凍結乾燥されたアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤
【課題】血友病の治療剤として使われる再組合わせ人血液凝固第８因子凍結乾燥製剤を提供する。
【解決手段】凍結乾燥時、力価の不安定な蛋白質である再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる安定剤として、人血液由来アルブミンの代わりに、６〜１００ｍＭアルギニン（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、３．５〜５０ｍＭイソロイシン（Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、１０〜１００ｍＭグルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）の混合物を使用して凍結乾燥して製造される。
【解決手段】凍結乾燥時、力価の不安定な蛋白質である再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる安定剤として、人血液由来アルブミンの代わりに、６〜１００ｍＭアルギニン（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、３．５〜５０ｍＭイソロイシン（Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、１０〜１００ｍＭグルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）の混合物を使用して凍結乾燥して製造される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血友病Ａの治療剤として使われる凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に関し、より詳細には凍結乾燥時に不安定な蛋白質である再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる安定剤として人血液由来アルブミンを使用する代わり、ウイルス感染などの恐れのないアミノ酸を使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子凍結乾燥組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病とは、先天的血液凝固障害で止血されない遺伝的疾病であって、人間血しょうに正常に存在する蛋白質のうち一つである生物学的活性凝固因子の欠乏により発生することが知られている。
血友病は劣性の伴性遺伝病であるため、女性の場合に血友病遺伝子をもっていても発病せず、男性のみ発病するが、その乏しい凝固因子の種類によって血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病ＡＢおよび血友病Ｃに区別される。
【０００３】
血友病Ａは、人体内の血液凝固第８因子（抗血友性因子）の欠乏により約２万人当り１人または２人が発病する。血友病Ｂは、人体内の血液凝固第９因子（クリスマス因子）欠乏により約１０万人当り１人が発病する。血友病ＡＢは、再組合わせ人体内の血液凝固第８因子および第９因子の欠乏により発病する。そして血友病Ｃは、人体内の血液凝固第１１因子の欠乏により発病する。
【０００４】
血友病Ａの治療剤は、約３０年間人間の血しょうから血液凝固第８因子を分離して精製、濃縮して製造されており、このような治療剤の助けで多くの血友病患者が正常的な生活をしている。
しかし、従来血友病の治療剤として使われる人血液由来血液凝固第８因子は人間の血しょうから抽出されるため、肝炎またはＨＩＶ、ＴＴウィルス等の各種血液媒介ウイルスの感染に露されるという問題がある。このような問題を克服するために、現在は、例えば、非特許文献１に報告されたように、再組合わせＤＮＡ技術を使用した再組合わせ動物細胞培養生成物から再組合わせ人血液凝固第８因子を分離および精製して製造する方法が一般的に利用されている。
【０００５】
再組合わせ人血液凝固第８因子生成物の構造および生化学的反応は非特許文献２に記述されている。
人血しょうから分離される人血液凝固第８因子濃縮物は、数個の断片化された安全な活性の第８因子形態を含む（非特許文献３参照）。最も小さな活性形態は分子質量が１７０ｋＤａであり、金属イオン架橋により９０ｋＤａおよび８０ｋＤａを共に保有した２個の鎖で構成される（特許文献１参照）。Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社は人血液由来血液凝固第８因子濃縮物中の分子量１７０ｋＤａサイズに相応するＢ−ｄｏｍａｉｎ部分が除去された再組合わせ人血液凝固第８因子生成物を開発した。切断された再組合わせ人血液凝固第８因子はｒ−ＶＩＩＩＳＱと称され、無血清培地で動物細胞培養方法によって、再組合わせハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株により生産される。ｒ−ＶＩＩＩＳＱ構造および生化学的反応は特許文献２に記述されている。
【０００６】
再組合わせ人血液凝固第８因子のような蛋白質の場合、保存、保存および取扱いのために凍結乾燥された形態に製造されて販売され、患者への投与時に、適当な溶媒で再溶解して患者に注射する方式で投与される。しかし、このような凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子のような蛋白質の場合、精製、滅菌、凍結乾燥、包装および再溶解して投与される間に蛋白質の活性（力価）が大きく低下してしまう。そこで、従来から、乾燥性状がよくないという問題点に対して、再組合わせ人血液凝固第８因子の凍結乾燥時に、安定剤として人血液由来アルブミンを添加して、再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させていた。人血液由来アルブミンは精製、滅菌および凍結乾燥時に一般的な安定剤として作用する（非特許文献４参照）。
【０００７】
また、人血液由来アルブミンは、凍結乾燥用剤のうち良好なケーキ形成剤である。再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化のためのアルブミンの使用は公知の通りであり、現在販売されているあらゆる高度に精製された再組合わせ人血液凝固第８因子の一部製品に使われている。
しかし、人血液由来アルブミンは人間の血しょうから分離されるので、前述したように肝炎、ＨＩＶ、ＴＴウィルスなどの血液由来ウイルスの感染危険に露されるため、再組合わせＤＮＡ技術により製造される血友病の治療剤としては望ましくない。また、最終完成品の理化学的検査時、少量の主薬効成分と比較して相対的に超過量が存在するアルブミンによる干渉現象などを引き起こすために精密な品質管理に難点がある。
【０００８】
したがって、乾燥または凍結乾燥される間に、溶液中であるいは凍結乾燥し、かつ再溶解した後の溶液として、安定した再組合わせ人血液凝固第８因子のアルブミン非含有剤形が要求されている。
再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化するためにいろいろな解決方案が提示された。
特許文献３は、安定化剤としてスクロースを１５〜６０ｍＭ使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している。
【０００９】
特許文献４は、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの非イオン性界面活性剤（ポリソルベート２０または８０）を安定剤として使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している。
特許文献５は、低濃度のイオン、すなわち、０．５〜１５ｍＭのＮａＣｌ、ＣａＣｌ2および０．０１〜１０ｍＭの塩酸リジンを利用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している（マルトース、スクロース、マンニトールのような糖が添加される）。
【００１０】
特許文献６は、高濃度のイオン、すなわち、０．３５〜１．２ＭのＮａＣｌ、１．５〜４０ｍＭのＣａＣｌ2を利用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している（マルトース、スクロース、マンニトールのような糖が添加される）。
特許文献７は、安定剤としてトレハロースを使用することを開示している。
特許文献８には、グリシン、マンニトールおよび緩衝剤を含む人間成長ホルモンの安定化された剤形が記述されており、望ましい様態ではポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤が添加される。非イオン性界面活性剤は還元された凝集および変性のために添加される。剤形は凍結乾燥中に及び再溶解後に、増加した安定性を示す。
【００１１】
特許文献９には、溶解剤／安定剤として非イオン性重合体清浄剤を含む不活性担体培地中に溶解された特定蛋白質、例えば、インターロイキン−２を含む溶液が記述されている。望ましい清浄剤としては、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物およびポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００１２】
特許文献１０には、蛋白質、例えば、インシュリンおよび表面活性物質を含む水溶液が記述されている。
特許文献１１には、ガンマグロブリン溶液およびその製造方法が記述されている。溶液はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する。非イオン性界面活性剤がさらに溶液に添加されてもよい。
【００１３】
特許文献１２には、再組合わせ人血液凝固第８因子を含有する溶液の安定性を改善させるためにアミノ酸、単糖類、オリゴ糖類または糖アルコールまたは炭化水素カルボン酸を添加することが開示されており、特許文献１３には、熱処理される間に安定性を増加させるために再組合わせ人血液凝固第８因子の水溶液に糖アルコールまたは二糖類を添加することが記述されている。
【００１４】
特許文献１４には、二糖類、望ましくはスクロースおよび１種以上のアミノ酸を含む第８因子または第９因子の安定した注射用溶液が開示されている。
【特許文献１】ＥＰ １９７ ９０１
【特許文献２】ＷＯ ９１／０９１２２
【特許文献３】ＵＳ ５，７６３，４０１（ＥＰ ８１８ ２０４，Ｂａｙｅｒ）
【特許文献４】ＵＳ ５，７３３，８７３（ＥＰ ６２７ ９２４，Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）
【特許文献５】ＵＳ ４，８７７，６０８（ＥＰ ３１５ ９６８，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）
【特許文献６】ＵＳ ５，６０５，８８４（ＥＰ ３１４ ０９５，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）
【特許文献７】ＷＯ ９６／２２１０７（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｈｏｌｉｎｇｓ Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献８】ＷＯ ８９／０９６１４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
【特許文献９】ＥＰ ２６８１１０（Ｃｅｔｕｓ）
【特許文献１０】ＵＳ ４，７８３，４４１（Ｈｏｅｃｈｓｔ）
【特許文献１１】ＵＳ ４，１６５，３７０（Ｃｏｖａｌ）
【特許文献１２】ＥＰ ７７８７０（Ｊａｐａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ）
【特許文献１３】ＥＰ １１７０６４
【特許文献１４】ＷＯ ９１／１０４３９（Ｏｃｔｏｐｈａｒｍａ）
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，３３０−３７，１９８４およびＥＰ １６０ ４５７
【非特許文献２】Ｋａｕｆｍａｎ Ｔｉｂｔｅｃｈ，Ｖｏｌ ９，１９９１ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，１５５−６５，１９９１
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ ８３，２９７９−８３，Ｍａｙ １９８６］
【非特許文献４】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．Ｖｏｌ ４２，Ｎｕｍｂｅｒ ２Ｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．１９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、従来の再組合わせ人血液凝固第８因子の安定剤として使用されてきた人血液由来アルブミンから発生しうるウイルス感染の問題点を解決すると同時に、前記アルブミン含有製品と比較して薬効面で差のない新しいアルブミン非含有凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、再組合わせ人血液凝固第８因子を凍結乾燥する時に安定剤として、人血液由来アルブミンに代えられる安定剤を探すために実験を重ねた結果、特定アミノ酸を一定割合で添加して凍結乾燥すれば、凍結乾燥後にもその力価、性状および濁度面で優れていることを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、血友病の治療剤として用いられる再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化剤としてアルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、従来のウイルス感染の恐れがあるアルブミンを使用せずに特定アミノ酸だけを使用することによってウイルス感染を引き起こせず、かつ人体内で副作用を起こす確率が少ない一方、安定性の高く、従来のアルブミン含有再組合わせ人血液凝固第８因子製剤と比較して、性状および再溶解後の力価、再溶解後の濁度面でほぼ類似した効果を奏する。また、非イオン性界面活性剤含有再組合わせ人血液凝固第８因子製剤よりその力価および性状面で優秀な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明で使われる再組合わせ人血液凝固第８因子原液とは、再組合わせＤＮＡ技術を利用して製造された動物細胞を培養して得られた再組合わせ人血液凝固第８因子含有培養液を、親和クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを利用して精製して得られた溶液を称する。
そして、再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液とは、再組合わせ人血液凝固第８因子原液に基本バッファおよび安定剤を添加希釈したものであって、凍結乾燥される前の溶液を称する。
【００１９】
本発明のアルブミンを含有していない再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、安定剤としてアルギニン（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、イソロイシン（Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）およびグルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする。
凍結乾燥される前の前記アルギニンの濃度は６〜１００ｍＭであることが望ましく、６〜４２ｍＭであることがさらに望ましい。
【００２０】
凍結乾燥される前の前記イソロイシンの濃度は３．５〜５０ｍＭであることが望ましく、７〜３５ｍＭであることがさらに望ましい。
凍結乾燥される前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜１００ｍＭであることが望ましくて、１０〜７０ｍＭであることがさらに望ましい。
また、本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液の基本バッファは、適当量のヒスチジン、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ2の混合物で構成できる。
【００２１】
前記ヒスチジン、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ2が人体蛋白質のバッファとしてよく使われることは公知である。
以下に、実施例を通じて本発明を詳細に説明する。本実施例は望ましい一実施の形態を示すものであり、本発明がこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
従来の人血液由来アルブミンに代えて再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる物質を探すために、安定剤としてレシチン（ホスファチジルコリン）、スクロース、グリシン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）およびアミノ酸（アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸）を使用してそれぞれ再組合わせ人血液凝固第８因子の凍結乾燥用最終原液組成物を製造した。
【００２３】
また、凍結乾燥してその効能を確認するために、それぞれの製造された凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に対して力価、ケーキ性状および濁度を測定した。
使われた材料および測定器は次の通りである。
-L-アルギニン-HCl(M.W.210.7, Sigma)
-L-イソロイシン(M.W.131.2, Sigma)
-L-グルタミン酸(M.W.169.1, Sigma)
-L-ヒスチジン一水和物 (M.W.209.63, Fluka)
-スクロース(M.W.342.3, Sigma)
-ツイーン80 (Sigma)
-PEG 3350 (M.W.3350, Carbowax)
-ヒト血清アルブミンｓ(20%, KGC)
-グリシン(M.W.75.07, Sigma)
-PVP(K30) (M.W. 40000, Fluka)
-ホスファチジルコリン(レシチン、Doosan)
-FVIII 色素産生性アッセイキット (Coamatic kit, Chromogenix)
-96ウェルインキュベータ(Sanofi-BMS)
-ELISAリーダー(Magellan)
-コアグロメータ（Coagulometer、登録商標）
-FVIII 欠乏プラズマ (DADE BEHRING)
-アクチン(DADE BEHRING)
-CaCl2(DADE BEHRING)
-CAバッファ(バルビタールナトリウム、DADE BEHRING)
-凍結乾燥器VIRTIR-GENESIS 25XL
-濁度計（Turbidity Meter 2400、HACH)
再組合わせ人血液凝固第８因子の精製
再組合わせＤＮＡ技術を利用して製造された動物細胞を培養して得られた再組合わせ人血液凝固第８因子含有培養液を、親和クロマトグラフィー、１次および２次イオン交換クロマトグラフィーを利用して精製した。これを再組合わせ人血液凝固第８因子原液という。
【００２４】
各組成別安定剤が含まれている再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の製造
下記表１によって各組成別に基本バッファおよび安定剤を調製し、精製された再組合わせ人血液凝固第８因子原液に前記基本バッファおよび安定剤を混合希釈して再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液を製造し（第８因子濃度：５０〜１２５ＩＵ／ｍｌ）、１０ｍｌ用バイアルにそれぞれ４ｍｌずつ分注して最終２００〜５００ＩＵ／Ｖｉａｌにし、凍結乾燥を行った。
【００２５】
凍結乾燥
精製された再組合わせ人血液凝固第８因子原液に基本バッファおよび安定剤を混合した最終原液用組成物を調製して混合した後、バイアルに分注して凍結乾燥器（ＶＩＲＴＩＳ−ＧＥＮＥＳＩＳ２５ＸＬ）に投入した後、図１に示されたように、−４５℃に急速冷却させて６時間維持後、真空状態に転換してまた６時間維持させ、０．２℃／ｍｉｎの速度で−２０℃まで２時間徐々に昇温させた後（１次加温）、−２０℃で８０時間平衡を維持させた。
【００２６】
その後、０．１℃／ｍｉｎの速度で７時間徐々に昇温させて２５℃に温度を高めた後（２次加温）、２５℃で３時間再び平衡を維持させ、０．１℃／ｍｉｎの速度で３３℃まで再び昇温させた後、３３℃で２０時間温度平衡を維持させて凍結乾燥した。
凍結乾燥が終わった後、各２〜８℃の冷室に各製品を保管し、必要時に力価、ケーキ性状および濁度を同時に測定した。
【００２７】
【表１】
効果確認
前記の方法によって製造された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤に対してその性状、再溶解後の濁度および再溶解後の力価を測定して下記表２に表した。
性状は肉眼で比較し、濁度はＴｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ ２４００（ＨＡＣＨ）を利用して比較試験し、力価はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＡｓｓａｙおよびＣｌｏｔｔｉｎｇ Ａｓｓａｙ（ＡＰＴＴ）で比較試験し、安定剤として人血液由来アルブミンを使用した場合を基準として相対値を評価した。換言すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）の性状、濁度および力価をそれぞれ１００％で評価した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００２８】
【表２】
表２に表されたように、安定剤として人血液由来アルブミンを添加して凍結乾燥させた再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の性状、濁度および力価を１００％と基準する時、実験２の非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の場合、濁度は優秀であるが、性状および力価は比較的よくないことが確認できた。
【００２９】
一方、本発明の安定剤としてＬ−アルギニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−グルタミン酸のアミノ酸を使用した場合、性状、濁度および力価いずれも優秀であることが確認できた（実験１３、１４）。
安定剤としてレシチンを使用した場合には力価面では優秀な結果を示したが、再溶解後の濁度がよくないということが確認できた。
【００３０】
また、安定剤としてスクロース、グリシンの場合、力価面では比較的優秀な結果を示すが、性状はよくないということが確認できた。
安定剤としてＰＶＰの場合、性状面では比較的優秀であるが、力価面ではよくないということが確認できた。
図２は、本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１６）を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験２）と比較した写真である。
【００３１】
図３は、本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験２）とその力価の成績を比較したグラフである。
分析すればアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均力価を１００％と基準する時、実験２の非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は平均力価８０±５％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は９０±５％で成績が優秀であることが分かる。
【００３２】
図４は、凍結乾燥後のケーキ性状の成績を比較したグラフである。分析すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均性状の成績を１００％と基準する時、非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は平均性状の成績は８０％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は１００％であって、成績が優秀であることが分かる。
【００３３】
図５は、濁度を比較したグラフである。分析すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績を１００％と基準する時、非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績は１００％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績は１００％であって、成績に差がないことが分かる。
【実施例２】
【００３４】
実施例１に示されたように、アルブミンに代えられる安定剤として最適の条件を示したアミノ酸（アルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸）再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の凍結乾燥後の性状の最適条件を実験して下記表３に表した。
【００３５】
【表３】
表３に表されたように、アルギニン１２〜３６ｍＭ、イソロイシン４〜１８ｍＭ、グルタミン酸１９〜５７ｍＭで基準（アルブミン含有）対比ケーキ性状の最適条件を示した。
【実施例３】
【００３６】
表３の結果を参照して各アミノ酸３種のうち各２種を、性状をなす最小濃度（アルギニン１２ｍＭ、イソロイシン３.５ｍＭ、グルタミン酸１９ｍＭ）に固定させた後、アルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸それぞれの濃度による力価の変化を調べるために１種のアミノ酸の濃度を変化させて実施例１のように凍結乾燥して再組合わせ人血液凝固第８因子組成物を製造し、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＡｓｓａｙおよびＣｌｏｔｔｉｎｇ Ａｓｓａｙを実施してその力価をアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に対する％で分析した。
【００３７】
下記表４では凍結乾燥後にケーキ形成を完全になす最小限の濃度であるイソロイシン３.５ｍＭおよびグルタミン酸１９ｍＭに固定させた後、アルギニンの濃度だけを６〜１００ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００３８】
【表４】
表４に表されたように、アルギニン濃度６〜１００ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に１２〜４８ｍＭでアルブミン含有の再組合わせ人凝固因子第８因子対比８０％以上の優秀な力価を示すことが分かり、アルギニン濃度が増加するにつれて力価も上昇して３６ｍＭで最適の力価（９０％）を示すことが分かった。
【００３９】
下記表５では最適の力価を示したアルギニン３６ｍＭを固定させ、イソロイシンは３．５ｍＭに固定させた後、グルタミン酸の濃度だけを１０〜１００ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００４０】
【表５】
表５に表されたように、グルタミン酸濃度１０〜１００ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に２９〜７６ｍＭで比較的優秀な力価（８０％以上）を示すことが分かり、グルタミン酸の濃度によって力価が増加しつつ５７ｍＭで最適の力価を示しことが分かった。
【００４１】
下記表６では最適の力価を示したアルギニン３６ｍＭおよびグルタミン酸５７ｍＭに固定させた後、イソロイシンの濃度だけを０〜５０ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００４２】
【表６】
表６に表されたようにイソロイシン濃度０〜５０ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に０〜１８ｍＭで比較的優秀な力価を示すことが分かり、イソロイシン濃度７ｍＭで最適の力価を示すことが分かった。
アルブミン非含有凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤のうち最適条件を示したアミノ酸安定剤に対する力価維持の最適条件を実験した結果、アルギニン３６ｍＭ、イソロイシン７ｍＭ、グルタミン酸５７ｍＭで基準（アルブミン含有）対比力価維持の最適条件を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、アルブミンを含有せずとも安定性の高い凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の凍結乾燥過程を示した図面である。
【図２】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤をアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤と比較した写真である。
【図３】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とその力価を比較したグラフである。
【図４】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とそのケーキ性状を比較したグラフである。
【図５】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とその濁度を比較したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は血友病Ａの治療剤として使われる凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に関し、より詳細には凍結乾燥時に不安定な蛋白質である再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる安定剤として人血液由来アルブミンを使用する代わり、ウイルス感染などの恐れのないアミノ酸を使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子凍結乾燥組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病とは、先天的血液凝固障害で止血されない遺伝的疾病であって、人間血しょうに正常に存在する蛋白質のうち一つである生物学的活性凝固因子の欠乏により発生することが知られている。
血友病は劣性の伴性遺伝病であるため、女性の場合に血友病遺伝子をもっていても発病せず、男性のみ発病するが、その乏しい凝固因子の種類によって血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病ＡＢおよび血友病Ｃに区別される。
【０００３】
血友病Ａは、人体内の血液凝固第８因子（抗血友性因子）の欠乏により約２万人当り１人または２人が発病する。血友病Ｂは、人体内の血液凝固第９因子（クリスマス因子）欠乏により約１０万人当り１人が発病する。血友病ＡＢは、再組合わせ人体内の血液凝固第８因子および第９因子の欠乏により発病する。そして血友病Ｃは、人体内の血液凝固第１１因子の欠乏により発病する。
【０００４】
血友病Ａの治療剤は、約３０年間人間の血しょうから血液凝固第８因子を分離して精製、濃縮して製造されており、このような治療剤の助けで多くの血友病患者が正常的な生活をしている。
しかし、従来血友病の治療剤として使われる人血液由来血液凝固第８因子は人間の血しょうから抽出されるため、肝炎またはＨＩＶ、ＴＴウィルス等の各種血液媒介ウイルスの感染に露されるという問題がある。このような問題を克服するために、現在は、例えば、非特許文献１に報告されたように、再組合わせＤＮＡ技術を使用した再組合わせ動物細胞培養生成物から再組合わせ人血液凝固第８因子を分離および精製して製造する方法が一般的に利用されている。
【０００５】
再組合わせ人血液凝固第８因子生成物の構造および生化学的反応は非特許文献２に記述されている。
人血しょうから分離される人血液凝固第８因子濃縮物は、数個の断片化された安全な活性の第８因子形態を含む（非特許文献３参照）。最も小さな活性形態は分子質量が１７０ｋＤａであり、金属イオン架橋により９０ｋＤａおよび８０ｋＤａを共に保有した２個の鎖で構成される（特許文献１参照）。Ｋａｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社は人血液由来血液凝固第８因子濃縮物中の分子量１７０ｋＤａサイズに相応するＢ−ｄｏｍａｉｎ部分が除去された再組合わせ人血液凝固第８因子生成物を開発した。切断された再組合わせ人血液凝固第８因子はｒ−ＶＩＩＩＳＱと称され、無血清培地で動物細胞培養方法によって、再組合わせハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株により生産される。ｒ−ＶＩＩＩＳＱ構造および生化学的反応は特許文献２に記述されている。
【０００６】
再組合わせ人血液凝固第８因子のような蛋白質の場合、保存、保存および取扱いのために凍結乾燥された形態に製造されて販売され、患者への投与時に、適当な溶媒で再溶解して患者に注射する方式で投与される。しかし、このような凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子のような蛋白質の場合、精製、滅菌、凍結乾燥、包装および再溶解して投与される間に蛋白質の活性（力価）が大きく低下してしまう。そこで、従来から、乾燥性状がよくないという問題点に対して、再組合わせ人血液凝固第８因子の凍結乾燥時に、安定剤として人血液由来アルブミンを添加して、再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させていた。人血液由来アルブミンは精製、滅菌および凍結乾燥時に一般的な安定剤として作用する（非特許文献４参照）。
【０００７】
また、人血液由来アルブミンは、凍結乾燥用剤のうち良好なケーキ形成剤である。再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化のためのアルブミンの使用は公知の通りであり、現在販売されているあらゆる高度に精製された再組合わせ人血液凝固第８因子の一部製品に使われている。
しかし、人血液由来アルブミンは人間の血しょうから分離されるので、前述したように肝炎、ＨＩＶ、ＴＴウィルスなどの血液由来ウイルスの感染危険に露されるため、再組合わせＤＮＡ技術により製造される血友病の治療剤としては望ましくない。また、最終完成品の理化学的検査時、少量の主薬効成分と比較して相対的に超過量が存在するアルブミンによる干渉現象などを引き起こすために精密な品質管理に難点がある。
【０００８】
したがって、乾燥または凍結乾燥される間に、溶液中であるいは凍結乾燥し、かつ再溶解した後の溶液として、安定した再組合わせ人血液凝固第８因子のアルブミン非含有剤形が要求されている。
再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化するためにいろいろな解決方案が提示された。
特許文献３は、安定化剤としてスクロースを１５〜６０ｍＭ使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している。
【０００９】
特許文献４は、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの非イオン性界面活性剤（ポリソルベート２０または８０）を安定剤として使用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している。
特許文献５は、低濃度のイオン、すなわち、０．５〜１５ｍＭのＮａＣｌ、ＣａＣｌ2および０．０１〜１０ｍＭの塩酸リジンを利用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している（マルトース、スクロース、マンニトールのような糖が添加される）。
【００１０】
特許文献６は、高濃度のイオン、すなわち、０．３５〜１．２ＭのＮａＣｌ、１．５〜４０ｍＭのＣａＣｌ2を利用して再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる方法を開示している（マルトース、スクロース、マンニトールのような糖が添加される）。
特許文献７は、安定剤としてトレハロースを使用することを開示している。
特許文献８には、グリシン、マンニトールおよび緩衝剤を含む人間成長ホルモンの安定化された剤形が記述されており、望ましい様態ではポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤が添加される。非イオン性界面活性剤は還元された凝集および変性のために添加される。剤形は凍結乾燥中に及び再溶解後に、増加した安定性を示す。
【００１１】
特許文献９には、溶解剤／安定剤として非イオン性重合体清浄剤を含む不活性担体培地中に溶解された特定蛋白質、例えば、インターロイキン−２を含む溶液が記述されている。望ましい清浄剤としては、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物およびポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００１２】
特許文献１０には、蛋白質、例えば、インシュリンおよび表面活性物質を含む水溶液が記述されている。
特許文献１１には、ガンマグロブリン溶液およびその製造方法が記述されている。溶液はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する。非イオン性界面活性剤がさらに溶液に添加されてもよい。
【００１３】
特許文献１２には、再組合わせ人血液凝固第８因子を含有する溶液の安定性を改善させるためにアミノ酸、単糖類、オリゴ糖類または糖アルコールまたは炭化水素カルボン酸を添加することが開示されており、特許文献１３には、熱処理される間に安定性を増加させるために再組合わせ人血液凝固第８因子の水溶液に糖アルコールまたは二糖類を添加することが記述されている。
【００１４】
特許文献１４には、二糖類、望ましくはスクロースおよび１種以上のアミノ酸を含む第８因子または第９因子の安定した注射用溶液が開示されている。
【特許文献１】ＥＰ １９７ ９０１
【特許文献２】ＷＯ ９１／０９１２２
【特許文献３】ＵＳ ５，７６３，４０１（ＥＰ ８１８ ２０４，Ｂａｙｅｒ）
【特許文献４】ＵＳ ５，７３３，８７３（ＥＰ ６２７ ９２４，Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）
【特許文献５】ＵＳ ４，８７７，６０８（ＥＰ ３１５ ９６８，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）
【特許文献６】ＵＳ ５，６０５，８８４（ＥＰ ３１４ ０９５，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）
【特許文献７】ＷＯ ９６／２２１０７（Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｈｏｌｉｎｇｓ Ｃａｍｂｒｉｇｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献８】ＷＯ ８９／０９６１４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
【特許文献９】ＥＰ ２６８１１０（Ｃｅｔｕｓ）
【特許文献１０】ＵＳ ４，７８３，４４１（Ｈｏｅｃｈｓｔ）
【特許文献１１】ＵＳ ４，１６５，３７０（Ｃｏｖａｌ）
【特許文献１２】ＥＰ ７７８７０（Ｊａｐａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｃｒｏｓｓ）
【特許文献１３】ＥＰ １１７０６４
【特許文献１４】ＷＯ ９１／１０４３９（Ｏｃｔｏｐｈａｒｍａ）
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，３３０−３７，１９８４およびＥＰ １６０ ４５７
【非特許文献２】Ｋａｕｆｍａｎ Ｔｉｂｔｅｃｈ，Ｖｏｌ ９，１９９１ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，６３，１５５−６５，１９９１
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ ８３，２９７９−８３，Ｍａｙ １９８６］
【非特許文献４】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．Ｖｏｌ ４２，Ｎｕｍｂｅｒ ２Ｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．１９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、従来の再組合わせ人血液凝固第８因子の安定剤として使用されてきた人血液由来アルブミンから発生しうるウイルス感染の問題点を解決すると同時に、前記アルブミン含有製品と比較して薬効面で差のない新しいアルブミン非含有凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、再組合わせ人血液凝固第８因子を凍結乾燥する時に安定剤として、人血液由来アルブミンに代えられる安定剤を探すために実験を重ねた結果、特定アミノ酸を一定割合で添加して凍結乾燥すれば、凍結乾燥後にもその力価、性状および濁度面で優れていることを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、血友病の治療剤として用いられる再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化剤としてアルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、従来のウイルス感染の恐れがあるアルブミンを使用せずに特定アミノ酸だけを使用することによってウイルス感染を引き起こせず、かつ人体内で副作用を起こす確率が少ない一方、安定性の高く、従来のアルブミン含有再組合わせ人血液凝固第８因子製剤と比較して、性状および再溶解後の力価、再溶解後の濁度面でほぼ類似した効果を奏する。また、非イオン性界面活性剤含有再組合わせ人血液凝固第８因子製剤よりその力価および性状面で優秀な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明で使われる再組合わせ人血液凝固第８因子原液とは、再組合わせＤＮＡ技術を利用して製造された動物細胞を培養して得られた再組合わせ人血液凝固第８因子含有培養液を、親和クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを利用して精製して得られた溶液を称する。
そして、再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液とは、再組合わせ人血液凝固第８因子原液に基本バッファおよび安定剤を添加希釈したものであって、凍結乾燥される前の溶液を称する。
【００１９】
本発明のアルブミンを含有していない再組合わせ人血液凝固第８因子製剤は、安定剤としてアルギニン（Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、イソロイシン（Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）およびグルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ）を含むことを特徴とする。
凍結乾燥される前の前記アルギニンの濃度は６〜１００ｍＭであることが望ましく、６〜４２ｍＭであることがさらに望ましい。
【００２０】
凍結乾燥される前の前記イソロイシンの濃度は３．５〜５０ｍＭであることが望ましく、７〜３５ｍＭであることがさらに望ましい。
凍結乾燥される前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜１００ｍＭであることが望ましくて、１０〜７０ｍＭであることがさらに望ましい。
また、本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液の基本バッファは、適当量のヒスチジン、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ2の混合物で構成できる。
【００２１】
前記ヒスチジン、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ2が人体蛋白質のバッファとしてよく使われることは公知である。
以下に、実施例を通じて本発明を詳細に説明する。本実施例は望ましい一実施の形態を示すものであり、本発明がこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
従来の人血液由来アルブミンに代えて再組合わせ人血液凝固第８因子を安定化させる物質を探すために、安定剤としてレシチン（ホスファチジルコリン）、スクロース、グリシン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）およびアミノ酸（アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸）を使用してそれぞれ再組合わせ人血液凝固第８因子の凍結乾燥用最終原液組成物を製造した。
【００２３】
また、凍結乾燥してその効能を確認するために、それぞれの製造された凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に対して力価、ケーキ性状および濁度を測定した。
使われた材料および測定器は次の通りである。
-L-アルギニン-HCl(M.W.210.7, Sigma)
-L-イソロイシン(M.W.131.2, Sigma)
-L-グルタミン酸(M.W.169.1, Sigma)
-L-ヒスチジン一水和物 (M.W.209.63, Fluka)
-スクロース(M.W.342.3, Sigma)
-ツイーン80 (Sigma)
-PEG 3350 (M.W.3350, Carbowax)
-ヒト血清アルブミンｓ(20%, KGC)
-グリシン(M.W.75.07, Sigma)
-PVP(K30) (M.W. 40000, Fluka)
-ホスファチジルコリン(レシチン、Doosan)
-FVIII 色素産生性アッセイキット (Coamatic kit, Chromogenix)
-96ウェルインキュベータ(Sanofi-BMS)
-ELISAリーダー(Magellan)
-コアグロメータ（Coagulometer、登録商標）
-FVIII 欠乏プラズマ (DADE BEHRING)
-アクチン(DADE BEHRING)
-CaCl2(DADE BEHRING)
-CAバッファ(バルビタールナトリウム、DADE BEHRING)
-凍結乾燥器VIRTIR-GENESIS 25XL
-濁度計（Turbidity Meter 2400、HACH)
再組合わせ人血液凝固第８因子の精製
再組合わせＤＮＡ技術を利用して製造された動物細胞を培養して得られた再組合わせ人血液凝固第８因子含有培養液を、親和クロマトグラフィー、１次および２次イオン交換クロマトグラフィーを利用して精製した。これを再組合わせ人血液凝固第８因子原液という。
【００２４】
各組成別安定剤が含まれている再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の製造
下記表１によって各組成別に基本バッファおよび安定剤を調製し、精製された再組合わせ人血液凝固第８因子原液に前記基本バッファおよび安定剤を混合希釈して再組合わせ人血液凝固第８因子の最終原液を製造し（第８因子濃度：５０〜１２５ＩＵ／ｍｌ）、１０ｍｌ用バイアルにそれぞれ４ｍｌずつ分注して最終２００〜５００ＩＵ／Ｖｉａｌにし、凍結乾燥を行った。
【００２５】
凍結乾燥
精製された再組合わせ人血液凝固第８因子原液に基本バッファおよび安定剤を混合した最終原液用組成物を調製して混合した後、バイアルに分注して凍結乾燥器（ＶＩＲＴＩＳ−ＧＥＮＥＳＩＳ２５ＸＬ）に投入した後、図１に示されたように、−４５℃に急速冷却させて６時間維持後、真空状態に転換してまた６時間維持させ、０．２℃／ｍｉｎの速度で−２０℃まで２時間徐々に昇温させた後（１次加温）、−２０℃で８０時間平衡を維持させた。
【００２６】
その後、０．１℃／ｍｉｎの速度で７時間徐々に昇温させて２５℃に温度を高めた後（２次加温）、２５℃で３時間再び平衡を維持させ、０．１℃／ｍｉｎの速度で３３℃まで再び昇温させた後、３３℃で２０時間温度平衡を維持させて凍結乾燥した。
凍結乾燥が終わった後、各２〜８℃の冷室に各製品を保管し、必要時に力価、ケーキ性状および濁度を同時に測定した。
【００２７】
【表１】
効果確認
前記の方法によって製造された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤に対してその性状、再溶解後の濁度および再溶解後の力価を測定して下記表２に表した。
性状は肉眼で比較し、濁度はＴｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ ２４００（ＨＡＣＨ）を利用して比較試験し、力価はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＡｓｓａｙおよびＣｌｏｔｔｉｎｇ Ａｓｓａｙ（ＡＰＴＴ）で比較試験し、安定剤として人血液由来アルブミンを使用した場合を基準として相対値を評価した。換言すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）の性状、濁度および力価をそれぞれ１００％で評価した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００２８】
【表２】
表２に表されたように、安定剤として人血液由来アルブミンを添加して凍結乾燥させた再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の性状、濁度および力価を１００％と基準する時、実験２の非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の場合、濁度は優秀であるが、性状および力価は比較的よくないことが確認できた。
【００２９】
一方、本発明の安定剤としてＬ−アルギニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−グルタミン酸のアミノ酸を使用した場合、性状、濁度および力価いずれも優秀であることが確認できた（実験１３、１４）。
安定剤としてレシチンを使用した場合には力価面では優秀な結果を示したが、再溶解後の濁度がよくないということが確認できた。
【００３０】
また、安定剤としてスクロース、グリシンの場合、力価面では比較的優秀な結果を示すが、性状はよくないということが確認できた。
安定剤としてＰＶＰの場合、性状面では比較的優秀であるが、力価面ではよくないということが確認できた。
図２は、本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１６）を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験２）と比較した写真である。
【００３１】
図３は、本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験１）および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤（実験２）とその力価の成績を比較したグラフである。
分析すればアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均力価を１００％と基準する時、実験２の非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は平均力価８０±５％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は９０±５％で成績が優秀であることが分かる。
【００３２】
図４は、凍結乾燥後のケーキ性状の成績を比較したグラフである。分析すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均性状の成績を１００％と基準する時、非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は平均性状の成績は８０％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物は１００％であって、成績が優秀であることが分かる。
【００３３】
図５は、濁度を比較したグラフである。分析すれば、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績を１００％と基準する時、非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績は１００％であり、本発明の組成であるアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の平均濁度成績は１００％であって、成績に差がないことが分かる。
【実施例２】
【００３４】
実施例１に示されたように、アルブミンに代えられる安定剤として最適の条件を示したアミノ酸（アルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸）再組合わせ人血液凝固第８因子組成物の凍結乾燥後の性状の最適条件を実験して下記表３に表した。
【００３５】
【表３】
表３に表されたように、アルギニン１２〜３６ｍＭ、イソロイシン４〜１８ｍＭ、グルタミン酸１９〜５７ｍＭで基準（アルブミン含有）対比ケーキ性状の最適条件を示した。
【実施例３】
【００３６】
表３の結果を参照して各アミノ酸３種のうち各２種を、性状をなす最小濃度（アルギニン１２ｍＭ、イソロイシン３.５ｍＭ、グルタミン酸１９ｍＭ）に固定させた後、アルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸それぞれの濃度による力価の変化を調べるために１種のアミノ酸の濃度を変化させて実施例１のように凍結乾燥して再組合わせ人血液凝固第８因子組成物を製造し、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＡｓｓａｙおよびＣｌｏｔｔｉｎｇ Ａｓｓａｙを実施してその力価をアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子組成物に対する％で分析した。
【００３７】
下記表４では凍結乾燥後にケーキ形成を完全になす最小限の濃度であるイソロイシン３.５ｍＭおよびグルタミン酸１９ｍＭに固定させた後、アルギニンの濃度だけを６〜１００ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００３８】
【表４】
表４に表されたように、アルギニン濃度６〜１００ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に１２〜４８ｍＭでアルブミン含有の再組合わせ人凝固因子第８因子対比８０％以上の優秀な力価を示すことが分かり、アルギニン濃度が増加するにつれて力価も上昇して３６ｍＭで最適の力価（９０％）を示すことが分かった。
【００３９】
下記表５では最適の力価を示したアルギニン３６ｍＭを固定させ、イソロイシンは３．５ｍＭに固定させた後、グルタミン酸の濃度だけを１０〜１００ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００４０】
【表５】
表５に表されたように、グルタミン酸濃度１０〜１００ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に２９〜７６ｍＭで比較的優秀な力価（８０％以上）を示すことが分かり、グルタミン酸の濃度によって力価が増加しつつ５７ｍＭで最適の力価を示しことが分かった。
【００４１】
下記表６では最適の力価を示したアルギニン３６ｍＭおよびグルタミン酸５７ｍＭに固定させた後、イソロイシンの濃度だけを０〜５０ｍＭ内で変化させてその力価を評価した結果を表した。凍結乾燥前の力価は１０７ＩＵ／ｍｌであった。
【００４２】
【表６】
表６に表されたようにイソロイシン濃度０〜５０ｍＭ全般にかけて比較的優秀な力価を示した。特に０〜１８ｍＭで比較的優秀な力価を示すことが分かり、イソロイシン濃度７ｍＭで最適の力価を示すことが分かった。
アルブミン非含有凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤のうち最適条件を示したアミノ酸安定剤に対する力価維持の最適条件を実験した結果、アルギニン３６ｍＭ、イソロイシン７ｍＭ、グルタミン酸５７ｍＭで基準（アルブミン含有）対比力価維持の最適条件を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、アルブミンを含有せずとも安定性の高い凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤の凍結乾燥過程を示した図面である。
【図２】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤をアルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤と比較した写真である。
【図３】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とその力価を比較したグラフである。
【図４】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とそのケーキ性状を比較したグラフである。
【図５】本発明のアルブミン非含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤を、アルブミン含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤および非イオン性界面活性剤含有の再組合わせ人血液凝固第８因子製剤とその濁度を比較したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血友病の治療剤として用いられる再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化剤としてアルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸を含む凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項２】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項３】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜４２ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項４】
凍結乾燥前の前記イソロイシンの濃度は３．５〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項５】
凍結乾燥前の前記イソロイシンの濃度は７〜３５ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項６】
凍結乾燥前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項７】
凍結乾燥前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜７０ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項８】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜４２ｍＭ、前記イソロイシンの濃度は７〜３５ｍＭ、前記グルタミン酸の濃度は１０〜７０ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項１】
血友病の治療剤として用いられる再組合わせ人血液凝固第８因子の安定化剤としてアルギニン、イソロイシンおよびグルタミン酸を含む凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項２】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項３】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜４２ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項４】
凍結乾燥前の前記イソロイシンの濃度は３．５〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項５】
凍結乾燥前の前記イソロイシンの濃度は７〜３５ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項６】
凍結乾燥前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項７】
凍結乾燥前の前記グルタミン酸の濃度は１０〜７０ｍＭであることを特徴とする請求項１または２に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【請求項８】
凍結乾燥前の前記アルギニンの濃度は６〜４２ｍＭ、前記イソロイシンの濃度は７〜３５ｍＭ、前記グルタミン酸の濃度は１０〜７０ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の凍結乾燥された再組合わせ人血液凝固第８因子製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−８６５０（Ｐ２００６−８６５０Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３６５６２（Ｐ２００４−２３６５６２）
【出願日】平成１６年８月１６日（２００４．８．１６）
【出願人】（５９１２７０８９９）株式会社緑十字 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１６日（２００４．８．１６）
【出願人】（５９１２７０８９９）株式会社緑十字 (1)
【Ｆターム（参考）】
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