ−７７
【００７７】
患者で疾患の陽性の動きがあった：呼吸困難の発作、咳、鼻炎の減衰、（１分当たり１６回までの）息切れ、鼻閉の軽減。患者は匂いを感じ始めた。
【００７８】
患者は入院１５日目で満足な状態で退院し、コルチコステロイド療法が維持用量（１日当たりプレドニゾロン２錠）まで減少し、ベース療法と１ヶ月以内の再検査を薦められた。
【００７９】
実施例４．花粉症の特定の免疫療法の有効性を高めるためのＳＣＶ−０７の使用
患者−４５歳のP-na M. N.。１回目の診察日−２００４年１０月。
診断：研究所で花粉症が、樹木花粉に対する感作があり、鼻結膜型で、閑散期に寛解することが確認された。
最初の臨床検査の結果：中程度の好酸球増加（７％）、中程度の高（hyper）ＩｇＥ免疫グロブリン血症（１６５ＭＥ／ｍＬ）、カバノキ及びハシバミの花粉に対する高い（ＭＡＳＴクラス ３）レベルの血清アレルゲン特異的なＩｇＥ、低減した（０．８８）免疫調節指数。
【００８０】
２００４年１１月下旬から２００５年３月中旬まで、患者は、以下のスキームに従ってアレルゴイド（「Ｐｕｒｅｔａｌ木」）を使用して、花粉症に特異的な免疫療法（ＳＩＴ）を受けた：１週間に１回皮下、０．０２５ｍＬの単回用量のアレルゴイド投与から始め、続いて治療過程中に、単回用量が０．５ｍＬに達するまで用量を徐々に上げ（０．０２５ｍＬ−０．０５ｍＬ、−０．１ｍＬ−０．２ｍＬ−０．３ｍＬ−０．４ｍＬ−０．５ｍＬ）、その後用量はこの用量を維持する。
【００８１】
続く花粉症の季節性増悪期間の性質（２００５年４月〜６月）が、ＳＩＴの有効性が極めて低いことを示し、顕著な鼻結膜症状には、必須用法の全身性経口抗ヒスタミン剤（Ｅｒｉｕｓ）と局所性ステロイド治療（Ｎａｓｏｎｅｘ）との使用が依然として必要であった。
【００８２】
上記の状況を考慮して、２００５年１０月中に、開始状態又は予想状態下でのＳＩＴの臨床効果を増大させるために、免疫刺激である製剤「ＳＣＶ−０７」治療（course）を以下のように経口で施した：連続して１０日間毎日、１日１回１．５ｍｇ。
【００８３】
「ＳＣＶ−０７」治療が完了したら、患者は、２００５年１１月中旬から２００６年３月中旬に、前のスキームに従ってアレルゴイド「Ｐｕｒｅｔａｌ木」を使用して、花粉症のために別のＳＩＴ治療を受けた。「ＳＣＶ−０７」治療と、花粉症のためのＳＩＴ治療の開始との間の間隔は１５日であった。
【００８４】
続く花粉症の季節性増悪期間の性質（２００６年４月〜６月）が、実行されたＳＩＴの有効性が有意に増大したことを示唆し、季節性の鼻結膜炎症状が実質的になくなり、樹木花粉の時期には、患者に抗ヒスタミン薬も局所ステロイドも使用しなかった。
【００８５】
得られた結果は、アレルギー性疾患を予防及び治療するのに「ＳＣＶ−０７」を使用することの有効性を示している。製剤の無害性と、その比較的低いコストとによって、この製剤が、独立療法として及び統合療法という状況においてこの目的に広く使用するのに有望となる。
【００８６】
実施例５：アレルギー性疾患のモルモットモデルにおけるＳＣＶ−０７の有効性
要約
喘息は、気管支収縮、炎症細胞の肺（特に好酸球）への浸潤、気道過敏性及び粘液分泌の増大を特徴とする肺障害である。アレルギー性喘息は、アレルゲンに対する有意な即時の気管支収縮反応と、炎症細胞浸潤と、肺損傷とを伴うモルモットでモデル化することができ、これはアレルゲン曝露の２４時間後に現れた。本研究の目的は、ＳＣＶ−０７がアレルゲン攻撃（challenge）後に炎症細胞の肺への浸潤を減衰することができるか否かを判定することであった。モルモットは、オボアルブミンの腹腔内注射によって感作させた。１７日目〜２１日目に、モルトットを、ＰＢＳビヒクル、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で腹腔内処理した。２１日目に、全ての動物を抗ヒスタミン薬で前処理し、死に至る可能性がある即時の気管支収縮反応を低減させた。その後、動物をエアロゾル化したオボアルブミンに曝し、アレルギー反応を開始した。対照動物はオボアルブミンで感作し、対照として生理食塩水で攻撃した。
【００８７】
ＳＣＶ−０７処理
即時のアレルギー反応中、動物の咳、呼吸困難及び全身疲労の軽減。
肺組織に常在する好酸球及び好中球の減少
気管支肺胞洗浄液中の赤血球漏出の有意な減衰から明らかなアレルギー性の肺損傷の軽減
アレルギー性肺への炎症細胞の浸潤、又はオボアルブミン特異的な抗体産生は目に見えて阻害はされなかった
【００８８】
結論：ＳＣＶ−０７は、即時のアレルギー反応と、その後の肺損傷を軽減するのに有望であるが、アレルギー性肺への炎症細胞の浸潤を防ぐ効果はない。今後の研究では、ＳＣＶ−０７がアレルゲン誘導性の気管支収縮を阻害する能力を調べる必要がある。さらに、赤血球浸出に対するＳＣＶ−０７の保護効果を考慮すると、微小血管透過性におけるアレルギー誘導性の変化、及びマスト細胞メディエータの放出を防ぐＳＣＶ−０７の能力を評価する必要がある。
【００８９】
略称
ＥＰＯ 好酸球ペルオキシダーゼ
ＭＰＯ ミエロペルオキシダーゼ
ＷＢＣ 白血球
ＲＢＣ 赤血球
ＢＡＬ 気管支肺胞洗浄液
ＮＳＳ 標準生理食塩水溶液
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＯＶＡ オボアルブミン
ｉｐ 腹腔内
【００９０】
背景：事例証拠は、他の兆候のためにＳＣＶ−０７を摂取している慢性喘息のヒトが、喘息用の救急薬の使用を減らすことができたことを示唆している。仮説：患者におけるβ2アゴニストの使用が減り、このことは気道過敏性及び／又はアレルゲン誘導性の初期及び後期気管支収縮がＳＣＶ−０７によって減衰することを示唆する。また喘息のマウスモデルの研究は、細胞浸潤がアレルゲン攻撃後にわずかに低減し得ることも示唆している（SciCloneとのコミュニケーション）。
【００９１】
目的：ＳＣＶ−０７が喘息のモルモットモデルにおける喘息症状を軽減するか否かを判定すること。
【００９２】
具体的な目的：感作後であるが、アレルゲン攻撃前のＳＣＶ−０７投与が、喘息のモルモットモデルにおける細胞浸潤を低減するか否かを判定する。
【００９３】
材料及び方法
動物
雌のダンキン・ハートレーモルモット（２００ｇ〜３５０ｇ）を、Charles River, Kingston, New York facility, Barrier K81から購入した。動物をミネソタ州ダールスに搬送し、実験開始前５日〜７日間、本発明者らの動物施設に収容した。実験処理群は表７に概説する。
【００９４】
【表７】
【００９５】
１つの実験当たり８匹〜１０匹の動物で５つの別々の実験をおよそ６ヶ月間にわたって実施した。第１の実験は、実験系が適切に働き、且つＯＶＡで攻撃した動物が有意に好酸球を発生することを確認するために、４匹のＰＢＳ ＮＳＳ動物と、４匹のＰＢＳ ＯＶＡ動物とから成っていた。続く４つの実験はいずれも、表７に示されたように、１つの処理群当たりの最終のＮを７、８匹の動物とするため、それぞれ６つの処理群で１匹〜３匹の動物から成っていた。
【００９６】
実験手順
０日目に、動物を５０ｍｇ／ｋｇのＯＶＡで腹腔内感作した。１７日目、１８日目、１９日目及び２０日目の午前８時〜１０時の間に、動物に、ＰＢＳ、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７、又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７（ペプチド処理）を腹腔内注射した。２１日目の午前８時〜１０時の間に、ＯＶＡ又は生理食塩水（ＮＳＳ）エアロゾル攻撃の２時間前、動物にペプチドを投与した。ＯＶＡ又はＮＳＳエアロゾル攻撃の３０分前、各動物に、抗ヒスタミン剤（６．１ｍｇ／ｋｇのマレイン酸ピリラミン）を腹腔内注射して、エアロゾルＯＶＡ攻撃に付随するアナフィラキシー反応による致死を予防した。デビルビスモデル３５Ｂの超音波ネブライザを使用して、プレキシガラス室（２２ｃｍ×２２ｃｍ×２９ｃｍ）内で５分間、動物を２匹１組で１％ ＯＶＡ溶液又はＮＳＳのいずれかのエアロゾルに曝した。全体で５分のエアロゾル投与（aerosolization）の間、動物を観察し、コメントを記録した。攻撃後２２時間〜２４時間以内に、動物を安楽死させ、心穿刺によって挽血し、洗浄して、細胞浸潤の測定のために肺葉を取り出した。ＯＶＡ又はＮＳＳ攻撃及び安楽死の時点で、動物の体重はおよそ３５０ｇ〜５５０ｇの範囲であり、平均体重はおよそ４２０ｇであった。この実験プロトコルは、以前に公開された研究（Regal and Fraser, 1996、Regal et al., 2000）で用いたものと同様のものである。
【００９７】
細胞浸潤の測定
動物をペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させ、心穿刺によって挽血し、室温のＰＢＳで洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）のために、気管にカニューレを挿入し、４倍容量のＰＢＳを気管カニューレに導入して、ゆっくりと回収した。洗浄液の総容量は６０ｍｌ／ｋｇであった。ＢＡＬを遠心分離し、細胞を堆積させ（sediment）、各動物のＢＡＬで回収した白血球（ＷＢＣ）の総数を決定するために、１．０ｍｌのＰＢＳ中でＢＡＬ細胞ペレットを再懸濁した。Lowry et al.（1951）の方法を用いて、ＢＡＬ上清中で回収した総タンパク質を求めるために、ＢＡＬ上清を−７０℃で凍結させた。チュルク液を用いた血球計における標準的な方法によって、ＢＡＬ中の総白血球を計測した。変法ライト染料（Diff Quik, American Scientific Products, McGraw Park, IL）で染色したＢＡＬ細胞（３×１０4個の細胞）のサイトスピン調製から白血球百分率（Differential counts）が得られた。４００個の細胞を計測し、好酸球、好中球又は単核細胞として同定した。ＢＡＬ細胞の白血球百分率及び白血球数は、ＢＡＬから１匹の動物あたりに回収した各細胞型の総数を算出するのに使用した。肺組織中の好酸球及び好中球の数を推定するために、それぞれ左肺葉を好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）の測定用に処理し、右肺葉をミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性用に処理した（Fraser et al., 1995）。肺の残りをグラム乾燥重量の測定のために、８０℃で３日〜５日間乾燥した。洗浄後の均質化肺由来のＥＰＯ活性を、左後葉由来の総ＯＤ／分として表した。洗浄後の均質化肺由来のＭＰＯ活性を、右後葉由来の酵素活性の総単位として表した。１ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７は、ＥＰＯアッセイ又はＭＰＯアッセイを阻害しなかった。ＢＡＬ中のＲＢＣの数は、上記のように、ＲＢＣ溶解後の再懸濁ＢＡＬ細胞ペレットのＯＤ412を求めることによって定量化した（Fraser et al., 1995）。洗浄手順中、及び計測のための細胞の再懸濁前に溶解したＲＢＣの数を推定するために、ＢＡＬ上清のＯＤ412も求めた。０．３ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７はｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＤ412測定に干渉しなかった。
【００９８】
ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１
上記のように、ＥＬＩＳＡによって、血清中のＯＶＡ特異的なＩｇＧ１を求めた（Fraser et al., 1998、Regal et al., 2000）。データを、標準におけるＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の濃度（これを１と規定した）で除算した試料におけるＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の濃度で表した。プロテインＡセファロースカラム上に、ＯＶＡで感作したモルモット由来の血清プールを通すことによって、ＩｇＧ標準を調製した。回収したＩｇＧをＮＳＳで透析し、アッセイにおける標準として使用するために等分した。
【００９９】
試薬
ＳＣＶ−０７
SciCloneのＳＣＶ−０７ ２００ｍｇをダルースに搬送し、−７０℃で保存した。消灯しながら、研究所で化合物を秤量し、暗所に保存した。２０ｕｇ／ｍｌのストック溶液及び２ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７をＰＢＳ中で作製し、−７０℃の冷凍室でアリコート１ｍｌが入ったポリプロピレン管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ管、Ｒｅｆ ７２．６９４．１０５）で保存した。ＳＣＶ−０７溶液を作製するのに使用するＰＢＳも等分し、対照のＰＢＳ注射のために凍結させた（ＰＢＳカタログ番号、Ｇｉｂｃｏ １００１０、カルシウム又はマグネシウムなし、エンドトキシンは、０．０３ＥＵ／ｍｌ未満であるとして試験した）。使用日にアリコートを解凍し、アルミホイルに包まれた試験管中、暗所で氷上に置いた。その日に完全に使用しなかった場合、冷蔵室中、暗所で保存して、次の日までに使用するか又は廃棄した。動物に、０．５ｍｌ／ｋｇのＰＢＳ、２ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７又は２０ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７を投与し、それにより送達用量のＳＣＶ１（１ｕｇ／ｋｇ）又はＳＣＶ１０（１０ｕｇ／ｋｇ）を得た。
【０１００】
感作用のＯＶＡ
２５ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン（Sigma製のＡ５５０３）の生理食塩水溶液（Baxter、滅菌、非発熱性）１００ｍｌを調製した。アリコート４ｍｌをNuncのｃｒｙｏｔｕｂｅバイアル（カタログ番号３３７５１６）中で−７０℃で保存した。動物に、２１ｇニードルでこのＯＶＡ溶液を２ｍｌ／ｋｇ腹腔内投与して、最終送達用量５０ｍｇ／ｋｇを得た。この実験の全ての動物をＯＶＡで感作した。
【０１０１】
エアロゾル攻撃用のＯＶＡ
室温のＮＳＳ（Baxter、滅菌、非発熱性）中で１％のＯＶＡ溶液をエアロゾル攻撃の日に新たに調製した。
【０１０２】
統計学的解析
全てのデータを対数変換して、分散を均等にし、正常なパラメトリックモデリングを行った。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の値に対して、統計学的解析前に、定数０．０１を全ての値に加えて、対数尺度での分散に対する非常に小さい値の影響を最小にした。全ての図の値は、７個、８個の値の幾何平均＋標準誤差（ＳＥ）を表す。統計学的解析には、ＪＭＰソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary, N. C., USA）を用いた対比（contrast：コントラスト）によるＡＮＯＶＡを使用した。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５と規定した。
【０１０３】
結果
ＯＶＡエアロゾルとの即時反応に対するＳＣＶ−０７の効果
ＯＶＡエアロゾル投与中に動物を観察し、記録したコメントを表８にまとめる。実験者は、処理に対して盲検ではなかった。表８の左側に見られるように、ＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物は通常の挙動を示し、呼吸パターン又は運動の変化は記録されなかった。概して、抗ヒスタミン剤を前処理し、ＯＶＡで感作及び攻撃した動物は、アレルゲンの攻撃により死に至ることはないが、呼吸困難になり、しばしば咳及び息切れを起こす。ＰＢＳ ＯＶＡ処理群における７匹の動物全てが、予想通り幾らかの可視反応を有していた。注目すべき結果は、ＯＶＡエアロゾルとの明らかな反応がなかった、ＳＣＶ１ ＯＶＡ処理群及びＳＣＶ１０ ＯＶＡ処理群における動物の数であった。これらのデータは、１ｕｇ／ｋｇ又は１０ｕｇ／ｋｇのいずれかでのＳＣＶ−０７の前処理が、アレルゲン感作及び攻撃の即時アナフィラキシー効果を保護することを示唆している。ＳＣＶ−０７が、アレルゲン攻撃に対する即時気管支収縮を減衰することが明らかに推測される。追跡実験はこの所見によって明らかに示される。
【０１０４】
【表８】
【０１０５】
肺へのＯＶＡ誘導性の細胞浸潤に対するＳＣＶ−０７の効果
全ての動物をＯＶＡで感作し、ＳＣＶ−０７の効果をＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物（陰性対照、アレルギー反応なし）と、ＯＶＡエアロゾルで攻撃した動物との両方で求めた。均質化肺中の好酸球ペルオキシダーゼの測定によって肺組織中の好酸球が、またミエロペルオキシダーゼの測定によって肺組織中の好中球が推測された（図４）。本発明者らの研究室と他の研究室との両方でのこれまでの研究によって、組織中の炎症性細胞の推量としてのこれらの測定結果の有効性が確認されている。さらに、本発明者らは、空域（airspace）中に存在していた白血球、即ちＢＡＬ細胞の数及び種類を求めた（図５、図６）。
【０１０６】
肺における常在細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
統計学的解析は、肺組織又は空域中での常在好酸球又は好中球に対するＳＣＶ−０７の有意な効果が存在していたか否かを判定するために、ＮＳＳエアロゾルのみによって攻撃した対照動物（ｎ＝２４）の対比によるＡＮＯＶＡを初めに包含していた。図４で示されるように、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７は、ＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物においてＭＰＯを有意に低減し、１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７は、ＥＰＯを有意に低減した（*ＰＢＳ ＮＳＳ対照に対してｐ＜０．０５）。これらのデータは、肺組織中でＳＣＶ−０７処理が常在好酸球及び好中球の数を有意に減少させることを示唆している（図４）。しかしながら、ＮＳＳで攻撃した対照動物のＢＡＬでは、ＳＣＶ−０７は、細胞の組成に有意な影響を与えなかった（図５、ＮＳＳ）。
【０１０７】
ＯＶＡ誘導性細胞浸潤に対するＳＣＶ−０７の効果
図４及び図５で明らかなように、ＡＮＯＶＡ解析は、肺ＥＰＯと、全てのＢＡＬ細胞型とにおける有意な全体的なＯＶＡの効果を示していた。本発明者らのこれまでの結果と一致して、肺ＭＰＯは、ＯＶＡ攻撃によっては有意に増大しなかった。ＳＣＶ−０７処理によって、常在好酸球及び好中球が変化したので、本発明者らは、以下のＡＮＯＶＡ対比を実施した：
（ＰＢＳ ＮＳＳからのＰＢＳ ＯＶＡへの変化）対（ＳＣＶ１ ＮＳＳからのＳＣＶ１ ＯＶＡへの変化）
（ＰＢＳ ＮＳＳからＰＢＳ ＯＶＡへの変化）対（ＳＣＶ１０ ＮＳＳからＳＣＶ１０ ＯＶＡへの変化）。
図４で示されるように、肺ＥＰＯにおける変化は、ＰＢＳ処理（＃）よりも１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７処理でより大きかった。肺ＭＰＯにおける変化は、ＳＣＶ−０７処理と変わらなかった。ＢＡＬ細胞を考慮すると、ＢＡＬ好中球における変化は、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７処理で異なっていた。これらの差は一部、ＳＣＶ−０７処理による常在好酸球及び好中球の減少によるものであった。％で表される細胞差は、マウス喘息モデル（SciCloneのｄｏｃ４３−１０７１８）におけるＳＣＶ−０７の研究との比較のために図６Ａ〜図６Ｃでも表される。ＢＡＬにおける好酸球％は、ＯＶＡエアロゾル攻撃したＳＣＶ−０７処理動物においては低減傾向にあった（図６Ａ）。しかしながら、ＢＡＬにおける総好酸球は変わらなかった（図５Ｂ）。
【０１０８】
ＯＶＡ誘導性肺損傷及び／又は微小血管透過性の変化に対するＳＣＶ−０７の効果
アレルゲン攻撃は、肺における微小血管透過性の増大、及び空域中への赤血球の漏出を引き起こし得る肺損傷の原因となることが知られている。これらの事象のいずれかが、血漿タンパク質又は間質液の空域中への漏出によるＢＡＬ液のタンパク質含量の増大を引き起こし得る。肺損傷及び／又は微小血管透過性の変化は、ＢＡＬにおけるＲＢＣ（図７Ａ、図７Ｂ）と、ＢＡＬ液の総タンパク質含量（図７Ｃ）とを求めることによって評価した。ＢＡＬにおけるＲＢＣの数は、細胞ペレットを溶解し、放出ヘモグロビンのＯＤ412を測定することによって推測した（図７Ａ）。さらに、計測用に洗浄手順前又は洗浄手順中、及び細胞再懸濁前に溶解したＲＢＣの数を推測するために、ＢＡＬ上清のＯＤ412も求めた（図７Ｂ）。図７で明らかなように、ＰＢＳ処理動物のＯＶＡ攻撃が、ＢＡＬにおけるＲＢＣ数と、ＢＡＬにおける総タンパク質を有意に増大した。ＮＳＳからＯＶＡへの変化のＡＮＯＶＡ対比は、１ｕｇ／ｋｇ又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかが、ＢＡＬにおけるＲＢＣ数を有意に減衰させたことを示していた（＃、図７Ａ）。さらに、ＢＡＬ上清のＯＤ412もＳＣＶ−０７によって有意に低減し、これは洗浄液回収プロセス中に溶解させるのに有意に少ないＲＢＣしか利用することができなかったことを示している（＃、図７Ｂ）。ＢＡＬ液における総タンパク質は、ＳＣＶ−０７処理による影響を受けなかった（図７Ｃ）。
【０１０９】
血清ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体に対するＳＣＶ−０７の効果
モルモットでアレルギー性肺反応に関与するマスト細胞を感作する抗体には、ＩｇＥ抗体とＩｇＧ１抗体との両方が含まれる。アジュバント非存在下でＯＶＡで感作したモルモットは最初に、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体を作製する。本発明者らの研究室でのこれまでの研究によって、本研究で動物を感作するのに使用する方法は、ＯＶＡ特異的なＩｇＥを産生する可能性が低いと判断されている（Fraser et al., 1995、Regal and Fraser, 1996）。ＳＣＶ−０７処理で見られるいずれの効果も産生されたＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体における変更によるものではなかったことを確認するために、血清中の濃度をＥＬＩＳＡで求めた（図８）。本研究では全て動物をＯＶＡで感作したので、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体は全ての群で検出可能であった。ＳＣＶ−０７処理又はＯＶＡ攻撃は、血清中のＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体の濃度に有意な影響を与えなかった。
【０１１０】
一般的な結論及び考察
喘息の制御は、重要な医療の課題である
近年の研究は、大多数の喘息患者は、市販の薬物では十分に制御されていないことを明示している。喘息の制御及び治療の実社会評価（The Real world Evaluation of Asthma Control and Treatment）（ＲＥＡＣＴ）の研究は、制御できない喘息が広く流行していることを示している。これらの結果は、標準的な喘息薬を使用する患者の５５％が制御できない喘息であったことを示唆していた。これらの患者の大多数が医療を利用できるにもかかわらず、このようなことが起こっていた（Peters et al., 2007）。この喘息制御の不足が、既存の薬物の準最適使用、又は既存の薬物が多くの喘息患者において正しいメディエータ及び／又は事象を標的としていないことに起因するか否かは明らかではない。したがって、新規の喘息療法は、アレルゲンに対する即時反応、又はアレルゲン曝露のより慢性的な炎症効果を標的とするか否かにかかわらず必要となる。即時アレルギー反応におけるメディエータの放出が、炎症性疾患のより慢性的な効果に寄与するという証拠は確かに存在する（Paul, 1999）。
【０１１１】
モルモットモデルの即時アレルギー反応における本研究の主な結論
モルモットにおけるＳＣＶ−０７処理によって、咳、呼吸困難及びＯＶＡエアロゾル攻撃で見られた即時アレルギー反応中の動物の全身疲労の低減が観察された。マウスモデルのこれまでの研究では、エアロゾルアレルゲン攻撃中の即時アレルギー反応に関しては全く所見が報告されていなかった。一般的に、マウスは、モルモットに比べて、肺機能において最小限の変化でアレルゲン攻撃に対して反応し、且つ、即時アレルギー反応中、死を防ぐために抗ヒスタミン剤の前処理を必要としない。モルモットモデルにおける即時反応に対するＳＣＶ−０７効果の本発明者らの所見は、アレルギー性疾患において臨床的に非常に有用なＳＣＶ−０７の特性を示唆している。皮膚及び肺における即時アレルギー反応におけるＳＣＶ−０７処理の有用性は、さらに研究する必要がある。
【０１１２】
アレルギー性肺炎症
モルモットは、アレルゲン感作と、アレルゲン攻撃後２４時間以内の炎症性細胞の肺への浸潤を伴う攻撃とに対して反応する。細胞の総数を調べると、５日間のＳＣＶ−０７前処理は、モルモット肺への好酸球浸潤における変化を阻害しなかった（図５）。ＳＣＶ−０７では、ＢＡＬにおけるアレルゲン攻撃後に集積した好酸球の％は減少傾向であった（図６）。しかしながら、これは統計的に有意なものではなかった。空域中の細胞型の割合が臨床的に重要であるか否か、又は空域中の細胞型の総数が評価に重要な変数であるか否かを考察することができる。これらのいずれかの評価（図５、図６）によって、同じ結論が得られる。ＳＣＶ−０７処理は、モルモット肺へのアレルゲン誘導性の炎症細胞浸潤をはっきりとは阻害しなかった。しかしながら、ＳＣＶ−０７処理は、対照動物における総肺ＥＰＯ及びＭＰＯを明らかに低減し、このことは、この化合物が正常状態の肺における常在好酸球及び好中球の数に影響を与えたことを示唆している。この所見は、ＳＣＶ−０７処理単独で常在細胞の数が変わるか否かを確かめるために、異なる処理群におけるモルモットの肺の組織病理学的試験によって追跡する必要がある。
【０１１３】
ＳＣＶ−０７によるアレルギー及び喘息のモデルシステムにおけるこれまでの調査には限界がある。本発明者は、喘息のマウスモデルにおけるＳＣＶ−０７の研究を再検討している（SciCloneのＤｏｃ４３−１０７１８）。マウス研究では、２つの異なる年齢群のマウスを感作し、ＯＶＡで攻撃して、細胞浸潤が報告された。２つの異なる年齢群のマウスにおいて試験を実施する根拠は明らかではなかった。モルモットによる本発明者らの研究では、１つの年齢群だけを評価した。幼若及び成体の雄及び雌のモルモットにおける本発明者らのこれまでの研究は、この性別及び年齢の動物が一貫して強いアレルギー性肺炎症を起こしたことを示していたため、本発明者らは、２００ｇ〜３５０ｇの雌モルモットを選択して使用した（Regal et al., 2006）。これらの動物は、研究中に活発に成長し、この体重範囲の動物は、アレルギー性炎症のモルモットモデルに一般的に使用される。報告されたマウス試験では、６週齢〜８週齢のマウスのＢＡＬにおいて、総細胞数は変化せずに、好酸球の％で軽度の減少が報告された。１８週齢〜２０週齢の動物では、ＳＣＶ−０７処理による細胞型の割合に差は見られなかったが、ＳＣＶ−０７は、１８週齢〜２０週齢のＢＡＬにおける総好酸球を減少させた。マウス研究では、非感作動物又は感作したが、エアロゾルＯＶＡで攻撃しなかった動物でのＢＡＬの細胞差又は総数は報告されていない。正常なモルモットは、肺において好酸球の常在集団を有する一方で、正常なマウス肺では好酸球は明らかなものではない。本発明者らの研究において、ベースラインＥＰＯ及びＭＰＯ測定に対するＳＣＶ−０７処理の効果のために、適切な対照ペプチド前処理群を用いて、ＮＳＳとＯＶＡエアロゾルとの間の変数の変化を統計学的に解析することは重要であった。このような比較はマウスデータには利用不可能であった。
【０１１４】
肺損傷又は微小血管透過性における変化
モルモット肺における重度のアレルギー反応は、２４時間後のＢＡＬにおける赤血球数の増加と共に起こる。明らかに、ＳＣＶ−０７はこの事象を有意に阻害した（図７）。このことが動物における即時アレルギー反応の観察された減衰を反映しているか（最初の５分）、又は即時反応の後であるが、最初の２４時間以内で肺で生じる損傷を反映しているかは、本発明者らの研究設計からは求めることはできない。しかしながら、ＳＣＶ−０７処理後のＢＡＬにおけるＲＢＣ数の顕著な差は、この化合物が非常に有意な保護的効果を有することを示唆している。この保護的効果には、非常に重要な臨床上の意義があり、今後の実験によって追跡をする必要がある。
【０１１５】
体液性免疫反応
ＳＣＶ−０７処理は、一次免疫反応がペプチド処理による影響を受けないように、ＯＶＡによる初期感作の１７日後に開始した。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の血清濃度は、アレルゲン攻撃後の洗浄時に求めた。予測通り、処理群におけるＩｇＧ１の血清レベルに有意な差はなかった。このことは、アレルギー反応で見られるいずれの変化も反応を媒介する細胞親和性抗体のアベイラビリティにおける差によるものではないと考えられることを示している。これは、ＯＶＡ特異的なＩｇＥに対する、小さいが有意な効果が、ＳＣＶ−０７処理マウスで見つかったマウス研究とは一部異なる。しかしながら、マウスモデルでは、ＳＣＶ−０７処理が異なり、ＯＶＡ＋ミョウバンの二次感作注射のわずか１日後に開始した。
【０１１６】
研究の強度及び制限
アレルギー性肺炎症のモルモットモデルがヒトにおける喘息を反映しているか否かは常に考慮され得るものである。モルモットモデルの利点は、肺への好酸球浸潤が容易に起こることである。さらに、モルモットは、アジュバントなしでＯＶＡに対する抗体を容易に産生する。欠点は、モルモットはヒトの様にＩｇＥ抗体を容易には産生しないが、細胞親和性ＩｇＧ１抗体を産生することである。ヒトと同様に、モルモットは、アレルゲン攻撃に対する顕著な即時気管支収縮反応を有する一方で、マウスモデルでのこの反応は、最小且つ短期間である。また、モルモットは、抗ヒスタミン剤で前処理しなければならず、又はモルモットの最大５０％が本発明者らのモデルでの５分のエアロゾル投与中に死滅する。このため、この付加的な薬物治療は、解釈を複雑にし得る。
【０１１７】
ＥＰＯ及びＭＰＯの測定によって、それぞれ肺葉での総好酸球及び好中球の様子が与えられるが、それらの細胞の位置に関する情報は与えられない。炎症細胞の位置を調べ、生化学的所見を確認するのに、組織病理学的追跡試験（Follow-up histopathology）が必要である。即時反応中に記録したコメントは、ＳＣＶ−０７が、アレルゲン曝露による即時気管支収縮反応から動物を保護したことを示唆している。しかしながら、肺機能の測定によって、この興味深い所見を追跡する必要がある。
【０１１８】
結論
喘息のこのロバスト（robust）モルモットモデルにおいて、ＳＣＶ−０７は、即時アレルギー反応と、その後の肺損傷との低減には有望であるが、アレルギー性肺への炎症細胞浸潤を防ぐ効果はない。今後の研究で、ＳＣＶ−０７がアレルゲン誘導性気管支収縮を阻害する能力を調べる必要がある。さらに、肺損傷に対するＳＣＶ−０７の予防的効果を考慮すると、微小血管透過性におけるアレルギー誘導性の変化と、皮膚及び肺におけるマスト細胞メディエータの放出とを防ぐＳＣＶ−０７の能力を評価する必要がある。
【０１１９】
参考文献
Fraser DG, Regal JF, and Arndt ML: Trimellitic anhydride-induced allergic response in the lung: Role of the complement system in cellular changes. J. Pharmacol exp Ther 273:793- 801 , 1995.
Fraser DG, Graziano FM, Larsen CP and Regal JF: The role of IgGI and lgG2 in trimellitic anhydride-induced allergic response in the guinea pig lung. Toxicology and Applied Pharmacology 150: 218-227, 1998.
Larsen CP and Regal JF: Trimellitic anhydride-induced cellular infiltration into guinea pig lung varies with age but not gender, lnt Arch Allergy Immunol 127:63-72, 2002.
Lowry OJ, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall PJ: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951 ;193:265-275.
Paul WE: Fundamental Immunology, 4th edition, 1999. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia.
Peters SP, Jones CA, Haselkorn T, Mink DR, Valacer DJ, and Weiss ST: Real-world evaluation of asthma control and treatment (REACT): Finding from a national Web-based survey. J Allergy Clin Immunol 119: 1454-1461 , 2007.
Regal JF and Fraser DG: Systemic complement system depletion does not inhibit cellular accumulation in antihistamine pretreated allergic guinea pig lung, lnt Arch Allergy Immunol 109:150-160, 1996.
Regal JF, Fraser DG, Weeks CD, Greenberg NA: Dietary phytoestrogens have antiinflammatory activity in a guinea pig model of asthma. PSEBM 223:372-378, 2000.
Regal JF, Regal RR, Meehan JL, Mohrman ME: Primary prevention of asthma: Age and sex influence sensitivity to allergen-induced airway inflammation and contribute to asthma heterogeneity in guinea pigs, lnt Arch Allergy Immunol 141 :241-256, 2006.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の治療の分野に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年５月１７日に出願されたロシア特許出願第２００７１１８２３７号明細書の優先権と、２００７年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／９５７，２０１号明細書の利点とを主張する。
【背景技術】
【０００３】
アトピー性気管支喘息は、産業先進国で広まっている疾患である。現在では、喘息の発症におけるＴリンパ球及びＴリンパ球によって産生されるサイトカインの役割は明らかである。１つの有力な仮説によれば、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の顕著な産出を伴う、ヘルパーＴ細胞のバランスが第２の型のヘルパーＴ細胞方向へと移行することが、肺組織において喘息過程を誘起及び維持するのに重要な因子である。
【０００４】
アレルギー状態は、患者の身体の免疫状態の低下及び環境汚染の進行に併せて産業先進国で広がっている。
【０００５】
現在、様々な医薬群に属する製剤が、アレルギーを予防及び治療するのに使用されている。特に、抗炎症薬の使用が提唱されており（アスピリン、イブプロフェン、ボルタレン、ヒドロコルチゾン）、抗ヒスタミン製剤（ジメドロール、ピポルフェン）が、症候性剤（symptomatic agents）、気管支拡張薬、吸着薬、天然起源及び合成起源の様々なホメオパシー製剤、コルチコステロイド等と併用して、様々なスキーム、及び脂肪細胞のカルシウムチャンネル遮断薬（クロマリン（chromalin）ナトリウム）とホルモン療法との様々な組合せで使用されている（特許文献１（２００２年）、特許文献２（１９９６年）、特許文献３（１９９４年）、非特許文献１、特許文献４（１９９０年）、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
最も知られている製剤の欠点は、比較的効率が低く、また非常に多くの禁忌があることである。特に、クロモグリク酸ナトリウム（インタール）は、吸入曝露中で且つアレルギー性疾患の症状が非常に小さい場合でしか効果がなく、抗ヒスタミン製剤は喘息には効果がなく、またアスピリントライアドは顕著な副作用を示す（特許文献５（１９９４年））といったことがある。
【０００７】
近年、一般的に受け入れられている或る理論が考慮されており、これによるとアレルギー性疾患は、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）と呼ばれるヘルパーＴリンパ球のアレルゲン特異的なクローンの活性化に付随した、免疫系の調節における障害によって引き起こされる（非特許文献４）。これに関連して、対となる（opposing）１型ヘルパーＴ細胞クローン（Ｔｈ１）の分化誘導因子を導入すること、又はＴｈ１によって合成されるサイトカインを使用することによるヘルパーＴ細胞クローンの相互調節の利用が、アレルギーの治療に提唱されている。特に、インターロイキン−１２、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）及び他の物質がこれらの目的で使用されている。
【０００８】
しかしながら、得られた結果は信頼性が不十分であり、多くの場合で矛盾していることが分かった。このため、ＩＦＮ−γのレベルが、炎症性アレルギー反応の強度及び疾患の臨床症状の重症度と相関関係にあることが示された（非特許文献５）。同時に、マウスでの多くの喘息モデルにおいて、動物でのＩＦＮ−γの投与が、気管支過敏性の増大を引き起こし得ることが示された（非特許文献６）。
【０００９】
喘息の患者での組換えインターロイキン−１２製剤の投与は、好酸球増加の低減を引き起こしたが、全体毒性が十分に高いという背景では、過敏性及び気管支痙攣症状の軽減を引き起こさなかった（非特許文献７）。
【００１０】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、アレルギー性疾患の治療に使用されている（非特許文献８）。全体として生物に正の効果を与える、動物でのＩＬ−１８の投与は、アレルギー症状の増大を引き起こすこともある。おそらくは、このことは、ＩＬ−１８が両方の種類のヘルパーＴ細胞クローンを活性化すると共に、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の両方の合成を強める可能性があるということに関連する。
【００１１】
ＩＬ−１８及び上述の他の製剤の欠点は、免疫系のポリクローナル活性化、効果の選択性の欠如、及び高い毒性であり、これは臨床試験中に見られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ロシア特許第２２４０１２６号明細書
【特許文献２】ロシア特許第２１３９１００号明細書
【特許文献３】ロシア特許第２１１６７６９１号明細書
【特許文献４】旧ソ連特許第１５４４４３８号明細書
【特許文献５】ロシア特許第２１７００９１号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Handbook for the Practical Physician, Moscow, Meditsina, 1988, Vol.1, p. 60-68
【非特許文献２】Immunocorrection on Pulmonology／A. G. Chuchalin編、Moscow, Meditsina, 1989, p. 202-210
【非特許文献３】Allergology. General Allergology, Vol. 1／G. B. Fedoseev編、St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, p. 816
【非特許文献４】Allergology. General Allergology, Vol. 1／G. B. Fedoseev編、St. Petersburg, Nordmed Publishers, 2001, 816 pages
【非特許文献５】Leonardi A., Curnow S., Zhan H., Calder V. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast culture. Clin. Exp. Allergy, 2006, V. 36, p. 777-784
【非特許文献６】Hessel E., Van Oosterhout A., Van Ark I. et al. Development of airway hyperresponsiveness is dependent of IFN-gamma and independent of eosinophil infiltration. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1997, V. 16, p. 325-335
【非特許文献７】Bryan S., O'Connor B., Matti S. et al. Effects of recombinant human IL-12 on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response. Lancet, 2000, V. 356, p. 2149-2153
【非特許文献８】Wild J., Sigounas A., Sur N. et al. IFN-γ-inducing factor (IL-18) increases allergic sensitization, serum IgE, Th2 cytokines, and airway eosinophilia in a mouse model of allergic asthma. J. Immunol., 2000, V. 164, p. 2701-2710
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
当該技術分野において、被験者においてアレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、被験者において、アレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法は、被験者に、有効量の式Ａの免疫調節化合物を投与することを含む。
【００１６】
【化１】
【００１７】
式Ａにおいて、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である。好ましくは、ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一実施形態による結果を示す図である。
【図２】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図３】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図４】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図５】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図６】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図７】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【図８】本発明によるさらなる結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一実施形態によれば、本発明は、被験者、好ましくはヒト患者において、喘息等のアレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法に関する。或る特定の実施形態では、アトピー性気管支喘息が治療される。
【００２０】
本発明による免疫調節化合物は式Ａの免疫調節剤を含む。
【００２１】
【化２】
【００２２】
式Ａにおいて、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である。好ましくは、ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである。
【００２３】
「Ｘ」に対する芳香族アミノ酸又は複素環アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−又はジ−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル置換アミド、アリールアミド、及び（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルエステル又はアリールエステルである。「Ｒ」に適切なアシル部又はアルキル部は、炭素数１〜約６の分岐アルキル基又は非分岐アルキル基、炭素数２〜約１０のアシル基、並びにカルボベンジルオキシ及びｔ−ブチルオキシカルボニル等の保護基である。ｎが２のとき、式Ａに示されるＣＨ基の炭素は、Ｘの立体配置と異なる立体配置を有していることが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、及びβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン等の化合物が利用される。特に好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７と称することもある）が利用される。これらの化合物と、これらの化合物、これらの化合物の医薬的に許容可能な塩、及びこれらの製剤処方を調製する方法とは、米国特許第５，９１６，８７８号明細書（参照されて本明細書の一部とする）に開示される。
【００２５】
γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンであるＳＣＶ−０７は、γ−グルタミル部又はβ−アスパルチル部を有する免疫調節剤群の成員であり、これはロシアの科学者によって発見され、SciClone Pharmaceuticals, Inc.により米国で幾つかの症状に対する有効性が試験されている。ＳＣＶ−０７は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの免疫調節活性を有している。ＳＣＶ−０７はＣｏｎ−Ａ誘導性の胸腺細胞及びリンパ細胞の増殖を高め、Ｃｏｎ−Ａ誘導性のインターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生及び脾臓リンパ細胞によるＩＬ−２受容体の発現を高めると共に、骨髄細胞におけるＴｈｙ−１．２の発現を刺激する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＳＣＶ−０７は、５−ＦＵ免疫阻害動物及びヒツジの赤血球による免疫付与モデルにおいて強い免疫刺激効果がある。
【００２６】
任意の有効用量、例えば約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲の用量で、式Ａの化合物を投与することができる。１日に１回又は複数回の調剤の投与で、１週間に１回又は複数回、例えば毎日、調剤を投与してもよい。経口、鼻孔、経皮、舌下、注射による、定期的な注入、連続注入等を含む任意の好適な方法で、投与することができる。この調剤は、筋肉内注射で投与することができるが、他の形態の注射及び注入を利用してもよく、経口吸入若しくは鼻孔吸入、又は経口摂取等の他の投与形態を用いることができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、式Ａの化合物を約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１ｍｇの範囲内の用量で、最も好ましくは約０．１ｍｇの用量で投与する。
【００２８】
また用量は、１ｋｇ当たりのμｇで測定することができ、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００２９】
ＳＣＶ−０７は、化学合成によって得られ、均質になるまで高速液体クロマトグラフィで精製した有効成分ジペプチド−γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ（γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン）を含有する（ロシア特許第２０９１３８９号明細書（１９９７年）、ロシア特許第２１２０２９８号明細書（１９９８年））。製剤はこれまで、感染症において、及び外科手術後に免疫力を回復させるのに使用されてきた。製剤には、体重１ｋｇ当たり０．００００１ｍｇ〜０．０１ｍｇという低い用量で免疫刺激効果があり、即ち製剤は極めて低い濃度で効果を示す。
【００３０】
アレルギー性疾患を治療するために、製剤を薬局方で許可された用量で投与する。身体への投与形態及び疾患の特徴に応じて、或る特定の実施形態では、製剤の１日用量は０．１ｍｇ〜１．５ｍｇである。より低い用量での製剤の使用が可能ではあるが、治療効果が低減し、１．５ｍｇを超える用量での使用は経済的に得策ではない。製剤は、用いられる用量の最低１０００００倍であっても非毒性である。
【００３１】
非経口（筋肉内又は腹腔内）で用いる場合、或る特定の実施形態では、製剤は、１ｍＬの容量の塩化ナトリウム等張溶液中で使用し、その溶液中に、賦形剤（Ｄ−マンニトール ９．０ｍｇ、塩化ナトリウム １．０ｍｇ）と共に有効成分を溶解する（γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｒｐ １００μｇ）。或る特定の実施形態での単回用量は、０．１ｍｇ（０．００１ｍｇ／ｋｇ）である。或る特定の実施形態では、５回〜１０回の注射の形で製剤による治療が行われる。
【００３２】
経口で用いる場合、或る特定の実施形態では、製剤は、０．３５ｍｇ又は１．５ｍｇの有効成分を含有する錠剤の形で使用する。或る特定の実施形態では、製剤は、１週間〜２週間、１日１回又は２回使用する。
【００３３】
置換部(substituted)、欠失部、伸長部、置き換え部(replaced)、又はそうでなければＳＣＶ−０７と実質的に同等の生物活性のある修飾部を有する生物学的に活性な類似体、例えばＳＣＶ−０７と実質的に同等の活性を伴って、実質的に同じように機能するような、ＳＣＶ−０７と十分に相同性であるＳＣＶ−０７由来ペプチドが含まれる。
【００３４】
一実施形態によれば、治療期間又は予防期間、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、式Ａ化合物を患者に投与することができる。本発明に従うと治療期間が非常に長くなると考えられるが、本発明の実施形態は、少なくとも約６時間、１０時間、１２時間、又はそれ以上の治療期間、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持することを包含する。他の実施形態では、治療期間は、少なくとも約１日、さらには数日、例えば１週間又はそれ以上である。しかしながら、上記で規定したように、有効量の式Ａ化合物が患者の循環系において実質的に継続して維持される治療は、同様の又は異なる長さの非治療期間で分断されていてもよいと考えられる。
【００３５】
一実施形態によれば、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、治療期間中、例えば静注によって式Ａ化合物を患者に継続して注入する。注入は、ミニポンプのような任意の好適な手段によって実施し得る。
【００３６】
代替的には、患者の循環系において有効量の式Ａ化合物を実質的に継続して維持するように、式Ａ化合物の注射レジメンを維持することができる。好適な注射レジメンは、治療期間中、患者の循環系において有効量の免疫調節化合物ペプチドを実質的に継続して維持するように、１時間、２時間、４時間、６時間等ごとの注射を包含し得る。
【００３７】
式Ａ化合物の継続注入の間、実質的に投与期間が長くなると考えられるが、一実施形態によれば、式Ａ化合物の継続注入による治療期間は少なくとも約１時間である。より好ましくは、より長い期間、例えば少なくとも約６時間、８時間、１０時間、１２時間又はそれ以上の期間、継続注入を実施する。他の実施形態では、少なくとも約１日、さらには数日、例えば１週間又はそれ以上、継続注入を行う。
【００３８】
実施形態によっては、式Ａ化合物は、注射用水、生理学的濃度の生理食塩水等のような医薬的に許容可能な液体担体中に存在する。
【００３９】
式Ａ化合物の有効量は、日常の用量漸増実験によって求めることができる。
【００４０】
式Ａ化合物を他の喘息治療剤と共に投与することもできる。
【００４１】
以下の非限定的な実施例で、本発明を説明する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：アトピー性気管支喘息の治療
ＳＣＶ−０７は、免疫系に対して広範な作用を有する、具体的にはＩＬ−２及びインターフェロン-γ産生を高めることができる合成免疫調節剤である。この活性は、製剤の影響下で、ヘルパーＴ細胞のバランスが第１の型のヘルパーＴ細胞へと移行することに明らかに起因している。この研究の目的は、マウスにおける実験的なアレルギー性喘息に対するＳＣＶ−０７の効果を調べることであった。このために、本発明者らは、アレルゲンの吸入投与によるアレルギー性オボアルブミン喘息モデルを用いた。予め感作した生物にアレルゲンが接触した状態をモデル化するために、予備全身免疫付与後、ＳＣＶ−０７を動物に投与した。
【００４３】
材料及び方法
実験的なアレルギー性喘息のモデル化
Ｂａｌｂ／Ｃ株の非病原性の雌マウス（「Pushchtino」の実験動物のブリーダー）を、一定温度、１２時間の昼／夜サイクルで、ＳＰＦビバリウム（vivarium：動物施設）条件下に置き、自由に殺菌飼料及び水を与えた。２系統の実験では、６週齢〜８週齢のマウスと、１８週齢〜２０週齢のマウスとをそれぞれ、実験開始時に用いた。
【００４４】
動物に、１匹のマウス当たり８μｇの用量で硫酸アンモニウムを基にしたアジュバント中のオボアルブミン溶液（Sigma）を５日間隔で２回免疫付与した。ＳＣＶ−０７を、１回目の免疫付与後６日目〜１１日目に１日１回、２００μＬ量のＰＢＳ中０．１μｇ／ｋｇ又は１．０μｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。対照群は、同じ日に生理食塩水を摂取した。各群には６匹〜１０匹の動物が含まれていた。１回目の免疫付与後、１２日目、１６日目及び２０日目に、動物を密封箱に入れ、そこに空気を連続混合させながら、１分間、超音波ネブライザＬＤ−２０７Ｕ（Little Doctor）によって、１％オボアルブミンのＰＢＳ溶液（ＯｖＡ）のエアロゾルを発生させた。動物のエアロゾルへの曝露時間は１５分であった。実験的なアレルギー性喘息の重症度の解析は、最後のエアロゾル曝露の２４時間後に実施した。
【００４５】
ＳＣＶ−０７の使用中における実験的なアレルギー性喘息の重症度変化の解析は、気管支肺胞洗浄液の細胞学的組成、組織学的試験及び抗原特異的なＩｇＥ抗体の力価の決定に従って実施した。
【００４６】
マウスを、致死用量のバルビタールナトリウムの腹腔内投与によって屠殺した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、ＰＢＳ溶液１ｍＬを気管に通し肺を洗浄することによって得た。ＢＡＬ細胞を遠心分離して沈殿させ、沈殿物を再懸濁し、細胞濃度をＧｏｒｙａｅｖチャンバで計算して、塗抹標本（smears）を調製した。塗抹標本を乾燥させ、固定し、ロマノフスキー色素で染色した。気管支肺胞洗浄液の細胞学的組成は、油浸レンズを備えた光学顕微鏡（接眼レンズ×１６、対物レンズ×１００）下で調べた。細胞２００個当たりの単球／マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球の数を計測し、これは少なくとも５つの視野で観察した。各細胞集団の相対的な細胞数を総細胞数の割合として表した。
【００４７】
気管支肺胞洗浄液を回収した後、３日〜７日間、肺を４％パラホルムアルデヒドで固定し、アルコール（２％セルイジン（celluidine）−ヒマシ油）とクロロホルムとを増大させながら、ぺテルフィ溶液を通し、パラフィンに流し込んだ。５μｍ厚の切片を調製した。細胞浸潤及びシッフヨード酸の強度を評価するのに、切片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、杯細胞の数を計算した。
【００４８】
気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の定量評価を、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅプログラムパッケージによって形態計測的に実施した。各動物由来の肺切片の３つの気管支と３つの血管とを解析した。浸潤領域を、気管支又は血管及びその周囲の浸潤を含有する組織領域と、血管又は気管支自体の領域との間の差として算出した。浸潤指数を、浸潤領域と、血管又は気管支の領域との比として算出した。実験群は、解析に含まれる気管支及び血管の領域に関しては同程度であった（群間の差は有意なものではなかった、ｐ＞０．６）。
【００４９】
気管支切片での杯細胞と上皮細胞との数は、各動物由来の肺切片で少なくとも５つの視野で算出し、全細胞数の割合として表した。実験群は、解析に含まれる気管支の大きさでは同程度であった（気管支における細胞数に関しては、群間の差は有意なものではなかった、ｐ＞０．５）。
【００５０】
末梢血を後眼窩洞から採取した。血清及び気管支肺胞洗浄液において抗ＯｖＡ ＩｇＥの力価を、以下のスキームに従って固相ＩＦＡによって求めた。ビオチンで標識したマウスＩｇＥに対するラット抗体（Caltag）を製造業者が推奨する希釈で（１００μＬ／ウェル）ＩＦＡに対する９６ウェルプレート（（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に導入し、室温で１時間インキュベートして洗浄した。それから、血清試料又はＢＡＬを段階希釈して導入し、室温で１時間インキュベートして洗浄した。その後、ＯｖＡを加え、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識して、室温で１時間振盪器でインキュベートして洗浄し、ペルオキシダーゼ用の基質を導入して（ＯＰＤ、Sigma）、１５分間インキュベートした。１ＭのＨ2ＳＯ4を添加することで反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍの波長で、Ｖｉｃｔｏｒ２分光光度計（Wallac）で解析した。バックグラウンドを差し引いた後、抗原特異的なＩｇＥの力価の定量比較のために、本発明者らは、動物対照群の試料での各希釈における平均光学密度を算出し、実験の全ての動物由来の試料での対応する希釈における光学密度を、得られた値の割合として表した。
【００５１】
結果の統計処理を、Microsoft社のエクセルとウィンドウズ（登録商標）用のＳＰＳＳプログラム（バージョン１３）とで実施した。コルモゴロフ・スミルノフ基準を用いて、分布の正規性を求めた。正規分布した値に対する群間の差の有意性を評価するために、本発明者らは、偏差が等しくない両側スチューデント検定を使用し、非正規分布した差には、マンホイットニー検定を使用した。差は、ｐ＜０．０５で有意性があると考えられた。特に明記しない限り、データは平均±標準偏差の形で表す。
【００５２】
得られた結果によれば、幼若動物（実験開始時で６週齢〜８週齢）での実験におけるＢＡＬの細胞組成の解析は、ＳＣＶ−０７の有意な効果を示してはいなかった。全ての群におけるＢＡＬの総細胞性（cellularity：細胞充実度）はおおよそ同じであった（対照群では２．００±０．３４×１０6個の細胞、０．１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群では１．９６±０．９９×１０6個、及び１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群では２．２１±１.１６×１０6個）。ＢＡＬでの個々の白血球集団の相対的割合を比較することによって、本発明者らは、対照動物に比べて１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群で、好酸球の割合が有意に低くなり、マクロファージの割合が有意に高くなったことに気が付いた（表１を参照されたい）。ＢＡＬにおける個々の集団の細胞絶対量は、群間で有意に異なっていなかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
１８週齢〜２０週齢の動物での実験において、ＳＣＶ−０７を摂取した群におけるＢＡＬの細胞組成の変化が本質的に異なっていた。本発明者らは、０．１μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群での洗浄液における総細胞数の有意な低減（対照群の２．０３±０．７８×１０6個に比べて１．１２±０．１５×１０6個、ｐ＜０．０５）、及び１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群でのこの指数における異なる低減傾向（１．３２±０．２３×１０6個）に気が付いた。個々の亜集団の白血球含有率において有意差がない場合、絶対値の解析は、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群での好酸球、好中球及びリンパ球の数、並びに１．０μｇ／ｋｇの製剤を摂取した群での単球／マクロファージ、好中球及びリンパ球の数の有意な低減を示した（表２、図１を参照されたい、ＳＣＶ−０７はＳＣＶ−０７と呼ばれる）。
【００５５】
【表２】
【００５６】
６ヶ月齢〜８ヶ月[sic]齢の動物の血清及び気管支肺胞洗浄液におけるモデルで使用されたＩｇＥ抗原に特異的な力価の測定は、対照群に比べて、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した群の血清における力価において有意な低減を示す。１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取したマウスでは、抗ＯｖＡ ＩｇＥの力価は、血清と気管支肺胞洗浄液との両方で有意に低くなった（表３、図２を参照されたい、ＳＣＶ−０７はＳＣＶ−０７と呼ばれる）。
【００５７】
【表３】
【００５８】
１８週齢〜２０週齢のマウスを使用した実験では、本発明者らは、ＳＣＶ−０７を使用した後にＩｇＥに特異的な力価において減少傾向も観察したが、全ての群の指数で、非常に高い変動性があり、統計的に有意な差はなかった（表４を参照されたい）。
【００５９】
【表４】
【００６０】
マウス切片の形態解析は、０．１μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を摂取した動物の気管支上皮における杯細胞の割合において２倍を超える低減を示し、対照群に比べて有意であった（表５を参照されたい）。今のところ、気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の強度の形態学的評価は完了していない。
【００６１】
【表５】
【００６２】
気管支周囲浸潤及び血管周囲浸潤の強度の形態学的評価によって、ＳＣＶ−０７を摂取した両方の群の気管支周囲浸潤において信頼性のある低減が実証された。また血管周囲浸潤の強度は、ＳＣＶ−０７を摂取した群において異なる減少傾向であったが、兆候の変動性が高かったために、対照との差は統計的に信頼できるものではなかった（表６を参照されたい）。
【００６３】
【表６】
【００６４】
結論
得られた結果は、アレルギー性喘息モデルにおいてＳＣＶ−０７を使用する間、実験的プロセスの重症度の低減が観察され、具体的には気管支内腔への白血球の発生及び気管支周囲の浸潤が少なくなり、気管支肺胞洗浄液の好酸球増加が軽減し、血清及び洗浄液における抗原特異的なＩｇＥの量が少なくなり、且つ気管支上皮における粘液形成杯細胞の数も減少することを示している。
【００６５】
実施例２．クローンＴｈ１及びＴｈ２によるサイトカインの産生に対するＳＣＶ−０７の効果
体重１ｋｇ当たり０．１μｇ及び１．０μｇの用量で１日５回、腹腔内注射の形でＳＣＶ−０７を無処理の野生型マウスに投与した。この後、脾臓細胞の単離を行い、細胞を５μｇ／ｍＬの用量でコンカナバリンＡで刺激することによって、培養液中でサイトカイン合成を誘導した。合成サイトカインの量を定量的な免疫酵素解析によって求めた。実験結果を図１に示し、これはＳＣＶ−０７の腹腔内投与後、マウス脾臓細胞によるインターロイキン−４及びインターフェロン−γのマイトジェン誘導性の産生を示す。図１で明らかなように、２つの異なる[sic]サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のＣｏｎＡ誘導性の産生変化は実際は相互に関係していた。ＳＣＶ−０７の影響下で（１μｇ／ｋｇ）、脾臓細胞によるＩＬ−４産生における２倍の低減と、ＩＦＮ−γ産生におけるおよそ５倍の増大に気が付いた。これらのデータは、ＳＣＶ−０７が脾臓のＴ細胞の機能的反応を刺激し、ＩＬ−２産生を高めるだけでなく、同時に主に１型ヘルパーＴ細胞を活性化することによって、ヘルパーＴ細胞の極性化に影響を与えることを示唆している。
【００６６】
実施例３．ＳＣＶ−０７による気管支喘息の治療
１９５２年生まれの患者B-skiiは、１日に６、７回の呼吸困難の発作、退院を困難にする痰を伴う咳、息切れ及び鼻閉を訴えていたことが報告された。１９８５年以降、彼は気管支喘息を患い、疾患の憎悪に併せてアレルギー科の救急医療センターに数回入院していたことが病歴から知られている。１９９７年以降、彼はグルココルチコイドの全身投与を受けている（プレドニゾロン１日２錠−維持用量）。彼は、ベクラゾン ＬＤ ２５０（１０００μｇ以下／日）、Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅ ２５０（１０００μｇ以下／日）、持続性気管支拡張薬（セレベント ２５μｇ／単位 ５０μｇ／ｓ）、Ｔｅｏｔａｒｄ ２００（２ｋ／日、４００ｍｇ／日）も服用している。発作はサルブタモール（ベントリン）で治療する。
【００６７】
１９９４年に、彼は、Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｏｆｆｉｃｅでアレルギー試験を受け、家庭内アレルゲンが見つかった（ハウスダスト（household dust）、イエダニ）。重篤な疾患経過を考慮して、ダストＡＳＩＴは行わなかった。最近の憎悪は２週間前であり、この時ベース療法を背景に呼吸困難の発作が起こり、β−２アゴニスト（短期間）での治療が困難であり、気管支痙攣及び息切れが増大した。彼は、通院治療の不応期に併せて、ＧＵＺ２号病院のアレルギー科に入院した。
【００６８】
アレルギー病理に関する遺伝性を材料系に沿って追跡した。
アレルギー歴：
薬剤−陰性、
食べ物−ハチミツ、柑橘類、スイカ、メロン（鼻閉、呼吸困難発作、咳）、
家庭内（ハウスダスト）−呼吸困難の発作、咳、鼻閉、鼻漏、
表皮−陰性、
鼻炎のダストによる季節性の憎悪（Dust-seasonal exacerbation）、結膜炎、１０年間の夏秋期間（７月〜１０月）における呼吸困難頻度の増大、
昆虫−陰性。
【００６９】
検査時：平均の重症状態。誘導した患者の体位（座位）。皮膚片−清潔、蒼白、乾燥。皮下リンパ節は肥大していない。甲状腺は触診しない。鼻呼吸は重度に妨げられており、わずかな粘液しか鼻孔から分離しないが、患者は匂いを認識しない。結膜−桃色。鼻粘膜（検鼻法中）−蒼白、浮腫。口腔粘膜−桃色。呼気の呼吸困難特性。呼吸数＝１分間当たり２４回。胸腔 樽状。打診−肺音の夾膜共鳴（capsular resonance）。聴診−全ての肺野にわたって散在した大量の乾性ラ音。心音は律動的である。ＨＲ＝Ｐ５＝１分当たり７８回。ＢＰ＝１３０／８５ｍｍＨｇ。
【００７０】
舌が白色痂皮に覆われている。腹部は柔らかく無痛である。肝臓は肋骨弓の縁に沿っている。腎臓域は変わらず、パステルナーク症候群は両側で陰性である。
【００７１】
入院時に、検査を実施した：
一般的な血液解析：赤血球＝５．０７×１０12／Ｌ、ヘモグロビン＝１６７ｇ／Ｌ、白血球＝１１．６×１０9／Ｌ、ＥＳＲ＝５ｍｍ／時間、Ｂ＝１％、Ｅ＝３％、杆状核（rod nuclears）＝１０％、分葉核＝７０％、リンパ球＝１１％、ＭＯＮ＝５％。
【００７２】
一般的な痰解析：色−灰色、特性−粘液性、粘稠度（constitution）−粘性、扁平上皮−１０〜１２×、肺胞上皮−３〜５×、Ｌ−１０〜１２×、赤血球−なし、杯細胞−見られず。
【００７３】
血液生化学解析：グルコース−５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、総ビリルビン−１１μｍｏｌ／Ｌ、ＡＬＴ−０．２４、ＡＳＴ−０.１６ｍｍｏｌ／時間／Ｌ、尿素−５．１２ｍｍｏｌ／Ｌ、クレアチニン−０．１０８ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−アミラーゼ−７．０ｍｍｏｌ／Ｌ。
ホルモン状態：血清コルチゾール−３９．８ｎｍｏｌ／Ｌ
免疫状態の評価：
ＣＤ３+−５３％ ＩｇＧ−８．７４ ＴＳＩＫ−４０相対単位
ＣＤ４+−３４％ ＩｇＡ−０．６７ ＮＳＴ−９４／１５８／１．７
ＣＤ８+−１５％ ＩｇＭ−１．３９
ＣＤ１６+−１２％ ＩｇＥ−１１３０．６
ＣＤ２０+−１８％
ＣＤ２５+−１．３％
ＥＫＧ：洞律動。ＨＲ＝７６拍動／分
画像：病変なし
ＦＶＤ：ＦＶＣ＝６６％、ＦＥＶ＝５２％、ＦＥＶ／ＦＶＣ＝６１％、
ＭＯＣ７５＝３７％、ＭＯＣ５０＝３４％、ＭＯＣ２５＝５１％。
ＰＴＭ：Ｌ／ｅｘｐ−２．０Ｌ／ｓ Ｌ／ｅｘｐ−１．０Ｌ／ｓ。
胸部ｘ線：気腫性の肺野、より小さい区画でのびまん性肺硬化症
ＥＮＴ診察：診断：持続性アレルギー鼻炎。慢性咽頭炎。
【００７４】
患者は以下のように診断された：ＤＳ：気管支喘息、持続性の疾患経過が重篤なホルモン依存性の憎悪。合併症：ＤＮ２。肺気腫、肺硬化症。
【００７５】
付随疾患：持続性アレルギー鼻炎。憎悪しない花粉症。
患者に以下のような治療を指示した：
１．呼吸困難の発作中のネブライザによるベントリン−２日間、その後多くても１日３、４回の呼吸困難中のアスタリン（ＤＡＩ）、
２．点滴：
１．２００．０ｍＬの生理食塩水中、プレドニゾロン９０ｎｕ−６０ｎｕ−３０ｎｕ、
２．Ｅｕｐｈｙｌｌｉｎｅ ２．４％−１０．０ｍＬ〜５．０ｍＬ。
３．ヘパリン ５０００単位。
４．Ｂｅｎａｃｏｒｔ２００（８００μｇ／日）。
５．プレドニゾロン ４錠／日（８：００、１２：００）
６．ネブライザによるＬａｚｏｌｖａｎ、その後１日３回の１錠のＡｍｂｒｏｈｅｘａｌ。
【００７６】
急性疾患の減衰中に（入院８日目）、毎日、５回の（No. 5）［sic］筋肉内で１日１回、１．０ｍＬの生理食塩水中０．１ｍｇの量でＳＣＶ−０７を処方した。治療過程を実施した（５回の筋肉内注射）後、患者は、健康、陽性気分の大幅な改善が見られ、副作用もなく、製剤が良好な耐容性を示し、体温は正常値内であった。
患者は、動的条件下で別の検査を受けた（ＳＣＶ−０７の５回目の筋肉内注射の２４時間後）：
総血液解析：赤血球−５．１２×１０12／Ｌ、ＨB−１５９ｇ／Ｌ、白血球−９．７×１０9／Ｌ、ＥＳＲ＝６ｍｍ／時間、ｂ−、ｅ−２％、杆状核−５％、分葉核−６７％、リンパ球−２０％、Ｍ−６％。
血液生化学解析：糖類−５．７、総ビリルビン−８．９、ＡＬＴ−０．１２、ＡＳＴ−０.１３、尿素−５．１２、クレアチニン−０．０７３。
一般的な痰解析−特性−粘液性、色 灰色、粘稠度 粘性、扁平上皮 ７〜８、肺胞上皮−なし、白血球−視野で１〜２×。
ホルモン状態−コルチゾール−７２．４
免疫状態の評価：
ＣＤ４+−３６ ＩｇＧ−１１．５
ＣＤ３+−５２ ＩｇＡ−１．１１
ＣＤ８+−１５ ＩｇＭ−０．９
ＣＤ１６+−７ ＩｇＥ−６７２．１ ＮＳＴ−１００／１６３
ＣＤ２０+−１１ κ−１．６
ＣＤ２５+−１．３ ＴＳＩＫ−７７
【００７７】
患者で疾患の陽性の動きがあった：呼吸困難の発作、咳、鼻炎の減衰、（１分当たり１６回までの）息切れ、鼻閉の軽減。患者は匂いを感じ始めた。
【００７８】
患者は入院１５日目で満足な状態で退院し、コルチコステロイド療法が維持用量（１日当たりプレドニゾロン２錠）まで減少し、ベース療法と１ヶ月以内の再検査を薦められた。
【００７９】
実施例４．花粉症の特定の免疫療法の有効性を高めるためのＳＣＶ−０７の使用
患者−４５歳のP-na M. N.。１回目の診察日−２００４年１０月。
診断：研究所で花粉症が、樹木花粉に対する感作があり、鼻結膜型で、閑散期に寛解することが確認された。
最初の臨床検査の結果：中程度の好酸球増加（７％）、中程度の高（hyper）ＩｇＥ免疫グロブリン血症（１６５ＭＥ／ｍＬ）、カバノキ及びハシバミの花粉に対する高い（ＭＡＳＴクラス ３）レベルの血清アレルゲン特異的なＩｇＥ、低減した（０．８８）免疫調節指数。
【００８０】
２００４年１１月下旬から２００５年３月中旬まで、患者は、以下のスキームに従ってアレルゴイド（「Ｐｕｒｅｔａｌ木」）を使用して、花粉症に特異的な免疫療法（ＳＩＴ）を受けた：１週間に１回皮下、０．０２５ｍＬの単回用量のアレルゴイド投与から始め、続いて治療過程中に、単回用量が０．５ｍＬに達するまで用量を徐々に上げ（０．０２５ｍＬ−０．０５ｍＬ、−０．１ｍＬ−０．２ｍＬ−０．３ｍＬ−０．４ｍＬ−０．５ｍＬ）、その後用量はこの用量を維持する。
【００８１】
続く花粉症の季節性増悪期間の性質（２００５年４月〜６月）が、ＳＩＴの有効性が極めて低いことを示し、顕著な鼻結膜症状には、必須用法の全身性経口抗ヒスタミン剤（Ｅｒｉｕｓ）と局所性ステロイド治療（Ｎａｓｏｎｅｘ）との使用が依然として必要であった。
【００８２】
上記の状況を考慮して、２００５年１０月中に、開始状態又は予想状態下でのＳＩＴの臨床効果を増大させるために、免疫刺激である製剤「ＳＣＶ−０７」治療（course）を以下のように経口で施した：連続して１０日間毎日、１日１回１．５ｍｇ。
【００８３】
「ＳＣＶ−０７」治療が完了したら、患者は、２００５年１１月中旬から２００６年３月中旬に、前のスキームに従ってアレルゴイド「Ｐｕｒｅｔａｌ木」を使用して、花粉症のために別のＳＩＴ治療を受けた。「ＳＣＶ−０７」治療と、花粉症のためのＳＩＴ治療の開始との間の間隔は１５日であった。
【００８４】
続く花粉症の季節性増悪期間の性質（２００６年４月〜６月）が、実行されたＳＩＴの有効性が有意に増大したことを示唆し、季節性の鼻結膜炎症状が実質的になくなり、樹木花粉の時期には、患者に抗ヒスタミン薬も局所ステロイドも使用しなかった。
【００８５】
得られた結果は、アレルギー性疾患を予防及び治療するのに「ＳＣＶ−０７」を使用することの有効性を示している。製剤の無害性と、その比較的低いコストとによって、この製剤が、独立療法として及び統合療法という状況においてこの目的に広く使用するのに有望となる。
【００８６】
実施例５：アレルギー性疾患のモルモットモデルにおけるＳＣＶ−０７の有効性
要約
喘息は、気管支収縮、炎症細胞の肺（特に好酸球）への浸潤、気道過敏性及び粘液分泌の増大を特徴とする肺障害である。アレルギー性喘息は、アレルゲンに対する有意な即時の気管支収縮反応と、炎症細胞浸潤と、肺損傷とを伴うモルモットでモデル化することができ、これはアレルゲン曝露の２４時間後に現れた。本研究の目的は、ＳＣＶ−０７がアレルゲン攻撃（challenge）後に炎症細胞の肺への浸潤を減衰することができるか否かを判定することであった。モルモットは、オボアルブミンの腹腔内注射によって感作させた。１７日目〜２１日目に、モルトットを、ＰＢＳビヒクル、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で腹腔内処理した。２１日目に、全ての動物を抗ヒスタミン薬で前処理し、死に至る可能性がある即時の気管支収縮反応を低減させた。その後、動物をエアロゾル化したオボアルブミンに曝し、アレルギー反応を開始した。対照動物はオボアルブミンで感作し、対照として生理食塩水で攻撃した。
【００８７】
ＳＣＶ−０７処理
即時のアレルギー反応中、動物の咳、呼吸困難及び全身疲労の軽減。
肺組織に常在する好酸球及び好中球の減少
気管支肺胞洗浄液中の赤血球漏出の有意な減衰から明らかなアレルギー性の肺損傷の軽減
アレルギー性肺への炎症細胞の浸潤、又はオボアルブミン特異的な抗体産生は目に見えて阻害はされなかった
【００８８】
結論：ＳＣＶ−０７は、即時のアレルギー反応と、その後の肺損傷を軽減するのに有望であるが、アレルギー性肺への炎症細胞の浸潤を防ぐ効果はない。今後の研究では、ＳＣＶ−０７がアレルゲン誘導性の気管支収縮を阻害する能力を調べる必要がある。さらに、赤血球浸出に対するＳＣＶ−０７の保護効果を考慮すると、微小血管透過性におけるアレルギー誘導性の変化、及びマスト細胞メディエータの放出を防ぐＳＣＶ−０７の能力を評価する必要がある。
【００８９】
略称
ＥＰＯ 好酸球ペルオキシダーゼ
ＭＰＯ ミエロペルオキシダーゼ
ＷＢＣ 白血球
ＲＢＣ 赤血球
ＢＡＬ 気管支肺胞洗浄液
ＮＳＳ 標準生理食塩水溶液
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＯＶＡ オボアルブミン
ｉｐ 腹腔内
【００９０】
背景：事例証拠は、他の兆候のためにＳＣＶ−０７を摂取している慢性喘息のヒトが、喘息用の救急薬の使用を減らすことができたことを示唆している。仮説：患者におけるβ2アゴニストの使用が減り、このことは気道過敏性及び／又はアレルゲン誘導性の初期及び後期気管支収縮がＳＣＶ−０７によって減衰することを示唆する。また喘息のマウスモデルの研究は、細胞浸潤がアレルゲン攻撃後にわずかに低減し得ることも示唆している（SciCloneとのコミュニケーション）。
【００９１】
目的：ＳＣＶ−０７が喘息のモルモットモデルにおける喘息症状を軽減するか否かを判定すること。
【００９２】
具体的な目的：感作後であるが、アレルゲン攻撃前のＳＣＶ−０７投与が、喘息のモルモットモデルにおける細胞浸潤を低減するか否かを判定する。
【００９３】
材料及び方法
動物
雌のダンキン・ハートレーモルモット（２００ｇ〜３５０ｇ）を、Charles River, Kingston, New York facility, Barrier K81から購入した。動物をミネソタ州ダールスに搬送し、実験開始前５日〜７日間、本発明者らの動物施設に収容した。実験処理群は表７に概説する。
【００９４】
【表７】
【００９５】
１つの実験当たり８匹〜１０匹の動物で５つの別々の実験をおよそ６ヶ月間にわたって実施した。第１の実験は、実験系が適切に働き、且つＯＶＡで攻撃した動物が有意に好酸球を発生することを確認するために、４匹のＰＢＳ ＮＳＳ動物と、４匹のＰＢＳ ＯＶＡ動物とから成っていた。続く４つの実験はいずれも、表７に示されたように、１つの処理群当たりの最終のＮを７、８匹の動物とするため、それぞれ６つの処理群で１匹〜３匹の動物から成っていた。
【００９６】
実験手順
０日目に、動物を５０ｍｇ／ｋｇのＯＶＡで腹腔内感作した。１７日目、１８日目、１９日目及び２０日目の午前８時〜１０時の間に、動物に、ＰＢＳ、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７、又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７（ペプチド処理）を腹腔内注射した。２１日目の午前８時〜１０時の間に、ＯＶＡ又は生理食塩水（ＮＳＳ）エアロゾル攻撃の２時間前、動物にペプチドを投与した。ＯＶＡ又はＮＳＳエアロゾル攻撃の３０分前、各動物に、抗ヒスタミン剤（６．１ｍｇ／ｋｇのマレイン酸ピリラミン）を腹腔内注射して、エアロゾルＯＶＡ攻撃に付随するアナフィラキシー反応による致死を予防した。デビルビスモデル３５Ｂの超音波ネブライザを使用して、プレキシガラス室（２２ｃｍ×２２ｃｍ×２９ｃｍ）内で５分間、動物を２匹１組で１％ ＯＶＡ溶液又はＮＳＳのいずれかのエアロゾルに曝した。全体で５分のエアロゾル投与（aerosolization）の間、動物を観察し、コメントを記録した。攻撃後２２時間〜２４時間以内に、動物を安楽死させ、心穿刺によって挽血し、洗浄して、細胞浸潤の測定のために肺葉を取り出した。ＯＶＡ又はＮＳＳ攻撃及び安楽死の時点で、動物の体重はおよそ３５０ｇ〜５５０ｇの範囲であり、平均体重はおよそ４２０ｇであった。この実験プロトコルは、以前に公開された研究（Regal and Fraser, 1996、Regal et al., 2000）で用いたものと同様のものである。
【００９７】
細胞浸潤の測定
動物をペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ）で安楽死させ、心穿刺によって挽血し、室温のＰＢＳで洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）のために、気管にカニューレを挿入し、４倍容量のＰＢＳを気管カニューレに導入して、ゆっくりと回収した。洗浄液の総容量は６０ｍｌ／ｋｇであった。ＢＡＬを遠心分離し、細胞を堆積させ（sediment）、各動物のＢＡＬで回収した白血球（ＷＢＣ）の総数を決定するために、１．０ｍｌのＰＢＳ中でＢＡＬ細胞ペレットを再懸濁した。Lowry et al.（1951）の方法を用いて、ＢＡＬ上清中で回収した総タンパク質を求めるために、ＢＡＬ上清を−７０℃で凍結させた。チュルク液を用いた血球計における標準的な方法によって、ＢＡＬ中の総白血球を計測した。変法ライト染料（Diff Quik, American Scientific Products, McGraw Park, IL）で染色したＢＡＬ細胞（３×１０4個の細胞）のサイトスピン調製から白血球百分率（Differential counts）が得られた。４００個の細胞を計測し、好酸球、好中球又は単核細胞として同定した。ＢＡＬ細胞の白血球百分率及び白血球数は、ＢＡＬから１匹の動物あたりに回収した各細胞型の総数を算出するのに使用した。肺組織中の好酸球及び好中球の数を推定するために、それぞれ左肺葉を好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）の測定用に処理し、右肺葉をミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性用に処理した（Fraser et al., 1995）。肺の残りをグラム乾燥重量の測定のために、８０℃で３日〜５日間乾燥した。洗浄後の均質化肺由来のＥＰＯ活性を、左後葉由来の総ＯＤ／分として表した。洗浄後の均質化肺由来のＭＰＯ活性を、右後葉由来の酵素活性の総単位として表した。１ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７は、ＥＰＯアッセイ又はＭＰＯアッセイを阻害しなかった。ＢＡＬ中のＲＢＣの数は、上記のように、ＲＢＣ溶解後の再懸濁ＢＡＬ細胞ペレットのＯＤ412を求めることによって定量化した（Fraser et al., 1995）。洗浄手順中、及び計測のための細胞の再懸濁前に溶解したＲＢＣの数を推定するために、ＢＡＬ上清のＯＤ412も求めた。０．３ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７はｉｎ ｖｉｔｒｏでＯＤ412測定に干渉しなかった。
【００９８】
ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１
上記のように、ＥＬＩＳＡによって、血清中のＯＶＡ特異的なＩｇＧ１を求めた（Fraser et al., 1998、Regal et al., 2000）。データを、標準におけるＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の濃度（これを１と規定した）で除算した試料におけるＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の濃度で表した。プロテインＡセファロースカラム上に、ＯＶＡで感作したモルモット由来の血清プールを通すことによって、ＩｇＧ標準を調製した。回収したＩｇＧをＮＳＳで透析し、アッセイにおける標準として使用するために等分した。
【００９９】
試薬
ＳＣＶ−０７
SciCloneのＳＣＶ−０７ ２００ｍｇをダルースに搬送し、−７０℃で保存した。消灯しながら、研究所で化合物を秤量し、暗所に保存した。２０ｕｇ／ｍｌのストック溶液及び２ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７をＰＢＳ中で作製し、−７０℃の冷凍室でアリコート１ｍｌが入ったポリプロピレン管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ管、Ｒｅｆ ７２．６９４．１０５）で保存した。ＳＣＶ−０７溶液を作製するのに使用するＰＢＳも等分し、対照のＰＢＳ注射のために凍結させた（ＰＢＳカタログ番号、Ｇｉｂｃｏ １００１０、カルシウム又はマグネシウムなし、エンドトキシンは、０．０３ＥＵ／ｍｌ未満であるとして試験した）。使用日にアリコートを解凍し、アルミホイルに包まれた試験管中、暗所で氷上に置いた。その日に完全に使用しなかった場合、冷蔵室中、暗所で保存して、次の日までに使用するか又は廃棄した。動物に、０．５ｍｌ／ｋｇのＰＢＳ、２ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７又は２０ｕｇ／ｍｌのＳＣＶ−０７を投与し、それにより送達用量のＳＣＶ１（１ｕｇ／ｋｇ）又はＳＣＶ１０（１０ｕｇ／ｋｇ）を得た。
【０１００】
感作用のＯＶＡ
２５ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン（Sigma製のＡ５５０３）の生理食塩水溶液（Baxter、滅菌、非発熱性）１００ｍｌを調製した。アリコート４ｍｌをNuncのｃｒｙｏｔｕｂｅバイアル（カタログ番号３３７５１６）中で−７０℃で保存した。動物に、２１ｇニードルでこのＯＶＡ溶液を２ｍｌ／ｋｇ腹腔内投与して、最終送達用量５０ｍｇ／ｋｇを得た。この実験の全ての動物をＯＶＡで感作した。
【０１０１】
エアロゾル攻撃用のＯＶＡ
室温のＮＳＳ（Baxter、滅菌、非発熱性）中で１％のＯＶＡ溶液をエアロゾル攻撃の日に新たに調製した。
【０１０２】
統計学的解析
全てのデータを対数変換して、分散を均等にし、正常なパラメトリックモデリングを行った。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の値に対して、統計学的解析前に、定数０．０１を全ての値に加えて、対数尺度での分散に対する非常に小さい値の影響を最小にした。全ての図の値は、７個、８個の値の幾何平均＋標準誤差（ＳＥ）を表す。統計学的解析には、ＪＭＰソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary, N. C., USA）を用いた対比（contrast：コントラスト）によるＡＮＯＶＡを使用した。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５と規定した。
【０１０３】
結果
ＯＶＡエアロゾルとの即時反応に対するＳＣＶ−０７の効果
ＯＶＡエアロゾル投与中に動物を観察し、記録したコメントを表８にまとめる。実験者は、処理に対して盲検ではなかった。表８の左側に見られるように、ＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物は通常の挙動を示し、呼吸パターン又は運動の変化は記録されなかった。概して、抗ヒスタミン剤を前処理し、ＯＶＡで感作及び攻撃した動物は、アレルゲンの攻撃により死に至ることはないが、呼吸困難になり、しばしば咳及び息切れを起こす。ＰＢＳ ＯＶＡ処理群における７匹の動物全てが、予想通り幾らかの可視反応を有していた。注目すべき結果は、ＯＶＡエアロゾルとの明らかな反応がなかった、ＳＣＶ１ ＯＶＡ処理群及びＳＣＶ１０ ＯＶＡ処理群における動物の数であった。これらのデータは、１ｕｇ／ｋｇ又は１０ｕｇ／ｋｇのいずれかでのＳＣＶ−０７の前処理が、アレルゲン感作及び攻撃の即時アナフィラキシー効果を保護することを示唆している。ＳＣＶ−０７が、アレルゲン攻撃に対する即時気管支収縮を減衰することが明らかに推測される。追跡実験はこの所見によって明らかに示される。
【０１０４】
【表８】
【０１０５】
肺へのＯＶＡ誘導性の細胞浸潤に対するＳＣＶ−０７の効果
全ての動物をＯＶＡで感作し、ＳＣＶ−０７の効果をＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物（陰性対照、アレルギー反応なし）と、ＯＶＡエアロゾルで攻撃した動物との両方で求めた。均質化肺中の好酸球ペルオキシダーゼの測定によって肺組織中の好酸球が、またミエロペルオキシダーゼの測定によって肺組織中の好中球が推測された（図４）。本発明者らの研究室と他の研究室との両方でのこれまでの研究によって、組織中の炎症性細胞の推量としてのこれらの測定結果の有効性が確認されている。さらに、本発明者らは、空域（airspace）中に存在していた白血球、即ちＢＡＬ細胞の数及び種類を求めた（図５、図６）。
【０１０６】
肺における常在細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
統計学的解析は、肺組織又は空域中での常在好酸球又は好中球に対するＳＣＶ−０７の有意な効果が存在していたか否かを判定するために、ＮＳＳエアロゾルのみによって攻撃した対照動物（ｎ＝２４）の対比によるＡＮＯＶＡを初めに包含していた。図４で示されるように、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７は、ＮＳＳエアロゾルで攻撃した動物においてＭＰＯを有意に低減し、１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７は、ＥＰＯを有意に低減した（*ＰＢＳ ＮＳＳ対照に対してｐ＜０．０５）。これらのデータは、肺組織中でＳＣＶ−０７処理が常在好酸球及び好中球の数を有意に減少させることを示唆している（図４）。しかしながら、ＮＳＳで攻撃した対照動物のＢＡＬでは、ＳＣＶ−０７は、細胞の組成に有意な影響を与えなかった（図５、ＮＳＳ）。
【０１０７】
ＯＶＡ誘導性細胞浸潤に対するＳＣＶ−０７の効果
図４及び図５で明らかなように、ＡＮＯＶＡ解析は、肺ＥＰＯと、全てのＢＡＬ細胞型とにおける有意な全体的なＯＶＡの効果を示していた。本発明者らのこれまでの結果と一致して、肺ＭＰＯは、ＯＶＡ攻撃によっては有意に増大しなかった。ＳＣＶ−０７処理によって、常在好酸球及び好中球が変化したので、本発明者らは、以下のＡＮＯＶＡ対比を実施した：
（ＰＢＳ ＮＳＳからのＰＢＳ ＯＶＡへの変化）対（ＳＣＶ１ ＮＳＳからのＳＣＶ１ ＯＶＡへの変化）
（ＰＢＳ ＮＳＳからＰＢＳ ＯＶＡへの変化）対（ＳＣＶ１０ ＮＳＳからＳＣＶ１０ ＯＶＡへの変化）。
図４で示されるように、肺ＥＰＯにおける変化は、ＰＢＳ処理（＃）よりも１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７処理でより大きかった。肺ＭＰＯにおける変化は、ＳＣＶ−０７処理と変わらなかった。ＢＡＬ細胞を考慮すると、ＢＡＬ好中球における変化は、１ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７処理で異なっていた。これらの差は一部、ＳＣＶ−０７処理による常在好酸球及び好中球の減少によるものであった。％で表される細胞差は、マウス喘息モデル（SciCloneのｄｏｃ４３−１０７１８）におけるＳＣＶ−０７の研究との比較のために図６Ａ〜図６Ｃでも表される。ＢＡＬにおける好酸球％は、ＯＶＡエアロゾル攻撃したＳＣＶ−０７処理動物においては低減傾向にあった（図６Ａ）。しかしながら、ＢＡＬにおける総好酸球は変わらなかった（図５Ｂ）。
【０１０８】
ＯＶＡ誘導性肺損傷及び／又は微小血管透過性の変化に対するＳＣＶ−０７の効果
アレルゲン攻撃は、肺における微小血管透過性の増大、及び空域中への赤血球の漏出を引き起こし得る肺損傷の原因となることが知られている。これらの事象のいずれかが、血漿タンパク質又は間質液の空域中への漏出によるＢＡＬ液のタンパク質含量の増大を引き起こし得る。肺損傷及び／又は微小血管透過性の変化は、ＢＡＬにおけるＲＢＣ（図７Ａ、図７Ｂ）と、ＢＡＬ液の総タンパク質含量（図７Ｃ）とを求めることによって評価した。ＢＡＬにおけるＲＢＣの数は、細胞ペレットを溶解し、放出ヘモグロビンのＯＤ412を測定することによって推測した（図７Ａ）。さらに、計測用に洗浄手順前又は洗浄手順中、及び細胞再懸濁前に溶解したＲＢＣの数を推測するために、ＢＡＬ上清のＯＤ412も求めた（図７Ｂ）。図７で明らかなように、ＰＢＳ処理動物のＯＶＡ攻撃が、ＢＡＬにおけるＲＢＣ数と、ＢＡＬにおける総タンパク質を有意に増大した。ＮＳＳからＯＶＡへの変化のＡＮＯＶＡ対比は、１ｕｇ／ｋｇ又は１０ｕｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかが、ＢＡＬにおけるＲＢＣ数を有意に減衰させたことを示していた（＃、図７Ａ）。さらに、ＢＡＬ上清のＯＤ412もＳＣＶ−０７によって有意に低減し、これは洗浄液回収プロセス中に溶解させるのに有意に少ないＲＢＣしか利用することができなかったことを示している（＃、図７Ｂ）。ＢＡＬ液における総タンパク質は、ＳＣＶ−０７処理による影響を受けなかった（図７Ｃ）。
【０１０９】
血清ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体に対するＳＣＶ−０７の効果
モルモットでアレルギー性肺反応に関与するマスト細胞を感作する抗体には、ＩｇＥ抗体とＩｇＧ１抗体との両方が含まれる。アジュバント非存在下でＯＶＡで感作したモルモットは最初に、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体を作製する。本発明者らの研究室でのこれまでの研究によって、本研究で動物を感作するのに使用する方法は、ＯＶＡ特異的なＩｇＥを産生する可能性が低いと判断されている（Fraser et al., 1995、Regal and Fraser, 1996）。ＳＣＶ−０７処理で見られるいずれの効果も産生されたＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体における変更によるものではなかったことを確認するために、血清中の濃度をＥＬＩＳＡで求めた（図８）。本研究では全て動物をＯＶＡで感作したので、ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体は全ての群で検出可能であった。ＳＣＶ−０７処理又はＯＶＡ攻撃は、血清中のＯＶＡ特異的なＩｇＧ１抗体の濃度に有意な影響を与えなかった。
【０１１０】
一般的な結論及び考察
喘息の制御は、重要な医療の課題である
近年の研究は、大多数の喘息患者は、市販の薬物では十分に制御されていないことを明示している。喘息の制御及び治療の実社会評価（The Real world Evaluation of Asthma Control and Treatment）（ＲＥＡＣＴ）の研究は、制御できない喘息が広く流行していることを示している。これらの結果は、標準的な喘息薬を使用する患者の５５％が制御できない喘息であったことを示唆していた。これらの患者の大多数が医療を利用できるにもかかわらず、このようなことが起こっていた（Peters et al., 2007）。この喘息制御の不足が、既存の薬物の準最適使用、又は既存の薬物が多くの喘息患者において正しいメディエータ及び／又は事象を標的としていないことに起因するか否かは明らかではない。したがって、新規の喘息療法は、アレルゲンに対する即時反応、又はアレルゲン曝露のより慢性的な炎症効果を標的とするか否かにかかわらず必要となる。即時アレルギー反応におけるメディエータの放出が、炎症性疾患のより慢性的な効果に寄与するという証拠は確かに存在する（Paul, 1999）。
【０１１１】
モルモットモデルの即時アレルギー反応における本研究の主な結論
モルモットにおけるＳＣＶ−０７処理によって、咳、呼吸困難及びＯＶＡエアロゾル攻撃で見られた即時アレルギー反応中の動物の全身疲労の低減が観察された。マウスモデルのこれまでの研究では、エアロゾルアレルゲン攻撃中の即時アレルギー反応に関しては全く所見が報告されていなかった。一般的に、マウスは、モルモットに比べて、肺機能において最小限の変化でアレルゲン攻撃に対して反応し、且つ、即時アレルギー反応中、死を防ぐために抗ヒスタミン剤の前処理を必要としない。モルモットモデルにおける即時反応に対するＳＣＶ−０７効果の本発明者らの所見は、アレルギー性疾患において臨床的に非常に有用なＳＣＶ−０７の特性を示唆している。皮膚及び肺における即時アレルギー反応におけるＳＣＶ−０７処理の有用性は、さらに研究する必要がある。
【０１１２】
アレルギー性肺炎症
モルモットは、アレルゲン感作と、アレルゲン攻撃後２４時間以内の炎症性細胞の肺への浸潤を伴う攻撃とに対して反応する。細胞の総数を調べると、５日間のＳＣＶ−０７前処理は、モルモット肺への好酸球浸潤における変化を阻害しなかった（図５）。ＳＣＶ−０７では、ＢＡＬにおけるアレルゲン攻撃後に集積した好酸球の％は減少傾向であった（図６）。しかしながら、これは統計的に有意なものではなかった。空域中の細胞型の割合が臨床的に重要であるか否か、又は空域中の細胞型の総数が評価に重要な変数であるか否かを考察することができる。これらのいずれかの評価（図５、図６）によって、同じ結論が得られる。ＳＣＶ−０７処理は、モルモット肺へのアレルゲン誘導性の炎症細胞浸潤をはっきりとは阻害しなかった。しかしながら、ＳＣＶ−０７処理は、対照動物における総肺ＥＰＯ及びＭＰＯを明らかに低減し、このことは、この化合物が正常状態の肺における常在好酸球及び好中球の数に影響を与えたことを示唆している。この所見は、ＳＣＶ−０７処理単独で常在細胞の数が変わるか否かを確かめるために、異なる処理群におけるモルモットの肺の組織病理学的試験によって追跡する必要がある。
【０１１３】
ＳＣＶ−０７によるアレルギー及び喘息のモデルシステムにおけるこれまでの調査には限界がある。本発明者は、喘息のマウスモデルにおけるＳＣＶ−０７の研究を再検討している（SciCloneのＤｏｃ４３−１０７１８）。マウス研究では、２つの異なる年齢群のマウスを感作し、ＯＶＡで攻撃して、細胞浸潤が報告された。２つの異なる年齢群のマウスにおいて試験を実施する根拠は明らかではなかった。モルモットによる本発明者らの研究では、１つの年齢群だけを評価した。幼若及び成体の雄及び雌のモルモットにおける本発明者らのこれまでの研究は、この性別及び年齢の動物が一貫して強いアレルギー性肺炎症を起こしたことを示していたため、本発明者らは、２００ｇ〜３５０ｇの雌モルモットを選択して使用した（Regal et al., 2006）。これらの動物は、研究中に活発に成長し、この体重範囲の動物は、アレルギー性炎症のモルモットモデルに一般的に使用される。報告されたマウス試験では、６週齢〜８週齢のマウスのＢＡＬにおいて、総細胞数は変化せずに、好酸球の％で軽度の減少が報告された。１８週齢〜２０週齢の動物では、ＳＣＶ−０７処理による細胞型の割合に差は見られなかったが、ＳＣＶ−０７は、１８週齢〜２０週齢のＢＡＬにおける総好酸球を減少させた。マウス研究では、非感作動物又は感作したが、エアロゾルＯＶＡで攻撃しなかった動物でのＢＡＬの細胞差又は総数は報告されていない。正常なモルモットは、肺において好酸球の常在集団を有する一方で、正常なマウス肺では好酸球は明らかなものではない。本発明者らの研究において、ベースラインＥＰＯ及びＭＰＯ測定に対するＳＣＶ−０７処理の効果のために、適切な対照ペプチド前処理群を用いて、ＮＳＳとＯＶＡエアロゾルとの間の変数の変化を統計学的に解析することは重要であった。このような比較はマウスデータには利用不可能であった。
【０１１４】
肺損傷又は微小血管透過性における変化
モルモット肺における重度のアレルギー反応は、２４時間後のＢＡＬにおける赤血球数の増加と共に起こる。明らかに、ＳＣＶ−０７はこの事象を有意に阻害した（図７）。このことが動物における即時アレルギー反応の観察された減衰を反映しているか（最初の５分）、又は即時反応の後であるが、最初の２４時間以内で肺で生じる損傷を反映しているかは、本発明者らの研究設計からは求めることはできない。しかしながら、ＳＣＶ−０７処理後のＢＡＬにおけるＲＢＣ数の顕著な差は、この化合物が非常に有意な保護的効果を有することを示唆している。この保護的効果には、非常に重要な臨床上の意義があり、今後の実験によって追跡をする必要がある。
【０１１５】
体液性免疫反応
ＳＣＶ−０７処理は、一次免疫反応がペプチド処理による影響を受けないように、ＯＶＡによる初期感作の１７日後に開始した。ＯＶＡ特異的なＩｇＧ１の血清濃度は、アレルゲン攻撃後の洗浄時に求めた。予測通り、処理群におけるＩｇＧ１の血清レベルに有意な差はなかった。このことは、アレルギー反応で見られるいずれの変化も反応を媒介する細胞親和性抗体のアベイラビリティにおける差によるものではないと考えられることを示している。これは、ＯＶＡ特異的なＩｇＥに対する、小さいが有意な効果が、ＳＣＶ−０７処理マウスで見つかったマウス研究とは一部異なる。しかしながら、マウスモデルでは、ＳＣＶ−０７処理が異なり、ＯＶＡ＋ミョウバンの二次感作注射のわずか１日後に開始した。
【０１１６】
研究の強度及び制限
アレルギー性肺炎症のモルモットモデルがヒトにおける喘息を反映しているか否かは常に考慮され得るものである。モルモットモデルの利点は、肺への好酸球浸潤が容易に起こることである。さらに、モルモットは、アジュバントなしでＯＶＡに対する抗体を容易に産生する。欠点は、モルモットはヒトの様にＩｇＥ抗体を容易には産生しないが、細胞親和性ＩｇＧ１抗体を産生することである。ヒトと同様に、モルモットは、アレルゲン攻撃に対する顕著な即時気管支収縮反応を有する一方で、マウスモデルでのこの反応は、最小且つ短期間である。また、モルモットは、抗ヒスタミン剤で前処理しなければならず、又はモルモットの最大５０％が本発明者らのモデルでの５分のエアロゾル投与中に死滅する。このため、この付加的な薬物治療は、解釈を複雑にし得る。
【０１１７】
ＥＰＯ及びＭＰＯの測定によって、それぞれ肺葉での総好酸球及び好中球の様子が与えられるが、それらの細胞の位置に関する情報は与えられない。炎症細胞の位置を調べ、生化学的所見を確認するのに、組織病理学的追跡試験（Follow-up histopathology）が必要である。即時反応中に記録したコメントは、ＳＣＶ−０７が、アレルゲン曝露による即時気管支収縮反応から動物を保護したことを示唆している。しかしながら、肺機能の測定によって、この興味深い所見を追跡する必要がある。
【０１１８】
結論
喘息のこのロバスト（robust）モルモットモデルにおいて、ＳＣＶ−０７は、即時アレルギー反応と、その後の肺損傷との低減には有望であるが、アレルギー性肺への炎症細胞浸潤を防ぐ効果はない。今後の研究で、ＳＣＶ−０７がアレルゲン誘導性気管支収縮を阻害する能力を調べる必要がある。さらに、肺損傷に対するＳＣＶ−０７の予防的効果を考慮すると、微小血管透過性におけるアレルギー誘導性の変化と、皮膚及び肺におけるマスト細胞メディエータの放出とを防ぐＳＣＶ−０７の能力を評価する必要がある。
【０１１９】
参考文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において、アレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法であって、該被験者に、有効量の式Ａ
【化１】
（式中、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である）の免疫調節化合物を投与することを含む、治療方法。
【請求項２】
ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記喘息がアトピー性気管支喘息である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物を約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を約０．０１ｍｇ〜１ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を約０．０００１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を約０．００１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）〜１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＣＶ−０７を約０．０１ｍｇ〜１ｍｇのγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの１日用量で等張液の形で非経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＣＶ−０７を約１．５ｍｇ以下の１日用量で経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＣＶ−０７を約５日〜１４日間の治療中、１日１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
被験者において、アレルギー性疾患又はその影響を治療、予防、阻害又は低減する治療方法であって、該被験者に、有効量の式Ａ
【化１】
（式中、ｎが１又は２であり、Ｒが水素、アシル、アルキル又はペプチド断片であり、且つＸが芳香族アミノ酸若しくは複素環アミノ酸、又はそれらの誘導体である）の免疫調節化合物を投与することを含む、治療方法。
【請求項２】
ＸがＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記喘息がアトピー性気管支喘息である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物を約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を約０．０１ｍｇ〜１ｍｇの範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を約０．０００１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を約０．００１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）〜１ｍｇ／ｋｇ（被験者の体重）の範囲内の用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がＳＣＶ−０７である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＣＶ−０７を約０．０１ｍｇ〜１ｍｇのγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンの１日用量で等張液の形で非経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＣＶ−０７を約１．５ｍｇ以下の１日用量で経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＣＶ−０７を約５日〜１４日間の治療中、１日１回投与する、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５２７３５４（Ｐ２０１０−５２７３５４Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８３８９（Ｐ２０１０−５０８３８９）
【出願日】平成２０年５月１３日（２００８．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６０７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３８２４
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５９３１９９５６３）サイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＳｃｉＣｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９５０ Ｔｏｗｅｒ Ｌａｎｅ， Ｓｕｉｔｅ ９００， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４４０４， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１３日（２００８．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６０７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４３８２４
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５９３１９９５６３）サイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＳｃｉＣｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９５０ Ｔｏｗｅｒ Ｌａｎｅ， Ｓｕｉｔｅ ９００， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４４０４， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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