本発明は、概して、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の分野、ならびにクローン動物および細胞の作製に関する。また、本開示は、哺乳類のクローニング、胚幹細胞等の多能性細胞の取得、または卵母細胞および受精した胚を使用した哺乳類の細胞の再プログラムの方法に関する。本発明はまた、概して、受精した胚を移植先として使用する、体細胞のクローン作成方法に関する。特定の実施形態において、卵母細胞は最初の移植先であり、受精した胚は第２の移植先である。特定の実施形態において、本開示は、多能性細胞を得るため、または哺乳類の細胞を再プログラムするための、哺乳類のクローン作成方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化した細胞の核を再プログラムする方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子に注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化させるステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子を前記二細胞期へ発達させるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から、前記の活性化された二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、
（ｆ）前記二細胞期胚の２つの細胞の間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、前記分化した細胞の再プログラムされた核を含む単一細胞を発生させるステップと、を含む方法。

【請求項２】
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ_２，カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ_２，サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、請求項１に記載の方法。

【請求項３】
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項４】
前記電気融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、請求項３に記載の方法。

【請求項５】
ステップ（ｆ）で前記生成した単一細胞を割球、桑実胚または胚盤胞期へと発育させるステップ（ｇ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項６】
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、請求項１に記載の方法。

【請求項７】
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、請求項１に記載の方法。

【請求項８】
前記分化した細胞はヒトの細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項９】
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項１０】
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項１１】
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項１２】
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期の胚は同一の種によるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項１３】
前記同一の種はヒトである、請求項１０に記載の方法。

【請求項１４】
動物を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から、前記二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、単一細胞を発生させるステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）から前記単一細胞を培養して、動物へと発達させるステップと、を含む方法。

【請求項１５】
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ_２，カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ_２，サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、請求項１４に記載の方法。

【請求項１６】
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、請求項１４に記載の方法。

【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記電気融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。

【請求項１８】
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、請求項１４に記載の方法。

【請求項１９】
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、請求項１４に記載の方法。

【請求項２０】
前記分化した細胞はヒトの細胞である、請求項１４に記載の方法。

【請求項２１】
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項２２】
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項２３】
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は前記同一の種によるものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項２４】
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は前記同一の種によるものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項２５】
前記同一の種はヒトである、請求項２２に記載の方法。

【請求項２６】
胚幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記二細胞期の卵子の核と細胞質の周囲とを除去するステップと、
（ｆ）単一細胞を発生させるために、前記二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、
（ｇ）前記単一細胞を、ステップ（ｆ）から胚幹細胞が由来する可能性のある発達期に培養させるステップと、を含む方法。

【請求項２７】
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ_２，カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ_２，サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、請求項２６に記載の方法。

【請求項２８】
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、請求項２６に記載の方法。

【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記電気的融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。

【請求項３０】
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、請求項２６に記載の方法。

【請求項３１】
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、請求項２６に記載の方法。

【請求項３２】
前記分化した細胞はヒトの細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項３３】
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項２６に記載の方法。

【請求項３４】
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、請求項２６に記載の方法。

【請求項３５】
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項２６に記載の方法。

【請求項３６】
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項２６に記載の方法。

【請求項３７】
前記同一の種はヒトである、請求項３４に記載の方法。

【請求項３８】
前記胚幹細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であり、前記分化した細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるか、または前記胚幹細胞は、相同組み換えまたはヘテロ接合性の喪失、あるいは両方によって、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合となるよう操作されるかのいずれかであり、前記同一の種はヒトである、請求項２６に記載の方法。

【請求項３９】
前記方法は、胚幹細胞バンクを作成するために何度も繰り返され、前記胚幹細胞のそれぞれは、前記バンクの他の胚幹細胞とは異なるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である、請求項３８に記載の方法。

【請求項４０】
前記ステップ（ｇ）は動物の子宮に前記培養細胞を移植するステップを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項４１】
前記移植した細胞および前記細胞が移植された前記動物は同一の種である、請求項４０に記載の方法。

【請求項４２】
ステップ（ｇ）は、
（ｉ）ステップ（ｆ）からの前記単一細胞を前記桑実胚期へ培養するステップと、
（ｉｉ）前記桑実胚から割球を単離するステップと、
（ｉｉｉ）前記割球を培養して、２つ以上の割球のクラスタを生成するステップと、
（ｉｖ）前記培養された２つ以上の割球のクラスタを、前記胚または胎児細胞に直接的または間接的に接触させるステップと、
（ｖ）ＥＳ細胞が生成されるまで（ｉｖ）の前記２つ以上の割球のクラスタを培養するステップと、を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項４３】
胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、
（ａ）哺乳類の親の胚から生検された割球と前記親の胚とを、共に１２時間〜１８時間培養するステップと、
（ｂ）ラミニンをさらに含み、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。

【請求項４４】
ＭＥＦは有糸分裂的に不活性化されている、請求項４３に記載の方法。

【請求項４５】
ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項４６】
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項４７】
前記ステップ（ｃ）は、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地内で５日間培養するステップを含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項４８】
請求項４３に記載の方法であって、ステップ（ｃ）はさらに、前記割球が約２０の細胞の細胞塊を形成するまで培養するステップと、ＥＳ細胞が播種された培地に前記細胞塊を転移させるステップとを含む、方法。

【請求項４９】
前記ＥＳ細胞は、マーカーを発現する、または標識される、請求項４８に記載の方法。

【請求項５０】
前記親の胚は、胚盤胞培地に転移され、胚盤胞で発達できるようにされていた、請求項４３に記載の方法。

【請求項５１】
前記割球は、
（ａ）前記胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで前記固定化胚をタッピングするステップと、によって前記胚から単離される、請求項４３に記載の方法。

【請求項５２】
胚幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子を前記二細胞期へ発達させるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記二細胞期の卵子の核と細胞質の周囲とを除去するステップと、
（ｆ）単一細胞を発生させるために、前記二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、
（ｇ）桑実胚が親の胚として使用できる、桑実胚を生成させるためにステップ（ｆ）から前記単一細胞を培養させるステップと、
（ｈ）前記桑実胚から前記割球を単離するステップと、
（ｉ）前記割球と前記親の胚とを、共に１２時間〜１８時間培養するステップと、
（ｊ）ラミニンをさらに含み、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｋ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｊ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。

【請求項５３】
前記ＭＥＦは有糸分裂的に不活性化されている、請求項５２に記載の方法。

【請求項５４】
ステップ（ｋ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項５５】
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、請求項５４に記載の方法

【請求項５６】
ステップ（ｋ）は、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地内で５日間培養するステップを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項５７】
請求項５２に記載の方法であって、ステップ（ｋ）はさらに前記割球が約２０の細胞の細胞塊を形成するまで培養するステップと、ＥＳ細胞が播種された培地に前記細胞塊を転移させるステップとを含む、方法。

【請求項５８】
前記ＥＳ細胞は、マーカーを発現する、または標識される、請求項５７に記載の方法。

【請求項５９】
前記親の胚は、胚盤胞培地に転移され、胚盤胞で発達できるようにされていた、請求項５２に記載の方法。

【請求項６０】
前記割球は、
（ａ）前記桑実胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで、前記桑実胚をタッピングするステップとを含み、前記胚から単離される、請求項５２に記載の方法。

【請求項６１】
請求項５２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ_２，カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭ ＡＰ、ＳｒＣｌ_２，サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、方法。

【請求項６２】
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、請求項５２に記載の方法。

【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記電気的融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。

【請求項６４】
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、請求項５２に記載の方法。

【請求項６５】
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、請求項５２に記載の方法。

【請求項６６】
前記分化した細胞はヒトの細胞である、請求項５２に記載の方法。

【請求項６７】
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項５２に記載の方法。

【請求項６８】
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、請求項５２に記載の方法。

【請求項６９】
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項５２に記載の方法。

【請求項７０】
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、請求項５２に記載の方法。

【請求項７１】
前記同一の種はヒトである、請求項７０に記載の方法。

【請求項７２】
前記胚幹細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であり、前記分化した細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるか、または前記胚幹細胞は、相同組み換えまたはヘテロ接合性の喪失、あるいは両方によって、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合となるよう操作されるかのいずれかであり、前記同一の種はヒトである、請求項５２に記載の方法。

【請求項７３】
前記方法は、胚幹細胞バンクを作成するために何度も繰り返され、前記胚幹細胞のそれぞれは、前記バンクの他の胚幹細胞とは異なるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である、請求項７２に記載の方法。

【請求項７４】
前記胚盤胞培地は非ＥＳ細胞への分化を阻害することができる因子を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項７５】
前記胚盤胞培地は、密着結合を阻害することができる因子を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項７６】
前記胚盤胞培地は、前記栄養外胚葉分化経路を阻害することができる因子を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項７７】
前記胚盤胞培地は細胞を脱分極することができる因子を含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項７８】
胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、
（ａ）哺乳類の親の胚から生検された割球を培養するステップと、
（ｂ）ラミニンをさらに含む、胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。

【請求項７９】
前記ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項８０】
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項８１】
前記親の胚は胚盤胞培地に移され、胚盤胞に発達させた、請求項７８に記載の方法。

【請求項８２】
前記割球は、
（ａ）前記胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで前記固定化胚をタッピングするステップと、によって前記胚から単離される、請求項７８に記載の方法。

【請求項８３】
前記（ａ）の割球は前記哺乳類の親の胚と共に培養される、請求項７８に記載の方法。

【請求項８４】
前記割球は、以前に得られたヒトの幹細胞と共に培養されない、請求項７８に記載の方法。

【図３】

【図９Ａ−９Ｃ】

【図１１Ａ−１１Ｃ】

【図１２Ａ−１２Ｉ】

【図１４】

【図１５Ａ−１５Ｉ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図１０】

【図１３】

【公表番号】特表２０１０−５１８８５７（Ｐ２０１０−５１８８５７Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５０９３１（Ｐ２００９−５５０９３１）
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２３８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３４６２
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０９２３６５２０）アドバンスド　セル　テクノロジー，　インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】