凝集体形成性循環タンパク質形態を、該形態を凝集させる薬剤及び形成された凝集体を捕捉するための薬剤を用いて検出する方法
【課題】凝集体形成性循環タンパク質形態を、該形態を凝集させる薬剤及び形成された凝集体を捕捉するための薬剤を用いて検出する方法の提供。
【解決手段】本発明は、凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の生物試料において、凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び／又は、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法に関する。
【解決手段】本発明は、凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の生物試料において、凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び／又は、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、これまで非感染性と認識されている神経変性疾患の分野に関し、特に、このような疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢関連疾患の増加により、人々への影響が増大しており、その平均年齢は、前世紀において大きく増大した。このような疾患の一部は脳に影響を及ぼし、あらゆる認知機能に影響を及ぼすようである。また、一部のこのような疾患では、感覚運動機能が相当影響され得る。これらは、「神経変性」疾患であり、これまで非感染性と認識されており、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、タウオパシー、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病及び血管性痴呆などがある。
【０００３】
したがって、例えば、世界中ではアルツハイマー病患者が２千５百万人を超える。フランスでは、約８０万人がアルツハイマー病又は関連疾患に罹患している。また、人口統計学的老齢人口は倍加しており、この数は増大している。既に１６万５千人程が、毎年新たに罹患している。アルツハイマー病は、心臓血管の病気、癌及び脳卒中に続き、一般的な死亡原因の第４位である。この神経変性痴呆は、進行的及び不可逆的に記憶障害（健忘症）及び認知機能（失語症、失行症、失認症）の喪失をもたらす。
【０００４】
アルツハイマー病と同様、主な非感染性神経変性疾患は、循環性形態（凝集体形成性循環タンパク質形態）で存在し得、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与している非感染性タンパク質からなる細胞外及び／又は細胞内沈着物を特徴とする。このようなタンパク質では、補因子若しくは酵素によって、あるいはタンパク質沈着物の形態の自発的凝集を促進させる遺伝子変異によって誘導される自発的な立体構造の変形が起こり得、このような変形により、タンパク質の型及び生理学的状況に依存して脳の種々の領域において蓄積がもたらされる（非特許文献１）。
【０００５】
したがって、アルツハイマー病の場合、凝集されるタンパク質は、主にタウタンパク質及びＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）タンパク質の断片、β−アミロイドペプチド（例えば、β１−４０、β１−４１、β１−４２）である。タウタンパク質はまた、β−アミロイドタンパク質は存在しない脳内への凝集タウタンパク質の沈着と関連している非アルツハイマー型痴呆であるタウオパシーと関連している。ＡＰＰタンパク質及び／又はそのβ−アミロイドペプチド断片はまた、血管性痴呆と関連しており、これは、アミロイド凝集体の血管周囲の沈着を特徴とする。中心灰白質核における神経変性を特徴とするパーキンソン病の場合は、関連するタンパク質はパーキンであり、特に家族性の形態では、α−シヌクレインもまたそうである。また、後者は、パーキンソン型痴呆にも関与しており、これは、感覚運動問題に加えて起こり得る。α−シヌクレインはまた、レヴィー小体痴呆もと関連している。後者は、特に、前頭皮質領域内での凝集したα−シヌクレインタンパク質の沈着を特徴とし、これにより、神経変性がもたらされ、認知機能に影響が及び、痴呆症候群がもたらされる。ハンチントン病の場合、凝集するタンパク質はハンチントンである。したがって、神経毒性タンパク質凝集体の脳へのこの沈着現象は、ほとんどの神経変性疾患において見られるが、「プリオン」疾患とは異なり、神経変性疾患と関連するタンパク質は感染性の性質を示さず、したがって伝染性ではない。実際、「プリオン」タンパク質は、伝染性海綿状脳症を媒介する因子であり、この疾患は、病気個体において単離された病原性プリオンの注射によって伝染し得る。これはまた、遺伝的起源のプリオン疾患、例えば、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｔｓｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）（ＧＳＳ）病などについてもそうであり、その病因プリオンは、宿主の遺伝子変異によって生じるが、この病因タンパク質は、いったん形成されると、プリオン疾患に特異的な感染性の性質を獲得する（非特許文献２）。「プリオン疾患」は、病原性プリオンタンパク質が接種された、又はこれに汚染された個体、あるいは、正常なタンパク質の病理的変換を起始させ、したがって「内因性」感染をもたらし得る遺伝子変異を有する個体における病原性プリオンタンパク質の量の緩緩な増加に起因する。
【０００６】
非感染性神経変性疾患と関連するタンパク質は、特に、全身性注射で正常な個体に疾患が伝染され得ないことで後者とは異なる。同様に、このような非感染性神経変性疾患に由来する組織要素では該疾患は伝染され得ず、それにより、後者は感染性疾患から除外され、プリオン疾患と異なる。
【０００７】
このような非感染性神経変性疾患の現在の診断は、ほとんどが、画像に基づくものであり、臨床検査及び神経心理学検査で補完する。これは、難儀で高価な手順であり、いくつかの診断工程を必要とし、いずれも生物試料では行なわれない。場合によっては、遺伝子変異の起源は、このようなタンパク質の１種類の異常な凝集が原因であり、ＤＮＡ配列レベルでの遺伝子診断が可能であるが、これは、「非遺伝子」形態に関しては一般的ではない。
【０００８】
したがって、このような疾患に対するより容易でより速やかな診断が必要である。したがって、ヒトにおける生物試料における診断は、極めて重要となる。特に、その免疫学的検出によって、簡便でさらにより容易な診断が可能となり得、病変が広がる前に治療工程が開始されるという点で、明白な利点を伴う（非特許文献１）。
【０００９】
種々のグループにおいて、かかる生物試料での検出を達成するための試みがなされた。したがって、特許文献１には、アルツハイマー病に罹患した患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、β−アミロイドペプチドの量の測定を、任意選択でタウタンパク質の量の測定と組み合わせ、所定の値と比較することによる診断が記載されている。この方法は、ＣＳＦの場合でしか実証されておらず、試験の特異性を改善するために、β−アミロイドペプチドの検出をタウタンパク質のアッセイで補完しなければならないという欠点を有する（非特許文献３）。
【００１０】
現時点では、このような非感染性神経変性疾患の生物学的診断のための常套的な血液試験は存在しない。例えば、タウタンパク質は、ニューロンでのみ産生され、ＣＳＦ中を通過後、血中では低濃度となるため、血中で検出するのは困難である。さらに、後者の場合、タウタンパク質は、程度の差はあれ、既存の試験によって充分良好に検出される。ＡＰＰタンパク質及びその循環性断片（例えば、前駆体タンパク質）のアッセイは血小板において行なわれ得るが、多くの凝集体形成性循環タンパク質形態が血漿タンパク質に結合し、これによりエピトープをマスクすることができ、したがって、これら同エピトープに指向させた抗体による検出が不可能及び／又は捕捉が不可能となり得るため、これも依然として問題がある。したがって、マスクされたエピトープは、使用する抗体によって認識されるものであるため、慣用的な免疫酵素的手順である「サンドイッチＥＬＩＳＡ」型を使用することは不可能である。さらに、抗体は、非常に大きなタンパク質であり、もし、凝集形態の場合、及び、血漿リガンドとの会合形態の場合のように、凝集体形成性循環タンパク質形態の分子性部位が３次元網目内に内在していると、これに接近することができない。小分子のみが、このような凝集体形成性循環タンパク質形態内の増大量のタンパク質と相互作用することができ、一方、抗体は、凝集されておらず、血漿リガンドとも会合していない遊離形態、すなわち、このような神経変性疾患と関連するタンパク質の大部分の生理学的画分を、より容易に検出する。したがって、可変的であり、そのため、その重要性が証明できない画分は、標準的な免疫学的試験ではアッセイされ得ない（非特許文献４）。
【００１１】
その結果、非感染性神経変性病理と関連する可溶性及び／又は循環性形態のタンパク質を捕捉、濃縮及び／又は検出する困難さに対する先行技術の諸方法が絶えず出現している。時として、各型のタンパク質に適した方法が想定されるが、このような方法は、大規模な常套試験に移行することが困難であるという事実に加え、このようなあらゆるタンパク質、又は診断が許容され得る充分な数のタンパク質に共通する単一の方法の実施を可能にすることができない（非特許文献４）。
【００１２】
このようなタンパク質を回収することができ、抗体認識を伴うことなく該タンパク質を生体液から分離することができ、次いで、任意選択で、該タンパク質を、考えられ得るリガンドと解離するように、免疫酵素アッセイに適した表面上に固定されるのに適合する条件下で処理することができ、続いて、最後に該タンパク質を抗体で同定することができる方法により、このような種々のタンパク質の有効で同等な検出を行なうことが可能となり得る。かかる条件は、このようなあらゆるタンパク質及びその種々の循環性形態のより有効な単離を可能にでき、さらに実際の生物医学的パラメータのより良好な相関性、したがって、このような疾患のそれぞれの診断をもたらすアッセイの解釈を伴うものでさえあり得る。
【００１３】
特許文献２には、亜鉛などの重金属カチオンを用いて、β−アミロイドペプチドの形成を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が記載されている。しかし、該タンパク質上の亜鉛結合部位の数が少ないことにより、この手法では、低速遠心分離によって沈降させ得る多分子網目を形成させることでは、β−アミロイドペプチドを凝集及び濃縮させることができない。
【００１４】
特許文献３には、プリオン、アミロイド及びタウタンパク質の病理学的形態の選択結合のための方法が記載されている。特に、硫酸デキストランによるタウタンパク質の凝集形態の捕捉は、この出願書類の実施例の１つに記載されている。この文献には、凝集剤の使用は記載されておらず、硫酸デキストランは、グリコサミノグリカンファミリーにも大環状分子ファミリーにも属しない。
【特許文献１】特許出願ＥＰ７１３０９５号
【特許文献２】米国特許第６３６５４１４号
【特許文献３】特許出願ＷＯ０３／０７３１０６号
【非特許文献１】Ｅｌ−Ａｇｎａｆ Ｏら、２００３，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２：４６１−４６２
【非特許文献２】Ｌａｎｔｏｓ ＰＬ．，１９９２，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（１）：１−１１
【非特許文献３】Ｓｊｏｇｒｅｎ Ｍら、２００３，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，３３２：１−１０
【非特許文献４】Ｋｕｏ Ｙら、２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２６８：７５０−７５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、ここに、予想外にも、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体若しくは前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態の診断のための試験において使用することにより、単一の方法によって、このようなタンパク質形態を、現在使用されている方法では検出され得ない希釈及び条件下で検出することが可能になることを示した。このような２つの薬剤の単独又は組合せでの使用により、凝集体形成性循環タンパク質形態が、これら凝集体形成性タンパク質形態に特異的な結合パートナーに結合する能力が明白に改善され得るが、いかなる場合も該能力は抑制されない。かかる結合パートナーは、診断試験に使用される。
【００１６】
したがって、本発明の主題は、ヒト起源の生物試料において、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法であって、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び／又は、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法である。
【００１７】
本発明はまた、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出するための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体若しくは前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用に関する。
【００１８】
したがって、本発明の方法は、適用の点に関して簡単で普遍的であり、血液などの生物試料において、凝集体形成性循環タンパク質形態の性質及びその濃度とは無関係に、非感染性神経変性疾患の診断を行なうのに特に有用な方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の実施形態によれば、２つの薬剤、すなわち、
−中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び
−凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩ
を使用する。
【００２０】
表現「中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤」は、該薬剤の存在下で、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集をもたらすことができる、すなわち、当初の凝集体形成性循環タンパク質形態より大きいサイズのタンパク質塊をもたらすことができる、及び、簡単な遠心分離によってその速やかな沈降を許容することができる非タンパク質の性質の任意の分子を意味することが意図される。凝集は、実際には、低速（１００００ｇ）での遠心分離によって沈降され得る多分子網目の形成と規定する。
【００２１】
表現「凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤」は、該薬剤が天然に（すなわち、生物体内で）形成されるか、又は人工的に（すなわち、薬剤Ｉとの反応後に）形成されるかに関係なく、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体に結合することができる非タンパク質の性質の任意の分子を意味することが意図される。
【００２２】
表現「これまで非感染性と認識されている神経変性疾患」は、上記のような凝集体形成性循環タンパク質形態の細胞外及び／又は細胞内沈着物を特徴とする疾患を意味することが意図され、このような凝集体形成性循環タンパク質形態は、感染性タンパク質、すなわち伝染性タンパク質でない。したがって、クロイツフェルト−ヤコブ病又はウシ海綿状脳症などのプリオン疾患は、この定義から明白に除外される。
【００２３】
本発明の定義に含まれる疾患の一例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、タウオパシー、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病及び血管性痴呆が挙げられ得る。
【００２４】
本発明の検出方法を行なう生物試料は、少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の試料であり得る。
【００２５】
かかる試料の一例としては、脳、中枢神経系の組織、脾臓及び腸などの器官、また生体液、例えば、脳脊髄液、尿及び血液（後者が好ましい）並びに選択した生物試料を構成する血液が挙げられ得る。
【００２６】
中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉは、凝集機能を有するあらゆる非タンパク質分子である。このような薬剤はすべて、タンパク質薬剤とは異なり、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を定量的及び定性的に増幅させる特殊性を有する。
【００２７】
薬剤Ｉの一例としては、少なくとも１つの正の電荷を有する分子が挙げられ得る。塩基性官能基、例えば、グアニジニウム、ピリジニウム又はアンモニウムなどによって提供される正の電荷が好ましい。本発明の目的に好ましい少なくとも１つの正の電荷を有する分子は、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を、好ましくは非重合性親水性分子系内に有する分子である。
【００２８】
本発明の具体的な一実施形態によれば、前記薬剤Ｉは、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子である。
【００２９】
好ましくは、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子は、グアニジニウムを有するアミノグリコシド類から選択され、ストレプトマイシンが特に好ましい。
【００３０】
薬剤Ｉの一例としてはまた、主要な抗結核剤、例えば、リファンピシン、イソニアジド及びエタンブトールなどが挙げられ得、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００３１】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する薬剤Ｉは、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）、ビス−３−アミノプロピルアミン、テトラヒドロ塩酸スペルミン、セスキ硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ストレプトマイシンから選択される。好ましくは、薬剤Ｉは、ストレプトマイシン及びＴＥＴから選択される。
【００３２】
抗体などのタンパク質薬剤と比べ、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集を可能にし、これを増幅様式で試験対象の試料中に捕捉する薬剤Ｉの特有の特徴のため（より多くの形態の捕捉）、薬剤Ｉのみを、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出に使用することが可能である。
【００３３】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉと、好ましくは少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と一緒にする工程を含む、又は該工程からなることを特徴とする方法に関する。
【００３４】
もちろん、薬剤Ｉは、上記規定のとおりである。
【００３５】
凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩは、捕捉機能を有するあらゆる非タンパク質分子である。薬剤ＩＩの一例としては、大環状分子及びグリコサミノグリカンが挙げられ得る。
【００３６】
このような薬剤はすべて、タンパク質薬剤とは異なり、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を定量的及び定性的に増幅させる特殊性を有する。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、薬剤ＩＩは、大環状分子及びグリコサミノグリカンから選択される。
【００３８】
グリコサミノグリカンは、当業者に広く知られており、例えば、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８８に記載されている。
【００３９】
本発明の目的に適したグリコサミノグリカンの一例としては、例えば、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸及びケラタン硫酸が挙げられ得る。
【００４０】
用語「大環状分子」は、大員環を形成している一連の複数の環からなる化合物を意味することが意図される。
【００４１】
大環状分子は、当業者に知られている。非限定的な例としては、シクロファン、メタシクロファン、シクロデキストリン、シクロ（テトラクロモトロプ酸）、スフェランド及びシクロ［ｎ］ベラトリレンが挙げられ得る。
【００４２】
大環状分子は、ケージ効果によって、遊離形態又は凝集体形態のいずれかで、試験対象のタンパク質を捕捉可能であるという特別な利点を有する。
【００４３】
大環状分子は、当業者に知られている、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６に記載された手法にしたがって調製され得る。
【００４４】
本発明の方法に好ましい大環状分子は、メタシクロファンから選択され、カリックスアレーンが特に好ましい。カリックスアレーン化合物は、Ａｒｄｕｉｎｉ，Ａ．ら、１９９６，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，編集Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｌ．Ｍ．＆ Ｍｏｄｄｙ，Ｃ．Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ及びＤａ Ｓｉｌｖａら、２００１，Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１：１３５−１３８に記載の方法論に従って得られ得る。
【００４５】
好ましい一実施形態によれば、本発明の大環状分子は、下記一般式（Ｉ）：
【００４６】
【化１】
【００４７】
（式中、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基を表し、ここで、Ｐｏｌは、リン酸基、硫酸基、アミン基、アンモニウム基、カルボン酸基を表し、Ｒは以下に規定するとおりであり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素又はイオウ原子であり、
Ｒ５及び６は、各々独立して、存在しないか、又は水素原子、ＣＨ２若しくは以下に規定するＲ基を表すか、あるいは
Ｒ５及び６は一緒になって、酸素又はイオウ原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基又は酸素若しくはイオウ原子を表し、
ｍは、０又は１である整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は、分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖を表し、ここで、該鎖は、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有し、
ｎは３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、該単位の性質に応じて異なっていてよい）
に相当する。
【００４８】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環の存在を特徴とする一連のｎ個の単位の形態であり、この環の置換基は、上記のその定義の範囲内で、それぞれ種々であり得る。
【００４９】
もちろん、式中の星印の存在は、環の形成のために必要な結合を表すことがあり得る。
【００５０】
分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖であって、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有する該鎖は、当業者に広く知られている。一例として、アルキル、アルケン、アリール及び飽和環（例えば、シクロヘキサンなど）が挙げられ得る。無極性基の一例はＣＦ３であり、極性基の一例は、上記規定の置換基Ｐｏｌである。
【００５１】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、下記式（Ｉａ）：
【００５２】
【化２】
【００５３】
（式中、
ｎは４〜８の整数であり、
各基Ｒ２は一緒になって、独立して、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは０〜６の整数であり、ｓは０〜６の整数である）を表す）
に相当する。
【００５４】
特に好ましい式（Ｉａ）の化合物は、２つの基Ｒ２が各々、硫酸基であり、ｎが４、６又は８であり、Ｒ７が水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基であり、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００５５】
好ましい一実施形態によれば、該大環状リガンドは、式中、ｎ＝６、Ｒ２＝硫酸基及びＲ７が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である一般式（Ｉａ）に相当する。
【００５６】
抗体などのタンパク質薬剤と比べ、試験対象の試料中、増幅様式で凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体の捕捉を可能にする（より多くの形態の捕捉）薬剤ＩＩの特有の特徴により、薬剤ＩＩのみを、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出に使用することが可能である。
【００５７】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩと、好ましくは大環状分子又はグリコサミノグリカンと一緒にする工程を含む、又は該工程からなることを特徴とする方法に関する。
【００５８】
もちろん、薬剤ＩＩは、上記規定のとおりである。
【００５９】
薬剤Ｉ及びＩＩの量は、具体的な試料に応じて当業者により容易に決定され得る。したがって、例えば、ストレプトマイシンなどの薬剤Ｉの量は、５０〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００６０】
予想外にも、本出願人らは、本発明の方法において検出される凝集体形成性循環タンパク質形態は、薬剤Ｉ、特に少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する薬剤との結合のために、その側鎖が酸官能基、好ましくはカルボン酸官能基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、又は水素結合受容体官能基、例えば、セリン（Ｓ）若しくはアスパラギン（Ｎ）のいずれかを有するアミノ酸を含み、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）が、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に全体に少なくとも４回存在することを示した。好ましくは、２０アミノ酸以下のペプチド配列全体において４以上であるこれらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）の密度が、凝集体形成性循環タンパク質形態を構成するタンパク質の完全配列において少なくとも２回見られる。好ましくは、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）は、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に全体に少なくとも５回存在するか、又は１６アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に少なくとも４回存在する。好ましくは、上記規定の密度は、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）より高密度である（１２アミノ酸以下の長さのペプチド配列において少なくとも５回に相当する）領域と関連している。また、同等の空間的距離での同等の官能基の密度により、タンパク質の一次構造において上記に規定したものを模倣する構造が構成され得る。
【００６１】
同様に、本出願人らは、薬剤ＩＩ、特に、カリックスアレーンなどの大環状分子との結合のために、凝集体形成性循環タンパク質形態は、最低３つの基本アミノ酸、好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）を、アミノ酸１２以下又は、さらに１５以下の長さのペプチド配列内に含むことを示した。また、同等の空間的距離での３つの等価な正の電荷の密度により、タンパク質の一次構造において上記に規定したものを模倣する構造が構成され得る。これは、例えば、１２又は、さらに１５のアミノ酸の配列に相当する３次元空間内のこれらのカチオン又はその機能的同等物が、アミノ酸からなるαヘリックスである該空間の一部分上に突出された立体構造であり得る。
【００６２】
本方法における生物試料への２つの薬剤Ｉ及び／又はＩＩの添加は、予想外にも、例えば凝集体形成性循環タンパク質形態に対する検出抗体を用いた凝集体形成性循環タンパク質形態の検出がなんら障害されないため、任意の順序で行なわれ得る。しかし、前記薬剤Ｉは前記生物試料に、薬剤ＩＩの前に凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集のために添加されることが好ましく、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００６３】
本発明の一実施形態によれば、該方法は、
ａ）凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために、前記薬剤Ｉを前記試料に添加し、これを沈殿させる工程、
ｂ）このようにして得られた混合物を、凝集体形成性循環タンパク質形態の前記凝集体を捕捉するために薬剤ＩＩと一緒にする工程、及び
ｃ）凝集体形成性循環タンパク質形態の存在を顕在化する工程
を含むか、又は該工程からなる。
【００６４】
好ましくは、凝集体形成性循環タンパク質形態の沈殿を促進させるため、薬剤Ｉの添加後、反応媒体の中程度の加熱を、２５〜４５℃の温度（３７℃の温度が好ましい）で行なう。
【００６５】
薬剤Ｉの存在下で形成される凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体は、薬剤ＩＩとの反応前に、反応媒体から分離され得る。分離方法は、当業者に知られている任意の沈殿物分離方法によって行なわれ得る。一例として、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体は反応媒体から、遠心分離又は膜分離によって分離され、次いで、上清みを除く。この分離工程により、その後の凝集体形成性循環タンパク質形態の検出反応に必要ないあらゆる生成物を除去すること、例えば、薬剤Ｉ非含有溶液とすることが可能になる。
【００６６】
薬剤Ｉでの凝集体の形成後、血漿リガンドが結合された（変性）凝集体形成性循環タンパク質形態の血漿リガンドとタンパク質との分離を促進させるため、グアニジン−ＨＣｌなどの化学変性剤が１〜６モル／１の濃度で添加され得る、及び／又は、熱変性が１００℃で行なわれ得、これにより、凝集体形成性循環タンパク質形態のタンパク質のマスクされたエピトープを、薬剤Ｉに結合されていないリガンドから分離させることにより遊離させることが可能になる。これにより、本発明の検出方法の感度をさらに増強させることが可能になる。凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体と薬剤ＩＩとの反応前での試験対象の生物試料中に存在する前記凝集体の変性もまた、当業者に知られている任意のタンパク質凝集体変性方法によって行なわれ得る。
【００６７】
したがって、本発明による凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法は、好ましくは、以下：
ｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を反応混合物から分離する工程、及び
ｉｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を変性させる工程
のさらなる工程ｉ）及びｉｉ）の少なくとも１つを含み、
これらの工程は、適切な場合は、工程ａ）及び工程ｂ）の間に含まれる。
【００６８】
本発明の方法による生物試料中での凝集体形成性循環タンパク質形態の存在の可視化は、試料中の被検物を検出するための慣用法に従って行なわれ得る。
【００６９】
これは、例えば、免疫学的又は非免疫学的検出によって行なわれ得る。
【００７０】
用語「免疫学的検出」は、凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応の実証を意味することが意図され、この免疫反応は、検出対象の凝集体形成性循環タンパク質形態と、該凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーとの間の結合、あるいは、試験対象の試料中に含まれている可能性がある凝集体形成性循環タンパク質形態と、標識された凝集体形成性循環タンパク質形態との間の競合反応からなる。
【００７１】
非免疫学的検出の一例としては、例えば、当業者によく知られている電気泳動ゲルでの染色手法が挙げられ得る。
【００７２】
免疫反応による凝集体形成性循環タンパク質形態の検出は、例えば、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーの添加後に行なわれ得る。
【００７３】
表現「凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナー」は、対象の凝集体形成性循環タンパク質形態に結合することができる任意のパートナーを意味することが意図される。そのため、免疫反応の可視化は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナー／凝集体形成性循環タンパク質形態複合体の可視化からなる。
【００７４】
好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との間の免疫反応のために、適切な場合は工程ｃ）において添加するものである。もちろん、かかるパートナーは、本発明の方法において薬剤Ｉのみ又は薬剤ＩＩのみを使用すると決定された場合にも添加され得る。
【００７５】
本発明の方法において添加される異なる結合パートナーの数は、試験対象の異なる凝集体形成性循環タンパク質形態の数に依存する。したがって、アルツハイマー病の検出の場合、タウタンパク質のみを試験することが望ましい場合、タウ特異的結合パートナーが添加される。他方において、タウタンパク質とβ−アミロイドペプチドとの両方を検出することが望ましい場合、β−アミロイドペプチドに特異的な結合パートナーもまた添加される。
【００７６】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーの一例としては、例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ハプテン及びアプタマーが挙げられ得る。
【００７７】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、遺伝子組換えによって得られる抗体並びに抗体断片を含む。
【００７８】
ポリクローナル抗体は、少なくとも１種類の対象の標的抗原（本発明の場合は、凝集体形成性循環タンパク質形態）での動物の免疫処置後、前記動物から血清試料を採取し、所望の抗体を他の血清成分から、特に、該抗体によって特異的に認識される抗原（特に、凝集体形成性循環タンパク質形態）を結合したカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによって分離することにより、純粋な形態で前記抗体を回収することによって得られ得る。
【００７９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ手法によって得られ得、その一般原理を、以下に想起する。
【００８０】
第１の工程では、動物、一般的にはマウス（又はｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫処置の場合は培養細胞）を、対象抗原（本発明の場合は、凝集体形成性循環タンパク質形態）で免疫処置すると、前記マウスのＢリンパ球は前記抗原に対して抗体産生できるようになる。次いで、この抗体産生リンパ球を「不死化」骨髄細胞（実施例ではマウスのもの）と、ハイブリドーマが得られるように融合させる。このようにして得られた細胞の不均一系混合物を、次いで、特異的抗体の産生することができ、かつ永久に増殖することができる細胞を選択するための供給源として使用する。各ハイブリドーマを、各々がモノクローナル抗体の産生をもたらすクローン形態で増殖させ、その対象抗原に関する認識特性が、ＥＬＩＳＡ、１次元若しくは２次元免疫ブロッティング、免疫蛍光又はバイオセンサーによって試験され得る。このようにして選択されたモノクローナル抗体は、続いて、特に上記のアフィニティクロマトグラフィー手法に従って精製される。
【００８１】
本発明に適した抗体の一例としては、例えば、総タウタンパク質（Ｔａｕ−１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、Ｔ４６（Ｚｙｍｅｄ））、リン酸化タウタンパク質（抗体ＰＨＦ−６（Ｚｙｍｅｄ））、ＡＰＰタンパク質（抗体２２Ｃ１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、β−アミロイドペプチド（６Ｅ１０抗体及び４Ｇ８（Ｓｉｇｍａ））に対するモノクローナル抗体が挙げられ得る。
【００８２】
抗体断片は、凝集体形成性循環タンパク質形態への結合機能を保持しているものである。
【００８３】
用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列を意味することが意図される。用語「アミノ酸」は、タンパク質をコードする１級アミノ酸、酵素作用後に誘導されるアミノ酸、例えば、トランス−４−ヒドロキシプロリンなど、及び天然だがタンパク質中には存在しないアミノ酸、例えば、ノルバリン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、スタリン（Ｈｕｎｔ Ｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，Ｂａｒｅｔｔ ＧＣ編，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５）など、化学官能基によって保護され、固相支持体又は液相合成に使用され得るアミノ酸、並びに非天然アミノ酸を意味することが意図される。
【００８４】
用語「タンパク質」は、ホロタンパク質及びヘテロタンパク質（例えば、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質など）を含み、ともに、繊維性及び球状である。
【００８５】
用語「核酸」は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸及びリボ核酸並びにその誘導体を意味することが意図される。
【００８６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの天然又は修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はその両方）の配列を表す。用語「修飾ヌクレオチド」は、例えば、修飾塩基を含むヌクレオチド、及び／又は、ヌクレオチド結合レベル及び／又は主鎖レベルの修飾を含むヌクレオチドを意味することが意図される。修飾塩基の一例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン及びブロモ−５−デオキシウリジンが挙げられ得る。修飾ヌクレオチド結合の例示としては、ホスホロチオエート、Ｎ−アルキルホスホルアミダイト、アルキルホスホネート及びアルキルホスホジエステル結合が挙げられ得る。α−オリゴヌクレオチド（例えば、ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載のものなど）、ＬＮＡ（例えば、ホスホロチオエート−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，第８巻，Ｉｓｓｕｅ １６，１８ Ａｕｇｕｓｔ １９９８，第２２１９−２２２２頁に記載）など）、並びにＰＮＡ（これは、Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７による論文の主題である）は、その主鎖が修飾されたヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
【００８７】
用語「ハプテン」は、非免疫原性化合物、すなわち、それ自体単独では抗体産生による免疫反応を促進することができないが、既知の条件下での動物の免疫処置、特に、ハプテン−タンパク質コンジュゲートによる免疫処置によって得られる抗体によって認識され得る化合物を表す。このような化合物は、一般的に、３０００Ｄａ未満、最も一般的には２０００Ｄａ未満の分子量を有し、例えば、グリコシル化ペプチド、代謝産物、ビタミン類、ホルモン、プロスタグランジン、毒素又は種々の医薬、ヌクレオシド及びヌクレオチドであり得る。
【００８８】
アプタマーは、タンパク質の捕捉パートナーであり、核酸性であり、その機能は、抗体としての機能を果たすこと、及びタンパク質リガンドに結合することである（Ｔｏｕｌｍｅ，ＪＪ．及びＧｉｅｇｅ，Ｒ．，１９９８，Ｍｅｄｅｃｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（２），１５５−１６６）。
【００８９】
これらのポリペプチド、タンパク質、ハプテン及びアプタマーはすべて、凝集体形成性循環タンパク質形態又は凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体に結合する能力を有する。
【００９０】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと、使用される（特に工程ｃ）で）凝集体形成性循環タンパク質形態との間の免疫反応の可視化は、当業者に知られている任意の検出手段、例えば、直接又は間接的手段などによって行なわれ得る。
【００９１】
直接検出の場合、すなわち、標識を使用しない場合、免疫反応は、例えば、プラズモン共鳴又は導電性ポリマーを担持する電極上でのサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
【００９２】
間接的検出の場合、すなわち、標識を使用する場合、標識は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な前記結合パートナーによって行なわれ得、ついで、該タンパク質形態が予備標識される。
【００９３】
本発明の方法による生物試料中での凝集体形成性循環タンパク質形態の存在の可視化はまた、「競合」法に従って行なわれ得る。次いで、予備標識された凝集体形成性循環タンパク質形態を、特に工程ｃ）において、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーの代わりに添加する。この場合、シグナルの検出は、凝集体形成性循環タンパク質形態の不在下で最大であり、次いで徐々に減少する。これは、調査対象の凝集体形成性循環タンパク質形態（これは非標識）の濃度が、競合反応によって増大するためである。
【００９４】
用語「標識すること」は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる標識の結合を意味することが意図される。このような標識の非限定的な例は、
検出可能なシグナルを、例えば、比色分析、蛍光又は発光によってもたらす酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど、
発色団、例えば、発光化合物、色素化合物など、
放射性分子、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなど、
蛍光分子、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アレクサ又はフィコシアニン、及び
金若しくは磁性ラテックス粒子、又はリポソームなどの粒子
からなる。
【００９５】
また、間接系も、例えば、別のリガンド／抗リガンドの組によって使用され得る。リガンド／抗リガンドの組は、当業者によく知られており、例えば、以下の組：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／該ポリヌクレオチドの相補配列が挙げられ得る。この場合、結合性因子を担持しているのはリガンドである。抗リガンドは、先のパラグラフに記載した標識によって直接検出可能であり得るか、又はリガンド／抗リガンドによって自身で検出可能である。
【００９６】
これらの間接検出系は、一定の条件下で、シグナルの増幅をもたらし得る。このシグナル増幅手法は、当業者によく知られており、論文Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１−４９１，１９９７を参照してよい。
【００９７】
タンパク質の標識は、当業者に広く知られており、例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｅ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，５２５Ｂ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１０１ ＵＳＡに記載されている。
【００９８】
使用する標識の型（例えば、酵素の使用）に応じて、当業者は、標識の可視化のための試薬を添加する。
【００９９】
かかる試薬は、当業者に広く知られており、特に、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｅｓｓａｙ，第２版，編集Ｃ．Ｐｒｉｃｅ，ＤＪ．Ｎｅｗｍａｎ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，３４５ Ｐａｒｋ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｏｕｔｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１００】
凝集体形成性循環タンパク質形態の検出は、固相検出であり得、すなわち、検出対象のタンパク質を捕捉することが意図される捕捉パートナーが固定された固相を使用する。本発明の場合、固相支持体上に事前に固定される捕捉パートナーとして供され得るのは、薬剤ＩＩである。固相検出の例は、当業者によく知られ、サンドイッチ型検出、例えばＥＬＩＳＡ型検出である。
【０１０１】
したがって、本発明の好ましい一実施形態によれば、前記薬剤ＩＩは固相支持体に結合される。
【０１０２】
固相支持体の一例としては、例えば、ビーズ（例えば、磁性ビーズなど）及びマイクロタイタープレートが挙げられ得る。
【０１０３】
薬剤ＩＩは固相支持体に、当業者に知られている様式で、例えば、吸着又は共有結合によって結合され得、共有結合が好ましい。
【０１０４】
したがって、固相支持体は、前記薬剤ＩＩに担持された官能基と結合を形成することができる官能基で官能基化されたものであり得る。好ましい一実施形態によれば、固相支持体は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）結合又はＮＨ２官能基で官能基化される。この官能基は、薬剤ＩＩに担持された官能基と反応し得る。この実施形態において、固相支持体の官能基結合と結合が形成されるように反応できる官能基を担持する、特にＮＨ２又はＣＯＯＨを担持する薬剤ＩＩが特に好ましい。
【０１０５】
本発明の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法の実施のため、薬剤Ｉ及び薬剤ＩＩを備える診断用キットが使用され得、前記薬剤は上記規定のとおりである。
【０１０６】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出のための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用に関する。
【０１０７】
好ましい一実施形態によれば、前記薬剤ＩＩは、固相検出法に従って少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を行なうために、キット内で固相支持体に結合された状態で存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
本発明は、非限定的な一例として示す以下の実施例及び図１〜２４から、より明白に理解されよう。
【０１０９】
図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す。
【０１１０】
図２は、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図２Ｂ）のＸ線写真の概略図（図２Ａ）である。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１１】
図３は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図３Ｂ）のＸ線写真の概略図（図３Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１２】
図４は、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図４Ｂ）のＸ線写真の概略図（図４Ａ）である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１３】
図５は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図５Ｂ）のＸ線写真の概略図（図５Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１４】
図６は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図６Ｂ）のＸ線写真の概略図（図６Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１５】
図７は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図７Ｂ）のＸ線写真の概略図（図７Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１６】
図８は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図８Ｂ）のＸ線写真の概略図（図８Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１７】
図９は、種々の濃度の薬剤ＩＩ ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４２での処理後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１１８】
図１０は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０で処理したペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【０１１９】
図１１は、種々の濃度の薬剤ＩＩコンドロイチン−６−硫酸、薬剤ＩＩでの処理なしでの対照であるＡｂ４２との反応後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１２０】
図１２は、アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）由来又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の、未処理（ＮＴ）又はトリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）である薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（ｐｇ／ｍｌ、当量（ｅｑ）の組換えタウタンパク質でアッセイ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【０１２１】
図１３は、アルツハイマー病の患者、未処理（ＮＴ）又は種々の濃度（ｍｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（当量Ｔａｕ、ｐｇ／ｍｌ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【０１２２】
図１４は、処理なし又はＳＤＳ１％での処理及びストレプトマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）での沈殿後の、リン酸化タウタンパク質の検出に対する種々の取り込みバッファーの効果を示すグラフ表示である。結果は、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＰＡＤ−）又は血漿無添加（Ｐ）の脳抽出物を用いて得たものである。Ｇｎｄ：グアニジン；ＳＮ：上清み；ｓｔｐ：ストレプトマイシン。
【０１２３】
図１５は、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後（図１５Ａ）及びウエスタンブロッティング後の同じゲルのＸ線写真（図１５Ｂ）の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０１２４】
図１６は、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後（図１６Ａ）及びウエスタンブロッティング後の同じゲルのＸ線写真（図１６Ｂ）の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【０１２５】
図１７は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である。図１７Ａはペレット画分に相当し、一方、図１７Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【０１２６】
図１８は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）である。図１８Ａはペレット画分に相当し、一方、図１８Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【０１２７】
図１９は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）である。図１９Ａはペレット画分に相当し、一方、図１９Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【０１２８】
図２０は、血漿中に存在し、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）で処理したＳｙｎタンパク質のある濃度範囲（ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。光学密度は、ペレット画分及び上清み画分にて読み取る。
【０１２９】
図２１は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を捕捉相に用いたサンドイッチ型のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）の脳抽出物由来の種々の量（ｎｇ）のタンパク質を試験する。得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【０１３０】
図２２は、特異的抗体を捕捉相に用いたサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加し、ストレプトマイシンである薬剤Ｉで沈殿させる。沈殿後、ペレット（Ｃ）を加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。ＮＴは未処理、Ｃはペレット及びＳは上清みを意味する。
【０１３１】
図２３は、薬剤Ｉ（ストレプトマイシン）での沈殿及び薬剤ＩＩ（カリックスアレーン）を用いた捕捉によるＥＬＩＳＡによる検出後のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加する。薬剤Ｉでの沈殿後、ペレットを加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。
【０１３２】
図２４は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）脳抽出物を用いて行ない、未処理又はストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した正常患者由来の血漿プール中に添加したリン酸化タウタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。捕捉相は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）からなる。ペレット画分及び上清み画分において得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【実施例１】
【０１３３】
実施例１：非感染性神経変性疾患における神経毒性凝集体沈着物と関連するタンパク質のペプチド配列の比較解析
本発明者らは、「Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ」ソフトウエアを用い、神経変性疾患における神経毒性凝集体沈着物と関連するタンパク質の代表的なタンパク質、すなわち、タンパク質α−シヌクレイン（配列番号１）、アミロイド前駆体タンパク質すなわちＡＰＰ（配列番号２）、パーキンタンパク質（配列番号３）及びタウタンパク質（配列番号４）のペプチド一次配列のアライメントを行なった。アミノ酸は、配列内のアライメント上に、最長のコンセンサス配列との一致に基づいて番号付けし、タンパク質の配列内の点線は、その線形ペプチド配列と、コンセンサス配列におけるすべてのタンパク質に共通する単位のアライメントとの間のシフトを表す。
【０１３４】
多重アライメントオプションを用いた「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」型のアライメントを行ない、図１に示す。相同性領域（同一であるか、又は同等の化学官能基を有するアミノ酸）を四角で囲み、これらの種々のタンパク質に共通するドメインを規定する。これらに共通する性質の１つは、神経変性疾患における中枢神経系でのその神経毒性凝集体の形成である。
【０１３５】
個々に四角で囲んだアミノ酸は、特定のタンパク質の一次配列内の目的の特定のアミノ酸の高頻度反復配列の代表である。このような反復配列は、タンパク質に応じて種々に分布し得るが、コンセンサスよりも高密度である官能基の基部を構成しているか、あるいは、その空間内での突出によって結合ドメインが構成され得る。
【０１３６】
薬剤Ｉ、例えば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を含む有機化合物など、あるいは薬剤ＩＩ、例えば、カリックス−６−アレーン−スルホネート型のカリックスアレーンなどとの結合に関与する官能基に関する本発明者らの当初の知識に基づき、本発明者らは、このような相同領域内において、上記の官能基を有する特定の密度のアミノ酸を同定することができた。
【０１３７】
したがって、図１において、薬剤Ｉ、例えば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を含む有機化合物などに対する結合では、以下に規定する領域が、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列において、Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮから選択される最低４個のアミノ酸を含むことがわかる：
ｉ）α−シヌクレインでは、例えば、領域
−１２４〜１４３は、４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２３１〜２６１は、１０つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１９アミノ酸上に有する（点線は、一次配列に対する一致に基づく番号付けにおけるシフトを示し、これは、２０アミノ酸が、そのタンパク質の配列範囲内の実際の数より大きな数で番号付けされていることを意味する）及び
−２３２〜２４９でさえ、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｉ）ＦＡＰＰでは、例えば、領域
−８０〜９８は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−１９３〜２１６は、１４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１７アミノ酸上に有する、
−２２５〜２３６は、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する、
−２４７〜２５６は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１０アミノ酸上に有する、
−６９２〜７０２は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１１アミノ酸上に有する、
−７１３〜７１８は、４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を６アミノ酸上に有する；
ｉｉｉ）パーキンでは、例えば、領域
−２５〜４６は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する（一致に関する番号付けにおけるシフトのため）、
−１５３〜１７２は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２２４〜２４０は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｖ）タウタンパク質では、領域
−３１〜５３は、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２２５〜２４８は、１２つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２３６〜２４７は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する、
−２８９〜３０８は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−３６１〜３８０は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−５２３〜５４２は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、及び
−７５３〜７６４は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する。
【０１３８】
また、２０アミノ酸以下のペプチド配列における４以上のこれらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）の密度はまた、凝集体形成性循環タンパク質形態を構成するタンパク質の完全配列において、少なくとも２回見られ得ることが注目され得る。さらに、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）は、２０アミノ酸以下のペプチド配列において全体として少なくとも５回、及び／又は、１６アミノ酸以下のペプチド配列において少なくとも４回存在し得ることが注目される。最後に、上記規定の密度はまた、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）より高密度である（１２アミノ酸以下の長さのペプチド配列において少なくとも５に相当する）領域と関連し得る。また、同等の空間的距離での同等の官能基の密度により、タンパク質の一次構造において上記規定のものを模倣する構造が構成され得る。
【０１３９】
また、これらのアミノ酸の頻度は、ＡＰＰのペプチド配列の４９の連続するアミノ酸のうち３２に達し得るが、４９残基（領域２２５−２７５）のこの配列から離れた他の結合領域は排除されないことに注目するのは興味深い。
【０１４０】
さらに、図１において、薬剤ＩＩ、例えば、カリックスアレーン型の大環状分子に対する結合では、以下に規定する領域が、最低３つの基本アミノ酸、好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）を、アミノ酸１２以下又は、さらに１５以下の長さのペプチド配列内に含むことが認められ得る：
ｉ）α−シヌクレインでは、領域
−１０６〜１２０は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１２８〜１４２は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１５９〜１６３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する；
ｉｉ）ＡＰＰでは、領域
−９０〜１０４は、７つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１０５〜１１６は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−１３２〜１４３は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−１５３〜１６３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−６９７〜７０７は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１１アミノ酸上に有する；
ｉｉｉ）パーキンでは、領域
−８３〜１００は、７つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１８２〜１９５は、６つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｖ）タウタンパク質では、領域
−１０１〜１０８は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を８アミノ酸上に有する、
−１３５〜１４７は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１３アミノ酸上に有する、
−１７８〜１８３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を６アミノ酸上に有する、
−１９７〜２０８は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１アミノ酸上に有する。
【０１４１】
また、同等の空間的距離での３つの等価な正の電荷の密度により、タンパク質の一次構造において上記規定のものを模倣する構造が構成され得ることも注目され得る。これは、例えば、１２又は、さらに１５のアミノ酸の配列に相当する３次元空間内のこれらのカチオン又はその機能的同等物が、アミノ酸からなるαヘリックスである該空間の一部分上に突出された立体構造であり得る。
【実施例２】
【０１４２】
実施例２：薬剤Ｉを用いた方法によるタウタンパク質の検出
２．１ 解析手法
この解析は、ウエスタンブロッティング（Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ １９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５）に従って行なう。
【０１４３】
解析する試料を、ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー）（５０／５０ｖ／ｖ）中で、１００℃にて５分間変性させる。次いで、前記試料を、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下、１２％ポリアクリルアミド一次元電気泳動ゲル上に載せる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【０１４４】
泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、タウタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ｔａｕ−１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いて４℃で一晩免疫ブロットする。
【０１４５】
二次検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされたマウス免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を認識するヤギ抗体である。
【０１４６】
膜は、工程ごとに、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、次いでこれを含有しないＰＢＳ中で洗浄する。
【０１４７】
シグナルを、化学発光によってスーパーシグナルキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出し、ラジオグラフィー膜（Ｐｉｅｒｃｅ）上で可視化する。
【０１４８】
２．２ 薬剤Ｉの存在下での検出
このアッセイは、６ヒスチジンのテイル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と融合させた１μｇの組換えタウタンパク質と、薬剤Ｉとして、硫酸塩形態のストレプトマイシン、又はトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴ、又はリファンピシン又はイソニアジドのいずれかを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が９／１又は３５／１に等しくなるように用いて行なう。
【０１４９】
該組換えタンパク質と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１５０】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、変性後、ウエスタンブロッティング手法によって解析する。
【０１５１】
結果を、以下に規定する図２及び３に報告する。
【０１５２】
図２は、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図２Ｂ）のＸ線写真の概略図（図２Ａ）であり、レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１５３】
図３は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図３Ｂ）のＸ線写真の概略図（図３Ａ）であり、レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１５４】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉの濃度は、以下の表１及び２に示すとおりである。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
結果は、タウタンパク質及びその消化形態が、ストレプトマイシン、ＴＥＴ、リファンピシン又はイソニアジドのどれであるかに関係なく、薬剤Ｉで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これらが、試験試料容量から濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、タウタンパク質の沈殿を誘導する。
【実施例３】
【０１５８】
実施例３：薬剤ＩＩを用いた方法によるタウタンパク質の検出
３．１ 解析手法
上記の２．１に記載のものと同じである。
【０１５９】
３．２ 薬剤ＩＩとしてのカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓと示す）の存在下で行なった検出
このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、濃度範囲を０．５ｍＭ〜６０ｍＭとする以外は、上記の２．２に示すようにして行なう。
【０１６０】
結果を図４に報告する。この図は、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーンで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図４Ｂ）のＸ線写真の概略図（図４Ａ）である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１６１】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表３に示すとおりである。
【０１６２】
【表３】
【０１６３】
これらの結果は、タウタンパク質及びその消化形態が、Ｃ６Ｓで処理した後のペレット中に見られること、及び、薬剤ＩＩの不在下では、タウタンパク質の濃縮も分離も観察されないことを示す。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション後にタウタンパク質の捕捉を誘導し、簡単な遠心分離によって該タンパク質を沈降させる。さらに、至適沈殿は０．５ｍＭ〜４０ｍＭで観察される。
【実施例４】
【０１６４】
実施例４：薬剤Ｉ又は薬剤ＩＩを用いた方法によるβ−アミロイドペプチドの検出
以下：
−１０μｇの４０アミノ酸長合成β−アミロイドペプチド（β−Ａペプチド１−４０；配列番号５）又は１０μｇの４２アミノ酸長合成β−アミロイドペプチド（β−Ａペプチド１−４２；配列番号６）、
−アミロイドペプチドに特異的なモノクローナル抗体（６Ｅ１０抗体（Ｓｉｇｍａ））、
−薬剤Ｉとして、ストレプトマイシン及びＴＥＴを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が３５／１に等しくなるように、あるいはリファンピシン及びイソニアジドを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が２／１、９／１若しくは３５／１に等しくなるように、及び
−薬剤ＩＩとして、Ｃ６Ｓを終濃度１ｍＭで
使用する以外は、上記の実施例２及び３に示した手順を繰り返す。
【０１６５】
遠心ペレットについて、ウエスタンブロッティングを行ない、これを実施例２に記載のようにして解析した。
【０１６６】
結果を、以下に規定する図５〜８に報告する。
【０１６７】
図５は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したβ−アミロイドペプチドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図５Ｂ）のＸ線写真の概略図（図５Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１６８】
図６は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図６Ｂ）のＸ線写真の概略図（図６Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１６９】
図７は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したβ−アミロイドペプチドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図７Ｂ）のＸ線写真の概略図（図７Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１７０】
図８は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図８Ｂ）のＸ線写真の概略図（図８Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１７１】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉ又はＩＩの濃度は、以下に規定する表４及び５（図５及び７（表４）並びに図６及び８（表５）に相当する）に示すとおりである。
【０１７２】
【表４】
【０１７３】
【表５】
【０１７４】
先のとおり、結果は、β−アミロイドペプチド及びそのオリゴマーが、薬剤Ｉ又は薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、該ペプチドの沈殿を誘導する。
【０１７５】
さらに、図７に示されるように、常套的に使用されている抗体などのタンパク質薬剤では通常捕捉されない高分子量オリゴマー（マルチマー）であるレーン１が、薬剤ＩＩによって捕捉されて沈殿し、これは、このようなマルチマー形態に対するその有効性を証明する。したがって、薬剤ＩＩにより、モノマー形態とオリゴマー形態との両方を、これらを架橋させることなく回収することが可能になる（電気泳動の移動度において種々のバンドが観察される）。
【０１７６】
同様に、図８に示されるように、常套的に使用されている抗体などのタンパク質薬剤とは通常架橋しない高分子量オリゴマー（マルチマー）であるレーン５が、薬剤Ｉと架橋して沈殿し、これは、このようなマルチマー形態に対する有効性を証明する。また、さらに薬剤Ｉにより、あらゆるモノマー形態及びオリゴマー形態を架橋させることが可能になり、これは、比較的均一な高分子量領域（スメア）内のすべての抗原性βアミロイド画分の電気泳動の移動度によって実証される。
【実施例５】
【０１７７】
実施例５：β−アミロイドペプチド１−４２とｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンとの相互作用
５．１．解析手法
この解析は円偏光二色性によって行なう。
上記のような解析対象のβ−アミロイドペプチド（Ａβ４２とも示される）を、２．２×１０−４Ｍの濃度で、水中２０％のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の溶液に即時的に溶解し、β−アミロイドペプチドを構成する。ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅ．ら、２００３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５９（３７）：７３５７−７３６４に記載のようにして調製）を、１００μＭで５０ｍＭリン酸バッファーに溶解する。試料を、リン酸バッファー中の終濃度１０μＭのβ−アミロイドペプチド、すなわち最終容量５００μＬが得られ得るように調製する。ペプチド濃度／カリックスアレーン濃度の比は、１／０〜１／５で種々であり得る。
【０１７８】
ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンなしのβ−アミロイド対照は、２０％ＴＦＥ中２．２×１０−４Ｍ（５ｎｍｏｌ）のＡβ４２ストック溶液２２．５μＬ、４７７．５μＬの５０ｍＭリン酸バッファーで行なう。
【０１７９】
試料を、１８０〜２６０ｎｍの円偏光二色性で解析する。
【０１８０】
５．２．Ａβ４２ペプチドとｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンとの相互作用
このアッセイは、以下の表６に示すように、Ａβ４２ペプチド／カリックスアレーンの濃度比１／１、１／２及び１／５で行なう。対照は、カリックスアレーンなしのＡβ４２ペプチドの試料（１／０）である。溶液は、最終容量５００μＬに調製する。Ａβ４２ペプチドは、４５１４ｇ／モルのモル質量を有する。ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンは、７４４ｇ／モルのモル質量を有する。
【０１８１】
【表６】
【０１８２】
結果を図９に示す。この図は、波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフであり、結果は、カリックスアレーンなしの対照（Ａｂ４２）について濃度比１／１、１／２、１／５で得られたものである。
【０１８３】
図９の曲線は、最初はα−ヘリックスの形態である該ペプチドが、ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンの存在下で、カリックス［４］アレーンの使用濃度とは無関係に、低濃度（１／１）又は高濃度（１／５）のいずれにおいても、３つの構造α−ヘリックス（２１０ｎｍ）、β−シート（２２０ｎｍ）及び非周期構造（２００ｎｍ）をとることを示す。α−ヘリックス構造は、可視構造の３７％より多く、β−シートは２６％より多く、最後に非周期構造は３８％を示す。
【０１８４】
本発明者らは、濃度比１／１で、該構造のモル楕円率が１／２の場合と比べて増大することを観察している。他方、２１０ｎｍの領域内波長付近では、１／５の濃度比のＡβ４２ペプチドのスペクトルは、１／１のものに近く、該領域を超えると１／２のものに近い。
【０１８５】
このような変動は、該スペクトルにおいて観察された有意な構造変形による薬剤ＩＩとβ−アミロイドペプチドとの分子相互作用を示す。
【実施例６】
【０１８６】
実施例６：電気スプレイ型の質量分析計によるβ−アミロイドペプチド１−４０とｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとの複合体形成の試験
６．１．解析手法
β−アミロイドペプチド（Ａβ４０ともいう）及び種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（ｎ＝４、６、８）（Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅ．ら、２００３（前掲）に記載のようにして調製）を、１００μＭの濃度で、１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中にて可溶化させる。試験対象のβ−アミロイドペプチドの溶液を、ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンの溶液と即時的に混合する。試料を、電気スプレイ型の質量分析計内に直接注入する。
【０１８７】
６．２．Ａβ４０ペプチドと種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとの複合体形成の試験
１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中１０μＭのペプチドＡβ４０（Ｍｗ＝４４３０ｇ／ｍｏｌ）のストック溶液を調製する。種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（ｎ＝４：ＳＣ４ Ｍｗ＝７４４ｇ／ｍｏｌ；ｎ＝６：ＳＣ６ Ｍｗ＝１１１６ｇ／ｍｏｌ；ｎ＝８：ＳＣ８ Ｍｗ＝１４８８ｇ／ｍｏｌ）を、１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中１００μＭで可溶化させる。
【０１８８】
１００μＬの１００μＭペプチドＡβ４０溶液を、１００μＬのｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン１００μＭ溶液と混合する。試料を、電気スプレイ型の質量分析計内に即時的に注入する。
【０１８９】
得られた結果を図１０に示す。この図は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０との反応後のペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【０１９０】
これらの結果は、ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとＡβ４０ペプチドとの複合体形成に特徴的なピークを示す。対照は、大過剰に存在する（これがピークの説明となる）ことが注目され得る。
【実施例７】
【０１９１】
実施例７：β−アミロイドペプチド１−４２とコンドロイチン−６−硫酸との相互作用
薬剤ＩＩとして、コンドロイチン−６−硫酸（Ｓｉｇｍａ）を使用したこと以外は、上記実施例５に記載の手順を繰り返した。
【０１９２】
結果を図１１に示す。この図は、カリックスアレーンなしの対照（Ａｂ４２）について濃度比１／１及び１／５での、波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１９３】
図１１において得られた結果は、Ａβ４２スペクトルが、２０１ｎｍに第１、及び２２６ｎｍに第２の２つの負の最小ピークを示していることを示す。この合成β−アミロイドペプチドは、一部が非周期構造であるα−ヘリックス構造の形態をとる。
【０１９４】
コンドロイチン−６−硫酸の存在下において、Ａβ４２のものと等しい濃度では、該ペプチドの構造は変化する。３つの構造は同様の割合で存在する。具体的には、α−ヘリックス（２１０ｎｍ）は３７％より多く存在し、非周期構造（２００ｎｍ）は２６％より多い。最後に、β−シートは２２０ｎｍにおいて見られる。
【０１９５】
コンドロイチン−６−硫酸の濃度がＡβ４２ペプチドのものより５倍大きく増大すると、後者の二次立体構造が変化し、本質的に非周期構造となる。
【０１９６】
結論として、アミロイドペプチドのものと等しい濃度のコンドロイチン−６−硫酸の存在下では、β−シートが見られるが、コンドロイチン−６−硫酸が高濃度では、この立体構造は非周期構造に置き換わる。
【０１９７】
このような変動は、該スペクトルにおいて観察された有意な構造変形による薬剤ＩＩとβ−アミロイドペプチドとの分子相互作用を示す。
【実施例８】
【０１９８】
実施例８：沈殿剤Ｉを用いた方法によるリン酸化タウタンパク質の検出
８．１ 解析手法
この解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７（２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従って行なう。
【０１９９】
ＰｈｏｓｐｈｏＴａｕ Ｅｌｉｓａアッセイは、Ｄｙｎｅｘマイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、３μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃヤギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２５ｍＭ ＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３を含有するバッファー中で、３時間２４℃にて結合させる。次いで、ウェルを、ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）カゼイン（１％）バッファー中で１時間２４℃にて不動態化し、次いで、２時間２４℃で、ＴＢＳカゼインバッファー中で希釈した３μｇ／ｍｌのＴａｕｌ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体及びＣＰ２７（ＡｐｐｌｉｅｄＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）抗体とともにインキュベートする。
【０２００】
標準及び脳抽出物を、このアッセイのための正常血漿プール中で希釈し、ウェル１つあたり８０μＬの割合で２連で入れる。検出抗体ＣＰ９（ＡｐｐｌｉｅｄＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＵＳ）を、２００μｇ／ｍｌのヒトアルブミン、２２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ及び０．１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＭを、クレブス−リンゲル炭酸塩バッファー中に含有するバッファー中で希釈する。この混合物２０μｌを各ウェルに添加し、６６時間２４℃でインキュベートする。結合ＣＰ９抗体を認識させるため、１％の正常ヒト血清（Ｂｉｏｃｅｌｌ）を含有するＴＢＳカゼインバッファー中０．２μｇ／ｍｌのビオチン化抗マウスＩｇＭヤギ抗体（Ｆ（ａｂ’）２）（Ａｃｃｕｒａｔｅ）を、２時間２４℃で添加する。該ビオチン化抗体を、ＴＢＳカゼインバッファー中で希釈し、４５分間２４℃でインキュベートした０．４μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出する。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳ）を、各ウェルに添加し、化学発光を照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０）にて読み取る。得られるデータは、組換えｔａｕ同等物においてアッセイされた濃度（ｐｇ／ｍｌ）である相対光単位（ＲＬＵ）の形態であり、試料のＲＬＵを標準曲線と関連させることにより得られる（濃度（ｐｇ／ｍｌ）の関数としてのＲＬＵ）。
【０２０１】
上記の工程ごとに、ウェルは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳバッファーで洗浄する。
【０２０２】
８．２ 薬剤Ｉ、ＴＥＴの存在下での検出
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤ＩとしてトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴを１００ｍｇ／ｍｌで用いて行なう。
【０２０３】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２０４】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２０５】
図１２に、アルツハイマー（ＡＤ＋）又は非アルツハイマー（ＡＤ−）患者由来の脳抽出物（血漿中に添加）に関して得られた結果をまとめる。結果は、１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴの不在下（ＮＴ）又はこれによる処理及び２つのペレット及び上清み画分の解析後に得られたものである。
【０２０６】
結果は、リン酸化タウタンパク質が、薬剤Ｉ、ＴＥＴで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。
【０２０７】
８．３ 薬剤Ｉストレプトマイシンの存在下での検出
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを種々の濃度で用いて行なう。
【０２０８】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２０９】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２１０】
図１３に、アルツハイマー（ＡＤ＋）患者由来の脳抽出物（血漿中に添加）に関して得られた結果をまとめる。結果は、種々の濃度のストレプトマイシンの不在下（ＮＴ）又はこれによる処理及び２つのペレット及び上清み画分の解析後に得られたものである。
【０２１１】
結果は、リン酸化タウタンパク質が、低濃度の薬剤Ｉストレプトマイシンで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉでの処理の不在下の同じ試料の解析と比べたときの、検出の増大によって反映される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。しかし、タンパク質が上清み中に残存しているため、沈殿は完全でないことがわかる。薬剤Ｉの量の増大により、５００ｍｇ／ｍｌの濃度では、上清み中のタンパク質の存在を排除することが可能になる。この場合、沈殿したタンパク質は、ペレット中において、ＥＬＩＳＡ手法ではもはや検出可能でなくなる。ウエスタンブロッティングによる解析（データ示さず）により、該タンパク質が実際に凝集形態で存在することの確認が可能となった。抗体との前記凝集形態を検出するため、各タンパク質のエピトープを再露出させるための適当な取込みバッファーが必要である（８．４参照）。
【０２１２】
８．４ 薬剤Ｉストレプトマイシンの存在下での検出：取込みバッファーの採用
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを５００ｍｇ／ｍｌで用いて行なう。
【０２１３】
試料はＳＤＳ（１％最終）で処理又は未処理とする。
【０２１４】
試料と薬剤Ｉとを、ＳＤＳの存在下又は不在下で接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２１５】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌの種々の溶液：
−１％ ＳＤＳ
−グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）
−１Ｍ尿素
−１％ ＳＤＳ＋グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）
−１％ ＳＤＳ＋１Ｍ尿素
−グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）＋１Ｍ尿素
−１％ ＳＤＳ＋グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）＋１Ｍ尿素
中に入れる。
【０２１６】
次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２１７】
結果（図１４）は、沈殿工程中ＳＤＳの不在下では、タンパク質の検出は至適でないことを示す。
【０２１８】
沈殿をＳＤＳの存在下で行なうと、結果は、使用する懸濁バッファーの型に応じて異なる。この場合も、取込みバッファー中のＳＤＳの存在は不可欠である。最良の２つの組合せはＳＤＳ−グアニジン、及び、さらに良好なＳＤＳ−グアニジン−尿素であり、これは、より良好な検出強度を可能にする。次いで、アルツハイマー陽性（ＰＡＤ＋）試料は、アルツハイマー陰性（ＰＡＤ−）試料又は非血漿添加（Ｐ）から完全に解離される。沈降ペレット中におけるその存在により、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。
【実施例９】
【０２１９】
実施例９：沈殿剤Ｉを用いた方法によるα−シヌクレインタンパク質の検出
９．１ 解析手法：タンパク質ゲル及びウエスタンブロッティング
解析する試料を、ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー）（５０／５０ｖ／ｖ）中で１００℃にて５分間変性させる。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下、１２％ポリアクリルアミド一次元電気泳動ゲル上に載せる。泳動後、２つの選択肢を採用する。
【０２２０】
＊タンパク質ゲルを、ゲルコードブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により、振とうしながら室温にて一晩クマシーブルーで染色する。蒸留水中での洗浄後、ゲルを乾燥用溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で、振とうしながら室温で１５分間インキュベートし、次いで、２枚のセロファンシート間で少なくとも一晩室温で乾燥させる。
【０２２１】
＊この解析は、ウエスタンブロッティング手法（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５）に従って行なう。タンパク質をニトロセルロース膜上に転写し、室温で１時間、Ｓｙｎタンパク質２１１（Ｚｙｍｅｄ）に特異的な抗体を用いて免疫ブロットする。二次検出抗体は、マウス免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を認識し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）である。膜は、工程ごとに、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％ｗ／ｖ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、次いで、Ｔｗｅｅｎ２０なしのＰＢＳ中で洗浄する。シグナルをｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた化学発光によって検出し、ラジオグラフィー膜（Ｐｉｅｒｃｅ）上で可視化する。
【０２２２】
９．２ 薬剤Ｉの存在下での検出
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した１μｇの組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシン又はトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴのいずれかを種々の濃度で用いて行なう。
【０２２３】
該組換えタンパク質と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２２４】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのＳＤＳバッファー中に入れる。変性後、すべての画分をウエスタンブロッティング手法によって解析する。
【０２２５】
図１５は、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られた染色後（図１５Ａ）及びウエスタンブロッティング後（図１５Ｂ）のタンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す（レーン２〜５：ペレット、８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０２２６】
図１６は、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られた染色後（図１６Ａ）及びウエスタンブロッティング後（図１６Ｂ）タンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す（レーン２〜５：ペレット、８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０２２７】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉの濃度は、以下の表７及び８に示すとおりである。
【０２２８】
表７：図１５
【０２２９】
【表７】
【０２３０】
表８：図１６
【０２３１】
【表８】
【０２３２】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、ストレプトマイシン又はＴＥＴのいずれかの薬剤Ｉで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＳｙｎタンパク質の沈殿を誘導する。しかし、上清み画分中にタンパク質が見られるため、この沈殿は完全ではない。それでもなお、この濃縮は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡアッセイにおけるその検出を可能にするのに充分である。
【０２３３】
また、この沈殿は、血漿タンパク質が主に上清み中に見られるため、比較的特異的であることが注目される（図１５Ａ及び１６Ａ、レーン７〜１２）
【実施例１０】
【０２３４】
実施例１０：沈殿剤ＩＩを用いた方法によるα−シヌクレインタンパク質の検出
１０．１ 解析手法：タンパク質ゲル及びウエスタンブロッティング
この手法は、実施例９に記載のものと同じである。
【０２３５】
１０．２ 解析手法：ＥＬＩＳＡ
この解析は、慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法：ヒトα−シヌクレインＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＫＨＢ００６１）を供給元の推奨に従って行なう。
【０２３６】
１０．３ 薬剤Ｉの存在下での検出Ｉ
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した１μｇの組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤ＩＩとして、カリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノ−エチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓとして知られている）を用いて行なう。このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、０〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲を用いたこと以外は、先の実施例で示したようにして行なう。
【０２３７】
図１７は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたタンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１７Ａはペレット画分に相当し、一方、図１７Ｂは上清みに相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み、レーン９は、未処理組換えタンパク質に相当する。
【０２３８】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表９及び１０に示すとおりである。
【０２３９】
表９：図１７Ａ
【０２４０】
【表９】
【０２４１】
表１０：図１７Ｂ
【０２４２】
【表１０】
【０２４３】
結果は、１０ｍｇ／ｍｌの前の濃度から、血漿タンパク質が、排他的にペレット中に見られることを示す（該タンパク質ゲルの検出限界内）。
【０２４４】
図１８は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーから得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１８Ａはペレット画分に相当し、一方、図１８Ｂは上清みに相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は、分子量マーカーを含み、レーン９は、未処理組換えタンパク質に相当する。
【０２４５】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表１１及び１２に示すとおりである。
【０２４６】
表１１：図１８Ａ
【０２４７】
【表１１】
【０２４８】
表１２：図１８Ｂ
【０２４９】
【表１２】
【０２５０】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から捕捉されたという事実が証明される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間インキュベーション後、組換えＳｙｎタンパク質の捕捉を誘導するが、この場合、予期に反してＩＩ型の薬剤では、この捕捉により簡単な遠心分離によるタンパク質の沈殿が可能になる。しかし、タンパク質が上清み画分中に見られるため、この捕捉は完全ではない。ペレット中に見られるタンパク質の最大量を、１０〜５０ｍｇ／ｍｌのカリックスアレーン濃度で調べる。
【０２５１】
しかし、この濃縮は、臨床検査室で常套的に使用され得るＥＬＩＳＡアッセイにおけるその検出を可能にするのに充分である。
【０２５２】
１０．４ 薬剤ＩＩの存在下での検出感度
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した一連の組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノ−エチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓとして知られる）を用いて行なう。このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、濃度を５０ｍｇ／ｍｌとしたこと以外は、先の実施例に示すようにして行なう。
【０２５３】
図１９は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーから得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１９Ａはペレット画分に相当し、一方、図１９Ｂは上清みに相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む。
【０２５４】
電気泳動レーンに対するに対するタンパク質の濃度は、以下の表１３及び１４に示すとおりである。
【０２５５】
表１３：図１９Ａ
【０２５６】
【表１３】
【０２５７】
表１４：図１９Ｂ
【０２５８】
【表１４】
【０２５９】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、２５ｎｇ／ｍｌの感度で、薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが捕捉されたという事実が証明され、この場合、試験試料容量からの沈殿に好ましい条件がもたらされた。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間インキュベーション後、組換えＳｙｎタンパク質の捕捉を誘導し、簡単な遠心分離によってその濃縮を促進する。タンパク質が上清み画分中に１００ｎｇ／ｍｌの濃度まで見られないため、この捕捉は完全である。これらの結果は、ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例１０参照）（図２０）により確認され、このとき、２５ｎｇ／ｍｌの濃度が、上清みと比べてペレットにおいて有意に検出される。
【実施例１１】
【０２６０】
実施例１１：薬剤ＩＩの存在下でのタウタンパク質の検出
解析手法：
この解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７（２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従い、捕捉に通常使用される抗体の代わりにカリックスアレーンを用いて行なう。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＮＨＳ活性化マイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、カリックスアレーンを、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で２時間、室温で結合させる。蒸留水で３回洗浄後、プレートを３７℃で１５分間真空乾燥させる。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルの０．５％乳分含有ＰＢＳで、３７℃にて１時間不動態化させる。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で３回洗浄後、プレートの使用の準備をする。
【０２６１】
アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の脳抽出物を、２００μｇ／ｍｌのヒトアルブミン、２２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ及び０．１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＭをクレブス−リンゲル炭酸塩バッファー中に含有するバッファーで希釈する。１〜１００００ｎｇの濃度を試験する。これらの希釈液１００μｌを３７℃で１時間３０分間インキュベートする。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー中で３μｇ／ｍｌの濃度に希釈したタウタンパク質Ｔ１４（Ｚｙｍｅｄ）に特異的な１００μｌのマウスモノクローナル抗体を、３７℃で１時間インキュベートする。
【０２６２】
結合された抗Ｔ１４抗体を認識させるため、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー中、０．５μｇ／ｍｌの濃度で、４５分間３７℃にて使用する。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳ）を各ウェルに添加し、化学発光を照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０）にて読み取る。得られるデータは相対光単位（ＲＬＵ）の形態である。上記の工程ごとに、ウェルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファーで洗浄する。
【０２６３】
図２１の結果は、タウタンパク質が、１ｎｇ／ｍｌの濃度までのカリックスアレーンよって完全に捕捉されることを示す。この捕捉により、ＥＬＩＳＡアッセイ形式において特異的抗体での検出可能になる。当業者には、高濃度のタンパク質で「フック効果」が注目されよう。この現象は、専門技術者によって行なわれる最適化の際に容易に解決され得る。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）アルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）で得られた差により、このアッセイを研究室で日常的に使用することが可能になる。
【実施例１２】
【０２６４】
実施例１２；薬剤Ｉ及びＩＩの存在下でのｓｙｎタンパク質の検出
解析手法
第１の解析は、慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法：ヒトα−シヌクレインＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＫＨＢ００６１）を供給元の推奨に従って行なう。
【０２６５】
第２の解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７ （２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従い、捕捉に通常使用される抗体の代わりにカリックスアレーンを用いて行なう。
【０２６６】
ＥＬＩＳＡアッセイは、ＮＨＳ活性化マイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で２時間、室温で結合させる。蒸留水で３回洗浄後、プレートを３７℃で１５分間真空乾燥させる。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルの０．５％乳分含有ＰＢＳで、３７℃にて１時間不動態化させる。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で３回洗浄後、プレートの使用の準備をする。
【０２６７】
このアッセイは、アルツハイマー病の患者（２０μｇ／ｍｌ）由来の脳抽出物及びヒト血漿プール中に添加した組換えα−シヌクレインタンパク（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）（２５ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なう。
【０２６８】
試料を薬剤Ｉ（５００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の存在下で沈殿させる。
【０２６９】
試料と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２７０】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５μｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中に入れ、場合によっては９０℃で１分間加熱し、次いで２２５μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー中で希釈する。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２７１】
図２２は、薬剤Ｉでの沈殿及び抗体捕捉による慣用的ＥＬＩＳＡ手法による検出後に得られた結果を示す（第１の解析；薬剤ＩＩの使用なし）。結果は、組換えタンパク質が薬剤Ｉでの沈殿後、血漿中に検出されていることを示す。しかし、凝集形態内のその沈殿では至適検出は可能でない。また、タンパク質が上清み中に検出され、モノマー形態が該抗体によって完全に捕捉されるため、この沈殿は完全ではない。他方において、脳抽出物では、タンパク質が主に凝集形態であり、未処理試料中での検出が弱く、薬剤Ｉでの処理後、この実施例の操作条件下では、タンパク質はペレットにも上清みにも検出されないことがすぐにわかる。
【０２７２】
図２３は、薬剤Ｉでの凝集形態での沈殿及び薬剤ＩＩでの捕捉による慣用的なＥＬＩＳＡ手法及び検出後に得られた結果を示す。結果は、組換えタンパク質及び脳抽出物が、未処理であってもほとんど又は全く検出されないことを示す。他方において、薬剤Ｉの作用後、捕捉ツールとして薬剤ＩＩを使用する利点は、非常によくわかる。実際、組換えタンパク質と脳抽出物との両方の場合において、Ｓｙｎタンパク質はその凝集形態で、沈殿ペレット中に完全に検出される。さらに、加熱工程により、得られるシグナルを改善することができる。
【０２７３】
したがって、薬剤Ｉ／薬剤ＩＩの組合せにより、血漿などの試料中のα−シヌクレインタンパク質の検出を改善することが可能になると結論付けることができる。
【実施例１３】
【０２７４】
実施例１３：薬剤Ｉ及びＩＩの存在下でのリン酸化タウタンパク質の検出
この解析手法は、抗体を、実施例１２に記載のカリックスアレーン（薬剤ＩＩ）に変えたこと以外は、実施例８に記載のものと同じである。使用した検出抗体は、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘで開発されたモノクローナル抗体であり、１μｇ／ｍｌの濃度のペルオキシダーゼにコンジュゲートさせて使用する。このモノクローナル抗体は、２３１位がリン酸化されたタウタンパク質から誘導されたリン酸化ペプチドでの免疫処置後に得た。
【０２７５】
使用した試料は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）由来の正常患者由来の血漿プールに添加した脳抽出物である。このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物及び薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを種々の濃度で用いて行なう。
【０２７６】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を６０分間３７℃でインキュベートする。次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２７７】
図２４の結果は、未処理血漿試料中でのリン酸化タウタンパク質の検出が困難であることを示す。他方において、薬剤Ｉでの凝集後、捕捉を薬剤ＩＩにより行なうと、ＥＬＩＳアッセイでのその検出がペレットにおいて可能になることは明白である。したがって、薬剤Ｉ／薬剤ＩＩの組合せにより、血漿などの試料中でのリン酸化タウタンパク質の検出を改善することが可能になると結論付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１−Ａ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す。
【図１−Ｂ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ａの続き）。
【図１−Ｃ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ｂの続き）。
【図１−Ｄ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ｃの続き）。
【図２−Ａ】図２−Ａは、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図２−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図３−Ａ】図３−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図３−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図４−Ａ】図４−Ａは、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図４−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図５−Ａ】図５−Ａは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図５−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図５−Ｂ】図５−Ｂは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図６−Ａ】図６−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図６−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図６−Ｂ】図６−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図７−Ａ】図７−Ａは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図７−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図８−Ａ】図８−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図８−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図８−Ｂ】図８−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図９】図９は、種々の濃度の薬剤ＩＩ ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４２での処理後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【図１０】図１０は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０で処理したペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【図１１】図１１は、種々の濃度の薬剤ＩＩコンドロイチン−６−硫酸、薬剤ＩＩでの処理なしでの対照であるＡｂ４２との反応後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【図１２】図１２は、アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）由来又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の、未処理（ＮＴ）又はトリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）である薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（ｐｇ／ｍｌ、当量（ｅｑ）の組換えタウタンパク質でアッセイ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【図１３】図１３は、アルツハイマー病の患者、未処理（ＮＴ）又は種々の濃度（ｍｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（当量Ｔａｕ、ｐｇ／ｍｌ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【図１４】図１４は、処理なし又はＳＤＳ１％での処理及びストレプトマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）での沈殿後の、リン酸化タウタンパク質の検出に対する種々の取り込みバッファーの効果を示すグラフ表示である。結果は、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＰＡＤ−）又は血漿無添加（Ｐ）の脳抽出物を用いて得たものである。Ｇｎｄ：グアニジン；ＳＮ：上清み；ｓｔｐ：ストレプトマイシン。
【図１５−Ａ】図１５−Ａは、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【図１５−Ｂ】図１５−Ｂは、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後のゲルのＸ線写真の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【図１６−Ａ】図１６−Ａは、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【図１６−Ｂ】図１６−Ｂは、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後のゲルのＸ線写真の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【図１７−Ａ】図１７−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１７−Ｂ】図１７−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１８−Ａ】図１８−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１８−Ｂ】図１８−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１９−Ａ】図１９−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【図１９−Ｂ】図１９−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【図２０】図２０は、血漿中に存在し、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）で処理したＳｙｎタンパク質のある濃度範囲（ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。光学密度は、ペレット画分及び上清み画分にて読み取る。
【図２１】図２１は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を捕捉相に用いたサンドイッチ型のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）の脳抽出物由来の種々の量（ｎｇ）のタンパク質を試験する。得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【図２２】図２２は、特異的抗体を捕捉相に用いたサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加し、ストレプトマイシンである薬剤Ｉで沈殿させる。沈殿後、ペレット（Ｃ）を加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。ＮＴは未処理、Ｃはペレット及びＳは上清みを意味する。
【図２３】図２３は、薬剤Ｉ（ストレプトマイシン）での沈殿及び薬剤ＩＩ（カリックスアレーン）を用いた捕捉によるＥＬＩＳＡによる検出後のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加する。薬剤Ｉでの沈殿後、ペレットを加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。
【図２４】図２４は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）脳抽出物を用いて行ない、未処理又はストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した正常患者由来の血漿プール中に添加したリン酸化タウタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。捕捉相は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）からなる。ペレット画分及び上清み画分において得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、これまで非感染性と認識されている神経変性疾患の分野に関し、特に、このような疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢関連疾患の増加により、人々への影響が増大しており、その平均年齢は、前世紀において大きく増大した。このような疾患の一部は脳に影響を及ぼし、あらゆる認知機能に影響を及ぼすようである。また、一部のこのような疾患では、感覚運動機能が相当影響され得る。これらは、「神経変性」疾患であり、これまで非感染性と認識されており、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、タウオパシー、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病及び血管性痴呆などがある。
【０００３】
したがって、例えば、世界中ではアルツハイマー病患者が２千５百万人を超える。フランスでは、約８０万人がアルツハイマー病又は関連疾患に罹患している。また、人口統計学的老齢人口は倍加しており、この数は増大している。既に１６万５千人程が、毎年新たに罹患している。アルツハイマー病は、心臓血管の病気、癌及び脳卒中に続き、一般的な死亡原因の第４位である。この神経変性痴呆は、進行的及び不可逆的に記憶障害（健忘症）及び認知機能（失語症、失行症、失認症）の喪失をもたらす。
【０００４】
アルツハイマー病と同様、主な非感染性神経変性疾患は、循環性形態（凝集体形成性循環タンパク質形態）で存在し得、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与している非感染性タンパク質からなる細胞外及び／又は細胞内沈着物を特徴とする。このようなタンパク質では、補因子若しくは酵素によって、あるいはタンパク質沈着物の形態の自発的凝集を促進させる遺伝子変異によって誘導される自発的な立体構造の変形が起こり得、このような変形により、タンパク質の型及び生理学的状況に依存して脳の種々の領域において蓄積がもたらされる（非特許文献１）。
【０００５】
したがって、アルツハイマー病の場合、凝集されるタンパク質は、主にタウタンパク質及びＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）タンパク質の断片、β−アミロイドペプチド（例えば、β１−４０、β１−４１、β１−４２）である。タウタンパク質はまた、β−アミロイドタンパク質は存在しない脳内への凝集タウタンパク質の沈着と関連している非アルツハイマー型痴呆であるタウオパシーと関連している。ＡＰＰタンパク質及び／又はそのβ−アミロイドペプチド断片はまた、血管性痴呆と関連しており、これは、アミロイド凝集体の血管周囲の沈着を特徴とする。中心灰白質核における神経変性を特徴とするパーキンソン病の場合は、関連するタンパク質はパーキンであり、特に家族性の形態では、α−シヌクレインもまたそうである。また、後者は、パーキンソン型痴呆にも関与しており、これは、感覚運動問題に加えて起こり得る。α−シヌクレインはまた、レヴィー小体痴呆もと関連している。後者は、特に、前頭皮質領域内での凝集したα−シヌクレインタンパク質の沈着を特徴とし、これにより、神経変性がもたらされ、認知機能に影響が及び、痴呆症候群がもたらされる。ハンチントン病の場合、凝集するタンパク質はハンチントンである。したがって、神経毒性タンパク質凝集体の脳へのこの沈着現象は、ほとんどの神経変性疾患において見られるが、「プリオン」疾患とは異なり、神経変性疾患と関連するタンパク質は感染性の性質を示さず、したがって伝染性ではない。実際、「プリオン」タンパク質は、伝染性海綿状脳症を媒介する因子であり、この疾患は、病気個体において単離された病原性プリオンの注射によって伝染し得る。これはまた、遺伝的起源のプリオン疾患、例えば、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｔｓｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）（ＧＳＳ）病などについてもそうであり、その病因プリオンは、宿主の遺伝子変異によって生じるが、この病因タンパク質は、いったん形成されると、プリオン疾患に特異的な感染性の性質を獲得する（非特許文献２）。「プリオン疾患」は、病原性プリオンタンパク質が接種された、又はこれに汚染された個体、あるいは、正常なタンパク質の病理的変換を起始させ、したがって「内因性」感染をもたらし得る遺伝子変異を有する個体における病原性プリオンタンパク質の量の緩緩な増加に起因する。
【０００６】
非感染性神経変性疾患と関連するタンパク質は、特に、全身性注射で正常な個体に疾患が伝染され得ないことで後者とは異なる。同様に、このような非感染性神経変性疾患に由来する組織要素では該疾患は伝染され得ず、それにより、後者は感染性疾患から除外され、プリオン疾患と異なる。
【０００７】
このような非感染性神経変性疾患の現在の診断は、ほとんどが、画像に基づくものであり、臨床検査及び神経心理学検査で補完する。これは、難儀で高価な手順であり、いくつかの診断工程を必要とし、いずれも生物試料では行なわれない。場合によっては、遺伝子変異の起源は、このようなタンパク質の１種類の異常な凝集が原因であり、ＤＮＡ配列レベルでの遺伝子診断が可能であるが、これは、「非遺伝子」形態に関しては一般的ではない。
【０００８】
したがって、このような疾患に対するより容易でより速やかな診断が必要である。したがって、ヒトにおける生物試料における診断は、極めて重要となる。特に、その免疫学的検出によって、簡便でさらにより容易な診断が可能となり得、病変が広がる前に治療工程が開始されるという点で、明白な利点を伴う（非特許文献１）。
【０００９】
種々のグループにおいて、かかる生物試料での検出を達成するための試みがなされた。したがって、特許文献１には、アルツハイマー病に罹患した患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、β−アミロイドペプチドの量の測定を、任意選択でタウタンパク質の量の測定と組み合わせ、所定の値と比較することによる診断が記載されている。この方法は、ＣＳＦの場合でしか実証されておらず、試験の特異性を改善するために、β−アミロイドペプチドの検出をタウタンパク質のアッセイで補完しなければならないという欠点を有する（非特許文献３）。
【００１０】
現時点では、このような非感染性神経変性疾患の生物学的診断のための常套的な血液試験は存在しない。例えば、タウタンパク質は、ニューロンでのみ産生され、ＣＳＦ中を通過後、血中では低濃度となるため、血中で検出するのは困難である。さらに、後者の場合、タウタンパク質は、程度の差はあれ、既存の試験によって充分良好に検出される。ＡＰＰタンパク質及びその循環性断片（例えば、前駆体タンパク質）のアッセイは血小板において行なわれ得るが、多くの凝集体形成性循環タンパク質形態が血漿タンパク質に結合し、これによりエピトープをマスクすることができ、したがって、これら同エピトープに指向させた抗体による検出が不可能及び／又は捕捉が不可能となり得るため、これも依然として問題がある。したがって、マスクされたエピトープは、使用する抗体によって認識されるものであるため、慣用的な免疫酵素的手順である「サンドイッチＥＬＩＳＡ」型を使用することは不可能である。さらに、抗体は、非常に大きなタンパク質であり、もし、凝集形態の場合、及び、血漿リガンドとの会合形態の場合のように、凝集体形成性循環タンパク質形態の分子性部位が３次元網目内に内在していると、これに接近することができない。小分子のみが、このような凝集体形成性循環タンパク質形態内の増大量のタンパク質と相互作用することができ、一方、抗体は、凝集されておらず、血漿リガンドとも会合していない遊離形態、すなわち、このような神経変性疾患と関連するタンパク質の大部分の生理学的画分を、より容易に検出する。したがって、可変的であり、そのため、その重要性が証明できない画分は、標準的な免疫学的試験ではアッセイされ得ない（非特許文献４）。
【００１１】
その結果、非感染性神経変性病理と関連する可溶性及び／又は循環性形態のタンパク質を捕捉、濃縮及び／又は検出する困難さに対する先行技術の諸方法が絶えず出現している。時として、各型のタンパク質に適した方法が想定されるが、このような方法は、大規模な常套試験に移行することが困難であるという事実に加え、このようなあらゆるタンパク質、又は診断が許容され得る充分な数のタンパク質に共通する単一の方法の実施を可能にすることができない（非特許文献４）。
【００１２】
このようなタンパク質を回収することができ、抗体認識を伴うことなく該タンパク質を生体液から分離することができ、次いで、任意選択で、該タンパク質を、考えられ得るリガンドと解離するように、免疫酵素アッセイに適した表面上に固定されるのに適合する条件下で処理することができ、続いて、最後に該タンパク質を抗体で同定することができる方法により、このような種々のタンパク質の有効で同等な検出を行なうことが可能となり得る。かかる条件は、このようなあらゆるタンパク質及びその種々の循環性形態のより有効な単離を可能にでき、さらに実際の生物医学的パラメータのより良好な相関性、したがって、このような疾患のそれぞれの診断をもたらすアッセイの解釈を伴うものでさえあり得る。
【００１３】
特許文献２には、亜鉛などの重金属カチオンを用いて、β−アミロイドペプチドの形成を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が記載されている。しかし、該タンパク質上の亜鉛結合部位の数が少ないことにより、この手法では、低速遠心分離によって沈降させ得る多分子網目を形成させることでは、β−アミロイドペプチドを凝集及び濃縮させることができない。
【００１４】
特許文献３には、プリオン、アミロイド及びタウタンパク質の病理学的形態の選択結合のための方法が記載されている。特に、硫酸デキストランによるタウタンパク質の凝集形態の捕捉は、この出願書類の実施例の１つに記載されている。この文献には、凝集剤の使用は記載されておらず、硫酸デキストランは、グリコサミノグリカンファミリーにも大環状分子ファミリーにも属しない。
【特許文献１】特許出願ＥＰ７１３０９５号
【特許文献２】米国特許第６３６５４１４号
【特許文献３】特許出願ＷＯ０３／０７３１０６号
【非特許文献１】Ｅｌ−Ａｇｎａｆ Ｏら、２００３，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２：４６１−４６２
【非特許文献２】Ｌａｎｔｏｓ ＰＬ．，１９９２，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（１）：１−１１
【非特許文献３】Ｓｊｏｇｒｅｎ Ｍら、２００３，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，３３２：１−１０
【非特許文献４】Ｋｕｏ Ｙら、２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２６８：７５０−７５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、ここに、予想外にも、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体若しくは前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態の診断のための試験において使用することにより、単一の方法によって、このようなタンパク質形態を、現在使用されている方法では検出され得ない希釈及び条件下で検出することが可能になることを示した。このような２つの薬剤の単独又は組合せでの使用により、凝集体形成性循環タンパク質形態が、これら凝集体形成性タンパク質形態に特異的な結合パートナーに結合する能力が明白に改善され得るが、いかなる場合も該能力は抑制されない。かかる結合パートナーは、診断試験に使用される。
【００１６】
したがって、本発明の主題は、ヒト起源の生物試料において、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法であって、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び／又は、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法である。
【００１７】
本発明はまた、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出するための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体若しくは前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用に関する。
【００１８】
したがって、本発明の方法は、適用の点に関して簡単で普遍的であり、血液などの生物試料において、凝集体形成性循環タンパク質形態の性質及びその濃度とは無関係に、非感染性神経変性疾患の診断を行なうのに特に有用な方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の実施形態によれば、２つの薬剤、すなわち、
−中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び
−凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩ
を使用する。
【００２０】
表現「中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤」は、該薬剤の存在下で、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集をもたらすことができる、すなわち、当初の凝集体形成性循環タンパク質形態より大きいサイズのタンパク質塊をもたらすことができる、及び、簡単な遠心分離によってその速やかな沈降を許容することができる非タンパク質の性質の任意の分子を意味することが意図される。凝集は、実際には、低速（１００００ｇ）での遠心分離によって沈降され得る多分子網目の形成と規定する。
【００２１】
表現「凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤」は、該薬剤が天然に（すなわち、生物体内で）形成されるか、又は人工的に（すなわち、薬剤Ｉとの反応後に）形成されるかに関係なく、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体に結合することができる非タンパク質の性質の任意の分子を意味することが意図される。
【００２２】
表現「これまで非感染性と認識されている神経変性疾患」は、上記のような凝集体形成性循環タンパク質形態の細胞外及び／又は細胞内沈着物を特徴とする疾患を意味することが意図され、このような凝集体形成性循環タンパク質形態は、感染性タンパク質、すなわち伝染性タンパク質でない。したがって、クロイツフェルト−ヤコブ病又はウシ海綿状脳症などのプリオン疾患は、この定義から明白に除外される。
【００２３】
本発明の定義に含まれる疾患の一例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、タウオパシー、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病及び血管性痴呆が挙げられ得る。
【００２４】
本発明の検出方法を行なう生物試料は、少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の試料であり得る。
【００２５】
かかる試料の一例としては、脳、中枢神経系の組織、脾臓及び腸などの器官、また生体液、例えば、脳脊髄液、尿及び血液（後者が好ましい）並びに選択した生物試料を構成する血液が挙げられ得る。
【００２６】
中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉは、凝集機能を有するあらゆる非タンパク質分子である。このような薬剤はすべて、タンパク質薬剤とは異なり、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を定量的及び定性的に増幅させる特殊性を有する。
【００２７】
薬剤Ｉの一例としては、少なくとも１つの正の電荷を有する分子が挙げられ得る。塩基性官能基、例えば、グアニジニウム、ピリジニウム又はアンモニウムなどによって提供される正の電荷が好ましい。本発明の目的に好ましい少なくとも１つの正の電荷を有する分子は、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を、好ましくは非重合性親水性分子系内に有する分子である。
【００２８】
本発明の具体的な一実施形態によれば、前記薬剤Ｉは、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子である。
【００２９】
好ましくは、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子は、グアニジニウムを有するアミノグリコシド類から選択され、ストレプトマイシンが特に好ましい。
【００３０】
薬剤Ｉの一例としてはまた、主要な抗結核剤、例えば、リファンピシン、イソニアジド及びエタンブトールなどが挙げられ得、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００３１】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する薬剤Ｉは、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）、ビス−３−アミノプロピルアミン、テトラヒドロ塩酸スペルミン、セスキ硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ストレプトマイシンから選択される。好ましくは、薬剤Ｉは、ストレプトマイシン及びＴＥＴから選択される。
【００３２】
抗体などのタンパク質薬剤と比べ、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集を可能にし、これを増幅様式で試験対象の試料中に捕捉する薬剤Ｉの特有の特徴のため（より多くの形態の捕捉）、薬剤Ｉのみを、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出に使用することが可能である。
【００３３】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉと、好ましくは少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と一緒にする工程を含む、又は該工程からなることを特徴とする方法に関する。
【００３４】
もちろん、薬剤Ｉは、上記規定のとおりである。
【００３５】
凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩは、捕捉機能を有するあらゆる非タンパク質分子である。薬剤ＩＩの一例としては、大環状分子及びグリコサミノグリカンが挙げられ得る。
【００３６】
このような薬剤はすべて、タンパク質薬剤とは異なり、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を定量的及び定性的に増幅させる特殊性を有する。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、薬剤ＩＩは、大環状分子及びグリコサミノグリカンから選択される。
【００３８】
グリコサミノグリカンは、当業者に広く知られており、例えば、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８８に記載されている。
【００３９】
本発明の目的に適したグリコサミノグリカンの一例としては、例えば、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸及びケラタン硫酸が挙げられ得る。
【００４０】
用語「大環状分子」は、大員環を形成している一連の複数の環からなる化合物を意味することが意図される。
【００４１】
大環状分子は、当業者に知られている。非限定的な例としては、シクロファン、メタシクロファン、シクロデキストリン、シクロ（テトラクロモトロプ酸）、スフェランド及びシクロ［ｎ］ベラトリレンが挙げられ得る。
【００４２】
大環状分子は、ケージ効果によって、遊離形態又は凝集体形態のいずれかで、試験対象のタンパク質を捕捉可能であるという特別な利点を有する。
【００４３】
大環状分子は、当業者に知られている、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６に記載された手法にしたがって調製され得る。
【００４４】
本発明の方法に好ましい大環状分子は、メタシクロファンから選択され、カリックスアレーンが特に好ましい。カリックスアレーン化合物は、Ａｒｄｕｉｎｉ，Ａ．ら、１９９６，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，編集Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｌ．Ｍ．＆ Ｍｏｄｄｙ，Ｃ．Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ及びＤａ Ｓｉｌｖａら、２００１，Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１：１３５−１３８に記載の方法論に従って得られ得る。
【００４５】
好ましい一実施形態によれば、本発明の大環状分子は、下記一般式（Ｉ）：
【００４６】
【化１】
【００４７】
（式中、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基を表し、ここで、Ｐｏｌは、リン酸基、硫酸基、アミン基、アンモニウム基、カルボン酸基を表し、Ｒは以下に規定するとおりであり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素又はイオウ原子であり、
Ｒ５及び６は、各々独立して、存在しないか、又は水素原子、ＣＨ２若しくは以下に規定するＲ基を表すか、あるいは
Ｒ５及び６は一緒になって、酸素又はイオウ原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基又は酸素若しくはイオウ原子を表し、
ｍは、０又は１である整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は、分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖を表し、ここで、該鎖は、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有し、
ｎは３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、該単位の性質に応じて異なっていてよい）
に相当する。
【００４８】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、ベンゼン環の存在を特徴とする一連のｎ個の単位の形態であり、この環の置換基は、上記のその定義の範囲内で、それぞれ種々であり得る。
【００４９】
もちろん、式中の星印の存在は、環の形成のために必要な結合を表すことがあり得る。
【００５０】
分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖であって、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有する該鎖は、当業者に広く知られている。一例として、アルキル、アルケン、アリール及び飽和環（例えば、シクロヘキサンなど）が挙げられ得る。無極性基の一例はＣＦ３であり、極性基の一例は、上記規定の置換基Ｐｏｌである。
【００５１】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、下記式（Ｉａ）：
【００５２】
【化２】
【００５３】
（式中、
ｎは４〜８の整数であり、
各基Ｒ２は一緒になって、独立して、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは０〜６の整数であり、ｓは０〜６の整数である）を表す）
に相当する。
【００５４】
特に好ましい式（Ｉａ）の化合物は、２つの基Ｒ２が各々、硫酸基であり、ｎが４、６又は８であり、Ｒ７が水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基であり、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００５５】
好ましい一実施形態によれば、該大環状リガンドは、式中、ｎ＝６、Ｒ２＝硫酸基及びＲ７が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である一般式（Ｉａ）に相当する。
【００５６】
抗体などのタンパク質薬剤と比べ、試験対象の試料中、増幅様式で凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体の捕捉を可能にする（より多くの形態の捕捉）薬剤ＩＩの特有の特徴により、薬剤ＩＩのみを、凝集体形成性循環タンパク質形態の検出に使用することが可能である。
【００５７】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩと、好ましくは大環状分子又はグリコサミノグリカンと一緒にする工程を含む、又は該工程からなることを特徴とする方法に関する。
【００５８】
もちろん、薬剤ＩＩは、上記規定のとおりである。
【００５９】
薬剤Ｉ及びＩＩの量は、具体的な試料に応じて当業者により容易に決定され得る。したがって、例えば、ストレプトマイシンなどの薬剤Ｉの量は、５０〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌであり得る。
【００６０】
予想外にも、本出願人らは、本発明の方法において検出される凝集体形成性循環タンパク質形態は、薬剤Ｉ、特に少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する薬剤との結合のために、その側鎖が酸官能基、好ましくはカルボン酸官能基、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）若しくはグルタミン酸（Ｅ）、又は水素結合受容体官能基、例えば、セリン（Ｓ）若しくはアスパラギン（Ｎ）のいずれかを有するアミノ酸を含み、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）が、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に全体に少なくとも４回存在することを示した。好ましくは、２０アミノ酸以下のペプチド配列全体において４以上であるこれらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）の密度が、凝集体形成性循環タンパク質形態を構成するタンパク質の完全配列において少なくとも２回見られる。好ましくは、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）は、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に全体に少なくとも５回存在するか、又は１６アミノ酸以下の長さのペプチド配列内に少なくとも４回存在する。好ましくは、上記規定の密度は、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）より高密度である（１２アミノ酸以下の長さのペプチド配列において少なくとも５回に相当する）領域と関連している。また、同等の空間的距離での同等の官能基の密度により、タンパク質の一次構造において上記に規定したものを模倣する構造が構成され得る。
【００６１】
同様に、本出願人らは、薬剤ＩＩ、特に、カリックスアレーンなどの大環状分子との結合のために、凝集体形成性循環タンパク質形態は、最低３つの基本アミノ酸、好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）を、アミノ酸１２以下又は、さらに１５以下の長さのペプチド配列内に含むことを示した。また、同等の空間的距離での３つの等価な正の電荷の密度により、タンパク質の一次構造において上記に規定したものを模倣する構造が構成され得る。これは、例えば、１２又は、さらに１５のアミノ酸の配列に相当する３次元空間内のこれらのカチオン又はその機能的同等物が、アミノ酸からなるαヘリックスである該空間の一部分上に突出された立体構造であり得る。
【００６２】
本方法における生物試料への２つの薬剤Ｉ及び／又はＩＩの添加は、予想外にも、例えば凝集体形成性循環タンパク質形態に対する検出抗体を用いた凝集体形成性循環タンパク質形態の検出がなんら障害されないため、任意の順序で行なわれ得る。しかし、前記薬剤Ｉは前記生物試料に、薬剤ＩＩの前に凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集のために添加されることが好ましく、これは、本発明の具体的な一実施形態を構成する。
【００６３】
本発明の一実施形態によれば、該方法は、
ａ）凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために、前記薬剤Ｉを前記試料に添加し、これを沈殿させる工程、
ｂ）このようにして得られた混合物を、凝集体形成性循環タンパク質形態の前記凝集体を捕捉するために薬剤ＩＩと一緒にする工程、及び
ｃ）凝集体形成性循環タンパク質形態の存在を顕在化する工程
を含むか、又は該工程からなる。
【００６４】
好ましくは、凝集体形成性循環タンパク質形態の沈殿を促進させるため、薬剤Ｉの添加後、反応媒体の中程度の加熱を、２５〜４５℃の温度（３７℃の温度が好ましい）で行なう。
【００６５】
薬剤Ｉの存在下で形成される凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体は、薬剤ＩＩとの反応前に、反応媒体から分離され得る。分離方法は、当業者に知られている任意の沈殿物分離方法によって行なわれ得る。一例として、凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体は反応媒体から、遠心分離又は膜分離によって分離され、次いで、上清みを除く。この分離工程により、その後の凝集体形成性循環タンパク質形態の検出反応に必要ないあらゆる生成物を除去すること、例えば、薬剤Ｉ非含有溶液とすることが可能になる。
【００６６】
薬剤Ｉでの凝集体の形成後、血漿リガンドが結合された（変性）凝集体形成性循環タンパク質形態の血漿リガンドとタンパク質との分離を促進させるため、グアニジン−ＨＣｌなどの化学変性剤が１〜６モル／１の濃度で添加され得る、及び／又は、熱変性が１００℃で行なわれ得、これにより、凝集体形成性循環タンパク質形態のタンパク質のマスクされたエピトープを、薬剤Ｉに結合されていないリガンドから分離させることにより遊離させることが可能になる。これにより、本発明の検出方法の感度をさらに増強させることが可能になる。凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体と薬剤ＩＩとの反応前での試験対象の生物試料中に存在する前記凝集体の変性もまた、当業者に知られている任意のタンパク質凝集体変性方法によって行なわれ得る。
【００６７】
したがって、本発明による凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法は、好ましくは、以下：
ｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を反応混合物から分離する工程、及び
ｉｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を変性させる工程
のさらなる工程ｉ）及びｉｉ）の少なくとも１つを含み、
これらの工程は、適切な場合は、工程ａ）及び工程ｂ）の間に含まれる。
【００６８】
本発明の方法による生物試料中での凝集体形成性循環タンパク質形態の存在の可視化は、試料中の被検物を検出するための慣用法に従って行なわれ得る。
【００６９】
これは、例えば、免疫学的又は非免疫学的検出によって行なわれ得る。
【００７０】
用語「免疫学的検出」は、凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応の実証を意味することが意図され、この免疫反応は、検出対象の凝集体形成性循環タンパク質形態と、該凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーとの間の結合、あるいは、試験対象の試料中に含まれている可能性がある凝集体形成性循環タンパク質形態と、標識された凝集体形成性循環タンパク質形態との間の競合反応からなる。
【００７１】
非免疫学的検出の一例としては、例えば、当業者によく知られている電気泳動ゲルでの染色手法が挙げられ得る。
【００７２】
免疫反応による凝集体形成性循環タンパク質形態の検出は、例えば、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーの添加後に行なわれ得る。
【００７３】
表現「凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナー」は、対象の凝集体形成性循環タンパク質形態に結合することができる任意のパートナーを意味することが意図される。そのため、免疫反応の可視化は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナー／凝集体形成性循環タンパク質形態複合体の可視化からなる。
【００７４】
好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との間の免疫反応のために、適切な場合は工程ｃ）において添加するものである。もちろん、かかるパートナーは、本発明の方法において薬剤Ｉのみ又は薬剤ＩＩのみを使用すると決定された場合にも添加され得る。
【００７５】
本発明の方法において添加される異なる結合パートナーの数は、試験対象の異なる凝集体形成性循環タンパク質形態の数に依存する。したがって、アルツハイマー病の検出の場合、タウタンパク質のみを試験することが望ましい場合、タウ特異的結合パートナーが添加される。他方において、タウタンパク質とβ−アミロイドペプチドとの両方を検出することが望ましい場合、β−アミロイドペプチドに特異的な結合パートナーもまた添加される。
【００７６】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーの一例としては、例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ハプテン及びアプタマーが挙げられ得る。
【００７７】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、遺伝子組換えによって得られる抗体並びに抗体断片を含む。
【００７８】
ポリクローナル抗体は、少なくとも１種類の対象の標的抗原（本発明の場合は、凝集体形成性循環タンパク質形態）での動物の免疫処置後、前記動物から血清試料を採取し、所望の抗体を他の血清成分から、特に、該抗体によって特異的に認識される抗原（特に、凝集体形成性循環タンパク質形態）を結合したカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによって分離することにより、純粋な形態で前記抗体を回収することによって得られ得る。
【００７９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ手法によって得られ得、その一般原理を、以下に想起する。
【００８０】
第１の工程では、動物、一般的にはマウス（又はｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫処置の場合は培養細胞）を、対象抗原（本発明の場合は、凝集体形成性循環タンパク質形態）で免疫処置すると、前記マウスのＢリンパ球は前記抗原に対して抗体産生できるようになる。次いで、この抗体産生リンパ球を「不死化」骨髄細胞（実施例ではマウスのもの）と、ハイブリドーマが得られるように融合させる。このようにして得られた細胞の不均一系混合物を、次いで、特異的抗体の産生することができ、かつ永久に増殖することができる細胞を選択するための供給源として使用する。各ハイブリドーマを、各々がモノクローナル抗体の産生をもたらすクローン形態で増殖させ、その対象抗原に関する認識特性が、ＥＬＩＳＡ、１次元若しくは２次元免疫ブロッティング、免疫蛍光又はバイオセンサーによって試験され得る。このようにして選択されたモノクローナル抗体は、続いて、特に上記のアフィニティクロマトグラフィー手法に従って精製される。
【００８１】
本発明に適した抗体の一例としては、例えば、総タウタンパク質（Ｔａｕ−１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、Ｔ４６（Ｚｙｍｅｄ））、リン酸化タウタンパク質（抗体ＰＨＦ−６（Ｚｙｍｅｄ））、ＡＰＰタンパク質（抗体２２Ｃ１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、β−アミロイドペプチド（６Ｅ１０抗体及び４Ｇ８（Ｓｉｇｍａ））に対するモノクローナル抗体が挙げられ得る。
【００８２】
抗体断片は、凝集体形成性循環タンパク質形態への結合機能を保持しているものである。
【００８３】
用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸の配列を意味することが意図される。用語「アミノ酸」は、タンパク質をコードする１級アミノ酸、酵素作用後に誘導されるアミノ酸、例えば、トランス−４−ヒドロキシプロリンなど、及び天然だがタンパク質中には存在しないアミノ酸、例えば、ノルバリン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、スタリン（Ｈｕｎｔ Ｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，Ｂａｒｅｔｔ ＧＣ編，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５）など、化学官能基によって保護され、固相支持体又は液相合成に使用され得るアミノ酸、並びに非天然アミノ酸を意味することが意図される。
【００８４】
用語「タンパク質」は、ホロタンパク質及びヘテロタンパク質（例えば、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質など）を含み、ともに、繊維性及び球状である。
【００８５】
用語「核酸」は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸及びリボ核酸並びにその誘導体を意味することが意図される。
【００８６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの天然又は修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はその両方）の配列を表す。用語「修飾ヌクレオチド」は、例えば、修飾塩基を含むヌクレオチド、及び／又は、ヌクレオチド結合レベル及び／又は主鎖レベルの修飾を含むヌクレオチドを意味することが意図される。修飾塩基の一例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン及びブロモ−５−デオキシウリジンが挙げられ得る。修飾ヌクレオチド結合の例示としては、ホスホロチオエート、Ｎ−アルキルホスホルアミダイト、アルキルホスホネート及びアルキルホスホジエステル結合が挙げられ得る。α−オリゴヌクレオチド（例えば、ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載のものなど）、ＬＮＡ（例えば、ホスホロチオエート−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，第８巻，Ｉｓｓｕｅ １６，１８ Ａｕｇｕｓｔ １９９８，第２２１９−２２２２頁に記載）など）、並びにＰＮＡ（これは、Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７による論文の主題である）は、その主鎖が修飾されたヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
【００８７】
用語「ハプテン」は、非免疫原性化合物、すなわち、それ自体単独では抗体産生による免疫反応を促進することができないが、既知の条件下での動物の免疫処置、特に、ハプテン−タンパク質コンジュゲートによる免疫処置によって得られる抗体によって認識され得る化合物を表す。このような化合物は、一般的に、３０００Ｄａ未満、最も一般的には２０００Ｄａ未満の分子量を有し、例えば、グリコシル化ペプチド、代謝産物、ビタミン類、ホルモン、プロスタグランジン、毒素又は種々の医薬、ヌクレオシド及びヌクレオチドであり得る。
【００８８】
アプタマーは、タンパク質の捕捉パートナーであり、核酸性であり、その機能は、抗体としての機能を果たすこと、及びタンパク質リガンドに結合することである（Ｔｏｕｌｍｅ，ＪＪ．及びＧｉｅｇｅ，Ｒ．，１９９８，Ｍｅｄｅｃｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（２），１５５−１６６）。
【００８９】
これらのポリペプチド、タンパク質、ハプテン及びアプタマーはすべて、凝集体形成性循環タンパク質形態又は凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体に結合する能力を有する。
【００９０】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと、使用される（特に工程ｃ）で）凝集体形成性循環タンパク質形態との間の免疫反応の可視化は、当業者に知られている任意の検出手段、例えば、直接又は間接的手段などによって行なわれ得る。
【００９１】
直接検出の場合、すなわち、標識を使用しない場合、免疫反応は、例えば、プラズモン共鳴又は導電性ポリマーを担持する電極上でのサイクリックボルタンメトリーによって観察される。
【００９２】
間接的検出の場合、すなわち、標識を使用する場合、標識は、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な前記結合パートナーによって行なわれ得、ついで、該タンパク質形態が予備標識される。
【００９３】
本発明の方法による生物試料中での凝集体形成性循環タンパク質形態の存在の可視化はまた、「競合」法に従って行なわれ得る。次いで、予備標識された凝集体形成性循環タンパク質形態を、特に工程ｃ）において、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーの代わりに添加する。この場合、シグナルの検出は、凝集体形成性循環タンパク質形態の不在下で最大であり、次いで徐々に減少する。これは、調査対象の凝集体形成性循環タンパク質形態（これは非標識）の濃度が、競合反応によって増大するためである。
【００９４】
用語「標識すること」は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる標識の結合を意味することが意図される。このような標識の非限定的な例は、
検出可能なシグナルを、例えば、比色分析、蛍光又は発光によってもたらす酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど、
発色団、例えば、発光化合物、色素化合物など、
放射性分子、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなど、
蛍光分子、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アレクサ又はフィコシアニン、及び
金若しくは磁性ラテックス粒子、又はリポソームなどの粒子
からなる。
【００９５】
また、間接系も、例えば、別のリガンド／抗リガンドの組によって使用され得る。リガンド／抗リガンドの組は、当業者によく知られており、例えば、以下の組：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／該ポリヌクレオチドの相補配列が挙げられ得る。この場合、結合性因子を担持しているのはリガンドである。抗リガンドは、先のパラグラフに記載した標識によって直接検出可能であり得るか、又はリガンド／抗リガンドによって自身で検出可能である。
【００９６】
これらの間接検出系は、一定の条件下で、シグナルの増幅をもたらし得る。このシグナル増幅手法は、当業者によく知られており、論文Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１−４９１，１９９７を参照してよい。
【００９７】
タンパク質の標識は、当業者に広く知られており、例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｅ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，５２５Ｂ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１０１ ＵＳＡに記載されている。
【００９８】
使用する標識の型（例えば、酵素の使用）に応じて、当業者は、標識の可視化のための試薬を添加する。
【００９９】
かかる試薬は、当業者に広く知られており、特に、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｅｓｓａｙ，第２版，編集Ｃ．Ｐｒｉｃｅ，ＤＪ．Ｎｅｗｍａｎ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，３４５ Ｐａｒｋ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｏｕｔｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１００】
凝集体形成性循環タンパク質形態の検出は、固相検出であり得、すなわち、検出対象のタンパク質を捕捉することが意図される捕捉パートナーが固定された固相を使用する。本発明の場合、固相支持体上に事前に固定される捕捉パートナーとして供され得るのは、薬剤ＩＩである。固相検出の例は、当業者によく知られ、サンドイッチ型検出、例えばＥＬＩＳＡ型検出である。
【０１０１】
したがって、本発明の好ましい一実施形態によれば、前記薬剤ＩＩは固相支持体に結合される。
【０１０２】
固相支持体の一例としては、例えば、ビーズ（例えば、磁性ビーズなど）及びマイクロタイタープレートが挙げられ得る。
【０１０３】
薬剤ＩＩは固相支持体に、当業者に知られている様式で、例えば、吸着又は共有結合によって結合され得、共有結合が好ましい。
【０１０４】
したがって、固相支持体は、前記薬剤ＩＩに担持された官能基と結合を形成することができる官能基で官能基化されたものであり得る。好ましい一実施形態によれば、固相支持体は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）結合又はＮＨ２官能基で官能基化される。この官能基は、薬剤ＩＩに担持された官能基と反応し得る。この実施形態において、固相支持体の官能基結合と結合が形成されるように反応できる官能基を担持する、特にＮＨ２又はＣＯＯＨを担持する薬剤ＩＩが特に好ましい。
【０１０５】
本発明の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出方法の実施のため、薬剤Ｉ及び薬剤ＩＩを備える診断用キットが使用され得、前記薬剤は上記規定のとおりである。
【０１０６】
したがって、本発明は、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出のための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用に関する。
【０１０７】
好ましい一実施形態によれば、前記薬剤ＩＩは、固相検出法に従って少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出を行なうために、キット内で固相支持体に結合された状態で存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
本発明は、非限定的な一例として示す以下の実施例及び図１〜２４から、より明白に理解されよう。
【０１０９】
図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す。
【０１１０】
図２は、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図２Ｂ）のＸ線写真の概略図（図２Ａ）である。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１１】
図３は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図３Ｂ）のＸ線写真の概略図（図３Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１２】
図４は、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図４Ｂ）のＸ線写真の概略図（図４Ａ）である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１３】
図５は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図５Ｂ）のＸ線写真の概略図（図５Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１４】
図６は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図６Ｂ）のＸ線写真の概略図（図６Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１５】
図７は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図７Ｂ）のＸ線写真の概略図（図７Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１１６】
図８は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図８Ｂ）のＸ線写真の概略図（図８Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１１７】
図９は、種々の濃度の薬剤ＩＩ ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４２での処理後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１１８】
図１０は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０で処理したペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【０１１９】
図１１は、種々の濃度の薬剤ＩＩコンドロイチン−６−硫酸、薬剤ＩＩでの処理なしでの対照であるＡｂ４２との反応後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１２０】
図１２は、アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）由来又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の、未処理（ＮＴ）又はトリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）である薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（ｐｇ／ｍｌ、当量（ｅｑ）の組換えタウタンパク質でアッセイ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【０１２１】
図１３は、アルツハイマー病の患者、未処理（ＮＴ）又は種々の濃度（ｍｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（当量Ｔａｕ、ｐｇ／ｍｌ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【０１２２】
図１４は、処理なし又はＳＤＳ１％での処理及びストレプトマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）での沈殿後の、リン酸化タウタンパク質の検出に対する種々の取り込みバッファーの効果を示すグラフ表示である。結果は、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＰＡＤ−）又は血漿無添加（Ｐ）の脳抽出物を用いて得たものである。Ｇｎｄ：グアニジン；ＳＮ：上清み；ｓｔｐ：ストレプトマイシン。
【０１２３】
図１５は、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後（図１５Ａ）及びウエスタンブロッティング後の同じゲルのＸ線写真（図１５Ｂ）の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０１２４】
図１６は、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後（図１６Ａ）及びウエスタンブロッティング後の同じゲルのＸ線写真（図１６Ｂ）の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【０１２５】
図１７は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である。図１７Ａはペレット画分に相当し、一方、図１７Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【０１２６】
図１８は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）である。図１８Ａはペレット画分に相当し、一方、図１８Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【０１２７】
図１９は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）である。図１９Ａはペレット画分に相当し、一方、図１９Ｂは上清み画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【０１２８】
図２０は、血漿中に存在し、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）で処理したＳｙｎタンパク質のある濃度範囲（ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。光学密度は、ペレット画分及び上清み画分にて読み取る。
【０１２９】
図２１は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を捕捉相に用いたサンドイッチ型のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）の脳抽出物由来の種々の量（ｎｇ）のタンパク質を試験する。得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【０１３０】
図２２は、特異的抗体を捕捉相に用いたサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加し、ストレプトマイシンである薬剤Ｉで沈殿させる。沈殿後、ペレット（Ｃ）を加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。ＮＴは未処理、Ｃはペレット及びＳは上清みを意味する。
【０１３１】
図２３は、薬剤Ｉ（ストレプトマイシン）での沈殿及び薬剤ＩＩ（カリックスアレーン）を用いた捕捉によるＥＬＩＳＡによる検出後のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加する。薬剤Ｉでの沈殿後、ペレットを加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。
【０１３２】
図２４は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）脳抽出物を用いて行ない、未処理又はストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した正常患者由来の血漿プール中に添加したリン酸化タウタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。捕捉相は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）からなる。ペレット画分及び上清み画分において得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【実施例１】
【０１３３】
実施例１：非感染性神経変性疾患における神経毒性凝集体沈着物と関連するタンパク質のペプチド配列の比較解析
本発明者らは、「Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ」ソフトウエアを用い、神経変性疾患における神経毒性凝集体沈着物と関連するタンパク質の代表的なタンパク質、すなわち、タンパク質α−シヌクレイン（配列番号１）、アミロイド前駆体タンパク質すなわちＡＰＰ（配列番号２）、パーキンタンパク質（配列番号３）及びタウタンパク質（配列番号４）のペプチド一次配列のアライメントを行なった。アミノ酸は、配列内のアライメント上に、最長のコンセンサス配列との一致に基づいて番号付けし、タンパク質の配列内の点線は、その線形ペプチド配列と、コンセンサス配列におけるすべてのタンパク質に共通する単位のアライメントとの間のシフトを表す。
【０１３４】
多重アライメントオプションを用いた「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」型のアライメントを行ない、図１に示す。相同性領域（同一であるか、又は同等の化学官能基を有するアミノ酸）を四角で囲み、これらの種々のタンパク質に共通するドメインを規定する。これらに共通する性質の１つは、神経変性疾患における中枢神経系でのその神経毒性凝集体の形成である。
【０１３５】
個々に四角で囲んだアミノ酸は、特定のタンパク質の一次配列内の目的の特定のアミノ酸の高頻度反復配列の代表である。このような反復配列は、タンパク質に応じて種々に分布し得るが、コンセンサスよりも高密度である官能基の基部を構成しているか、あるいは、その空間内での突出によって結合ドメインが構成され得る。
【０１３６】
薬剤Ｉ、例えば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を含む有機化合物など、あるいは薬剤ＩＩ、例えば、カリックス−６−アレーン−スルホネート型のカリックスアレーンなどとの結合に関与する官能基に関する本発明者らの当初の知識に基づき、本発明者らは、このような相同領域内において、上記の官能基を有する特定の密度のアミノ酸を同定することができた。
【０１３７】
したがって、図１において、薬剤Ｉ、例えば、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を含む有機化合物などに対する結合では、以下に規定する領域が、２０アミノ酸以下の長さのペプチド配列において、Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮから選択される最低４個のアミノ酸を含むことがわかる：
ｉ）α−シヌクレインでは、例えば、領域
−１２４〜１４３は、４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２３１〜２６１は、１０つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１９アミノ酸上に有する（点線は、一次配列に対する一致に基づく番号付けにおけるシフトを示し、これは、２０アミノ酸が、そのタンパク質の配列範囲内の実際の数より大きな数で番号付けされていることを意味する）及び
−２３２〜２４９でさえ、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｉ）ＦＡＰＰでは、例えば、領域
−８０〜９８は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−１９３〜２１６は、１４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１７アミノ酸上に有する、
−２２５〜２３６は、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する、
−２４７〜２５６は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１０アミノ酸上に有する、
−６９２〜７０２は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１１アミノ酸上に有する、
−７１３〜７１８は、４つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を６アミノ酸上に有する；
ｉｉｉ）パーキンでは、例えば、領域
−２５〜４６は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する（一致に関する番号付けにおけるシフトのため）、
−１５３〜１７２は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２２４〜２４０は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｖ）タウタンパク質では、領域
−３１〜５３は、６つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２２５〜２４８は、１２つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−２３６〜２４７は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する、
−２８９〜３０８は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−３６１〜３８０は、８つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、
−５２３〜５４２は、９つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を２０アミノ酸上に有する、及び
−７５３〜７６４は、５つのＤ、Ｅ、Ｓ又はＮ残基を１２アミノ酸上に有する。
【０１３８】
また、２０アミノ酸以下のペプチド配列における４以上のこれらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）の密度はまた、凝集体形成性循環タンパク質形態を構成するタンパク質の完全配列において、少なくとも２回見られ得ることが注目され得る。さらに、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）は、２０アミノ酸以下のペプチド配列において全体として少なくとも５回、及び／又は、１６アミノ酸以下のペプチド配列において少なくとも４回存在し得ることが注目される。最後に、上記規定の密度はまた、これらのアミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｓ又はＮ）より高密度である（１２アミノ酸以下の長さのペプチド配列において少なくとも５に相当する）領域と関連し得る。また、同等の空間的距離での同等の官能基の密度により、タンパク質の一次構造において上記規定のものを模倣する構造が構成され得る。
【０１３９】
また、これらのアミノ酸の頻度は、ＡＰＰのペプチド配列の４９の連続するアミノ酸のうち３２に達し得るが、４９残基（領域２２５−２７５）のこの配列から離れた他の結合領域は排除されないことに注目するのは興味深い。
【０１４０】
さらに、図１において、薬剤ＩＩ、例えば、カリックスアレーン型の大環状分子に対する結合では、以下に規定する領域が、最低３つの基本アミノ酸、好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）又はグルタミン（Ｑ）を、アミノ酸１２以下又は、さらに１５以下の長さのペプチド配列内に含むことが認められ得る：
ｉ）α−シヌクレインでは、領域
−１０６〜１２０は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１２８〜１４２は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１５９〜１６３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する；
ｉｉ）ＡＰＰでは、領域
−９０〜１０４は、７つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１０５〜１１６は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−１３２〜１４３は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−１５３〜１６３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する、
−６９７〜７０７は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１１アミノ酸上に有する；
ｉｉｉ）パーキンでは、領域
−８３〜１００は、７つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１５アミノ酸上に有する、
−１８２〜１９５は、６つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１２アミノ酸上に有する；
ｉｖ）タウタンパク質では、領域
−１０１〜１０８は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を８アミノ酸上に有する、
−１３５〜１４７は、４つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１３アミノ酸上に有する、
−１７８〜１８３は、３つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を６アミノ酸上に有する、
−１９７〜２０８は、５つのＫ、Ｈ、Ｑ又はＲ残基を１アミノ酸上に有する。
【０１４１】
また、同等の空間的距離での３つの等価な正の電荷の密度により、タンパク質の一次構造において上記規定のものを模倣する構造が構成され得ることも注目され得る。これは、例えば、１２又は、さらに１５のアミノ酸の配列に相当する３次元空間内のこれらのカチオン又はその機能的同等物が、アミノ酸からなるαヘリックスである該空間の一部分上に突出された立体構造であり得る。
【実施例２】
【０１４２】
実施例２：薬剤Ｉを用いた方法によるタウタンパク質の検出
２．１ 解析手法
この解析は、ウエスタンブロッティング（Ｌａｅｍｍｌｉ，ＵＫ １９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５）に従って行なう。
【０１４３】
解析する試料を、ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー）（５０／５０ｖ／ｖ）中で、１００℃にて５分間変性させる。次いで、前記試料を、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下、１２％ポリアクリルアミド一次元電気泳動ゲル上に載せる（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
【０１４４】
泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、タウタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ｔａｕ−１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を用いて４℃で一晩免疫ブロットする。
【０１４５】
二次検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされたマウス免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を認識するヤギ抗体である。
【０１４６】
膜は、工程ごとに、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、次いでこれを含有しないＰＢＳ中で洗浄する。
【０１４７】
シグナルを、化学発光によってスーパーシグナルキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出し、ラジオグラフィー膜（Ｐｉｅｒｃｅ）上で可視化する。
【０１４８】
２．２ 薬剤Ｉの存在下での検出
このアッセイは、６ヒスチジンのテイル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と融合させた１μｇの組換えタウタンパク質と、薬剤Ｉとして、硫酸塩形態のストレプトマイシン、又はトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴ、又はリファンピシン又はイソニアジドのいずれかを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が９／１又は３５／１に等しくなるように用いて行なう。
【０１４９】
該組換えタンパク質と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１５０】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、変性後、ウエスタンブロッティング手法によって解析する。
【０１５１】
結果を、以下に規定する図２及び３に報告する。
【０１５２】
図２は、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図２Ｂ）のＸ線写真の概略図（図２Ａ）であり、レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１５３】
図３は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図３Ｂ）のＸ線写真の概略図（図３Ａ）であり、レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１５４】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉの濃度は、以下の表１及び２に示すとおりである。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
結果は、タウタンパク質及びその消化形態が、ストレプトマイシン、ＴＥＴ、リファンピシン又はイソニアジドのどれであるかに関係なく、薬剤Ｉで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これらが、試験試料容量から濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、タウタンパク質の沈殿を誘導する。
【実施例３】
【０１５８】
実施例３：薬剤ＩＩを用いた方法によるタウタンパク質の検出
３．１ 解析手法
上記の２．１に記載のものと同じである。
【０１５９】
３．２ 薬剤ＩＩとしてのカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓと示す）の存在下で行なった検出
このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、濃度範囲を０．５ｍＭ〜６０ｍＭとする以外は、上記の２．２に示すようにして行なう。
【０１６０】
結果を図４に報告する。この図は、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーンで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図４Ｂ）のＸ線写真の概略図（図４Ａ）である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１６１】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表３に示すとおりである。
【０１６２】
【表３】
【０１６３】
これらの結果は、タウタンパク質及びその消化形態が、Ｃ６Ｓで処理した後のペレット中に見られること、及び、薬剤ＩＩの不在下では、タウタンパク質の濃縮も分離も観察されないことを示す。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション後にタウタンパク質の捕捉を誘導し、簡単な遠心分離によって該タンパク質を沈降させる。さらに、至適沈殿は０．５ｍＭ〜４０ｍＭで観察される。
【実施例４】
【０１６４】
実施例４：薬剤Ｉ又は薬剤ＩＩを用いた方法によるβ−アミロイドペプチドの検出
以下：
−１０μｇの４０アミノ酸長合成β−アミロイドペプチド（β−Ａペプチド１−４０；配列番号５）又は１０μｇの４２アミノ酸長合成β−アミロイドペプチド（β−Ａペプチド１−４２；配列番号６）、
−アミロイドペプチドに特異的なモノクローナル抗体（６Ｅ１０抗体（Ｓｉｇｍａ））、
−薬剤Ｉとして、ストレプトマイシン及びＴＥＴを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が３５／１に等しくなるように、あるいはリファンピシン及びイソニアジドを、総タンパク質量（μｇ）に対する薬剤Ｉの量（μｇ）の比が２／１、９／１若しくは３５／１に等しくなるように、及び
−薬剤ＩＩとして、Ｃ６Ｓを終濃度１ｍＭで
使用する以外は、上記の実施例２及び３に示した手順を繰り返す。
【０１６５】
遠心ペレットについて、ウエスタンブロッティングを行ない、これを実施例２に記載のようにして解析した。
【０１６６】
結果を、以下に規定する図５〜８に報告する。
【０１６７】
図５は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したβ−アミロイドペプチドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図５Ｂ）のＸ線写真の概略図（図５Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１６８】
図６は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図６Ｂ）のＸ線写真の概略図（図６Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１６９】
図７は、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したβ−アミロイドペプチドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図７Ｂ）のＸ線写真の概略図（図７Ａ）である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【０１７０】
図８は、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティングの電気泳動ゲル（図８Ｂ）のＸ線写真の概略図（図８Ａ）である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【０１７１】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉ又はＩＩの濃度は、以下に規定する表４及び５（図５及び７（表４）並びに図６及び８（表５）に相当する）に示すとおりである。
【０１７２】
【表４】
【０１７３】
【表５】
【０１７４】
先のとおり、結果は、β−アミロイドペプチド及びそのオリゴマーが、薬剤Ｉ又は薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。したがって、これらの分子は、３７℃で３０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、該ペプチドの沈殿を誘導する。
【０１７５】
さらに、図７に示されるように、常套的に使用されている抗体などのタンパク質薬剤では通常捕捉されない高分子量オリゴマー（マルチマー）であるレーン１が、薬剤ＩＩによって捕捉されて沈殿し、これは、このようなマルチマー形態に対するその有効性を証明する。したがって、薬剤ＩＩにより、モノマー形態とオリゴマー形態との両方を、これらを架橋させることなく回収することが可能になる（電気泳動の移動度において種々のバンドが観察される）。
【０１７６】
同様に、図８に示されるように、常套的に使用されている抗体などのタンパク質薬剤とは通常架橋しない高分子量オリゴマー（マルチマー）であるレーン５が、薬剤Ｉと架橋して沈殿し、これは、このようなマルチマー形態に対する有効性を証明する。また、さらに薬剤Ｉにより、あらゆるモノマー形態及びオリゴマー形態を架橋させることが可能になり、これは、比較的均一な高分子量領域（スメア）内のすべての抗原性βアミロイド画分の電気泳動の移動度によって実証される。
【実施例５】
【０１７７】
実施例５：β−アミロイドペプチド１−４２とｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンとの相互作用
５．１．解析手法
この解析は円偏光二色性によって行なう。
上記のような解析対象のβ−アミロイドペプチド（Ａβ４２とも示される）を、２．２×１０−４Ｍの濃度で、水中２０％のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の溶液に即時的に溶解し、β−アミロイドペプチドを構成する。ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅ．ら、２００３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５９（３７）：７３５７−７３６４に記載のようにして調製）を、１００μＭで５０ｍＭリン酸バッファーに溶解する。試料を、リン酸バッファー中の終濃度１０μＭのβ−アミロイドペプチド、すなわち最終容量５００μＬが得られ得るように調製する。ペプチド濃度／カリックスアレーン濃度の比は、１／０〜１／５で種々であり得る。
【０１７８】
ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンなしのβ−アミロイド対照は、２０％ＴＦＥ中２．２×１０−４Ｍ（５ｎｍｏｌ）のＡβ４２ストック溶液２２．５μＬ、４７７．５μＬの５０ｍＭリン酸バッファーで行なう。
【０１７９】
試料を、１８０〜２６０ｎｍの円偏光二色性で解析する。
【０１８０】
５．２．Ａβ４２ペプチドとｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンとの相互作用
このアッセイは、以下の表６に示すように、Ａβ４２ペプチド／カリックスアレーンの濃度比１／１、１／２及び１／５で行なう。対照は、カリックスアレーンなしのＡβ４２ペプチドの試料（１／０）である。溶液は、最終容量５００μＬに調製する。Ａβ４２ペプチドは、４５１４ｇ／モルのモル質量を有する。ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンは、７４４ｇ／モルのモル質量を有する。
【０１８１】
【表６】
【０１８２】
結果を図９に示す。この図は、波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフであり、結果は、カリックスアレーンなしの対照（Ａｂ４２）について濃度比１／１、１／２、１／５で得られたものである。
【０１８３】
図９の曲線は、最初はα−ヘリックスの形態である該ペプチドが、ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーンの存在下で、カリックス［４］アレーンの使用濃度とは無関係に、低濃度（１／１）又は高濃度（１／５）のいずれにおいても、３つの構造α−ヘリックス（２１０ｎｍ）、β−シート（２２０ｎｍ）及び非周期構造（２００ｎｍ）をとることを示す。α−ヘリックス構造は、可視構造の３７％より多く、β−シートは２６％より多く、最後に非周期構造は３８％を示す。
【０１８４】
本発明者らは、濃度比１／１で、該構造のモル楕円率が１／２の場合と比べて増大することを観察している。他方、２１０ｎｍの領域内波長付近では、１／５の濃度比のＡβ４２ペプチドのスペクトルは、１／１のものに近く、該領域を超えると１／２のものに近い。
【０１８５】
このような変動は、該スペクトルにおいて観察された有意な構造変形による薬剤ＩＩとβ−アミロイドペプチドとの分子相互作用を示す。
【実施例６】
【０１８６】
実施例６：電気スプレイ型の質量分析計によるβ−アミロイドペプチド１−４０とｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとの複合体形成の試験
６．１．解析手法
β−アミロイドペプチド（Ａβ４０ともいう）及び種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（ｎ＝４、６、８）（Ｄａ Ｓｉｌｖａ，Ｅ．ら、２００３（前掲）に記載のようにして調製）を、１００μＭの濃度で、１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中にて可溶化させる。試験対象のβ−アミロイドペプチドの溶液を、ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンの溶液と即時的に混合する。試料を、電気スプレイ型の質量分析計内に直接注入する。
【０１８７】
６．２．Ａβ４０ペプチドと種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとの複合体形成の試験
１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中１０μＭのペプチドＡβ４０（Ｍｗ＝４４３０ｇ／ｍｏｌ）のストック溶液を調製する。種々のｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン（ｎ＝４：ＳＣ４ Ｍｗ＝７４４ｇ／ｍｏｌ；ｎ＝６：ＳＣ６ Ｍｗ＝１１１６ｇ／ｍｏｌ；ｎ＝８：ＳＣ８ Ｍｗ＝１４８８ｇ／ｍｏｌ）を、１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー中１００μＭで可溶化させる。
【０１８８】
１００μＬの１００μＭペプチドＡβ４０溶液を、１００μＬのｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーン１００μＭ溶液と混合する。試料を、電気スプレイ型の質量分析計内に即時的に注入する。
【０１８９】
得られた結果を図１０に示す。この図は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０との反応後のペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【０１９０】
これらの結果は、ｐ−スルホナト−カリックス［ｎ］アレーンとＡβ４０ペプチドとの複合体形成に特徴的なピークを示す。対照は、大過剰に存在する（これがピークの説明となる）ことが注目され得る。
【実施例７】
【０１９１】
実施例７：β−アミロイドペプチド１−４２とコンドロイチン−６−硫酸との相互作用
薬剤ＩＩとして、コンドロイチン−６−硫酸（Ｓｉｇｍａ）を使用したこと以外は、上記実施例５に記載の手順を繰り返した。
【０１９２】
結果を図１１に示す。この図は、カリックスアレーンなしの対照（Ａｂ４２）について濃度比１／１及び１／５での、波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【０１９３】
図１１において得られた結果は、Ａβ４２スペクトルが、２０１ｎｍに第１、及び２２６ｎｍに第２の２つの負の最小ピークを示していることを示す。この合成β−アミロイドペプチドは、一部が非周期構造であるα−ヘリックス構造の形態をとる。
【０１９４】
コンドロイチン−６−硫酸の存在下において、Ａβ４２のものと等しい濃度では、該ペプチドの構造は変化する。３つの構造は同様の割合で存在する。具体的には、α−ヘリックス（２１０ｎｍ）は３７％より多く存在し、非周期構造（２００ｎｍ）は２６％より多い。最後に、β−シートは２２０ｎｍにおいて見られる。
【０１９５】
コンドロイチン−６−硫酸の濃度がＡβ４２ペプチドのものより５倍大きく増大すると、後者の二次立体構造が変化し、本質的に非周期構造となる。
【０１９６】
結論として、アミロイドペプチドのものと等しい濃度のコンドロイチン−６−硫酸の存在下では、β−シートが見られるが、コンドロイチン−６−硫酸が高濃度では、この立体構造は非周期構造に置き換わる。
【０１９７】
このような変動は、該スペクトルにおいて観察された有意な構造変形による薬剤ＩＩとβ−アミロイドペプチドとの分子相互作用を示す。
【実施例８】
【０１９８】
実施例８：沈殿剤Ｉを用いた方法によるリン酸化タウタンパク質の検出
８．１ 解析手法
この解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７（２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従って行なう。
【０１９９】
ＰｈｏｓｐｈｏＴａｕ Ｅｌｉｓａアッセイは、Ｄｙｎｅｘマイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、３μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃヤギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２５ｍＭ ＫＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＮａＮ３を含有するバッファー中で、３時間２４℃にて結合させる。次いで、ウェルを、ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）カゼイン（１％）バッファー中で１時間２４℃にて不動態化し、次いで、２時間２４℃で、ＴＢＳカゼインバッファー中で希釈した３μｇ／ｍｌのＴａｕｌ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）抗体及びＣＰ２７（ＡｐｐｌｉｅｄＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）抗体とともにインキュベートする。
【０２００】
標準及び脳抽出物を、このアッセイのための正常血漿プール中で希釈し、ウェル１つあたり８０μＬの割合で２連で入れる。検出抗体ＣＰ９（ＡｐｐｌｉｅｄＮｅｕｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＵＳ）を、２００μｇ／ｍｌのヒトアルブミン、２２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ及び０．１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＭを、クレブス−リンゲル炭酸塩バッファー中に含有するバッファー中で希釈する。この混合物２０μｌを各ウェルに添加し、６６時間２４℃でインキュベートする。結合ＣＰ９抗体を認識させるため、１％の正常ヒト血清（Ｂｉｏｃｅｌｌ）を含有するＴＢＳカゼインバッファー中０．２μｇ／ｍｌのビオチン化抗マウスＩｇＭヤギ抗体（Ｆ（ａｂ’）２）（Ａｃｃｕｒａｔｅ）を、２時間２４℃で添加する。該ビオチン化抗体を、ＴＢＳカゼインバッファー中で希釈し、４５分間２４℃でインキュベートした０．４μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出する。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳ）を、各ウェルに添加し、化学発光を照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０）にて読み取る。得られるデータは、組換えｔａｕ同等物においてアッセイされた濃度（ｐｇ／ｍｌ）である相対光単位（ＲＬＵ）の形態であり、試料のＲＬＵを標準曲線と関連させることにより得られる（濃度（ｐｇ／ｍｌ）の関数としてのＲＬＵ）。
【０２０１】
上記の工程ごとに、ウェルは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳバッファーで洗浄する。
【０２０２】
８．２ 薬剤Ｉ、ＴＥＴの存在下での検出
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤ＩとしてトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴを１００ｍｇ／ｍｌで用いて行なう。
【０２０３】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２０４】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２０５】
図１２に、アルツハイマー（ＡＤ＋）又は非アルツハイマー（ＡＤ−）患者由来の脳抽出物（血漿中に添加）に関して得られた結果をまとめる。結果は、１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＴの不在下（ＮＴ）又はこれによる処理及び２つのペレット及び上清み画分の解析後に得られたものである。
【０２０６】
結果は、リン酸化タウタンパク質が、薬剤Ｉ、ＴＥＴで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。
【０２０７】
８．３ 薬剤Ｉストレプトマイシンの存在下での検出
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを種々の濃度で用いて行なう。
【０２０８】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２０９】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２１０】
図１３に、アルツハイマー（ＡＤ＋）患者由来の脳抽出物（血漿中に添加）に関して得られた結果をまとめる。結果は、種々の濃度のストレプトマイシンの不在下（ＮＴ）又はこれによる処理及び２つのペレット及び上清み画分の解析後に得られたものである。
【０２１１】
結果は、リン酸化タウタンパク質が、低濃度の薬剤Ｉストレプトマイシンで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉでの処理の不在下の同じ試料の解析と比べたときの、検出の増大によって反映される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。しかし、タンパク質が上清み中に残存しているため、沈殿は完全でないことがわかる。薬剤Ｉの量の増大により、５００ｍｇ／ｍｌの濃度では、上清み中のタンパク質の存在を排除することが可能になる。この場合、沈殿したタンパク質は、ペレット中において、ＥＬＩＳＡ手法ではもはや検出可能でなくなる。ウエスタンブロッティングによる解析（データ示さず）により、該タンパク質が実際に凝集形態で存在することの確認が可能となった。抗体との前記凝集形態を検出するため、各タンパク質のエピトープを再露出させるための適当な取込みバッファーが必要である（８．４参照）。
【０２１２】
８．４ 薬剤Ｉストレプトマイシンの存在下での検出：取込みバッファーの採用
このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを５００ｍｇ／ｍｌで用いて行なう。
【０２１３】
試料はＳＤＳ（１％最終）で処理又は未処理とする。
【０２１４】
試料と薬剤Ｉとを、ＳＤＳの存在下又は不在下で接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２１５】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌの種々の溶液：
−１％ ＳＤＳ
−グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）
−１Ｍ尿素
−１％ ＳＤＳ＋グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）
−１％ ＳＤＳ＋１Ｍ尿素
−グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）＋１Ｍ尿素
−１％ ＳＤＳ＋グアニジンＨＣｌ ０．１Ｍ（Ｇｎｄ）＋１Ｍ尿素
中に入れる。
【０２１６】
次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２１７】
結果（図１４）は、沈殿工程中ＳＤＳの不在下では、タンパク質の検出は至適でないことを示す。
【０２１８】
沈殿をＳＤＳの存在下で行なうと、結果は、使用する懸濁バッファーの型に応じて異なる。この場合も、取込みバッファー中のＳＤＳの存在は不可欠である。最良の２つの組合せはＳＤＳ−グアニジン、及び、さらに良好なＳＤＳ−グアニジン−尿素であり、これは、より良好な検出強度を可能にする。次いで、アルツハイマー陽性（ＰＡＤ＋）試料は、アルツハイマー陰性（ＰＡＤ−）試料又は非血漿添加（Ｐ）から完全に解離される。沈降ペレット中におけるその存在により、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明され、これは、薬剤Ｉの不在下では起こらない。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＴａｕタンパク質の沈殿を誘導する。次いで、該タンパク質は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡ手法による検出に利用され得る。
【実施例９】
【０２１９】
実施例９：沈殿剤Ｉを用いた方法によるα−シヌクレインタンパク質の検出
９．１ 解析手法：タンパク質ゲル及びウエスタンブロッティング
解析する試料を、ＳＤＳバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー）（５０／５０ｖ／ｖ）中で１００℃にて５分間変性させる。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下、１２％ポリアクリルアミド一次元電気泳動ゲル上に載せる。泳動後、２つの選択肢を採用する。
【０２２０】
＊タンパク質ゲルを、ゲルコードブルー染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により、振とうしながら室温にて一晩クマシーブルーで染色する。蒸留水中での洗浄後、ゲルを乾燥用溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で、振とうしながら室温で１５分間インキュベートし、次いで、２枚のセロファンシート間で少なくとも一晩室温で乾燥させる。
【０２２１】
＊この解析は、ウエスタンブロッティング手法（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５）に従って行なう。タンパク質をニトロセルロース膜上に転写し、室温で１時間、Ｓｙｎタンパク質２１１（Ｚｙｍｅｄ）に特異的な抗体を用いて免疫ブロットする。二次検出抗体は、マウス免疫グロブリンＧの重鎖及び軽鎖を認識し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）である。膜は、工程ごとに、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％ｗ／ｖ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、次いで、Ｔｗｅｅｎ２０なしのＰＢＳ中で洗浄する。シグナルをｓｕｐｅｒ ｓｉｇｎａｌ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた化学発光によって検出し、ラジオグラフィー膜（Ｐｉｅｒｃｅ）上で可視化する。
【０２２２】
９．２ 薬剤Ｉの存在下での検出
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した１μｇの組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシン又はトリエチレンテトラミンすなわちＴＥＴのいずれかを種々の濃度で用いて行なう。
【０２２３】
該組換えタンパク質と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２２４】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのＳＤＳバッファー中に入れる。変性後、すべての画分をウエスタンブロッティング手法によって解析する。
【０２２５】
図１５は、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られた染色後（図１５Ａ）及びウエスタンブロッティング後（図１５Ｂ）のタンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す（レーン２〜５：ペレット、８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０２２６】
図１６は、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られた染色後（図１６Ａ）及びウエスタンブロッティング後（図１６Ｂ）タンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す（レーン２〜５：ペレット、８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【０２２７】
電気泳動レーンに対する薬剤Ｉの濃度は、以下の表７及び８に示すとおりである。
【０２２８】
表７：図１５
【０２２９】
【表７】
【０２３０】
表８：図１６
【０２３１】
【表８】
【０２３２】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、ストレプトマイシン又はＴＥＴのいずれかの薬剤Ｉで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から凝集によって濃縮されたという事実が証明される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間のインキュベーション及び簡単な遠心分離後、組換えＳｙｎタンパク質の沈殿を誘導する。しかし、上清み画分中にタンパク質が見られるため、この沈殿は完全ではない。それでもなお、この濃縮は、臨床検査室で日常的に使用され得るＥＬＩＳＡアッセイにおけるその検出を可能にするのに充分である。
【０２３３】
また、この沈殿は、血漿タンパク質が主に上清み中に見られるため、比較的特異的であることが注目される（図１５Ａ及び１６Ａ、レーン７〜１２）
【実施例１０】
【０２３４】
実施例１０：沈殿剤ＩＩを用いた方法によるα−シヌクレインタンパク質の検出
１０．１ 解析手法：タンパク質ゲル及びウエスタンブロッティング
この手法は、実施例９に記載のものと同じである。
【０２３５】
１０．２ 解析手法：ＥＬＩＳＡ
この解析は、慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法：ヒトα−シヌクレインＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＫＨＢ００６１）を供給元の推奨に従って行なう。
【０２３６】
１０．３ 薬剤Ｉの存在下での検出Ｉ
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した１μｇの組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤ＩＩとして、カリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノ−エチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓとして知られている）を用いて行なう。このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、０〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲を用いたこと以外は、先の実施例で示したようにして行なう。
【０２３７】
図１７は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたタンパク質ゲルにおいて得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１７Ａはペレット画分に相当し、一方、図１７Ｂは上清みに相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み、レーン９は、未処理組換えタンパク質に相当する。
【０２３８】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表９及び１０に示すとおりである。
【０２３９】
表９：図１７Ａ
【０２４０】
【表９】
【０２４１】
表１０：図１７Ｂ
【０２４２】
【表１０】
【０２４３】
結果は、１０ｍｇ／ｍｌの前の濃度から、血漿タンパク質が、排他的にペレット中に見られることを示す（該タンパク質ゲルの検出限界内）。
【０２４４】
図１８は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーから得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１８Ａはペレット画分に相当し、一方、図１８Ｂは上清みに相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は、分子量マーカーを含み、レーン９は、未処理組換えタンパク質に相当する。
【０２４５】
電気泳動レーンに対する薬剤ＩＩの濃度は、以下の表１１及び１２に示すとおりである。
【０２４６】
表１１：図１８Ａ
【０２４７】
【表１１】
【０２４８】
表１２：図１８Ｂ
【０２４９】
【表１２】
【０２５０】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが、試験試料容量から捕捉されたという事実が証明される。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間インキュベーション後、組換えＳｙｎタンパク質の捕捉を誘導するが、この場合、予期に反してＩＩ型の薬剤では、この捕捉により簡単な遠心分離によるタンパク質の沈殿が可能になる。しかし、タンパク質が上清み画分中に見られるため、この捕捉は完全ではない。ペレット中に見られるタンパク質の最大量を、１０〜５０ｍｇ／ｍｌのカリックスアレーン濃度で調べる。
【０２５１】
しかし、この濃縮は、臨床検査室で常套的に使用され得るＥＬＩＳＡアッセイにおけるその検出を可能にするのに充分である。
【０２５２】
１０．４ 薬剤ＩＩの存在下での検出感度
このアッセイは、ヒト血漿プール中に添加した一連の組換えα−シヌクレインタンパク質（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）、及び、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノ−エチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓとして知られる）を用いて行なう。このアッセイは、特許出願ＷＯ２００４／０５９３２２に示されたようにして調製したＣ６Ｓを使用し、濃度を５０ｍｇ／ｍｌとしたこと以外は、先の実施例に示すようにして行なう。
【０２５３】
図１９は、カリックスアレーンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーから得られた結果（概略図、上パネル、及び写真、下パネル）を示す。図１９Ａはペレット画分に相当し、一方、図１９Ｂは上清みに相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む。
【０２５４】
電気泳動レーンに対するに対するタンパク質の濃度は、以下の表１３及び１４に示すとおりである。
【０２５５】
表１３：図１９Ａ
【０２５６】
【表１３】
【０２５７】
表１４：図１９Ｂ
【０２５８】
【表１４】
【０２５９】
結果は、Ｓｙｎタンパク質が、２５ｎｇ／ｍｌの感度で、薬剤ＩＩで処理した後のペレット中に見られることを示す。沈降ペレット中におけるその存在により、これが捕捉されたという事実が証明され、この場合、試験試料容量からの沈殿に好ましい条件がもたらされた。したがって、これらの分子は、３７℃で６０分間インキュベーション後、組換えＳｙｎタンパク質の捕捉を誘導し、簡単な遠心分離によってその濃縮を促進する。タンパク質が上清み画分中に１００ｎｇ／ｍｌの濃度まで見られないため、この捕捉は完全である。これらの結果は、ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例１０参照）（図２０）により確認され、このとき、２５ｎｇ／ｍｌの濃度が、上清みと比べてペレットにおいて有意に検出される。
【実施例１１】
【０２６０】
実施例１１：薬剤ＩＩの存在下でのタウタンパク質の検出
解析手法：
この解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７（２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従い、捕捉に通常使用される抗体の代わりにカリックスアレーンを用いて行なう。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＮＨＳ活性化マイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、カリックスアレーンを、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で２時間、室温で結合させる。蒸留水で３回洗浄後、プレートを３７℃で１５分間真空乾燥させる。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルの０．５％乳分含有ＰＢＳで、３７℃にて１時間不動態化させる。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で３回洗浄後、プレートの使用の準備をする。
【０２６１】
アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の脳抽出物を、２００μｇ／ｍｌのヒトアルブミン、２２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ及び０．１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＭをクレブス−リンゲル炭酸塩バッファー中に含有するバッファーで希釈する。１〜１００００ｎｇの濃度を試験する。これらの希釈液１００μｌを３７℃で１時間３０分間インキュベートする。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー中で３μｇ／ｍｌの濃度に希釈したタウタンパク質Ｔ１４（Ｚｙｍｅｄ）に特異的な１００μｌのマウスモノクローナル抗体を、３７℃で１時間インキュベートする。
【０２６２】
結合された抗Ｔ１４抗体を認識させるため、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファー中、０．５μｇ／ｍｌの濃度で、４５分間３７℃にて使用する。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳ）を各ウェルに添加し、化学発光を照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０）にて読み取る。得られるデータは相対光単位（ＲＬＵ）の形態である。上記の工程ごとに、ウェルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳバッファーで洗浄する。
【０２６３】
図２１の結果は、タウタンパク質が、１ｎｇ／ｍｌの濃度までのカリックスアレーンよって完全に捕捉されることを示す。この捕捉により、ＥＬＩＳＡアッセイ形式において特異的抗体での検出可能になる。当業者には、高濃度のタンパク質で「フック効果」が注目されよう。この現象は、専門技術者によって行なわれる最適化の際に容易に解決され得る。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）アルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）で得られた差により、このアッセイを研究室で日常的に使用することが可能になる。
【実施例１２】
【０２６４】
実施例１２；薬剤Ｉ及びＩＩの存在下でのｓｙｎタンパク質の検出
解析手法
第１の解析は、慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法：ヒトα−シヌクレインＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＫＨＢ００６１）を供給元の推奨に従って行なう。
【０２６５】
第２の解析は、Ｋｏｈｎｋｅｎら（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８７ （２０００）１８７−１９０）に記載の慣用的な「ＥＬＩＳＡサンドイッチ型」免疫酵素手法に従い、捕捉に通常使用される抗体の代わりにカリックスアレーンを用いて行なう。
【０２６６】
ＥＬＩＳＡアッセイは、ＮＨＳ活性化マイクロプレートの使用に基づくものであり、これに、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で２時間、室温で結合させる。蒸留水で３回洗浄後、プレートを３７℃で１５分間真空乾燥させる。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルの０．５％乳分含有ＰＢＳで、３７℃にて１時間不動態化させる。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で３回洗浄後、プレートの使用の準備をする。
【０２６７】
このアッセイは、アルツハイマー病の患者（２０μｇ／ｍｌ）由来の脳抽出物及びヒト血漿プール中に添加した組換えα−シヌクレインタンパク（ＳＹＮ）（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）（２５ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なう。
【０２６８】
試料を薬剤Ｉ（５００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の存在下で沈殿させる。
【０２６９】
試料と薬剤Ｉを接触させたら、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２７０】
次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５μｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中に入れ、場合によっては９０℃で１分間加熱し、次いで２２５μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー中で希釈する。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２７１】
図２２は、薬剤Ｉでの沈殿及び抗体捕捉による慣用的ＥＬＩＳＡ手法による検出後に得られた結果を示す（第１の解析；薬剤ＩＩの使用なし）。結果は、組換えタンパク質が薬剤Ｉでの沈殿後、血漿中に検出されていることを示す。しかし、凝集形態内のその沈殿では至適検出は可能でない。また、タンパク質が上清み中に検出され、モノマー形態が該抗体によって完全に捕捉されるため、この沈殿は完全ではない。他方において、脳抽出物では、タンパク質が主に凝集形態であり、未処理試料中での検出が弱く、薬剤Ｉでの処理後、この実施例の操作条件下では、タンパク質はペレットにも上清みにも検出されないことがすぐにわかる。
【０２７２】
図２３は、薬剤Ｉでの凝集形態での沈殿及び薬剤ＩＩでの捕捉による慣用的なＥＬＩＳＡ手法及び検出後に得られた結果を示す。結果は、組換えタンパク質及び脳抽出物が、未処理であってもほとんど又は全く検出されないことを示す。他方において、薬剤Ｉの作用後、捕捉ツールとして薬剤ＩＩを使用する利点は、非常によくわかる。実際、組換えタンパク質と脳抽出物との両方の場合において、Ｓｙｎタンパク質はその凝集形態で、沈殿ペレット中に完全に検出される。さらに、加熱工程により、得られるシグナルを改善することができる。
【０２７３】
したがって、薬剤Ｉ／薬剤ＩＩの組合せにより、血漿などの試料中のα−シヌクレインタンパク質の検出を改善することが可能になると結論付けることができる。
【実施例１３】
【０２７４】
実施例１３：薬剤Ｉ及びＩＩの存在下でのリン酸化タウタンパク質の検出
この解析手法は、抗体を、実施例１２に記載のカリックスアレーン（薬剤ＩＩ）に変えたこと以外は、実施例８に記載のものと同じである。使用した検出抗体は、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘで開発されたモノクローナル抗体であり、１μｇ／ｍｌの濃度のペルオキシダーゼにコンジュゲートさせて使用する。このモノクローナル抗体は、２３１位がリン酸化されたタウタンパク質から誘導されたリン酸化ペプチドでの免疫処置後に得た。
【０２７５】
使用した試料は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）由来の正常患者由来の血漿プールに添加した脳抽出物である。このアッセイは、２５ｎｇの脳抽出物及び薬剤Ｉとして硫酸塩形態のストレプトマイシンを種々の濃度で用いて行なう。
【０２７６】
試料と薬剤Ｉとを接触させたら、混合物を６０分間３７℃でインキュベートする。次いで、試料を１０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを回収し、上清みから分離する。すべての画分を保存する。ペレットを、２５０μｌのｔｒｉｓ−マレイン酸バッファー（特に記載のない限り）中に入れる。次いで、試料をプレートに加える準備をする。
【０２７７】
図２４の結果は、未処理血漿試料中でのリン酸化タウタンパク質の検出が困難であることを示す。他方において、薬剤Ｉでの凝集後、捕捉を薬剤ＩＩにより行なうと、ＥＬＩＳアッセイでのその検出がペレットにおいて可能になることは明白である。したがって、薬剤Ｉ／薬剤ＩＩの組合せにより、血漿などの試料中でのリン酸化タウタンパク質の検出を改善することが可能になると結論付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１−Ａ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す。
【図１−Ｂ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ａの続き）。
【図１−Ｃ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ｂの続き）。
【図１−Ｄ】図１は、凝集体形成性循環タンパク質形態α−シヌクレイン、ＡＰＰ（アミロイドペプチド前駆体タンパク質）、パーキン及びタウタンパク質の配列の比較を示す（図１−Ｃの続き）。
【図２−Ａ】図２−Ａは、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図２−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、ストレプトマイシン（レーン３及び４）又はＴＥＴ（レーン５及び６）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図３−Ａ】図３−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図３−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図４−Ａ】図４−Ａは、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図４−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、薬剤ＩＩとしてカリックスアレーンｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノエチルオキシ）カリックス−［６］−アレーン（Ｃ６Ｓ）で処理したタウタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。回収された画分は、ペレット（レーン２〜９）又は上清み（レーン１２〜２０）のいずれかである。レーン１及び２１は、カリックスアレーンでの処理なしの対照試料に相当し、レーン１１は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図５−Ａ】図５−Ａは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図５−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図５−Ｂ】図５−Ｂは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図６−Ａ】図６−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図６−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図６−Ｂ】図６−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４０の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図７−Ａ】図７−Ａは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図７−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、Ｃ６Ｓ（レーン２）、ストレプトマイシン（レーン３）又はＴＥＴ（レーン４）で処理したペプチドβ−Ａペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１は、薬剤Ｉ又はＩＩでの処理なしの対照試料に相当し、レーン５は、分子量マーカーレーンに相当する。
【図８−Ａ】図８−Ａは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲル（図８−Ｂ）のＸ線写真の概略図である。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図８−Ｂ】図８−Ｂは、リファンピシン（レーン３、４及び５）又はイソニアジド（レーン８、９及び１０）のいずれかである薬剤Ｉで処理したβ−アミロイドペプチド１−４２の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルである。レーン１及び６は、分子量マーカーレーンに相当し、レーン２及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料に相当する。
【図９】図９は、種々の濃度の薬剤ＩＩ ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４２での処理後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【図１０】図１０は、薬剤ＩＩ：ｐ−スルホナト−カリックス［４］アレーン（ＳＣ４）、ｐ−スルホナト−カリックス［６］アレーン（ＳＣ６）、ｐ−スルホナト−カリックス［８］アレーン（ＳＣ８）、薬剤ＩＩでの処理なしの対照であるＡｂ４０で処理したペプチドβアミロイド１−４０の電気スプレイ型の質量分析計で得られた複合体形成ピークの強度ｃｐｓ（カウント毎秒）を示すグラフ表示である。
【図１１】図１１は、種々の濃度の薬剤ＩＩコンドロイチン−６−硫酸、薬剤ＩＩでの処理なしでの対照であるＡｂ４２との反応後のβ−アミロイドペプチド１−４２の円偏光二色性によって得られた波長の関数としてのモル楕円率を示すグラフ表示である。
【図１２】図１２は、アルツハイマー病患者（ＡＤ＋）由来又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）由来の、未処理（ＮＴ）又はトリエチレンテトラミン（ＴＥＴ）である薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（ｐｇ／ｍｌ、当量（ｅｑ）の組換えタウタンパク質でアッセイ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【図１３】図１３は、アルツハイマー病の患者、未処理（ＮＴ）又は種々の濃度（ｍｇ／ｍｌ）のストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した脳抽出物を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。リン酸化タウタンパク質の検出（当量Ｔａｕ、ｐｇ／ｍｌ）をペレット画分及び上清み画分において行なう。
【図１４】図１４は、処理なし又はＳＤＳ１％での処理及びストレプトマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）での沈殿後の、リン酸化タウタンパク質の検出に対する種々の取り込みバッファーの効果を示すグラフ表示である。結果は、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＰＡＤ−）又は血漿無添加（Ｐ）の脳抽出物を用いて得たものである。Ｇｎｄ：グアニジン；ＳＮ：上清み；ｓｔｐ：ストレプトマイシン。
【図１５−Ａ】図１５−Ａは、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【図１５−Ｂ】図１５−Ｂは、ＴＥＴでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後のゲルのＸ線写真の電気泳動ゲル（下パネル）の概略図（上パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は、組換えタンパク質単独に相当する。
【図１６−Ａ】図１６−Ａは、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【図１６−Ｂ】図１６−Ｂは、ストレプトマイシンでの処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後のゲルのＸ線写真の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）である（レーン２〜５：ペレット；レーン８〜１１：上清み）。レーン１及び７は、薬剤Ｉでの処理なしの対照試料のペレット及び上清みに相当し、レーン６は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４、６及び３ｋＤａ）、レーン１２は組換えタンパク質単独に相当する。
【図１７−Ａ】図１７−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１７−Ｂ】図１７−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたクマシーブルーで染色後の概略図（上パネル）及び電気泳動ゲル（下パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８及び１４ＫＤａ）、レーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１８−Ａ】図１８−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１８−Ｂ】図１８−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜７は、種々の濃度のカリックスアレーンで処理したＳｙｎタンパク質に相当し、レーン８は分子量マーカーを含み（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び６ｋＤａ）及びレーン９は未処理組換えタンパク質に相当する。
【図１９−Ａ】図１９−Ａは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、ペレット画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【図１９−Ｂ】図１９−Ｂは、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）での処理後の血漿中のＳＹＮタンパク質の泳動後に得られたウエスタンブロッティング後の電気泳動ゲルのオートラジオグラフ（下パネル）の概略図（上パネル）であって、上清み画分に相当する。レーン１〜８は、カリックスアレーンで処理した種々の濃度のＳｙｎタンパク質に相当し、レーン１０〜１２は、未処理Ｓｙｎタンパク質に相当し、レーン９は分子量マーカーを含む（１８８、６２、４９、３８、２８、１８、１４及び３ｋＤａ）。
【図２０】図２０は、血漿中に存在し、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）で処理したＳｙｎタンパク質のある濃度範囲（ｎｇ／ｍｌ）を用いて行なったＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。光学密度は、ペレット画分及び上清み画分にて読み取る。
【図２１】図２１は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）を捕捉相に用いたサンドイッチ型のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。アルツハイマー病の患者（ＡＤ＋）又はアルツハイマー病でない患者（ＡＤ−）の脳抽出物由来の種々の量（ｎｇ）のタンパク質を試験する。得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【図２２】図２２は、特異的抗体を捕捉相に用いたサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加し、ストレプトマイシンである薬剤Ｉで沈殿させる。沈殿後、ペレット（Ｃ）を加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。ＮＴは未処理、Ｃはペレット及びＳは上清みを意味する。
【図２３】図２３は、薬剤Ｉ（ストレプトマイシン）での沈殿及び薬剤ＩＩ（カリックスアレーン）を用いた捕捉によるＥＬＩＳＡによる検出後のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。該アッセイは、アルツハイマー病の患者（ＰＡＤ＋）由来の脳抽出物を用いて、又は組換えα−シヌクレインタンパク質（Ｐα−ｓｙｎ）を用いて行ない、ヒト血漿のプール中に添加する。薬剤Ｉでの沈殿後、ペレットを加熱又は非加熱グアニジンバッファー中に入れる。結果を光学密度の形態で示す。
【図２４】図２４は、アルツハイマー病患者（ＡＤ ｐｏｓ）脳抽出物を用いて行ない、未処理又はストレプトマイシンである薬剤Ｉで処理した正常患者由来の血漿プール中に添加したリン酸化タウタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイのグラフ表示である。捕捉相は、カリックスアレーン（薬剤ＩＩ）からなる。ペレット画分及び上清み画分において得られた結果を相対光単位（ＲＬＵ）の形態で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の生物試料において、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、
中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記薬剤ＩＩの前に、凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために前記薬剤Ｉを生物試料に添加することを特徴とする、請求項１に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項３】
ａ）凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために、前記薬剤Ｉを試料に添加する工程、
ｂ）このようにして得られた混合物を、凝集体形成性循環タンパク質形態の前記凝集体を捕捉するために薬剤ＩＩと一緒にする工程、及び
ｃ）凝集体形成性循環タンパク質形態の存在を顕在化させる工程
を含むことを特徴とする、請求項２に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項４】
以下：
ｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を反応混合物から分離する工程、及び
ｉｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を変性させる工程
からなるさらなる工程ｉ）及びｉｉ）の少なくとも１つを含み、
これらの工程は、適切な場合は、工程ａ）及び工程ｂ）の間に含まれることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項５】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応のために、適切な場合は工程ｃ）において添加することを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項６】
前記薬剤ＩＩが固相支持体に結合されていることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項７】
前記薬剤Ｉが、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子であることを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項８】
前記薬剤Ｉが抗結核剤であることを特徴とする、請求項７に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項９】
前記薬剤ＩＩが大環状分子又はグリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項１〜８いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１０】
大環状分子が、メタシクロファン、好ましくはカリックスアレーンから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１１】
大環状分子が、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基を表し、ここで、Ｐｏｌは、リン酸基、硫酸基、アミン基、アンモニウム基、カルボン酸基を表し、Ｒは以下に規定するとおりであり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素又はイオウ原子であり、
Ｒ５及び６は、各々独立して、存在しないか、又は水素原子、ＣＨ２若しくは以下に規定するＲ基を表し、あるいは
Ｒ５及び６は一緒になって、酸素又はイオウ原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基又は酸素若しくはイオウ原子を表し、
ｍは、０又は１である整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は、分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖を表し、ここで、該鎖は、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有し、
ｎは３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、該単位の性質に応じて異なっていてよい）
に相当することを特徴とする、請求項１０に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１２】
大環状分子が、下記一般式（Ｉａ）：
【化２】
（式中、
ｎは４〜８の整数であり、
各基Ｒ２は一緒になって、独立して、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは０〜６の整数であり、ｓは０〜６の整数である）を表す）
に相当することを特徴とする、請求項１１に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１３】
前記大環状分子が、式中、２つの基Ｒ２が各々、硫酸基であり、ｎが４、６又は８であり、Ｒ７が水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基である（Ｉａ）のカリックスアレーンであることを特徴とする、請求項１２に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１４】
大環状分子が、式中、ｎ＝６であり、Ｒ７が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である一般式（Ｉａ）に相当することを特徴とする、請求項１３に記載の凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１５】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉと、好ましくは少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と一緒にする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、
ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩであって、大環状分子又はグリコサミノグリカンである該薬剤ＩＩと一緒にする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１つの結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応のために添加することを特徴とする、請求項１５又は１６いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１８】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出のための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用。
【請求項１】
凝集体形成性循環タンパク質形態を含み得るヒト起源の生物試料において、非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、
中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ、及び凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体又は前記薬剤Ｉによって誘導される凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記薬剤ＩＩの前に、凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために前記薬剤Ｉを生物試料に添加することを特徴とする、請求項１に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項３】
ａ）凝集体形成性循環タンパク質形態を凝集させるために、前記薬剤Ｉを試料に添加する工程、
ｂ）このようにして得られた混合物を、凝集体形成性循環タンパク質形態の前記凝集体を捕捉するために薬剤ＩＩと一緒にする工程、及び
ｃ）凝集体形成性循環タンパク質形態の存在を顕在化させる工程
を含むことを特徴とする、請求項２に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項４】
以下：
ｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を反応混合物から分離する工程、及び
ｉｉ）凝集体形成性循環タンパク質形態の凝集体を変性させる工程
からなるさらなる工程ｉ）及びｉｉ）の少なくとも１つを含み、
これらの工程は、適切な場合は、工程ａ）及び工程ｂ）の間に含まれることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項５】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１種類の結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応のために、適切な場合は工程ｃ）において添加することを特徴とする、請求項１〜４いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項６】
前記薬剤ＩＩが固相支持体に結合されていることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項７】
前記薬剤Ｉが、少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子であることを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項８】
前記薬剤Ｉが抗結核剤であることを特徴とする、請求項７に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項９】
前記薬剤ＩＩが大環状分子又はグリコサミノグリカンであることを特徴とする、請求項１〜８いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１０】
大環状分子が、メタシクロファン、好ましくはカリックスアレーンから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１１】
大環状分子が、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基を表し、ここで、Ｐｏｌは、リン酸基、硫酸基、アミン基、アンモニウム基、カルボン酸基を表し、Ｒは以下に規定するとおりであり、
Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシル基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは以下に規定するとおりである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素又はイオウ原子であり、
Ｒ５及び６は、各々独立して、存在しないか、又は水素原子、ＣＨ２若しくは以下に規定するＲ基を表し、あるいは
Ｒ５及び６は一緒になって、酸素又はイオウ原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基又は酸素若しくはイオウ原子を表し、
ｍは、０又は１である整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は、分枝若しくは非分枝の、環状若しくは非環状の、飽和若しくは不飽和の炭化水素系の鎖を表し、ここで、該鎖は、非置換若しくはハロゲンで置換されており、極性若しくは無極性の官能基を有し、
ｎは３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、該単位の性質に応じて異なっていてよい）
に相当することを特徴とする、請求項１０に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１２】
大環状分子が、下記一般式（Ｉａ）：
【化２】
（式中、
ｎは４〜８の整数であり、
各基Ｒ２は一緒になって、独立して、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは０〜６の整数であり、ｓは０〜６の整数である）を表す）
に相当することを特徴とする、請求項１１に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１３】
前記大環状分子が、式中、２つの基Ｒ２が各々、硫酸基であり、ｎが４、６又は８であり、Ｒ７が水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基である（Ｉａ）のカリックスアレーンであることを特徴とする、請求項１２に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１４】
大環状分子が、式中、ｎ＝６であり、Ｒ７が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である一般式（Ｉａ）に相当することを特徴とする、請求項１３に記載の凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１５】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉと、好ましくは少なくとも２つのグアニジニウム及び／又はピリジニウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と一緒にする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法であって、
ヒト生体から誘導又は採取した生物試料を、凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩであって、大環状分子又はグリコサミノグリカンである該薬剤ＩＩと一緒にする工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な少なくとも１つの結合パートナーを、凝集体形成性循環タンパク質形態に特異的な結合パートナーと凝集体形成性循環タンパク質形態との免疫反応のために添加することを特徴とする、請求項１５又は１６いずれか１項に記載の少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態を検出する方法。
【請求項１８】
非感染性神経変性疾患と関連する少なくとも１つの凝集体形成性循環タンパク質形態の検出のための、中枢神経系の病理学的凝集過程に関与する非感染性タンパク質の循環性形態の凝集をもたらす非タンパク質薬剤Ｉ及び／又は凝集体形成性循環タンパク質形態の天然の凝集体の天然の凝集体を捕捉するための非タンパク質薬剤ＩＩを備える診断用キットの使用。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図１−Ｄ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８−Ａ】
【図８−Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−Ａ】
【図１５−Ｂ】
【図１６−Ａ】
【図１６−Ｂ】
【図１７−Ａ】
【図１７−Ｂ】
【図１８−Ａ】
【図１８−Ｂ】
【図１９−Ａ】
【図１９−Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図１−Ｄ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８−Ａ】
【図８−Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５−Ａ】
【図１５−Ｂ】
【図１６−Ａ】
【図１６−Ｂ】
【図１７−Ａ】
【図１７−Ｂ】
【図１８−Ａ】
【図１８−Ｂ】
【図１９−Ａ】
【図１９−Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２００９−５０１９２２（Ｐ２００９−５０１９２２Ａ）
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２２００２（Ｐ２００８−５２２００２）
【出願日】平成１８年７月７日（２００６．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００１６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１０１１０
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（３０５０２３５８４）サントル・ナシオナル・ド・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィック (8)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【住所又は居所原語表記】３ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ， ７５７９４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １６， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０８０１９３１１）ユニヴェルシテ クロード ベルナール リヨン １ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月７日（２００６．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００１６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１０１１０
【国際公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（３０５０２３５８４）サントル・ナシオナル・ド・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィック (8)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【住所又は居所原語表記】３ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ， ７５７９４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １６， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５０８０１９３１１）ユニヴェルシテ クロード ベルナール リヨン １ (6)
【Ｆターム（参考）】
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