冠動脈疾患および心血管イベントのリスクの予測
対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップによる対象における心血管疾患のリスクを評価する方法は、本明細書に開示される。代謝産物のレベルは、対象における心血管疾患のリスクを示す。代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸またはヒドロキシブチラートとなり得る。心血管疾患は、心血管イベントのリスク、冠動脈疾患の存在または冠動脈疾患の発症のリスクとなり得る。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月１０日出願の米国特許仮出願第６１／１５９，０７７号明細書の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、先進工業国における主な死亡原因であり、肥満および糖尿病の流行と足並みを揃えており、急速に開発途上国の主な死亡原因になっている。ＣＡＤの遺伝的な偏向は十分に確立されており、家族歴は、特に、早期の発生形態でＣＡＤの独立したリスク因子となり得ることが示されている。これにもかかわらず、ＣＡＤの遺伝的な構築は、大部分は未知のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Smith et al., Circulation 1991;84[5 Suppl], 111:245-253
【非特許文献２】Shah et al., Mol Syst Biol 2009;5:258
【非特許文献３】Newgard et al., Cell Metab 2009;9(4):311-26
【非特許文献４】An et al., Nat Med 2004;10(3):268-274
【非特許文献５】Chace et al., Clin Chem 1995;41(l):62-8
【非特許文献６】DeLong et al, Biometrics 1988;44(3):837-45
【非特許文献７】Hauser et al, 2003, Am Heart J, 145, 602-613
【非特許文献８】Haqq et al, 2005 Contemp Clin Trials, 26, 616-625
【非特許文献９】Millington et al, 1990, J Inherit Metab Dis, 13, 321-324
【非特許文献１０】Wu et al, 2004, J Clin Invest, 113, 434-440
【非特許文献１１】Patterson et al, 1999, J Lipid Res, 40, 2118-2124
【非特許文献１２】Almasy and Blangero, 1998, Am J Hum Genet, 62, 1198-1211
【非特許文献１３】Johnson and Wichern D. W., 1988, Applied Multivariate Statistical Analysis. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey
【非特許文献１４】Kaiser, 1960, Educational and Psychological Measurement, 20, 141-151
【非特許文献１５】Lawlor et al, 2004, Am J Epidemiol, 159, 1013-1018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＡＤの多くの容認されたリスク因子は代謝性である。しかし、ＣＡＤのリスクを機構的に理解することはまだ完全ではなく、心血管イベントの最も高いリスクがある個体を同定する能力を洗練させる必要性が等しく重要である。ＣＡＤの複雑な性質を考えると、より包括的なツールによる判定は、リスク階層化を改善し疾患過程の理解を深めることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法が提供される。リスク評価は、心筋梗塞などのその後の心血管イベントの可能性を予測すること、ＣＡＤの発症を予測すること、または対象におけるＣＡＤの存在を識別することが含まれ得る。これらの方法には、対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物を検出するステップが含まれる。代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸またはβ−ヒドロキシブチラートとなり得る。その場合は、代謝産物のレベルは、標準または対照群と比較され、対象における心血管イベントのリスクのレベル、ＣＡＤの発症のリスクまたはＣＡＤの存在を決定するために用いることができる。
【０００６】
他の態様では、ＣＡＤを発症した対象もしくは発症するリスクのある対象または心血管イベントのリスクのある対象のための治療計画を開発する方法はまた、提供される。これらの方法には、対象における検出された代謝産物のレベルを用いて、対象における心血管疾患のリスクに基づいた治療計画を開発するステップが含まれる。この計画は、食事制限、運動および医薬品治療オプションを含み得る。
【０００７】
さらに他の態様では、対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法は、試料が対象から得られるものが提供される。試料は、試料中の代謝産物レベルを検出するために研究室に提供される。検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸またはヒドロキシブチラートとなり得る。研究室は、対象における心血管疾患のリスクを示す、試料中の代謝産物レベルを示す報告書を返却する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】代謝産物因子およびＣＡＤの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す一組のグラフである。ＲＯＣ曲線およびモデルの適合（ｃ統計量）の測定値は、３つのモデルについて示された。すなわち、伝統的なＣＡＤリスク因子（糖尿病、高血圧、異脂肪血症、喫煙、ＢＭＩ、家族歴；複製群の場合、年齢、人種および性別はまた含まれる）を含めた臨床モデル（黒線）；すべての伝統的なリスク因子プラス代謝産物因子４および９を含めたモデル（灰線）；すべての伝統的なリスク因子プラスすべての代謝産物因子を含めたモデル（破線の黒線）である。上部のグラフは、初期群を示し、下部のグラフは、複製群を示す。
【図２】心血管イベントのための代謝産物因子８の予測能力のためのコックス比例ハザードモデルを示す一組のグラフである。調整されない（左パネル）および調整された（右パネル）生存曲線（ＢＭＩ、ＣＡＤの重症度、高血圧、異脂肪血症、糖尿病、喫煙、家族歴、駆出率、血清クレアチニン、その後のＣＡＢＧ、年齢、人種および性別について調整された）は、代謝産物因子８について示された。
【図３】８つのマルチプレックスのＧＥＮＥＣＡＲＤファミリーの系図を示す図である。符号中の塗りつぶされた黒は早期ＣＡＤに罹患したことを表し、より小さい灰色の丸は、本試験のために行われた血液プロファイリングを表す。プロファイルされたファミリーメンバーの大部分は、元の罹患した同胞対（以下、罹患同胞対）の今のところ罹患していない子孫であることに留意されたい。
【図４】従来の代謝産物の遺伝率を示すグラフである。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【図５】アミノ酸および遊離脂肪酸の遺伝率を示すグラフである。示されたのは、アミノ酸および遊離脂肪酸の遺伝率である。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【図６】アシルカルニチンの遺伝率を示すグラフである。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
小分子代謝産物の試験であるメタボロミクスは、ヒトの疾患の診断に有用となり得る。試験は、植物およびマウスにおける代謝産物の遺伝率を実証している。実施例に記載されている通り、代謝産物プロファイルは、早期発生ＣＡＤを有するヒトのファミリーに遺伝性であり、ＣＡＤの公知の遺伝率は、血液中の測定可能な代謝性の成分によって少なくとも一部で媒介され得ることを示唆する。実施例は、Ｄｕｋｅ大学ＣＡＴＨＧＥＮバイオレポジトリー（Ｄｕｋｅ ＣＡＴＨＧＥＮ ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）に登録された患者においておよびＤｕｋｅ大学ＧＥＮＥＣＡＲＤ試験（Ｄｕｋｅ ＧＥＮＥＣＡＲＤ ｓｔｕｄｙ）から選択されたファミリーにおいて、アシルカルニチン種（ミトコンドリアの脂肪酸、炭水化物、およびアミノ酸酸化の副生成物）、アミノ酸、ならびに遊離脂肪酸、ケトンおよびβ−ヒドロキシブチラートなどの従来の代謝産物を含めて、６９種の代謝産物の定量的なプロファイリングを記載している。対象において心血管疾患のリスクを評価する代謝産物プロファイルの能力は、本明細書において提供される。実施例により、特定の代謝産物のレベルは、単独であるいは組み合わせて、ＣＡＤを発症する可能性、ＣＡＤの存在およびその後の心血管イベントのリスクを識別することが実証される。
【００１０】
対象において心血管疾患のリスクを評価するまたは予測する方法は提供される。これらの方法には、対象からの試料中で少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップが含まれる。代謝産物の量または相対レベルは検出することができる。検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、またはヒドロキシブチラートとなり得る。対象からの試料中の代謝産物のレベルは、その場合、心血管疾患のリスクを評価するために標準と比較される。標準は、正常な範囲および／または心血管疾患を示す範囲を示す各代謝産物について経験に基づいて引き出された数値になり得るまたは公知の心血管疾患状態を有する個体における代謝産物のレベルとの直接比較になり得る。
【００１１】
対象から試料を得るステップおよび試料中の代謝産物レベルを検出するために研究室に試料を提供するステップにより対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法はまた提供される。上記と同様に、研究室により検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸およびヒドロキシブチラートを含み得る。その場合には、試料中の代謝産物レベルを示す報告は、研究室から受け取られる。報告は、対象における代謝産物のレベルを示し、このレベルは、対象における心血管疾患のリスクを示す標準値と比較するために用いることができる。
【００１２】
心血管疾患のリスクには、ＣＡＤを有さない対象の、遺伝性の因子により経時的にＣＡＤを発症するリスクを評価すること、対象においてＣＡＤの存在または非存在を評価することおよび心血管イベントを有するリスクを評価することが含まれる。心血管イベントには、心筋梗塞、脳卒中および死亡が含まれる。
【００１３】
対象は、任意の哺乳動物となり得、適当には、対象はヒトである。ＣＡＤを有するまたはＣＡＤを発症するリスクがあると同定された対象は、本明細書で提供される方法を用いて心血管イベントのこれらのリスクを決定するためにさらに評価することができる。これらの方法は、非侵襲的なやり方でＣＡＤの存在を診断するのに役立てるおよび／またはＣＡＤのリスクがあると同定された対象、ＣＡＤを有する対象または心血管イベントのリスクがある対象のための治療計画を開発するために用いることができる。治療計画は、対象への規定食、運動、および医薬品療法の提供が含まれ得る。心血管イベントには、制限するわけではないが、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中および死亡が含まれる。
【００１４】
代謝産物は、様々な試料を用いて検出することができ、その中のいくつかは、当業者には明らかである。実施例では、末梢血は、対象から得られ、対象における代謝産物のレベルを検出するために処理された。対象からの他の組織または液体は、それだけには限らないが、血液、血漿、尿、血清、唾液、および組織生検を含めて用いることもできる。
【００１５】
任意の方法は、代謝産物を検出するために用いることができる。適当には、この方法は、対象における代謝産物または対象からの試料のレベルもしくは量を決定できるように定量的である。実施例において、代謝産物のレベルは、質量分析により決定された。測定の他の方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を含めて用いることができる。代謝産物はまた、結合もしくは酵素アッセイなどのアッセイによる代謝産物の検出に基づいた比色定量アッセイまたは蛍光定量アッセイを用いて検出することができる。代謝産物についての任意の適当なアッセイ方法は用いることができる。かかる方法は、当業者には明らかである。対象における代謝産物のレベルは、血液または組織中の代謝産物をｎｇ／ｍｌとして、血液もしくは組織中の代謝産物ｍＭまたはμＭ濃度によって、または対象間の相対レベルを示すために任意の単位を用いることによって報告することができる。実施例では、血液中の代謝産物ｍＭもしくはμＭは報告される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、単一の代謝産物の検出は、心血管疾患のリスクを評価するのに十分である。他の実施形態では、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５種の代謝産物は、心血管疾患のリスクを評価するための方法で検出し用いることができる。検出された代謝産物は、対象の母集団の主成分分析による一因子として関連し得る。ＣＡＤの遺伝率を評価するために有用なおよびＣＡＤの存在もしくは心血管イベントを有するリスクのために有用な代謝産物の因子、または群は、以下の実施例に示される。
【００１７】
対象における代謝産物のレベルは、対象がＣＡＤ、対象がＣＡＤを発症するリスクおよび／または対象が将来心血管イベントを経験するリスクを有するか否かを決定するために用いられる。リスク決定のレベルは、血液中に存在する代謝産物の標準レベルに基づくことができる。このような標準は、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール測定値間の関係について用いられ、コレステロールレベルが絶食後の血液中のあるレベルに達し、ＨＤＬ対ＬＤＬの比が標準の限界を超えるとき、ＣＡＤのリスクは予測される。かかる標準は、大規模な母集団試験に基づいて一般に開発される。あるいは、リスクの決定は、１種または複数の対照群との直接比較に基づくことができる。例えば、一組のＣＡＤがない対照群および試料入手後２年心血管イベントを伴わない対照群、ならびに一組のＣＡＤを有する対照群および試料入手後２年心血管イベントを伴うもしくは伴わない対照群は、比較として用いられ得る。
【００１８】
対象における心血管疾患のリスクは、相対的な用語で表すことができる。例えば、代謝産物の正常なレベルは、ＣＡＤまたは心血管イベントなど、心血管疾患の低リスクから平均的なリスクのある対象において１．０と言われ得る。１．０未満の任意の数値は、対象が一般的な母集団リスクよりも低いリスクを有することを示し得る。１．０を超える数値は、対象が平均的なリスクレベルよりも高く、実際の数値がリスクのレベルに関係し得ることを示すことになる。例えば、代謝産物レベルが２．０である対象は、平均的な個体に比べて今後２年に心血管イベントを経験する可能性が２倍となり得る。
【００１９】
ＣＡＤまたは将来の心血管イベントを含めた心血管疾患のリスクの評価には、制限するわけではないが、リスクプロファイルの作成が含まれる。評価または予測は、対象が、対照群よりもＣＡＤなどの心血管疾患を有するもしくは発症する、または心血管イベントを有する可能性が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％または１０００％高いことが示され得る。対照群は、ＣＡＤを有さず、ＣＡＤまたは心血管イベントの高いリスクと相関しない代謝産物のレベルを有する個体である。
【００２０】
心血管疾患ＣＡＤを発症するリスクの予測的な代謝産物には、脂質、タンパク質および炭水化物代謝の主な経路の多くに関与する代謝産物が含まれる。したがって、アシルカルニチンには、アミノ酸異化作用に関する情報を提供するアセチルカルニチン（Ｃ２）、グルコース、脂肪酸およびアミノ酸代謝の副生成物、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）およびイソベレリルカルニチン（Ｉｓｏｖｅｌｅｒｙｌ ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）（Ｃ５）、ペルオキシソームの脂肪酸代謝について報告されるジカルボキシル化されたアシルカルニチン、および、長鎖脂肪酸β−酸化における中間体である中長鎖アシルカルニチンが含まれる。アミノ酸は、タンパク質代謝回転および異化作用における重要な中間体として働き、ケトンは、脂肪酸β−酸化の指標である。以下の表１は、実施例において試験された代謝産物の短縮名およびフルネームを示す。表２は、可能な場合、それぞれの試験された代謝産物の生体機能を示す。
【００２１】
【表１−１】
【００２２】
【表１−２】
【００２３】
【表２−１】
【００２４】
【表２−２】
【００２５】
【表２−３】
【００２６】
対象において少なくとも１種の代謝産物を検出するステップにより対象における心血管イベント（死亡または心筋梗塞）のリスクを予測する方法はまた、提供される。心血管イベントのリスクの予測的な代謝産物は、ペルオキシソームの脂肪酸代謝の推定された生成物であり、具体的には、短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン、およびシトルリンである。特定の代謝産物は、実施例の表９に列挙され、因子８として同定される。表１０は、因子８内の個別の代謝産物を示し、それぞれの代謝産物についての因子負荷データを提供する。実施例中のデータから、シトルリンおよび短鎖ジカルボキシルアシルカルニチンが心血管イベントのリスクを予測することが実証される。
【００２７】
個別の代謝産物はまた、心血管イベントのリスクを予測することができる。これらの代謝産物には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｘ、Ｇｌｘ、オルニチン、シトルリン、ａｒｇ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃ１４；Ｃ５：１、Ｃ５、Ｃ４：ＯＨ、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０：３、Ｃ１０、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ１２：１、Ｃ１２、Ｃ１２−ＯＨ：Ｃ１０ＤＣ、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６、Ｃ１６−ＯＨ／Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：２、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｃ２０、Ｃ２０：１−ＯＨ／Ｃ１８：１−ＤＣ、Ｃ２０−ＯＨ／Ｃ１８−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ２０：４、ＦＦＡ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔが含まれる。具体的には、シトルリン、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、およびＣ８：１−ＤＣのレベルは、心血管イベントを予測する。さらに、オルニチン、シトルリン、Ｃ５、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ２０：４およびＦＦＡのレベルはまた、心血管イベントのリスクを評価するために有用である。
【００２８】
対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップによる対象におけるＣＡＤの存在および／または程度を評価する方法はまた提供される。ＣＡＤの存在を評価するために有用な代謝産物は、中鎖アシルカルニチン、分枝鎖アミノ酸または関連する代謝産物、尿素回路に関連する代謝産物である。
【００２９】
特定の代謝産物は、実施例の表６、７および８に列挙され、表９中の因子１、４、および９として同定される。表１０は、因子１、４および９内の個別の代謝産物を示し、それぞれの代謝産物についての因子負荷データを提供する。０．０４以上の因子負荷を有するこのような代謝産物のみ、因子中に含まれる。
【００３０】
個別の代謝産物は、心血管イベントのリスクを予測することもできる。これらの代謝産物には、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｘ、シトルリン、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃｉ４；Ｃ５、Ｃ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔが含まれる。具体的には、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｇｌｘ、Ｃ２、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、対象におけるＣＡＤの存在を示す。正常な対照または正常な標準に比べてＬｅｕ／ＩｌｅまたはＧｌｘのレベルの増加は、対象におけるＣＡＤを示す。Ｃ２、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルの低下は、対象におけるＣＡＤの存在を示す。１６５ｍＭ、１７０ｍＭまたは１７５ｍＭを超えるＬｅｕ／Ｉｌｅのレベルは、冠動脈疾患を示す。１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３２ｍＭ、１３５ｍＭまたは１４０ｍＭを超えるＧｌｘのレベルは、冠動脈疾患を示す。０．０１４μＭ、０．０１３μＭまたは０．０１２μＭ未満のＣ１４：１−ＯＨのレベルは、冠動脈疾患を示す。０．００９μＭ、０．００８９μＭ、または０．００８８μＭ未満のＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、冠動脈疾患を示す。
【００３１】
対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップにより対象においてＣＡＤを発症する可能性を評価する方法はまた提供される。ＣＡＤの可能性のある発症を評価するために有用な代謝産物は、短鎖および中鎖アシルカルニチン代謝産物、分枝鎖アミノ酸および尿素回路に関係する代謝産物である。
【００３２】
特定の代謝産物は、実施例の表１４に列挙される。表１５は、同定された因子内の個別の代謝産物を示す。０．０４以上の因子負荷を有するこのような代謝産物のみ、因子中に含まれる。個別の代謝産物はまた、心血管イベントのリスクを予測することもできる。これらの代謝産物には、ケトン、ａｒｇ、オルニチン、シトルリン、ｇｌｘ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｃ２、Ｃ１４：１、Ｃ１８：１、Ｃ５：１、Ｃ４−ｉ４、Ｃ１８、Ｃ１０：１およびＦＦＡが含まれる。
【００３３】
実施例
以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを意味する。
【実施例１】
【００３４】
代謝産物のＣＡＤおよび心血管イベントのリスクとの関連
方法
試験試料
ＣＡＴＨＧＥＮバイオレポジトリーは、Ｄｕｋｅ大学メディカルセンター（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）の心臓カテーテル処置研究室により順次募集された対象からなる。インフォームドコンセント後、血液を、カテーテル処置のための動脈アクセス時に大腿動脈から得、直ちに血漿を分離するために処理し、−８０℃で凍結した。すべての対象は、採取前に最低６時間空腹であった。臨床データは、ＤＤＣＤ、すなわち１９６９年からＤｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで心臓カテーテル処置を実施した患者のデータベースによって提供された。薬剤データを、慢性的に用いた薬剤、すなわち、入院時の薬剤（入院患者）について収集したまたは以前の１カ月以内の診察記録（外来患者）から収集した。心筋梗塞（ＭＩ）の発生および死亡を含めたフォローアップデータを、カテーテル処置後６カ月目に収集し、次いで、その後毎年収集した。生命状態を米国死亡指数（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｅｘ）によって確認した。すべての対象についてのカテーテル処置の適応は、虚血性心疾患の臨床的な配慮であった。重症肺高血圧または臓器移植を有する患者を除外した。
【００３５】
ＣＡＤのための代謝産物の識別可能な能力を評価するため、２つの独立した症例−対照群を構成した。すなわち、「初期」（ＣＡＤ症例１７４名および無ＣＡＤ対照１７４名）；および「複製」（ＣＡＤ症例１４０名および無ＣＡＤ対照１４０名）である。初期群の場合、組み入れ基準を満たす逐次的な症例を選択した。すなわち、ＣＡＤ指数≧３２（≧９５％の狭窄を有する少なくとも１つの冠動脈）および発生年齢≦５５歳である。ＣＡＤ指数は、血管造影のデータの数値的な要約である。（例えば、非特許文献１を参照）。発生年齢を、最初のＭＩ、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）の年齢、またはＣＡＤ指数閾値を満たす最初のカテーテル処置時の年齢として定義した。次の基準を満たす性別および人種に一致した対照を選択した。すなわち、ＣＡＤ指数≦２３；＞５０％の狭窄を有する冠動脈なし；カテーテル処置時年齢≧６１歳；およびＭＩ歴、ＰＣＩ歴、ＣＡＢＧ歴、または移植歴なしである。これらの基準に基づいた年齢が異なる場合、結果は年齢によって混乱する可能性がある。したがって、複製群の場合、同じ組み入れ基準を満たす逐次的な症例および対照を選択したが、発生年齢（症例）またはカテーテル処置時の年齢（対照）の基準を取り除き、症例／対照を一致させなかった。これにより、カテーテル処置について参照された患者の代表的な母集団への知見の一般化可能性が可能になる。分析を、ＣＡＤ症例を以前のＭＩ歴を有する症例に限定することによっても行った（初期における症例Ｎ＝８６症例、複製における症例Ｎ＝６１）。
【００３６】
その後の心血管イベントのリスクを予測する代謝産物の能力を評価するために、初期および複製群からＣＡＤ症例を組み合わせ、「イベント」群を構成し（「イベント」群、Ｎ＝３１４）、その中の、個体７４名は、フォローアップ中死亡したまたはＭＩに罹った。代謝産物の心血管イベントのリスクとの関連についての知見を検証するため、プロファイリングを、次の基準、すなわち、駆出率＞４０％；ＰＣＩ歴またはＣＡＢＧ歴なし；およびその後のＣＡＢＧなしを満たすＣＡＴＨＧＥＮから得られた独特な個体から構成される独立した心血管イベント症例−対照群（「イベント−複製」）において行った。これらのうち、イベント症例（Ｎ＝６３）は、死亡したもしくはＭＩに罹った、またはカテーテル処置後２年以内に急性の冠動脈症候群でＰＣＩを行い、対照（Ｎ＝６６）は、フォローアップの少なくとも２年でイベントがなく、年齢、人種、性別およびＣＡＤ指数において症例に一致した。
【００３７】
Ｄｕｋｅ大学施設内審査委員会（Ｄｕｋｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）は、ＣＡＴＨＧＥＮに関するプロトコールおよび現在の試験を承認した。インフォームドコンセントは、それぞれ対象から得た。
【００３８】
代謝産物測定
空腹時血漿試料を、４５種のアシルカルニチン、１５種のアミノ酸、５つの従来の分析物（総コレステロール、低密度リポタンパク質［ＬＤＬ］コレステロールおよび高密度リポタンパク質［ＨＤＬ］コレステロール、トリグリセリド、ならびにグルコース）、ケトン、β−ヒドロキシブチラート、全遊離脂肪酸およびＣ反応性タンパク質［ＣＲＰ］についての標的レベルの定量的な決定のために用いた（表１）。それぞれのアッセイの方法論および変動係数は報告されている。（非特許文献２および非特許文献３を参照）。研究室（Ｓａｒａｈ ＷＳｔｅｄｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ／ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、症例−対照状態に盲検化され、症例／対照は無作為に分布された。
【００３９】
標準の臨床化学方法を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した試薬を含む従来の代謝産物のために、およびＷａｋｏから入手した試薬を含む（全）遊離脂肪酸およびケトン（全およびβ−ヒドロキシブチラート）のために用いた。すべてのアッセイを、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１臨床化学分析器で行った。
【００４０】
質量分析（ＭＳ）によってプロファイルされた代謝産物（アシルカルニチン、アミノ酸）の場合、次のプロトコールを用いた。（非特許文献４および非特許文献５を参照）タンパク質を、メタノールを用いた沈澱により最初に除去した。アリコートした上清を乾燥し、次いで、熱い、酸性のメタノール（アシルカルニチン）またはｎ−ブタノール（アミノ酸）でエステル化した。Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を有するタンデム型ＭＳを用いて分析をした。「標的化された」中間代謝物の定量を、安定同位体内部標準の公知の量の混合物を加えることによって容易にした（表３）。ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ）を、これらが、本発明者らのＭＳ／ＭＳ方法によって分離されず、アロ−イソロイシンおよびヒドロキシプロリンによる寄与を含むため、単一の分析物として報告した。正常な環境下で、これらの等比重のアミノ酸は、ＬＥＵ／ＩＬＥに帰せられるシグナルにほとんど寄与しない。さらに、ブチルエステルを形成するために用いた酸性条件により、グルタミンをグルタミン酸に部分的に加水分解し、アスパラギンをアスパルタートに部分的に加水分解する。したがって、ＧＬＵ／ＧＬＮ（ＧＬＸ）またはＡＳＰ／ＡＳＮ（ＡＳＸ）として報告される値は、グルタマートおよびグルタミンのモル和、またはアスパルタートおよびアスパラギンのモル和を示すものではなく、むしろ、グルタマートまたはアスパルタートの量プラスそれぞれグルタミンおよびアスパラギンの部分的な加水分解反応の寄与を測定することを意味する。生物学的な注釈づけは、上記表２に含まれる。
【００４１】
【表３】
【００４２】
統計分析
「０」（すなわち、定量下限（ＬＯＱ）を下回る）として報告された代謝産物レベルは、ＬＯＱ／２の値を与えられた。「０」としての値の＞２５％を有する代謝産物を分析しなかった（５つのアシルカルニチン）。すべての代謝産物を、正規分布に近づけるために自然対数に変換させた。ＣＡＤ状態の分析の場合、一般化された線形回帰モデルを、マッチング、すなわち、糖尿病、高血圧、異脂肪血症、肥満度指数（ＢＭＩ）、ＣＡＤの家族歴、および喫煙によって限定されない伝統的なＣＡＤリスク因子について調整されないおよび調整された、ＣＡＤ症例と対照間の代謝産物レベルの差を評価するために用いた。複製群の分析を、人種、性別および年齢についてさらに調整した。対数に変換すると、すべての有意な代謝産物は、バリン、ケトン、およびＣ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣアシルカルニチンを除いて、正規分布（コルモゴロフ−スミルノフ検定Ｐ＞０．０１）を示した。分布を目視検査すると、大いに正規分布が示唆された。それにもかかわらず、本発明者らは、ノンパラメトリックウィルコクソン検定を用いて感度分析を実施し、バリンおよびＣ１４：２アシルカルニチンを除く、セミパラメトリックな線形モデルとして類似の結果を示し、どちらも、線形回帰において有意でなかった（それぞれｐ＝０．１０およびｐ＝０．０６）が、これらのノンパラメトリック検定で有意であった（ｐ＝０．０５およびｐ＝０．００８）。分析を、糖尿病および喫煙によってやはり層別化した。
【００４３】
探索的分析において、多変量モデルを、薬剤クラス（β遮断薬、スタチン、糖尿病薬剤、アスピリン、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、硝酸塩、クロピドグレルおよび利尿薬）、処置前の鎮静の使用、およびカテーテル処置時の連続的な静脈内ヘパリンの使用についてさらに調整した。ＣＡＴＨＧＥＮプロトコールは、カテーテル処置中の追加的なヘパリン投与前に試料採取を必要とする。したがって、カテーテル処置時の連続的な静脈内ヘパリン使用についての調整は、ヘパリンに関連した差に対処している。個体の６６％が薬剤データを有しているにすぎず、そのため、薬剤を、別々の変数としてコード化した。すなわち、投薬なし、不明、および投薬ありである。
【００４４】
代謝産物が重複する経路に存在する場合、代謝産物の相関は予想される。本発明者らは、主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、多数の相関変数を無相関因子にした。「固有値」がより高い因子は、データセット内でより多量の可変性を説明する。固有値≧１．０を有する因子を同定し、バリマックス回転を行って解釈可能な因子を生成した。因子負荷≧｜０．４｜を有する代謝産物を、因子を構成するものとして報告した。表１０を参照のこと。スコアリング係数を、初期群から構成し、それぞれの個体についての因子スコア（それぞれの代謝産物について因子負荷量に重み付けされた、その因子内で標準化された代謝産物の重み付けされた和）を算出するために用い、複製群にも適用した。一般化された線形回帰モデルを用いて、症例と対照間との因子スコアの差を評価した。すべての因子は、因子７〜９を除いて正規に分布し（コルモゴロフ−スミルノフ検定Ｐ＞０．０１）、目視検査では、大いに正規分布を示した。これらの因子についてのノンパラメトリックウィルコクソン検定は、線形モデルと同じ結果を示した。
【００４５】
ＣＡＤ症例を対照と識別する代謝産物プロファイルの独立した能力をさらに評価するために、多変量ロジスティック回帰モデルを構成し、これらのモデルにおいて、ＣＡＤリスク因子（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙）をモデルに強制し、次いで、代謝産物因子を加えた。受信者動作曲線（ＲＯＣ）を構成し、モデル適合の測定値を算出した。これらの曲線下面積の比較についてのノンパラメトリック分析を以前の方法を用いて行った（非特許文献６参照）。
【００４６】
その後の心血管イベントの分析の場合、初期および複製群からの症例を併合した（「イベント」群）。代謝産物因子と死亡／Ｍｌの発生までの時間との関係を、（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙、年齢、人種、性別、クレアチニン、駆出率およびＣＡＤ指数について調整されないおよび調整された）Ｃｏｘ比例ハザードを用いて評価した。比例ハザードの仮定は満たされた。「イベント−複製」群中の複製の場合、初期のＣＡＤ群において構成されたＰＣＡ由来因子から得られたスコアリング係数を用いて、イベント−複製群における因子スコアを算出し、ロジスティック回帰を用いて、因子と（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙、クレアチニン、および駆出率について調整されないおよび調整された）症例／対照状態との関連を評価した。
【００４７】
すべての分析が、性質上探索的であり、代謝産物の共直線性をもたらすため、多重比較について調整されない両側のｐ値を示したが、ボンフェローニ補正と関連して解釈された結果を報告した。公称の統計的有意性をＰ≦０．０５として定義した。ボンフェローニにより調整されたｐ値は、Ｐ＜０．０００７（個別の代謝産物）およびＰ＜０．００４（因子）であった。統計解析をＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｃａｒｙ ＮＣ）を用いたＤ．Ｒ．Ｃ．およびＳ．Ｈ．Ｓによって行った。
【００４８】
結果
患者母集団
初期（早期発生ＣＡＤ症例１７４名、一致する対照１７４名）および複製群（ＣＡＤ症例１４０名、対照１４０名）についての母集団の特徴を、表４に示し、イベント−複製群についての母集団の特徴を表５に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
個別の代謝産物のＣＡＤとの関連
いくつかのアミノ酸のレベルは、分枝鎖アミノ酸ロイシン／イソロイシン（Ｐ＜０．０００１）およびバリン（Ｐ＝０．００７）、グルタマート／グルタミン（Ｐ＜０．０００１）、プロリン（Ｐ＝０．０４）およびメチオニン（Ｐ＝Ｏ．０５）を含めて、初期群において症例と対照間で異なった（表６）。いくつかのアシルカルニチンのレベルはまた、Ｃ１６アシルカルニチン（Ｃ１６：１、Ｐ＝０．００６；Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｐ＝０．００４；Ｃ１６：２、Ｐ＝０．０５；およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｐ＝０．００３）、およびＣ４：Ｃｉ４（Ｐ＝０．００９）、Ｃ８（Ｐ＝０．００９）、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ（Ｐ＝０．００３）、およびＣ１０：１（Ｐ＝０．００２）アシルカルニチンを含めて、初期群において症例と対照間で異なった（表６）。ほとんどの代謝産物の場合、これらの差は、ＣＡＤリスク因子についての調整後に持続した。
【００５２】
【表６−１】
【００５３】
【表６−２】
【００５４】
これらの代謝産物のいくつかは、アミノ酸ロイシン／イソロイシンおよびグルタマート／グルタミン、および長鎖アシルカルニチンＣ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣを含めて（効果の類似した方向を有する）調整された分析における複製群で有意であった（表６）。調整されない分析では、これらの代謝産物、アミノ酸メチオニンおよびプロリン、およびＣ１６：２およびＣ１６：１アシルカルニチンは、両群で有意であった。
【００５５】
初期群中のＬＥＵ／ＩＬＥについての関連を減弱するが、脂質（総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリド）についてのさらなる調整は、類似の結果になった（表７および８）。糖尿病によって層別化された分析は、糖尿病による関連のいくつかの異質性を示唆した。例えば、ＬＥＵ／ＩＬＥおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣは、非糖尿病においてより強い関連を示した。喫煙により層別化された分析では、喫煙者および非喫煙者において差がないことが示唆された。
【００５６】
【表７−１】
【００５７】
【表７−２】
【００５８】
【表８−１】
【００５９】
【表８−２】
【００６０】
不偏主成分分析
ＰＣＡは、共線状の代謝産物からなる１２個の因子を同定し（表９）、生物学的に妥当な因子にグループ化した。３個の因子は、調整された分析において初期群の症例と対照間で有意差があった、すなわち、因子１（中鎖アシルカルニチン）、因子４（分枝鎖アミノ酸および関連する代謝産物）、および因子９（アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、Ｃｉ４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ）である。これらの因子のうち、２個の因子（４および９）は、複製群において有意なままであった。因子１は、複製群においてわずかに有意であったにすぎない（調整されないＰ＝０．１５、調整されたＰ＝０．０３）。それぞれの代謝産物についての因子負荷を表１０に示す。
【００６１】
【表９−１】
【００６２】
【表９−２】
【００６３】
【表９−３】
【００６４】
【表１０−１】
【００６５】
【表１０−２】
【００６６】
【表１０−３】
【００６７】
脂質についてさらに調整すると、因子４は初期群において有意でなかったが（初期群：因子１、Ｐ＝０．０００２；因子４、Ｐ＝０．５９；因子９、Ｐ＝０．０２；複製群：因子１、Ｐ＝０．０１；因子４、Ｐ＝０．０２；因子９、Ｐ＝０．００４）、ＣＡＤとの連続した関連を示した。研究がインスリン抵抗性を有する代謝産物との関係を示す場合、本発明者らは、糖尿病について調整したが、空腹時グルコースについてのベース多変量モデルにさらに調整した。これらの分析は、ＣＡＤとの連続した有意な関連を明らかにした（初期群：因子１、Ｐ＝０．０２；因子４、Ｐ＝０．０２；因子９、Ｐ＝０．００３；複製群：因子１、Ｐ＝０．０３；因子４、Ｐ＝０．０５；因子９、Ｐ＝０．０２）。
【００６８】
層別化された分析は、糖尿病と比較して非糖尿病においてＣＡＤを有する因子４と因子９との間でより強力な関連を示唆し（表１１）、糖尿病においてシグナルが最小もしくは識別不能であるが、喫煙によるＣＡＤとの関連において一貫した差はなかった（表１２）。
【００６９】
【表１１】
【００７０】
【表１２】
【００７１】
薬剤の１０クラスについてさらに調整すると、初期群では因子とＣＡＤとの関係に対する影響が最小限であった（因子１、調整されたＰ＝０．００９；因子４、Ｐ＝０．０３；因子９、Ｐ＝０．００３）が、複製群ではまったく有意でなかった（因子１、Ｐ＝０．０２；因子４、Ｐ＝０．１９；因子９、Ｐ＝０．１４）。本発明者らは、検出力を最適化するために組み合わせたデータセットにおいて、利用可能な薬剤データを有するこれらの個体に限定した、類似の分析を行った（Ｎ＝４１６）。これらの結果は、減弱したが（因子４：調整されないモデル、ｐ＝０．０００９；ＣＡＤリスク因子について調整されたモデル、Ｐ＝０．０３；ＣＡＤリスク因子および薬剤について調整されたモデル、Ｐ＝０．０５；因子９：調整されないモデル、Ｐ＝０．０００３；ＣＡＤリスク因子について調整されたモデル、Ｐ＝０．００２；ＣＡＤリスク因子および薬剤について調整されたモデル、Ｐ＝０．００７）、ＣＡＤを有する因子４と９との間の連続した関連を示した。
【００７２】
示された結果を、多重比較について調整していない。本発明者らは、ＰＣＡを用いて代謝産物の共直線性を説明する。個別の代謝産物のうち、グルタマート／グルタミンのみ、ボンフェローニ補正を存続した。因子４および９は、因子のレベルでボンフェローニ補正を存続した（Ｐ＜０．００４）。
【００７３】
代謝産物プロファイルの一般的な心筋梗塞との関連
これらの代謝産物のより重症の表現型との関連を試験するために、本発明者らは、ＣＡＤのない対照と比べた以前のＭＩ歴を有する症例においてＰＣＡ由来の因子の関係を評価した（初期群 ＭＩ症例Ｎ＝８６、複製群 ＭＩ症例Ｎ＝６１）。ＣＡＤと関連する２つの因子（４および９）はまた、両群で以前のＭＩと関連した（表９）。
【００７４】
モデル適合およびＣＡＤのＲＯＣ曲線の評価
代謝産物因子のＣＡＤとの独立した関連をさらに定量化するため、ロジスティック回帰モデルを構成した。すなわち（１）臨床モデル；（２）臨床モデルプラス因子４および９；ならびに（３）臨床モデルプラスすべての代謝産物因子である。因子４および９は、初期群（因子４：オッズ比［ＯＲ］１．４２；９５％ＣＩ、１．０９から１．８４、Ｐ＝０．０１；因子９：ＯＲ０．６９、９５％ＣＩ、０．５３から０．９０、Ｐ＝０．００６）および複製群（因子４：ＯＲ１．４２；９５％ＣＩ１．０６から１．８９、Ｐ＝０．０２；因子９：ＯＲ０．６７；９５％ＣＩ０．４８から０．９２、Ｐ＝０．０１）において、独立にＣＡＤと関連した。初期群におけるモデル適合およびＲＯＣ曲線の測定値（図１）は、臨床変数のみを含むモデルを上回って（ｃ統計量０．７５６；臨床モデルと臨床モデルプラス因子４および９との比較の場合、Ｐ＝０．０６；臨床モデルと臨床モデルプラスすべての因子との比較の場合、Ｐ＝０．００３）、すべての因子（ｃ統計量０．８０４）の付加によるいくつかの改善と共に、因子４および９を含むモデル（ｃ統計量０．７７８）について、穏やかにより優れた識別可能な能力を示した。複製群において、臨床モデル単独（ｃ統計量０．７４３）の場合よりも因子４および９を臨床モデルに加えたｃ統計量（ｃ統計量０．７７３）がわずかに高かったが、すべての因子の付加によりさらに劇的に改善した（ｃ統計量０．８７４；臨床モデルと臨床モデルプラス因子４および９との比較の場合、Ｐ＝０．０４；および臨床モデルと臨床モデルプラスすべての因子との比較の場合、Ｐ＜０．０００１）。
【００７５】
ＣＡＤの診断が考慮されている患者において脂質を測定することが標準治療であり、ＣＲＰが、心血管疾患の認識された生物マーカーであることを前提として、本発明者らは、脂質およびＣＲＰを含めたこれらのモデルを再構成した。これらの分析は、初期および複製群において臨床モデル適合がより高いことを明らかにした（ｃ統計量それぞれ０．８４２および０．７７８）。因子４および９を脂質およびＣＲＰを含めた臨床モデルに付加すると、初期群においてモデルの識別可能な能力が改善せず（ｃ統計量０．８４８、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．３１）、すべての因子を付加することでいくつか改善した（ｃ統計量０．８６５、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．０１）。しかし、代謝産物因子の付加による臨床モデルの改善の大きさは、複製群において類似し大きいままであった（ｃ統計量：脂質およびＣＲＰを含めた臨床モデル、０．７７８；臨床モデル＋因子４および９、０．７９９、Ｐ＝０．０８；臨床モデル＋すべて代謝産物因子、０．９００、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．０００１）。
【００７６】
代謝産物因子およびその後の心血管イベントのリスク
フォローアップの２．７２年の中央値の間、ＣＡＤ症例３１４名のうち７４名は、起こりやすい心血管イベントを有した。調整されない比較において、因子８（短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン）は、死亡またはＭＩの発生に大いに関連した（図２；最高対最低三分位値のハザード比［ＨＲ］２．５０；９５％ＣＩ、１．４７から４．１７；Ｐ＝０．０００８；最高対中央三分位値ＨＲ２．３３；９５％ＣＩ、１．３９から３．８５；Ｐ＝０．００２）。この関連の強度は、ＣＡＤリスク因子、ＣＡＤ指数、年齢、人種、性別、駆出率、クレアチニンおよびカテーテル処置後のＣＡＢＧによる治療について調整した後いくぶんか減弱した（最高対最低三分位値：ＨＲ１．６７；９５％ＣＩ、０．８８から３．１３；Ｐ＝０．１１；最高対中央三分位値：ＨＲ１．８９；９５％ＣＩ１．０９から３．３３；Ｐ＝０．０３）。因子１はまた、調整されない比較において、死亡／ＭＩの発生に関連したが（最高対最低三分位値ＨＲ１．８５；９５％ＣＩ、１．０６から３．２３；Ｐ＝０．０３；最高対中央三分位値ＨＲ１．７９；９５％ＣＩ、１．０２から３．０３；Ｐ＝０．０４）、調整後まったく有意でなかった（それぞれＰ＝０．１４および０．０５）。
【００７７】
これらの知見を検証するため、本発明者らは、独立した症例−対照データセット（「イベント−複製」群）においてメタボロミクスのプロファイリングを行った。この群では、因子８は、その後の心血管イベントに罹った症例対イベントなしの対照においてより高いスコアを有する、心血管イベントに関連した（調整されないＯＲ１．５２；９５％ＣＩ、１．０８から２．１４；Ｐ＝０．０１；調整されたＯＲ１．８２；９５％ＣＩ、１．０８から３．５０；Ｐ＝０．０３）。因子内の個別の代謝産物はまた、元の「イベント」データセットで観察されたものと類似の効果の方向を有する、症例と対照との間で有意に異なった（Ｐ＜０．０５）。
【００７８】
この実施例により、末梢血代謝産物プロファイルが、ＣＡＤの存在と独立に関連しており、臨床変数のみを含むモデルと比較したＣＡＤの識別可能な能力に加えることが実証される。さらに、本発明者らは、ＣＡＤを有する個体においてその後の心血管イベントを独立に予測するある特定の代謝産物クラスターを報告する。
【実施例２】
【００７９】
ＣＡＤの遺伝率
材料および方法
試験母集団。ＧＥＮＥＣＡＲＤ試験は、９２０のファミリーを登録して、（男性５１歳、女性５６歳以前に）早期発生のＣＡＤの遺伝子を同定するために罹患同胞対連鎖を行った（非特許文献７参照）。少なくとも２つの同胞を有し、そのそれぞれが（男性５１歳、女性５６歳以前に）早期発生のＣＡＤの基準を満たすファミリーを補充した。罹患していないファミリーメンバーを、ＣＡＤの臨床的証拠なしおよび男性が５５歳を超える（女性が６０歳を超える）年齢として定義した。このコホートから、本発明者らは、本発明者らが比較的多数のファミリーメンバーの利用可能性および発端者および周囲の世代におけるＣＡＤの重い負担に基づいて特に有益であると考えた、８つの代表的なファミリーを選択した（図３）。これらのファミリーに再度連絡を取り、前もって登録していない罹患同胞対およびファミリーメンバーをＣＡＤに関係なく確認し、罹患同胞対の子孫に焦点を絞った。この確認戦略は、代謝性のプロファイルの異常がこれらのファミリーにおけるＣＡＤの発症に先行するかどうか、子孫中に顕性のＣＡＤがない場合でもファミリー内の代謝産物レベルの有意な一致が明らかであるという仮説に基づいた。所与のファミリー内の試料採取を、１人の熟練した瀉血士によりいくつかの異なる回数でおよび異なる場所で行った。血液試料を、末梢の静脈の瀉血による採取後に（数分以内に）迅速に処理し、その後可能な限り早く凍結し（試料の大部分が採取の１〜２時間以内に凍結されるなら、せいぜい１２時間以内に）、ＥＤＴＡによって処置した管に血漿試料として−８０℃で貯蔵した。試料を、できるだけ空腹状態で採取したが、このコンシステンシーは決定できなかった。施設内審査委員会は、試験プロトコールを承認し、インフォームドコンセントを、それぞれの対象から得た。
【００８０】
生化学的測定。凍結した血漿試料を用いて、３７種のアシルカルニチン種、１５種のアミノ酸、９種の遊離脂肪酸および従来の分析物、ケトンおよびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含めて、標的代謝産物を定量的に測定した。試料調製および変動係数が報告されている（非特許文献８参照）。研究室は、ファミリー識別子および症例−対照状態に盲検化された。アッセイの範囲は、０．０５〜４０マイクロモル（μＭ）（アシルカルニチン）；５〜１０００μＭ（アミノ酸）；および１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ（脂肪酸）である。簡潔にするために、代謝産物の臨床の省略表現を用いる（表１）。個体内の可変性を、繰り返しプロファイリングが別々の５日に同じ試料で実施された５名の個体から得られた試料において評価した。変動係数および相関は、最小限のアッセイ内の可変性を確認した（表１）。
【００８１】
従来の代謝産物分析。標準臨床化学方法を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した試薬を含むグルコース、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、およびトリグリセリド；ならびにＷａｋｏ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から入手した試薬を含む（全）遊離脂肪酸およびケトン（全および３−ヒドロキシブチラート）を含めた従来の代謝産物のために用いた。すべての測定を、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１臨床化学分析器を用いて行った。
【００８２】
アシルカルニチンおよびアミノ酸。タンパク質を最初にメタノールによる沈澱によって除去した。アリコートした上清を乾燥し、次いで、熱い、酸性のメタノール（アシルカルニチン）またはｎ−ブタノール（アミノ酸）でエステル化した。アシルカルニチンおよびアミノ酸を、Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を有するタンデム型ＭＳにより分析した。血漿中の３７種のアシルカルニチン種および１５種のアミノ酸を、本発明者らが前もって記載した方法（非特許文献９；非特許文献４；非特許文献１０参照）によりアッセイした。ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ）が本発明者らのＭＳ／ＭＳ方法によって分離されず、アロ−イソロイシンおよびヒドロキシプロリンからの寄与を含むため、これらを単一の分析物として報告した。正常な環境下で、これらの等比重のアミノ酸は、ＬＥＵ／ＩＬＥに帰せられるシグナルにほとんど寄与しない。さらに、ブチルエステルを形成するために用いた酸性条件により、グルタミンをグルタミン酸に部分的に加水分解し、アスパラギンをアスパルタートに部分的に加水分解する。したがって、ＧＬＵ／ＧＬＮまたはＡＳＰ／ＡＳＮとして報告される値は、グルタマートおよびグルタミンのモル和、またはアスパルタートおよびアスパラギンのモル和を示すものではなく、むしろ、グルタマートまたはアスパルタートの量プラスそれぞれグルタミンおよびアスパラギンの部分的な加水分解反応の寄与を測定することを意味する。
【００８３】
遊離脂肪酸。遊離脂肪酸を、ヨードメタンを用いてゆっくりとメチル化し、固相抽出によって精製した（非特許文献１１参照）。誘導体化された脂肪酸を、Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてキャピラリーガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析した。試料容積を考慮することによって、１１７名の個体のうち８０名のみ（８ファミリーのうち５ファミリー）は、遊離脂肪酸測定が行われた。
【００８４】
すべての質量分析は、安定同位体希釈を使った。前述の「標的化された」中間代謝物の定量は、公知の量の安定同位体内部標準の混合物を、Ｉｓｏｔｅｃ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）およびＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃ１ａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ、ＣＮ）から入手した試料に加えることによって容易にした（表３）。
【００８５】
遺伝率分析。遺伝率を、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｌｉｇｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｏｕｔｉｎｅｓ（ＳＯＬＡＲ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．７（非特許文献１２参照）を用いて算出し、これは、最尤法を用いて分散成分を推定し、遺伝的影響についての公知の共変量および分散成分についての固定された影響の取り込みを可能にする。この手法は、すべてのファミリーメンバー間の相関を適切に説明し、現在の研究において存在するような拡大した家系の取り込みを可能にする。全変動は、相加遺伝分散および環境分散、ならびに残りの（未解明の）可変性についての成分に分配される。このプログラムは、家系の共分散行列を用いる。
【００８６】
【数１】
【００８７】
式中、Ωは共分散行列であり、Φは血族値の行列であり、
【００８８】
【数２】
【００８９】
は相加遺伝分散であり、Ｉは単位行列を表し、
【００９０】
【数３】
【００９１】
はランダムな環境分散である（非特許文献１２参照）。このモデルは、複雑な家系データ（すなわち、親−子孫対を超えた）を可能にし、そのため、得られた遺伝率推定値は、核ファミリーメンバーのみを用いて得られたものよりも正確である。現在の研究の場合、家系からの採取されたすべての個体は、罹患していない子孫、いとこ、および婚姻したファミリーメンバーを含めて、分散成分モデルの一部になる。婚姻したファミリーメンバー（すなわち、遺伝子的に無関係であるが環境を共有する）の取り込みは、形質の家族内のクラスタリングの環境成分のより優れた推定を可能にする。
【００９２】
外れ値とみなされる値を、遺伝率分析から除外し，平均±４ＳＤ以外に属する値として定義した（それぞれ２４種の代謝産物について１〜２個の外れ値）。定量下限（ＬＯＱ）を下回る代謝産物測定値には、ＬＯＱ／２の値が与えられた。ＬＯＱを下回る試料の＞２５％を有する４種の代謝産物を、さらに分析しなかった（Ｃ６、Ｃ５−ＯＨ：Ｃ３−ＤＣ、Ｃ４ＤＣ、およびＣ１０：２アシルカルニチン）。すべての測定値を、分析前に自然対数に変換し、その結果、ほとんどの代謝産物は、分散成分分析について考慮すべき重要な点である、正規分布に近似した。１８個の代謝産物は、この判定基準を満たさず、したがって、肥満度指数（ＢＭＩ）、年齢、性別、ＣＡＤ、糖尿病（ＤＭ（あり／なし）、高血圧（あり／なし）、および異脂肪血症（あり／なし）について調整された線形回帰モデルを、これらの代謝産物のそれぞれについて構成し、残差を遺伝率推定値に用いた。代謝産物について時々の低い形質の標準偏差（＜０．５）があることを前提として、すべての対数に変換された代謝産物を、分析前に４．７倍に乗じた。
【００９３】
次いで、多遺伝子性の遺伝率モデルを構成した。正規に分布する代謝産物（代謝産物の大部分）の場合、多遺伝子性の遺伝率モデルを、年齢、性別、ＢＭＩ、ＤＭ、異脂肪血症、高血圧およびＣＡＤについて調整し、対数変換値を用いて算出した。発端者およびファミリーメンバーを、任意の代謝産物値に基づいて選択しなかったが、確認バイアスの可能性が存在する。したがって、分析を、ファミリーメンバー（発端者）が早期発生ＣＡＤのファミリーを確認するための指標メンバーであったことに基づいて補正した。食事制限（家庭で共有するが、推定上遺伝的ではない）などの因子を説明するために、（現住所（ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ ａｄｄｒｅｓｓ）のマーカーによるモデルが含まれる）一般的な家庭の影響に関連する分散の画分に対応する追加の分散成分パラメータを、それぞれのモデルに加えた。最終の多遺伝子性のモデルのすべての残差尖度は、２種のアミノ酸（セリンおよびフェニルアラニン）、１１種のアシルカルニチン（Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１０：１、Ｃ１０：３、Ｃ１２：１、Ｃ１４、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６−ＯＨ：Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：１−ＯＨ、Ｃ１８：１−ＤＣ、およびＣ１８−ＤＣ：Ｃ２０−ＯＨ）および３種の遊離脂肪酸（ＦＡＣ１４：０、ＦＡＣ１６：１、ＦＡＣ１８：１）を除いて、正常な範囲内であった（すなわち、＜０．８）。これらの代謝産物の場合、最も極端な値の１〜４個を除去することが必要であり、その結果、正常な残差尖度になった。２種のアシルカルニチンは、正常な残差尖度（Ｃ１６−ＯＨ：Ｃ１４−ＤＣおよびＣ１２−ＯＨ：Ｃ１０−ＤＣ）を達成するためにさらに多数の外れ値の除去を必要とし、そのため、これらの結果は、それに応じて解釈すべきである。１８種の正規に分布しない代謝産物の場合、調整された回帰モデルから得られた標準化された残差を、ＳＯＬＡＲを用いて遺伝率を推定するために用いたが、正常化された変数が関連する共変量についてすでに調整されたため、これらの残差を用いた遺伝率モデルをさらに調整しなかった。臨床の共変量によって説明された分散の比率の推定値を、対数に変換した粗の値から構成された調整された多遺伝子性のモデルを用いて推定した、これらの正規に分布しない代謝産物について報告する。
【００９４】
ファミリー間の代謝産物における定量的な差を理解するために、性別、年齢、ＢＭＩ、ＣＡＤ、ＤＭ、異脂肪血症および高血圧について調整された、多変量によって一般化した線形モデルを用いて、ファミリー間の平均代謝産物レベルを比較した。
【００９５】
教師なし主成分分析。多くの代謝産物が重複する経路に存在する場合、代謝産物の相関が予測される。相関を理解するために、本発明者らは、多数の相関した変数を、外れ値を除去せずに生の代謝産物の値を用いてより少ない数の相関していない因子のクラスターにするために主成分分析（ＰＣＡ）を用いた。最も高い「固有値」を有する因子は、データセット内の最も多量の可変性を説明する。年齢、性別、ＢＭＩ、ＤＭ、およびＣＡＤについて調整された線形回帰モデルからそれぞれの代謝産物を算出した標準化された残差を、ＰＣＡのための入力として用いた。この場合に関して、それぞれの変数の単位が大きさで有意に変わるとき、残差を用いたＰＣＡは、推奨される（非特許文献１３を参照）。固有値≧１．０を有する因子を、一般に使用したＫａｉｓｅｒ判定基準に基づいて同定した（非特許文献１４を参照）。次いで、バリマックス回転を行って、解釈可能な因子を生成した。因子負荷≧｜０．４｜を有する代謝産物を、任意の閾値として一般に用いられ、所与の因子を構成するものとして報告した（非特許文献１５を参照）。次いで、スコアリング係数を用いて、（それぞれの個別の代謝産物について算出した因子負荷量に重み付けされた、その因子内で標準化された代謝産物の値の重み付けされた和からなる）それぞれの個体の因子スコアをコンピュータで計算した。次いで、これらの因子スコアを、共変数についてさらに調整されない多遺伝子性のモデルを用いた、上記で詳述したＳＯＬＡＲでそれぞれの因子の遺伝率を算出するために用いた。因子のいくつかの最も極端な値の１〜４個を除去することは、正常な残差尖度を達成するために必要であった。
【００９６】
すべての分析が性質上探索的であり、代謝産物の共直線性をもたらすため、多重比較について調整されない公称の両側のｐ値を示したが、保守的なボンフェローニ補正と関連して解釈した結果を報告した。公称の統計的有意性をｐ値≦０．０５として定義した。統計解析は、ＳＯＬＡＲ（非特許文献１２を参照）を用いた遺伝率推定値の他に、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ ＮＣ）を用いた。
【００９７】
結果および考察
遺伝率分析。代謝性のプロファイリングを、早期ＣＡＤのＧＥＮＥＣＡＲＤ試験から得られた８つのマルチプレックスのコーカサス人ファミリー（図３）内の個体１１７名に行った。注目すべきことに、本試験で標本抽出したファミリーメンバーの大部分は、元の罹患同胞対の、今のところ罹患していない子孫であったが、この子孫は、これらのファミリーのメンバーとして、早期ＣＡＤの発症のリスクが高かった。予想通り、有病率がファミリー間で異なったが、ＣＡＤリスク因子の負担が高かった（表１３）。
【００９８】
【表１３】
【００９９】
本発明者らは、脂質およびＢＭＩなどの従来のリスク因子の高い遺伝率を見出した（図４）。全ケトン（ｈ2 ０．７５、ｐ＝３．８×１０-8）は、非質量分析に基づく方法により分析した代謝産物間で最も遺伝率が高く、同様に、個別のケトンβ−ヒドロキシブチラートの遺伝率が高かった（ｈ2 ０．５１、ｐ＝０．００４）。質量分析によって測定された分析物のうち、いくつかのアミノ酸は、遺伝率が高かった（図５、表１４）。アルギニン（ＡＲＧ）は、スコアが最も高く（ｈ2 ０．８０、ｐ＝１．９×１０-16）、グルタミン／グルタマート（ＧＬＸ；ｈ2 ０．７３、ｐ＝０．００００６）、アラニン（ＡＬＡ；ｈ2 ０．５５、ｐ＝０．００００２）、プロリン（ＰＲＯ；ｈ2 ０．５２、ｐ＝０．００００４）、オルニチン（ＯＲＮ、ｈ2 ０．４８、ｐ＝０．０００００５）、フェニルアラニン（ＰＨＥ；ｈ2 ０．４６、ｐ＝０．０００１）、および分枝鎖アミノ酸ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ；ｈ2 ０．３９、ｐ＝０．００００５）およびバリン（ＶＡＬ；ｈ2 ０．４４、ｐ＝０．００００６）の遺伝率もまた強力であった。遊離脂肪酸（図５）のうち、ＦＡ−Ｃ２０：４（アラキドン酸、炎症経路の中で最重要な成分）が、ＦＡ−Ｃ１８：２（リノール酸、アラキドン酸の前駆体、ｈ2 ０．４８、ｐ＝０．００２）と同様に最も遺伝性であった（ｈ2 ０．５９、ｐ＝０．００００５）。多くのアシルカルニチンもまた、遺伝率が高く（図６、表１４）、最も高いのは、Ｃ１８アシルカルニチン（Ｃ１８、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２、ｈ2 ０．３９〜０．８２、ｐ＝０．００００００７〜０．００４）；Ｃ１４：１（ｈ2 ０．７９、ｐ＝０．００００００２）；Ｃ５：１（ｈ2 ０．６７、ｐ＝０．０００００３）；Ｃ１０群（Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８−ＤＣ、Ｃ１０およびＣ１０：１、ｈ2 ０．３５〜０．５７、ｐ＝０．００００３〜０．０２）；Ｃ１６（ｈ2 ０．５７、（ｐ＝０．０００２）；Ｃ４：Ｃｉ４（ｈ2 ０．５６、ｐ＝０．００００３）；短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン（Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、ｈ2 ０．４５〜０．５１、ｐ＝０．００３〜０．００４）；およびＣ２アシルカルニチン（ｈ2 ０．５０、ｐ＝０．００００８）であった。興味深いことに、それぞれの代謝産物の可変性の遺伝的な成分の推定値は、しばしば、臨床の共変量によって説明される分散の比率を超えた（表１４）。
【０１００】
【表１４−１】
【０１０１】
【表１４−２】
【０１０２】
【表１４−３】
【０１０３】
ファミリー内のメタボロミクスのプロファイル。これらの強力な知見を前提として、本発明者らは、ファミリー間の代謝産物の定量的な差を理解しようと努めた。多変量の線形モデルを用いてファミリー間の代謝産物の差を試験した。アミノ酸の中で、グルタマート、オルニチン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アラニンおよびメチオニン（すべてｐ＜０．０００１）、ロイシン／イソロイシン（ｐ＜０．０００１）およびバリン（ｐ＝０．００３）は、ファミリーを最も良く区別した。アシルカルニチンの中で、Ｃ５：１（ｐ＜０．０００１）およびＣ２（ｐ＜０．０００１）アシルカルニチンと共に、Ｃ１８（Ｃ１８、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２）およびＣ１４アシルカルニチン（Ｃ１４、Ｃ１４：１）（すべてｐ＜０．０００１）は、ファミリーを最も良く区別した。多くの遊離脂肪酸は、ファミリーを区別し、最も強力なものは、アラキドン酸およびパルミチン酸（両方ｐ＜０．０００１）であった。従来の代謝産物の中で、ケトン（ｐ＜０．０００１）およびβ−ヒドロキシブチラート（ｐ＝０．０００１）は、ファミリーを最も良く区別した。
【０１０４】
主成分分析。生物学的な経路における代謝産物の相関の場合、本発明者らは、代謝産物のクラスターが相関したことを理解するためにおよびほとんど遺伝性であった因子を同定するためにＰＣＡを行った。１５個の因子を同定し、生物学的に一定の関係が証明された（表１５）。データセット内で最も多量の分散を占めている因子は、因子１（短鎖および中鎖アシルカルニチン）；因子２（長鎖遊離脂肪酸）；因子３（ミトコンドリアの機能でおそらく報告している長鎖アシルカルニチンおよびアミノ酸［アルギニン、グルタマート／グルタミン、およびオルニチン］）；因子４（ケトン、β−ヒドロキシブチラート、Ｃ２およびＣ４−ＯＨ［β−ヒドロキシブトリル］アシルカルニチン；脂肪酸酸化の最終ステップのすべてのマーカー）；および因子５（分枝鎖アミノ酸を含めたアミノ酸、ならびにＣ３およびＣ５アシルカルニチン［分枝鎖アミノ酸異化作用の副生成物］）であった。予想通り、個別の代謝産物についての結果を前提として、多くの因子は遺伝性であった。
【０１０５】
【表１５−１】
【０１０６】
【表１５−２】
【０１０７】
分析ツールの包括的なセットを適用して、心血管疾患の生化学的および生理的な基盤、ならびにどのようにしてメタボロミクスのプロファイルがＣＡＤリスクの公知の遺伝成分に関係し得るのかということのより良い理解を得た。標的化された、定量的な代謝性のプロファイリングを、早期ＣＡＤを抱えたマルチプレックスファミリー内で行い、その大部分が、ＣＡＤをまだ発症していなかった罹患した世代の子孫を表したが、その中で、かかるプロファイルが遺伝性であった場合、本発明者らは、彼らの罹患したファミリーメンバーと類似の代謝性のプロファイルを仮定した。高い遺伝率は、多くの代謝産物に見出され、多くは従来のリスク因子よりも高い遺伝率を有した。こうした高い遺伝率は、遺伝子型および表現型間の強力な相関を示唆し、ＣＡＤを抱えたファミリーにおけるこれらの代謝性のサインのクラスタリングへの強力な遺伝成分を意味する。
【０１０８】
さらに、いくつかの個別の代謝産物は、ファミリーを区別し、最も際立ったのは、アミノ酸のうち、アルギニン、オルニチン、およびグルタマート／グルタミンであり、脂質由来代謝産物のうち、長鎖アシルカルニチンＣ１８：０、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２である。これらの知見は、これらのファミリーにおけるミトコンドリアの機能の基本的な差を示唆し、損傷を受けたミトコンドリアの機能とインスリン抵抗性との関係を示す以前の研究と整合する。
【０１０９】
本発明者らの研究が仮説生成であったことを前提として、本発明者らは、多重比較について調整しなかった。しかし、因子のレベルにおけるボンフェローニ補正により、９つの因子は有意なままである（ｐ＜０．００３）。本発明者らは、食事パターン（代謝産物に対する公知の影響）、腎機能、または薬剤（未知の影響）について説明しなかった。これらの「非遺伝性の」影響を最小限にするのを助けるため、本発明者らは、家庭の影響を組み込み、婚姻した個体を含め、共有した栄養上および他の環境の影響について部分的に制御した。家庭の影響の測定により、調整に関わらず高い遺伝率を有する遺伝率推定値に対する最小限の影響が示唆される。したがって、本発明者らは、結果が、伝統的なコレステロールパラメータと同様の、両方の根底にある遺伝および環境の影響を反映すると考える。したがって、本発明者らは、ＬＤＬコレステロールの有意な家庭の影響を見出したが（家庭による分散の比率０．１１、ｐ＝０．０２）、この環境の影響についての調整にもかかわらず遺伝率は有意であった（ｈ2 ０．３７、ｐ＝０．００４）。
【０１１０】
同様に、結果は、必須の代謝産物対非必須の代謝産物の差を反映し得る。しかし、本発明者らは、群として分析したとき、必須（ｈ2＝０．４０、ｐ＝０．０００４）および非必須（ｈ2＝０．６３、ｐ＝０．００００２）アミノ酸の類似の遺伝率を見出し、必須（ｈ2＝０．５０、ｐ＝０．００３）脂肪酸の類似の遺伝率を非必須（ｈ2＝０．３３、ｐ＝０．０３）脂肪酸と比較した。かかる分析にパワー不足であるが、本発明者らはまた、年齢のこれらの群に関係する遺伝率との関係を試験した。年齢は、両方の必須（バリン）および非必須（プロリン、オルニチン、シトルリン）アミノ酸の遺伝率推定値に対して有意な共変量であった（表１４）。遊離脂肪酸の場合、年齢は、非必須脂肪酸（パルミトレイン酸、オレイン酸およびステアリン酸）のみの共変量であった。本発明者らはまた、代謝産物の年齢との相関を試験し、必須（チロシン、リノール酸）および非必須（グルタミン、オルニチン、シトルリン、オレイン酸）代謝産物の両方が、年齢と有意に相関した（データ未掲載）ことを見出した。したがって、必須／非必須群に基づいて、代謝産物の年齢との一貫した変動になると思われず、遺伝率推定値との一貫した変動になるとも思われない。これは、基本的なおよび遺伝子的に制御された代謝過程（例えば、ミトコンドリアのまたはミクロソームの異化経路）が、代謝機構のこれらの一般的な要素を利用する必須および非必須の代謝産物のレベルに影響を与えていることが示され得る。
【０１１１】
遺伝率推定値に影響を与え得る他の因子には、試料採取またはプロセシングにおける可変性が含まれる。本発明者らは、この可変性のタイプを制限するために標準化されたプロトコールを用い、個体内の変動は、一組の繰り返されるアッセイにおいて低く、ファミリーメンバーは、異なる場所および時間で採取された。
【０１１２】
本試験の主な強度は、メタボロミクスのプロファイリングへの非常に正確な、標的化された、定量的な手法の使用であり、ＣＡＤ病態生理の根底にある生物学的な機序を精査することが可能になる。ＣＡＤ病態生理の理解を促す他、これらの結果は、リスク予測のための有意な意味を有し得る。
【０１１３】
本明細書で引用したそれぞれの参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月１０日出願の米国特許仮出願第６１／１５９，０７７号明細書の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、先進工業国における主な死亡原因であり、肥満および糖尿病の流行と足並みを揃えており、急速に開発途上国の主な死亡原因になっている。ＣＡＤの遺伝的な偏向は十分に確立されており、家族歴は、特に、早期の発生形態でＣＡＤの独立したリスク因子となり得ることが示されている。これにもかかわらず、ＣＡＤの遺伝的な構築は、大部分は未知のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Smith et al., Circulation 1991;84[5 Suppl], 111:245-253
【非特許文献２】Shah et al., Mol Syst Biol 2009;5:258
【非特許文献３】Newgard et al., Cell Metab 2009;9(4):311-26
【非特許文献４】An et al., Nat Med 2004;10(3):268-274
【非特許文献５】Chace et al., Clin Chem 1995;41(l):62-8
【非特許文献６】DeLong et al, Biometrics 1988;44(3):837-45
【非特許文献７】Hauser et al, 2003, Am Heart J, 145, 602-613
【非特許文献８】Haqq et al, 2005 Contemp Clin Trials, 26, 616-625
【非特許文献９】Millington et al, 1990, J Inherit Metab Dis, 13, 321-324
【非特許文献１０】Wu et al, 2004, J Clin Invest, 113, 434-440
【非特許文献１１】Patterson et al, 1999, J Lipid Res, 40, 2118-2124
【非特許文献１２】Almasy and Blangero, 1998, Am J Hum Genet, 62, 1198-1211
【非特許文献１３】Johnson and Wichern D. W., 1988, Applied Multivariate Statistical Analysis. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey
【非特許文献１４】Kaiser, 1960, Educational and Psychological Measurement, 20, 141-151
【非特許文献１５】Lawlor et al, 2004, Am J Epidemiol, 159, 1013-1018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＡＤの多くの容認されたリスク因子は代謝性である。しかし、ＣＡＤのリスクを機構的に理解することはまだ完全ではなく、心血管イベントの最も高いリスクがある個体を同定する能力を洗練させる必要性が等しく重要である。ＣＡＤの複雑な性質を考えると、より包括的なツールによる判定は、リスク階層化を改善し疾患過程の理解を深めることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法が提供される。リスク評価は、心筋梗塞などのその後の心血管イベントの可能性を予測すること、ＣＡＤの発症を予測すること、または対象におけるＣＡＤの存在を識別することが含まれ得る。これらの方法には、対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物を検出するステップが含まれる。代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸またはβ−ヒドロキシブチラートとなり得る。その場合は、代謝産物のレベルは、標準または対照群と比較され、対象における心血管イベントのリスクのレベル、ＣＡＤの発症のリスクまたはＣＡＤの存在を決定するために用いることができる。
【０００６】
他の態様では、ＣＡＤを発症した対象もしくは発症するリスクのある対象または心血管イベントのリスクのある対象のための治療計画を開発する方法はまた、提供される。これらの方法には、対象における検出された代謝産物のレベルを用いて、対象における心血管疾患のリスクに基づいた治療計画を開発するステップが含まれる。この計画は、食事制限、運動および医薬品治療オプションを含み得る。
【０００７】
さらに他の態様では、対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法は、試料が対象から得られるものが提供される。試料は、試料中の代謝産物レベルを検出するために研究室に提供される。検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸またはヒドロキシブチラートとなり得る。研究室は、対象における心血管疾患のリスクを示す、試料中の代謝産物レベルを示す報告書を返却する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】代謝産物因子およびＣＡＤの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す一組のグラフである。ＲＯＣ曲線およびモデルの適合（ｃ統計量）の測定値は、３つのモデルについて示された。すなわち、伝統的なＣＡＤリスク因子（糖尿病、高血圧、異脂肪血症、喫煙、ＢＭＩ、家族歴；複製群の場合、年齢、人種および性別はまた含まれる）を含めた臨床モデル（黒線）；すべての伝統的なリスク因子プラス代謝産物因子４および９を含めたモデル（灰線）；すべての伝統的なリスク因子プラスすべての代謝産物因子を含めたモデル（破線の黒線）である。上部のグラフは、初期群を示し、下部のグラフは、複製群を示す。
【図２】心血管イベントのための代謝産物因子８の予測能力のためのコックス比例ハザードモデルを示す一組のグラフである。調整されない（左パネル）および調整された（右パネル）生存曲線（ＢＭＩ、ＣＡＤの重症度、高血圧、異脂肪血症、糖尿病、喫煙、家族歴、駆出率、血清クレアチニン、その後のＣＡＢＧ、年齢、人種および性別について調整された）は、代謝産物因子８について示された。
【図３】８つのマルチプレックスのＧＥＮＥＣＡＲＤファミリーの系図を示す図である。符号中の塗りつぶされた黒は早期ＣＡＤに罹患したことを表し、より小さい灰色の丸は、本試験のために行われた血液プロファイリングを表す。プロファイルされたファミリーメンバーの大部分は、元の罹患した同胞対（以下、罹患同胞対）の今のところ罹患していない子孫であることに留意されたい。
【図４】従来の代謝産物の遺伝率を示すグラフである。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【図５】アミノ酸および遊離脂肪酸の遺伝率を示すグラフである。示されたのは、アミノ酸および遊離脂肪酸の遺伝率である。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【図６】アシルカルニチンの遺伝率を示すグラフである。Ｙ軸は、遺伝率推定値（Ｘ軸）のためのｐ値の負のｌｏｇ１０である。遺伝率の点推定値近くのエラーバーは、薄灰色である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
小分子代謝産物の試験であるメタボロミクスは、ヒトの疾患の診断に有用となり得る。試験は、植物およびマウスにおける代謝産物の遺伝率を実証している。実施例に記載されている通り、代謝産物プロファイルは、早期発生ＣＡＤを有するヒトのファミリーに遺伝性であり、ＣＡＤの公知の遺伝率は、血液中の測定可能な代謝性の成分によって少なくとも一部で媒介され得ることを示唆する。実施例は、Ｄｕｋｅ大学ＣＡＴＨＧＥＮバイオレポジトリー（Ｄｕｋｅ ＣＡＴＨＧＥＮ ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）に登録された患者においておよびＤｕｋｅ大学ＧＥＮＥＣＡＲＤ試験（Ｄｕｋｅ ＧＥＮＥＣＡＲＤ ｓｔｕｄｙ）から選択されたファミリーにおいて、アシルカルニチン種（ミトコンドリアの脂肪酸、炭水化物、およびアミノ酸酸化の副生成物）、アミノ酸、ならびに遊離脂肪酸、ケトンおよびβ−ヒドロキシブチラートなどの従来の代謝産物を含めて、６９種の代謝産物の定量的なプロファイリングを記載している。対象において心血管疾患のリスクを評価する代謝産物プロファイルの能力は、本明細書において提供される。実施例により、特定の代謝産物のレベルは、単独であるいは組み合わせて、ＣＡＤを発症する可能性、ＣＡＤの存在およびその後の心血管イベントのリスクを識別することが実証される。
【００１０】
対象において心血管疾患のリスクを評価するまたは予測する方法は提供される。これらの方法には、対象からの試料中で少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップが含まれる。代謝産物の量または相対レベルは検出することができる。検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、またはヒドロキシブチラートとなり得る。対象からの試料中の代謝産物のレベルは、その場合、心血管疾患のリスクを評価するために標準と比較される。標準は、正常な範囲および／または心血管疾患を示す範囲を示す各代謝産物について経験に基づいて引き出された数値になり得るまたは公知の心血管疾患状態を有する個体における代謝産物のレベルとの直接比較になり得る。
【００１１】
対象から試料を得るステップおよび試料中の代謝産物レベルを検出するために研究室に試料を提供するステップにより対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法はまた提供される。上記と同様に、研究室により検出された代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸およびヒドロキシブチラートを含み得る。その場合には、試料中の代謝産物レベルを示す報告は、研究室から受け取られる。報告は、対象における代謝産物のレベルを示し、このレベルは、対象における心血管疾患のリスクを示す標準値と比較するために用いることができる。
【００１２】
心血管疾患のリスクには、ＣＡＤを有さない対象の、遺伝性の因子により経時的にＣＡＤを発症するリスクを評価すること、対象においてＣＡＤの存在または非存在を評価することおよび心血管イベントを有するリスクを評価することが含まれる。心血管イベントには、心筋梗塞、脳卒中および死亡が含まれる。
【００１３】
対象は、任意の哺乳動物となり得、適当には、対象はヒトである。ＣＡＤを有するまたはＣＡＤを発症するリスクがあると同定された対象は、本明細書で提供される方法を用いて心血管イベントのこれらのリスクを決定するためにさらに評価することができる。これらの方法は、非侵襲的なやり方でＣＡＤの存在を診断するのに役立てるおよび／またはＣＡＤのリスクがあると同定された対象、ＣＡＤを有する対象または心血管イベントのリスクがある対象のための治療計画を開発するために用いることができる。治療計画は、対象への規定食、運動、および医薬品療法の提供が含まれ得る。心血管イベントには、制限するわけではないが、心筋梗塞（ＭＩ）、脳卒中および死亡が含まれる。
【００１４】
代謝産物は、様々な試料を用いて検出することができ、その中のいくつかは、当業者には明らかである。実施例では、末梢血は、対象から得られ、対象における代謝産物のレベルを検出するために処理された。対象からの他の組織または液体は、それだけには限らないが、血液、血漿、尿、血清、唾液、および組織生検を含めて用いることもできる。
【００１５】
任意の方法は、代謝産物を検出するために用いることができる。適当には、この方法は、対象における代謝産物または対象からの試料のレベルもしくは量を決定できるように定量的である。実施例において、代謝産物のレベルは、質量分析により決定された。測定の他の方法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を含めて用いることができる。代謝産物はまた、結合もしくは酵素アッセイなどのアッセイによる代謝産物の検出に基づいた比色定量アッセイまたは蛍光定量アッセイを用いて検出することができる。代謝産物についての任意の適当なアッセイ方法は用いることができる。かかる方法は、当業者には明らかである。対象における代謝産物のレベルは、血液または組織中の代謝産物をｎｇ／ｍｌとして、血液もしくは組織中の代謝産物ｍＭまたはμＭ濃度によって、または対象間の相対レベルを示すために任意の単位を用いることによって報告することができる。実施例では、血液中の代謝産物ｍＭもしくはμＭは報告される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、単一の代謝産物の検出は、心血管疾患のリスクを評価するのに十分である。他の実施形態では、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５種の代謝産物は、心血管疾患のリスクを評価するための方法で検出し用いることができる。検出された代謝産物は、対象の母集団の主成分分析による一因子として関連し得る。ＣＡＤの遺伝率を評価するために有用なおよびＣＡＤの存在もしくは心血管イベントを有するリスクのために有用な代謝産物の因子、または群は、以下の実施例に示される。
【００１７】
対象における代謝産物のレベルは、対象がＣＡＤ、対象がＣＡＤを発症するリスクおよび／または対象が将来心血管イベントを経験するリスクを有するか否かを決定するために用いられる。リスク決定のレベルは、血液中に存在する代謝産物の標準レベルに基づくことができる。このような標準は、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール測定値間の関係について用いられ、コレステロールレベルが絶食後の血液中のあるレベルに達し、ＨＤＬ対ＬＤＬの比が標準の限界を超えるとき、ＣＡＤのリスクは予測される。かかる標準は、大規模な母集団試験に基づいて一般に開発される。あるいは、リスクの決定は、１種または複数の対照群との直接比較に基づくことができる。例えば、一組のＣＡＤがない対照群および試料入手後２年心血管イベントを伴わない対照群、ならびに一組のＣＡＤを有する対照群および試料入手後２年心血管イベントを伴うもしくは伴わない対照群は、比較として用いられ得る。
【００１８】
対象における心血管疾患のリスクは、相対的な用語で表すことができる。例えば、代謝産物の正常なレベルは、ＣＡＤまたは心血管イベントなど、心血管疾患の低リスクから平均的なリスクのある対象において１．０と言われ得る。１．０未満の任意の数値は、対象が一般的な母集団リスクよりも低いリスクを有することを示し得る。１．０を超える数値は、対象が平均的なリスクレベルよりも高く、実際の数値がリスクのレベルに関係し得ることを示すことになる。例えば、代謝産物レベルが２．０である対象は、平均的な個体に比べて今後２年に心血管イベントを経験する可能性が２倍となり得る。
【００１９】
ＣＡＤまたは将来の心血管イベントを含めた心血管疾患のリスクの評価には、制限するわけではないが、リスクプロファイルの作成が含まれる。評価または予測は、対象が、対照群よりもＣＡＤなどの心血管疾患を有するもしくは発症する、または心血管イベントを有する可能性が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％または１０００％高いことが示され得る。対照群は、ＣＡＤを有さず、ＣＡＤまたは心血管イベントの高いリスクと相関しない代謝産物のレベルを有する個体である。
【００２０】
心血管疾患ＣＡＤを発症するリスクの予測的な代謝産物には、脂質、タンパク質および炭水化物代謝の主な経路の多くに関与する代謝産物が含まれる。したがって、アシルカルニチンには、アミノ酸異化作用に関する情報を提供するアセチルカルニチン（Ｃ２）、グルコース、脂肪酸およびアミノ酸代謝の副生成物、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）およびイソベレリルカルニチン（Ｉｓｏｖｅｌｅｒｙｌ ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）（Ｃ５）、ペルオキシソームの脂肪酸代謝について報告されるジカルボキシル化されたアシルカルニチン、および、長鎖脂肪酸β−酸化における中間体である中長鎖アシルカルニチンが含まれる。アミノ酸は、タンパク質代謝回転および異化作用における重要な中間体として働き、ケトンは、脂肪酸β−酸化の指標である。以下の表１は、実施例において試験された代謝産物の短縮名およびフルネームを示す。表２は、可能な場合、それぞれの試験された代謝産物の生体機能を示す。
【００２１】
【表１−１】
【００２２】
【表１−２】
【００２３】
【表２−１】
【００２４】
【表２−２】
【００２５】
【表２−３】
【００２６】
対象において少なくとも１種の代謝産物を検出するステップにより対象における心血管イベント（死亡または心筋梗塞）のリスクを予測する方法はまた、提供される。心血管イベントのリスクの予測的な代謝産物は、ペルオキシソームの脂肪酸代謝の推定された生成物であり、具体的には、短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン、およびシトルリンである。特定の代謝産物は、実施例の表９に列挙され、因子８として同定される。表１０は、因子８内の個別の代謝産物を示し、それぞれの代謝産物についての因子負荷データを提供する。実施例中のデータから、シトルリンおよび短鎖ジカルボキシルアシルカルニチンが心血管イベントのリスクを予測することが実証される。
【００２７】
個別の代謝産物はまた、心血管イベントのリスクを予測することができる。これらの代謝産物には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｘ、Ｇｌｘ、オルニチン、シトルリン、ａｒｇ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃ１４；Ｃ５：１、Ｃ５、Ｃ４：ＯＨ、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０：３、Ｃ１０、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ１２：１、Ｃ１２、Ｃ１２−ＯＨ：Ｃ１０ＤＣ、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６、Ｃ１６−ＯＨ／Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：２、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｃ２０、Ｃ２０：１−ＯＨ／Ｃ１８：１−ＤＣ、Ｃ２０−ＯＨ／Ｃ１８−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ２０：４、ＦＦＡ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔが含まれる。具体的には、シトルリン、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、およびＣ８：１−ＤＣのレベルは、心血管イベントを予測する。さらに、オルニチン、シトルリン、Ｃ５、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ２０：４およびＦＦＡのレベルはまた、心血管イベントのリスクを評価するために有用である。
【００２８】
対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップによる対象におけるＣＡＤの存在および／または程度を評価する方法はまた提供される。ＣＡＤの存在を評価するために有用な代謝産物は、中鎖アシルカルニチン、分枝鎖アミノ酸または関連する代謝産物、尿素回路に関連する代謝産物である。
【００２９】
特定の代謝産物は、実施例の表６、７および８に列挙され、表９中の因子１、４、および９として同定される。表１０は、因子１、４および９内の個別の代謝産物を示し、それぞれの代謝産物についての因子負荷データを提供する。０．０４以上の因子負荷を有するこのような代謝産物のみ、因子中に含まれる。
【００３０】
個別の代謝産物は、心血管イベントのリスクを予測することもできる。これらの代謝産物には、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｘ、シトルリン、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃｉ４；Ｃ５、Ｃ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔが含まれる。具体的には、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｇｌｘ、Ｃ２、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、対象におけるＣＡＤの存在を示す。正常な対照または正常な標準に比べてＬｅｕ／ＩｌｅまたはＧｌｘのレベルの増加は、対象におけるＣＡＤを示す。Ｃ２、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルの低下は、対象におけるＣＡＤの存在を示す。１６５ｍＭ、１７０ｍＭまたは１７５ｍＭを超えるＬｅｕ／Ｉｌｅのレベルは、冠動脈疾患を示す。１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３２ｍＭ、１３５ｍＭまたは１４０ｍＭを超えるＧｌｘのレベルは、冠動脈疾患を示す。０．０１４μＭ、０．０１３μＭまたは０．０１２μＭ未満のＣ１４：１−ＯＨのレベルは、冠動脈疾患を示す。０．００９μＭ、０．００８９μＭ、または０．００８８μＭ未満のＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、冠動脈疾患を示す。
【００３１】
対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップにより対象においてＣＡＤを発症する可能性を評価する方法はまた提供される。ＣＡＤの可能性のある発症を評価するために有用な代謝産物は、短鎖および中鎖アシルカルニチン代謝産物、分枝鎖アミノ酸および尿素回路に関係する代謝産物である。
【００３２】
特定の代謝産物は、実施例の表１４に列挙される。表１５は、同定された因子内の個別の代謝産物を示す。０．０４以上の因子負荷を有するこのような代謝産物のみ、因子中に含まれる。個別の代謝産物はまた、心血管イベントのリスクを予測することもできる。これらの代謝産物には、ケトン、ａｒｇ、オルニチン、シトルリン、ｇｌｘ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｃ２、Ｃ１４：１、Ｃ１８：１、Ｃ５：１、Ｃ４−ｉ４、Ｃ１８、Ｃ１０：１およびＦＦＡが含まれる。
【００３３】
実施例
以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを意味する。
【実施例１】
【００３４】
代謝産物のＣＡＤおよび心血管イベントのリスクとの関連
方法
試験試料
ＣＡＴＨＧＥＮバイオレポジトリーは、Ｄｕｋｅ大学メディカルセンター（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）の心臓カテーテル処置研究室により順次募集された対象からなる。インフォームドコンセント後、血液を、カテーテル処置のための動脈アクセス時に大腿動脈から得、直ちに血漿を分離するために処理し、−８０℃で凍結した。すべての対象は、採取前に最低６時間空腹であった。臨床データは、ＤＤＣＤ、すなわち１９６９年からＤｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで心臓カテーテル処置を実施した患者のデータベースによって提供された。薬剤データを、慢性的に用いた薬剤、すなわち、入院時の薬剤（入院患者）について収集したまたは以前の１カ月以内の診察記録（外来患者）から収集した。心筋梗塞（ＭＩ）の発生および死亡を含めたフォローアップデータを、カテーテル処置後６カ月目に収集し、次いで、その後毎年収集した。生命状態を米国死亡指数（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｅｘ）によって確認した。すべての対象についてのカテーテル処置の適応は、虚血性心疾患の臨床的な配慮であった。重症肺高血圧または臓器移植を有する患者を除外した。
【００３５】
ＣＡＤのための代謝産物の識別可能な能力を評価するため、２つの独立した症例−対照群を構成した。すなわち、「初期」（ＣＡＤ症例１７４名および無ＣＡＤ対照１７４名）；および「複製」（ＣＡＤ症例１４０名および無ＣＡＤ対照１４０名）である。初期群の場合、組み入れ基準を満たす逐次的な症例を選択した。すなわち、ＣＡＤ指数≧３２（≧９５％の狭窄を有する少なくとも１つの冠動脈）および発生年齢≦５５歳である。ＣＡＤ指数は、血管造影のデータの数値的な要約である。（例えば、非特許文献１を参照）。発生年齢を、最初のＭＩ、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）の年齢、またはＣＡＤ指数閾値を満たす最初のカテーテル処置時の年齢として定義した。次の基準を満たす性別および人種に一致した対照を選択した。すなわち、ＣＡＤ指数≦２３；＞５０％の狭窄を有する冠動脈なし；カテーテル処置時年齢≧６１歳；およびＭＩ歴、ＰＣＩ歴、ＣＡＢＧ歴、または移植歴なしである。これらの基準に基づいた年齢が異なる場合、結果は年齢によって混乱する可能性がある。したがって、複製群の場合、同じ組み入れ基準を満たす逐次的な症例および対照を選択したが、発生年齢（症例）またはカテーテル処置時の年齢（対照）の基準を取り除き、症例／対照を一致させなかった。これにより、カテーテル処置について参照された患者の代表的な母集団への知見の一般化可能性が可能になる。分析を、ＣＡＤ症例を以前のＭＩ歴を有する症例に限定することによっても行った（初期における症例Ｎ＝８６症例、複製における症例Ｎ＝６１）。
【００３６】
その後の心血管イベントのリスクを予測する代謝産物の能力を評価するために、初期および複製群からＣＡＤ症例を組み合わせ、「イベント」群を構成し（「イベント」群、Ｎ＝３１４）、その中の、個体７４名は、フォローアップ中死亡したまたはＭＩに罹った。代謝産物の心血管イベントのリスクとの関連についての知見を検証するため、プロファイリングを、次の基準、すなわち、駆出率＞４０％；ＰＣＩ歴またはＣＡＢＧ歴なし；およびその後のＣＡＢＧなしを満たすＣＡＴＨＧＥＮから得られた独特な個体から構成される独立した心血管イベント症例−対照群（「イベント−複製」）において行った。これらのうち、イベント症例（Ｎ＝６３）は、死亡したもしくはＭＩに罹った、またはカテーテル処置後２年以内に急性の冠動脈症候群でＰＣＩを行い、対照（Ｎ＝６６）は、フォローアップの少なくとも２年でイベントがなく、年齢、人種、性別およびＣＡＤ指数において症例に一致した。
【００３７】
Ｄｕｋｅ大学施設内審査委員会（Ｄｕｋｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）は、ＣＡＴＨＧＥＮに関するプロトコールおよび現在の試験を承認した。インフォームドコンセントは、それぞれ対象から得た。
【００３８】
代謝産物測定
空腹時血漿試料を、４５種のアシルカルニチン、１５種のアミノ酸、５つの従来の分析物（総コレステロール、低密度リポタンパク質［ＬＤＬ］コレステロールおよび高密度リポタンパク質［ＨＤＬ］コレステロール、トリグリセリド、ならびにグルコース）、ケトン、β−ヒドロキシブチラート、全遊離脂肪酸およびＣ反応性タンパク質［ＣＲＰ］についての標的レベルの定量的な決定のために用いた（表１）。それぞれのアッセイの方法論および変動係数は報告されている。（非特許文献２および非特許文献３を参照）。研究室（Ｓａｒａｈ ＷＳｔｅｄｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ／ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、症例−対照状態に盲検化され、症例／対照は無作為に分布された。
【００３９】
標準の臨床化学方法を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した試薬を含む従来の代謝産物のために、およびＷａｋｏから入手した試薬を含む（全）遊離脂肪酸およびケトン（全およびβ−ヒドロキシブチラート）のために用いた。すべてのアッセイを、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１臨床化学分析器で行った。
【００４０】
質量分析（ＭＳ）によってプロファイルされた代謝産物（アシルカルニチン、アミノ酸）の場合、次のプロトコールを用いた。（非特許文献４および非特許文献５を参照）タンパク質を、メタノールを用いた沈澱により最初に除去した。アリコートした上清を乾燥し、次いで、熱い、酸性のメタノール（アシルカルニチン）またはｎ−ブタノール（アミノ酸）でエステル化した。Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を有するタンデム型ＭＳを用いて分析をした。「標的化された」中間代謝物の定量を、安定同位体内部標準の公知の量の混合物を加えることによって容易にした（表３）。ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ）を、これらが、本発明者らのＭＳ／ＭＳ方法によって分離されず、アロ−イソロイシンおよびヒドロキシプロリンによる寄与を含むため、単一の分析物として報告した。正常な環境下で、これらの等比重のアミノ酸は、ＬＥＵ／ＩＬＥに帰せられるシグナルにほとんど寄与しない。さらに、ブチルエステルを形成するために用いた酸性条件により、グルタミンをグルタミン酸に部分的に加水分解し、アスパラギンをアスパルタートに部分的に加水分解する。したがって、ＧＬＵ／ＧＬＮ（ＧＬＸ）またはＡＳＰ／ＡＳＮ（ＡＳＸ）として報告される値は、グルタマートおよびグルタミンのモル和、またはアスパルタートおよびアスパラギンのモル和を示すものではなく、むしろ、グルタマートまたはアスパルタートの量プラスそれぞれグルタミンおよびアスパラギンの部分的な加水分解反応の寄与を測定することを意味する。生物学的な注釈づけは、上記表２に含まれる。
【００４１】
【表３】
【００４２】
統計分析
「０」（すなわち、定量下限（ＬＯＱ）を下回る）として報告された代謝産物レベルは、ＬＯＱ／２の値を与えられた。「０」としての値の＞２５％を有する代謝産物を分析しなかった（５つのアシルカルニチン）。すべての代謝産物を、正規分布に近づけるために自然対数に変換させた。ＣＡＤ状態の分析の場合、一般化された線形回帰モデルを、マッチング、すなわち、糖尿病、高血圧、異脂肪血症、肥満度指数（ＢＭＩ）、ＣＡＤの家族歴、および喫煙によって限定されない伝統的なＣＡＤリスク因子について調整されないおよび調整された、ＣＡＤ症例と対照間の代謝産物レベルの差を評価するために用いた。複製群の分析を、人種、性別および年齢についてさらに調整した。対数に変換すると、すべての有意な代謝産物は、バリン、ケトン、およびＣ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣアシルカルニチンを除いて、正規分布（コルモゴロフ−スミルノフ検定Ｐ＞０．０１）を示した。分布を目視検査すると、大いに正規分布が示唆された。それにもかかわらず、本発明者らは、ノンパラメトリックウィルコクソン検定を用いて感度分析を実施し、バリンおよびＣ１４：２アシルカルニチンを除く、セミパラメトリックな線形モデルとして類似の結果を示し、どちらも、線形回帰において有意でなかった（それぞれｐ＝０．１０およびｐ＝０．０６）が、これらのノンパラメトリック検定で有意であった（ｐ＝０．０５およびｐ＝０．００８）。分析を、糖尿病および喫煙によってやはり層別化した。
【００４３】
探索的分析において、多変量モデルを、薬剤クラス（β遮断薬、スタチン、糖尿病薬剤、アスピリン、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、硝酸塩、クロピドグレルおよび利尿薬）、処置前の鎮静の使用、およびカテーテル処置時の連続的な静脈内ヘパリンの使用についてさらに調整した。ＣＡＴＨＧＥＮプロトコールは、カテーテル処置中の追加的なヘパリン投与前に試料採取を必要とする。したがって、カテーテル処置時の連続的な静脈内ヘパリン使用についての調整は、ヘパリンに関連した差に対処している。個体の６６％が薬剤データを有しているにすぎず、そのため、薬剤を、別々の変数としてコード化した。すなわち、投薬なし、不明、および投薬ありである。
【００４４】
代謝産物が重複する経路に存在する場合、代謝産物の相関は予想される。本発明者らは、主成分分析（ＰＣＡ）を用いて、多数の相関変数を無相関因子にした。「固有値」がより高い因子は、データセット内でより多量の可変性を説明する。固有値≧１．０を有する因子を同定し、バリマックス回転を行って解釈可能な因子を生成した。因子負荷≧｜０．４｜を有する代謝産物を、因子を構成するものとして報告した。表１０を参照のこと。スコアリング係数を、初期群から構成し、それぞれの個体についての因子スコア（それぞれの代謝産物について因子負荷量に重み付けされた、その因子内で標準化された代謝産物の重み付けされた和）を算出するために用い、複製群にも適用した。一般化された線形回帰モデルを用いて、症例と対照間との因子スコアの差を評価した。すべての因子は、因子７〜９を除いて正規に分布し（コルモゴロフ−スミルノフ検定Ｐ＞０．０１）、目視検査では、大いに正規分布を示した。これらの因子についてのノンパラメトリックウィルコクソン検定は、線形モデルと同じ結果を示した。
【００４５】
ＣＡＤ症例を対照と識別する代謝産物プロファイルの独立した能力をさらに評価するために、多変量ロジスティック回帰モデルを構成し、これらのモデルにおいて、ＣＡＤリスク因子（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙）をモデルに強制し、次いで、代謝産物因子を加えた。受信者動作曲線（ＲＯＣ）を構成し、モデル適合の測定値を算出した。これらの曲線下面積の比較についてのノンパラメトリック分析を以前の方法を用いて行った（非特許文献６参照）。
【００４６】
その後の心血管イベントの分析の場合、初期および複製群からの症例を併合した（「イベント」群）。代謝産物因子と死亡／Ｍｌの発生までの時間との関係を、（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙、年齢、人種、性別、クレアチニン、駆出率およびＣＡＤ指数について調整されないおよび調整された）Ｃｏｘ比例ハザードを用いて評価した。比例ハザードの仮定は満たされた。「イベント−複製」群中の複製の場合、初期のＣＡＤ群において構成されたＰＣＡ由来因子から得られたスコアリング係数を用いて、イベント−複製群における因子スコアを算出し、ロジスティック回帰を用いて、因子と（ＢＭＩ、異脂肪血症、高血圧、糖尿病、家族歴、喫煙、クレアチニン、および駆出率について調整されないおよび調整された）症例／対照状態との関連を評価した。
【００４７】
すべての分析が、性質上探索的であり、代謝産物の共直線性をもたらすため、多重比較について調整されない両側のｐ値を示したが、ボンフェローニ補正と関連して解釈された結果を報告した。公称の統計的有意性をＰ≦０．０５として定義した。ボンフェローニにより調整されたｐ値は、Ｐ＜０．０００７（個別の代謝産物）およびＰ＜０．００４（因子）であった。統計解析をＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｃａｒｙ ＮＣ）を用いたＤ．Ｒ．Ｃ．およびＳ．Ｈ．Ｓによって行った。
【００４８】
結果
患者母集団
初期（早期発生ＣＡＤ症例１７４名、一致する対照１７４名）および複製群（ＣＡＤ症例１４０名、対照１４０名）についての母集団の特徴を、表４に示し、イベント−複製群についての母集団の特徴を表５に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
個別の代謝産物のＣＡＤとの関連
いくつかのアミノ酸のレベルは、分枝鎖アミノ酸ロイシン／イソロイシン（Ｐ＜０．０００１）およびバリン（Ｐ＝０．００７）、グルタマート／グルタミン（Ｐ＜０．０００１）、プロリン（Ｐ＝０．０４）およびメチオニン（Ｐ＝Ｏ．０５）を含めて、初期群において症例と対照間で異なった（表６）。いくつかのアシルカルニチンのレベルはまた、Ｃ１６アシルカルニチン（Ｃ１６：１、Ｐ＝０．００６；Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｐ＝０．００４；Ｃ１６：２、Ｐ＝０．０５；およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｐ＝０．００３）、およびＣ４：Ｃｉ４（Ｐ＝０．００９）、Ｃ８（Ｐ＝０．００９）、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ（Ｐ＝０．００３）、およびＣ１０：１（Ｐ＝０．００２）アシルカルニチンを含めて、初期群において症例と対照間で異なった（表６）。ほとんどの代謝産物の場合、これらの差は、ＣＡＤリスク因子についての調整後に持続した。
【００５２】
【表６−１】
【００５３】
【表６−２】
【００５４】
これらの代謝産物のいくつかは、アミノ酸ロイシン／イソロイシンおよびグルタマート／グルタミン、および長鎖アシルカルニチンＣ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣを含めて（効果の類似した方向を有する）調整された分析における複製群で有意であった（表６）。調整されない分析では、これらの代謝産物、アミノ酸メチオニンおよびプロリン、およびＣ１６：２およびＣ１６：１アシルカルニチンは、両群で有意であった。
【００５５】
初期群中のＬＥＵ／ＩＬＥについての関連を減弱するが、脂質（総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリド）についてのさらなる調整は、類似の結果になった（表７および８）。糖尿病によって層別化された分析は、糖尿病による関連のいくつかの異質性を示唆した。例えば、ＬＥＵ／ＩＬＥおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣは、非糖尿病においてより強い関連を示した。喫煙により層別化された分析では、喫煙者および非喫煙者において差がないことが示唆された。
【００５６】
【表７−１】
【００５７】
【表７−２】
【００５８】
【表８−１】
【００５９】
【表８−２】
【００６０】
不偏主成分分析
ＰＣＡは、共線状の代謝産物からなる１２個の因子を同定し（表９）、生物学的に妥当な因子にグループ化した。３個の因子は、調整された分析において初期群の症例と対照間で有意差があった、すなわち、因子１（中鎖アシルカルニチン）、因子４（分枝鎖アミノ酸および関連する代謝産物）、および因子９（アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、Ｃｉ４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ）である。これらの因子のうち、２個の因子（４および９）は、複製群において有意なままであった。因子１は、複製群においてわずかに有意であったにすぎない（調整されないＰ＝０．１５、調整されたＰ＝０．０３）。それぞれの代謝産物についての因子負荷を表１０に示す。
【００６１】
【表９−１】
【００６２】
【表９−２】
【００６３】
【表９−３】
【００６４】
【表１０−１】
【００６５】
【表１０−２】
【００６６】
【表１０−３】
【００６７】
脂質についてさらに調整すると、因子４は初期群において有意でなかったが（初期群：因子１、Ｐ＝０．０００２；因子４、Ｐ＝０．５９；因子９、Ｐ＝０．０２；複製群：因子１、Ｐ＝０．０１；因子４、Ｐ＝０．０２；因子９、Ｐ＝０．００４）、ＣＡＤとの連続した関連を示した。研究がインスリン抵抗性を有する代謝産物との関係を示す場合、本発明者らは、糖尿病について調整したが、空腹時グルコースについてのベース多変量モデルにさらに調整した。これらの分析は、ＣＡＤとの連続した有意な関連を明らかにした（初期群：因子１、Ｐ＝０．０２；因子４、Ｐ＝０．０２；因子９、Ｐ＝０．００３；複製群：因子１、Ｐ＝０．０３；因子４、Ｐ＝０．０５；因子９、Ｐ＝０．０２）。
【００６８】
層別化された分析は、糖尿病と比較して非糖尿病においてＣＡＤを有する因子４と因子９との間でより強力な関連を示唆し（表１１）、糖尿病においてシグナルが最小もしくは識別不能であるが、喫煙によるＣＡＤとの関連において一貫した差はなかった（表１２）。
【００６９】
【表１１】
【００７０】
【表１２】
【００７１】
薬剤の１０クラスについてさらに調整すると、初期群では因子とＣＡＤとの関係に対する影響が最小限であった（因子１、調整されたＰ＝０．００９；因子４、Ｐ＝０．０３；因子９、Ｐ＝０．００３）が、複製群ではまったく有意でなかった（因子１、Ｐ＝０．０２；因子４、Ｐ＝０．１９；因子９、Ｐ＝０．１４）。本発明者らは、検出力を最適化するために組み合わせたデータセットにおいて、利用可能な薬剤データを有するこれらの個体に限定した、類似の分析を行った（Ｎ＝４１６）。これらの結果は、減弱したが（因子４：調整されないモデル、ｐ＝０．０００９；ＣＡＤリスク因子について調整されたモデル、Ｐ＝０．０３；ＣＡＤリスク因子および薬剤について調整されたモデル、Ｐ＝０．０５；因子９：調整されないモデル、Ｐ＝０．０００３；ＣＡＤリスク因子について調整されたモデル、Ｐ＝０．００２；ＣＡＤリスク因子および薬剤について調整されたモデル、Ｐ＝０．００７）、ＣＡＤを有する因子４と９との間の連続した関連を示した。
【００７２】
示された結果を、多重比較について調整していない。本発明者らは、ＰＣＡを用いて代謝産物の共直線性を説明する。個別の代謝産物のうち、グルタマート／グルタミンのみ、ボンフェローニ補正を存続した。因子４および９は、因子のレベルでボンフェローニ補正を存続した（Ｐ＜０．００４）。
【００７３】
代謝産物プロファイルの一般的な心筋梗塞との関連
これらの代謝産物のより重症の表現型との関連を試験するために、本発明者らは、ＣＡＤのない対照と比べた以前のＭＩ歴を有する症例においてＰＣＡ由来の因子の関係を評価した（初期群 ＭＩ症例Ｎ＝８６、複製群 ＭＩ症例Ｎ＝６１）。ＣＡＤと関連する２つの因子（４および９）はまた、両群で以前のＭＩと関連した（表９）。
【００７４】
モデル適合およびＣＡＤのＲＯＣ曲線の評価
代謝産物因子のＣＡＤとの独立した関連をさらに定量化するため、ロジスティック回帰モデルを構成した。すなわち（１）臨床モデル；（２）臨床モデルプラス因子４および９；ならびに（３）臨床モデルプラスすべての代謝産物因子である。因子４および９は、初期群（因子４：オッズ比［ＯＲ］１．４２；９５％ＣＩ、１．０９から１．８４、Ｐ＝０．０１；因子９：ＯＲ０．６９、９５％ＣＩ、０．５３から０．９０、Ｐ＝０．００６）および複製群（因子４：ＯＲ１．４２；９５％ＣＩ１．０６から１．８９、Ｐ＝０．０２；因子９：ＯＲ０．６７；９５％ＣＩ０．４８から０．９２、Ｐ＝０．０１）において、独立にＣＡＤと関連した。初期群におけるモデル適合およびＲＯＣ曲線の測定値（図１）は、臨床変数のみを含むモデルを上回って（ｃ統計量０．７５６；臨床モデルと臨床モデルプラス因子４および９との比較の場合、Ｐ＝０．０６；臨床モデルと臨床モデルプラスすべての因子との比較の場合、Ｐ＝０．００３）、すべての因子（ｃ統計量０．８０４）の付加によるいくつかの改善と共に、因子４および９を含むモデル（ｃ統計量０．７７８）について、穏やかにより優れた識別可能な能力を示した。複製群において、臨床モデル単独（ｃ統計量０．７４３）の場合よりも因子４および９を臨床モデルに加えたｃ統計量（ｃ統計量０．７７３）がわずかに高かったが、すべての因子の付加によりさらに劇的に改善した（ｃ統計量０．８７４；臨床モデルと臨床モデルプラス因子４および９との比較の場合、Ｐ＝０．０４；および臨床モデルと臨床モデルプラスすべての因子との比較の場合、Ｐ＜０．０００１）。
【００７５】
ＣＡＤの診断が考慮されている患者において脂質を測定することが標準治療であり、ＣＲＰが、心血管疾患の認識された生物マーカーであることを前提として、本発明者らは、脂質およびＣＲＰを含めたこれらのモデルを再構成した。これらの分析は、初期および複製群において臨床モデル適合がより高いことを明らかにした（ｃ統計量それぞれ０．８４２および０．７７８）。因子４および９を脂質およびＣＲＰを含めた臨床モデルに付加すると、初期群においてモデルの識別可能な能力が改善せず（ｃ統計量０．８４８、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．３１）、すべての因子を付加することでいくつか改善した（ｃ統計量０．８６５、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．０１）。しかし、代謝産物因子の付加による臨床モデルの改善の大きさは、複製群において類似し大きいままであった（ｃ統計量：脂質およびＣＲＰを含めた臨床モデル、０．７７８；臨床モデル＋因子４および９、０．７９９、Ｐ＝０．０８；臨床モデル＋すべて代謝産物因子、０．９００、臨床モデルとの比較の場合、Ｐ＝０．０００１）。
【００７６】
代謝産物因子およびその後の心血管イベントのリスク
フォローアップの２．７２年の中央値の間、ＣＡＤ症例３１４名のうち７４名は、起こりやすい心血管イベントを有した。調整されない比較において、因子８（短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン）は、死亡またはＭＩの発生に大いに関連した（図２；最高対最低三分位値のハザード比［ＨＲ］２．５０；９５％ＣＩ、１．４７から４．１７；Ｐ＝０．０００８；最高対中央三分位値ＨＲ２．３３；９５％ＣＩ、１．３９から３．８５；Ｐ＝０．００２）。この関連の強度は、ＣＡＤリスク因子、ＣＡＤ指数、年齢、人種、性別、駆出率、クレアチニンおよびカテーテル処置後のＣＡＢＧによる治療について調整した後いくぶんか減弱した（最高対最低三分位値：ＨＲ１．６７；９５％ＣＩ、０．８８から３．１３；Ｐ＝０．１１；最高対中央三分位値：ＨＲ１．８９；９５％ＣＩ１．０９から３．３３；Ｐ＝０．０３）。因子１はまた、調整されない比較において、死亡／ＭＩの発生に関連したが（最高対最低三分位値ＨＲ１．８５；９５％ＣＩ、１．０６から３．２３；Ｐ＝０．０３；最高対中央三分位値ＨＲ１．７９；９５％ＣＩ、１．０２から３．０３；Ｐ＝０．０４）、調整後まったく有意でなかった（それぞれＰ＝０．１４および０．０５）。
【００７７】
これらの知見を検証するため、本発明者らは、独立した症例−対照データセット（「イベント−複製」群）においてメタボロミクスのプロファイリングを行った。この群では、因子８は、その後の心血管イベントに罹った症例対イベントなしの対照においてより高いスコアを有する、心血管イベントに関連した（調整されないＯＲ１．５２；９５％ＣＩ、１．０８から２．１４；Ｐ＝０．０１；調整されたＯＲ１．８２；９５％ＣＩ、１．０８から３．５０；Ｐ＝０．０３）。因子内の個別の代謝産物はまた、元の「イベント」データセットで観察されたものと類似の効果の方向を有する、症例と対照との間で有意に異なった（Ｐ＜０．０５）。
【００７８】
この実施例により、末梢血代謝産物プロファイルが、ＣＡＤの存在と独立に関連しており、臨床変数のみを含むモデルと比較したＣＡＤの識別可能な能力に加えることが実証される。さらに、本発明者らは、ＣＡＤを有する個体においてその後の心血管イベントを独立に予測するある特定の代謝産物クラスターを報告する。
【実施例２】
【００７９】
ＣＡＤの遺伝率
材料および方法
試験母集団。ＧＥＮＥＣＡＲＤ試験は、９２０のファミリーを登録して、（男性５１歳、女性５６歳以前に）早期発生のＣＡＤの遺伝子を同定するために罹患同胞対連鎖を行った（非特許文献７参照）。少なくとも２つの同胞を有し、そのそれぞれが（男性５１歳、女性５６歳以前に）早期発生のＣＡＤの基準を満たすファミリーを補充した。罹患していないファミリーメンバーを、ＣＡＤの臨床的証拠なしおよび男性が５５歳を超える（女性が６０歳を超える）年齢として定義した。このコホートから、本発明者らは、本発明者らが比較的多数のファミリーメンバーの利用可能性および発端者および周囲の世代におけるＣＡＤの重い負担に基づいて特に有益であると考えた、８つの代表的なファミリーを選択した（図３）。これらのファミリーに再度連絡を取り、前もって登録していない罹患同胞対およびファミリーメンバーをＣＡＤに関係なく確認し、罹患同胞対の子孫に焦点を絞った。この確認戦略は、代謝性のプロファイルの異常がこれらのファミリーにおけるＣＡＤの発症に先行するかどうか、子孫中に顕性のＣＡＤがない場合でもファミリー内の代謝産物レベルの有意な一致が明らかであるという仮説に基づいた。所与のファミリー内の試料採取を、１人の熟練した瀉血士によりいくつかの異なる回数でおよび異なる場所で行った。血液試料を、末梢の静脈の瀉血による採取後に（数分以内に）迅速に処理し、その後可能な限り早く凍結し（試料の大部分が採取の１〜２時間以内に凍結されるなら、せいぜい１２時間以内に）、ＥＤＴＡによって処置した管に血漿試料として−８０℃で貯蔵した。試料を、できるだけ空腹状態で採取したが、このコンシステンシーは決定できなかった。施設内審査委員会は、試験プロトコールを承認し、インフォームドコンセントを、それぞれの対象から得た。
【００８０】
生化学的測定。凍結した血漿試料を用いて、３７種のアシルカルニチン種、１５種のアミノ酸、９種の遊離脂肪酸および従来の分析物、ケトンおよびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含めて、標的代謝産物を定量的に測定した。試料調製および変動係数が報告されている（非特許文献８参照）。研究室は、ファミリー識別子および症例−対照状態に盲検化された。アッセイの範囲は、０．０５〜４０マイクロモル（μＭ）（アシルカルニチン）；５〜１０００μＭ（アミノ酸）；および１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ（脂肪酸）である。簡潔にするために、代謝産物の臨床の省略表現を用いる（表１）。個体内の可変性を、繰り返しプロファイリングが別々の５日に同じ試料で実施された５名の個体から得られた試料において評価した。変動係数および相関は、最小限のアッセイ内の可変性を確認した（表１）。
【００８１】
従来の代謝産物分析。標準臨床化学方法を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した試薬を含むグルコース、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、およびトリグリセリド；ならびにＷａｋｏ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から入手した試薬を含む（全）遊離脂肪酸およびケトン（全および３−ヒドロキシブチラート）を含めた従来の代謝産物のために用いた。すべての測定を、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１１臨床化学分析器を用いて行った。
【００８２】
アシルカルニチンおよびアミノ酸。タンパク質を最初にメタノールによる沈澱によって除去した。アリコートした上清を乾燥し、次いで、熱い、酸性のメタノール（アシルカルニチン）またはｎ−ブタノール（アミノ酸）でエステル化した。アシルカルニチンおよびアミノ酸を、Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を有するタンデム型ＭＳにより分析した。血漿中の３７種のアシルカルニチン種および１５種のアミノ酸を、本発明者らが前もって記載した方法（非特許文献９；非特許文献４；非特許文献１０参照）によりアッセイした。ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ）が本発明者らのＭＳ／ＭＳ方法によって分離されず、アロ−イソロイシンおよびヒドロキシプロリンからの寄与を含むため、これらを単一の分析物として報告した。正常な環境下で、これらの等比重のアミノ酸は、ＬＥＵ／ＩＬＥに帰せられるシグナルにほとんど寄与しない。さらに、ブチルエステルを形成するために用いた酸性条件により、グルタミンをグルタミン酸に部分的に加水分解し、アスパラギンをアスパルタートに部分的に加水分解する。したがって、ＧＬＵ／ＧＬＮまたはＡＳＰ／ＡＳＮとして報告される値は、グルタマートおよびグルタミンのモル和、またはアスパルタートおよびアスパラギンのモル和を示すものではなく、むしろ、グルタマートまたはアスパルタートの量プラスそれぞれグルタミンおよびアスパラギンの部分的な加水分解反応の寄与を測定することを意味する。
【００８３】
遊離脂肪酸。遊離脂肪酸を、ヨードメタンを用いてゆっくりとメチル化し、固相抽出によって精製した（非特許文献１１参照）。誘導体化された脂肪酸を、Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてキャピラリーガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析した。試料容積を考慮することによって、１１７名の個体のうち８０名のみ（８ファミリーのうち５ファミリー）は、遊離脂肪酸測定が行われた。
【００８４】
すべての質量分析は、安定同位体希釈を使った。前述の「標的化された」中間代謝物の定量は、公知の量の安定同位体内部標準の混合物を、Ｉｓｏｔｅｃ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）およびＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃ１ａｉｒｅ、Ｑｕｅｂｅｃ、ＣＮ）から入手した試料に加えることによって容易にした（表３）。
【００８５】
遺伝率分析。遺伝率を、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｌｉｇｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｏｕｔｉｎｅｓ（ＳＯＬＡＲ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０．７（非特許文献１２参照）を用いて算出し、これは、最尤法を用いて分散成分を推定し、遺伝的影響についての公知の共変量および分散成分についての固定された影響の取り込みを可能にする。この手法は、すべてのファミリーメンバー間の相関を適切に説明し、現在の研究において存在するような拡大した家系の取り込みを可能にする。全変動は、相加遺伝分散および環境分散、ならびに残りの（未解明の）可変性についての成分に分配される。このプログラムは、家系の共分散行列を用いる。
【００８６】
【数１】
【００８７】
式中、Ωは共分散行列であり、Φは血族値の行列であり、
【００８８】
【数２】
【００８９】
は相加遺伝分散であり、Ｉは単位行列を表し、
【００９０】
【数３】
【００９１】
はランダムな環境分散である（非特許文献１２参照）。このモデルは、複雑な家系データ（すなわち、親−子孫対を超えた）を可能にし、そのため、得られた遺伝率推定値は、核ファミリーメンバーのみを用いて得られたものよりも正確である。現在の研究の場合、家系からの採取されたすべての個体は、罹患していない子孫、いとこ、および婚姻したファミリーメンバーを含めて、分散成分モデルの一部になる。婚姻したファミリーメンバー（すなわち、遺伝子的に無関係であるが環境を共有する）の取り込みは、形質の家族内のクラスタリングの環境成分のより優れた推定を可能にする。
【００９２】
外れ値とみなされる値を、遺伝率分析から除外し，平均±４ＳＤ以外に属する値として定義した（それぞれ２４種の代謝産物について１〜２個の外れ値）。定量下限（ＬＯＱ）を下回る代謝産物測定値には、ＬＯＱ／２の値が与えられた。ＬＯＱを下回る試料の＞２５％を有する４種の代謝産物を、さらに分析しなかった（Ｃ６、Ｃ５−ＯＨ：Ｃ３−ＤＣ、Ｃ４ＤＣ、およびＣ１０：２アシルカルニチン）。すべての測定値を、分析前に自然対数に変換し、その結果、ほとんどの代謝産物は、分散成分分析について考慮すべき重要な点である、正規分布に近似した。１８個の代謝産物は、この判定基準を満たさず、したがって、肥満度指数（ＢＭＩ）、年齢、性別、ＣＡＤ、糖尿病（ＤＭ（あり／なし）、高血圧（あり／なし）、および異脂肪血症（あり／なし）について調整された線形回帰モデルを、これらの代謝産物のそれぞれについて構成し、残差を遺伝率推定値に用いた。代謝産物について時々の低い形質の標準偏差（＜０．５）があることを前提として、すべての対数に変換された代謝産物を、分析前に４．７倍に乗じた。
【００９３】
次いで、多遺伝子性の遺伝率モデルを構成した。正規に分布する代謝産物（代謝産物の大部分）の場合、多遺伝子性の遺伝率モデルを、年齢、性別、ＢＭＩ、ＤＭ、異脂肪血症、高血圧およびＣＡＤについて調整し、対数変換値を用いて算出した。発端者およびファミリーメンバーを、任意の代謝産物値に基づいて選択しなかったが、確認バイアスの可能性が存在する。したがって、分析を、ファミリーメンバー（発端者）が早期発生ＣＡＤのファミリーを確認するための指標メンバーであったことに基づいて補正した。食事制限（家庭で共有するが、推定上遺伝的ではない）などの因子を説明するために、（現住所（ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ ａｄｄｒｅｓｓ）のマーカーによるモデルが含まれる）一般的な家庭の影響に関連する分散の画分に対応する追加の分散成分パラメータを、それぞれのモデルに加えた。最終の多遺伝子性のモデルのすべての残差尖度は、２種のアミノ酸（セリンおよびフェニルアラニン）、１１種のアシルカルニチン（Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１０：１、Ｃ１０：３、Ｃ１２：１、Ｃ１４、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６−ＯＨ：Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：１−ＯＨ、Ｃ１８：１−ＤＣ、およびＣ１８−ＤＣ：Ｃ２０−ＯＨ）および３種の遊離脂肪酸（ＦＡＣ１４：０、ＦＡＣ１６：１、ＦＡＣ１８：１）を除いて、正常な範囲内であった（すなわち、＜０．８）。これらの代謝産物の場合、最も極端な値の１〜４個を除去することが必要であり、その結果、正常な残差尖度になった。２種のアシルカルニチンは、正常な残差尖度（Ｃ１６−ＯＨ：Ｃ１４−ＤＣおよびＣ１２−ＯＨ：Ｃ１０−ＤＣ）を達成するためにさらに多数の外れ値の除去を必要とし、そのため、これらの結果は、それに応じて解釈すべきである。１８種の正規に分布しない代謝産物の場合、調整された回帰モデルから得られた標準化された残差を、ＳＯＬＡＲを用いて遺伝率を推定するために用いたが、正常化された変数が関連する共変量についてすでに調整されたため、これらの残差を用いた遺伝率モデルをさらに調整しなかった。臨床の共変量によって説明された分散の比率の推定値を、対数に変換した粗の値から構成された調整された多遺伝子性のモデルを用いて推定した、これらの正規に分布しない代謝産物について報告する。
【００９４】
ファミリー間の代謝産物における定量的な差を理解するために、性別、年齢、ＢＭＩ、ＣＡＤ、ＤＭ、異脂肪血症および高血圧について調整された、多変量によって一般化した線形モデルを用いて、ファミリー間の平均代謝産物レベルを比較した。
【００９５】
教師なし主成分分析。多くの代謝産物が重複する経路に存在する場合、代謝産物の相関が予測される。相関を理解するために、本発明者らは、多数の相関した変数を、外れ値を除去せずに生の代謝産物の値を用いてより少ない数の相関していない因子のクラスターにするために主成分分析（ＰＣＡ）を用いた。最も高い「固有値」を有する因子は、データセット内の最も多量の可変性を説明する。年齢、性別、ＢＭＩ、ＤＭ、およびＣＡＤについて調整された線形回帰モデルからそれぞれの代謝産物を算出した標準化された残差を、ＰＣＡのための入力として用いた。この場合に関して、それぞれの変数の単位が大きさで有意に変わるとき、残差を用いたＰＣＡは、推奨される（非特許文献１３を参照）。固有値≧１．０を有する因子を、一般に使用したＫａｉｓｅｒ判定基準に基づいて同定した（非特許文献１４を参照）。次いで、バリマックス回転を行って、解釈可能な因子を生成した。因子負荷≧｜０．４｜を有する代謝産物を、任意の閾値として一般に用いられ、所与の因子を構成するものとして報告した（非特許文献１５を参照）。次いで、スコアリング係数を用いて、（それぞれの個別の代謝産物について算出した因子負荷量に重み付けされた、その因子内で標準化された代謝産物の値の重み付けされた和からなる）それぞれの個体の因子スコアをコンピュータで計算した。次いで、これらの因子スコアを、共変数についてさらに調整されない多遺伝子性のモデルを用いた、上記で詳述したＳＯＬＡＲでそれぞれの因子の遺伝率を算出するために用いた。因子のいくつかの最も極端な値の１〜４個を除去することは、正常な残差尖度を達成するために必要であった。
【００９６】
すべての分析が性質上探索的であり、代謝産物の共直線性をもたらすため、多重比較について調整されない公称の両側のｐ値を示したが、保守的なボンフェローニ補正と関連して解釈した結果を報告した。公称の統計的有意性をｐ値≦０．０５として定義した。統計解析は、ＳＯＬＡＲ（非特許文献１２を参照）を用いた遺伝率推定値の他に、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ ＮＣ）を用いた。
【００９７】
結果および考察
遺伝率分析。代謝性のプロファイリングを、早期ＣＡＤのＧＥＮＥＣＡＲＤ試験から得られた８つのマルチプレックスのコーカサス人ファミリー（図３）内の個体１１７名に行った。注目すべきことに、本試験で標本抽出したファミリーメンバーの大部分は、元の罹患同胞対の、今のところ罹患していない子孫であったが、この子孫は、これらのファミリーのメンバーとして、早期ＣＡＤの発症のリスクが高かった。予想通り、有病率がファミリー間で異なったが、ＣＡＤリスク因子の負担が高かった（表１３）。
【００９８】
【表１３】
【００９９】
本発明者らは、脂質およびＢＭＩなどの従来のリスク因子の高い遺伝率を見出した（図４）。全ケトン（ｈ2 ０．７５、ｐ＝３．８×１０-8）は、非質量分析に基づく方法により分析した代謝産物間で最も遺伝率が高く、同様に、個別のケトンβ−ヒドロキシブチラートの遺伝率が高かった（ｈ2 ０．５１、ｐ＝０．００４）。質量分析によって測定された分析物のうち、いくつかのアミノ酸は、遺伝率が高かった（図５、表１４）。アルギニン（ＡＲＧ）は、スコアが最も高く（ｈ2 ０．８０、ｐ＝１．９×１０-16）、グルタミン／グルタマート（ＧＬＸ；ｈ2 ０．７３、ｐ＝０．００００６）、アラニン（ＡＬＡ；ｈ2 ０．５５、ｐ＝０．００００２）、プロリン（ＰＲＯ；ｈ2 ０．５２、ｐ＝０．００００４）、オルニチン（ＯＲＮ、ｈ2 ０．４８、ｐ＝０．０００００５）、フェニルアラニン（ＰＨＥ；ｈ2 ０．４６、ｐ＝０．０００１）、および分枝鎖アミノ酸ロイシン／イソロイシン（ＬＥＵ／ＩＬＥ；ｈ2 ０．３９、ｐ＝０．００００５）およびバリン（ＶＡＬ；ｈ2 ０．４４、ｐ＝０．００００６）の遺伝率もまた強力であった。遊離脂肪酸（図５）のうち、ＦＡ−Ｃ２０：４（アラキドン酸、炎症経路の中で最重要な成分）が、ＦＡ−Ｃ１８：２（リノール酸、アラキドン酸の前駆体、ｈ2 ０．４８、ｐ＝０．００２）と同様に最も遺伝性であった（ｈ2 ０．５９、ｐ＝０．００００５）。多くのアシルカルニチンもまた、遺伝率が高く（図６、表１４）、最も高いのは、Ｃ１８アシルカルニチン（Ｃ１８、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２、ｈ2 ０．３９〜０．８２、ｐ＝０．００００００７〜０．００４）；Ｃ１４：１（ｈ2 ０．７９、ｐ＝０．００００００２）；Ｃ５：１（ｈ2 ０．６７、ｐ＝０．０００００３）；Ｃ１０群（Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８−ＤＣ、Ｃ１０およびＣ１０：１、ｈ2 ０．３５〜０．５７、ｐ＝０．００００３〜０．０２）；Ｃ１６（ｈ2 ０．５７、（ｐ＝０．０００２）；Ｃ４：Ｃｉ４（ｈ2 ０．５６、ｐ＝０．００００３）；短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン（Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、ｈ2 ０．４５〜０．５１、ｐ＝０．００３〜０．００４）；およびＣ２アシルカルニチン（ｈ2 ０．５０、ｐ＝０．００００８）であった。興味深いことに、それぞれの代謝産物の可変性の遺伝的な成分の推定値は、しばしば、臨床の共変量によって説明される分散の比率を超えた（表１４）。
【０１００】
【表１４−１】
【０１０１】
【表１４−２】
【０１０２】
【表１４−３】
【０１０３】
ファミリー内のメタボロミクスのプロファイル。これらの強力な知見を前提として、本発明者らは、ファミリー間の代謝産物の定量的な差を理解しようと努めた。多変量の線形モデルを用いてファミリー間の代謝産物の差を試験した。アミノ酸の中で、グルタマート、オルニチン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アラニンおよびメチオニン（すべてｐ＜０．０００１）、ロイシン／イソロイシン（ｐ＜０．０００１）およびバリン（ｐ＝０．００３）は、ファミリーを最も良く区別した。アシルカルニチンの中で、Ｃ５：１（ｐ＜０．０００１）およびＣ２（ｐ＜０．０００１）アシルカルニチンと共に、Ｃ１８（Ｃ１８、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２）およびＣ１４アシルカルニチン（Ｃ１４、Ｃ１４：１）（すべてｐ＜０．０００１）は、ファミリーを最も良く区別した。多くの遊離脂肪酸は、ファミリーを区別し、最も強力なものは、アラキドン酸およびパルミチン酸（両方ｐ＜０．０００１）であった。従来の代謝産物の中で、ケトン（ｐ＜０．０００１）およびβ−ヒドロキシブチラート（ｐ＝０．０００１）は、ファミリーを最も良く区別した。
【０１０４】
主成分分析。生物学的な経路における代謝産物の相関の場合、本発明者らは、代謝産物のクラスターが相関したことを理解するためにおよびほとんど遺伝性であった因子を同定するためにＰＣＡを行った。１５個の因子を同定し、生物学的に一定の関係が証明された（表１５）。データセット内で最も多量の分散を占めている因子は、因子１（短鎖および中鎖アシルカルニチン）；因子２（長鎖遊離脂肪酸）；因子３（ミトコンドリアの機能でおそらく報告している長鎖アシルカルニチンおよびアミノ酸［アルギニン、グルタマート／グルタミン、およびオルニチン］）；因子４（ケトン、β−ヒドロキシブチラート、Ｃ２およびＣ４−ＯＨ［β−ヒドロキシブトリル］アシルカルニチン；脂肪酸酸化の最終ステップのすべてのマーカー）；および因子５（分枝鎖アミノ酸を含めたアミノ酸、ならびにＣ３およびＣ５アシルカルニチン［分枝鎖アミノ酸異化作用の副生成物］）であった。予想通り、個別の代謝産物についての結果を前提として、多くの因子は遺伝性であった。
【０１０５】
【表１５−１】
【０１０６】
【表１５−２】
【０１０７】
分析ツールの包括的なセットを適用して、心血管疾患の生化学的および生理的な基盤、ならびにどのようにしてメタボロミクスのプロファイルがＣＡＤリスクの公知の遺伝成分に関係し得るのかということのより良い理解を得た。標的化された、定量的な代謝性のプロファイリングを、早期ＣＡＤを抱えたマルチプレックスファミリー内で行い、その大部分が、ＣＡＤをまだ発症していなかった罹患した世代の子孫を表したが、その中で、かかるプロファイルが遺伝性であった場合、本発明者らは、彼らの罹患したファミリーメンバーと類似の代謝性のプロファイルを仮定した。高い遺伝率は、多くの代謝産物に見出され、多くは従来のリスク因子よりも高い遺伝率を有した。こうした高い遺伝率は、遺伝子型および表現型間の強力な相関を示唆し、ＣＡＤを抱えたファミリーにおけるこれらの代謝性のサインのクラスタリングへの強力な遺伝成分を意味する。
【０１０８】
さらに、いくつかの個別の代謝産物は、ファミリーを区別し、最も際立ったのは、アミノ酸のうち、アルギニン、オルニチン、およびグルタマート／グルタミンであり、脂質由来代謝産物のうち、長鎖アシルカルニチンＣ１８：０、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２である。これらの知見は、これらのファミリーにおけるミトコンドリアの機能の基本的な差を示唆し、損傷を受けたミトコンドリアの機能とインスリン抵抗性との関係を示す以前の研究と整合する。
【０１０９】
本発明者らの研究が仮説生成であったことを前提として、本発明者らは、多重比較について調整しなかった。しかし、因子のレベルにおけるボンフェローニ補正により、９つの因子は有意なままである（ｐ＜０．００３）。本発明者らは、食事パターン（代謝産物に対する公知の影響）、腎機能、または薬剤（未知の影響）について説明しなかった。これらの「非遺伝性の」影響を最小限にするのを助けるため、本発明者らは、家庭の影響を組み込み、婚姻した個体を含め、共有した栄養上および他の環境の影響について部分的に制御した。家庭の影響の測定により、調整に関わらず高い遺伝率を有する遺伝率推定値に対する最小限の影響が示唆される。したがって、本発明者らは、結果が、伝統的なコレステロールパラメータと同様の、両方の根底にある遺伝および環境の影響を反映すると考える。したがって、本発明者らは、ＬＤＬコレステロールの有意な家庭の影響を見出したが（家庭による分散の比率０．１１、ｐ＝０．０２）、この環境の影響についての調整にもかかわらず遺伝率は有意であった（ｈ2 ０．３７、ｐ＝０．００４）。
【０１１０】
同様に、結果は、必須の代謝産物対非必須の代謝産物の差を反映し得る。しかし、本発明者らは、群として分析したとき、必須（ｈ2＝０．４０、ｐ＝０．０００４）および非必須（ｈ2＝０．６３、ｐ＝０．００００２）アミノ酸の類似の遺伝率を見出し、必須（ｈ2＝０．５０、ｐ＝０．００３）脂肪酸の類似の遺伝率を非必須（ｈ2＝０．３３、ｐ＝０．０３）脂肪酸と比較した。かかる分析にパワー不足であるが、本発明者らはまた、年齢のこれらの群に関係する遺伝率との関係を試験した。年齢は、両方の必須（バリン）および非必須（プロリン、オルニチン、シトルリン）アミノ酸の遺伝率推定値に対して有意な共変量であった（表１４）。遊離脂肪酸の場合、年齢は、非必須脂肪酸（パルミトレイン酸、オレイン酸およびステアリン酸）のみの共変量であった。本発明者らはまた、代謝産物の年齢との相関を試験し、必須（チロシン、リノール酸）および非必須（グルタミン、オルニチン、シトルリン、オレイン酸）代謝産物の両方が、年齢と有意に相関した（データ未掲載）ことを見出した。したがって、必須／非必須群に基づいて、代謝産物の年齢との一貫した変動になると思われず、遺伝率推定値との一貫した変動になるとも思われない。これは、基本的なおよび遺伝子的に制御された代謝過程（例えば、ミトコンドリアのまたはミクロソームの異化経路）が、代謝機構のこれらの一般的な要素を利用する必須および非必須の代謝産物のレベルに影響を与えていることが示され得る。
【０１１１】
遺伝率推定値に影響を与え得る他の因子には、試料採取またはプロセシングにおける可変性が含まれる。本発明者らは、この可変性のタイプを制限するために標準化されたプロトコールを用い、個体内の変動は、一組の繰り返されるアッセイにおいて低く、ファミリーメンバーは、異なる場所および時間で採取された。
【０１１２】
本試験の主な強度は、メタボロミクスのプロファイリングへの非常に正確な、標的化された、定量的な手法の使用であり、ＣＡＤ病態生理の根底にある生物学的な機序を精査することが可能になる。ＣＡＤ病態生理の理解を促す他、これらの結果は、リスク予測のための有意な意味を有し得る。
【０１１３】
本明細書で引用したそれぞれの参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法であって、
ａ）前記対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップであって、前記代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸およびヒドロキシブチラートからなる群から選択される、該ステップと、
ｂ）標準と前記試料中の前記代謝産物のレベルを比較するステップであって、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記心血管疾患のリスクを示す、該ステップと
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項２】
対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法であって、
前記対象から試料を得るステップと、
前記試料中の代謝産物レベルの検出のために研究室に前記試料を提供するステップであって、前記代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸およびヒドロキシブチラートから選択される、該ステップと、
前記研究室から前記試料中の前記代謝産物レベルを示す報告を受けるステップであって、前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記心血管疾患のリスクを示す、該ステップと
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項３】
前記心血管疾患は、心血管イベントであり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象において心血管イベントのリスクを示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン代謝産物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｘ、Ｇｌｘ、オルニチン、シトルリン、ａｒｇ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃ１４；Ｃ５：１、Ｃ５、Ｃ４：ＯＨ、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０：３、Ｃ１０、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ１２：１、Ｃ１２、Ｃ１２−ＯＨ：Ｃ１０ＤＣ、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６、Ｃ１６−ＯＨ／Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：２、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｃ２０、Ｃ２０：１−ＯＨ／Ｃ１８：１−ＤＣ、Ｃ２０−ＯＨ／Ｃ１８−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ２０：４、ＦＦＡ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、因子８の前記代謝産物を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、シトルリン、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、およびＣ８：１−ＤＣを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、オルニチン、シトルリン、Ｃ５、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ２０：４およびＦＦＡを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記心血管疾患は、冠動脈疾患であり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記冠動脈疾患の存在を示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）において検出される代謝産物は、中鎖アシルカルニチン、分枝鎖アミノ酸もしくは関連代謝産物、または尿素回路に関連する代謝産物であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｘ、シトルリン、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃｉ４；Ｃ５、Ｃ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、因子１、因子４または因子９の少なくとも１種の前記代謝産物を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｇｌｘ、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
１７０ｍＭを超えるＬｅｕ／Ｉｌｅのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１２８ｍＭを超えるＧＬｘのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
０．０１３ｕＭ未満のＣ１４：１−ＯＨのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
０．００８９ｕＭ未満のＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｃ２、Ｃ５およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記心血管疾患は、冠動脈疾患であり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象において前記冠動脈疾患を発症するリスクを示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
測定された前記代謝産物は、短鎖および中鎖アシルカルニチン代謝産物、分枝鎖アミノ酸、ならびに尿素回路に関連する代謝産物を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定された前記代謝産物は、ケトン、ａｒｇ、オルニチン、シトルリン、ｇｌｘ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｃ２、Ｃ１４：１、Ｃ１８：１、Ｃ５：１、Ｃ４−ｉ４、Ｃ１８、Ｃ１０：１およびＦＦＡを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２つの代謝産物のレベルは、ステップ（ａ）において検出されることを特徴とする請求項１から５、９から１１または１９から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、血液であることを特徴とする請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝産物のレベルは、質量分析を用いて検出されることを特徴とする請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝産物のレベルは、比色定量アッセイまたは蛍光定量アッセイを用いて検出されることを特徴とする請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
対象のための治療計画を開発する方法であって、前記対象における心血管疾患のリスクに基づいた治療計画を開発するために請求項１から２５のいずれかに記載のステップ（ｂ）の比較を用いるステップを含むことを特徴とする、該方法。
【請求項１】
対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法であって、
ａ）前記対象からの試料中の少なくとも１種の代謝産物のレベルを検出するステップであって、前記代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、遊離脂肪酸およびヒドロキシブチラートからなる群から選択される、該ステップと、
ｂ）標準と前記試料中の前記代謝産物のレベルを比較するステップであって、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記心血管疾患のリスクを示す、該ステップと
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項２】
対象における心血管疾患のリスクを評価するための方法であって、
前記対象から試料を得るステップと、
前記試料中の代謝産物レベルの検出のために研究室に前記試料を提供するステップであって、前記代謝産物は、アシルカルニチン、アミノ酸、ケトン、脂肪酸およびヒドロキシブチラートから選択される、該ステップと、
前記研究室から前記試料中の前記代謝産物レベルを示す報告を受けるステップであって、前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記心血管疾患のリスクを示す、該ステップと
を含むことを特徴とする、該方法。
【請求項３】
前記心血管疾患は、心血管イベントであり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象において心血管イベントのリスクを示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、短鎖ジカルボキシルアシルカルニチン代謝産物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｘ、Ｇｌｘ、オルニチン、シトルリン、ａｒｇ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃ１４；Ｃ５：１、Ｃ５、Ｃ４：ＯＨ、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０：３、Ｃ１０、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ１２：１、Ｃ１２、Ｃ１２−ＯＨ：Ｃ１０ＤＣ、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１４−ＯＨ：Ｃ１２−ＤＣ、Ｃ１６、Ｃ１６−ＯＨ／Ｃ１４−ＤＣ、Ｃ１８：２、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、Ｃ２０、Ｃ２０：１−ＯＨ／Ｃ１８：１−ＤＣ、Ｃ２０−ＯＨ／Ｃ１８−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ２０：４、ＦＦＡ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、因子８の前記代謝産物を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、シトルリン、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、およびＣ８：１−ＤＣを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、オルニチン、シトルリン、Ｃ５、Ｃ１４−ＤＣ：Ｃ４ＤＣ、Ｃ５−ＤＣ、Ｃ６−ＤＣ、Ｃ１０−ＯＨ：Ｃ８ＤＣ、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ８：１−ＤＣ、Ｃ２０：４およびＦＦＡを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記心血管疾患は、冠動脈疾患であり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象における前記冠動脈疾患の存在を示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）において検出される代謝産物は、中鎖アシルカルニチン、分枝鎖アミノ酸もしくは関連代謝産物、または尿素回路に関連する代謝産物であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｘ、シトルリン、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４：Ｃｉ４；Ｃ５、Ｃ８、Ｃ８：１−ＯＨ／Ｃ６：１−ＤＣ、Ｃ１０：１、Ｃ１４：２、Ｃ１４：１−ＯＨ、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２、Ｃ１６：１、Ｃ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣ、Ｃ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣ、ＨＢＵＴ、およびＫｅｔからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、因子１、因子４または因子９の少なくとも１種の前記代謝産物を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｇｌｘ、Ｃ１４：１−ＯＨおよびＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
１７０ｍＭを超えるＬｅｕ／Ｉｌｅのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１２８ｍＭを超えるＧＬｘのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
０．０１３ｕＭ未満のＣ１４：１−ＯＨのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
０．００８９ｕＭ未満のＣ１６：１−ＯＨ／Ｃ１４：１−ＤＣのレベルは、冠動脈疾患を示すことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）において検出された代謝産物は、Ｃ２、Ｃ５およびＣ１８−ＯＨ／Ｃ１６−ＤＣをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記心血管疾患は、冠動脈疾患であり、前記対象における前記代謝産物のレベルは、前記対象において前記冠動脈疾患を発症するリスクを示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
測定された前記代謝産物は、短鎖および中鎖アシルカルニチン代謝産物、分枝鎖アミノ酸、ならびに尿素回路に関連する代謝産物を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定された前記代謝産物は、ケトン、ａｒｇ、オルニチン、シトルリン、ｇｌｘ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｃ２、Ｃ１４：１、Ｃ１８：１、Ｃ５：１、Ｃ４−ｉ４、Ｃ１８、Ｃ１０：１およびＦＦＡを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２つの代謝産物のレベルは、ステップ（ａ）において検出されることを特徴とする請求項１から５、９から１１または１９から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試料は、血液であることを特徴とする請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝産物のレベルは、質量分析を用いて検出されることを特徴とする請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝産物のレベルは、比色定量アッセイまたは蛍光定量アッセイを用いて検出されることを特徴とする請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
対象のための治療計画を開発する方法であって、前記対象における心血管疾患のリスクに基づいた治療計画を開発するために請求項１から２５のいずれかに記載のステップ（ｂ）の比較を用いるステップを含むことを特徴とする、該方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２０４６３（Ｐ２０１２−５２０４６３Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５４１５９（Ｐ２０１１−５５４１５９）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６８４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０４９６４
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（３０４０２８１５１）デューク ユニバーシティ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６８４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０４９６４
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（３０４０２８１５１）デューク ユニバーシティ (5)
【Ｆターム（参考）】
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